TWI782434B - 用於多種癌症之免疫治療的新穎胜肽、胜肽的組合物及支架 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及用於免疫治療方法的肽、蛋白質、核酸和細胞。特別是，本發明涉及癌症的免疫療法。本發明還涉及單獨使用或與其他腫瘤相關肽(刺激抗腫瘤免疫反應或體外刺激T細胞和轉入患者的疫苗複合物的活性藥物成分)聯合使用的腫瘤相關T細胞(CTL)肽表位。與主要組織相容性複合體(MHC)分子結合的肽或與此同類的肽也可能是抗體、可溶性T細胞受體和其他結合分子的靶標。

Description

用於多種癌症之免疫治療的新穎胜肽、胜肽的組合物及支架
本發明涉及用於免疫治療方法的肽、蛋白質、核酸和細胞。特別是，本發明涉及癌症的免疫療法。本發明還涉及單獨使用或與其他腫瘤相關肽(刺激抗腫瘤免疫反應或體外刺激T細胞和轉入患者的疫苗複合物的活性藥物成分)聯合使用的腫瘤相關T細胞(CTL)肽表位。與主要組織相容性複合體(MHC)分子結合的肽或與此同類的肽也可能是抗體、可溶性T細胞受體和其他結合分子的靶標。
本發明涉及數種新型肽序列及其變體，它們源自人腫瘤細胞的HLA-I類分子，可用于引發抗腫瘤免疫反應的疫苗組合物中或作為開發藥物/免疫活性化合物和細胞的目標。
根據世界衛生組織(WHO)的資料，癌症是2012年全球範圍內四大非傳染性致命疾病之一。同年，結直腸癌、乳腺癌和呼吸道癌症在高收入國家被列為前10位死亡原因內(http：//www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/)。
流行病學
2012年，估計全球有1,410萬新增癌症病例，3,260萬癌症患者(5年之內確診)，820萬癌症死亡病例(Ferlay et al.,2013；Bray et al.,2013)。
在腦癌、白血病和肺癌組群內，本申請特別著重於膠質母細胞瘤(GB)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)和非小細胞和小細胞肺癌(NSCLC和SCLC)。
肺癌是全球範圍內最常見的癌症類型，在很多國家是癌症死亡的首要原因。
乳腺癌是一種免疫原性腫瘤實體，原發腫瘤中不同類型的浸潤免疫細胞表現出不同的預後和預測意義。在乳腺癌患者中進行過大量的早期免疫試驗。大部分已完成的疫苗接種研究均針對HER2和糖類抗原如MUC-1的，並顯示了令人失望的結果。對於在乳腺癌患者中使用 易普利姆瑪和其他T細胞活化抗體進行免疫步驟調製的作用，正在出現臨床資料(Emens,2012)。
慢性淋巴細胞白血病
雖然目前CLL不可治癒，很多患者只顯示緩慢的病情進展或症狀惡化。由於患者並沒有從早期治療中獲益，因此最初方法是「觀望和等待」(Richards et al.,1999)。對於有症狀或疾病進展迅速的患者，有幾種治療方案可供選擇。這些包括化學療法、靶向治療、基於免疫的療法(如單克隆抗體、嵌合抗原受體(CARS)和主動免疫療法)和幹細胞移植。
單克隆抗體被廣泛應用於血液惡性疾病。這是由於基於免疫細胞表面分子良好表徵和血液或骨髓腫瘤細胞可取性瞭解了合適的抗原。CLL治療中所用的常見單克隆抗體靶向作用於CD20或CD52。利妥昔單抗是第一個經FDA批准用於治療NHL的單克隆抗CD20抗體，現已廣泛應用於CLL治療。與氟達拉濱/環磷醯胺組合治療相比，利妥昔單抗/氟達拉濱/環磷醯胺組合治療帶來了更高的CR率並提高了總生存率(OS)，後者已成為首選治療方案(Hallek et al.,2008)。Ofatumomab靶向作用於CD20，用於治療難治性CLL患者(Wierda et al.,2011)。Obinutuzumab是與苯丁酸氮芥組合的一線治療中使用的另一種單克隆抗CD20抗體(Goede et al.,2014)。
阿侖單抗是一種抗CD52抗體，用於治療化療耐藥性疾病患者或存在不良預後因素(如del 17p或p53突變)的患者(Parikh et al.,2011)。
新型單克隆抗體靶向作用於CD37(otlertuzumab、BI 836826、IMGN529和(177)Lu-tetulomab)或CD40(dacetuzumab和lucatumumab)，並在臨床前環境中進行了測試(Robak and Robak,2014)。
一些已完成和正在進行的試驗是基於具有CD19特異性的工程自體嵌合抗原受體(CAR)修飾的T細胞(Maus et al.,2014)。到目前為止，只有少數患者顯示出可檢測到或持續性的CAR。Porter等人和Kalos等人在CAR T細胞試驗中檢測到了一例部分反應(PR)和2例完全反應(CR)(Kalos et al.,2011；Porter et al.,2011)。
主動免疫治療包括以下策略：基因治療、整體修飾的腫瘤細胞疫苗、基於DC的疫苗和腫瘤相關抗原(TAA)衍生肽疫苗。
基因治療方法利用自體基因修飾腫瘤細胞。這些B-CLL細胞用免疫(共同)刺激基因(如IL-2、IL-12、TNF-α、GM-CSF、CD80、CD40L、LFA-3和ICAM-1)轉染，以提高抗原提呈和T細胞活化(Carballido et al.,2012)。雖然腫瘤細胞中的特異 性T細胞應答和減少是很容易觀察到，但是免疫應答僅僅是短暫性的。
幾項研究已經使用自體DC作為抗原提呈細胞來引起抗腫瘤反應。DC已經在體外載有腫瘤相關肽、全腫瘤細胞裂解物和腫瘤衍生RNA或DNA。另一種策略採用全腫瘤細胞與DC融合並產生DC-B-CLL細胞雜合物。轉染的DC引發CD4+和CD8+ T細胞應答(Muller et al.,2004)。載有腫瘤細胞裂解物或凋亡體的融合雜合體和DC增加腫瘤特異性CD8+ T細胞應答。顯示出臨床反應的患者IL-12血清水準增加，Tregs數量減少(Palma et al.,2008)。
不同的方法使用改變的腫瘤細胞來引發或增加CLL特異性免疫應答。此策略的一個實例是產生三瘤細胞：B-CLL細胞融合至具有抗APC特異性的抗Fc受體表達雜交瘤細胞。三瘤細胞在體外誘導CLL特異性T細胞應答(Kronenberger et al.,2008)。
另一種策略利用以芽孢桿菌卡介苗作為佐劑的照射自體CLL細胞充當一種疫苗。數名患者顯示白細胞水準下降或病情穩定(Hus et al.,2008)。
除了分離的CLL細胞之外，在製備於血液治療單位後，使用來自CLL患者的全血作為疫苗。該疫苗引發CLL特異性T細胞反應，並在幾名患者中帶來部分臨床反應或穩定病情(Spaner et al.,2005)。
幾種TAA在CLL中呈過度表達並適於接種。這些包括纖維調節素(Mayr et al.,2005)、RHAMM/CD168(Giannopoulos et al.,2006)、MDM2(Mayr et al.,2006)、hTERT(Counter et al.,1995)、癌胚抗原未成熟層黏連蛋白受體蛋白質(OFAiLRP)(Siegel et al.,2003)、脂肪分化相關蛋白(Schmidt et al.,2004)、生存素(Granziero et al.,2001)、KW1至KW14(Krackhardt et al.,2002)以及腫瘤衍生的IgVHCDR3區域(Harig et al.,2001；Carballido et al.,2012)。一項I期臨床試驗使用RHAMM衍生R3肽作為疫苗。6名患者中有5名可檢測到R3特異性CD8+T細胞應答(Giannopoulos et al.,2010)。
結直腸癌
根據所述結直腸癌(CRC)期別，有不同的標準療法可用於結腸癌和直腸癌。標準方法包括外科手術、放射治療、化學治療和靶向治療CRC(Berman et al.,2015a；Berman et al.,2015b)。
除了化療藥物外，靶向作用於表皮生長因子受體(EGFR、西妥昔單抗、帕尼單抗)或血管內皮生長因子-A(VEGF-A、貝伐單抗)的若干單克隆抗體施用給疾病期別高的患者。對於二線治療和之後的治療，可使用VEGF抑制劑阿柏西普、酪氨酸激酶抑制劑瑞戈非尼、 胸苷酸合成酶抑制劑TAS-102和磷酸酶抑制劑TAS-114(Stintzing,2014；Wilson et al.,2014)。
最近的臨床試驗分析了主動免疫療法作為CRC的一種治療選擇。這些治療策略包括用腫瘤相關抗原(TAA)的肽、全腫瘤細胞、樹突狀細胞(DC)疫苗和病毒載體進行疫苗接種(Koido et al.,2013)。
迄今為止的肽疫苗針對癌胚抗原(CEA)、黏蛋白1、EGFR、T細胞識別的鱗狀細胞癌抗原3(SART3)、β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)、腎母細胞瘤抗原1(WT1)、生存素-2B、MAGE3、p53、環指蛋白43和線粒體外膜移位酶34(TOMM34)或突變KRAS。在幾項一期和二期臨床試驗中，患者表現為抗原特異性CTL反應或產生抗體。與免疫反應相反，許多患者沒有從肽疫苗中獲得臨床水準上的利益(Koido et al.,2013；Miyagi et al.,2001；Moulton et al.,2002；Okuno et al.,2011)。
樹突細胞疫苗包括用TAA衍生肽、腫瘤細胞裂解物、凋亡腫瘤細胞脈衝處理的DC或腫瘤RNA或DC腫瘤細胞融合產物。雖然I/II期試驗的許多患者表現出特異性免疫反應，但只有少數人獲得臨床益處(Koido et al.,2013)。
全腫瘤細胞疫苗由自體腫瘤細胞組成，被修飾以分泌GM-CSF，透過輻射或病毒感染、照射細胞被修飾。 多數患者在幾項II/III期臨床試驗中沒有表現獲得臨床利益(Koido et al.,2013)。
編碼CEA以及B7.1、ICAM-1和LFA-3的牛痘病毒或複製缺陷型禽流痘病毒已經在I期臨床試驗的病毒載體疫苗中被用作賦形劑。不同的研究使用了編碼CEA和B7.1的非複製型金絲雀痘病毒。除了誘導CEA特異性T細胞應答外，40%的患者表現出客觀臨床反應(Horig et al.,2000；Kaufman et al.,2008)。
食管癌
食管癌的主要治療策略取決於腫瘤分期和位置、組織學類型和患者病情。單純手術是不夠的，除非用於一小部分的鱗狀細胞癌患者。
食管癌免疫治療方法的資料很少，這是因為只進行了數量很有限的早期階段臨床試驗。在一項I期試驗中，晚期食管癌患者被給予一種疫苗，其包含來自三個不同癌症-睾丸抗原(TTK蛋白激酶、淋巴細胞抗原6複合體基因座K和胰島素樣生長因子(IGF)-II mRNA結合蛋白3)，結果一般。在一項I/II期研究中，11名患者中有4名患者自體腫瘤細胞在體外刺激後腫瘤內注入活化的T細胞引起完全或部分腫瘤反應(Toomey et al.,2013)。
胃癌
胃癌(GC)首先發生於黏膜層內壁，隨著生長而擴散至外層。手術是胃癌的主要治療方法並且是唯一的一種治癒性治療方法。對於晚期胃癌，當前治療方案的療效都較差，導致5年生存率低。免疫療法可能是改善胃癌患者生存期的另一種方法。在胃癌臨床試驗中，腫瘤相關淋巴細胞和細胞因子誘導的殺傷細胞、基於肽的HER2/neu靶向疫苗、MAGE-3或血管內皮生長因子受體1和2以及基於樹突狀細胞的HER2/neu靶向疫苗的過繼轉移顯示出有希望的結果。免疫步驟抑制和工程T細胞可能代表了更多的治療選擇，目前正在臨床前研究和臨床研究中進行評估(Matsueda and Graham,2014)。
膠質母細胞瘤
膠質母細胞瘤(WHO Ⅳ級)的治療選擇非常有限。根據德國神經學學會發佈的指南，年輕患者的標準治療包括腫瘤切除或活組織活檢、局灶放射治療以及替莫唑胺或CCNU/洛莫司汀或丙卡巴肼與CCNU和長春新堿(PCV)組合的化學治療。在美國、加拿大和瑞士，貝伐單抗(抗VEGF抗體)也被批准用於治療復發(Leitlinien für Diagnostik und Therapie in der Neurologie,2014)。
不同免疫治療方法針對膠質母細胞瘤(GB)進行了研究，包括免疫檢查點抑制、疫苗接種和工程化T細胞過繼轉移。
針對抑制T細胞受體或其配體的抗體被證明可有效地提高在不同癌症類型(包括黑素瘤和膀胱癌)中的T細胞介導抗腫瘤免疫應答。因此，易普利姆瑪和nivolumab等T細胞活化抗體的效果在臨床GB試驗中進行了評估，但初步資料顯示了自身免疫相關不良事件。
GB患者的不同疫苗接種策略目前正在研究，包括基於肽的疫苗、熱休克蛋白疫苗、自體腫瘤細胞疫苗、基於樹突狀細胞的疫苗以及基於病毒蛋白的疫苗。在這些方法中，來自GB相關蛋白衍生的肽，如表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)或熱休克蛋白或用自體腫瘤細胞裂解物或巨細胞病毒組分刺激的樹突細胞用於誘導GB患者的抗腫瘤免疫應答。其中一些研究顯示出良好的安全性和耐受性以及有前景的療效資料。
轉基因T細胞的過繼轉移是GB治療的另一個免疫治療方法。不同的臨床試驗目前評估嵌合抗原受體的安全性和有效性，其載有針對HER2、IL-13受體α 2和EGFRvIII的T細胞(Ampie et al.,2015)。
肝癌
疾病管理取決於診斷時腫瘤的階段以及肝臟的整體狀況。如果手術不是一種治療選項，可用現有的其他療法。
最近，對於HCC進行了少量的免疫療法試驗。細胞因子已被用於活化免疫細胞的亞群和/或增加腫瘤免疫原性(Reinisch et al.,2002；Sangro et al.,2004)。其他的試驗主要關注腫瘤浸潤性淋巴細胞或活化外周血淋巴細胞的輸注(Shi et al.,2004；Takayama et al.,1991；Takayama et al.,2000b)。
到目前為止，已經進行了少量的治療性疫苗接種試驗。Butterfield等人使用源自甲胎蛋白(AFP)的肽或載有AFP肽的DC進行了兩項體外試驗(Butterfield et al.,2003；Butterfield et al.,2006)。在兩項不同的研究中，自體樹突細胞(DC)用自體腫瘤裂解物(Lee et al.,2005)或肝母細胞瘤細胞系HepG2的裂解物(Palmer et al.,2009)進行體外衝擊。到目前為止，疫苗接種試驗僅顯示臨床結果的有限改善。
黑色素瘤
黑色素瘤的標準療法是手術完全切除連同周圍的健康組織。如果切除不完全或完全不能切除，則患者接受主要的輻射治療，這種療法可以與干擾素α聯合使用於晚期疾病(IIB/C和III A-C期)。
增強抗腫瘤免疫反應似乎是晚期黑色素瘤治療的一種有前景的策略。在美國，免疫檢查點抑制劑易普利姆瑪以及BRAF激酶抑制劑vemurafenib和dabrafenib和MEK抑制劑trametinib已經被批准用於治療晚期黑色素瘤。這兩種方法均可增加患者的抗腫瘤免疫性--易普利姆瑪直接透過減少T細胞抑制起作用，激酶抑制劑間接透過增強黑色素細胞分化抗原的表達起作用。目前正在臨床研究中測試其他檢查點抑制劑(nivolumab和lambrolizumab)，取得了初步令人鼓舞的結果。此外，針對抗腫瘤免疫應答的不同聯合療法正在臨床試驗中測試，包括易普利姆瑪+nivolumab，易普利姆瑪+ gp100衍生肽疫苗，易普利姆瑪+達卡巴嗪，易普利姆瑪+IL-2和易普利姆瑪+GM-CSF(Srivastava and McDermott,2014)。
幾種不同的疫苗接種方法已經在晚期黑色素瘤中進行了評估。到目前為止，III期臨床試驗顯示相當令人失望的結果，疫苗接種策略顯然需要加以改進。因此，新的臨床試驗，如OncoVEX GM-CSF試驗或DERMA試驗均針對提高臨床療效而不降低耐受性(http：//www.cancerresearchuk.org)。
T細胞過繼轉移顯示了晚期黑色素瘤治療的巨大潛力。浸潤淋巴細胞的體外增大自體腫瘤以及含有對癌症-睾丸抗原NY-ESO-1具有高親和力的T細胞受體的T細胞在轉移到黑素瘤患者時具有顯著有益的和較低的 毒性作用。不幸的是，含有對黑素細胞特異性抗原MART1和gp100以及癌症-睾丸抗原MAGEA3具有高親和力T細胞受體的T細胞在臨床試驗中誘導相當的毒性作用。因此，T細胞過繼轉移具有較高的治療潛力，但這些治療的安全性和耐受性需要進一步提高(Phan and Rosenberg,2013；Hinrichs and Restifo,2013)。
非小細胞肺癌
治療選擇根據癌症的類型(小細胞和非小細胞肺癌)和階段進行確定，包括手術、放療、化療、靶向生物治療，如貝伐單抗、埃羅替尼和吉非替尼。
為了擴大NSCLC的治療方案，已經研究了或正在研究不同的免疫治療方法。雖然用L-BLP25或MAGEA3進行疫苗接種未能證明在NSCLC患者中疫苗介導的生存優勢，但是同種異體細胞源性疫苗在臨床研究中表現出有希望的結果。此外，針對神經節苷脂、表皮生長因子受體和其他幾個抗原的進一步接種試驗目前正在進行中。增強患者抗腫瘤T細胞反應的另一策略包括使用特異性抗體阻斷抑制性T細胞受體或其配體。目前，正在臨床試驗中評估上述幾種抗體(包括ipilimumab、nivolumab、pembrolizumab、MPDL3280A和MEDI-4736)在NSCLC中的治療潛力(Reinmuth et al.,2015)。
卵巢癌
手術切除是早期和晚期卵巢癌的主要治療方法。手術切除之後使用鉑類似物進行全身化療，但無手術後化療適應症的非常低等級的卵巢癌(IA期、1級)除外。
免疫療法似乎是改善卵巢癌患者治療的一種有前景的策略，因為存在促炎性腫瘤浸潤淋巴細胞，尤其是CD8陽性T細胞與良好的預後相關，腫瘤相關肽特異性T細胞可從癌組織中分離。
因此，大量的科學工作均投入到卵巢癌不同免疫療法的研究中。已經進行了相當多的臨床前研究和臨床研究，進一步的研究目前正在進行中。對於細胞因子療法、接種疫苗、單克隆抗體治療、細胞過繼轉移和免疫調節，目前有臨床資料。
使用白介素-2、干擾素-α、干擾素-γ或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的細胞因子治療目的在於增強患者自身的抗腫瘤免疫反應，這些治療已經在小型研究組中顯示出有前景的結果。
使用來自幾種腫瘤相關蛋白(HER2/neu、NY-ESO-1、p53、Wilms腫瘤-1)的單個或多個肽或來自自體腫瘤細胞的全腫瘤抗原的I期和II期疫苗接種研究顯示了良好的安全性和耐受性特性，但臨床效果僅為低至中等。
特異性識別腫瘤相關蛋白的單克隆抗體被視為可增強對腫瘤細胞的免疫細胞介導的殺傷力。抗CA-125抗體或egovomab和abagovomab以及抗EpCAM抗體catumaxomab在II期和III期研究中取得了有前景的結果。與此相反，抗MUC1抗體HMFG1在III期研究中未能明確地提高生存期。
另一種方法使用單克隆抗體來靶向作用於並阻止腫瘤細胞上的生長因子和存活受體。雖然施用曲妥單抗(抗HER2/neu抗體)和MOv18與MORAb-003(抗葉酸受體α抗體)僅對卵巢癌具有有限的臨床益處，但是在標準化療中加入貝伐單抗(抗VEGF抗體)對晚期卵巢癌似乎是有利的。
免疫細胞的過繼轉移實現了臨床試驗中的異質結果。自體、體外增大的腫瘤浸潤性T細胞的過繼轉移在中試試驗中被證明是一種有希望的方法。相反，轉移含有葉酸受體α特異性嵌合抗原受體的T細胞在I期試驗中不會誘導顯著臨床反應。用腫瘤細胞裂解物或腫瘤相關蛋白體外刺激的樹突細胞顯示可在轉移後增強抗腫瘤T細胞反應，但T細胞活化的程度與臨床效果無關。在II期研究中，自然殺傷細胞的轉移造成明顯的毒性。
內在抗腫瘤免疫性以及免疫治療受免疫抑制腫瘤微環境影響。為了克服這個障礙，免疫調節藥物(如環磷醯胺、抗CD25抗體和聚乙二醇化脂質體多柔比星)與免疫療法組合進行了測試。增強T細胞活性的易普利 姆瑪、抗CTLA4抗體目前有最可靠的資料。易普利姆瑪被證明可在卵巢癌患者中產生顯著的抗腫瘤效果(Mantia-Smaldone et al.,2012)。
胰腺癌
胰腺癌患者的治療選擇非常有限。有效治療的一個主要問題是在確診時通常處於腫瘤晚期。此外，胰腺癌對化療藥物相當耐藥，這可能是由緻密和少血管結締組織增生腫瘤基質引起的。
根據德國抗癌協會、德國癌症援助組織和德國科學醫學協會發佈的指導方針，切除腫瘤是唯一可用的有效治療選擇。
疫苗接種策略作為胰腺癌治療的進一步創新和有前途的替代方法進行了研究。靶向作用於KRAS突變、活性端粒酶、胃泌素、存活蛋白、CEA和MUC1已經在臨床試驗中進行評估，部分顯示有希望的結果。此外，針對胰腺癌患者的樹突狀細胞疫苗、異基因GM-CSF分泌疫苗和algenpantucel-L臨床試驗還顯示了免疫療法的有益效果。進一步研究不同疫苗接種方案效率的臨床試驗目前正在進行中(Salman et al.,2013)。
攝護腺癌
攝護腺癌的治療策略主要取決於癌症的分期。基於樹突狀細胞的疫苗sipuleucel-T是FDA批准的第 一個抗癌疫苗。由於其對CRPC患者的生存有積極效果，許多努力被投入到進一步免疫療法的開發上。關於疫苗接種策略，肽疫苗攝護腺特異性抗原(PSA)-TRICOM、個性化肽疫苗PPV、DNA疫苗pTVG-HP以及表達GM-CSF GVAX的全細胞疫苗在不同的臨床試驗中均表現出有希望的結果。此外，除了sipuleucel-T外，基於樹突狀細胞的疫苗，即BPX-101和DCVAC/Pa被證明可引起攝護腺癌患者的臨床反應。免疫步驟抑制劑，如易普利姆瑪(ipilimumab)和nivolumab目前正在臨床研究中作為單一療法以及與其他治療(包括雄激素剝奪療法、局部放射治療、PSA-TRICOM和GVAX)聯合進行評估。在II期臨床試驗中顯著減緩進展和增加無進展生存期的免疫調節物質tasquinimod目前正在III期臨床試驗中進行進一步的研究。另一種免疫調節劑來那度胺在早期臨床研究中誘導出有前途的作用，但在III期臨床試驗中未能改善生存。儘管有這些令人失望的結果，但是來那度胺的進一步試驗正在進行中(Quinn et al.,2015)。
腎細胞癌
初始治療最常見是部分或完全切除患病腎臟，仍然是主要的有效治療方法(Rini et al.,2008)。RCC的已知免疫原性代表了支持在晚期RCC中使用免疫治 療和癌症疫苗的基礎。淋巴細胞PD-1表達和RCC晚期分期、分級和預後以及RCC腫瘤細胞選擇性PD-L1表達之間的有趣相關性以及其與較差臨床結果的潛在關聯性導致新的抗PD-1/PD-L1製劑的開發，單獨使用或與抗血管生成藥物或其他免疫治療方法聯合使用治療RCC(Massari et al.,2015)。在晚期RCC中，一項名為TRIST研究的III期癌症疫苗試驗評估了TroVax(使用腫瘤相關抗原5T4的疫苗，含痘病毒載體)加入到一線標準治療後是否延長局部晚期或mRCC患者的生存期。兩組均未達到平均生存期，399名患者(54%)繼續參加研究，但是資料分析證實了之前的臨床效果，這表明TroVax具有免疫活性，5T4-特異性抗體反應強度與生存期改善存在相關性。另外，有幾項研究尋找在RCC中過度表達的使用表位的肽疫苗。
腫瘤疫苗的各種方法已在研究中。採用全腫瘤方法(包括腫瘤細胞裂解物，與腫瘤細胞的樹突狀細胞融合體或整個腫瘤RNA)的研究在RCC患者中完成，在一些試驗中報告了腫瘤病灶的緩解(Avigan et al.,2004；Holtl et al.,2002；Marten et al.,2002；Su et al.,2003；Wittig et al.,2001)。
小細胞肺癌
小細胞肺癌(SCLC)的治療和預後強烈地依賴確診癌症分期。免疫療法是癌症治療的過度研究領域。對 於SCLC的治療研究了各種方法。其中一種方法靶向阻斷CTLA-4，這是一種天然的人免疫抑制物。CTLA-4的抑制旨在增強對抗癌症的免疫系統。最近，開始研發用於治療SCLC的有前景的免疫步驟抑制劑。另一種方法基於防癌疫苗，這是目前可用於臨床研究的SCLC治療方法(American Cancer Society,2015；National Cancer Institute,2015)。
急性髓性白血病
急性髓性白血病(AML)的一種治療選擇是用抗體-藥物偶聯物(抗CD33+calechiamicin、SGN-CD33a、抗CD33+錒-225)、雙特異性抗體(識別CD33+CD3(AMG 330)或CD33+CD16)和嵌合抗原受體(CAR)靶向作用CD33(Estey,2014)。
非霍奇金淋巴瘤
非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治療取決於組織類型和分期(National Cancer Institute,2015)：在淋巴瘤患者中可觀察到腫瘤自發消退。因此，主動免疫療法是一種治療選擇(Palomba,2012)。
一種重要的疫苗接種方案包括Id疫苗。B淋巴細胞表達在其重鏈和輕鏈可變區以特定的氨基酸序列表達表面免疫球蛋白，每個細胞克隆都是獨特的(=個體基因型，Id)。個體基因型作為腫瘤相關抗原。
被動免疫包括單獨注射重組鼠抗-Id單克隆抗體或與干擾素α、IL2或苯丁酸氮芥聯合使用。
主動免疫包括注射偶聯至佐劑(KLH)的重組蛋白(Id)，其與GM-CSF一起作為免疫佐劑給予。腫瘤特異性Id透過雜交瘤培養物或使用重組DNA技術(質粒)透過細菌、昆蟲或哺乳動物細胞培養物產生。
已經進行了三項III期臨床試驗(Biovest、Genitope、Favrille)。在兩項試驗中，患者接受了利妥昔單抗。所有三項試驗均給予GM-CSF。Biovest使用了雜交瘤產生的蛋白質，Genitope和Favrille使用了重組蛋白。在所有三項試驗中，Id均偶聯至KLH。只有Biovest獲得有意義的結果。
除了Id之外的疫苗包括癌睾丸抗原MAGE、NY-ESO1和PASD-1、B細胞抗原CD20或細胞疫苗。最新提及的包括凋亡腫瘤細胞脈衝處理的DC、腫瘤細胞裂解物、DC-腫瘤細胞融合物或腫瘤衍生RNA脈衝處理的DC。
原位接種涉及使用腫瘤內CpG與化療或在出現GM-CSF和收集/擴展/再灌注T細胞情況下生長的照射腫瘤細胞聯合進行免疫接種。
採用可改變免疫檢查點的抗體進行接種包括抗CD40、抗OX40、抗41BB、抗CD27、抗GITR(直接增強抗腫瘤反應的激動劑抗體)或抗PD1、抗CTLA-4(阻斷會妨礙免疫應答的檢查點的阻滯抗體)。 實例為易普利姆瑪(抗CTLA-4)和CT-011(抗PD1)(Palomba,2012)。
子宮癌
子宮內膜癌的治療與分期相關。多數子宮內膜癌包括良好至中度分化的子宮內膜腺癌，其在診斷時通常局限於子宮體並且可以透過全子宮切除術治癒(World Cancer Report,2014)。
宮頸癌的治療也取決於分期。在早期階段，切除是標準治療，也可能與放療(化療)結合治療。在有淋巴結浸潤或腫瘤不能切除的病例中，較晚期別(III期及以上)時主要選擇放(化)療治療。
目前也正在測試一些免疫治療方法。在一項I/II期臨床試驗中，子宮癌患者採用Wilms腫瘤基因1(WT1)mRNA電穿孔的自體樹突狀細胞(DC)接種。除了一例對佐劑局部過敏反應的病例，沒有觀察到不良反應，6名患者中有3名表現出免疫應答(Coosemans et al.,2013)。
如上所述，HPV感染引發的病變可能最終導致宮頸癌。因此，在高度病變和癌症中組成性表達且是惡性表型發生和維持所需的HPV病毒癌蛋白E6和E7被視為免疫治療方法的有前景的靶標(Hung et al.,2008；Vici et al.,2014)。一項研究在轉移性宮頸癌患者中進行了過繼T細胞療法(ACT)。患者接受E6和E7反應性 腫瘤浸潤性T細胞(TIL)輸注，9名患者中，2名完全消退，1名有部分反應(Stevanovic et al.,2015)。此外，根據報告，靶向作用於E7的細胞內抗體可阻止小鼠腫瘤生長(Accardi et al.,2014)。此外，靶向作用於HPV E6和E7的肽、DNA和基於DC的疫苗也在臨床試驗中進行研究(Vici et al.,2014)。
膽囊腺癌及膽管癌
由於診斷困難，膽管癌發現時大多數是晚期。膽管癌難以治療，通常是致命的。
膽囊癌是世界範圍內最常見和侵襲性最強的膽道惡性腫瘤。
膀胱癌
膀胱癌的標準治療包括手術、放射療法、化學療法和免疫療法。
在第0和I期，膀胱癌的治療方法通常進行經尿道切除術，之後可能進行膀胱內化療或與BCG(卡介苗)膀胱免疫治療相結合。
一種有效的免疫治療方法在治療侵襲性非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)中得到確定。由此，一種弱化形式的細菌牛型分枝桿菌(卡介苗=BCG)作為一種膀胱內解決方案。BCG治療的主要作用很長期(長達10年)阻止癌症復發並降低進展率。原則上，用BCG治療可誘導 局部炎症反應，其刺激細胞免疫應答。BCG免疫應答基於以下關鍵步驟：透過BCG感染尿路上皮和膀胱癌細胞，之後增加抗原呈遞分子的表達，透過細胞因子釋放介導而誘導免疫應答，透過各種免疫細胞(細胞毒性T淋巴細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞)的參與誘導抗腫瘤活性(Fuge et al.,2015；Gandhi et al.,2013)。
BCG治療一般患者耐受性良好，但是特別對於免疫缺陷患者可能是致命的。約30-40%的患者中觀察到了BCG的難治性(Fuge et al.,2015；Steinberg et al.,2016a)對於BCG療法失敗的患者，治療具有挑戰性。BCG治療失敗的患者存在發生肌層浸潤性疾病的高風險。根治性膀胱切除是無應答者優選的治療選擇(Steinberg et al.,2016b；von Rundstedt and Lerner,2015)。對於希望保留膀胱的患者，FDA批准的BCG失敗NMIBC二線治療為戊柔比星化學治療。其他一些二線療法目前可獲得或正在研究中，包括免疫治療方法，如BCG-干擾素聯合或BCG-檢查點抑制劑治療，前BCG透皮疫苗接種，草分枝桿菌細胞壁核酸(MCNA)複合物，單獨化療或配合各種藥物如像絲裂黴素C、吉西他濱、多西他賽、白蛋白結合型紫杉醇、表柔比星聯合化療，絲裂黴素/吉西他濱，吉西他濱/多西他賽，以及裝置輔助化療如熱化療、放化療、電療或光動力療法(Fuge et al.,2015；Steinberg et al.,2016b；von Rundstedt and Lerner,2015)。仍然需要在臨床試驗中進一步評估現有的治療。
對於晚期膀胱癌的替代治療方案在正在進行的臨床試驗中進行研究。目前的臨床試驗集中于分子靶向療法和免疫療法的開發。靶向療法研究致癌相關途徑抑制劑(即mTOR、血管內皮、成纖維細胞或表皮生長因子受體、抗血管生成或細胞週期抑制劑)在治療膀胱癌中的效果。由於膀胱癌的高度因子多樣性，因此，分子靶向治療的開發仍具有挑戰性。當前免疫治療的主要焦點是開發檢查點阻斷劑，如抗PD1單克隆抗體和過繼T細胞轉移(Knollman et al.,2015b；Grivas et al.,2015；Jones et al.,2016；Rouanne et al.,2016)。
頭頸部鱗狀細胞癌
頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)是異構腫瘤，其流行病學、病因和治療均具有差異(Economopoulou et al.,2016)。
HNSCC被視為是一種免疫抑制疾病，其特徵在於免疫活性細胞和受損細胞因子分泌的失調(Economopoulou et al.,2016)。HPV陰性和HPV陽性腫瘤的免疫治療策略不同。
對於HPV陽性腫瘤，病毒癌蛋白E6和E7代表著良好的靶標，這是因為他們連續地透過腫瘤細胞中表達，對於保持HPV陽性癌細胞的轉化狀態必不可少。 幾種疫苗療法目前正在HPV陽性HNSCC中進行研究，包括DNA疫苗、肽疫苗和涉及樹突狀細胞(DC)的疫苗。此外，正在進行的II期臨床試驗在HPV陽性腫瘤患者中研究了淋巴細胞耗竭繼而自體輸注TIL的療效(Economopoulou et al.,2016)。
在HPV陰性腫瘤中，目前正在使用和研究幾種免疫治療策略。嵌合IgG1抗EGFR單克隆抗體西妥昔單抗已被FDA批准用於組合化療，作為復發/轉移性HNSCC的標準一線治療。其他的抗EGFR單克隆抗體(包括帕尼單抗、尼妥珠單抗和紮妥木單抗)在HNSCC中進行了評估。一些免疫檢查點抑制劑在HNSCC的用途在臨床試驗中進行了研究。他們包括以下抗體：易普利姆瑪(抗CTLA-4)、tremelimumab(抗CTLA-4)、pembrolizumab(抗PD-1)、nivolumab(抗PD-1)、durvalumab(抗PD-1)、抗KIR、urelumab(抗CD137)和抗LAG-3。
HNSCC患者的兩項臨床研究評估了載有p53肽或凋亡腫瘤細胞的DC的用途。免疫應答令人滿意的，副作用可以接受。
數項研究使用了過繼性T細胞療法(ACT)進行。T細胞被誘導對抗任何輻照的自體腫瘤細胞或EB病毒。疾病控制和總生存率結果是看好的(Economopoulou et al.,2016)。
考慮到嚴重的副作用及與治療癌症相關的費用，有必要確定可用於總體上治療癌症，尤其是治療肝細胞癌(HCC)、結直腸癌(CRC)、膠質母細胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腎細胞癌(RCC)、良性攝護腺增生(BPH)、攝護腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、梅克爾細胞癌(MCC)、小細胞肺癌(SCLC)、非何傑金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、膽囊癌和膽管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、子宮癌(UEC)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)的因子。通常也有必要確定代表癌症生物標誌物的因子，尤其是上述癌症類型，從而更好地診斷癌症、評估預後和預測治療成功性。
癌症免疫治療代表了癌症細胞特異性靶向作用的一個選項，同時最大限度地減少副作用。癌症免疫療法利用存在的腫瘤相關抗原。
腫瘤相關抗原(TAA)的目前分類主要包括以下幾組：
a)癌-睾丸抗原：T細胞能夠識別的最先確認的TAA屬於這一類抗原，由於其成員表達于組織學相異的人腫瘤中、正常組織中、僅在睾丸的精母細胞/精原細胞中、偶爾在胎盤中，因此，它最初被稱為癌-睾丸(CT)抗原。由於睾丸細胞不表達HLA I類和II類分子，所以，在正常組織中，這些抗原不能被T細胞識別，因此在免 疫學上可考慮為具有腫瘤特異性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成員和NY-ESO-1。
b)分化抗原：腫瘤和正常組織(腫瘤源自該組織)都含有TAA。大多數已知的分化抗原發現於黑色素瘤和正常黑色素細胞中。許多此類黑色素細胞譜系相關蛋白參與黑色素的生物合成，因此這些蛋白不具有腫瘤特異性，但是仍然被廣泛用於癌症的免疫治療。例子包括，但不僅限於，黑色素瘤的酪氨酸酶和Melan-A/MART-1或攝護腺癌的PSA。
c)過量表達的TAA：在組織學相異的腫瘤中以及許多正常組織中都檢測到了基因編碼被廣泛表達的TAA，一般表達水準較低。有可能許多由正常組織加工和潛在提呈的表位低於T細胞識別的閾值水準，而它們在腫瘤細胞中的過量表達能夠透過打破先前確立的耐受性而引發抗癌反應。這類TAA的典型例子為Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。
d)腫瘤特異性抗原：這些獨特的TAA產生于正常基因(如β-catenin、CDK4等)的突變。這些分子變化中有一些與致瘤性轉化和/或進展相關。腫瘤特異性抗原一般可在不對正常組織帶來自體免疫反應風險的情況下誘導很強的免疫反應。另一方面，這些TAA在多數情況下只與其上確認了有TAA的確切腫瘤相關，並且通常在許多個體腫瘤之間並不都共用TAA。在含有腫瘤特定(相關)同種型蛋白的情況下，如果肽源自腫 瘤(相關)外顯子也可能出現肽腫瘤特異性(或相關性)。
e)由異常翻譯後修飾產生的TAA：此類TAA可能由腫瘤中既不具有特異性也不過量表達的蛋白產生，但其仍然具有腫瘤相關性(該相關性由主要對腫瘤具有活性的翻譯後加工所致)。此類TAA產生於變糖基化模式的改變，導致腫瘤產生針對MUC1的新型表位或在降解過程中導致諸如蛋白拼接的事件，這可能具有也可能不具有腫瘤特異性。
f)腫瘤病毒蛋白：這些TTA是病毒蛋白，可在致癌過程中發揮關鍵作用，並且由於它們是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能夠激發T細胞反應。這類蛋白的例子有人乳頭狀瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它們在宮頸癌中表達。
基於T細胞的免疫治療靶向作用于主要組織相容性複合體(MHC)分子提呈的來源於腫瘤相關蛋白或腫瘤特異性蛋白的肽表位。腫瘤特異性T淋巴細胞所識別的抗原，即其表位，可以是源自所有蛋白類型的分子，如酶、受體、轉錄因子等，它們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比，其表達通常上調。
MHC分子有兩類：MHC I類和MHC II類。MHC I類分子由一條α重鏈和β-2-微球蛋白，MHC II類分子由一條α和一條β鏈組成。其三位構造形成一個結合槽，用於與肽進行非共價相互作用。
大部分有核細胞上都可發現MHC-I類分子。他們提呈主要為內源性的蛋白、缺陷核糖體產物(DRIP)和較大肽裂解生成的肽。然而，源自內體結構或外源性來源的肽也經常在MHC-I類分子上發現。這種I-類分子非經典提呈方式在文獻中被稱為交叉提呈(Brossart and Bevan,1997；Rock et al.,1990)。MHC II類分子主要發現于專業抗原提呈細胞(APC)上，並且主要提呈，例如，在內吞作用過程中由APC佔據並且隨後被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。
肽和MHC I類的複合體由負載相應T細胞受體(TCR)的CD8陽性T細胞進行識別，而肽和MHC II類分子的複合體由負載相應TCR的CD4陽性輔助T細胞進行識別。因此，TCR、肽和MHC按照1：1：1的化學計量呈現，這一點已是共識。
CD4陽性輔助T細胞在誘導和維持CD8陽性細胞毒性T細胞的有效反應中發揮重要作用。腫瘤相關抗原(TAA)衍生的CD4陽性T細胞表位的識別對開發能引發抗腫瘤免疫反應的藥物產品可能非常重要(Gnjatic et al.,2003)。在腫瘤部位，T輔助細胞維持著對細胞毒性T細胞(CTL)友好的細胞因子環境(Mortara et al.,2006)並吸引效應細胞，如CTL、天然殺傷(NK)細胞、巨噬細胞和粒細胞(Hwang et al.,2007)。
在沒有炎症的情況下，MHC II類分子的表達主要局限於免疫系統細胞，尤其是專業抗原提呈細胞 (APC)，例如，單核細胞、單核細胞源性細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。在癌症患者的腫瘤細胞中發現有MHC II類分子的表達(Dengjel et al.,2006)。
本發明的拉長肽可作為MHC-II類活性表位。
MHC-II類表位活化的輔助T細胞在編排抗腫瘤免疫的CTL效應子功能中發揮著重要作用。觸發TH1細胞反應的輔助T細胞表位支援CD8陽性殺傷T細胞的效應子功能，其中包括直接作用於腫瘤細胞的細胞毒性功能(該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關肽/MHC複合體)。這樣，腫瘤相關T輔助細胞表位單獨使用或與其他腫瘤相關肽結合使用可作為刺激抗腫瘤免疫反應的疫苗化合物的活性藥物成分。
哺乳動物(如小鼠)模型顯示，即使沒有CD8陽性T淋巴細胞，CD4陽性T細胞也能透過分泌干擾素-γ(IFN γ)抑制血管生成而足以抑制腫瘤的表現(Beatty and Paterson,2001；Mumberg et al.,1999)。沒有CD4T細胞作為直接抗腫瘤效應因子的證據(Braumuller et al.,2013；Tran et al.,2014)。
由於HLA II類分子的組成性表達通常僅限於免疫細胞，因此，直接從原發腫瘤中分離II類肽之前被認為是不可能的事。然而，Dengjel等人成功地在腫瘤中直接識別了多個MHC II類表位(WO 2007/028574,EP 1 760 088 B1)。
由於CD8依賴型和CD4依賴型這兩種反應共同並協同地促進抗腫瘤作用，因此，確定和表徵由CD8+ T細胞(配體：MHC I類分子+肽表位)或CD4陽性T輔助細胞(配體：MHC II類分子)識別的腫瘤相關抗原對開發腫瘤疫苗非常重要。
對於MHC I類肽觸發(引發)細胞免疫反應的肽，它也必須與MHC分子結合。這一過程依賴於MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態性。MHC-I類-結合肽的長度通常為8-12個氨基酸殘基，並且在其與MHC分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基(「錨」)。這樣，每個MHC的等位基因都有「結合基序」，從而確定哪些肽能與結合溝槽特異性結合。
在MHC-I類依賴性免疫反應中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些MHC-I類分子結合，而且它們之後還必須能被T細胞負載的特異性T細胞受體(TCR)識別。
對於被T淋巴細胞識別為腫瘤特異性抗原或相關性抗原以及用於治療的蛋白質，必須具備特殊的條件。該抗原應主要由腫瘤細胞表達，而不由正常健康組織表達，或表達數量相對較少。在一個優選的實施方案中，與正常健康組織相比，所述肽應在腫瘤細胞中過度提呈。更為適宜的情況是，該相應抗原不僅出現於一種腫瘤中，而且濃度(即每個細胞的相應肽拷貝數目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原往往是源自直接參與因細胞週期控 制或凋亡抑制中的其功能而發生的正常細胞向腫瘤細胞轉化的蛋白。另外，這些直接導致轉化事件的蛋白的下游靶標可能會被上調，因此可能與腫瘤間接相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標(Singh-Jasuja et al.,2004)。至關重要的是，表位存在於抗原氨基酸序列中，以確保這種來自腫瘤相關抗原的肽(「免疫原性肽」)可導致體外或體內T細胞反應。
基本上，任何能與MHC分子結合的肽都可能充當一個T細胞表位。誘導體外或體內T細胞反應的前提是存在具有相應TCR的T細胞並且不存在對該特定表位的免疫耐受性。
因此，TAA是基於T細胞療法(包括但不限於腫瘤疫苗)研發的起點。識別和表徵TAA的方法通常基於對患者或健康受試者T細胞的使用情況，或基於腫瘤與正常組織肽之間差別轉錄特性或差別表達模式的產生。然而，對腫瘤組織或人腫瘤細胞株中過量表達或選擇性表達的基因的識別並不提供在免疫療法中使用這些基因所轉錄抗原的準確資訊。這是因為，有著相應TCR的T細胞必須要存在而且對這個特定表位的免疫耐受性必須不存在或為最低水準，因此，這些抗原的表位只有一部分適合這種應用。因此，在本發明的一非常優選的實施例中，只選擇那些針對可發現功能性和/或增殖性T細胞情況的過量提呈或選擇性提呈肽，這一點非常重要。這種功能性T細 胞被定義為在以特異性抗原刺激後能夠克隆地擴展並能夠執行效應子功能(「效應子T細胞」)的T細胞。
在透過根據本發明的特定TCR(例如可溶性TCR)和抗體或其他結合分子(支架)靶向作用於肽-MHC的情況下，潛在肽的免疫原性是次要的。在這些情況下，提呈是決定因素。
在本發明的第一方面，本發明涉及一種肽，包含選自包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的組的一個氨基酸序列、或該序列的與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388具有至少77%，優選至少88%同源(優選至少77%或至少88%相同)的一種變體序列(其中所述變體與MHC結合和/或誘導T細胞與所述肽發生交叉反應)，或其藥用鹽(其中所述肽不是潛在全長多肽)。
雖然作為癌症治療靶標的肽最重要的標準是其在原發腫瘤組織中相比于正常組織過度提呈，但是，相應基因的RNA表達譜也可有助於選擇適當的肽。特別是，由於它們的化學性質或在細胞上的低拷貝數，部分肽很難透過質譜檢測，側重於肽提呈檢測的篩選方法可能無法識別這些靶標。然而，這些靶標可透過另一種方法來檢測，開始分析正常組織的基因表達，其次評估腫瘤肽提呈和基因表達。這種方法在發明中使用mRNA資料庫(Lonsdale,2013)結合進一步的基因表達資料(包括 腫瘤樣本)以及肽提呈資料實現。如果一個基因的mRNA在正常組織中幾乎不存在，特別是在重要器官系統中不存在，透過很有效的策略(例如雙特異性親和力優化的抗體或T細胞受體)靶向作用於相應肽更可能是安全的。雖然此類肽僅在一小部分腫瘤組織中被發現，但其代表了令人關注的靶標。常規質譜分析不夠敏感，無法在肽水準上評估靶標範圍。相反，腫瘤mRNA表達可用於評估靶標範圍。為了檢測肽本身，比在常規篩選中敏感度更高的靶向質譜方法可能是必要的，並可能更好地在肽提呈水準上評估靶標範圍。
本發明進一步涉及本發明的一種肽，包含選自包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的組的一個序列、或與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388具有至少77%、優選至少88%同源性(優選為至少77%或至少88%相同)的一種變體，其中所述肽或其變體的總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至14個氨基酸。
下表顯示了根據本發明的肽、它們各自的SEQ ID NO、以及這些肽的可能源(潛在)基因。表1A和表2A中的所有肽均與HLA-A*02結合。表1C和表2B中的所有肽均與HLA-A*24結合。表1B中的肽與HLA-II類等位基因結合。表3中的肽是與HLA-A*24結合並可與本發明其他肽組合使用的其他肽。
表1A：與HLA-A*02結合的本發明肽
Figure 110107429-A0202-12-0035-561
Figure 110107429-A0202-12-0036-562
Figure 110107429-A0202-12-0037-563
表1B：與HLA-II類結合的本發明肽。
Figure 110107429-A0202-12-0037-564
表1C：與HLA-A*24類結合的本發明肽。
Figure 110107429-A0202-12-0038-587
Figure 110107429-A0202-12-0039-566
Figure 110107429-A0202-12-0040-567
Figure 110107429-A0202-12-0041-568
Figure 110107429-A0202-12-0042-569
Figure 110107429-A0202-12-0043-570
表2A：與HLA-A*02結合的本發明其他肽
Figure 110107429-A0202-12-0043-571
Figure 110107429-A0202-12-0044-572
表2B：與HLA-A*24結合的本發明其他肽
Figure 110107429-A0202-12-0044-573
Figure 110107429-A0202-12-0045-574
表3：用於癌症療法(例如個性化癌症療法)的本發明肽
Figure 110107429-A0202-12-0045-575
Figure 110107429-A0202-12-0046-576
本發明還一般涉及本發明的肽用於治療增殖性疾病，例如，腦膠質細胞瘤(GB)、乳腺癌(BRCA)、結直腸癌(CRC)、腎細胞癌(RCC)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、肝細胞癌(HCC)、非小細胞和小細胞肺癌(NSCLC、SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、卵巢癌(OC)、胰腺癌(PC)、攝護腺癌(PCA)、包括胃食管交界癌(OSCAR)的食管癌、膽囊癌和膽管癌(GBC、CCC)、黑色素瘤(MEL)、胃癌(GC)、睾丸癌(TC)、膀胱癌(UBC)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、子宮癌(UEC)。
特別優選的是本發明的肽(單獨或組合)，其選自包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的組團。更優選的是所述肽(單獨或組合)選自包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：295的組團(見表1A、B、C)並且其用於免疫治療腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細 胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌或子宮癌。
特別優選的是本發明的肽(單獨或組合)，其選自包括SEQ ID NO：770、80、323和325的組團。更優選的是所述肽(單獨或組合)選自包括SEQ ID NO：770、80、323和325的組團，並且其用於免疫治療腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌或子宮癌。
特別優選的是本發明的肽(單獨或組合)，其選自包括SEQ ID NO：391和403的組團。更優選的是所述肽(單獨或組合)選自包括SEQ ID NO：391和403的組團，並且其用於免疫治療腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌或子宮癌。
如示實施例1所示，其中本發明的許多肽也發現於各種類型腫瘤中，因此也可用於各種適應症的免疫治療。如實施例2所示，潛在肽在各種癌症中過度表達提示在各種其他腫瘤適應症中這些肽的有用性。
因此，本發明的另一個方面涉及本發明中肽的用途-優選聯合用於治療選自腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌或子宮癌組中的增殖性疾病。
本發明還涉及本發明的肽，其具有與主要組織相容性複合體(MHC)I或以拉長形式存在的例如長度變化的-MHC-II類分子結合的能力。
本發明進一步涉及本發明中的肽，其中所述肽(每種肽)系由或基本系由根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的一個氨基酸序列組成。
本發明進一步涉及本發明的肽，其中所述肽被修飾和/或包含非肽鍵。
本發明進一步涉及本發明的肽，其中所述肽為融合蛋白的一部分，特別是與HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的N-端氨基酸融合，或與抗體(例如，樹突狀細胞特定抗體)或抗體的序列融合。
本發明的另一實施方案涉及一種非天然肽，其中所述肽系由或基本系由根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：48的一個氨基酸序列組成，並經合成產生(即，合成)為一種藥用鹽。合成產生肽的方法是本領域公知的。本發明肽的鹽與其體內狀態的肽顯著不同，因為這些體內產生的肽不是鹽。該肽的非天然鹽形式介導肽的溶解度，特別是包含所述肽的藥物組合物的情況下，例如，本文所公開的肽疫苗。為了向需要治療的受試者有效地提供肽，需要肽具有充分、至少基本的溶解度。優選地，鹽為肽的藥用鹽。本發明的這些鹽包括堿和堿土鹽類，諸如Hofmeister系列的鹽，包含陰離子PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、Cl-、Br-、NO3 -、ClO4 -、I-、SCN-和陽離子NH4 +、Rb+、K+、Na+、Cs+、Li+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+和Ba2+。特別地，鹽選自(NH4)3PO4、(NH4)2HPO4、(NH4)H2PO4、(NH4)2SO4、NH4CH3COO、NH4Cl、NH4Br、NH4NO3、NH4CIO4、NH4I、NH4SCN、Rb3PO4、Rb2HPO4、RbH2PO4、Rb2SO4、Rb4CH3COO、Rb4Cl、Rb4Br、Rb4NO3、Rb4CIO4、Rb4I、Rb4SCN、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、K2SO4、KCH3COO、KCl、KBr、KNO3、KClO4、KI、KSCN、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、Na2SO4、NaCH3COO、NaCl、NaBr、NaNO3、NaCIO4、NaI、NaSCN、ZnCI2Cs3PO4、Cs2HPO4、CsH2PO4、 Cs2SO4、CsCH3COO、CsCl、CsBr、CsNO3、CsCIO4、CsI、CsSCN、Li3PO4、Li2HPO4、LiH2PO4、Li2SO4、LiCH3COO、LiCl、LiBr、LiNO3、LiClO4、LiI、LiSCN、Cu2SO4、Mg3(PO4)2、Mg2HPO4、Mg(H2PO4)2、Mg2SO4、Mg(CH3COO)2、MgCl2、MgBr2、Mg(NO3)2、Mg(ClO4)2、MgI2、Mg(SCN)2、MnCl2、Ca3(PO4),、Ca2HPO4、Ca(H2PO4)2、CaSO4、Ca(CH3COO)2、CaCl2、CaBr2、Ca(NO3)2、Ca(ClO4)2、CaI2、Ca(SCN)2、Ba3(PO4)2、Ba2HPO4、Ba(H2PO4)2、BaSO4、Ba(CH3COO)2、BaCl2、BaBr2、Ba(NO3)2、Ba(ClO4)2、BaI2和Ba(SCN)2。特別優選為NH乙酸、MgCl2、KH2PO4、Na2SO4、KCl、NaCl和CaCl2，例如：氯化物或乙酸酯(三氟乙酸)鹽。
一般來說，肽和變體(至少含氨基酸殘基之間的肽聯接)可使用Lukas等人(Lukas et al.,1981)以及此處引用的參考文獻所披露的固相肽合成Fmoc-聚醯胺模式進行合成。芴甲氧羰基(Fmoc)團對N-氨基提供臨時保護。使用N,N-二甲基甲醯胺中的20%二甲基呱啶中對這種堿高度敏感的保護基團進行重複裂解。由於它們的丁基醚(在絲氨酸蘇氨酸和酪氨酸的情況下)、丁基酯(在谷氨酸和天門冬氨酸的情況下)、叔丁氧羰基衍生物(在賴氨酸和組氨酸的情況下)、三苯甲基衍生物 (在半胱氨酸的情況下)及4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺醯基衍生物(在精氨酸的情況下)，側鏈功能可能會受到保護。只要穀氨醯胺和天冬醯胺為C-末端殘基，側鏈氨基功能保護所使用的是由4,4'-二甲氧基二苯基團。固相支撐基於聚二甲基丙烯醯胺聚合物，其由三個單體二甲基丙烯醯胺(骨架單體)、雙丙烯醯乙烯二胺(交聯劑)和N-丙烯醯肌胺酸甲酯(功能劑)構成。使用的肽-樹脂聯劑為酸敏感的4-羥甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作為其預製對稱酸酐衍生物加入，但是天冬醯胺和穀氨醯胺除外，它們使用被逆轉的N,N-二環己基碳二亞胺/1-羥基苯並三唑介導的耦合程序而加入。所有的耦合和脫保護反應用茚三酮、硝基苯磺酸或isotin測試程序監測。合成完成後，用濃度為95%含50%清道夫混合物的三氟醋酸，從伴隨去除側鏈保護基團的樹脂支承物中裂解肽。常用的清道夫混合物包括乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，準確的選擇依據合成肽的氨基酸組成。此外，固相和液相方法結合使用對肽進行合成是可能的(例如，請參閱(Bruckdorfer et al.,2004)以及本文引用的參考文獻)。
三氟乙酸用真空中蒸發、隨後用承載粗肽的二乙基乙醚滴定進行去除。用簡單萃取程序(水相凍乾後，該程序制得不含清道夫混合物的肽)清除任何存在的清道夫混合物。肽合成試劑一般可從Calbiochem-Novabiochem(英國諾丁漢)獲得。
純化可通過以下技術的任何一種或組合方法進行，如：再結晶法、體積排阻色譜法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法以及(通常)反相高效液相色譜法(如使用乙腈/水梯度分離)。
本發明進一步涉及一種核酸，其編碼本發明的肽。本發明進一步涉及一種本發明的核酸，為DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能為其組合物。
本發明進一步涉及一種能表達和/或表達本發明核酸的表達載體。
本發明進一步涉及本發明的一種肽、本發明的一種核酸或本發明的一種治療疾病的藥用表達載體，特別是用於治療癌症。
本發明進一步涉及本發明中肽或本發明中所述肽複合體(含有MHC)的特定抗體以及製造這些抗體的方法。
本發明進一步涉及本發明的T細胞受體(TCR)，特別是可溶性TCR(sTCRs)和加工為自體或異體T細胞的克隆TCR，以及製造這些TCR的方法和載有所述TCR或所述TCR交叉反應的NK細胞的製造方法。
抗體和TCR是根據本發明的肽現有免疫治療用途的另外實施方案。
本發明進一步涉及含本發明核酸或前述表達載體的一種宿主細胞。本發明進一步涉及本發明的宿主細胞，其為抗原提呈細胞，優選為樹突細胞。
本發明進一步涉及配製本發明一種肽的一種方法，所述方法包括培養本發明的宿主細胞和從所述宿主細胞或其培養基中分離肽。
本發明進一步涉及本發明中的所述方法，其中抗原透過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達於合適抗原提呈細胞或人工抗原呈遞細胞表面的I或II類MHC分子。
本發明進一步涉及本發明的方法，其中抗原提呈細胞由能表達含SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.388、優選為含SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.295所述肽的一個表達載體、或一個變體氨基酸序列組成。
本發明進一步涉及以本發明方法製造的活化T細胞，其中所述T細胞有選擇性地識別一種細胞，該細胞表達含一種本發明氨基酸序列的多肽。
本發明進一步涉及一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發明任何氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者按本發明方法製造的有效量T細胞。
本發明進一步涉及任何所述肽、本發明的核酸、本發明的表達載體、本發明的細胞、本發明的作為藥劑或製造藥劑的活化T淋巴細胞、T細胞受體或抗體或其他肽- 和/或肽-MHC結合分子的用途。所述藥劑優選為具有抗癌活性。
優選情況為，所述藥劑為基於可溶性TCR或抗體的細胞治療藥物、疫苗或蛋白質。
本發明還一般涉及本發明的用途，其中所述癌細胞為腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌或子宮癌。
本發明進一步涉及一種基於本發明肽的生物標誌物，在此成為「靶標」，其可用於診斷癌症，優選為腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌或子宮癌。所述標誌物可以肽本身過度提呈或相應基因過度表達。標誌物也可以用於預測治療成功的可能性，優選為免疫療法，最優選為靶向作用於該生物標誌物識別的相同靶標的免疫療法。例如，抗體或可溶性TCR可用於染色腫瘤切片以檢測是否存在相關肽與MHC複合。
或者，抗體具有進一步的效應子功能，如免疫刺激域或毒素。
本發明還涉及這些癌症治療中新靶點的用途。
針對其他癌性疾病的治療和診斷用途在本發明肽的基礎表達產物(多肽)的以下描述中進行披露。
A4GNT在胰腺癌細胞中頻繁表達，但在外周血細胞中並非如此，外周血單核細胞部分中A4GNT mRNA表達的定量分析將有助於檢測胰腺癌(Ishizone et al.,2006)。當癌細胞局限于胃黏膜時，A4GNT mRNA可在80%早期胃癌患者中檢測到，A4GNT mRNA的表達水準增加與腫瘤進展相關(Shimizu et al.,2003)。
ABCC2在原發性輸卵管癌中的上調表達與較差預後相關(Halon et al.,2013)。
在人類癌症中，ADAM10上調，其水準一般與腫瘤進展和不良結局的參數相關。在臨床前模型中，ADAM10的選擇性抑制劑已被證明在減少腫瘤生長的現有療法中具有協同作用(Duffy et al.,2009)。
AHCYL2被證明在結腸癌和一部分肺癌組織中下調(Lleonart et al.,2006)。AHCYL2的mRNA表達被描述為可能與p53功能控制以及ras-MAPK途徑、甲基化和轉錄細胞程序相關，因此，AHCYL2可能是涉及人類結腸和肺腫瘤的調節抑制基因(Lleonart et al.,2006)。
AKR1C1在宮頸癌、卵巢癌和肺癌細胞中起著順鉑的抗性作用，其包括線粒體膜去極化、產生ROS和活化JNK途徑(Chen et al.,2015)。對新輔助化療有反應者與無反應者相比，發現AKR1C1在前者的瘤內水準顯著更高(Hlavac et al.,2014)。
AKR1C3的表達被證明與攝護腺癌的Gleason評分升高呈正相關，這表明AKR1C3可以作為攝護腺癌進展的一個有前途的生物標誌物(Tian et al.,2014)。AKR1C3被證明可催化4-雄甾烯-3,17-二酮還原為睾酮，雌酮還原為17 β雌二醇，從而分別促進激素依賴性攝護腺癌和乳腺癌的增殖(Byrns et al.,2011)。AKR1C3被證明在乳腺癌、攝護腺癌和皮膚鱗狀細胞癌中上調(Byrns et al.,2011；Mantel et al.,2014)。AKR1C3被證明是基因標籤內的一個標誌物，其能夠辨別局部晚期直腸癌患者放化療後有反應者和無反應者(Agostini et al.,2015)。AKR1C3透過腫瘤抑制因子PTEN喪失來活化抗凋亡PTEN/Akt途徑被證明與人乳腺癌中的多柔比星抗性有關(Zhong et al.,2015)。AKR1C3被證明與暴露於燃煤排放的中國縣域肺癌患者的較高風險相關(Li et al.,2015a)。AKR1C3被描述為絨毛膜癌的一個潛在治療標誌物，也與該病的甲氨蝶呤抗性發生有關(Zhao et al.,2014a)。
研究顯示ALDH1L1的表達在HCC和腦膠質瘤中下調。ALDH1L1在上述癌症中的下調與較差的預後和更具侵襲性的表型相關(Chen et al.,2012；Rodriguez et al.,2008)。
與正常組織相比，ALOX15以高水準存在於攝護腺癌(PCa)、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤和結腸腺癌中(Kelavkar et al.,2002)。ALOX15酶活性有助於PCa的發生和發展(Kelavkar et al.,2007)。
AR牽涉各種癌症的發生，如攝護腺癌、去勢抵抗攝護腺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、結腸癌和胃癌(Wang et al.,2009b；Yu et al.,2015b；Mehta et al.,2015；Wang et al.,2015a；Sukocheva et al.,2015)。除了促進攝護腺癌的增殖，透過AR的雄激素信令經由誘導p21(WAF1/CIP1，一種細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑)的表達導致細胞凋亡(Yeh et al.,2000)。
ARMC5突變導致皮質醇結節產瘤、雙側結節樣增生、原發性腎上腺結節增生和腦膜瘤(Espiard and Bertherat,2015；Kirschner and Stratakis,2016；Elbelt et al.,2015)。
藥物基因組學研究顯示，ATAD5和抗癌藥物之間存在相互關係(Abaan et al.,2013)。ATAD5在惡性神經鞘瘤中顯著上調(Pasmant et al.,2011)。B型肝炎病毒X蛋白顯著增強ATAD5在HBV相關 肝癌中的表達(Ghosh et al.,2016)。ATAD5損失可導致小鼠胚胎死亡，它充當小鼠和人類的腫瘤抑制因子，並與人範可尼貧血途徑組件交互作用。此外，它可能負責一些與神經纖維瘤病(一種遺傳性疾病，伴有腫瘤生長的高風險)相關的表型(Gazy et al.,2015；Jenne et al.,2001)。ATAD5基因位點的變體與上皮性卵巢癌風險相關(Kuchenbaecker et al.,2015)。ATAD5具有非小細胞肺癌中至少一種哺乳動物表型上的支座(Li et al.,2014)。
ATP10B的表達在高度侵襲性膠質瘤細胞中失調，並于侵襲行為相關(Tatenhorst et al.,2004)。
ATP8B4可能是多發性骨髓瘤患者和其他實體中的預後標誌物和治療靶標(美國專利號20070237770 A1)(Ni et al.,2012)。
ATR編碼ATR絲氨酸/蘇氨酸激酶，其屬於PI3/PI4激酶家族。在口腔鱗癌細胞系中觀察到ATR基因的拷貝數增加、擴增或易位(Parikh et al.,2014)。已經證實，子宮內膜癌截斷ATR突變與降低無病和總體生存下降相關(Zighelboim et al.,2009)。
B3GNT5在急性髓性白血病和小鼠胚胎癌中過度表達，其表達與膠質母細胞瘤的啟動子甲基化呈負相關(Ogasawara et al.,2011；Etcheverry et al.,2010；Wang et al.,2012)。B3GNT5透過miRNA-203的下調可能促進下咽鱗狀細胞癌的惡性程 度(Wang et al.,2015g)。B3GNT5與乳腺癌患者的存活相關(Potapenko et al.,2015)。
在淋巴瘤、乳腺癌、胃癌和攝護腺癌子集中Bub1表達增加。Bub1過度表達與不良臨床預後相關(Ricke and van Deursen,2011)。Bub1突變可發現於顯示出染色體不穩定的結直腸癌中(Williams et al.,2007)。
C4A被描述為多囊卵巢綜合症和子宮內膜癌的生物標誌物，實驗資料表明，C4可介導癌症生長(Galazis et al.,2013；Rutkowski et al.,2010)。
在急性單核細胞白血病細胞系JIH3中，染色體缺失包括C7orf10(Pan et al.,2012)。
C8由人肝癌細胞系HepG2組成性表達，在細胞因子IL-6、IFN-γ和IL-1 β刺激後表達大度增強(Scheurer et al.,1997)。
睾丸癌抗原特異性引物可檢測多形性膠質母細胞瘤(惡性程度最高和侵襲性最強的腫瘤之一，預後很差)中的CASC5。CASC5在N-末端(針對Bub1和BubR1)和C-末端(針對Zwint-1和hMis14/hNsl1)有特異性結合基序。此連接的破壞可導致腫瘤發生(Kiyomitsu et al.,2011；Jiang et al.,2014c)。CASC5與腫瘤抑制因子pRb相互作用(Bogdanov and Takimoto,2008)。CASC5在增殖體細胞、腫 瘤和健康人睾丸中高度表達(Bogdanov and Takimoto,2008；Sasao et al.,2004)。CASC5與細胞生長抑制和成熟增強關聯，其破壞可能是白血病形成的關鍵因素(Hayette et al.,2000；Bogdanov and Takimoto,2008；Chinwalla et al.,2003；Kuefer et al.,2003；Yang et al.,2014a)。
CCR4被描述為各種腫瘤的預後標誌物，如腎細胞癌、頭頸部鱗狀細胞癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌和霍奇金淋巴瘤(Ishida et al.,2006；Olkhanud et al.,2009；Yang et al.,2011；Tsujikawa et al.,2013；Al-haidari et al.,2013；Liu et al.,2014a)。研究顯示，有CCR4陽性腫瘤的胃癌患者與有CCR4陰性腫瘤的患者相比預後明顯較差(Lee et al.,2009a)。
CCR8表達在尿路上皮和腎癌患者的外周血中的單核細胞和粒髓樣細胞亞群中增加。在人膀胱和腎癌組織內也檢測到CCR8表達上調，主要限於腫瘤相關巨噬細胞。CCL1/CCR8軸是癌症相關炎症的一個組成部分，並可能有助於免疫逃避(Eruslanov et al.,2013)。
CD101中的單核苷酸多態性被證明與胰腺癌風險相關，但結果在攝護腺癌病例對照和同組列人口中不能被複製，因此，需要未來的研究查明CD101在胰腺癌中的可能作用(Reid-Lombardo et al.,2011)。CD101被確定為6基因標籤中的一個基因，其使用貝葉 斯模型平均方法鑒別慢性期和原始細胞慢性髓細胞性白血病(Oehler et al.,2009)。
CD84被描述為CD抗原，相比於減緩進展和穩定的慢性淋巴細胞白血病，其在進行性慢性淋巴細胞白血病中差異化豐富表達(Huang et al.,2014)。CD84表達被證明從慢性淋巴細胞性白血病的早期階段開始顯著升高(Binsky-Ehrenreich et al.,2014)。
CENPE表達與膠質瘤級別顯著相關，可能為神經膠質瘤患者預測生存時間補充其他參數(Bie et al.,2011)。與化療敏感腫瘤相比，CENPE在化療耐藥卵巢上皮性腫瘤中上調(Ju et al.,2009)。CENPE在浸潤性和侵襲-浸潤性垂體泌乳素瘤中上調(Wierinckx et al.,2007)。
CLDN14被證明在胃癌中上調(Gao et al.,2013)。CLDN14表達被證明與胃癌淋巴轉移有關(Gao et al.,2013)。CLDN14被描述為在小鼠腫瘤血管完整性和血管生成中具有調節作用(Baker et al.,2013)。
CLDN3在許多人類腫瘤中高度差異化表達，可提供有效的分子工具來特異性識別和靶向作用於生物侵襲性人體癌細胞，因為CLDN3是產氣莢膜梭菌腸毒素的高親和力受體(Black et al.,2015)。CLDN3在幾種瘤中頻繁過度表達，包括卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和攝護腺癌(Morin,2005)。CLDN3被確定為攝護腺 癌生物標誌物，因為它在攝護腺癌中高度表達(Amaro et al.,2014)。CLDN3表達下降與完全切除的肺鱗癌預後不良和EMT相關(Che et al.,2015)。CLDN3透過Wnt-EMT信令抑制癌症侵襲性，是肝細胞癌潛在的預後生物標誌物(Jiang et al.,2014b)。
CLDN4在許多人類腫瘤中高度差異化表達，可提供有效的分子工具來特異性識別和靶向作用於生物侵襲性人體癌細胞，因為CLDN4是產氣莢膜梭菌腸毒素的高親和力受體(Black et al.,2015)。CLDN4在幾種瘤中頻繁過度表達，包括卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和攝護腺癌(Morin,2005)。針對CLDN4胞外域的抗體在膀胱癌中有親化療作用(Kuwada et al.,2015)。CLDN4高表達與更加差異化的腸型胃癌有關，並在低分化彌漫型胃癌中缺失。CLDN4低表達與淋巴管生成有關(Shareef et al.,2015)。
CLDN6表達被證明與非小細胞肺癌的淋巴結轉移和TNM分期有關(Wang et al.,2015f)。此外，CLDN6低表達被證明與非小細胞肺癌患者的顯著降低的存活率有關(Wang et al.,2015f)。因此，CLDN6低表達是一個獨立的預後生物標誌物，提示非小細胞肺癌患者的預後較差(Wang et al.,2015f)。CLDN6被證明在宮頸癌和胃癌中下調(Zhang et al.,2015；Lin et al.,2013)。CLDN6被證明在BRCA1相關乳腺癌和卵巢乳頭狀漿液性癌中上調(Wang et al.,2013b； Heerma van Voss et al.,2014)。CLDN6被描述為乳腺癌的腫瘤抑制因子(Zhang et al.,2015)。宮頸癌細胞系HeLa和C33A中CLDN6表達增加被證明可在抑制細胞增殖、體外集落形成、體內腫瘤生長，這表明CLDN6可充當宮頸癌細胞中的腫瘤抑制因子(Zhang et al.,2015)。CLDN6可能在卵巢癌的侵襲和轉移中起著積極作用(Wang et al.,2013b)。CLDN6被證明在生殖細胞瘤中始終如一地表達，因此，是原始生殖細胞腫瘤的新型診斷標誌物(Ushiku et al.,2012)。CLDN6表達被證明在接受評估的一組非典型畸胎瘤/中樞神經系統橫紋肌樣瘤大部分腫瘤中呈陽性，且CLDN6呈強陽性，是疾病結局的潛在的獨立預後因子(Dufour et al.,2012)。
CLDN9被證明在轉移性Lewis肺癌細胞系p-3LL中、由這些細胞衍生的腫瘤中以及垂體嗜酸細胞瘤中上調(Sharma et al.,2016；Hong et al.,2014)。轉移性Lewis肺癌p-3LL細胞中CLDN9表達的敲減被證明可導致運動性、體外侵襲性和體內轉移顯著降低，而在這些細胞中暫態過度表達被證明可提高他們的運動性(Sharma et al.,2016)。因此，CLDN9可能在促進肺癌轉移中起重要作用(Sharma et al.,2016)。CLDN9被證明在宮頸癌組織中下調(Zhu et al.,2015a)。CLDN9表達被發現與宮頸癌淋巴轉移有關(Zhu et al.,2015a)。CLDN9被描述為垂體嗜酸細 胞瘤中突變和上調最顯著的基因，與非侵襲性嗜酸細胞瘤相比，在侵襲性嗜酸細胞瘤中表達水準較高(Hong et al.,2014)。因此，CLDN9可能是侵襲性垂體嗜酸細胞瘤的重要生物標誌物(Hong et al.,2014)。CLDN9在胃癌細胞系AGS中的過度表達被證明可提高侵襲能力、細胞遷移和增殖速度，因此足以增強胃癌細胞系的致瘤性(Zavala-Zendejas et al.,2011)。與腸型胃腺癌相比，CLDN9強表達被證明與彌漫型胃腺癌的較高死亡率相關，檢測值被描述為「腸型」和「彌漫型」胃腺癌一個有用的預後指標(Rendon-Huerta et al.,2010)。
CLEC5A mRNA表達被證明在原發性急性髓細胞白血病患者的樣本中比健康供體的巨噬細胞和粒細胞中明顯降低(Batliner et al.,2011)。CLEC5A被描述為單核細胞/巨噬細胞和粒細胞中腫瘤抑制因子PU.1的一個新轉錄靶標(Batliner et al.,2011)。
DCP2被確定為miR-224靶標，在甲氨蝶呤抗性人結腸癌細胞中差異表達超過2倍(Mencia et al.,2011)。
DCSTAMP表達在乳頭狀甲狀腺癌中增加(Lee et al.,2009b；Kim et al.,2010b)。DCSTAMP下調導致MCF-7細胞集落形成降低，可能的原因是增殖和細胞週期進展下降以及細胞凋亡增加(Zeng et al.,2015)。DCSTAMP在外周巨噬細胞中 過度表達，樹突狀細胞和骨髓瘤漿細胞顯示出對DCSTAMP的高敏感性並能夠轉分化成破骨細胞。表達癌幹細胞表型的惡性漿細胞和高轉移性能力表達破骨細胞標誌物，其活化導致ERK1/2磷酸化和骨吸收活性活化的β 3轉錄途徑(Silvestris et al.,2011)。七葉亭和白菊抑制c-Fos和活化T細胞c1信號傳導途徑的核因子，導致抑制DCSTAMP表達，這是破骨細胞分化的標誌物基因(Ihn et al.,2015；Baek et al.,2015；Cicek et al.,2011；Courtial et al.,2012；Kim et al.,2014a)。
DENND1B的SNP與胰腺癌風險顯著相關(Cotterchio et al.,2015)。
DNAH17，也稱為DNEL2，被描述為黑色素瘤患者中確定的腫瘤抗原的一個同源物(Ehlken et al.,2004)。DNAH17被描述為幾個候選基因之一，他們被映射到與常染色體顯性疾病遺傳神經痛肌萎縮和胼胝症中散發性乳腺癌、卵巢腫瘤、食管癌相關的小染色體間隔(Kalikin et al.,1999)。
DNAH2是在
Figure 110107429-A0202-12-0065-28
10%慢性粒細胞白血病患者中突變的基因之一(Mason et al.,2015)。編碼微管相關蛋白的基因，如DNAH2，在CpG島甲基化表型陽性腎透明細胞癌中顯示有10%或更高的遺傳畸變發生率(Arai et al.,2015)。
透過抑制DNMT3B讓甲基化沉寂腫瘤抑制基因再表達已成為針對癌症的有效策略(Singh et al.,2013)。
FAM83B mRNA表達在鱗狀細胞癌中比在正常肺或腺癌中顯著更高，因此，FAM83B是診斷和預後的一種新生物標誌物(Okabe et al.,2015)。FAM83B被確定為參與活化CRAF/MAPK信號和驅動上皮細胞轉化的癌基因。表達升高與腫瘤分級升高和總生存率降低有關(Cipriano et al.,2014)。FAM83B表達升高還活化PI3K/AKT信號傳導途徑，並對PI3K、AKT和mTOR抑制劑敏感度降低(Cipriano et al.,2013)。
由於基因突變導致的FANCD2下調和功能障礙在不同癌症類型中報告過，包括乳腺癌、急性淋巴性白血病和睾丸精原細胞瘤，並與癌症發展有關。另外，FANCD2再次表達和上調被證明與膠質瘤和結直腸癌的腫瘤進展和轉移有關(Patil et al.,2014；Shen et al.,2015a；Shen et al.,2015b；Ozawa et al.,2010；Rudland et al.,2010；Zhang et al.,2010a；Smetsers et al.,2012)。PI3K/mTOR/Akt途徑促進FANCD2誘導ATM/Chk2檢查點作為DNA損傷應答，並且單泛素化FANCD2活化腫瘤抑制因子TAp63的轉錄(Shen et al.,2013；Park et al.,2013)。
FOXJ1表達上調，與腫瘤分期、組織學分級和大小有關，並與透明細胞腎細胞癌患者預後相關(Zhu et al.,2015b)。FOXJ1表達下降與臨床分期、淋巴結轉移及遠處轉移顯著相關，較低的FOXJ1表達獨立預測胃癌生存期較短(Wang et al.,2015c)。FOXJ1過度表達可促進肝細胞癌的腫瘤細胞增殖和細胞週期過渡，並與組織學分級和較差預後相關(Chen et al.,2013)。
高GINS2轉錄水準預測較差預後，透過乳腺癌患者的乳腺癌幹細胞與高組織學分級及內分泌治療耐藥相關(Zheng et al.,2014)。據報告，GINS2以高水準存在於肺腺癌中，並與TNM分期相關(Liu et al.,2013b)。GINS2在許多惡性實體腫瘤(如乳腺癌、黑色素瘤和肝細胞癌)中大量異常表達。此外，GINS2過度表達可促進白血病細胞系的增殖(Zhang et al.,2013a)。
相對于正常組織，GPR98在原發性神經內分泌腫瘤中表達增加(Sherman et al.,2013)。GPR98是與多形性膠質母細胞瘤存活相關的基因之一(Sadeque et al.,2012)。GPR98顯示由糖皮質激素調節的轉錄物，糖皮質激素用於急性淋巴細胞白血病，因為它們導致細胞凋亡的誘導(Rainer et al.,2012)。
GTPBP10與膠質母細胞瘤的拷貝數變異、基因表達和患者轉歸相關(Kong et al.,2016)。
GTSE1表達抑制了凋亡信令，並導致胃癌細胞的順鉑耐藥(Subhash et al.,2015)。GTSE1在子宮平滑肌肉瘤(ULMS)中過度表達並參與細胞週期調控。
H2BFS一貫表達為與低風險急性淋巴細胞白血病亞組相關的重要簇群(Qiu et al.,2003)。
HIST1H2BJ被證明在腦腫瘤中下調，並描述為可用于開發有診斷或預後價值的分子標誌物(Luna et al.,2015)。
HISTH4A乙醯化可能是滅活胚胎腎細胞癌(Wilms腫瘤)的潛在靶標(Yan-Fang et al.,2015)。
HIST1H4C可作為治療相關骨髓性白血病發生的風險區別因子(Bogni et al.,2006)。
HIST1H4F被發現在攝護腺癌中超甲基化，這也可能與患者的老化相關(Kitchen et al.,2016)。
HIST1H4K高甲基化率發現于高級別無肌層浸潤性膀胱癌以及攝護腺癌中，因此代表著一種潛在的生物標誌物(Payne et al.,2009；Kachakova et al.,2013)。
結果表明，HIST1H4L在ERG+攝護腺癌中顯著上調(Camoes et al.,2012)。HIST1H4L編碼複製依賴組蛋白簇1-H4L，這是組蛋白H4家族的一員(RefSeq,2002)。
HIST2H4B被確定為是感染了呼腸孤病毒亞型的細胞中關鍵細胞致病途徑的新蛋白，在目前臨床試驗中作為抗癌溶瘤劑(Berard et al.,2015)。
HIST4H4是以下的基因之一：這些基因顯示在使用由特異性靶向作用於表達突變d9-E-鈣黏蛋白的細胞的α-發射體和單克隆抗體d9Mab組成的免疫偶聯物治療後在胃癌細胞中連續下調(Seidl et al.,2010)。組蛋白H4家族其他成員的超甲基化與I期非小細胞肺癌較短的無復發生存期顯著相關(Sandoval et al.,2013)。
HIVEP1被確定為透過淋巴瘤細胞系中人類T淋巴細胞病毒1型融合破壞的細胞基因(Cao et al.,2015)。HIVEP1與11q不良缺失相關，還與慢性淋巴細胞性白血病的不良Binet階段B和C相關(Aalto et al.,2001)。
HNRNPH2在不同癌症類型(包括胰腺癌、肝癌和胃癌)中上調(Honore et al.,2004；Zeng et al.,2007)。HNRNPH2參與hTERT的β-缺失轉錄物的剪接，這在癌細胞中高度表達和競爭，從而抑制內源性端粒酶活性(Listerman et al.,2013)。
HOXD11在頭頸部鱗狀細胞癌中失調，在細胞系和患者腫瘤樣本中顯示出極高的水準。HOXD11敲減降低了侵襲性(Sharpe et al.,2014)。HOXD11在口腔鱗狀細胞癌中顯著上調(Rodini et al.,2012)。 HOXD11在人乳腺癌中異常甲基化(Miyamoto et al.,2005)。HOXD11基因融合至含有t(2；11)(q31；p15)的急性髓性白血病中的NUP98基因(Taketani et al.,2002)。
ICOS作為T細胞上程序性死亡-1(PD-1)的配體，誘導癌細胞的免疫逃逸，也充當介導對腫瘤細胞抗凋亡作用的受體(Yang et al.,2015c)。小鼠腫瘤模型為腫瘤生長期間涉及ICOS的多個免疫檢查點的靶向作用提供了重要支援(Leung and Suh,2014)。ICOS+細胞浸潤與患者的不良預後相關，識別ICOS為癌症免疫治療的新靶標(Faget et al.,2013)。ICOS能在體外和體內增強針對膽管癌的細胞因子誘導殺傷細胞的細胞毒性作用(He et al.,2011)。
IFNG瘤內表達被證明與MHCII類分子表達及其在人黑色素瘤中更具侵襲性的表型相關(Brocker et al.,1988)。自分泌IFNG信令被證明可增強IFNG基因轉染哺乳動物腺癌細胞的實驗性轉移能力，並可提高對NK細胞的抗性(Lollini et al.,1993)。
與預後不良標誌物相關的IGFBP3在三陰性乳腺癌中高表達(Marzec et al.,2015)。特異性結合至IGFBP3的一種新型細胞死亡受體被確定，並可用於乳腺癌的治療(Mohanraj and Oh,2011)。IGFBP3顯示出體外的促生存和促生長特性(Johnson and Firth,2014)。IGFBP3是尿路上皮細胞癌復發的獨立標誌物(Phe et al.,2009)。
IGFBPL1是胰島素生長因子的調節因子，因異常超甲基化在乳腺癌細胞系下調。IGFBPL1甲基化與較差的總生存率和無病生存率明顯相關(Smith et al.,2007)。
IGFLR1在結直腸癌中突變(Donnard et al.,2014)。IGFLR1具有與腫瘤壞死因子受體家族相似的結構(Lobito et al.,2011)。
IL4I1蛋白表達在腫瘤中非常頻繁。IL4I1在不同腫瘤實體的腫瘤相關巨噬細胞、淋巴瘤腫瘤細胞中檢測到，在罕見情況下，在實體癌(主要間皮瘤)中檢測到(Carbonnelle-Puscian et al.,2009)。人Th17細胞中IL4I1上調透過阻斷參與IL-2啟動子活化的分子途徑和維持高水準的Tob1限制了它們的T細胞受體(TCR)介導擴張，這影響進入細胞週期(Santarlasci et al.,2014)。
IQGAP3在肺癌中過度表達，與腫瘤細胞生長、遷移和侵襲相關。此外，它在肝細胞癌中由染色體擴增上調，IQGAP3表達在p53突變預後差的結直腸癌患者中增加(Katkoori et al.,2012；Yang et al.,2014b；Skawran et al.,2008)。IQGAP3調製所述EGFR/Ras/ERK信號級聯，並與Rac/Cdc42相互作用(Yang et al.,2014b；Kunimoto et al.,2009)。
與正常培養的黑色素細胞和非轉移性黑色素瘤細胞系相比，ITGA2水準升高發現於高度侵襲性和轉移性黑色素瘤細胞系中(van Muijen et al.,1995)。黏附分子ITGA2被黑色素瘤細胞中的IFN-γ、TNF-α和IL-1-β上調(Garbe and Krasagakis,1993)。ITGA2轉染入不表達ITGA2的人橫紋肌肉瘤細胞增強了各器官轉移的頻率(Matsuura et al.,1995)。
KCNU1位於經常參與乳腺癌複雜染色體重排區域中的染色體8p上(Gelsi-Boyer et al.,2005)。KCNU1是兒科癌症樣本肝母細胞瘤中前25位過度表達的細胞外膜蛋白之一(Orentas et al.,2012)。
KIAA0226L被認為是一種腫瘤抑制基因，在宮頸癌中超甲基化。KIAA0226L重新活化導致細胞生長、活力和集落形成下降(Huisman et al.,2015；Eijsink et al.,2012；Huisman et al.,2013)。KIAA0226L的甲基化模式可用於分辨前體病變和正常宮頸癌(Milutin et al.,2015)。KIAA0226L的甲基化模式不可用作宮頸癌的特定生物標誌物(Sohrabi et al.,2014)。KIAA0226L重新活化部分去甲基化其啟動子區域，也降低壓制性組蛋白甲基化(Huisman et al.,2013)。
KIAA1244過度表達是乳腺癌細胞激素相關生長中造成雌激素/雌激素受體α信號傳導途徑活化的 重要機制之一(Kim et al.,2009)。KIAA1244和PHB2相互作用的抑制可能是管腔型乳腺癌的一種新治療策略(Yoshimaru et al.,2013)。
KIAA1524編碼蛋白磷酸酶2A的癌抑制劑(CIP2A)。CIP2A的一個重要角色在NSCLC、HCC、HNSCC、膀胱癌、胰腺癌、宮頸癌、乳腺癌、攝護腺癌、卵巢癌和結直腸癌中已得到證明(Ventela et al.,2015；Ma et al.,2014；Guo et al.,2015b；Rincon et al.,2015；Guo et al.,2015c；Wu et al.,2015；Peng et al.,2015；Lei et al.,2014；Liu et al.,2014c；Farrell et al.,2014；Fang et al.,2012；He et al.,2012；Bockelman et al.,2012)。
KIF18A被證明在肝細胞癌中過度表達，這與較短的無病生存期和總生存率相關。因此，KIF18A可能是肝癌診斷的生物標誌物，並且是手術切除後無病生存和總生存的獨立預測因子(Liao et al.,2014)。KIF18A表達在滑膜肉瘤特定亞型中上調(Przybyl et al.,2014)。雌激素強烈誘導乳腺癌的KIF18A表達，這與增殖增加和細胞凋亡減少相關(Zou et al.,2014)。
在胰腺導管腺癌、黑色素瘤、膀胱癌、非小細胞肺癌和膽管細胞癌中檢測到KIF20A過度表達(Imai et al.,2011；Yamashita et al.,2012；Stangel et al.,2015)。最近，據報告，用KIF20A衍生肽接種的 胰腺導管腺癌患者與對照組相比，表現出更好的預後(Asahara et al.,2013)。此外，KIF20A的沉寂導致抑制胰腺癌細胞系的增殖、運動性和侵襲性(Stangel et al.,2015)。
乳腺癌中KIF26B的高表達與較差預後相關(Wang et al.,2013c)。KIF26B上調與腫瘤大小顯著相關，可用於分析CRC腫瘤組織和癌旁正常黏膜。KIF26B在結直腸癌發生中起著重要作用，並充當CRC的一種新型預後指標和潛在的治療靶點(Wang et al.,2015d)。
KIF2C被證明參與腫瘤細胞的定向遷移和侵襲(Ritter et al.,2015)。KIF2C過度表達被證明與胃癌和結直腸癌患者的淋巴浸潤和淋巴結轉移相關(Ritter et al.,2015)。KIF2C被證明在口腔舌癌中上調(Wang et al.,2014a)。KIF2C高表達被證明與口腔舌鱗狀細胞癌的淋巴結轉移和腫瘤分期相關(Wang et al.,2014a)。KIF2C的沉寂被證明可導致人口腔鱗狀細胞癌細胞系Tca8113的增殖和遷移抑制(Wang et al.,2014a)。KIF2C突變被描述為與結直腸癌相關(Kumar et al.,2013)。
KIFC1被證明是獨立來自大量形成的中心體(正常或多餘中心體)的紡錘體正確組裝、穩定極聚焦和癌細胞生存所需要的。KIFC1表達被證明在乳腺癌，特別是雌激素受體陰性、孕激素受體陰性和三陰性乳腺癌和 8個人乳腺癌細胞系中上調。在雌激素受體陽性乳腺癌細胞中，KIFC1是由雌激素強烈誘導表達的其他19種動力蛋白之一。在乳腺癌中，KIFC1過度表達及其核積累被證明與組織學分級有關，並可預測較差的無進展和總生存期。在乳腺癌細胞系中，KIFC1過度表達被證明可介導對多西他賽的抗性。KIFC1沉寂負面影響乳腺癌細胞生存力(Zou et al.,2014；Pannu et al.,2015；De et al.,2009；Li et al.,2015b)。KIFC1被證明在卵巢癌中過度表達，其與腫瘤侵襲性、晚期腫瘤分級和分期相關。KIFC1被確定為三種基因之一，其在原發性NSCLC腫瘤中高表達提示發生腦轉移的風險較高(Grinberg-Rashi et al.,2009)。
KL被描述為一種腫瘤抑制因子，其抑制宮頸癌中上皮至間質的轉變，並透過抑制胰島素/IGF1、p53/p21和Wnt信號充當幾種類型人類癌症的腫瘤抑制因子(Xie et al.,2013；Qureshi et al.,2015)。在許多癌症(包括乳腺癌、肺癌和肝細胞癌)中，KL被描述為一個異常表達基因(Zhou and Wang,2015)。KL被描述為在胰腺癌、肝細胞癌和其他腫瘤中下調(Zhou and Wang,2015)。KL被描述為癌症的一個新生物標誌物，其下調被描述為可導致促進增殖和減少癌細胞凋亡。在此背景下，Wnt/β-連環蛋白信號是幾個相關信號通路之一(Zhou and Wang,2015)。KL基因多 態性被證明與結直腸癌的風險增加有關(Liu et al.,2015)。
KLHDC7B與宮頸鱗狀細胞癌相關，是宮頸鱗狀細胞癌的一個潛在生物標誌物(Guo et al.,2015a)。
KLHL基因負責幾種孟德爾疾病並與癌症相關(Dhanoa et al.,2013)。
在源自指甲基質角質的侵襲性指甲細胞癌中觀察到KRT31局灶性表達(Wang et al.,2015e)。毛母質瘤是模擬毛囊基質細胞分化的腫瘤，顯示出皮質分化，順序性過度表達KRT35和KRT31角蛋白(Battistella et al.,2014)。
KRT35是毛母質瘤中最常和最強烈表達的毛髮角蛋白中的一個。毛母質瘤是模擬毛囊基質細胞分化的腫瘤，顯示出皮質分化，順序性過度表達KRT35和KRT31角蛋白(Battistella et al.,2014)。
LCTL的敲減使hTERT穩定人結腸上皮細胞(Kim et al.,2011)。
研究人員觀察到，透過RNA干擾或透過顯性負突變體抑制LRBA表達導致癌細胞的生長抑制。這些發現提示，LRBA表達失調促進癌細胞生長特性的改變(Wang et al.,2004)。
與正常樣本相比，LRRC8E在骨肉瘤和神經母細胞瘤組織中過度表達(Orentas et al.,2012)。
LTA多態性導致癌症風險增加(Huang et al.,2013a)。如LTA等骨吸收因子由某些實體和血液癌產生，也與腫瘤誘導超鈣血症相關(Goni and Tolis,1993)。LTA至LtbetaR信號軸和癌症之間存在關聯(Drutskaya et al.,2010)。B細胞衍生的淋巴毒素促成去勢抗性攝護腺癌(Ammirante et al.,2010)。
MACC1在許多癌症實體中，包括胃癌、結直腸癌、肺癌和乳腺癌中過度表達，並與癌症的進展、轉移和患者生存期差有關(Huang et al.,2013b；Ma et al.,2013a；Stein,2013；Wang et al.,2015b；Wang et al.,2015h；Ilm et al.,2015)。MACC1透過靶向作用於β-連環蛋白和PI3K/AKT信號通路促進致癌作用，從而導致增加c-Met和β-連環蛋白和其下游靶基因包括c-Myc、細胞週期蛋白D1、胱天蛋白酶9、BAD和MMP9(Zhen et al.,2014；Yao et al.,2015)。
MAGEA10編碼MAGE家族成員A10，其牽涉某些遺傳性疾病，如先天性角化不良(RefSeq,2002)。透過針對MAGEA10的疫苗和另外兩種癌症-睾丸抗原(所有這些都是已知的細胞毒性T淋巴細胞應答靶標)，將涵蓋三分之二以上的乳腺癌(Taylor et al.,2007)。MAGEA10在36.7%的肝細胞癌患者腫瘤組織中表達，但是在癌旁組織中不表達(Chen et al.,2003)。在79種肺癌組織中，MAGEA10表達於14%的這些組織中(Kim et al.,2012)。
MAGEB6被確定為在正常組織(睾丸除外)中不表達而在不同組織學來源的腫瘤中表達的新MAGE基因(Lucas et al.,2000)。MAGEB6被發現在頭頸部鱗狀細胞癌中頻繁表達，mRNA陽性表現出與不良結局公認的臨床特點顯著相關(Zamuner et al.,2015)。
MCC與β-連環蛋白相互作用，MCC在結腸癌細胞重新表達特異性抑制Wnt信號(Fukuyama et al.,2008)。MCC基因與5號染色體上的腺瘤性結腸息肉病基因密切聯繫，5號染色體是結直腸癌中雜合性(LOH)頻繁缺失的區域(Kohonen-Corish et al.,2007)。MCC基因的LOH可在早期和晚期階段的胃癌、肺癌、食管癌和乳腺癌中找到(Wang et al.,1999a；Medeiros et al.,1994)。
MET被證明在去分化脂肪肉瘤中上調，並且與黑素細胞瘤、肝細胞癌、非小細胞肺癌、遺傳性乳頭狀腎癌和胃腺癌相關(Petrini,2015；Finocchiaro et al.,2015；Steinway et al.,2015；Bill et al.,2015；Yeh et al.,2015)。
MMP10在口腔鱗狀細胞癌中表達密集，在疣狀癌中表達中度(Kadeh et al.,2015)。MMP10有助於肝癌形成，與基質衍生因子1/C-X-C趨化因子受體4軸產生新的串擾(Garcia-Irigoyen et al.,2015)。幽門螺桿菌感染透過增加MMP10的表達提升胃癌的侵襲性和轉移(Jiang et al.,2014a)。MMP10 透過宮頸腫瘤血管生成和細胞凋亡途徑的調節促進腫瘤進展(Zhang et al.,2014)。
術前MMP-13升高被發現與食管鱗狀細胞癌患者的腫瘤進展和較差預後差相關(Jiao et al.,2014)。PAI-1(miR-143靶基因)透過增強人骨肉瘤細胞中的MMP-13表達和分泌調節侵襲性和肺轉移，這表明這些分子可能是預防骨肉瘤患者肺轉移的潛在治療靶基因(Hirahata et al.,2016)。MMP13在口腔扁平苔蘚(OLP)中上調，OLP被歸類為口腔鱗狀細胞癌(OSCC)的癌前疾病(Agha-Hosseini and Mirzaii-Dizgah,2015)。MMP-13在成骨細胞樣細胞再生中可能發揮獨特的生理作用(Ozeki et al.,2016)。
MUC5AC在多種癌症類型(包括結直腸癌、胃癌、肺癌和胰腺癌)中失調。結直腸癌和胃癌中表達損耗或低表達與更侵襲性的行為和較差預後相關。在肺癌中過度表達導致復發和轉移的可能性增加(Yonezawa et al.,1999；Kocer et al.,2002；Kim et al.,2014b；Yu et al.,1996)。
MUC5B在不同癌症實體(包括結直腸癌、肺癌和乳腺癌中)過度表達，並與腫瘤進展相關(Sonora et al.,2006；Valque et al.,2012；Walsh et al.,2013；Nagashio et al.,2015)。MUC5B可在甲基化的影響下被抑制，並且由ATF-1、c-Myc、NF κ B、 Sp1、CREB、TTF-11和GCR調節(Perrais et al.,2001；Van,I et al.,2000)。
根據報告，MUC6基因變異可改變胃癌發生的風險(Resende et al.,2011)。在涎腺腫瘤中，MUC6的表達方式似乎與組織病理學腫瘤類型非常密切相關，提示他們可用於提高診斷的準確性(Mahomed,2011)。研究發現，與非腫瘤乳腺組織相比，MUC6在乳腺癌組織中差異表達(Mukhopadhyay et al.,2011)。
一項中國的研究確定MXRA5為非小細胞肺癌中第二最常見的突變基因(Xiong et al.,2012)。在結腸癌中，MXRA5被證明過度表達，並可能作為早期診斷和網膜轉移的生物標誌物(Zou et al.,2002；Wang et al.,2013a)。
MYB可透過幾種突變被轉換為致癌轉化蛋白(Zhou and Ness,2011)。MYB被稱為致癌基因，並透過調節關鍵靶基因(如，環氧合酶-2、Bcl-2、BclX(L)和c-Myc)的表達與細胞凋亡、細胞週期控制、細胞生長/血管生成和細胞黏附相關(Ramsay et al.,2003；Stenman et al.,2010)。致癌融合蛋白MYB-NFIB和MYB過度表達發現於唾液腺腺樣囊性癌以及乳腺癌、兒童彌散膠質瘤、急性髓細胞性白血病和胰腺癌(Wallrapp et al.,1999；Pattabiraman and Gonda,2013；Nobusawa et al.,2014；Chae et al.,2015；Marchio et al.,2010)。透過Wnt信 號傳導期間MYB和β-連環蛋白之間的協同作用，MYB與結腸腫瘤發生有關(Burgess et al.,2011)。由於MYB是雌激素信號的直接靶標，因此考慮抗MYB療法來治療ER陽性乳腺癌(Gonda et al.,2008)。
N4BP2在鼻咽癌的發生中發揮潛在作用。與散發鼻咽癌風險相關的兩個不同的單倍型區段存在統計學相關差異。此外，相對于相應正常組織，N4BP2在這些腫瘤組織中過度表達(Zheng et al.,2007)。
在12518名攝護腺癌病例的多期別單純病例全基因組關聯研究中，NAALADL2被確定為與Gleason評分(疾病侵襲性病理學指標)相關的基因座(Berndt et al.,2015)。NAALADL2在攝護腺癌和結腸癌中過度表達，並促進與不良生存相關的遷移前和轉移前表型(Whitaker et al.,2014)。
NCAPG在多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病患者中以及來自血液的白血病細胞或骨髓瘤細胞中下調(Cohen et al.,2014)。NCAPG可能是結直腸癌的多重抗藥性基因(Li et al.,2012a)。NCAPG在嫌色亞型人類細胞癌中高度上調，但在常規人類腎細胞癌中不是這樣(Kim et al.,2010a)。NCAPG上調與黑色素瘤進展相關(Ryu et al.,2007)。NCAPG與葡萄膜黑色素瘤相關相關(Van Ginkel et al.,1998)。NCAPG在不同腫瘤細胞中表現出不同表達(Jager et al.,2000)。
NRK編碼Nik相關激酶，這是可能參與後期胚胎形成中肌動蛋白聚合誘導的JNK活化所需要的蛋白激酶(RefSeq,2002)。NRK活化c-Jun N-末端激酶信號傳導途徑，可能透過絲切蛋白磷酸化參與骨骼肌細胞中肌動蛋白細胞骨架組織的調控(Nakano et al.,2003)。
NUP210被證明是攜帶結直腸癌風險相關多態性的候選基因(Landi et al.,2012)。NUP210被證明在宮頸癌中上調，提示在腫瘤發生的早期階段發揮作用(Rajkumar et al.,2011)。
ORC1被證明在腫瘤衍生細胞系中過度表達，被預測為攝護腺癌以及白血病的生物標誌物(Struyf et al.,2003；Zimmerman et al.,2013；Young et al.,2014)。透過與組蛋白乙醯轉移酶(如HBO1)相互作用，ORC1在乳腺癌中發揮致癌功能(Wang et al.,2010)。
OSCP1中兩個SNP雜合突變的非載體可能是非病毒性肝臟癌敏感性的生物標誌物(Toda et al.,2014)。
OVOL2誘導導致轉移減少的間充質上皮轉化(Roca et al.,2013)。OVOL2抑制c-Myc和Notch1(Wells et al.,2009)。OVOL2在結直腸癌中超甲基化，導致其不能抑制Wnt信令(Ye et al.,2016)。OVOL2過度表達降低細胞遷移和侵襲型，減 少上皮-間質轉化標誌物並抑制轉移(Ye et al.,2016)。OVOL2在結直腸癌中下調，與腫瘤分期呈負相關(Ye et al.,2016)。OVOL2由Wnt信號通路調控(Ye et al.,2016)。
OXTR在原發性小腸和胰腺神經內分泌腫瘤、肺小細胞癌、卵巢癌以及攝護腺癌中顯著過度表達，介導細胞遷移和轉移(Morita et al.,2004；Zhong et al.,2010；Carr et al.,2012；Carr et al.,2013；Pequeux et al.,2002)。但是，OXTR1還具有對上皮、神經或骨來源的腫瘤細胞增殖的抑制作用，這被認為依賴於膜上的受體定位(Cassoni et al.,2004)。
PAPPA表示轉移相關基因，發生於廣泛的癌症類型，如NSCLC和肝細胞癌，這與生長(VEGF和IGF-I)和轉錄因子(NF-κ B p50、NF-κ B p65、HIF-1 α)正相關(Salim et al.,2013；Iunusova et al.,2013；Engelmann et al.,2015)。PAPPA透過調節乳腺癌和卵巢癌細胞的IGF-1信號通路調控有絲分裂進程，它主要發現于原發位置(Boldt and Conover,2011；Loddo et al.,2014；Becker et al.,2015；Iunusova et al.,2014)。
PGAP1在腺癌細胞系AsPC-1中下調(Yang et al.,2016)。
PGR與乳腺癌發生和發展高度相關，其活化MAPK和PI3K/AKT通路以及生長因子受體(GFR) 的表達(Jaiswal et al.,2014；Piasecka et al.,2015)。PGR(除了HER和雌激素受體)充當一種分類因子，幫助區分乳腺癌的三種不同亞型(Safarpour and Tavassoli,2015)。
PLA2G7對乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤和攝護腺癌細胞的脂質代謝有強烈影響，其中酶堵塞導致癌症致病性受損(Vainio et al.,2011a；Massoner et al.,2013；Kohnz et al.,2015)。PLA2G7與攝護腺癌高度相關，因此代表此類癌症的潛在生物標誌物(Vainio et al.,2011b)。
PPP3R1在影響多達10個不同信號通路的肝細胞癌細胞中上調(Zekri et al.,2008)。
PRKDC是子宮內膜異位症相關卵巢癌和乳腺癌中常見的突變基因(Er et al.,2016；Wheler et al.,2015)。在結直腸癌中，與正常組織相比，PRKDC在癌組織中上調。PRKDC高表達的患者表現出較差的總生存期(Sun et al.,2016)。
PSMA7T上調表達發現於轉移性肺癌、去勢後復發攝護腺癌(CRPC)以及原發性結直腸癌中，其增加肝臟轉移的風險(Hu et al.,2008；Hu et al.,2009；Romanuik et al.,2010；Cai et al.,2010)。PSMA7T數量還被證明與雄激素/AR介導的攝護腺腫瘤生長中雄激素受體(AR)反式活化相關(Ogiso et al.,2002)。
據證明，PSMC1能夠影響細胞生長，因此代表攝護腺癌、多發性骨髓瘤和成膠質細胞瘤細胞中的潛在抗癌靶標(Dahlman et al.,2012；Kim et al.,2008)。
RAD18由於其在DNA損傷旁路、複製後修復和同源重組中眾所周知的作用而牽涉腫瘤生成(Ting et al.,2010)。RAD18 Arg302Gln多態性與結直腸癌和非小細胞肺癌的風險相關(Kanzaki et al.,2008；Kanzaki et al.,2007)。RAD18介導對人腦膠質瘤細胞中電離輻射的抗性，RAD18敲減破壞同源重組介導的修復，導致雙鏈斷裂積累增加(Xie et al.,2014)。黑色素瘤組織微陣列表明，與發育不良痣相比，核RAD18表達在原發性和轉移性黑色素瘤中上調(Wong et al.,2012)。
RAD51AP1被證明與放射暴露乳頭狀甲狀腺癌相關(Handkiewicz-Junak et al.,2016)。RAD51AP1擴增被證明與卵巢癌的細胞永生性和較短生存時間相關(Sankaranarayanan et al.,2015)。RAD51AP1被描述通常在腫瘤細胞和組織中過度表達，RAD51AP1功能的破壞表明是腫瘤靶向治療一種有前景的方法(Parplys et al.,2014)。RAD51AP1轉錄被證明由抑癌因子MEN1直接刺激(Fang et al.,2013)。RAD51AP1被證明在肝內膽管癌、頭頸部人乳頭狀瘤病毒陽性鱗狀細胞癌以及相較於散發性乳腺腫 瘤在BRCA1缺陷乳腺腫瘤中上調(Martinez et al.,2007；Martin et al.,2007；Obama et al.,2008)。RAD51AP1抑制被證明可導致肝內膽管癌細胞生長抑制，這表明其參與肝內膽管癌的發展和/或進展(Obama et al.,2008)。
RBM14敲減被證明可阻斷體內照射後多形性膠質母細胞瘤再生長(Yuan et al.,2014)。RBM14被證明在腎細胞癌中下調(Kang et al.,2008)。RBM14被描述為腎癌的一個潛在腫瘤抑制因子，其抑制人腎細胞G(1)-S過渡，並透過下調原癌基因c-myc抑制錨定非依賴性生長和部分抑制異種移植物腫瘤形成(Kang et al.,2008)。RBM14被證明參與PEA3和MCF7人類癌細胞的遷移增強作用(Verreman et al.,2011)。RBM14基因被證明在子集原發性人類癌症(包括非小細胞肺癌、鱗狀細胞皮膚癌和淋巴瘤)中擴增(Sui et al.,2007)。
RBM4參與前體信使RNA的調控剪接機制，抑制各種癌細胞的增殖和遷移(Lin et al.,2014；Wang et al.,2014c)。BBM4活性的失調發現于宮頸癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌和直腸癌(Liang et al.,2015；Markus et al.,2016)。
肝癌患者血清RCOR3水準顯著低於中度慢性B型肝炎、輕度慢性B型肝炎患者(Xue et al.,2011)。
RFWD2下調與胃癌不良預後相關(Sawada et al.,2013)。RFWD2直接與p27相互作用，該相互作用的失調參與腫瘤發生(Choi et al.,2015b；Choi et al.,2015a；Marine,2012)。RFWD2上調與膀胱癌、胃癌和三陰性乳腺癌不良預後相關(Ouyang et al.,2015；Li et al.,2016；Li et al.,2012c)。
RIF1在人乳腺腫瘤中高度表達，編碼DNA修復所需的抗凋亡因子，是癌症治療的潛在靶標(Wang et al.,2009a)。RIF1在維持基因組穩定性的作用已經擴大到包括染色質結構、複製時間和S期內檢查點的調節(Kumar and Cheok,2014)。
在診斷有內臟多中心嬰兒肌纖維瘤病的患者中，發現有RLTPR基因的新純合變體(Linhares et al.,2014)。
RNF24被證明在食管腺癌中上調，在Barrett食管進展為食管腺癌中起著關鍵作用(Wang et al.,2014b)。RNF24被證明根據某些風險因素在口腔鱗狀細胞癌中差異表達(Cheong et al.,2009)。
RPGRIP1L部分透過有絲分裂步驟蛋白Mad2抑制錨定非依賴性生長，並且是人肝細胞癌的候選腫瘤抑制基因(Lin et al.,2009)。
Rt11在成年小鼠肝臟中過度表達導致高度滲透腫瘤形成，在30%分析的人肝細胞癌樣本中檢測到 RTL1過度表達(Riordan et al.,2013)。印跡基因RTL1的轉錄活性在一組32個Wilms細胞瘤中進行了評估，與正常腎組織相比檢測到大量的過度表達(Hubertus et al.,2011)。
SAPCD2(也稱為p42.3或C9orf140)編碼最初發現表達於胃癌但不表達于正常胃黏膜的蛋白(Xu et al.,2007)。SAPCD2在不同癌症實體(包括結直腸癌、胃癌、肝細胞癌和腦癌)中過度表達，SAPCD2高水準與腫瘤進展相關(Sun et al.,2013；Weng et al.,2014；Wan et al.,2014)。在胃癌蛋白調控網路中SAPCD2基因的最佳途徑是Ras蛋、Raf-1蛋白、MEK、MAPK激酶、MAPK、微管蛋白、紡錘體蛋白、著絲粒蛋白和腫瘤(Zhang et al.,2012a；Weng et al.,2014)。
SEMA3A較低表達被證明與較短的總生存期相關，並在頭頸部鱗狀細胞癌患者具有獨立預後重要性(Wang et al.,2016)。SEMA3A過度表達被證明可抑制遷移、侵襲和上皮至間質轉變，部分原因是頭頸部鱗狀細胞癌細胞系中NF-κ B和SNAI2的抑制(Wang et al.,2016)。因此，SEMA3A充當頭頸部鱗狀細胞癌的腫瘤抑制因子，可能是治療這種疾病的新靶標(Wang et al.,2016)。SEMA3A表達被證明與肝細胞癌的轉移顯著負相關(Yan-Chun et al.,2015)。SEMA3A被描述為在許多類型癌症(包括攝護腺癌、乳 腺癌、神經膠質瘤、卵巢癌和胃癌)中下調(Jiang et al.,2015a；Tang et al.,2014)。SEMA3A低表達被證明與胃癌的低分化、血管浸潤、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、高級別TNM分期及預後不良相關(Tang et al.,2014)。SEMA3A被描述為胃癌發生中的候選腫瘤抑制因子和潛在預後生物標誌物(Tang et al.,2014)。
SERPINB10基因的錯義變異被證明具有致瘤性特徵，導致攝護腺癌風險增加(Shioji et al.,2005)。此外，SERPINB10表達在轉移性乳腺腫瘤中顯著上調(Klopfleisch et al.,2010)。
SLC16A14表達水準與無進展生存顯著相關，並提出了上皮性卵巢癌進展的一個新型推定標誌物(Elsnerova et al.,2016)。
SLC18A1在預後不良的神經母細胞瘤腫瘤類型中相較於預後良好者表達降低(Wilzen et al.,2009)。
SLC25A43被確定為透過乳腺癌細胞系中推定的線粒體檢查點作為細胞週期進程和細胞增殖的調節因子(Gabrielson et al.,2016)。SLC25A43影響乳腺癌細胞系藥物暴露後的藥物療效和細胞週期調控(Gabrielson and Tina,2013)。
SLC28A3被證明在胰腺導管腺癌下調(Mohelnikova-Duchonova et al.,2013)。 SLC28A3與接受紫杉醇和吉西他濱化療的轉移性乳腺癌臨床結果、吉西他濱治療的非小細胞肺癌總體生存、基於吉西他濱化放療的胰腺癌的總體生存相關(Li et al.,2012b；Lee et al.,2014b；Marechal et al.,2009)。SLC28A3與慢性淋巴細胞性白血病的氟達拉濱抗性以及T細胞白血病的耐藥性相關(Karim et al.,2011；Fernandez-Calotti et al.,2012)。
SLC2A13在口腔鱗狀細胞癌樣本原代培養物球形成細胞中持續增加，共焦顯微鏡檢查顯示，SLC2A13表達細胞在腫瘤組織局限區域包埋為群集，提示，SLC2A13可能是癌症幹細胞的一個潛在標誌物(Lee et al.,2011)。SLC2A13被確定為與非小細胞肺癌促進和進展有關的基因(Bankovic et al.,2010)。
SLC35A1抑制被證明可減少癌細胞唾液酸化，降低癌細胞的轉移可能性(Maggioni et al.,2014)。
SLC7A11被證明是在W1卵巢癌細胞系的耐藥變種中下調，從而可能在癌細胞藥物抗性中發揮作用(Januchowski et al.,2013)。SLC7A11被描述為可調節腫瘤微環境，導致癌症生長優勢(Savaskan and Eyupoglu,2010)。SLC7A11被描述為參與膠質瘤的神經變性過程(Savaskan et al.,2015)。SLC7A11被證明在鐵死亡的情況下透過p53抑制， p53-SLC7A11軸被描述為保留於p53(3KR)突變體，並有助於其在不存在經典腫瘤抑制機制時抑制腫瘤發生(Jiang et al.,2015b)。SLC7A11被描述為系統Xc-的功能性亞基，其功能在侵襲性乳腺癌細胞中增加(Linher-Melville et al.,2015)。順鉑耐藥性膀胱癌中SLC7A11高膜染色被證明與較差的臨床結果相關，並且SLC7A11抑制被描述為本病一種有前景的治療方法(Drayton et al.,2014)。SLC7A11被證明在已被暴露於苯和其代謝物的人早幼粒白血病細胞系HL-60中差異表達，因而強調了SLC7A11與白血病發生的潛在關聯性(Sarma et al.,2011)。SLC7A11破壞被描述為可導致多種癌症(包括淋巴瘤、神經膠質瘤、攝護腺癌和乳腺癌)的生長抑制(Chen et al.,2009)。SLC7A11抑制被證明可在體外抑制食管癌細胞系KYSE150的細胞浸潤和裸鼠的實驗性轉移，從而確立了SLC7A11在腫瘤轉移中的作用(Chen et al.,2009)。
SLCO5A1位於質膜，並且可透過影響藥物的胞內運輸有助於小細胞肺癌的化療(Olszewski-Hamilton et al.,2011)。SLCO5A1是轉移性小細胞肺癌最突出的有機陰離子轉運多肽，SLCO5A1的mRNA水準在肝腫瘤和乳腺癌中高度增加(Kindla et al.,2011；Wlcek et al.,2011；Brenner et al.,2015)。口咽鱗狀細胞癌的基因融合與SLCO5A1下調相關(Guo et al.,2016)。
SP5在結直腸癌細胞系β-連環蛋白耗盡後下調，是Wnt信號通路中一種新的直接下游靶標(Takahashi et al.,2005)。SP5過度表達證實了罕見人類胰腺腫瘤β-連環蛋白通路的活化(Cavard et al.,2009)。在顯示去調節Wnt信號傳導的人結直腸癌細胞中，莫能菌素減少β連環蛋白的細胞內水準，導致Wnt信號靶基因(如SP5)表達減少和增殖速率降低(Tumova et al.,2014)。
STIL屬於在15種皮質醇分泌腎上腺皮質腺瘤中拷貝數變化和雜合性複製中性損失的基因(Ronchi et al.,2012)。融合此基因和相鄰基因座的染色體缺失通常發生於T細胞白血病，被認為透過非法的V-(D)-J重組事件產生(Karrman et al.,2009；Alonso et al.,2012)。
TBC1D7表達升高發現於大多數肺癌，免疫組織化學染色表明TBC1D7表達與NSCLC患者的不良預後相關(Sato et al.,2010)。TBC7過度表達增強TSC1的泛素化，並透過位於mTOR信號傳導途徑的S6激酶增加S6蛋白的磷酸化(Nakashima et al.,2007)。
TDG經由與轉錄因子TCF4交互影響以上調方式影響Wnt信號通路，並且被認為是結直腸癌的潛在生物標誌物(Xu et al.,2014)。另一方面，TDG的表達降低導致堿基切除修復(BER)途徑受損且具有較 強的致癌特性(van de Klundert et al.,2012)。在早期乳腺癌、食管鱗狀細胞癌(ESCC)以及胃癌中觀察到了該蛋白質的下調(Li et al.,2013；Du et al.,2015；Yang et al.,2015a)。
在四個最頻繁突變的基因中，TENM4在原發性CNS淋巴瘤中表現出蛋白改變性突變(Vater et al.,2015)。MDA-MB-175細胞系含有一個染色體易位，導致TENM4和ErbB家族受體融合。在神經母細胞瘤中也發現嵌合基因(Wang et al.,1999b；Boeva et al.,2013)。
TET2是造血幹細胞穩態的關鍵調節因子，其功能障礙導致血液惡性腫瘤(Nakajima and Kunimoto,2014)。TET2突變對預後產生不良影響，並可能有助於證明急性髓細胞白血病患者風險適應治療策略的合理性(Liu et al.,2014b)。TET2的核定位元在結直腸癌組織的一個重要部分丟失，與轉移相關(Huang et al.,2016)。
TKTL1與多種腫瘤類型的發展和進展有關，諸如食管鱗狀細胞癌、口腔鱗狀細胞癌、肺癌、結直腸癌和非小細胞肺癌(Kayser et al.,2011；Bentz et al.,2013；Grimm et al.,2014)。
TMEM67在中心粒遷移至頂膜和初級纖毛形成中發揮作用。此基因的缺陷是梅克爾症候群3型(MKS3)和茹貝爾症候群6型(JBTS6)的原因 (RefSeq,2002)。TMEM67參與纖毛形成，有缺陷的纖毛可能導致眼部缺損、舌瘤、髓母細胞瘤(Yang et al.,2015b；Parisi,2009)。
TONSL透過穩定致癌蛋白MMS22L參與肺癌和食管癌形成(Nguyen et al.,2012)。TONSL和BRCA1之間顯示出進一步的相互作用，其作為乳腺癌和卵巢腫瘤的一個抑制基因(Hill et al.,2014)。
TP63易位被描述為間變性淋巴瘤激酶陽性間變性大細胞淋巴瘤子集中的一個事件，其與疾病的侵襲過程相關(Hapgood and Savage,2015)。TP63被描為由於其參與上皮細胞分化、細胞週期停滯和細胞凋亡而在癌症中發揮複雜的作用(Lin et al.,2015)。TP63異構體TAp63被描述為在惡性血液病中過度表達，而TP63錯義突變報告發生於淋巴瘤和一些肺腺癌中的鱗狀癌和TP63易位處(Orzol et al.,2015)。導致TP63異構體δNp63過度表達的異常剪接在人類癌症(如，皮膚鱗狀細胞癌)中經常發現，其很可能有利於腫瘤發生和發展(Missero and Antonini,2014；Inoue and Fry,2014)。
TRIM59透過上調細胞週期蛋白促進非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移(Zhan et al.,2015)。與非腫瘤組織相比，推定的泛素連接酶TRIM59在胃癌中上調，TRIM59水準與腫瘤進展和患者存活時間相關。TRIM59與P53相互作用，促進其泛素化和降解， TRIM59可能透過此機制促進胃癌形成(Zhou et al.,2014)。
TRPC4被發現在肺癌、卵巢癌、頭頸癌、腎癌和非小細胞肺癌中上調(Zhang et al.,2010b；Zeng et al.,2013a；Jiang et al.,2013；Park et al.,2016)。
ULBP3在許多腫瘤細胞中表達為可溶性和膜結合異構體。相比成人原始細胞，小兒急性淋巴細胞白血病原始細胞表達顯著更高水準的ULBP3(Torelli et al.,2014)。相比於其他白血病細胞系，發現在白血病細胞系K562中ULBP3表達水準高得多。此外，它可能存在於白血病細胞系和原發性惡性白血病細胞中(Ma et al.,2013b)。ULBP3基因座在結腸癌細胞系中甲基化(Bormann et al.,2011)。在人肺癌細胞系SW-900中檢測到mRNA水準和ULBP3表面表達水準增加(Park et al.,2011)。ULBP3在白血病細胞中呈更高的表面表達(Ogbomo et al.,2008)。不同腫瘤細胞系的ULBP3水準與NK細胞細胞毒性相關，但是，ULBP3似乎不適合作為生物標誌物(Wang et al.,2008；Linkov et al.,2009)。人鼻咽癌細胞系CNE2中不表達ULBP3(Mei et al.,2007)。ULBP3在卵巢癌中表達，與患者存活呈負相關(Carlsten et al.,2007；McGilvray et al.,2010)。B細胞在非霍奇金淋巴瘤中表達ULBP3，也可在外周血、骨髓或淋巴結 中發現(Catellani et al.,2007)。ULBP3在乳腺癌、膠質母細胞瘤細胞系U251、人腦腫瘤、頭頸部鱗狀細胞癌中表達(Eisele et al.,2006；Butler et al.,2009；Bryant et al.,2011；de Kruijf et al.,2012)。腫瘤細胞表達可溶性和表面ULBP3以調節NK細胞活性(Mou et al.,2014)。在某些上皮腫瘤中ULBP3過度表達。此外，與健康供體相比，ULBP3水準在癌症患者血清中升高(Mou et al.,2014)。
VPS13B等位基因在小細胞肺癌中突變(Iwakawa et al.,2015)。在胃癌和結直腸癌中觀察到VPS13B突變(An et al.,2012)。
在微衛星不穩定性胃癌和結直腸癌中發現VPS13C移碼突變(An et al.,2012)。
WDR62表達在胃癌組織和細胞系中顯著上升，並與分化程度和預後相關。此外，WDR62表達在多藥耐藥細胞中升高(Zeng et al.,2013b)。WDR62過度表達與中心體擴增相關，可能是卵巢癌一種新的有用分化生物標誌物和潛在治療靶標(Zhang et al.,2013b)。
外來體結合WDR92透過降解雙調蛋白mRNA抑制乳腺癌細胞侵襲(Saeki et al.,2013)。WDR92增強腫瘤壞死因子-α和放線菌酮誘導的細胞凋亡(Ni et al.,2009)。
WNT5A屬於WNT基因家族，由編碼分泌信號蛋白且結構上相關的基因組成。這些蛋白質涉及腫瘤發生和幾個發育過程，包括胚胎發育過程中細胞命運和模式的調節。WNT5A基因編碼WNT家族的一員，其透過經典和非經典WNT途徑傳導信號。這種蛋白是7跨膜受體捲曲型5和酪氨酸激酶孤兒受體2的配體。該蛋白在胚胎發育過程中對調節發育途徑起著重要作用。這種蛋白質也在癌形成中發揮作用(RefSeq,2002)。WNT5A在CRC中過度表達，與原發腫瘤和轉移部位之間具有76%的一致率(Lee et al.,2014a)。在人胃癌細胞、鼻咽癌和胰腺癌中，WNT5A上調並且是上皮-間質轉化和轉移的關鍵調節因子(Kanzawa et al.,2013；Zhu et al.,2014；Bo et al.,2013)。
XRN1可能參與星形膠質細胞和星形細胞瘤細胞中的一些調節性mRNA通路(Moser et al.,2007)。XRN1敲減抑制攝護腺癌細胞的雄激素受體表達，並在攝護腺腺癌的miR-204/XRN1軸中起重要作用(Ding et al.,2015)。
全基因組關聯研究確定了XXYLT1的基因多態性。研究提出，這些多態性是非小細胞肺癌發展的易感性基因座(Zhang et al.,2012b)。
ZBTB20透過FoxO1抑制促進非小細胞肺癌的細胞增殖(Zhao et al.,2014b)。ZBTB20表達在肝細胞癌中增加，與不良預後相關(Wang et al., 2011c)。ZBTB20基因多態性與胃癌有關(Song et al.,2013)。
ZFHX4被認為可調節細胞分化，其抑制與無膠質瘤生存期相關(Chudnovsky et al.,2014)。松果體區乳頭狀瘤顯示ZFHX4高表達水準(Fevre-Montange et al.,2006)。ZFHX4被發現是基底細胞癌易感基因(Stacey et al.,2015)。
ZMYM1是ZNF131的主要相互作用因子，其在雌激素信號和乳腺癌細胞增殖中發揮作用(Oh and Chung,2012；Kim et al.,2016)。
圖1顯示了正常組織(白色柱)和不同癌症(黑色柱)中各種肽的過量提呈。圖1A)基因符號：IGFBPL1，肽：LLPLLPPLSPSLG(SEQ ID NO：33)-從左至右的組織：1細胞系(1胰腺癌)，1正常組織(1甲狀腺)，22癌組織(5腦癌，1乳腺癌，1結腸癌，1食管癌，1膽囊癌，1肝癌，10肺癌，1胰腺癌，1胃癌)；圖1B)基因符號：HIVEP1，肽：NYIPVKNGKQF(SEQ ID NO：103)-從左至右的組織：11癌組織(1腦癌，1肝癌，8肺癌，1攝護腺癌)；圖1C)基因符號：GET4，肽：EYLDRIGQLFF(SEQ ID NO：131)-從左至右的組織：2正常組織(1腎，1肺)，41癌組織(2腦癌，1腎癌，3肝癌，29肺癌，2攝護腺癌，4胃癌)； 圖1D)基因符號：N4BP2，肽：FYINGQYQF(SEQ ID NO：176)-從左至右的組織：1細胞系(1攝護腺)，3正常組織(1腎臟，1腦垂體，1皮膚)，67癌組織(4腦癌，2肝癌，42肺癌，12攝護腺癌，7胃癌)。圖1E)至Z)顯示了與正常組織相比各種肽在不同癌症組織中的過度提呈。分析包括來自440多個正常組織樣本以及526個癌症樣本的資料。顯示的僅是被發現提呈肽的樣本。圖1E)基因符號：AKR1C1、AKR1C3，肽：HLYNNEEQV(SEQ ID NO：16)-從左至右的組織：1細胞系(胰腺)，15癌組織(1膽管癌，1食管癌，6肝癌，5肺癌，2膀胱癌)；圖1F)基因符號：RPS26P39、RPS26P11、RPS26、RPS26P28、RPS26P20,RPS26P15、RPS26P50、RPS26P2、RPS26P25、RPS26P58，肽：YVLPKLYVKL(SEQ ID NO：35)-從左至右的組織：1正常組織(1白細胞樣本)，8癌組織(1頭頸部癌，3白細胞白血病癌症，1骨髓細胞癌，1膽囊癌，1結腸癌，1淋巴結癌)；圖1G)基因符號：CLDN4、CLDN3、CLDN14、CLDN6、CLDN9，肽：SLLALPQDLQA(SEQ ID NO：40)-從左至右的組織：21癌組織(1膽管癌，1乳腺癌，3結腸癌，1直腸癌，6肺癌，2卵巢癌，1攝護腺癌，3膀胱癌，3子宮癌)；圖1H)基因符號：KLHDC7B，肽：VLSPFILTL(SEQ ID NO：42)-從左至右的組織：18癌組織(1白細胞白血病癌，1骨髓細胞癌，1乳腺癌， 1腎癌，6肺癌，3淋巴結癌，2卵巢癌，2膀胱癌，1子宮癌)；圖1I)基因符號：ATR，肽：SLLSHVIVA(SEQ ID NO：53)-從左至右的組織：3細胞系(1血細胞，2胰腺)，21癌組織(1頭頸部癌，1膽管癌，2白細胞白血病癌症，1乳腺癌，2食管癌，1膽囊癌，1腎癌，1肝癌，2肺癌，4淋巴結癌，1卵巢癌，3皮膚癌，1膀胱癌)；圖1J)基因符號：PGAP1，肽：FITDFYTTV(SEQ ID NO：66)-從左至右的組織：1細胞系(皮膚)，1正常組織(1結腸)，13癌組織(1頭頸癌，6腦癌，1結腸癌，1肝癌，2皮膚癌，2膀胱癌)；圖1K)基因符號：ZNF679、SAPCD2，肽：RLLPKVQEV(SEQ ID NO：325)-從左至右的組織：4細胞系(2血細胞，1腎臟，1大腸)，22癌組織(1骨髓細胞癌，1乳腺癌，1食管癌，4結腸癌，1直腸癌，10肺癌，2卵巢癌，1胃癌，1膀胱癌)；圖1L)基因符號：ZDHHC24，肽：VLGPGPPPL(SEQ ID NO：339)-從左至右的組織：2細胞系(1腎臟，1脾)，19癌組織(4白細胞白血病癌症，1骨髓細胞癌，1骨髓癌，2腦癌，1肝癌，2肺癌，6淋巴結癌，1皮膚癌，1子宮癌)；圖1M)基因符號：ORC1，肽：VYVQILQKL(SEQ ID NO：111)-從左至右的組織：1正常組織(1肝臟)，32癌組織(2肝癌，24肺癌，6胃癌)；圖1N)基因符號：RIF1，肽：IYSFHTLSF(SEQ ID NO：113)-從左至右的組織：28癌組織(1攝護腺，1腦癌，25肺癌，2胃癌)；圖1O) 基因符號：ANKRD5，肽：RYLNKSFVL(SEQ ID NO：115)-從左至右的組織：1正常組織(1胃)，25癌組織(1腦癌，2肝癌，17肺癌，2攝護腺癌，3胃癌)；圖1P)基因符號：IGFLR1，肽：RYGLPAAWSTF(SEQ ID NO：121)-從左至右的組織：20癌組織(2肝癌，17肺癌，1胃癌)；圖1Q)基因符號：CCR8，肽：VYALKVRTI(SEQ ID NO：145)-從左至右的組織：25癌組織(25肺癌)；圖1R)基因符號：CLEC5A，肽：SYGTVSQIF(SEQ ID NO：148)-從左至右的組織：5正常組織(1肝臟，3肺，1腦下垂體)，100癌組織(10腦癌，4肝癌，74肺癌，1攝護腺癌，11胃癌)；圖1S)基因符號：FOXJ1，肽：IYKWITDNF(SEQ ID NO：155)-從左至右的組織：4正常組織(4腎臟)，53癌組織(10腦癌，1肝癌，26肺癌，1攝護腺癌，15胃癌)；圖1T)基因符號：IFNG，肽：KYTSYILAF(SEQ ID NO：162)-從左至右的組織：3細胞系(3攝護腺)，4正常組織(1肝臟，1肺，1胰腺，1胃)，95癌組織(1腎癌，5肝癌，71肺癌，2攝護腺癌，16胃癌)；圖1U)基因符號：KLHL11，肽：EYFTPLLSGQF(SEQ ID NO：165)-從左至右的組織：10癌組織(10肺癌)；圖1V)基因符號：TMEM189，肽：LYSPVPFTL(SEQ ID NO：175)-從左至右的組織：42癌組織(4腦癌，1肝癌，30肺癌，7胃癌)；圖1W)基因符號：BUB1，肽：EYNSDLHQFF(SEQ ID NO：345)-從 左至右的組織：13癌組織(3腦癌，10肺癌)；圖1X)基因符號：CASC5，肽：IYVIPQPHF(SEQ ID NO：346)-從左至右的組織：21癌組織(3腦癌，1腎癌，1肝癌，14肺癌，2胃癌)；圖1Y)基因符號：KIF18A，肽：VYNEQIRDLL(SEQ ID NO：354)-從左至右的組織：13癌組織(1腦癌，11肺癌，1胃癌)；圖1Z)基因符號：PSMA8、PSMA7，肽：VFSPDGHLF(SEQ ID NO：360)-從左至右的組織：33癌組織(4肝癌，27肺癌，1攝護腺癌，1胃癌)。
圖2顯示了本發明的源基因的代表性表達特徵，這些基因在一系列正常組織(白色柱)的不同癌症中以及不同癌症樣本(黑色柱)中高度過度表達或專門表達。圖2A)基因符號：MXRA5-從左到右的組織：61正常組織樣本(6動脈，1腦，1心臟，2肝，2肺，2靜脈，1脂肪組織，1腎上腺，5骨髓，1軟骨，1結腸，1食管，2膽囊，1腎臟，6淋巴結，1胰腺，1腦垂體，1直腸，1骨骼肌，1皮膚，1小腸，1脾臟，1胃，1胸腺，1甲狀腺，5氣管，1膀胱，1乳腺，5卵巢，3胎盤，1攝護腺，1睾丸，1子宮)和70癌症樣本(10乳腺癌，11肺癌，12卵巢癌，11食管癌，26胰腺癌)；圖2B)基因符號：KIF26B-從左到右的組織：61正常組織樣本(6動脈，1腦，1心臟，2肝，2肺，2靜脈，1脂肪組織，1腎上腺，5骨髓，1軟骨，1結腸，1食管，2膽囊，1腎臟，6淋巴結，1胰腺，1腦垂體，1直腸，1骨骼肌，1皮膚，1小腸， 1脾臟，1胃，1胸腺，1甲狀腺，5氣管，1膀胱，1乳腺，5卵巢，3胎盤，1攝護腺，1睾丸，1子宮)和58癌症樣本(10乳腺癌，11肺癌，11食管癌，26胰腺癌)；圖2C)基因符號：IL4I1-從左到右的組織：61正常組織樣本(6動脈，1腦，1心臟，2肝，2肺，2靜脈，1脂肪組織，1腎上腺，5骨髓，1軟骨，1結腸，1食管，2膽囊，1腎臟，6淋巴結，1胰腺，1腦垂體，1直腸，1骨骼肌，1皮膚，1小腸，1脾臟，1胃，1胸腺，1甲狀腺，5氣管，1膀胱，1乳腺，5卵巢，3胎盤，1攝護腺，1睾丸，1子宮)和34癌症樣本(11肺癌，12卵巢癌，11食管癌)；圖2D)基因符號：TP63-從左到右的組織：61正常組織樣本(6動脈，1腦，1心臟，2肝，2肺，2靜脈，1脂肪組織，1腎上腺，5骨髓，1軟骨，1結腸，1食管，2膽囊，1腎臟，6淋巴結，1胰腺，1腦垂體，1直腸，1骨骼肌，1皮膚，1小腸，1脾臟，1胃，1胸腺，1甲狀腺，5氣管，1膀胱，1乳腺，5卵巢，3胎盤，1攝護腺，1睾丸，1子宮)和11個食管癌樣本
圖3顯示了示例性的免疫原性資料：肽特定多聚體染色後流式細胞儀結果。
圖4顯示了健康HLA-A*02+供體的肽特異性CD8+ T細胞體外反應的示例性結果。CD8+ T細胞製備的方法為：使用抗CD28 mAb和HLA-A*02塗層的人工APC分別與SEQ ID NO：2肽(A，左圖)、SEQ ID NO：9肽(B，左圖)或SEQ ID NO：331肽(C， 左圖)合成。經過3個週期的刺激後，用A*02/SEQ ID NO：2(A)、A*02/SEQ ID NO：9(B)或A*02/SEQ ID NO：331(C)的2D多聚體染色法對肽反應性細胞進行檢測。右圖(A、B和C)顯示用不相關A*02/肽複合體刺激的細胞對照染色。活單細胞在CD8+淋巴細胞上得到門控。Boolean門控幫助排除用不同肽特定的多聚體檢測的假陽性事件。提示了特異性多聚體+細胞和CD8+淋巴細胞的頻率。
圖5顯示了健康HLA-A*24+供體的肽特異性CD8+ T細胞體外反應的示例性結果。CD8+ T細胞製備的方法為：使用抗CD28 mAb和HLA-A*24塗層的人工APC分別與SEQ ID NO：99肽(A，左圖)或SEQ ID NO：119肽(B，左圖)、SEQ ID NO：142肽(C，左圖)和SEQ ID NO：174肽(D，左圖)合成。經過3個週期的刺激後，用A*24/SEQ ID NO：99(A)、A*24/SEQ ID NO：119(B)、A*24/SEQ ID NO：142(C)或A*24/SEQ ID NO：174(D)的2D多聚體染色法對肽反應性細胞進行檢測。右圖(A、B、C和D)顯示用不相關A*24/肽複合體刺激的細胞對照染色。活單細胞在CD8+淋巴細胞上得到門控。Boolean門控幫助排除用不同肽特定的多聚體檢測的假陽性事件。提示了特異性多聚體+細胞和CD8+淋巴細胞的頻率。
是否能刺激免疫反應取決於是否存在被宿主免疫系統視為異物的抗原。發現腫瘤相關抗原的存在增加了運用宿主免疫系統干預腫瘤生長的可能性。目前，針對癌症免疫治療，正在探索利用免疫系統的體液和細胞進行免疫的各種機制。
細胞免疫反應的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的T-細胞表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了重要作用。特別是CD8陽性T細胞在這種反應中發揮重要作用，TCD8+能識別通常8至10個源自蛋白或位於細胞質的缺損核糖體產物(DRIP)的氨基酸殘基的主要組織相容性複合體(MHC)所載的肽中所含的I類分子。人MHC分子也稱為人白細胞-抗原(HLA)。
除非另有說明，否則本文使用的所有術語定義如下。
術語「T細胞反應」應指由一種肽在體外或體內誘導的效應子功能的特異性擴散和活化。對於MHC I類限制性細胞毒性T細胞，效應子功能可能為溶解肽脈衝的、肽前體脈衝的或天然肽提呈的靶細胞、分泌細胞因子，優選為肽誘導的干擾素-γ，TNF-α或IL-2，分泌效應分子，優選為肽誘導的顆粒酶或穿孔素，或脫顆粒。
本文所用「肽」這一術語，系指一系列氨基酸殘基，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來 連接。這些肽的長度優選為9個氨基酸，但至短可為8個氨基酸長度，至長可為10、11、12、13或14個氨基酸或更長，如果為MHC-II類肽時(本發明肽的拉長變體)，至長可為15、16、17、18、19或20個氨基酸長度或更長。
因此，「肽」這一術語應包括一系列氨基酸殘基的鹽，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。優選的情況是，鹽為肽的藥用鹽，例如：氯化物或乙酸(三氟乙酸)鹽。必須注意的是，本發明肽的鹽與其體內狀態的肽基本上不同，因為該不是體內的鹽。
術語「肽」應也包括「寡肽」。本文使用的術語「寡肽」是指一系列氨基酸殘基，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。寡肽的長度對於本發明來說並不十分關鍵，只要在寡肽中保持正確的表位即可。通常，寡肽長度約小於30個氨基酸殘基，約長於15個氨基酸。
「多肽」這一術語是指一系列氨基酸殘基，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。多肽的長度對於本發明來說並不十分關鍵，只要保持正確的表位即可。與術語肽或寡肽相對，「多肽」這一術語是指包含多於約30個氨基酸殘基的分子。
一種肽、寡肽、蛋白質或編碼該分子的核苷酸如果能誘導免疫反應，則具有「免疫原性」(因此是本發明中的一種「免疫原」)。在本發明的情況下，免疫原性的 更具體定義是誘導T細胞反應的能力。因此，「免疫原」是一種能夠誘導免疫反應的分子，並且在本發明的情況下，是一種能誘導T細胞反應的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽，肽與MHC的複合體、和/或用於提高特異性抗體或TCR抗性的蛋白。
I類T細胞「表位」要求的是一種結合至MHC I類受體上的短肽，從而形成一種三元複合體(MHC I類α鏈、β-2-微球蛋白和肽)，其可以透過T細胞負載匹配T細胞受體與具有適當親和力的MHC/肽複合物結合來識別。結合至MHC I類分子的肽的典型長度為8-14個氨基酸，最典型為9個氨基酸長度。
在人類中，有三種編碼MHC I類分子的不同基因位點(人MHC分子也是指定的人白細胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-B*07是可從這些基因位點表達的不同MHC I類等位元基因的實例。
表4：HLA-A*02和HLA-A*24和最常見HLA-DR血清類型的表達頻率F。頻率根據Mori等人(Mori et al.,1997)使用的Hardy-Weinberg公式F=1-(1-Gf)2改編，從美國人群範圍內的單體型頻率中推導出。由於連鎖不平衡，某些HLA-DR等位基因內的A*02或A*24組合與其預期單一頻率相比，可能是濃縮的或頻率較低。有關詳細資訊，請參閱Chanock等人的文獻(Chanock et al.,2004)。
Figure 110107429-A0202-12-0108-577
Figure 110107429-A0202-12-0109-578
本發明的肽，優選當如本文描述納入本發明的疫苗時優選與所指定的A*02、A*24或II類等位基因結合。疫苗還可能包括泛結合MHC II類肽。因此，本發明的疫苗可用於治療A*02陽性患者中的癌症，但不因為這些肽的廣泛結核性而必須選擇II類MHC同種異型。
如果本發明的A*02肽與結合至另一等位基因例如A*24的肽組合，與單獨的MHC I類等位基因相比，可治療更高比例的患者群體。雖然在大多數人群中，低於50%的患者可由單獨的等位基因來解決問題，但是本發明中一種含HLA-A*24和HLA-A*02表位的疫苗可以治療任何相關人群中至少60%的患者。具體來說，各區域中，以下比例的患者這些等位基因中的至少一個有肯定效果：美國61%、西歐62%、中國75%、韓國77%、日本86%(根據www.allelefrequencies.net計算)。
在一項優選的實施方案中，術語「核苷酸序列」系指去氧核苷酸的雜聚物。
編碼特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可為天然核苷酸序列，也可為合成核苷酸序列。一般來說，編碼肽、多肽以及本發明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸銜接物，或一系列寡核苷酸組成，以提供一種合成基因，該基因能夠在包含源自微生物或病毒操縱子的調節元素的重組轉錄單元中被表達。
如本文所用的術語「肽的核苷酸編碼」系指對肽進行核苷酸序列編碼，其中該肽包括與將由用於產生TCR的樹突細胞或另一細胞系統所表達該序列的生物系統相容的人工(人造)啟動和停止密碼子。
本文提到的核酸序列既包括單鏈核酸也包括雙鏈核酸。因此，除非本文另有所指，否則，例如對於DNA， 具體的序列是該序列的單鏈DNA、該序列與其互補序列的雙工(雙鏈DNA)以及該序列的互補序列。
「編碼區」這一術語是指在基因的天然基因組環境中天然或正常編碼該基因的表達產物的那部分基因，即，體內編碼該基因的天然表達產物的區域。
編碼區可來自非突變(「正常」)基因、突變基因或異常基因，甚至還可以來自DNA序列，完全可在實驗室中使用本領域熟知的DNA合成方法合成。
「表達產物」這一術語是指多肽或蛋白，它是基因和遺傳碼退化並因而編碼同樣的氨基酸所造成的任何核酸序列編碼同等物的翻譯產物。
「片斷」這一術語，當指的是一種編碼序列時，表示包含非完整編碼區的DNA的一部分，其表達產物與完整編碼區表達產物基本上具有相同的生物學功能或活性。
「DNA片段」這一術語是指一種DNA聚合物，以單獨的片段形式或一種較大DNA結構的組分形式存在，它們從至少分離過一次的DNA中以基本純淨的形式獲得，即不含污染性內源性材料，並且獲得的數量或濃度能夠使用標準生化方法，例如使用克隆載體，進行識別、操縱和回收該片段及其組分核苷酸序列。此類片段以開放閱讀框架(未被內部未翻譯序列打斷)或內含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未翻譯DNA序列可 能存在於開放閱讀框架的下游，在那裏其不會干預編碼區的操縱或表達。
「引物」這一術語表示一種短核酸序列，其可與一個DNA鏈配對，並在DNA聚合酶開始合成去氧核糖核酸鏈之處提供一個游離的3'-OH末端。
「啟動子」這一術語表示參與RNA聚合酶的結合從而活化轉錄的DNA區域。
術語「分離」表示一種物質從其原來的環境(例如，如果是天然發生的則是天然環境)中被移走。例如，活體動物中的天然核苷酸或多肽不是分離的，但是，從天然系統中一些或所有共存物質中分離出來的核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可能是載體的一部分和/或此類多核苷酸和多肽可能是一種組合物的一部分，並且由於該載體或組合物不是其天然環境的一部分，因此它仍然是分離的。
本發明中披露的多核苷酸和重組或免疫原性多肽也可能以「純化」的形式存在。術語「純化」並非要求絕對的純度；它只是一個相對的定義，可以包括高度純化或部分純化的製劑，相關領域技術人員能理解這些術語。例如，各個從已用傳統方法純化為具有電泳同質性的cDNA庫中分離出的各種克隆物。明確考慮到將起始材料或天然物質純化至少一個數量級，優選為兩或三個數量級，更優選為四或五個數量級。此外，明確涵蓋所述多肽 的純度優選為99.999%，或至少為99.99%或99.9%；甚而適宜為以重量計99%或更高。
根據本發明公開的核酸和多肽表達產物，以及包含此類核酸和/或多肽的表達載體可能以「濃縮的形式」存在。本文使用的術語「濃縮」是指材料的濃度至少是其自然濃度的大約2、5、10、100或1000倍，有優勢的是，按重量計為0.01%，優選為至少0.1%。也明確考慮到，按重量計約為0.5%、1%、5%、10%和20%的濃縮製劑。序列、構型、載體、克隆物以及包含本發明的其他材料可有優勢地以濃縮或分離的形式存在。「活性片段」這一術語是指產生免疫反應的片段(即具有免疫原性活性)，通常是一種肽、多肽或核酸序列的片段，不論是單獨或可選地與合適的佐劑一起或在載體中給予一種動物，比如哺乳動物，例如兔子或小鼠，也包括人；這種免疫反應採用的形式是在接受動物(如：人)體內刺激T細胞反應。或者，「活性片段」也可用於誘導體外T細胞反應。
本文使用的「部分」(portion)、「節段」(segment)、「片段」(fragment)這幾個術語，當與多肽相關地使用時是指殘基的連續序列，比如氨基酸殘基，其序列形成一個較大序列的子集。例如，如果一個多肽以任一種肽鏈內切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)進行處理，則該處理獲得的寡肽會代表起始多肽的部分、節段或片段。當與多核苷酸相關地使用時，這些術語系指用任何核酸內切酶處理所述多核苷酸產生的產物。
根據本發明，術語「等同度百分比」或「等同百分比」，如果指的是序列，則表示在待對比序列(「被對比序列」)與所述序列或請求項的序列(「參考序列」)對準之後將被對比序列與所述序列或請求項的序列進行比較。然後根據下列公式計算等同度百分比：
等同度百分比=100[1-(C/R)]
其中C是參考序列與被對比序列之間對準長度上參考序列與被對比序列之間的差異數量，其中
(i)參考序列中每個堿基或氨基酸序列在被對比序列中沒有對應的對準堿基或氨基酸；
(ii)參考序列中每個空隙，以及
(iii)參考序列中每個對準堿基或氨基酸與被比對比序列中對準堿基或氨基酸不同，即構成一個差異以及
(iiii)必須在對準序列的第1位置開始對準；並且R是參考序列與被對比序列對準長度上在參考序列中產生任何空隙也計算為一個堿基或氨基酸的參考序列中的堿基或氨基酸數目。
如果「被對比序列」和「參考序列」之間存在的一個對準按上述計算的等同度百分比大致等於或大於指定的最低等同度百分比，則被對比序列與參考序列具有指定的最低等同度百分比，雖然可能存在按本文上述計算的等同度百分比低於指定等同度百分比的對準。
因此，如上所述，本發明提出了一種肽，其包括選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388組成的組團的 一個序列、或與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388具有88%同源性的其變體、或誘導與該肽發生T細胞交叉反應的一個變體。本發明所述的肽具有與主要組織相容性複合體(MHC)I或所述肽拉長版本的II類分子結合的能力。
在本發明中，「同源性」一詞系指兩個氨基酸序列之間的同一度(參見上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的「同源」是透過將理想條件下調整的兩個序列與待比較序列進行比對後確定的。此類序列同源性可透過使用ClustalW等演算法創建一個排列而進行計算。也可用使用一般序列分析軟體，更具體地說，是Vector NTI、GENETYX或由公共資料庫提供的其他工具。
本領域技術人員能評估特定肽變體誘導的T細胞是否可與該肽本身發生交叉反應(Appay et al.,2006；Colombetti et al.,2006；Fong et al.,2001；Zaremba et al.,1997)。
發明人用給定氨基酸序列的「變體」表示，一個或兩個氨基酸殘基等的側鏈透過被另一個天然氨基酸殘基的側鏈或其他側鏈取代而發生改變，這樣，這種肽仍然能夠以含有給定氨基酸序列(由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388組成)的肽大致同樣的方式與HLA分子結合。例如，一種肽可能被修飾以便至少維持(如沒有提高)其能與HLA-A*02或-DR等合適MHC分子的 結合槽相互作用和結合，以及至少維持(如沒有提高)其與活化T細胞的TCR結合的能力。
隨後，這些T細胞可與細胞和殺傷細胞發生交叉反應，這些細胞表達多肽(其中包含本發明中定義的同源肽的天然氨基酸序列)。正如科學文獻和資料庫(Rammensee et al.,1999；Godkin et al.,1997)中所述，HLA-A結合肽的某些位點通常為錨定殘基，可形成一種與HLA結合槽的結合模序相稱的核心序列，其定義由構成結合槽的多肽鏈的極性、電物理、疏水性和空間特性確定。因此，本領域技術人員能夠透過保持已知的錨殘基來修飾SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388提出的氨基酸序列，並且能確定這些變體是否保持與MHC I或II類分子結合的能力。本發明的變體保持與活化T細胞的TCR結合的能力，隨後，這些T細胞可與表達一種包含本發明定義的同源肽的天然氨基酸序列的多肽的細胞發生交叉反應並殺死該等細胞。
如果無另有說明，那麼本文公開的原始(未修飾)肽可以透過在肽鏈內的不同(可能為選擇性)位點上取代一個或多個殘基而被修飾。優選情況是，這些取代位於氨基酸鏈的末端。此取代可能是保守性的，例如，其中一個氨基酸被具有類似結構和特點的另一個氨基酸所取代，比如其中一個疏水性氨基酸被另一個疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類似的大小和化學性質的氨基酸間的取代，例如，亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源 蛋白質家族序列變異的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，這些氨基酸往往表現出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關，這是確定「保守取代」的基礎。
在本文中，保守取代定義為在以下五種基團之一的內部進行交換：基團1-小脂肪族、非極性或略具極性的殘基(Ala,Ser,Thr,Pro,Gly)；基團2-極性、帶負電荷的殘基及其醯胺(Asp,Asn,Glu,Gln)；基團3-極性、帶正電荷的殘基(His,Arg,Lys)；基團4-大脂肪族非極性殘基(Met,Leu,Ile,Val,Cys)以及基團5-大芳香殘基(Phe,Tyr,Trp)。
較不保守的取代可能涉及一個氨基酸被另一個具有類似特點但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被異亮氨酸殘基取代。高度不保守的取代可能涉及一個酸性氨基酸被另一個具有極性或甚至具有鹼性性質的氨基酸所取代。然而，這種「激進」取代不能認為是無效的而不予考慮，因為化學作用是不完全可預測的，激進的取代可能會帶來其簡單化學原理中無法預見的偶然效果。
當然，這種取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其他結構。因此，D-氨基酸可能被本發明的抗原肽中常見的L-氨基酸取代，也仍在本公開的範圍之內。此外，非標準氨基酸(即，除了常見的天然蛋白原氨基酸)也可 以用於取代之目的，以生產根據本發明的免疫原和免疫原性多肽。
如果在一個以上位置上的取代發現導致肽的抗原活性基本上等於或大於以下定義值，則對這些取代的組合進行測試，以確定組合的取代是否產生對肽抗原性的疊加或協同效應。肽內被同時取代的位置最多不能超過4個。
基本上由本文所指氨基酸序列組成的一種肽可能有一個或兩個非錨定氨基酸(見下面錨基序相關內容)被交換，而不存在這種情況，即相比於未修飾的肽，與人類主要組織相容性複合體(MHC)-I或II類分子的能力基本上被改變或受到不利影響。在另一實施方案中，在基本上由本文所述氨基酸序列組成的肽中，一個或兩個氨基酸可與其保守交換夥伴交換(見下文)，而不存在這種情況，即相比於未修飾的肽，與人類主要組織相容性複合體(MHC)-I或II類分子的能力基本上被改變或受到不利影響。
這些基本不與T細胞受體互動的氨基酸殘基可透過取代其他幾乎不影響T細胞反應並不妨礙與相關MHC結合的氨基酸而得到修飾。因此，除了特定限制性條件外，本發明的肽可能為任何包括給定氨基酸序列或部分或其變體的肽(發明人所用的這個術語包括寡肽或多肽)。
表5：根據SEQ ID NO：2、4和6的HLA-A*02肽的優選變體和基序
Figure 110107429-A0202-12-0119-579
Figure 110107429-A0202-12-0120-580
表6：根據SEQ ID No：98、114和158的HLA-A*24結合肽的優選變體和基序
Figure 110107429-A0202-12-0120-581
Figure 110107429-A0202-12-0121-582
較長(拉長)的肽也可能適合。MHC I類表位(通常長度為8至11個氨基酸)可能由肽從較長的肽或包含實際表位的蛋白中加工而產生。兩側有實際表位的殘基優選為在加工過程中幾乎不影響暴露實際表位所需蛋白裂解的殘基。
本發明的肽可被拉長多達四個氨基酸，即1、2、3或4個氨基酸，可按照4：0與0：4之間的任何組合添加至任意一端。本發明的拉長組合可見表7。
表7：本發明肽的拉長組合
Figure 110107429-A0202-12-0121-588
Figure 110107429-A0202-12-0122-584
拉伸/延長的氨基酸可以是所述蛋白或任何其他氨基酸的原序列肽。拉長可用于增強所述肽的穩定性或溶解性。
因此，本發明所述的表位可能與天然腫瘤相關表位或腫瘤特異性表位相同，也可能包括來自參考肽的不超過四個殘基的不同肽，只要它們有基本相同的抗原活性即可。
在一項替代實施方案中，肽的一邊或雙邊被拉長4個以上的氨基酸，優選最多30個氨基酸的總長度。這可形成MHC-II類結合肽。結合至MHC II類肽可透過本領域中已知的方法進行測試。
因此，本發明提出了MHC I類表位的肽和變體，其中所述肽或抗體的總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至14個氨基酸長度(即10、11、12、13、14個氨基酸，如果為拉長II類結合肽時，長度也可為15、16、17、18、19、20、21或22個氨基酸)。
當然，本發明的肽或變體能與人主要組織相容性複合體(MHC)I或II類分子結合。肽或變體與MHC複合物的結合可用本領域內的已知方法進行測試。
優選情況是，當本發明的肽特異性T細胞相比於取代肽受到檢測時，如果取代肽在相對於背景肽溶解度增加達到最大值的一半，則該肽濃度不超過約1mM，優選為不超過約1μM，更優選為不超過約1nM，再優選為不超過約100pM，最優選為不超過約10pM。也優選為，取代肽被一個以上的T細胞識別，最少為2個，更優選為3個。
在本發明的一個特別優選實施方案中，肽系由或基本系由根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388所選的氨基酸序列組成。
基本由「...組成」系指本發明的肽，除了根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388中的任一序列或其變體組成外，還含有位於其他N和/或C端延伸處的氨基酸，而它們不一定能形成作為MHC分子表位的肽。
但這些延伸區域對有效將本發明中的肽引進細胞具有重要作用。在本發明的一實施例中，該肽為融合蛋白的一部分，含來自NCBI、GenBank登錄號X00497的HLA-DR抗原相關不變鏈(p33，以下稱為「Ii」)的80個N-端氨基酸等。在其他的融合中，本發明的肽可以被融合到本文所述的抗體、或其功能性部分，特別是融 合入抗體的序列，以便所述抗體進行特異性靶向作用，或者，例如進入本文所述的樹突狀細胞特異性抗體。
此外，該肽或變體可進一步修飾以提高穩定性和/或與MHC分子結合，從而引發更強的免疫反應。肽序列的該類優化方法是本領域內所熟知的，包括，例如，反式肽鍵和非肽鍵的引入。
在反式肽鍵氨基酸中，肽(-CO-NH-)並未連接其殘基，但是其肽鍵是反向的。這種逆向反向模擬肽(retro-inverso peptidomimetics)可透過本領域已知的方法製備，例如：Meziere等人在(Meziere et al.,1997)中所述的方法，以引用的方式併入本文。這種方法涉及製備包含骨架(而並非側鏈)改變的模擬肽。Meziere等人(Meziere et al.,1997)的研究顯示，這些類比肽有利於MHC的結合和輔助性T細胞的反應。以NH-CO鍵替代CO-NH肽鍵的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。
非肽鍵為-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-等。美國4897445號專利提出了多肽鏈中非肽鍵(-CH2-NH)的非固相合成法，該方法涉及按標準程序合成的多肽以及透過氨基醛和一種含NaCNBH3的氨基酸相互作用而合成的非肽鍵。
含上述序列的肽可與其氨基和/或羧基末端的其他化學基團進行合成，從而提高肽的穩定性、生物利用 度、和/或親和力等。例如，苄氧羰基、丹醯基等疏水基團或叔丁氧羰基團可加入肽的氨基末端。同樣，乙醯基或9-芴甲氧羰基可能位於肽的氨基末端。此外，疏水基團、叔丁氧羰基團或氨基團都可能被加入肽的羧基末端。
另外，本發明中的所有肽都可能經合成而改變其空間構型。例如，可能使用這些肽的一個或多個氨基酸殘基的右旋體，通常不是其左旋體。更進一步地，本發明中肽的至少一個氨基酸殘基可被熟知的一個非天然氨基酸殘基取代。諸如此類的改變可能有助於增加本發明肽的穩定性、生物利用度和/或結合作用。
同樣，本發明中的肽或變體可在合成肽之前或之後透過特異氨基酸的反應而進行化學修飾。此類修飾的實施例為本領域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的《Chemical Reagents for Protein Modification》(3rd ed.CRC Press,2004)(Lundblad,2004)中有概述，以參考文獻的方式併入本文。雖然氨基酸的化學修飾方法無限制，但其包括(但不限於)透過以下方法修飾：醯基化、脒基化、賴氨酸吡哆基化、還原烷基化、以2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基團、透過將半胱氨酸過甲酸氧化為磺基丙氨酸而對羧基團和巰基進行氨基修飾、形成易變衍生物、與其他巰基化合物形成混合二硫化合物、與馬來醯亞胺反應，與碘乙酸或碘乙醯胺羧甲基化、在鹼性pH值下與氰酸鹽甲氨醯化。在這方面，技術人員參考了 《Current Protocols In Protein Science》(Eds.Coligan et al.(John Wiley and Sons NY 1995-2000))(Coligan et al.,1995)中第15章所述的在蛋白質化學修飾相關的廣泛方法。
簡言之，修飾蛋白質的精氨醯殘基等往往基於於鄰二羰基化合物(如苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮以及1,2-烯巳二酮)的反應而形成加合物。另一個實施例是丙酮醛與精氨酸殘基的反應。半胱氨酸可在賴氨酸和組氨酸等親核位點不作隨同修飾的情況下就得到修飾。因此，有大量試劑可進行半胱氨酸的修飾。Sigma-Aldrich(http：//www.sigma-aldrich.com)等公司的網站含有具體試劑的資訊。
蛋白質中二硫鍵的選擇性還原也很普遍。二硫鍵可在生物制藥熱處理中形成和氧化。伍德沃德氏試劑K可用於修飾特定的谷氨酸殘基。N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基-碳二亞胺可用于形成賴氨酸殘基和谷氨酸殘基的分子內交聯。例如：焦碳酸二乙酯是修飾蛋白質組氨酸殘基的試劑。組氨酸也可使用4-羥基-2-壬烯醛進行修飾。賴氨酸殘基與其他α-氨基團的反應，例如，有利於肽結合到蛋白/肽的表面或交聯處。賴氨酸聚是多(乙烯)乙二醇的附著點，也是蛋白質糖基化的主要修飾位點。蛋白質的蛋氨酸殘基可透過碘乙醯胺、溴乙胺、氯胺T等被修飾。
四硝基甲烷和N-乙醯基咪唑可用於酪氨酸殘基的修飾。經二酪氨酸形成的交聯可透過過氧化氫/銅離子完成。
對色氨酸修飾的最近研究中使用了N-溴代琥珀醯亞胺、2-羥基-5-硝基苄溴或3-溴-3-甲基-2-(2-硝苯巰基)-3H-吲哚(BPNS-糞臭素)。
當蛋白與戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交聯用於配製水凝膠時，治療性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修飾往往可延長迴圈半衰期。針對免疫治療的變態反應原化學修飾往往透過氰酸鉀的氨基甲醯化實現。
一種肽或變體，其中肽被修飾或含非肽鍵，優選為本發明的實施例。一般來說，肽和變體(至少含氨基酸殘基之間的肽聯接)可使用Lukas等人(Lukas et al.,1981)以及此處引用的參考文獻所披露的固相肽合成Fmoc-聚醯胺模式進行合成。芴甲氧羰基(Fmoc)團對N-氨基提供臨時保護。使用N,N-二甲基甲醯胺中的20%二甲基呱啶中對這種堿高度敏感的保護基團進行重複分裂。由於它們的丁基醚(在絲氨酸蘇氨酸和酪氨酸的情況下)、丁基酯(在谷氨酸和天門冬氨酸的情況下)、叔丁氧羰基衍生物(在賴氨酸和組氨酸的情況下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸的情況下)及4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺醯基衍生物(在精氨酸的情況下)，側鏈功能可能會受到保護。只要穀氨醯胺和天冬醯胺為C-末端殘基，側鏈氨基功能保護所使用的是由4,4'-二甲氧基二苯 基團。固相支撐基於聚二甲基丙烯醯胺聚合物，其由三個單體二甲基丙烯醯胺(骨架單體)、雙丙烯醯乙烯二胺(交聯劑)和N-丙烯醯肌胺酸甲酯(功能劑)構成。使用的肽-樹脂聯劑為酸敏感的4-羥甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作為其預製對稱酸酐衍生物加入，但是天冬醯胺和穀氨醯胺除外，它們使用被逆轉的N,N-二環己基碳二亞胺/1-羥基苯並三唑介導的耦合程序而加入。所有的耦合和脫保護反應用茚三酮、硝基苯磺酸或isotin測試程序監測。合成完成後，用濃度為95%含50%清道夫混合物的三氟醋酸，從伴隨去除側鏈保護基團的樹脂支承物中裂解肽。常用的清道夫混合物包括乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，準確的選擇依據合成肽的氨基酸組成。此外，固相和液相方法結合使用對肽進行合成是可能的(例如，請參閱(Bruckdorfer et al.,2004)以及本文引用的參考文獻)
三氟乙酸用真空中蒸發、隨後用承載粗肽的二乙基乙醚滴定進行去除。用簡單萃取程序(水相凍乾後，該程序制得不含清道夫混合物的肽)清除任何存在的清道夫混合物。肽合成試劑一般可從Calbiochem-Novabiochem(英國諾丁漢)獲得。
純化可透過以下技術的任何一種或組合方法進行，如：再結晶法、體積排阻色譜法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法以及(通常)反相高效液相色譜法(如使用乙腈/水梯度分離)。
可以使用薄層色譜法、電泳特別是毛細管電泳、固相萃取(CSPE)、反相高效液相色譜法、酸解後的氨基酸分析、快原子轟擊(FAB)質譜分析以及MALDI和ESI-Q-TOF質譜分析進行肽分析。
為了識別本發明的肽，對約3000個正常(健康)組織樣本的RNA表達數據庫(Lonsdale,2013)進行了篩選在重要器官系統中近乎無表達而在其他重要器官系統中低表達的基因。然後，從這些基因的蛋白質產物衍生的癌相關肽透過使用如本文所述的XPRESIDENTTM平臺質譜法識別。
為了選擇過度提呈的肽，計算了提呈圖，其顯示樣本中位元提呈量以及複製變化。該特點使相關腫瘤實體的樣本與正常組織樣本的基線值並列。可透過計算調節線性混合效應模型(Pinheiro et al.,2015)的p值將以上每個特點併入過度提呈分數中，從而透過假發現率(Benjamini and Hochberg,1995)調整多項檢驗(參見實施例1)。
對於透過質譜法對HLA配體的識別和相對定量，對來自衝擊冷凍組織樣本的HLA分子進行純化並對HLA相關肽進行分離。分離的肽分開，並透過線上納米-電噴霧-電離(nanoESI)液相色譜-譜(LC-MS)實驗進行鑒定。由此產生的肽序列的驗證方法是，將癌症樣本(N=來自377個供體的377個A*02陽性樣本，N=204個A*24陽性樣本)中記錄的自然腫瘤相 關肽(TUMAP)的片段模式與相同序列相應合成參考肽的片段模式進行比較。由於這些肽被直接鑒定為原發腫瘤HLA分子的配體，因此這些結果為來自574名癌症患者的原發癌症織上確定肽的自然加工和提呈提供了直接證據。
發現管道XPRESIDENT® v2.1(例如，參見US 2013-0096016，並在此透過引用將其整體併入本文)考慮到識別和選擇相關過量提呈的候選肽疫苗，這基於與幾種不同的非癌組織和器官相比癌症或其他受感染組織的HLA限制肽水準直接相對定量結果。這透過以下方法實現：使用專有資料分析管道處理的LC-MS採集資料、結合序列識別演算法、譜聚類、計算離子、保留時間調整、充電狀態卷積以及正態化而開發無標記差異化定量方法。
為每種肽和樣本確立了提呈水準，包括誤差估計值。腫瘤組織大量提呈的肽以及腫瘤與非腫瘤組織和器官中過量提呈的肽已經得到確定。
對來自組織樣本的HLA肽複合物進行純化，並且對HLA相關肽使用LC-MS進行分離和分析(見實施例)。本申請中包含的所有TUMAP用此方式確定于原發性癌症樣本上，證實它們提呈于原發性腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃 食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌或子宮癌。
在多個癌症和正常組織上確定的TUMAP用無標記LC-MS資料的離子計數方法進行量化。該方法假定肽的LC-MS信號區域與樣本中其豐度相關。各種LC-MS實驗中肽的所有量化信號在集中趨勢基礎上進行正常化，根據每個樣品進行平均，併合併入柱狀圖(被稱為提呈圖)。提呈圖整合了不同分析方法，如：蛋白資料庫檢索、譜聚類、充電狀態卷積(除電)和保留時間校準和正態化。
此外，發現管道XPRESIDENT® v2.1可對癌症或其他感染組織上的MHC-肽(優選為HLA限制性肽)進行直接的絕對定量。簡言之，總細胞計數根據被分析的組織樣本的總DNA含量來計算。組織樣本中TUMAP的總肽量用nanoLC-MS/MS測定為天然TUMAP的比率以及TUMAP同位素標記版本的已知量，稱為內部標準。TUMAP分離效率確定方法：把肽：所有選定TUMAP的MHC在TUMAP分離程序儘早的時間點加入組織裂解液，並在肽分離成後完成後透過nanoLC-MS/MS檢測。總細胞計數和總肽量根據每份組織樣本三次測量值來計算。所述肽特異性隔離效率計算為三次測量10次加標實驗的平均值(見實施例6和表14)。
RNA表達和質譜分析資料的這種組合分析獲得本發明的417種肽。
本發明提出了有利於治療癌腫/腫瘤，優選為治療過量提呈或只提呈本發明肽的腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌或子宮癌。這些肽由質譜分析法直接顯示出，而由HLA分子自然提呈于人原發癌樣本中。
與正常組織相比，癌症中高度過量表達肽來源的許多源基因/蛋白質(也指定為「全長蛋白」或「潛在蛋白」)-本發明相關的「正常組織」應指源自與腫瘤相同器官的健康細胞或組織或其他正常組織細胞，這表明腫瘤與這些源基因的高度關聯性(見實施例2)。此外，這些肽本身也在腫瘤組織中過度提呈(本發明相關的「腫瘤組織」是指來自癌症患者的樣本)，但不在正常組織中過度提呈(如見實施例1)。
HLA結合肽能夠被免疫系統識別，特別是T淋巴細胞。T細胞可破壞提呈被識別HLA/肽複合體的細胞(如：提呈衍生肽的腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵 巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌或子宮癌細胞)。
本發明的所有肽已被證明具有刺激T細胞反應的能力，並過量提呈，因而可用于製備本發明的抗體和/或TCR，例如可溶性TCR(參見實施例3)。此外，肽與相應的MHC組合時，也可用于製備本發明的抗體和/或TCR，特別是sTCR。各個方法均為技術人員所熟知，並在各個文獻中可找到。因此，本發明的肽可用于在患者中產生免疫反應，從而能夠毀滅腫瘤細胞。患者的免疫反應能夠透過直接給予患者所述肽或前體物質(如，加長肽、蛋白或編碼這些肽的核酸)，較理想是與加強免疫原性的製劑相結合，而進行誘導。源自該治療性疫苗的免疫反應預期能夠高度特異性地對抗腫瘤細胞，因為本發明的目標肽在正常組織上提呈的複製數目較少，防止患者發生對抗正常細胞的不良自體免疫反應的風險。
本說明書還涉及包含一個α鏈和一個β鏈(「α/β TCR」)的T細胞受體(TCR)。還提供了由MHC分子提呈時可與TCR和抗體結合的肽。本說明書還涉及核酸、載體和用於表達TCR的宿主細胞和本說明書的肽；以及使用它們的方法。
術語「T細胞受體」(縮寫TCR)是指一種異二聚體分子，其包含一個α多肽鏈(α鏈)和一個β 多肽鏈(β鏈)，其中所述異二聚體受體能夠結合由HLA分子提呈的肽抗原。該術語還包括所謂的γ/δ TCR。
在一個實施方案中，本說明書提供了如本文中所描述的產生TCR的方法，該方法包括在適於促進TCR表達的條件下培養能夠表達TCR的宿主細胞。
另一個方面，本說明書涉及一種根據本說明書的方法，其中所述抗原透過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達於合適抗原提呈細胞或人工抗原呈遞細胞表面的I或II類MHC分子，或該抗原透過四聚化被載入I或II類MHC四聚體/I或II類MHC複合單體。
α/β TCR的α和β鏈和γ/δ TCR的γ和δ鏈通常被視為各自有兩個「結構域」，即可變和恒定結構域。可變結構域由可變區(V)和連接區(J)的組合。可變結構域還可能包括一個前導區(L)。β和δ鏈還可能包括一個多樣區(D)。α和β恒定結構域還可能包括錨定α和β鏈至細胞膜的C末端跨膜(TM)結構域。
相對於γ/δ的TCR，如本文所用的術語「TCR γ可變域」是指無前導區(L)的TCR γ V(TRGV)區與TCR γ(TRGJ)區的組合，術語TCR γ恒定結構域是指細胞外TRGC區域，或C-末端截短TRGC序列。同樣地，「TCR δ可變域」是指無前導區(L)的TCR δ V(TRDV)區與TCR δ D/J (TRDD/TRDJ)區的組合，術語「TCR δ恒定結構域」是指細胞外TRDC區域，或C-末端截短TRDC序列。
本說明書的TCR優選結合至肽HLA分子複合體，其具有約100μM或更小、約50μM或更小、約25μM或更小或約10μM或更小的結合親和力(KD)。更為優選的情況是具有約1μM或更小、約100nM或更小、約50nM或更小或約25nM或更小結合親和力的高親和力TCR。本發明TCR優選結合親和力範圍的非限制性示例包括約1nM至約10nM；約10nM至約20nM；約20nM至約30nM；約30nM至約40nM；約40nM至約50nM；約50nM至約60nM；約60nM至約70nM；約70nM至約80nM；約80nM至約90nM；以及約90nM至約100nM。
與本說明書TCR相關，本文使用的「特異性結合」及其語法變體用於表示對100μM或更小的肽-HLA分子複合體有結合親和力(KD)的TCR。
本說明書的α/β異二聚體TCR可能具有其恒定結構域之間的引入二硫鍵。這種類型的優選TCR包括那些具有一個TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列的TCR，除非TRAC的蘇氨酸48和TRBC1或TRBC2的絲氨酸57被半胱氨酸殘基取代，所述半胱氨酸形成TRAC恒定域序列和TCR的TRBC1或TRBC2恒定區序列之間的二硫鍵。
不論具有或不具有上述的引入鏈間鍵，本說明書的α/β雜二聚體TCR可能具有一個TRAC恒定域序列和一個TRBC1或TRBC2恒定結構域序列，並且TRAC恒定結構域序列和TCR的TRBC1或TRBC2恒定結構域序列可能透過TRAC外顯子2的Cys4和TRBC1或TRBC2外顯子2的Cys4之間的天然二硫鍵相連。
本說明書的TCR可能包括選自由放射性核素、螢光團和生物素組成組中的可檢測標記。本說明書的TCR可能共軛至治療活性劑，如放射性核素、化學治療劑或毒素。
在一個實施方案中，具有在α鏈中至少一個突變和/或具有在β鏈中至少一個突變的TCR與未突變TCR相比，已經修改了糖基化。
在一個實施方案中，在TCR α鏈和/或TCR β鏈中包括至少一個突變的TCR對肽HLA分子複合體有結合親和力和/或結合半衰期，其是包含未突變TCR α鏈和/或未突變TCR β鏈的TCR的結合親和力的至少兩倍。腫瘤特異性TCR親和力增強及其開發依賴於存在最佳TCR親和力的窗口。這樣窗口的存在是根據觀察結果：HLA-A2限制性病原體特異性TCR與HLA-A2限制性腫瘤相關自身抗原特異性TCR相比，KD值通常大約低10倍。現已知，儘管腫瘤抗原可能具有免疫原性，但是因為腫瘤來自個體自身的細胞，因此僅突變蛋白質或翻譯加工改變的蛋白將被免疫系統視為外來物質。上調或過 度表達(所謂的自體抗原)的抗原不一定誘導針對腫瘤的功能免疫應答：表達對這些抗原具有高度反應性的TCR的T細胞會在一種稱為中樞耐受的程序中在胸腺內被不利選擇，也就是說只有對自身抗原具有低親和力TCR的細胞才仍然存在。因此，本說明書的TCR或變體對本發明的肽的親和力可透過本領域熟知的方法來增強。
本說明書還涉及一種識別和分離本發明TCR的一種方法，所述方法包括：用A2/肽單體從HLA-A*02陰性健康供體孵育PBMC，用四聚體-藻紅蛋白(PE)孵育PBMC並透過螢光活化細胞分選(FACS)-Calibur方法分析分離高親和力T細胞。
本說明書還涉及一種識別和分離本發明TCR的一種方法，所述方法包括：獲得含整個人體TCRαβ基因位點(1.1 and 0.7Mb)的轉基因小鼠(其T細胞表達多樣化人類TCR，用於補償小鼠TCR缺乏)，用相關肽對小鼠進行免疫處理，用四聚體-藻紅蛋白(PE)孵育從轉基因小鼠中獲得的PBMC，並透過螢光活化細胞分選(FACS)-Calibur方法分析分離高親和力T細胞。
一方面，為了獲得表達本說明書TCR的T細胞，編碼本說明書TCR-α和/或TCR-β鏈的核酸被克隆入表達載體，諸如γ反轉錄病毒或慢病毒。重組病毒產生，然後測試功能，如抗原專一性和功能性親合力。然後，最終產品的等分試樣被用於轉導靶T細胞群體(一般純化自患者的PBMC)，在輸入患者前展開。另一方面，為了 獲得表達本說明書TCR的T細胞，TCR RNA透過本領域中已知的技術(例如，體外轉錄系統)合成。然後，體外合成的TCR RNA透過電穿孔來重新表達腫瘤特異性TCR-α和/或TCR-β鏈被引入獲得自健康供體的初級CD8+ T細胞。
為了增加表達，編碼本說明書TCR的核酸在操作上可連接到強啟動子，例如逆轉錄病毒長末端重複序列(LTR)、巨細胞病毒(CMV)、鼠幹細胞病毒(MSCV)U3、磷酸甘油酸激酶(PGK)、β肌動蛋白、泛素蛋白和猿猴病毒40(SV40)/CD43複合啟動子、延伸因子(EF)-1a和脾臟病灶形成病毒(SFFV)啟動子。在一優選實施方案中，啟動子與被表達的核酸異源。除了強啟動子外，本說明書的TCR表達盒可能含有附加的元素，可提高轉基因表達，包括中樞多聚嘌呤區(CPPT)，其促進了慢病毒構建體的核易位(Follenzi et al.,2000)，和土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元素(WPRE)，其透過提高RNA穩定性增加轉基因表達水準(Zufferey et al.,1999)。
本發明TCR的α和β鏈可由位於分開的載體核酸進行編碼，或者可透過位於同一載體的多核苷酸編碼。
實現高水準的TCR表面表達需要引入TCR的TCR-α和TCR-β鏈高水準轉錄。為了實現它，本說明書的TCR-α和TCR-β鏈可在單一的載體中被克隆入雙順反子構建體，其已被證明能夠克服這一障礙。使 用TCR-α和TCR-β鏈在之間的病毒核糖體間進入位元點(IRES)導致兩鏈的協同表達，因為TCR-α和TCR-β鏈均由在翻譯過程中分成兩個蛋白質的單一轉錄物產生，從而確保了產生TCR-α和TCR-β鏈的相等摩爾比。(Schmitt et al.2009)。
編碼本說明書TCR的核酸可以是被優化以從宿主細胞增加表達的密碼子。遺傳密碼冗餘讓一些氨基酸被一個以上的密碼子編碼，但某些密碼子沒有其他密碼子「優化」，因為匹配tRNA以及其他因子的相對可用性(Gustafsson et al.,2004)。修改TCR-α和TCR-β基因序列使得每個氨基酸被用於哺乳動物基因表達的最佳密碼子編碼，以及消除mRNA不穩定性基序或隱蔽剪接位元點，已顯示可顯著提高TCR-α和TCR-β基因表達(Scholten et al.,2006)。
此外，引入的和內源性TCR鏈之間的錯配可能會導致獲得特異性，其構成自身免疫的顯著風險。例如，混合TCR二聚體的形成可能會減少可用以形成正確配對TCR複合體的CD3分子數目，因此，可以顯著降低表達所引入TCR的細胞的功能性親合力(Kuball et al.,2007)。
為了減少錯配，本說明書引入的TCR鏈的C-末端結構域可以進行修改以促進鏈間親和力，同時降低引入鏈與內源TCR配對的能力。這些策略可能包括用鼠配對物取代人類TCR-α和TCR-β C端結構域(鼠化 C端結構域)；透過引入第二個半胱氨酸殘基到引入TCR的TCR-α和TCR-β鏈產生C末端結構域的第二個鏈間二硫鍵(半胱氨酸修飾)；交換TCR-α和TCR-β鏈C端結構域的相互作用殘基(「杵臼結構」)；直接融合TCR-α和TCR-β鏈可變結構域至CD3 ζ(CD3 ζ融合)(Schmitt et al.2009)。
在一實施方案中，宿主細胞被改變結構以表達本說明書的TCR。在一優選實施方案中，宿主細胞為人T細胞或T細胞祖細胞。在一些實施方案中，T細胞或T細胞祖細胞從癌症患者中獲得。在另一些實施方案中，T細胞或T細胞祖細胞從健康供體中獲得。本說明書的宿主細胞相對於待治療的患者可以為同種異體或自體的。在一實施方案中，宿主是被轉化以表達α/β TCR的γ/δ T細胞。
「藥物組合物」是指適合在醫療機構用於人體的組合物。優選地，藥物組合物為無菌狀態，並根據GMP指南生產。
藥物組合物包括游離形式或以一種藥用鹽形式存在的肽(也參見上文)。此處使用的「藥用鹽」系指所公開的肽的一種衍生物，其中該肽由制酸或藥劑的堿鹽進行改性。例如，用與適合的酸反應的游離堿(通常其中的中性藥物有一個中性-NH2基團)製備酸式鹽。適合製備酸鹽的酸包括有機酸，如：乙酸、丙酸、羥基酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、 甲磺酸、苯磺酸、水楊酸等等、以及無機酸，如：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一種肽上提呈的酸性基團的堿鹽製劑使用藥用堿基進行製備，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等等。
在特別優選的實施方案中，藥物組合物包括乙酸(醋酸鹽)，三氟乙酸鹽或鹽酸(氯化物)形式的肽。
本發明中所述的藥劑優選為一種免疫治療藥劑，例如，一種疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射方式全身給藥，或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨後再將這些細胞注入到患者中)，或體外用於從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然後再將細胞重新給予患者)。如果核酸體外注入細胞，可能有益於細胞轉染，以共同表達免疫刺激細胞因子(如白細胞介素-2)。肽可完全單獨給藥，也可與免疫刺激佐劑相結合(見下文)、或與免疫刺激細胞因子聯合使用、或以適當的輸送系統給藥(例如脂質體)。該肽也可共軛形成一種合適的載體(如鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或甘露)到合適的載體(參閱WO 95/18145及(Longenecker et al.,1993))。肽也可能被標記，可能是融合蛋白，或可能是雜交分子。在本發明中給出序列的肽預計能刺激CD4或CD8 T細胞。然而，在有CD4 T-輔助細胞的幫助時，CD8 T細胞刺激更加有效。因此，對於刺激CD8 T細胞的MHC-I類表位，一種雜合分子的融合夥伴或片段提供了 刺激CD4陽性T細胞的適當表位。CD4-和CD8刺激表位為本領域所熟知、並包括本發明中確定的表位。
一方面，疫苗包括至少含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388中提出的一種肽以及至少另外一種肽，優選為2至50個、更優選為2至25個、再優選為2至20個、最優選為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個肽。肽可能從一個或多個特定TAA中衍生，並且可能與MHC I類分子結合。
另一方面，本發明提出了一種編碼本發明中肽或肽變體的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能為，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA或其組合物，它們可為單鏈和/或雙鏈、或多聚核苷酸的原生或穩定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，並且只要它編碼肽，就可能包含也可能不包含內含子。當然，多聚核苷酸只能編碼加入天然肽鍵並含有天然氨基酸殘基的肽。另一個方面，本發明提出了一種可根據本發明表達多肽的表達載體。
對於連接多核苷酸，已經開發出多種方法，尤其是針對DNA，可透過向載體補充可連接性末端等方法進行連接。例如，可向DNA片段加入補充性均聚物軌道，之後DNA片段被插入到載體DNA。然後，透過補充性均聚物尾巴的氫鍵結合，將載體和DNA片段結合，從而形成重組DNA分子。
含有一個或多個酶切位點的合成接頭為DNA片段與載體連接提供了另一種方法。含各種限制性核酸內切酶的合成接頭可透過多種管道購得，其中包括從國際生物技術公司(International Biotechnologies Inc,New Haven,CN，美國)購得。
編碼本發明多肽的DNA理想修飾方法是使用Saiki等人(Saiki et al.,1988)所採用的聚合酶鏈反應方法。此方法可用於將DNA引入合適的載體(例如，透過設計合適的酶切位點)，也可用於本領域已知的其他有用方法修飾DNA。如果使用病毒載體，痘病毒載體或腺病毒載體為優選。
之後，DNA(或在逆轉錄病毒載體情況下，RNA)可能表達於合適的宿主，從而製成含本發明肽或變體的多肽。因此，可根據已知技術使用編碼本發明肽或變體的DNA，用本文所述方法適當修飾後，構建表達載體，然後表達載體用於轉化合適宿主細胞，從而表達和產生本發明中的多肽。此類技術包括那些公開於，例如，美國專利4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810,648。
編碼含本發明化合物多肽的DNA(或在逆轉錄病毒載體情況下，RNA)可能被加入到其他多種DNA序列，從而引入到合適的宿主中。同伴DNA將取決於 宿主的性質、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持為游離體還是要相互結合。
一般來說，DNA可以適當的方向和正確的表達閱讀框架附著到一種表達載體(如質粒)中。如有必要，該DNA可能與所需宿主所識別的相應轉錄和翻譯調節控制核苷酸序列連接，儘管表達載體中一般存在此類控制功能。然後，該載體透過標準方法被引入宿主。一般來說，並不是所有的宿主都會被載體轉化。因此，有必要選擇轉化過的宿主細胞。選擇方法包括用任何必要的控制元素向表達載體插入一個DNA序列，該序列對轉化細胞中的可選擇性屬性(如抗生素耐藥性)進行編碼。
另外，有這種選擇屬性的基因可在另外一個載體上，該載體用來協同轉化所需的宿主細胞。
然後，本發明中的重組DNA所轉化的宿主細胞在本文中所述本領域技術人員熟悉的合適條件下培養足夠長的時間，從而表達之後可回收的肽。
有許多已知的表達系統，包括細菌(如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)、酵母(如酵母菌)、絲狀真菌(如曲黴菌)、植物細胞、動物細胞及昆蟲細胞。該系統可優選為哺乳動物細胞，如來自ATCC細胞生物學庫(Cell Biology Collection)中的CHO細胞。
典型的哺乳動物細胞組成型表達載體質粒包括CMV或含一個合適的多聚A尾巴的SV40啟動子以及抗性標誌物(如新黴素)。一個實例為從Pharmacia 公司(Piscataway，新澤西，美國)獲得的pSVL。一種可誘導型哺乳動物表達載體的例子是pMSG，也可以從Pharmacia公司獲得。有用的酵母質粒載體是pRS403-406和pRS413-416，一般可從Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla,CA 92037，美國)獲得。質粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型質粒(YIp)，並插入了酵母可選擇性標記物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416質粒為酵母著絲粒質粒(Ycp)。基於CMV啟動子的載體(如，來自於Sigma-Aldrich公司)提供了暫態或穩定的表達、胞漿表達或分泌，以及FLAG、3xFLAG、c-myc或MATN不同組合物中的N-端或C-端標記。這些融合蛋白可用於檢測、純化及分析重組蛋白。雙標融合為檢測提供了靈活性。
強勁的人巨細胞病毒(CMV)啟動子調控區使得COS細胞中的組成蛋白表達水準高達1mg/L。對於較弱的細胞株，蛋白水準一般低於0.1mg/L。SV40複製原點的出現將導致DNA在SV40複製容納性COS細胞中高水準複製。例如，CMV載體可包含細菌細胞中的pMB1(pBR322的衍生物)複製原點、細菌中進行氨苄青黴素抗性選育的鈣-內醯胺酶基因、hGH polyA和f1的原點。含前胰島素原引導(PPT)序列的載體可使用抗FLAG抗體、樹脂和板引導FLAG融合蛋白分 泌到進行純化的培養基中。其他與各種宿主細胞一起應用的載體和表達系統是本領域熟知眾所周知的。
在另一個實施方案中，對本發明的兩個或更多的肽或肽變體進行編碼，因此，以一個連續順序(類似於「一串珠子」的構建體)表達。在達到目標，所述肽或肽變體可能透過連接子氨基酸的延伸處(例如LLLLLL)連接或融合一起，也可能他們之間沒有任何附加的肽而被連接。這些構建體也可用於癌症治療，可誘導涉及MHC I和MHC II類分子的免疫應答。
本發明還涉及一種宿主細胞，其以本發明的多核苷酸載體構建轉化而來。宿主細胞可為原核細胞，也可為真核細胞。在有些情況下，細菌細胞為優選原核宿主細胞，典型為大腸桿菌株，例如，大腸桿菌菌株DH5(從Bethesda Research Laboratories公司(Bethesda,MD，美國)獲得)和RR1(從美國菌種保藏中心(ATCC,Rockville,MD，美國)，ATCC編號31343獲得)。首選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞，優選為脊椎動物細胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纖維細胞和結腸癌細胞株中的細胞。酵母宿主細胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可從Stratagene Cloning Systems公司(La Jolla,CA 92037，美國)獲得。首選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞為ATCC中的CCL61細胞、NIH瑞士小鼠胚胎細胞NIH/3T3為ATCC中的CRL 1658細胞、猴腎源性COS-1細胞為ATCC中的CRL 1650細胞以及人胚胎腎細胞的293號細胞。首選昆蟲細胞為Sf9細胞，可用杆狀病毒表達載體轉染。有關針對表達選擇合適宿主細胞的概要，可從教科書(Paulina Balbás and Argelia Lorence《Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression,Reviews and Protocols》Part One,Second Edition,ISBN 978-1-58829-262-9)和技術人員知道的其他文獻中查到。
含本發明DNA結構的適當宿主細胞的轉化可使用大家熟知的方法完成，通常取決於使用載體的類型。關於原核宿主細胞的轉化，請參見，例如，Cohen等人的文獻(Cohen et al.,1972)和(Green and Sambrook,2012)。酵母細胞的轉化在Sherman等人的文章(Sherman et al.,1986)中進行了描述。Beggs(Beggs,1978)中所述的方法也很有用。對於脊椎動物細胞，轉染這些細胞的試劑等，例如，磷酸鈣和DEAE-葡聚糖或脂質體配方，可從Stratagene Cloning Systems公司或Life Technologies公司(Gaithersburg,MD 20877，美國)獲得。電穿孔也可用於轉化和/或轉染細胞，是本領域用於轉化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和脊椎動物細胞大家熟知的方法。
被成功轉化的細胞(即含本發明DNA結構的細胞)可用大家熟知的方法(如PCR)進行識別。另外，上清液存在的蛋白可使用抗體進行檢測。
應瞭解，本發明中的某些宿主細胞用於製備本發明中的肽，例如細菌細胞、酵母細胞和昆蟲細胞。但是，其他宿主細胞可能對某些治療方法有用。例如，抗原提呈細胞(如樹突狀細胞)可用于表達本發明中的肽，使他們可以加載入相應的MHC分子中。因此，本發明提出了含本發明中核酸或表達載體的一種宿主細胞。
在一個優選實施方案中，宿主細胞為抗原提呈細胞，尤其是樹突狀細胞或抗原提呈細胞。2010年4月29日，美國食品和藥物管理局(FDA)批准載有含攝護腺酸性磷酸酶(PAP)的重組融合蛋白可用於治療無症狀或症狀輕微的轉移性HRPC(Rini et al.,2006；Small et al.,2006)。
另一方面，本發明提出了一種配製一種肽及其變體的方法，該方法包括培養宿主細胞和從宿主細胞或其培養基中分離肽。
在另一個實施方案中，本發明中的肽、核酸或表達載體用於藥物中。例如，肽或其變體可製備為靜脈(i.v.)注射劑、皮下(s.c.)注射劑、皮內(i.d.)注射劑、腹膜內(i.p.)注射劑、肌肉(i.m.)注射劑。肽注射的優選方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的優選方法為i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。 例如，給予50μg至1.5mg，優選為125μg至500μg的肽或DNA，這取決於具體的肽或DNA。上述劑量範圍在以前的試驗中成功使用(Walter et al.,2012)。
用於主動免疫接種的多聚核苷酸可為基本純化形式，也可包被於載體或輸送系統。核酸可能為DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能為其組合物。這種核酸的設計和引入方法為本領域所熟知。例如，文獻中有其概述(Teufel et al.,2005)。多核苷酸疫苗很容易製備，但這些載體誘導免疫反應的作用模式尚未完全瞭解。合適的載體和輸送系統包括病毒DNA和/或RNA，如基於腺病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒、腺相關病毒或含一種以上病毒元素的混合病毒的系統。非病毒輸送系統包括陽離子脂質體和陽離子聚合物，是DNA輸送所屬領域內熟知的系統。也可使用物理輸送系統，如透過「基因槍」。肽或核酸編碼的肽可以是一種融合蛋白，例如，含刺激T細胞進行上述CDR的表位。
本發明的藥劑也可能包括一種或多種佐劑。佐劑是那些非特異性地增強或加強免疫反應的物質(例如，透過CD8-陽性T細胞和輔助T(TH)細胞介導的對一種抗原的免疫應答，因此被視為對本發明的藥劑有用。適合的佐劑包括(但不僅限於)1018ISS、鋁鹽、AMPLIVAX®、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的TLR5配體、FLT3配體、GM-CSF、IC30、IC31、 咪喹莫特(ALDARA®)、resiquimod、ImuFact IMP321、白細胞介素IL-2、IL-13、IL-21、干擾素α或β，或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、JuvImmune®、LipoVac、MALP2、MF59、單磷醯脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳狀液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、PepTel®載體系統、基於聚丙交酯複合乙交酯[PLG]和右旋糖苷微粒、重組人乳鐵傳遞蛋白SRL172、病毒顆粒和其他病毒樣顆粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支桿菌提取物和細菌細胞壁合成模擬物的Aquila公司的QS21刺激子，以及其他專有佐劑，如：Ribi's Detox、Quil或Superfos。優選佐劑如：弗氏佐劑或GM-CSF。前人對一些樹突狀細胞特異性免疫佐劑(如MF59)及其製備方法進行了描述(Allison and Krummel,1995)。也可能使用細胞因子。一些細胞因子直接影響樹突狀細胞向淋巴組織遷移(如，TNF-)，加速樹突狀細胞成熟為T淋巴細胞的有效抗原提呈細胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美國5849589號專利，特別以其完整引用形式併入本文)，並充當免疫佐劑(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich et al.,1996)。
據報告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐劑在疫苗中的作用。如果沒有理論的約束，CpG寡核苷酸可透過Toll樣受體(TLR)(主要為TLR9)活化先天(非適應性)免疫系統從而起作用。CpG引發的TLR9活化作用提高了對各種抗原的抗原特異性體液和細胞反應，這些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被殺死的病毒、樹突狀細胞疫苗、自體細胞疫苗以及預防性和治療性疫苗中的多糖結合物。更重要的是，它會增強樹突狀細胞的成熟和分化，導致TH1細胞的活化增強以及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成加強，甚至CD4 T細胞說明的缺失。甚至有疫苗佐劑的存在也能維持TLR9活化作用誘發的TH1偏移，這些佐劑如：正常促進TH2偏移的明礬或弗氏不完全佐劑(IFA)。CpG寡核苷酸與以下其他佐劑或配方一起製備或聯合給藥時，表現出更強的佐劑活性，如微粒、納米粒子、脂肪乳或類似製劑，當抗原相對較弱時，這些對誘發強反應尤為必要。他們還能加速免疫反應，使抗原劑量減少約兩個數量級，在有些實驗中，對不含CpG的全劑量疫苗也能產生類似的抗體反應(Krieg,2006)。美國6406705 B1號專利對CpG寡核苷酸、非核酸佐劑和抗原結合使用促使抗原特異性免疫反應進行了描述。一種CpG TLR9拮抗劑為Mologen公司(德國柏林)的dSLIM(雙幹環免疫調節劑)，這是本發明藥物組合物的優選成分。也可使用其他如TLR結合分子，如：RNA結合TLR7、TLR8和/或TLR9。
其他有用的佐劑例子包括(但不限於)化學修飾性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA模擬物，如，Poly(I：C)及其衍生物(如：AmpliGen、Hiltonol、多聚-(ICLC)、多聚(IC-R)、多聚(I：C12U))、非CpG細菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗體，如：環磷醯胺、舒尼替單抗、貝伐單抗®、西樂葆、NCX-4016、西地那非、他達拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系統的其他抗體靶向性主要結構(如：抗-CD40、抗-TGF β、抗-TNF α受體)和SC58175，這些藥物都可能有治療作用和/或充當佐劑。技術人員無需過度進行不當實驗就很容易確定本發明中有用的佐劑和添加劑的數量和濃度。
首選佐劑是抗-CD40、咪喹莫特、瑞喹莫德、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、干擾素α、CpG寡核苷酸及衍生物、多聚(I：C)及衍生物、RNA、西地那非和PLG或病毒顆粒的微粒製劑。
本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑從含集落刺激因子製劑中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、環磷醯胺、咪喹莫特、resiquimod和干擾素-α。
本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑從含集落刺激因子製劑中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺 激因子(GM-CSF，沙格司亭)、環磷醯胺、咪喹莫特和resimiquimod。在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑為環磷醯胺、咪喹莫特或resiquimod。更優選的佐劑是Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、聚-ICLC(Hiltonol®)和抗CD40 mAB或其組合物。
此組合藥物為非腸道注射使用，如皮下、皮內、肌肉注射，也可口服。為此，肽和其他選擇性分子在藥用載體中分解或懸浮，優選為水載體。此外，組合物可包含輔料，如：緩衝劑、結合劑、衝擊劑、稀釋劑、香料、潤滑劑等。這些肽也可與免疫刺激物質合用，如：細胞因子。可用於此類組合物的更多輔料可在從A.Kibbe所著的Handbook of Pharmaceutical Excipients(Kibbe,2000)等書中獲知。此組合藥物可用於阻止、預防和/或治療腺瘤或癌性疾病。例如，EP2112253中有示例製劑。
重要的是要認識到，透過本發明的疫苗引發的免疫應答在不同的細胞階段和開發的不同階段攻擊癌症。而且不同的癌症相關信號通路被攻擊。這相對於其他疫苗的優勢，這些疫苗只針對一個或幾個靶標，這可能會導致腫瘤很容易適應於攻擊(腫瘤逃逸)。此外，並非所有的個體腫瘤都表達相同模式的抗原。因此，幾個腫瘤相關肽的組合確保了每個腫瘤都承擔至少一些靶標。該組合物以這 樣的方式設計，預期每個腫瘤可表達幾種抗原並覆蓋腫瘤生長和維持所需要的幾種獨立的途徑。因此，疫苗可易於「現成的」用於較大患者群體。這意味著，預選擇接受疫苗治療的患者可限制為HLA分型，無需抗原表達的任何額外的生物標誌物評估，但仍然確保多個靶標同時被誘導的免疫應答攻擊，這對於療效很重要(Banchereau et al.,2001；Walter et al.,2012)。
本文所用的「支架」一詞是指與(如抗原)決定因子特異性結合的分子。在一項實施方案中，支架是能夠引導其所連接的實體(例如，(第二)抗原結合部分)至目標靶點，例如，至特定類型的腫瘤細胞或承載抗原決定簇的腫瘤基質(如根據目前申請中肽和MHC的複合體)。在另一項實施例中，支架能夠透過其靶抗原(例如T細胞受體複合體抗原)活化信號通路。支架包括但不限於抗體及其片段，抗體的抗原結合區，其包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區，結合的蛋白包括至少一個錨蛋白重複序列基元和單域抗原結合(SDAB)分子、適體、(可溶)TCR和(經修飾的)細胞，例如同種異體或自體T細胞。為了評估某個分子是否是結合至靶點的支架，可進行結合測定。
「特定」結合系指，與其他天然肽-MHC複合體相比，該支架與感興趣的肽-MHC複合體更好地結合，結合程度為，擁有能夠殺死承載特定靶點細胞的活性分子的支架不能夠殺死無特定靶點但提呈一個或多個其他肽 -MHC複合體的另一細胞。如果交叉反應性肽-MHC的肽並不是天然的，即，並非來自人HLA-多肽組，則結合至其他肽-MHC複合體是無關緊要的。評估靶細胞殺傷的測試在本領域中是公知的。它們應該含有未改變的肽-MHC提呈的靶細胞(原發細胞或細胞系)或載有肽的細胞進行，以便達到天然肽-MHC的水準。
各支架可包括一個標記，其透過確定是否存在或不存在標籤所提供的信號可檢測到結合支架。例如，該支架可用螢光染料或任何其他適用的細胞標記分子進行標記。此類標記分子是本領域中公知的。例如，透過螢光染料進行的螢光標記可透過螢光或鐳射掃描顯微術或流式細胞術提供結合適體的視覺化。
各支架可與第二個活性分子(例如IL-21、抗CD3、抗CD28)共軛。
關於多肽支架的進一步資訊，可參閱，例如，在WO 2014/071978A1背景技術部分，並作為參考文獻引用。
本發明還涉及適體。適體(例如，參見WO 2014/191359及其中引用的文獻)是短的單鏈核酸分子，其可以折疊為所定義的三維結構並識別特定的靶標結構。它們似乎是開發靶向治療的合適替代方法。適體已顯示可選擇性與具有高親和力和特異性的複合體靶標相結合。
識別細胞表面分子的適體在過去十年內已經確定，並為開發診斷和治療方法提供了手段。由於適體已顯示幾乎無毒性和免疫原性，因此，它們是生物醫學應用中有前景的候選物質。事實上適體，例如攝護腺特異性膜抗原識別適體，已被成功地用於靶向治療並在體內模型的異種移植物中顯示出功能。此外，認識到特定腫瘤細胞系的適體也已確定。
可選擇DNA適體來揭示各種癌細胞的廣譜識別屬性，特別是那些來自於實體瘤的細胞，而非致瘤和主要健康細胞不被識別。如果所識別的適體不僅識別腫瘤特異性子類型，而且與一系列腫瘤相互作用，這使適體適用于作為所謂的廣譜診斷和治療手段。
此外，用流式細胞儀對細胞結合行為的研究顯示，適體在納摩爾範圍內顯示出很好的親和力。
適體用於診斷和治療目的。此外，也可能顯示，一些適體被腫瘤細胞吸取，因而可作為抗癌劑靶向遞送的分子賦形劑，例如siRNA進入腫瘤細胞。
可選擇適體針對複合體的靶標，如細胞和組織以及包含、優選包括根據任何SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 388的一個序列、根據當前發明的肽複合體與MHC分子，使用細胞SELEX(透過指數富集的配體系統進化)技術。
本發明中的肽可用于生成和開發出針對MHC/肽複合物的特定抗體。這些抗體可用於治療，將毒素或放 射性物質靶向病變組織。這些抗體的另一用途是為了成像之目的(如PET)將放射性核素靶向病變組織。這可有助於檢測小轉移灶或確定病變組織的大小和準確位置。
因此，本發明的另一方面是提出產生特異性結合至與HLA限制性抗原絡合的I或II類人主要組織相容性複合體(MHC)的一種重組抗體的方法，該方法包括：用可溶形式的與HLA限制性抗原絡合的(MHC)I或II類分子對包含表達所述主要組織相容性說複合體(MHC)I或II類的基因工程非人哺乳動物進行免疫；將mRNA分子與產生所述非人哺乳動物細胞的抗體分離；產生一個噬菌體顯示庫，顯示由所述mRNA分子編碼的蛋白分子；以及將至少一個噬菌體與所述噬菌體顯示庫分離，所述的至少一個噬菌體顯示所述抗體特異性地結合至與HLA限制性抗原絡合的所述人主要組織相容性說複合體(MHC)I或II類。
本發明的另一方面提出一種抗體，其特異性結合至與一種HLA限制性抗原絡合的I或II類人主要組織相容性說複合體(MHC)，其中該抗體優選為多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體和/或嵌合抗體。
產生這種抗體和單鏈I類主要組織相容性複合物的相應方法，以及產生這些抗體的其他工具在WO 03/068201、WO 2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752以及出版物(Cohen et al.,2003a；Cohen et al.,2003b；Denkberg et al.,2003)中 進行了披露，為了本發明之目的，所有參考文獻透過引用被完整地併入本文。
優選地，該抗體與複合體的結合親和力低於20納摩爾，優選為低於10納摩爾，這在本發明情況下也被視為具有「特異性」。
本發明涉及一種肽，包含選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388組成的組的一個序列或該序列的與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388具有88%同源性(優選為相同)的一種變體，或誘導與所述變異肽發生T細胞交叉反應的一種變體，其中，所述肽不是基本的全長多肽。
本發明進一步涉及一種肽，包含選自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388組成的組的一個序列、或與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388具有至少88%同源性(優選為相同)的一種變體，其中所述肽或變體的總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至14個氨基酸。
本發明進一步涉及本發明的肽，其具有與主要組織相容性複合體(MHC)I或II類分子結合的能力。
本發明進一步涉及本發明中的肽，其中肽系由或基本系由根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的一個氨基酸序列組成。
本發明進一步涉及本發明的肽，其中該肽(在化學上)被修飾和/或包含非肽鍵。
本發明進一步涉及本發明的肽，其中該肽為融合蛋白的一部分，特別包括HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的N-端氨基酸，或其中該肽與一種抗體(例如，樹突狀細胞特定抗體)融合。
本發明進一步涉及一種核酸，其編碼本發明所述肽，前提是該肽並非完整(完全)的人蛋白。
本發明進一步涉及一種本發明的核酸，為DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能為其組合物。
本發明進一步涉及一種能表達或表達本發明核酸的表達載體。
本發明進一步涉及本發明的一種肽、本發明的一種核酸或本發明的一種藥用表達載體，特別是用於治療癌症，例如，腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌(GC)、睾丸癌(TC)、膀胱癌(UBC)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)或子宮癌(UEC)。
本發明進一步涉及含本發明核酸或本發明表達載體的一種宿主細胞。
本發明進一步涉及本發明的宿主細胞，其為抗原提呈細胞，優選為樹突細胞。
本發明進一步涉及配製本發明一種肽的一種方法，所述方法包括培養本發明的宿主細胞和從所述宿主細胞或其培養基中分離肽。
本發明進一步涉及本發明中的方法，其中抗原透過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達於合適抗原提呈細胞表面的I或II類MHC分子。
本發明進一步涉及本發明的方法，其中該抗原提呈細胞包括一個表達載體，該載體有能力表達含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的肽或所述變體氨基酸序列。
本發明進一步涉及以本發明方法製造的活化T細胞，其中所述T細胞有選擇性地識別一種細胞，該細胞異常表達含一種本發明氨基酸序列的多肽。
本發明進一步涉及一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發明任何氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者本發明的有效量T細胞。
本發明進一步涉及任何所述肽、本發明的一種核酸、本發明的一種表達載體、本發明的一種細胞、本發明一種作為藥劑或製造藥劑的活化細胞毒性T淋巴細胞的用途。本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中藥劑可有效抗癌。
本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中該藥劑為一種疫苗。本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中藥劑可有效抗癌。
本發明還一般涉及本發明的用途，其中所述癌細胞為實體或血液腫瘤細胞，如：例如，腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)或子宮癌。
本發明進一步涉及一種基於本發明肽的特定標誌物蛋白和生物標誌物，在此成為「靶標」，其可用於診斷和/或判斷腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)或子宮癌的預後。本發明還涉及這些供癌症治療使用的新靶點。
本文中術語「抗體」為廣義上的定義，既包括多克隆也包括單克隆抗體。除了完整或「全部」的免疫球蛋白分子，「抗體」這一術語還包括這些免疫球蛋白分子和人源化免疫球蛋白分子的片段(如，CDR、Fv、Fab和Fc片段)或聚合物，只要它們表現出本發明的任何期望屬性(例如，腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、 胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)或子宮癌標誌物(多)肽的特異性結合、將毒素傳遞給癌症標誌物基因表達水準增加時的癌細胞和/或抑制癌標誌物多肽的活性)。
只要有可能，本發明的抗體可從商業來源購買。本發明的抗體也可能使用已知的方法制得。技術人員會瞭解全長腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)或子宮癌(UEC)標誌物多肽或其片段可用于產生本發明的抗體。用於產生本發明抗體的多肽可部分或全部地由天然源經純化而得，也可利用重組DNA技術生產。
例如，本發明的編碼肽的cDNA，例如，該肽為根據SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388多肽的肽，或其中一個變體或片段，可在原核細胞中(如：細菌)或真核細胞(如：酵母、昆蟲或哺乳動物細胞)中表達，之後，可純化重組蛋白，並用於產生一種特異性結合用於產生本發明抗體的上述癌症標誌物多肽的單克隆或多克隆抗體製劑。
本領域的技術人員會認識到，兩種或兩種以上不同集合的單克隆抗體或多克隆抗體能最大限度地增加獲得一種含預期用途所需的特異性和親和力(例如，ELISA法、免疫組織化學、體內成像、免疫毒素療法)的抗體的可能性。根據抗體的用途，用已知的方法對其期望活性進行測試(例如，ELISA法、免疫組織化學、免疫治療等；要獲取產生和測試抗體的進一步指導，請參閱，例如，Greenfield,2014(Greenfield,2014))。例如，該抗體可用ELISA法或免疫印跡法、免疫組織化學染色福馬林固定的癌組織或冰凍的組織切片進行檢測。在初次體外表徵後，用於治療或體內診斷用途的抗體根據已知的臨床測試方法進行檢測。
此處使用的術語「單克隆抗體」系指從大量同質抗體中獲得的一種抗體，即，由相同的抗體組成的抗體群，但可能少量提呈的自然突變除外。此處所述的單克隆抗體具體包括「嵌合」抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與從特定物種中獲得的抗體或屬於特定抗體類型和分類型抗體的相應序列相同(同質)，同時，剩餘鏈與從其他物種中獲得的抗體或屬於特定抗體類型和子類型抗體的相應序列以及這些抗體的片段相同(同質)，只要他們表現出預期的拮抗活性(美國4816567號專利，其在此以其整體併入)。
本發明的單克隆抗體可能使用雜交瘤方法制得。在雜交瘤方法中，老鼠或其他適當的宿主動物，通常 用免疫製劑以引發產生或能產生將特異性結合至免疫製劑的抗體。或者，淋巴細胞可在體外進行免疫。
單克隆抗體也可由DNA重組方法制得，如：美國4816567號專利所述。編碼本發明單克隆抗體的DNA可很容易地使用傳統程序進行分離和測序(例如：透過使用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。
體外方法也適用於製備單價抗體。抗體消化以產生抗體的片段，尤其是Fab片段，可以透過使用本領域已知的常規技術完成。例如，可以透過使用木瓜蛋白酶完成消化。木瓜蛋白酶消化的實施例在WO 94/29348和美國4342566號專利中有描述。抗體的木瓜蛋白酶消化通常產生兩種相同的抗原結合性片段，稱為Fab片段(每個片段都有一個抗原結合點)和殘餘Fc片段。胃蛋白酶處理產生一個F(ab')2片段和一個pFc'片段。
抗體片段，不論其是否附著於其他序列，均可包括特定區域或特定氨基酸殘基的插入、刪除、替換、或其他選擇性修飾，但前提是，片段的活性與非修飾的抗體或抗體片段相比沒有顯著的改變或損害。這些修飾可提供一些額外的屬性，如：刪除/添加可與二硫鍵結合的氨基酸，以增加其生物壽命、改變其分泌特性等。在任何情況下，抗體片段必須擁有生物活性的特性，如：結合活性、調節結合域的結合力等。抗體的功能性或活性區域可透過蛋白特定區域的基因突變、隨後表達和測試所表達的多肽進行 確定。這些方法為本行業技術人員所熟知，可包括編碼抗體片段的核酸的特定位點基因突變。
本發明的抗體可進一步包括人源化抗體或人抗體。非人(如：鼠)抗體的人源化形式為嵌合抗體免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如：Fv、Fab、Fab'或抗體的其他抗原結合序列)，其中包含從非人免疫球蛋白中獲得的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體互補決定區(CDR)的殘基被來自非人物種(供體抗體)(如具有與其特異性、親和力和能力的小鼠、大鼠或兔子)CDR的殘基取代。在某些情況下，人類免疫球蛋白的Fv框架(FR)殘基被相應的非人殘基取代。人源化抗體可能還包括既非受體抗體、也非輸入CDR或框架序列中發現的殘基。一般來說，人源化抗體將包括幾乎所有的至少一個、通常為二個可變域，其中，全部或幾乎全部的CDR區域均對應於非人免疫球蛋白的區域並且全部或幾乎全部的FR區域均為人免疫球蛋白相同序列的區域。理想情況是，人源化抗體還將包括至少免疫球蛋白恒定區(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區的一部分。
人源化非人抗體的方法為本行業所熟知。一般來說，人源化抗體具有一個或多個從非人源頭引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基往往被稱為「輸入」殘基，通常從「輸入」可變域中獲得。人源化基本上可以透過將齧齒動物CDR或CDR序列取代為相應的人抗體序列而 完成。因此，這種「人源化」抗體為嵌合抗體(美國4816567號專利)，其中大大少於完整的人可變域被來自於非人物種的相應序列取代。在實踐中，人源化抗體通常為人抗體，其中有些CDR殘基以及可能的一些FR殘基被來自齧齒動物抗體中的類似位點的殘基取代。
可使用免疫後在內源性免疫球蛋白產生缺失時能產生完整人抗體的轉基因動物(如：小鼠)。例如，它被描述為，嵌合和種系突變小鼠中的抗體重鏈連接區域基因的純合性缺失導致內源性抗體生成的完全抑制。在此種系變種小鼠中人種系免疫球蛋白基因陣列的轉移在抗原挑戰後將導致人抗體的生成。人抗體也可在噬菌體展示庫中產生。
本發明的抗體優選為透過藥用載體的形式給予受試者。通常，在製劑中使用適量的藥用鹽，以使製劑等滲。藥用載體的例子包括生理鹽水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH值優選為約5至8，更優選為約7至7.5。此外，載體還包括緩釋製劑，如：含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質，其中基質為有形物品形式，如：薄膜、脂質體或微粒。本行業的技術人員熟知，某些載體可能為更優選，取決於例如，抗體的給藥途徑和濃度。
該抗體可透過注射(如：靜脈內、腹腔內、皮下、肌肉內)或透過輸注等其他方法給予受試者、患者或細胞，確保其以有效的形式傳輸到血液中。這些抗體也可以 透過瘤內或瘤周途徑給予，從而發揮局部和全身的治療作用。局部或靜脈注射為優選。
抗體給藥的有效劑量和時間表可根據經驗確定，並且作出此類決定屬本行業的技術範圍內。本行業的技術人員會明白，必須給予的抗體劑量根據以下因素會有所不同，例如：接受抗體的受試者、給藥途徑、使用的抗體以及其他正在使用的藥物的特定類型。單獨使用的抗體的通常日劑量可能為約1μg/kg至最多100mg/kg體重或更多，這取決於上述因素。給予抗體，優選為治療腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)或子宮癌後，治療抗體的療效可透過技術人員熟知的不同方法評估。例如：接受治療的受試者癌症的大小、數量和/或分佈可使用標準腫瘤成像技術進行監測。因治療而給予的抗體與不給予抗體時的病程相比，可阻止腫瘤生長、導致腫瘤縮小、和/或阻止新腫瘤的發展，這樣的抗體是一種有效治療癌症的抗體。
本發明的另一方面提出了製備識別特異性肽-MHC複合物的可溶性T細胞受體(sTCR)的一種方法。這種可溶性T細胞受體可從特異性T細胞克隆中產生，並且它們的親和力可以透過互補決定區靶向誘變而增 加。為了T細胞受體選擇之目的，可以使用噬菌體展示(美國2010/0113300，(Liddy et al.,2012))。為了在噬菌體展示期間以及實際使用為藥物時穩定T細胞受體之目的，可透過非天然二硫鍵、其他共價鍵(單鏈T細胞受體)或透過二聚化結構域連接α和β鏈(Boulter et al.,2003；Card et al.,2004；Willcox et al.,1999)。T細胞受體可以連接到毒素、藥物、細胞因子(參見US 2013/0115191)、域招募效應細胞，如抗CD3域等，以便對靶細胞執行特定的功能。此外，它可能表達於用於過繼轉移的T細胞。進一步的資訊可在WO 2004/033685A1和WO 2004/074322A1中找到。sTCR的組合在WO 2012/056407A1中進行了描述。WO 2013/057586A1中公開了製備的進一步的方法。
此外，可用本發明的肽和/或TCR或抗體或其他結合分子在活檢樣本的基礎上驗證病理師對癌症的診斷。
該抗體或TCR也可用於體內診斷實驗。一般來說，抗體用放射性核素標記(如：111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)，從而可免疫閃爍掃描法使腫瘤局限化。在一實施方案中，其中的抗體或片段與兩個或兩個以上選自包括上述蛋白的組的蛋白質靶標的細胞外域結合，並且親和力值(Kd)低於1 x 10μM。
診斷用抗體可透過各種影像學方法使用適合檢測的探針進行標記。探針檢測方法包括但不限於，螢光、光、共聚焦和電鏡方法；磁共振成像和光譜學技術；透視、電腦斷層掃描和正電子發射斷層掃描。合適的探針包括但不限於，螢光素、羅丹明、曙紅及其它螢光團、放射性同位素、黃金、釓和其他稀土、順磁鐵、氟-18和其他正電子發射放射性核素。此外，探針可能是雙功能或多功能的，並且用一種以上的上述方法可進行檢測。這些抗體可用所述的探針直接或間接進行標記。抗體探針的連接，包括探針的共價連接、將探針融合入抗體、以及螯合化合物的共價連接從而結合探針、以及其他本行業熟知的方法。對於免疫組織化學方法，疾病組織樣本可能是新鮮或冷凍或可能包埋於石蠟中以及用福馬林等防腐劑固定。固定或包埋的切片包括與標記一抗和二抗接觸的樣本，其中該抗體用於檢測原位蛋白的表達。
本發明的另一方面包括一種體外製備活化的T細胞的方法，該方法包括將T細胞與載有抗原的人MHC分子進行體外連接，這些分子在合適的抗原提呈細胞表面表達足夠的一段時間從而以抗原特異性方式活化T細胞，其中所述抗原為根據本發明所述的一種肽。優選情況是足夠量的抗原與抗原提呈細胞一同使用。
優選情況是，哺乳動物細胞的TAP肽轉運載體缺乏或水準下降或功能降低。缺乏TAP肽轉運載體的適 合細胞包括T2、RMA-S和果蠅細胞。TAP是與抗原加工相關的轉運載體。
人體肽載入的缺陷細胞株T2從屬美國菌種保藏中心(ATCC,12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852，美國)目錄號CRL1992；果蠅細胞株Schneider 2號株從屬ATCC目錄CRL 19863；小鼠RMA-S細胞株Ljunggren等人描述過(Ljunggren and Karre,1985)。
優選情況是，宿主細胞在轉染前基本上不表達MHC I類分子。刺激因子細胞還優選為表達對T細胞共刺激信號起到重要作用的分子，如，B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA 3中的任一種分子。大量MHC I類分子和共刺激分子的核酸序列可從GenBank和EMBL資料庫中公開獲得。
當MHC I類表位用作一種抗原時，T細胞為CD8陽性T細胞。
如果抗原提呈細胞受到轉染而表達這種表位，則優選的細胞包括一個表達載體，該載體有能力表達含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：388的肽或變體氨基酸序列。
可使用其他一些方法來體外生成T細胞。例如，自體腫瘤浸潤性淋巴細胞可用于生成CTL。Plebanski等人在(Plebanski et al.,1995)使用自體外周血淋巴細胞(PLB)制得T細胞。另外，也可能用肽或多肽 脈衝處理樹突狀細胞或透過與重組病毒感染而製成自體T細胞。此外，B細胞可用於製備自體T細胞。此外，用肽或多肽脈衝處理或用重組病毒感染的巨噬細胞可用於配製自體T細胞。S.Walter等人在(Walter et al.,2003)中描述了透過使用人工抗原提呈細胞(aAPC)體外活化T細胞，這也是生成作用於所選肽的T細胞的一種合適方法。在本發明中，根據生物素：鏈黴素生物化學方法透過將預製的MHC：肽複合物耦合到聚苯乙烯顆粒(微球)而生成aAPC。該系統實現了對aAPC上的MHC密度進行精確調節，這使得可以在血液樣本中選擇地引發高或低親合力的高效抗原特異性T細胞反應。除了MHC：肽複合物外，aAPC還應攜運含共刺激活性的其他蛋白，如耦合至表面的抗-CD28抗體。此外，此類基於aAPC的系統往往需要加入適當的可溶性因子，例如，諸如白細胞介素12的細胞因子。
也可用同種異體細胞制得T細胞，在WO 97/26328中詳細描述了一種方法，以參考文獻方式併入本文。例如，除了果蠅細胞和T2細胞，也可用其他細胞來提呈肽，如CHO細胞、杆狀病毒感染的昆蟲細胞、細菌、酵母、牛痘感染的靶細胞。此外，也可使用植物病毒(例如，參閱Porta等人在(Porta et al.,1994)中描述了將豇豆花葉病毒開發為一種提呈外來肽的高產系統。
被活化的T細胞直接針對本發明中的肽，有助於治療。因此，本發明的另一方面提出了用本發明前述方法制得的活化T細胞。
按上述方法製成的活化T細胞將會有選擇性地識別異常表達含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO 388氨基酸序列的多肽。
優選情況是，T細胞透過與其含HLA/肽複合物的TCR相互作用(如，結合)而識別該細胞。T細胞是殺傷患者靶細胞方法中有用的細胞，其靶細胞異常表達含本發明中氨基酸序列的多肽。此類患者給予有效量的活化T細胞。給予患者的T細胞可能源自該患者，並按上述方法活化(即，它們為自體T細胞)。或者，T細胞不是源自該患者，而是來自另一個人。當然，優選情況是該供體為健康人。發明人使用「健康個人」系指一個人一般狀況良好，優選為免疫系統合格，更優選為無任何可很容易測試或檢測到的疾病。
根據本發明，CD8-陽性T細胞的體內靶細胞可為腫瘤細胞(有時表達MHC-II類抗原)和/或腫瘤周圍的基質細胞(腫瘤細胞)(有時也表達MHC-II類抗原；(Dengjel et al.,2006))。
本發明所述的T細胞可用作治療性組合物中的活性成分。因此，本發明也提出了一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發明中氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者上述有效量的T細胞。
發明人所用的「異常表達」的意思還包括，與正常組織表達水準相比，多肽過量表達，或該基因在從腫瘤獲得的組織中未表達而在腫瘤中表達。「過量表達」系指多肽水準至少為正常組織中的1.2倍；優選為至少為正常組織中的2倍，更優選為至少5或10倍。
T細胞可用本領域已知的方法制得(如，上述方法)。
T細胞繼轉移方案為本領域所熟知的方案。綜述可發現於：Gattioni et al.和Morgan et al.(Gattinoni et al.,2006；Morgan et al.,2006)。
本發明的另一個方面包括使用與MHC複合的肽，以生成T細胞受體，其核酸被克隆並被引入至宿主細胞，優選為T細胞。然後，該透過基因工程改變的T細胞可轉給患者用於癌症治療。
本發明的任一分子(即肽、核酸、抗體、表達載體、細胞，活化T細胞、T細胞受體或編碼核酸)都有益於治療疾病，其特點在於細胞逃避免疫反應的打擊。因此，本發明的任一分子都可用作藥劑或用於製造藥劑。這種分子可單獨使用也可與本發明中的其他分子或已知分子聯合使用。
本發明還涉及一種套件，其包括：
(a)一個容器，包含上述溶液或凍乾粉形式的藥物組合物；
(b)可選的第二個容器，其含有凍乾粉劑型的稀釋劑或重組溶液；和
(c)可選的(i)溶液使用或(ii)重組和/或凍乾製劑使用的說明。
該套件還步包括一個或多個(iii)緩衝劑，(iv)稀釋劑，(v)過濾液，(vi)針，或(v)注射器。容器最好是瓶子、小瓶、注射器或試管，可以為多用途容器。藥物組合物最好是凍乾的。
本發明中的套件優選包含一種置於合適容器中的凍乾製劑以及重組和/或使用說明。適當的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如雙室瓶)、注射器(如雙室注射器)和試管。該容器可能由多種材料製成，如玻璃或塑膠。試劑盒和/或容器最好有容器或關於容器的說明書，指明重組和/或使用的方向。例如，標籤可能表明凍乾劑型將重組為上述肽濃度。該標籤可進一步表明製劑用於皮下注射。
存放製劑的容器可使用多用途西林瓶，使得可重複給予(例如，2-6次)重組劑型。該套件可進一步包括裝有合適稀釋劑(如碳酸氫鈉溶液)的第二個容器。
稀釋液和凍乾製劑混合後，重組製劑中的肽終濃度優選為至少0.15mg/mL/肽(=75μg)，不超過3mg/mL/肽(=1500μg)。該套件還可包括商業和用戶角度來說可取的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑，過濾液、針頭、注射器和帶有使用說明書的包裝插頁。
本發明中的套件可能有一個單獨的容器，其中包含本發明所述的藥物組合物製劑，該製劑可有其他成分(例如，其他化合物或及其藥物組合物)，也可無其他成分，或者每種成分都有其不同容器。
優選情況是，本發明的套件包括與本發明的一種製劑，包裝後與第二種化合物(如佐劑(例如GM-CSF)、化療藥物、天然產品、激素或拮抗劑、抗血管生成劑或抑制劑、凋亡誘導劑或螯合劑)或其藥物組合物聯合使用。該套件的成分可進行預絡合或每種成分在給予患者之前可放置於單獨的不同容器。該套件的成分可以是一種或多種溶液，優選為水溶液，更優選為無菌水溶液。該套件的成分也可為固體形式，加入合適的溶劑後轉換為液體，最好放置於另一個不同的容器中。
治療套件的容器可能為西林瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器、或任何其他盛裝固體或液體的工具。通常，當成分不只一種時，套件將包含第二個西林瓶或其他容器，使之可以單獨定量。該套件還可能包含另一個裝載藥用液體的容器。優選情況是，治療套件將包含一個設備(如，一個或多個針頭、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本發明的藥物(本套件的組合物)。
本發明的藥物配方適合以任何可接受的途徑進行肽給藥，如口服(腸道)、鼻內、眼內、皮下、皮內、肌內，靜脈或經皮給藥。優選為皮下給藥，最優選為皮內給藥，也可透過輸液泵給藥。
由於本發明的肽分離自腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、食管癌(包括胃食管交界癌)、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌或子宮癌，因此，本發明的藥劑優選用於治療腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、食管癌(包括胃食管交界癌)、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)或子宮癌。
本發明進一步涉及為個體患者製備個體化藥物的一種方法，其中包括：製造含選自預篩選TUMAP存儲庫至少一種肽的藥物組合物，其中藥物組合物中所用的至少一種肽選擇為適合於個體患者。在一項實施方案中，藥物組合物為一種疫苗。該方法也可以改動以產生下游應用的T細胞克隆物，如：TCR隔離物或可溶性抗體和其他治療選擇。
「個體化藥物」系指專門針對個體患者的治療，將僅用於該等個體患者，包括個體化活性癌症疫苗以及使用自體組織的過繼細胞療法。
如本文所述，「存儲庫」應指已經接受免疫原性預篩查和/或在特定腫瘤類型中過量提呈的一組或一系列 肽。「存儲庫」一詞並不暗示，疫苗中包括的特定肽已預先製造並儲存於物理設備中，雖然預期有這種可能性。明確預期所述肽可以用於新製造每種個體化疫苗，也可能被預先製造和儲存。存儲庫(例如，資料庫形式)由腫瘤相關肽組成，其在各種HLA-A HLA-B和HLA-C等位元基因腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)或子宮癌患者的腫瘤組織中高度過度表達。其可能含有包括MHC I類和MHC II類肽或拉長的MHC I類肽。除了從幾種癌症組織中採集的腫瘤相關肽外，存儲庫還可能包含HLA-A*02和HLA-A*24標記肽。這些肽可對TUMAP誘導的T細胞免疫進行量化比較，從而可得出疫苗抗腫瘤反應能力的重要結論。其次，在沒有觀察到來自患者「自身」抗原TUMAP的任何疫苗誘導的T細胞反應時，它們可作為來自「非自身」抗原的重要陽性對照肽。第三，它還可對患者的免疫功能狀態得出結論。
存儲庫的TUMAP透過使用一種功能基因組學方法進行鑒定，該方法結合了基因表達分析、質譜法和T細胞免疫學(XPresident ®)。該方法確保了只選擇真實存在于高百分比腫瘤但在正常組織中不表達或僅很少 量表達的TUMAP用於進一步分析。對於初始肽的選擇，患者腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)和子宮癌樣本和健康供體的血液以循序漸進的方法進行分析：
1.惡性材料的HLA配體用質譜法確定
2.使用全基因組信使核糖核酸(mRNA)表達分析法用於確定惡性腫瘤組織與一系列正常器官和組織相比過度表達的基因。
3.確定的HLA配體與基因表達資料進行比較。腫瘤組織上過度提呈或選擇性提呈的肽，優選為第2步中檢測到的選擇性表達或過量表達基因所編碼的考慮為多肽疫苗的合適候選TUMAP。
4.文獻檢索以確定更多證據以支持確認為TUMP的肽的相關性
5.過度表達在mRNA水準的相關性由腫瘤組織第3步選定的TUMAP重新檢測而確定，並且在健康組織上缺乏(或不經常)檢測。
6.為了評估透過選定的肽誘導體內T細胞反應是否可行，使用健康供體以及癌症患者的人T細胞進行體外免疫原性測定。
一方面，在將所述肽加入存儲庫之前，對其進行篩查以瞭解免疫原性。舉例來說(但不限於此)，納入存儲庫的肽的免疫原性的確定方法包括體外T細胞活化，具體為：用裝載肽/MHC複合物和抗CD28抗體的人工抗原提呈細胞反復刺激來自健康供體的CD8+ T細胞。
這種方法優選用於罕見癌症以及有罕見表達譜的患者。與含目前開發為固定組分的多肽雞尾酒相反的是，存儲庫可將腫瘤中抗原的實際表達於疫苗進行更高程度的匹配。在多目標方法中，每名患者將使用幾種「現成」肽的選定單一肽或組合。理論上來說，基於從50抗原肽庫中選擇例如5種不同抗原肽的一種方法可提供大約170萬種可能的藥物產品(DP)組分。
在一方面，選擇所述肽用於疫苗，其基於個體患者的適合性，並使用本發明此處或後文所述的方法。
HLA表型、轉錄和肽組學資料從患者的腫瘤材料和血液樣本中收集，以確定最合適每名患者且含有「存儲庫」和患者獨特(即突變)TUMAP的肽。將選擇的那些肽選擇性地或過度表達于患者腫瘤中，並且可能的情況下，如果用患者個體PBMC進行檢測，則表現出很強的體外免疫原性。
優選的情況是，疫苗所包括的肽的一種確定方法包括：(a)識別由來自個體患者腫瘤樣本提呈的腫瘤相關肽(TUMAP)；(b)將(a)中鑒定的肽與上述肽的存儲庫(資料庫)進行比對；且(c)從與患者中確定的腫瘤 相關肽相關的存儲庫(資料庫)中選擇至少一種肽。例如，腫瘤樣本提呈的TUMAP的鑒定方法有：(a1)將來自腫瘤樣本的表達資料與所述腫瘤樣本組織類型相對應的正常組織樣本的表達資料相比對，以識別腫瘤組織中過量表達或異常表達的蛋白；以及(a2)將表達資料與結合到腫瘤樣本中I類MHC和/或II類分子的MHC配體序列想關聯，以確定來源於腫瘤過量表達或異常表達的蛋白質的MHC配體。優選情況是，MHC配體的序列的確定方法是：洗脫來自腫瘤樣本分離的MHC分子結合肽，並測序洗脫配體。優選情況是，腫瘤樣本和正常組織從同一患者獲得。
除了使用存儲庫(資料庫)模型選擇肽以外，或作為一種替代方法，TUMAP可能在新患者中進行鑒定，然後列入疫苗中。作為一種實施例，患者中的候選TUMAP可透過以下方法進行鑒定：(a1)將來自腫瘤樣本的表達資料與所述腫瘤樣本組織類型相對應的正常組織樣本的表達資料相比對，以識別腫瘤組織中過量表達或異常表達的蛋白；以及(a2)將表達資料與結合到腫瘤樣本中I類MHC和/或II類分子的MHC配體序列想關聯，以確定來源於腫瘤過量表達或異常表達的蛋白質的MHC配體。作為另一實施例，蛋白的鑒定方法為可包含突變，其對於腫瘤樣本相對于個體患者的相應正常組織是獨特的，並且TUMAP可透過特異性靶向作用於變異來鑒定。例如，腫瘤以及相應正常組織的基因組可透過 全基因組測序方法進行測序：為了發現基因蛋白質編碼區域的非同義突變，從腫瘤組織中萃取基因組DNA和RNA，從外周血單核細胞(PBMC)中提取正常非突變基因組種系DNA。運用的NGS方法只限于蛋白編碼區的重測序(外顯子組重測序)。為了這一目的，使用供應商提供的靶序列富集試劑盒來捕獲來自人樣本的外顯子DNA，隨後使用HiSeq2000(Illumina公司)進行測序。此外，對腫瘤的mRNA進行測序，以直接定量基因表達，並確認突變基因在患者腫瘤中表達。得到的數以百萬計的序列讀數透過軟體演算法處理。輸出列表中包含突變和基因表達。腫瘤特異性體突變透過與PBMC衍生的種系變化比較來確定，並進行優化。然後，為了存儲庫可能測試新確定的肽瞭解如上所述的免疫原性，並且選擇具有合適免疫原性的候選TUMAP用於疫苗。
在一個示範實施方案中，疫苗中所含肽透過以下方法確定：(a)用上述方法識別由來自個體患者腫瘤樣本提呈的腫瘤相關肽(TUMAP)；(b)將(a)中鑒定的肽與進行腫瘤(與相應的正常組織相比)免疫原性和過量提呈預篩查肽的存儲庫進行比對；(c)從與患者中確定的腫瘤相關肽相關的存儲庫中選擇至少一種肽；及(d)可選地在(a)中選擇至少一種新確定的肽，確認其免疫原性。
在一個示範實施方案中，疫苗中所含肽透過以下方法確定：(a)識別由來自個體患者腫瘤樣本提呈的腫瘤 相關肽(TUMAP)；以及(b)在(a)中選擇至少一種新確定的肽，並確認其免疫原性。
一旦選定了用於個體化肽疫苗的肽時，則產生疫苗。該疫苗優選為一種液體製劑，包括溶解於20-40% DMSO之間，優選為約30-35% DMSO，例如，約33% DMSO中的個體肽。
列入產品的每種肽都溶於DMSO中。單個肽溶液濃度的選擇取決於要列入產品中的肽的數量。單肽-DMSO溶液均等混合，以實現一種溶液中包含所有的肽，且濃度為每肽~2.5mg/ml。然後該混合溶液按照1：3比例用注射用水進行稀釋，以達到在33% DMSO中每肽0.826mg/ml的濃度。稀釋的溶液透過0.22μm無菌篩檢程序進行過濾。從而獲得最終本體溶液。
最終本體溶液填充到小瓶中，在使用前儲存於-20℃下。一個小瓶包含700μL溶液，其中每種肽含有0.578mg。其中的500μL(每種肽約400μg)將用於皮內注射。
本發明的肽除了用於治療癌症，也可用於診斷。由於肽由腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)或子宮癌樣本產生，並且已確定這些肽 在正常組織中不存在或水準較低，因此這些肽可用於診斷癌症是否存在。
血液樣本中組織活檢物含請求項的肽，可有助於病理師診斷癌症。用抗體、質譜或其他本領域內已知的方法檢測某些肽可使病理師判斷該組織樣本為惡性的還是炎症或一般病變，也可用作腦膠質細胞瘤、乳腺癌、結直腸癌、腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、肝細胞癌、非小細胞和小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、包括胃食管交界癌的食管癌、膽囊癌和膽管癌、黑色素瘤、胃癌、睾丸癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)或子宮癌的生物標誌物。肽基團的提呈使得能對病變組織進行分類或進一步分成子類。
對病變標本中肽的檢測使得能對免疫系統治療方法的利益進行判斷，特別是如果T-淋巴細胞已知或預計與作用機制有關。MHC表達的缺失是一種機制，充分說明了哪些受感染的惡性細胞逃避了免疫監視。因此，肽的提呈表明，分析過的細胞並沒有利用這種機制。
本發明的肽可用於分析淋巴細胞對肽的反應(如T細胞反應)，或抗體對肽或MHC分子絡合的肽發生的反應。這些淋巴細胞反應可以作為預後指標，決定是否採取進一步的治療。這些反應也可以用作免疫療法中的替代反應指標，旨在以不同方式誘導淋巴細胞反應，如接種蛋白疫苗、核酸、自體材料、淋巴細胞過繼轉移。基因治療 中，淋巴細胞對肽發生的反應可以在副作用的評估中考慮。淋巴細胞反應監測也可能成為移植療法隨訪檢查中的一種有價值的工具，如，用於檢測移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。
下列描述優選方案的實施例將對本發明進行說明，並參照隨附圖表(但是不僅限於此)。考慮到本發明的目的，文中引用的所有參考文獻透過引用的方式併入在本文中。
實施例
實施例1
細胞表面提呈的腫瘤相關肽的識別和定量
組織樣本
患者的腫瘤組織的獲得在所有患者在手術或屍檢前都給予了書面知情同意。切除後組織立即進行冷休克處理，在分離TUMAP前儲存於-70℃或以下。
如果以下兩個條件是真實的，則選擇肽：(1)其潛在轉錄物和/或外顯子表達水準非常低，對於以下器官，每百萬讀數每千堿基讀數中值(RPKM)要求小於2，且75%百分位數要求小於5：腦、血管、心臟、肝、肺、血液。此外，對於以下器官的中位RPKM要求小於10：膀胱、唾液腺、胃、腎上腺、結腸、小腸、脾、骨髓、胰腺、肌肉、脂肪組織、皮膚、食管、腎、甲狀腺、腦垂體、神經。(2)肽與腫瘤相關，即，特異發現或在腫瘤上或與基線正常組織相比過度表達(參照實施例1)。
HLA-A*02 TUMAP選擇的樣本數量為：胰腺癌N=16，腎癌N=20，結直腸癌N=28，包括胃食管交界癌的食管癌N=15，攝護腺腫瘤N=35，肝細胞癌N=16，非小細胞肺癌N=88，胃癌N=29，乳腺癌N=9，黑色素瘤N=3，卵巢癌N=20，慢性淋巴細胞性白血病N=13(12個供體)，膀胱癌N=5，睾丸癌N=1，小細胞肺癌N=18(13個供體)，膽囊癌和膽管癌N=3，急性骨髓性白血病N=5(4個供體)，腦膠質細胞瘤N=40，子宮癌N=5。
HLA-A*24 TUMAP選擇的樣本數量為：胃癌N=44，攝護腺腫瘤N=37，非小細胞肺癌N=88，肝細胞癌N=15，腎癌N=2，結直腸癌N=1，腦膠質細胞瘤N=17。
從組織樣本中分離HLA肽
根據公開的方案(Falk et al.,1991；Seeger et al.,1999)略加修改，使用HLA-A*02特異性抗體BB7.2、HLA-A、HLA-B、HLA-﹁C特異性抗體W6/32、HLA-II類特異性抗體L243、CNBr活化的瓊脂糖凝膠、酸處理和超濾方法以免疫沉澱法從實體組織中獲得了冷凍組織樣本的HLA肽庫。
質譜分析
獲得的HLA肽庫根據其疏水性用反相色譜(nanoAcquity UPLC system,Waters)分離，洗脫肽用裝有電噴霧源的LTQ-velos融合雜交質譜(ThermoElectron)進行了分析。肽庫被直接載入填充有1.7μm C18反相材料(Waters)的分析用熔煉石英微毛細管柱(75μm內徑x 250mm)，應用流速為400nL每分鐘。隨後，使用來自流速為300nL每分鐘、濃度為10%至33%溶劑B中的兩步180分鐘二元梯度法對肽進行分離。梯度由溶劑A(含0.1%甲酸的水)和溶劑B(含0.1%甲酸的乙腈)。金鍍膜玻璃毛細管(PicoTip,New Objective)用於引入到納升電噴霧源。使用前5(TOP5)策略在資料依賴模式下操作LTQ-Orbitrap質譜儀。簡言之，首先以高精確品質完全掃描在orbitrap開始一個掃描週期(R=30000)，之後用先前選定離子的動態排除技術在orbitrap中對5種含量最為豐富的前體離子進行MS/MS掃描(R=7500)。串聯質譜以SEQUEST和另一種手動控制器進行解讀。生成的自然肽破碎模式與合成序列相同參考肽的破碎模式進行比較後，確保了被識別的肽序列。
無標記相對LC-MS定量透過離子計數(即透過LC-MS功能提取和分析)來進行(Mueller et al.,2007)。該方法假定肽的LC-MS信號區域與樣本中其豐度相關。提取的特徵透過充電狀態去卷積和保留時間校準進行進一步處理(Mueller et al.,2008；Sturm et al.,2008)。最後，所有的LC-MS特徵與序列鑒定結果交叉引用，以將不同樣本和組織的定量資料與肽呈遞特徵結合。定量資料根據集中資料以兩層方式進行正態化處理，以說明技術和生物學複製變異。因此，每個被識別的肽均可與定量資料相關，從而可得出樣本和組織之間的相對定量。此外，對候選肽獲得的所有定量資料進行手動檢查，以確保資料的一致性，並驗證自動化分析的準確度。對於每種肽，計算了提呈圖，其顯示樣本平均提呈量以及複製變化。這些特徵使不同樣本與正常組織樣本的基線值並列。示範性過度提呈肽的提呈譜示於圖1中。
表8(A和B)和表9(A和B)顯示了選定肽在各種癌症實體上的提呈，因此顯示所提及的肽特別相關性用於診斷和/或治療所示的癌症(例如，肽序列ID號1用於膀胱癌、包括胃食管交界癌的食管癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌和胰腺癌，肽序列ID號2用於腎癌、包括胃食管交界癌的食管癌、腦膠質細胞瘤…等等)。
表8A：本發明選定HLA-A*02結合腫瘤相關肽在各種實體中提呈概述。GB=膠質母細胞瘤，BRCA=乳腺癌，CRC=結直腸癌，RCC=腎細胞癌，CLL=慢性淋巴細胞性白血病，HCC=肝細胞癌，NSCLC=非小細胞肺癌，SCLC=小細胞肺癌，NHL=非霍奇金淋巴瘤(8個樣本)，AML=急性骨髓性白血病，OC=卵巢癌，PC=胰腺癌，clPC=胰腺癌細胞系，PCA=攝護腺癌和良性攝護腺增生，OSCAR=食管癌，包括胃食管交界 處癌，GBC_CCC=膽囊腺癌和膽管癌，MEL=黑色素瘤，GC=胃癌，TC=睾丸癌，UBC=膀胱癌，UEC=子宮癌。
Figure 110107429-A0202-12-0188-589
Figure 110107429-A0202-12-0189-29
Figure 110107429-A0202-12-0190-30
表8B顯示選定肽在其他癌症實體中的提呈，因此顯示所提及的肽特別相關性用於診斷和/或治療所示的癌症。
表8B：選定HLA-A*02肽在各種實體中提呈概述。GB=膠質母細胞瘤，BRCA=乳腺癌，CRC= 結直腸癌，RCC=腎細胞癌，CLL=慢性淋巴細胞性白血病，HCC=肝細胞癌，NSCLC=非小細胞肺癌，SCLC=小細胞肺癌，NHL=非霍奇金淋巴瘤，AML=急性骨髓性白血病，OC=卵巢癌，PC=胰腺癌，BPH=攝護腺癌和良性攝護腺增生，OSCAR=食管癌，包括胃食管交界處癌，GBC_CCC=膽囊腺癌和膽管癌，MEL=黑色素瘤，GC=胃癌，UBC=膀胱癌，UTC=子宮癌，HNSCC=頭頸部鱗狀細胞癌。
Figure 110107429-A0202-12-0191-31
Figure 110107429-A0202-12-0192-32
Figure 110107429-A0202-12-0193-33
表9A：本發明選定HLA-A*24結合腫瘤相關肽在各種實體中提呈概述。GB=腦膠質細胞瘤，HCC=肝細胞癌，NSCLC=非小細胞肺癌，PCA=攝護腺癌，GC=胃癌，CRC=結直腸癌，RCC=腎細胞癌。
Figure 110107429-A0202-12-0193-590
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Figure 110107429-A0202-12-0195-36
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Figure 110107429-A0202-12-0198-39
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表9B顯示選定肽在其他癌症實體中的提呈，因此顯示所提及的肽特別相關性用於診斷和/或治療所示的癌症。
表9B：選定HLA-A*24肽在各種實體中提呈概述。GB=腦膠質細胞瘤，CRC=結直腸癌，RCC=腎細胞癌，HCC=肝細胞癌，NSCLC=非小細胞肺癌，PCA=攝護腺癌和良性攝護腺增生，GC=胃癌。
Figure 110107429-A0202-12-0199-42
Figure 110107429-A0202-12-0200-43
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實施例2
編碼本發明肽的基因的表達譜
與正常細胞相比在腫瘤細胞上一種肽過度提呈或特定提呈足夠其在免疫治療中有效使用，一些肽為腫瘤特異性的，儘管存在其源蛋白也存在于正常組織中。但是，mRNA表達譜增加了免疫治療目標肽選擇中其他級別的安全性。特別是對於具有高安全性風險的治療選擇，諸如親和力成熟的TCR，理想的目標肽將來源於對該腫瘤獨一無二且不出現于正常組織中的蛋白，基因表達高腫瘤-正常比例表提示治療窗口。此外，尚未進行肽提呈分析的腫瘤實體源基因過度表達提示某種肽可能在各實體中具有重要性。
對於本發明的HLA-I類肽，根據涵蓋大約3000個正常組織樣本RNASeq資料的數據庫，所有源 基因的正常組織表達被證明是最少的(Lonsdale,2013)。此外，腫瘤與正常組織的基因表達數據進行了分析，以評估在各種腫瘤實體中靶標覆蓋情況。
RNA來源與製備
手術切除組織標本按如上所述(參見實施例1)在獲得每名患者的書面知情同意後提供。手術後立即速凍腫瘤組織標本，之後在液態氮中用杵臼勻漿。使用TRI試劑(Ambion公司，Darmstadt，德國)之後用RNeasy(QIAGEN公司，Hilden，德國)清理從這些樣本中製備總RNA；這兩種方法都根據製造商的方案進行。
用於RNASeq實驗來自健康人體組織的總RNA獲得自：Asterand(Detroit,MI,USA & Royston,Herts,UK)、Bio-Options Inc.(Brea,CA,USA)、ProteoGenex Inc.(Culver City,CA,USA)、Geneticist Inc.(Glendale,CA,USA)、Istituto Nazionale Tumori "Pascale"(Naples,Italy)、BioServe(Beltsville,MD,USA)、Capital BioScience Inc.(Rockville,MD,USA)。
用於RNASeq實驗來自腫瘤組織的總RNA獲得自：Asterand(Detroit,MI,USA & Royston,Herts,UK)、Bio-Options Inc.(Brea,CA,USA)、BioServe(Beltsville,MD,USA)、 Geneticist Inc.(Glendale,CA,USA)、ProteoGenex Inc.(Culver City,CA,USA)、Tissue Solutions Ltd(Glasgow,UK)、波恩大學醫院(Bonn,Germany)、海德堡大學醫院(Heidelberg,Germany)、蒂賓根大學醫院(Tübingen,Germany)。
所有RNA樣本的品質和數量都在Agilent 2100 Bioanalyzer分析儀(Agilent公司，Waldbronn，德國)上使用RNA 6000 Pico LabChip Kit試劑盒(Agilent公司)進行評估。
RNA序列實驗
腫瘤和正常組織的RNA樣本都透過新一代測序技術(RNAseq)由CeGaT(Tübingen,Germany)對腫瘤和正常組織的RNA樣本進行基因表達分析。簡言之，根據供應商的方案(Illumina Inc.,San Diego,CA,USA)，其中包括RNA碎片化、cDNA轉化和測序適配器的加入，利用Illumina HiSeq v4試劑盒準備測序文庫。從多個樣本獲得的文庫根據製造商的說明等摩爾混合並在Illumina HiSeq 2500定序器上測序，產生50bp的單端讀數。處理的讀數使用STAR軟體映射至人類基因組(GRCh38)。根據ENSEMBL序列數據庫的說明(Ensemb177)，表達資料在轉錄水準設置為RPKM(每百萬映射讀數每千堿基讀數，由 Cufflinks軟體生成)並在外顯子水準上設置(總讀數，由Bedtools軟體生成)。外顯子讀數被歸為外顯子長度和校準尺寸，以獲得RPKM值。
本發明的代表性源基因在不同癌症中高度過量表達的表達譜如圖2所示。根據內部RNA測序分析，進一步的示例性靶標的表達分數如表10(A和B)所示。其他實體的表達資料和進一步的示例性肽總結於表11中，其基於TCGA研究網路http：//cancergenome.nih.gov/產生的資料。
表10A：各種腫瘤實體內的靶標覆蓋，針對選定肽源基因的表達。過度表達被定義為相比最高表達該基因的相關正常組織，在腫瘤上的表達超過1.5倍。<19%過度表達=I,20-49%=II,50-69%=III,>70%=IV。如果一種肽能夠從多個源基因獲得，最少範圍的基因則是決定性的。基線包括以下相關正常組織：脂肪組織、腎上腺、動脈、骨髓、腦、軟骨、結腸、食道、膽囊、心臟、腎、肝、肺、淋巴結、胰腺、垂體、直腸、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、胸腺、甲狀腺、氣管、膀胱和靜脈。如果獲得同一組織類型幾個樣本的表達資料，則使用各樣本的算術平均值進行計算。
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表10B：選定肽源基因的靶標範圍。過度表達被定義為相比最高表達該基因的相關正常組織，在腫瘤上的表達超過1.5倍。<19%過度表達=I,20-49%=II,50-69%=III,>70%=IV。如果一種肽能夠從多個源基因獲得，最少範圍的基因則是決定性的。基線包括以下相關正常組織：脂肪組織、腎上腺、動脈、骨髓、腦、軟骨、結腸、食道、膽囊、心臟、腎、肝、肺、淋巴結、胰腺、垂體、直腸、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、胸腺、甲狀腺、氣管、膀胱和靜脈。如果獲得同一組織類型幾個樣本的表達資料，則使用各樣本的算術平均值進行計算。NHL=非霍奇金淋巴瘤，PCA=攝護腺癌和良性攝護腺增生，GC=胃癌，GBC_CCC=膽囊腺癌和膽管癌，MEL=黑色素瘤，UBC=膀胱癌，UTC=子宮癌，HNSCC=頭頸部小細胞癌。
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表11：各種腫瘤實體內的靶標覆蓋，針對選定肽源基因的表達。如果腫瘤樣本中表達水準超過從以下器官(鄰近腫瘤)樣本中測定的最高75%百分位數2倍以上，則考慮該基因：直腸(n=10)，食管(n=11)，膀胱(n=19)，腎(n=129)，胃癌(n=35)，結腸癌(n=41)，頭頸部(n=43)，肝臟(n=50)，肺(n=51)，甲狀腺(n=59)，肺(n=59)。
過度表達類別分為「A」(>=50%的腫瘤高於臨界值)、「B」(>=20%但<50%的腫瘤高於臨界值)和「C」(>=5%但<20%的腫瘤高於臨界值)。
ACC=腎上腺皮質癌(N=79)，BLCA=膀胱尿路上皮癌(N=408)，LGG=較低級別神經膠質瘤(N=534)，CESC=宮頸鱗狀細胞癌和宮頸腺癌(N=307)，STAD=胃腺癌(N=415)，CHOL=膽管癌(N=36)，MESO=間皮瘤(N=87)，KICH= 腎嫌色細胞癌(N=66)，PRAD=攝護腺癌(N=498)，DLBC=淋巴腫瘤彌散性大B細胞淋巴瘤(N=48)，PCPG=嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(N=184)，KIRP=腎乳頭細胞癌(N=291)，SKCM=皮膚黑色素瘤(N=473)，SARC=肉瘤(N=263)，THCA=甲狀腺癌(N=513)，THYM=胸腺瘤(N=120)，UCS=子宮癌肉瘤(N=57)，UCEC=子宮體子宮內膜癌(N=546)，UVM=葡萄膜黑色素瘤(N=80)， TGCT=睾丸生殖細胞腫瘤(N=156)，HNSC=頭頸部鱗狀細胞癌(N=521)
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實施例3
MHC-I類提呈肽的體外免疫原性
為了獲得關於本發明TUMAP的免疫原性資訊，發明人使用體外T細胞擴增分析方法進行了研究，其中該分析方法基於使用裝載肽/MHC複合物和抗CD28抗體的人工抗原提呈細胞(aAPC)進行反復刺激。用這種方法，發明人可顯示本發明的HLA-A*02：01和HLA-A*24的免疫原性，這表明這些肽為對抗人CD8+前體T細胞的T細胞表位(表9)。
CD8+ T細胞體外活化
為了用載有肽-MHC複合物(pMHC)和抗CD28抗體的人工抗原提呈細胞進行體外刺激，發明人首先從University clinics Mannheim,Germany中獲取健康供體CD8微珠(Miltenyi Biotec,Bergisch-Gladbach,Germany)透過積極選擇白細胞清除術後新鮮HLA-A*02產物而分離出CD8+ T細胞。
PBMC和分離出的CD8+淋巴細胞使用前在T細胞培養基(TCM)中培養，培養基包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，Karlsruhe，德國)並補充10%熱滅活人AB血清(PAN-Biotech公司，Aidenbach，德國)、100U/ml青黴素/100μg/ml鏈黴素(Cambrex公司，Cologne，德國)，1mM丙酮酸鈉(CC Pro公司，Oberdorla，德國)和20μg/ml慶 大黴素(Cambrex公司)。在此步驟，2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司，Heidelberg，德國)和10U/ml的IL-2(Novartis Pharma公司，Nürnberg，德國)也加入TCM。
對於pMHC/抗-CD28塗層珠的生成、T細胞的刺激和讀出，使用每刺激條件四個不同pMHC分子以及每個讀出條件8個不同的pMHC分子在高度限定的體外系統中進行。
純化的共刺激小鼠IgG2a抗人CD28抗體9.3(Jung et al.,1987)使用製造商(Perbio公司，波恩，德國)推薦的N-羥基琥珀醯亞胺生物素進行化學生物素化處理。所用珠為5.6μm的鏈黴抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯顆粒(Bangs Labooratories，伊利諾州，美國)。
用於陽性和陰性對照刺激物的pMHC分別為A*0201/MLA-001(從Melan-A/MART-1中修飾制得的肽ELAGIGILTV(SEQ ID NO.418))和A*0201/DDX5-001(從DDX5中獲得的YLLPAIVHI(SEQ ID NO.419))。
800.000珠/200μl包裹於含有4 x 12.5ng不同生物素-pMHC的96孔板、進行洗滌，隨後加入體積為200μl的600ng生物素抗-CD28。在37℃下，在含5ng/ml IL-12(PromoCell)的200μl TCM中共培養1x106 CD8+T細胞與2x105的清洗塗層珠3天，從而活化刺激。之後，一半培養基與補充80U/ml IL-2 的新鮮TCM進行交換，並且培養在37℃下持續4天。這種刺激性週期總共進行3次。對於使用每條件8種不同pMHC分子的pMHC多聚體讀出，二維組合編碼方法如前述使用(Andersen et al.,2012)，稍作修飾，涵蓋耦合至5種不同的螢光染料。最後，用Live/dead near IR染料(Invitrogen公司，Karlsruhe，德國)、CD8-FITC抗體克隆SK1(BD公司，Heidelberg，德國)和螢光pMHC多聚體而執行多聚體分析。對於分析，使用了配有合適鐳射儀和篩檢程序的BD LSRII SORP細胞儀。肽特異性細胞以占總CD8+細胞的百分比形式進行計算。多聚體分析結果使用FlowJo軟體(Tree Star公司，Oregon，美國)進行評估。特定多聚體+ CD8+淋巴細胞的體外填裝用與陰性對照刺激組比較而進行檢測。如果健康供體中的至少一個可評價的體外刺激孔在體外刺激後發現含有特異性CD8+ T細胞株(即該孔包含至少1%特定多聚體+ CD8+ T細胞，並且特定多聚體+的百分比至少為陰性對照刺激中位數的10倍)，則檢測給定抗原的免疫原性。
不同癌症肽體外免疫原性
對於受到測試的HLA-I類肽，可透過肽特異性T細胞株的生成證明其體外免疫原性。TUMAP特異性多聚體對本發明的2種肽染色後流式細胞儀檢測的典型結果如圖3所示，同時也含有相應的陰性對照資訊。本發明5種 肽的結果匯總於表12A。TUMAP特異性多聚體對本發明的7種肽染色後流式細胞儀檢測的典型結果如圖4和5所示，同時也含有相應的陰性對照資訊。本發明74種肽的結果匯總於表12B。
表12A：本發明中HLA I類肽的體外免疫原性
申請人對本發明的肽所做的體外免疫原性實驗的示例性結果。<20%=+；20%-49%=++；50%-69%=+++：>=70%=++++
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表12B：本發明HLA-I類肽的體外免疫原性
申請人對本發明的肽所做的體外免疫原性實驗的示例性結果。<20%=+；20%-49%=++；50%-69%=+++；>=70%=++++
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實施例4
肽的合成
所有的肽透過使用Fmoc策略以標準、廣為接受的固相肽合成法合成。每個肽的身份和純度已使用質譜和RP-HPLC分析法確定。用凍乾法(三氟乙酸鹽)獲得白色至類白色的肽，純度為>50%。所有的TUMAP優選 作為三氟乙酸鹽或乙酸鹽進行給藥，其他藥用鹽形式也可以。
實施例5
MHC結合測定
本發明基於T細胞療法的候選肽進一步測試其MHC結合能力(親和性)。單個肽-MHC複合體透過UV-配體交換產生，其中，紫外線敏感肽經紫外線照射後裂解，與分析的相關肽交換。只有能夠有效地結合並穩定肽接受MHC分子的候選肽才能阻止MHC複合物的解離。為了確定交換反應的產率，將基於穩定MHC複合物輕鏈(β2m)的檢測結果進行ELISA測定。檢測總體上按照Rodenko等人在(Rodenko et al.,2006)中描述的方法進行。
96孔Maxisorp板(NUNC)在室溫下在PBS中以2ug/ml鏈黴包被過夜，用4倍洗滌並在37℃下在含封閉緩衝液的2% BSA中封閉1小時。折疊的HLA-A*02：01/MLA-001單體作為標準品，涵蓋15-500ng/ml的範圍。紫外線交換反應的肽-MHC單體在封閉緩衝液中稀釋100倍。樣本在37℃下孵育1小時，洗滌四次，在37℃下以2ug/ml HRP綴合抗-β2m溫育1小時，再次洗滌，並以NH2SO4封堵的TMB溶液進行檢測。在450nm處測量吸收。在生成和產生抗體或其片段時和/或T細胞受體或其片段時，通常優選顯示為高交換產率(優選為高於50%，最優選為高於75%)的候 選肽，這是因為它們對MHC分子表現出足夠的親合力，並能防止MHC複合物的解離。
表13：MHC-I類結合分數。HLA-I類限制肽與HLA-A*02的結合根據肽交換產量進行範圍劃分：<20%=+；20%-49%=++；50%-75%=+++；>=75%=++++
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表14：MHC-I類結合分數。HLA-I類限制肽與HLA-A*24的結合根據肽交換產量進行範圍劃分：<20%=+；20%-49%=++；50%-75%=+++；>=75%=++++
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實施例6
細胞表面提呈的腫瘤相關肽的絕對定量
黏合劑例如抗體和/或TCR的產生是一個費力的過程，其可以僅針對一些選定靶標進行。在腫瘤相關和特異性肽的情況下，選擇標準包括但不限於排除提呈於細胞表面上肽的提呈和濃度。除了所述肽的分離和相對定量，發明人也分析了每個細胞的絕對肽拷貝數，如實施例1所述。實體腫瘤樣本中每個細胞的TUMAP拷貝數定量需要分離TUMAP的絕對定量、TUMAP分離效率和分析的組織樣本細胞計數。
nanoLC-MS/MS肽定量
對於透過質譜法對肽的準確定量，使用內標法生成每種肽的校準曲線。內標是每種肽的雙同位素標記的變體，即，TUMAP合成中納入2個同位素標記的氨基酸。它與腫瘤相關肽僅在品質上不同，但在其他的物理化學性質方面無差異(Anderson et al.,2012)。內標被摻入 到每個MS樣本，所有MS信號均標準化為內標MS信號，以平衡MS實驗之間潛在的技術差異。
校準曲線用至少三種不同的矩陣繪製，即，來自于類似於常規MS樣本的天然樣本的HLA肽洗脫液，並且每個制備品以重複MS運行進行測量。對於評價，MS信號被標準化為內標信號，校準曲線透過logistic回歸計算。
對於來自組織樣本的腫瘤相關肽的定量，各樣本也摻有內標；MS信號標準化為內標並使用該肽校正曲線進行定量。
肽/MHC分離的效率
對於任何蛋白質純化過程，來自組織樣本蛋白的分離與相關蛋白的一定損失相關聯。為了確定TUMAP分離的效率，針對選定為絕對定量的所有TUMAP產生了肽/MHC複合體。為了能夠天然肽MHC/複合體與加樣物，使用了單同位素標記版本的TUMAP，即TUMAP合成期間納入1個同位素標記的氨基酸。這些複合物被摻入新製備的組織裂解物中，例如，在TUMAP分離過程中最早可能時間點，然後在之後的親和純化中像天然肽MHC/複合物被獲取。因此，測量單標記TUMAP的恢復可得到個體TUMAP分離效率相關的結論。
分離效率使用少量樣本進行分析，且這些組織樣本可比較。與此相反，個體肽之間的分離效率不同。這表 明，分離效率雖然只在有限數量的樣本中進行測定，但可外推至任何其他組織制備品中。但是，由於分離效率不能從一種肽外推至其他肽，因此，有必要單獨分析每個TUMAP。
固體、冷凍組織中細胞計數的測定
為了確定經過絕對肽定量的組織樣本的細胞數，發明人採用了DNA含量分析。此方法適用于不同來源的廣泛樣本，最重要的是，冷凍樣本(Alcoser et al.,2011；Forsey and Chaudhuri,2009；Silva et al.,2013)。在肽分離方案期間，組織樣本被加工為均勻的裂解物，從中取一小等份裂解物。樣本等分為三份，從中分離DNA被分離(QiaAmp DNA Mini Kit,Qiagen,Hilden，德國)。每次DNA分離的總DNA含量至少重複兩次使用基於螢光的DNA定量測定法(Qubit dsDNA HS Assay Kit,Life Technologies,Darmstadt，德國)進行定量。
為了計算細胞數，生成了來自單個健康血細胞等分試樣的DNA標準曲線，使用一系列指定的細胞數。標準曲線用於計算每次DNA分離總DNA含量的總細胞含量。用於肽分離的組織樣本的平均總細胞計數，在考慮裂解物等份的已知體積和總裂解物體積的情況下進行推算。
每細胞的肽拷貝數
使用前述實驗的資料，發明人以總肽量除以樣本總細胞計數計算得出每個細胞的TUMAP拷貝數，隨後除以分離效率。選定肽的細胞拷貝數如表15所示。
表15：絕對拷貝數。該表列出了腫瘤樣本中絕對肽定量的結果。針對每種肽，每個細胞的中位元拷貝數表示：<100=+；>=100=++；>=1,000 +++；>=10,000=++++.提示樣本數量，其中提供評估的高品質MS育料。
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參考文獻列表
Aalto, Y. et al., Leukemia 15 (2001): 1721-1728
Abaan, O. D. et al., Cancer Res 73 (2013): 4372-4382
Accardi, L. et al., Int.J Cancer 134 (2014): 2742-2747
Adams, D. J. et al., Mol.Cell Biol 25 (2005): 779-788
Agha-Hosseini, F. et al., Med.J Islam Repub.Iran 29 (2015): 218
Agostini, M. et al., Oncotarget. 6 (2015): 32561-32574
Akiyama, Y. et al., Oncol.Rep. 31 (2014): 1683-1690
Al-haidari, A. A. et al., Int.J Colorectal Dis. 28 (2013): 1479-1487
Alcoser, S. Y. et al., BMC.Biotechnol. 11 (2011): 124
Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933
Alonso, C. N. et al., Leuk.Res. 36 (2012): 704-708
Amaro, A. et al., Cancer Metastasis Rev 33 (2014): 657-671
American Cancer Society, (2015), www.cancer.org
Ammirante, M. et al., Nature 464 (2010): 302-305
Ampie, L. et al., Front Oncol. 5 (2015): 12
An, C. H. et al., Hum.Pathol. 43 (2012): 40-47
Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902
Anderson, N. L. et al., J Proteome.Res 11 (2012): 1868-1878
Appay, V. et al., Eur.J Immunol. 36 (2006): 1805-1814
Arai, E. et al., Int.J Cancer 137 (2015): 2589-2606
Armitage, J. O., Blood 110 (2007): 29-36
Armstrong, C. M. et al., Am.J Clin Exp.Urol. 3 (2015): 64-76
Asahara, S. et al., J Transl.Med. 11 (2013): 291
Atcheson, E. et al., Biosci.Rep. 31 (2011): 371-379
Avigan, D. et al., Clin Cancer Res. 10 (2004): 4699-4708
Azevedo, R. et al., J Control Release 214 (2015): 40-61
Baek, J. M. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 461 (2015): 334-341
Baker, M. et al., PLoS.One. 8 (2013): e62516
Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274
Bankovic, J. et al., Lung Cancer 67 (2010): 151-159
Barlin, J. N. et al., Neoplasia. 17 (2015): 183-189
Batliner, J. et al., Mol.Immunol. 48 (2011): 714-719
Battistella, M. et al., J Cutan.Pathol. 41 (2014): 427-436
Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282
Becker, M. A. et al., Mol.Cancer Ther. 14 (2015): 973-981
Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109
Benada, J. et al., Biomolecules. 5 (2015): 1912-1937
Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical
Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995): 289-300
Bentz, S. et al., Digestion 88 (2013): 182-192
Berard, A. R. et al., Proteomics. 15 (2015): 2113-2135
Berman, R. S. et al., National Cancer Institute: PDQ(R) Colon
Cancer Treatment (2015a)
Berman, R. S. et al., National Cancer Institute: PDQ(R) Rectal
Cancer Treatment (2015b)
Berndt, S. I. et al., Nat Commun. 6 (2015): 6889
Bie, L. et al., PLoS.One. 6 (2011): e25631
Bill, K. L. et al., Lab Invest (2015)
Binsky-Ehrenreich, I. et al., Oncogene 33 (2014): 1006-1016
Black, J. D. et al., Toxins.(Basel) 7 (2015): 1116-1125
Bo, H. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 496
Bockelman, C. et al., Cancer Biol Ther. 13 (2012): 289-295
Boeva, V. et al., PLoS.One. 8 (2013): e72182
Bogdanov, K. V. et al., Tsitologiia 50 (2008): 590-596
Bogni, A. et al., Leukemia 20 (2006): 239-246
Boldt, H. B. et al., Endocrinology 152 (2011): 1470-1478
Bormann, F. et al., Mol.Genet.Genomics 286 (2011): 279-291
Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711
Braumuller, H. et al., Nature (2013)
Bray, F. et al., Int J Cancer 132 (2013): 1133-1145
Brenner, S. et al., Cancer Lett. 356 (2015): 517-524
Bridgewater, J. et al., J Hepatol. 60 (2014): 1268-1289
Brocker, E. B. et al., Int.J Cancer 41 (1988): 562-567
Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599
Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol. 5 (2004): 29-43
Bryant, N. L. et al., J Neurooncol. 101 (2011): 179-188
Burgess, A. W. et al., Exp.Cell Res 317 (2011): 2748-2758
Butler, J. E. et al., J Immunol. 182 (2009): 6600-6609
Butterfield, L. H. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 2817-2825
Butterfield, L. H. et al., Clin Cancer Res 9 (2003): 5902-5908
Byrd, J. C. et al., N.Engl.J Med. 369 (2013): 32-42
Byrns, M. C. et al., J Steroid Biochem.Mol.Biol 125 (2011): 95-104
Cai, C. J. et al., Sichuan.Da.Xue.Xue.Bao.Yi.Xue.Ban. 41 (2010): 941-945
Camoes, M. J. et al., PLoS.One. 7 (2012): e49819
Cao, S. et al., J Virol. 89 (2015): 713-729
Cao, W. et al., J Biol Chem 282 (2007): 18922-18928
Carballido, E. et al., Cancer Control 19 (2012): 54-67
Carbonnelle-Puscian, A. et al., Leukemia 23 (2009): 952-960
Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357
Carlsten, M. et al., Cancer Res 67 (2007): 1317-1325
Carr, J. C. et al., Surgery 152 (2012): 998-1007
Carr, J. C. et al., Ann.Surg.Oncol 20 Suppl 3 (2013): S739-S746
Cassoni, P. et al., J Neuroendocrinol. 16 (2004): 362-364
Catellani, S. et al., Blood 109 (2007): 2078-2085
Cavard, C. et al., J Pathol. 218 (2009): 201-209
Chae, Y. K. et al., Oncotarget. 6 (2015): 37117-37134
Chang, Y. S. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 59 (2007): 561-574
Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol. 65 (2004): 1211-1223
Chapiro, J. et al., Radiol.Med. 119 (2014): 476-482
Che, J. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 6559-6568
Chen, H. S. et al., Zhonghua Gan Zang.Bing.Za Zhi. 11 (2003): 145-148
Chen, H. W. et al., Mol.Carcinog 52 (2013): 647-659
Chen, J. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 75 (2015): 1217-1227
Chen, R. S. et al., Oncogene 28 (2009): 599-609
Chen, W. L. et al., BMC.Cancer 12 (2012): 273
Chen, Y. et al., Am.J Physiol Lung Cell Mol.Physiol 306 (2014): L797-L807
Cheong, S. C. et al., Oral Oncol 45 (2009): 712-719
Chinwalla, V. et al., Oncogene 22 (2003): 1400-1410
Chisholm, K. M. et al., PLoS.One. 7 (2012): e30748
Choi, H. H. et al., Oncotarget. 6 (2015a): 19721-19734
Choi, H. H. et al., Oncotarget. 6 (2015b): 11779-11793
Chudnovsky, Y. et al., Cell Rep. 6 (2014): 313-324
Cicek, M. et al., PLOS.One. 6 (2011): e17522
Cipriano, R. et al., Oncotarget. 4 (2013): 729-738
Cipriano, R. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 1156-1165
Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332
Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361
Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114
Cohen, Y. et al., Hematology. 19 (2014): 286-292
Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995)
Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738
Coosemans, A. et al., Anticancer Res 33 (2013): 5495-5500
Cotterchio, M. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0125273
Counter, C. M. et al., Blood 85 (1995): 2315-2320
Courtial, N. et al., FASEB J 26 (2012): 523-532
Crawford, H. C. et al., Curr.Pharm.Des 15 (2009): 2288-2299
Cribier, B. et al., Br.J Dermatol. 144 (2001): 977-982
Cui, D. et al., Oncogene 33 (2014): 2225-2235
Dahlman, K. B. et al., PLoS.One. 7 (2012): e34414
Dai, X. et al., J Virol. 88 (2014): 12694-12702
de Kruijf, E. M. et al., BMC.Cancer 12 (2012): 24
De, S. et al., Cancer Res 69 (2009): 8035-8042
Dedes, K. J. et al., Sci.Transl.Med. 2 (2010): 53ra75
Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170
Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207
Dhanoa, B. S. et al., Hum.Genomics 7 (2013): 13
Ding, M. et al., Oncotarget. 6 (2015): 7686-7700
Donnard, E. et al., Oncotarget. 5 (2014): 9199-9213
Drayton, R. M. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 1990-2000
Drutskaya, M. S. et al., IUBMB.Life 62 (2010): 283-289
Du, C. et al., Gastric.Cancer 18 (2015): 516-525
Du, H. et al., Protein Pept.Lett. 16 (2009): 486-489
Duffy, M. J. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 1140-1144
Dufour, C. et al., Cancer 118 (2012): 3812-3821
Economopoulou, P. et al., Ann.Transl.Med. 4 (2016): 173
Ehlken, H. et al., Int.J Cancer 108 (2004): 307-313
Eichhorst, B. F. et al., Blood 107 (2006): 885-891
Eijsink, J. J. et al., Int.J Cancer 130 (2012): 1861-1869
Eisele, G. et al., Brain 129 (2006): 2416-2425
Elbelt, U. et al., J Clin Endocrinol.Metab 100 (2015): E119-E128
Elsnerova, K. et al., Oncol Rep. (2016)
Emens, L. A., Expert.Rev.Anticancer Ther. 12 (2012): 1597-1611
Engelmann, J. C. et al., PLoS.Comput.Biol 11 (2015): e1004293
Enguita-German, M. et al., World J Hepatol. 6 (2014): 716-737
Er, T. K. et al., J Mol.Med.(Berl) (2016)
Eruslanov, E. et al., Clin.Cancer Res. 19 (2013): 1670-1680
Espiard, S. et al., Endocrinol.Metab Clin North Am. 44 (2015): 311-334
Estey, E. H., Am.J Hematol. 89 (2014): 1063-1081
Etcheverry, A. et al., BMC.Genomics 11 (2010): 701
Faget, J. et al., Oncoimmunology 2 (2013): e23185
Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296
Fang, M. et al., Mol.Cell Biol 33 (2013): 2635-2647
Fang, Y. et al., Tumour.Biol 33 (2012): 2299-2306
Farrell, A. S. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 924-939
Ferlay et al., GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and
Mortality Worldwide: IARC CancerBase No.11 [Internet], (2013), http://globocan.iarc.fr
Fernandez-Calotti, P. X. et al., Haematologica 97 (2012): 943-951
Fevre-Montange, M. et al., J Neuropathol.Exp.Neurol. 65 (2006): 675-684
Finocchiaro, G. et al., Ann.Transl.Med. 3 (2015): 83
Fiorito, V. et al., Biochim.Biophys.Acta 1839 (2014): 259-264
Fokas, E. et al., Cell Death.Dis. 3 (2012): e441
Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814
Ford-Hutchinson, A. W., Eicosanoids 4 (1991): 65-74
Forsey, R. W. et al., Biotechnol.Lett. 31 (2009): 819-823
Fremont, S. et al., EMBO Rep. 14 (2013): 364-372
Fritz, P. et al., Pathol.Res Pract. 208 (2012): 203-209
Fuge, O. et al., Res Rep.Urol. 7 (2015): 65-79
Fujita, H. et al., J Histochem.Cytochem. 63 (2015): 217-227
Fukuyama, R. et al., Oncogene 27 (2008): 6044-6055
Furman, R. R. et al., N.Engl.J Med. 370 (2014): 997-1007
Furukawa, T. et al., Sci.Rep. 1 (2011): 161
Gabrielson, M. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 469 (2016): 1090-1096
Gabrielson, M. et al., Oncol Rep. 29 (2013): 1268-1274
Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103
Galazis, N. et al., Gynecol.Endocrinol. 29 (2013): 638-644
Gandhi, A. V. et al., Ann Surg.Oncol 20 Suppl 3 (2013): S636-S643
Gao, M. et al., Diagn.Pathol. 8 (2013): 205
Garbe, C. et al., J Invest Dermatol. 100 (1993): 239S-244S
Garcia-Irigoyen, O. et al., Hepatology 62 (2015): 166-178
Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393
Gazy, I. et al., Mutat.Res Rev Mutat.Res 763 (2015): 267-279
Gelsi-Boyer, V. et al., Mol.Cancer Res 3 (2005): 655-667
Ghosh, A. et al., Int.J Biol Sci. 12 (2016): 30-41
Giannopoulos, K. et al., Leukemia 24 (2010): 798-805
Giannopoulos, K. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 95-103
Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867
Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911
Goede, V. et al., N.Engl.J Med. 370 (2014): 1101-1110
Gonda, T. J. et al., Expert.Opin.Biol Ther. 8 (2008): 713-717
Goni, M. H. et al., Anticancer Res 13 (1993): 1155-1160
Granziero, L. et al., Blood 97 (2001): 2777-2783
Green, J. et al., Cochrane.Database.Syst.Rev (2005): CD002225
Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012)
Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014)
Grimm, M. et al., J Transl.Med. 12 (2014): 208
Grinberg-Rashi, H. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 1755-1761
Grivas, P. D. et al., Semin.Cancer Biol 35 (2015): 125-132
Gruel, N. et al., Breast Cancer Res 16 (2014): R46
Gunawardana, C. et al., Br.J Haematol. 142 (2008): 606-609
Guo, P. et al., Onco.Targets.Ther. 8 (2015a): 73-79
Guo, T. et al., Int.J Cancer (2016)
Guo, Z. et al., Tumour.Biol 36 (2015b): 3583-3589
Guo, Z. et al., Tumour.Biol 36 (2015c): 4777-4783
Guyonnet, Duperat, V et al., Biochem.J 305 ( Pt 1) (1995): 211-219
Hallek, Michael et al., ASH Annual Meeting Abstracts 112 (2008): 325
Halon, A. et al., Arch.Gynecol.Obstet. 287 (2013): 563-570
Handkiewicz-Junak, D. et al., Eur.J Nucl.Med.Mol.Imaging (2016)
Hapgood, G. et al., Blood 126 (2015): 17-25
Harig, S. et al., Blood 98 (2001): 2999-3005
Hayette, S. et al., Oncogene 19 (2000): 4446-4450
He, H. et al., Diagn.Mol.Pathol. 21 (2012): 143-149
He, M. et al., J Dig.Dis. 12 (2011): 393-400
Heerma van Voss, M. R. et al., Histopathology 65 (2014): 814-827
Heishima, K. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0137361
Hill, S. J. et al., Genes Dev. 28 (2014): 1957-1975
Hinrichs, C. S. et al., Nat.Biotechnol. 31 (2013): 999-1008
Hirahata, M. et al., Cancer Med. (2016)
Hirano, Y. et al., Genes Cells 11 (2006): 1295-1304
Hlavac, V. et al., Medicine (Baltimore) 93 (2014): e255
Holla, S. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 210
Holtl, L. et al., Clin.Cancer Res. 8 (2002): 3369-3376
Hong, L. et al., Hum.Pathol. 45 (2014): 2423-2429
Honore, B. et al., Exp.Cell Res 294 (2004): 199-209
Horig, H. et al., Cancer Immunol Immunother. 49 (2000): 504-514
Hu, X. T. et al., Zhonghua Zhong.Liu Za Zhi. 30 (2008): 515-518
Hu, X. T. et al., Oncol Rep. 22 (2009): 1247-1252
Huang, P. Y. et al., Leuk.Lymphoma 55 (2014): 2085-2092
Huang, Y. et al., Clin Epigenetics. 8 (2016): 9
Huang, Y. et al., PLoS.One. 8 (2013a): e82519
Huang, Y. et al., Cell Biosci. 3 (2013b): 16
Huang, Y. X. et al., Nan.Fang Yi.Ke.Da.Xue.Xue.Bao. 29 (2009): 1329-1332
Hubertus, J. et al., Oncol Rep. 25 (2011): 817-823
Huisman, C. et al., Mol.Ther. (2015)
Huisman, C. et al., Mol.Oncol 7 (2013): 669-679
Hung, C. F. et al., Immunol.Rev 222 (2008): 43-69
Hus, I. et al., Oncol Rep. 20 (2008): 443-451
Hussein, S. et al., Sci.Rep. 5 (2015): 15752
Huu, N. T. et al., FEBS J 282 (2015): 4727-4746
Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838
Ihn, H. J. et al., Exp.Biol Med.(Maywood.) 240 (2015): 1690-1697
Ilm, K. et al., Mol.Cancer 14 (2015): 38
Imai, K. et al., Br.J Cancer 104 (2011): 300-307
Inoue, K. et al., Subcell.Biochem. 85 (2014): 17-40
Ishida, T. et al., Leukemia 20 (2006): 2162-2168
Ishizone, S. et al., Cancer Sci. 97 (2006): 119-126
Iunusova, N. V. et al., Izv.Akad.Nauk Ser.Biol (2014): 448-455
Iunusova, N. V. et al., Izv.Akad.Nauk Ser.Biol (2013): 284-291
Iwakawa, R. et al., Carcinogenesis 36 (2015): 616-621
Jager, D. et al., Cancer Res 60 (2000): 3584-3591
Jaiswal, A. S. et al., Bioorg.Med.Chem Lett. 24 (2014): 4850-4853
Januchowski, R. et al., Biomed.Pharmacother. 67 (2013): 240-245
Januchowski, R. et al., Biomed.Pharmacother. 68 (2014): 447-453
Jelinek, J. et al., PLoS.One. 6 (2011): e22110
Jenne, D. E. et al., Am.J Hum.Genet. 69 (2001): 516-527
Jiang, H. et al., Int.J Mol.Med. 35 (2015a): 1374-1380
Jiang, H. et al., Exp.Ther.Med. 8 (2014a): 769-774
Jiang, H. N. et al., PLoS.One. 8 (2013): e67637
Jiang, L. et al., Cell Cycle 14 (2015b): 2881-2885
Jiang, L. et al., Oncotarget. 5 (2014b): 7663-7676
Jiang, Y. et al., Mol.Cell 53 (2014c): 75-87
Jiao, X. L. et al., Eur.Rev Med.Pharmacol.Sci. 18 (2014): 509-515
Johnson, M. A. et al., Growth Horm.IGF.Res 24 (2014): 164-173
Jones, R. T. et al., Urol.Clin North Am. 43 (2016): 77-86
Ju, W. et al., Oncol.Res. 18 (2009): 47-56
Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615
Junttila, M. R. et al., Cell Cycle 7 (2008): 592-596
Kachakova, D. et al., J BUON. 18 (2013): 660-668
Kadeh, H. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 16 (2015): 6609-6613
Kalikin, L. M. et al., Genomics 57 (1999): 36-42
Kalos, M. et al., Sci.Transl.Med. 3 (2011): 95ra73
Kang, Y. K. et al., Cancer Res 68 (2008): 7887-7896
Kanthan, R. et al., J Oncol 2015 (2015): 967472
Kanzaki, H. et al., Oncol Rep. 18 (2007): 1171-1175
Kanzaki, H. et al., J Cancer Res Clin Oncol 134 (2008): 211-217
Kanzawa, M. et al., Pathobiology 80 (2013): 235-244
Karim, H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 411 (2011): 156-161
Karrman, K. et al., Br.J Haematol. 144 (2009): 546-551
Kasiappan, R. et al., Mol.Cancer 9 (2010): 311
Katkoori, V. R. et al., PLoS.One. 7 (2012): e30020
Kato, S. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 33-40
Kaufman, H. L. et al., Clin Cancer Res 14 (2008): 4843-4849
Kayser, G. et al., Pathology 43 (2011): 719-724
Kelavkar, U. et al., Curr.Urol.Rep. 3 (2002): 207-214
Kelavkar, U. P. et al., Prostaglandins Other Lipid Mediat. 82 (2007): 185-197
Khanna, A. et al., Int.J Cancer 138 (2016): 525-532
Khanna, A. et al., Cancer Res 73 (2013): 6548-6553
Khatamianfar, V. et al., BMJ Open. 2 (2012)
Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000)
Kim, D. S. et al., J Proteome.Res 9 (2010a): 3710-3719
Kim, H. S. et al., Korean J Intern.Med. 25 (2010b): 399-407
Kim, J. et al., J Biol Chem 286 (2011): 43294-43300
Kim, J. H. et al., J Prev.Med.Public Health 49 (2016): 61-68
Kim, J. W. et al., Cancer Sci. 100 (2009): 1468-1478
Kim, J. Y. et al., BMB.Rep. 47 (2014a): 451-456
Kim, K. et al., Mol.Cancer Res 6 (2008): 426-434
Kim, S. M. et al., Int.J Cancer 134 (2014b): 114-124
Kim, Y. D. et al., Int.J Mol.Med. 29 (2012): 656-662
Kindla, J. et al., Cancer Biol Ther. 11 (2011): 584-591
Kirschner, L. S. et al., Horm.Cancer 7 (2016): 9-16
Kitchen, M. O. et al., Epigenetics. 11 (2016): 237-246
Kiyomitsu, T. et al., Mol.Cell Biol 31 (2011): 998-1011
Kleylein-Sohn, J. et al., J Cell Sci. 125 (2012): 5391-5402
Klopfleisch, R. et al., J Proteome.Res 9 (2010): 6380-6391
Knollman, H. et al., Ther.Adv.Urol. 7 (2015a): 312-330
Knollman, H. et al., Ther.Adv.Urol. 7 (2015b): 312-330
Kocer, B. et al., Pathol.Int. 52 (2002): 470-477
Kohnz, R. A. et al., ACS Chem Biol 10 (2015): 1624-1630
Kohonen-Corish, M. R. et al., Oncogene 26 (2007): 4435-4441
Koido, S. et al., World J Gastroenterol. 19 (2013): 8531-8542
Kong, D. S. et al., Oncotarget. (2016)
Krackhardt, A. M. et al., Blood 100 (2002): 2123-2131
Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484
Kronenberger, K. et al., J Immunother. 31 (2008): 723-730
Krupenko, S. A. et al., Cell Growth Differ. 13 (2002): 227-236
Kubota, T. et al., Cell Cycle 12 (2013): 2570-2579
Kuchenbaecker, K. B. et al., Nat Genet. 47 (2015): 164-171
Kuefer, M. U. et al., Oncogene 22 (2003): 1418-1424
Kumar, A. et al., Cell Biochem.Biophys. 67 (2013): 837-851
Kumar, R. et al., DNA Repair (Amst) 15 (2014): 54-59
Kunimoto, K. et al., J Cell Physiol 220 (2009): 621-631
Kuwada, M. et al., Cancer Lett. 369 (2015): 212-221
Landi, D. et al., Cancer 118 (2012): 4670-4680
Lanier, M. H. et al., Mol.Biol Cell 26 (2015): 4577-4588
Lee, D. G. et al., Curr.Cancer Drug Targets. 11 (2011): 966-975
Lee, J. H. et al., Ann.Surg. 249 (2009a): 933-941
Lee, K. Y. et al., Yonsei Med.J 50 (2009b): 60-67
Lee, M. A. et al., BMC.Cancer 14 (2014a): 125
Lee, S. Y. et al., Eur.J Cancer 50 (2014b): 698-705
Lee, W. C. et al., J Immunother. 28 (2005): 496-504
Lei, N. et al., Oncol Rep. 32 (2014): 1689-1694
Leitlinie Endometriumkarzinom, 032/034, (2008)
Leitlinie Magenkarzinom, 032-009OL, (2012)
Leitlinien für Diagnostik und Therapie in der Neurologie, 030/099, (2014)
Leonetti, M. D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 109 (2012): 19274-19279
Leung, J. et al., Immune.Netw. 14 (2014): 265-276
Li, J. et al., Mol.Biol Rep. 41 (2014): 8071-8079
Li, J. et al., Zhongguo Fei.Ai.Za Zhi. 18 (2015a): 16-22
Li, J. et al., Tumour.Biol (2016)
Li, J. F. et al., Zhonghua Wei Chang Wai Ke.Za Zhi. 15 (2012a): 388-391
Li, L. et al., Pharmacogenet.Genomics 22 (2012b): 105-116
Li, W. Q. et al., Carcinogenesis 34 (2013): 1536-1542
Li, Y. et al., Cancer Biol Ther. 16 (2015b): 1316-1322
Li, Y. et al., Cancer Epidemiol. 39 (2015c): 8-13
Li, Y. F. et al., Int.J Biol Sci. 8 (2012c): 1168-1177
Liang, Y. C. et al., Oncotarget. 6 (2015): 38046-38060
Liao, W. et al., Oncotarget. 5 (2014): 10271-10279
Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987
Lin, C. et al., Oncotarget. 6 (2015): 8434-8453
Lin, J. C. et al., RNA. 20 (2014): 1621-1631
Lin, Y. W. et al., Eur.J Cancer 45 (2009): 2041-2049
Lin, Z. et al., Diagn.Pathol. 8 (2013): 133
Lindqvist, B. M. et al., Epigenetics. 7 (2012): 300-306
Linhares, N. D. et al., Eur.J Med.Genet. 57 (2014): 643-648
Linher-Melville, K. et al., Mol.Cell Biochem. 405 (2015): 205-221
Linkov, F. et al., Eur.Cytokine Netw. 20 (2009): 21-26
Listerman, I. et al., Cancer Res 73 (2013): 2817-2828
Liu, C. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015): 7446-7449
Liu, L. et al., Biochem.J 451 (2013a): 55-60
Liu, M. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 14 (2013b): 6281-6286
Liu, Q. et al., Med.Oncol 31 (2014a): 882
Liu, T. et al., DNA Repair (Amst) 11 (2012): 131-138
Liu, W. J. et al., Leuk.Lymphoma 55 (2014b): 2691-2698
Liu, X. et al., Mol.Biol Rep. 41 (2014c): 7471-7478
Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759
Lleonart, M. E. et al., Oncol Rep. 16 (2006): 603-608
Llovet, J. M. et al., N.Engl.J Med. 359 (2008): 378-390
Lobito, A. A. et al., J Biol Chem 286 (2011): 18969-18981
Loddo, M. et al., J Pathol. 233 (2014): 344-356
Lollini, P. L. et al., Int.J Cancer 55 (1993): 320-329
Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291
Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585
Lu, G. et al., Cancer Cell 26 (2014): 222-234
Lucas, S. et al., Int.J Cancer 87 (2000): 55-60
Luhrig, S. et al., Cell Div. 8 (2013): 3
Luis, Espinoza J. et al., Cancer Sci. 104 (2013): 657-662
Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981):2791-2795
Lukka, H. et al., Clin Oncol (R Coll.Radiol.) 14 (2002): 203-212
Luna, B. et al., Mol.Neurobiol. 52 (2015): 1341-1363
Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004)
Ma, J. et al., Pathol.Oncol Res 19 (2013a): 821-832
Ma, L. D. et al., Zhongguo Shi Yan.Xue.Ye.Xue.Za Zhi. 21 (2013b): 1429-1434
Ma, T. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi. 94 (2014): 3005-3007
Maggioni, A. et al., Protein Expr.Purif. 101 (2014): 165-171
Mahomed, F., Oral Oncol 47 (2011): 797-803
Mantel, A. et al., Exp.Dermatol. 23 (2014): 573-578
Mantia-Smaldone, G. M. et al., Hum.Vaccin.Immunother. 8 (2012): 1179-1191
Marchio, C. et al., J Clin Pathol. 63 (2010): 220-228
Marechal, R. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 2913-2919
Marine, J. C., Nat Rev Cancer 12 (2012): 455-464
Markus, M. A. et al., Genomics 107 (2016): 138-144
Marten, A. et al., Cancer Immunol.Immunother. 51 (2002): 637-644
Martin, R. W. et al., Cancer Res 67 (2007): 9658-9665
Martinez, I. et al., Eur.J Cancer 43 (2007): 415-432
Marzec, K. A. et al., Biomed.Res Int. 2015 (2015): 638526
Mason, C. C. et al., Leukemia (2015)
Massari, F. et al., Cancer Treat.Rev. 41 (2015): 114-121
Massoner, P. et al., PLoS.One. 8 (2013): e55207
Matsueda, S. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014): 1657-1666
Matsuura, N. et al., Nihon Rinsho 53 (1995): 1643-1647
Maus, M. V. et al., Blood 123 (2014): 2625-2635
Mayr, C. et al., Exp.Hematol. 34 (2006): 44-53
Mayr, C. et al., Blood 105 (2005): 1566-1573
McGilvray, R. W. et al., Int.J Cancer 127 (2010): 1412-1420
Medeiros, A. C. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 3 (1994): 331-333
Mehta, J. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0120622
Mei, J. Z. et al., Nan.Fang Yi.Ke.Da.Xue.Xue.Bao. 27 (2007): 887-889
Mencia, N. et al., Biochem.Pharmacol. 82 (2011): 1572-1582
Mendoza-Maldonado, R. et al., PLoS.One. 5 (2010): e13720
Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237
Migliorini, D. et al., J Clin Invest 121 (2011): 1329-1343
Milutin, Gasperov N. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0129452
Missero, C. et al., Exp.Dermatol. 23 (2014): 143-146
Miyagi, Y. et al., Clin Cancer Res 7 (2001): 3950-3962
Miyamoto, K. et al., Int.J Cancer 116 (2005): 407-414
Mohanraj, L. et al., Recent Pat Anticancer Drug Discov 6 (2011): 166-177
Mohelnikova-Duchonova, B. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 72 (2013): 669-682
Molina, J. R. et al., Mayo Clin Proc. 83 (2008): 584-594
Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129
Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027
Morin, P. J., Cancer Res 65 (2005): 9603-9606
Morita, T. et al., Int.J Cancer 109 (2004): 525-532
Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443
Moser, J. J. et al., J Neurosci.Res 85 (2007): 3619-3631
Mou, X. et al., Sci.Rep. 4 (2014): 6138
Moulton, H. M. et al., Clin Cancer Res 8 (2002): 2044-2051
Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61
Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480
Mukhopadhyay, P. et al., Biochim.Biophys.Acta 1815 (2011): 224-240
Muller, M. R. et al., Blood 103 (2004): 1763-1769
Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638
Nagashio, R. et al., Sci.Rep. 5 (2015): 8649
Naito, T. et al., J Biol Chem 290 (2015): 15004-15017
Nakajima, H. et al., Cancer Sci. 105 (2014): 1093-1099
Nakano, K. et al., EXp.Cell Res 287 (2003): 219-227
Nakarai, C. et al., Clin Exp.Med. 15 (2015): 333-341
Nakashima, A. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 361 (2007): 218-223
National Cancer Institute, (5-6-2015), www.cancer.gov
Nguyen, M. H. et al., Int.J Oncol 41 (2012): 1285-1296
Ni, I. B. et al., Hematol.Rep. 4 (2012): e19
Ni, L. et al., J Cell Biochem. 106 (2009): 920-928
Nobusawa, S. et al., Brain Tumor Pathol. 31 (2014): 229-233
O'Brien, S. et al., Lancet Oncol 15 (2014): 48-58
O'Geen, H. et al., PLoS.Genet. 3 (2007): e89
Obama, K. et al., Clin Cancer Res 14 (2008): 1333-1339
Oehler, V. G. et al., Blood 114 (2009): 3292-3298
Ogasawara, N. et al., J Biochem. 149 (2011): 321-330
Ogbomo, H. et al., Neoplasia. 10 (2008): 1402-1410
Ogiso, Y. et al., Cancer Res 62 (2002): 5008-5012
Oh, Y. et al., J Biol.Chem 287 (2012): 17517-17529
Okabe, N. et al., Int.J Oncol 46 (2015): 999-1006
Okuno, K. et al., Exp.Ther Med. 2 (2011): 73-79
Olkhanud, P. B. et al., Cancer Res 69 (2009): 5996-6004
Olszewski-Hamilton, U. et al., Biomark.Cancer 3 (2011): 31-40
Orentas, R. J. et al., Front Oncol 2 (2012): 194
Orzol, P. et al., Histol.Histopathol. 30 (2015): 503-521
Ouyang, M. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 132
Ozawa, H. et al., Ann.Surg.Oncol 17 (2010): 2341-2348
Ozeki, N. et al., Int.J Mol.Sci. 17 (2016)
Palma, M. et al., Cancer Immunol Immunother. 57 (2008): 1705-1710
Palmer, D. H. et al., Hepatology 49 (2009): 124-132
Palomba, M. L., Curr.Oncol Rep. 14 (2012): 433-440
Pan, J. et al., Leuk.Res 36 (2012): 889-894
Pannu, V. et al., Oncotarget. 6 (2015): 6076-6091
Parikh, R. A. et al., Genes Chromosomes.Cancer 53 (2014): 25-37
Parikh, S. A. et al., Blood 118 (2011): 2062-2068
Parisi, M. A., Am.J Med.Genet.C.Semin.Med.Genet. 151C(2009): 326-340
Park, E. et al., Mol.Cell 50 (2013): 908-918
Park, M. J. et al., Immunol.Invest 40 (2011): 367-382
Park, Y. R. et al., Cancer Genomics Proteomics. 13 (2016): 83-90
Parplys, A. C. et al., DNA Repair (Amst) 24 (2014): 87-97
Pasmant, E. et al., Mol.Med. 17 (2011): 79-87
Patil, A. A. et al., Oncotarget. 5 (2014): 6414-6424
Pattabiraman, D. R. et al., Leukemia 27 (2013): 269-277
Pawar, S. et al., J Ovarian.Res 7 (2014): 53
Payne, S. R. et al., Prostate 69 (2009): 1257-1269
Peng, B. et al., Mol.Biosyst. 11 (2015): 105-114
Pequeux, C. et al., Cancer Res 62 (2002): 4623-4629
Perrais, M. et al., J Biol Chem 276 (2001): 15386-15396
Petrini, I., Ann.Transl.Med. 3 (2015): 82
Phan, G. Q. et al., Cancer Control 20 (2013): 289-297
Phe, V. et al., BJU.Int. 104 (2009): 896-901
Piasecka, D. et al., Postepy Biochem. 61 (2015): 198-206
Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects
Models (http://CRAN.R-project.org/packe=nlme) (2015)
Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787
Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955
Porter, D. L. et al., N.Engl.J Med. 365 (2011): 725-733
Potapenko, I. O. et al., Mol.Oncol 9 (2015): 861-876
Przybyl, J. et al., Int.J Biochem.Cell Biol 53 (2014): 505-513
Qian, M. X. et al., Cell 153 (2013): 1012-1024
Qiu, J. et al., Leukemia 17 (2003): 1891-1900
Quinn, D. I. et al., Urol.Oncol. (2015)
Qureshi, R. et al., Cancer Lett. 356 (2015): 321-331
Rainer, J. et al., Mol.Endocrinol. 26 (2012): 178-193
Raja, S. B. et al., J Cell Sci. 125 (2012): 703-713
Rajadhyaksha, A. M. et al., Am.J Hum.Genet. 87 (2010): 643-654
Rajkumar, T. et al., BMC.Cancer 11 (2011): 80
Rakic, M. et al., Hepatobiliary.Surg.Nutr. 3 (2014): 221-226
Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219
Ramsay, R. G. et al., Expert.Opin.Ther.Targets. 7 (2003): 235-248
RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/
Reid-Lombardo, K. M. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 20 (2011): 1251-1254
Reinisch, W. et al., J Immunother. 25 (2002): 489-499
Reinmuth, N. et al., Dtsch.Med.Wochenschr. 140 (2015): 329-333
Relogio, A. et al., PLoS.Genet. 10 (2014): e1004338
Rendon-Huerta, E. et al., J Gastrointest.Cancer 41 (2010): 52-59
Resende, C. et al., Helicobacter. 16 Suppl 1 (2011): 38-44
Richards, S. et al., J Natl.Cancer Inst. 91 (1999): 861-868
Ricke, R. M. et al., Cell Cycle 10 (2011): 3645-3651
Rincon, R. et al., Oncotarget. 6 (2015): 4299-4314
Rini, B. I. et al., Curr.Opin.Oncol. 20 (2008): 300-306
Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74
Riordan, J. D. et al., PLoS.Genet. 9 (2013): e1003441
Ritter, A. et al., Cell Cycle 14 (2015): 3755-3767
Robak, T. et al., Expert.Opin.Biol.Ther 14 (2014): 651-661
Roca, H. et al., PLoS.One. 8 (2013): e76773
Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921
Rodenko, B. et al., Nat Protoc. 1 (2006): 1120-1132
Rodini, C. O. et al., Int.J Oncol 40 (2012): 1180-1188
Rodriguez, F. J. et al., J Neuropathol.Exp.Neurol. 67 (2008): 1194-1204
Romanuik, T. L. et al., BMC.Med.Genomics 3 (2010): 43
Ronchi, C. L. et al., Neoplasia. 14 (2012): 206-218
Rouanne, M. et al., Crit Rev Oncol Hematol. 98 (2016): 106-115
Rucki, A. A. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014): 2237-2246
Rudland, P. S. et al., Am.J Pathol. 176 (2010): 2935-2947
Rutkowski, M. J. et al., Mol Cancer Res 8 (2010): 1453-1465
Ryu, B. et al., PLoS.One. 2 (2007): e594
S3-Leitlinie Exokrines Pankreaskarzinom, 032-010OL, (2013)
S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 020/007, (2011)
S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 032-035OL, (2013)
S3-Leitlinie Mammakarzinom, 032-045OL, (2012)
S3-Leitlinie Melanom, 032-024OL, (2013)
S3-Leitlinie Prostatakarzinom, 043/022OL, (2014)
S3-Leitlinie Zervixkarzinom, 032/033OL, (2014)
Sadeque, A. et al., BMC.Med.Genomics 5 (2012): 59
Saeki, M. et al., PLoS.One. 8 (2013): e67326
Safarpour, D. et al., Arch.Pathol.Lab Med. 139 (2015): 612-617
Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491
Salim, H. et al., Genes Chromosomes.Cancer 52 (2013): 895-911
Salman, B. et al., Oncoimmunology. 2 (2013): e26662
Sandoval, J. et al., J Clin Oncol 31 (2013): 4140-4147
Sangro, B. et al., J Clin Oncol 22 (2004): 1389-1397
Sankaranarayanan, P. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0121396
Santarlasci, V. et al., Eur.J Immunol. 44 (2014): 654-661
Sarma, S. N. et al., Environ.Toxicol.Pharmacol. 32 (2011): 285-295
Sasao, T. et al., Reproduction. 128 (2004): 709-716
Satija, Y. K. et al., Int.J Cancer 133 (2013): 2759-2768
Sato, N. et al., Genes Chromosomes.Cancer 49 (2010): 353-367
Savaskan, N. E. et al., Ann.Anat. 192 (2010): 309-313
Savaskan, N. E. et al., Curr.Neuropharmacol. 13 (2015): 258-265
Sawada, G. et al., Oncol Rep. 30 (2013): 1971-1975
Schetelig, J. et al., J Clin Oncol 26 (2008): 5094-5100
Scheurer, B. et al., Immunopharmacology 38 (1997): 167-175
Schmidt, S. M. et al., Cancer Res 64 (2004): 1164-1170
Schreiber, M. et al., J Biol Chem 273 (1998): 3509-3516
Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576
Seidl, C. et al., Invest New Drugs 28 (2010): 49-60
Seppanen, M. et al., Acta Obstet.Gynecol.Scand. 87 (2008): 902-909
Shareef, M. M. et al., Arab.J Gastroenterol. 16 (2015): 105-112
Sharma, R. K. et al., Clin Exp.Metastasis 33 (2016): 263-275
Sharpe, D. J. et al., Oncotarget. 5 (2014): 8803-8815
Shen, C. et al., Cancer Res 73 (2013): 3393-3401
Shen, Y. et al., Oncotarget. 6 (2015a): 20396-20403
Shen, Y. et al., Cancer Cell Microenviron. 2 (2015b)
Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986)
Sherman, S. K. et al., Surgery 154 (2013): 1206-1213
Shi, M. et al., World J Gastroenterol. 10 (2004): 1146-1151
Shi, Z. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 8519-8529
Shimizu, F. et al., Lab Invest 83 (2003): 187-197
Shioji, G. et al., J Hum.Genet. 50 (2005): 507-515
Showel, M. M. et al., F1000Prime.Rep. 6 (2014): 96
Siegel, S. et al., Blood 102 (2003): 4416-4423
Siew, Y. Y. et al., Int.Immunol. 27 (2015): 621-632
Silva, L. P. et al., Anal.Chem. 85 (2013): 9536-9542
Silvestris, F. et al., Adv.Exp.Med.Biol 714 (2011): 113-128
Singh, V. et al., Curr.Cancer Drug Targets. 13 (2013): 379-399
Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 187-195
Skawran, B. et al., Mod.Pathol. 21 (2008): 505-516
Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094
Smetsers, S. et al., Fam.Cancer 11 (2012): 661-665
Smith, P. et al., Clin Cancer Res 13 (2007): 4061-4068
Sohrabi, A. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 15 (2014): 6745-6748
Song, H. R. et al., Mol.Carcinog 52 Suppl 1 (2013): E155-E160
Sonora, C. et al., J Histochem.Cytochem. 54 (2006): 289-299
Spaner, D. E. et al., Cancer Immunol Immunother. 54 (2005): 635-646
Srivastava, N. et al., Cancer Manag.Res. 6 (2014): 279-289
Stacey, S. N. et al., Nat Commun. 6 (2015): 6825
Stahl, M. et al., Ann.Oncol. 24 Suppl 6 (2013): vi51-vi56
Stangel, D. et al., J Surg.Res 197 (2015): 91-100
Stein, U., EXpert.Opin.Ther.Targets. 17 (2013): 1039-1052
Steinberg, R. L. et al., Urol.Oncol (2016a)
Steinberg, R. L. et al., Urol.Oncol (2016b)
Steinway, S. N. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0128159
Stenman, G. et al., Cell Cycle 9 (2010): 2986-2995
Stevanovic, S. et al., J Clin Oncol 33 (2015): 1543-1550
Stintzing, S., F1000Prime.Rep. 6 (2014): 108
Stratakis, C. A. et al., DNA Seq. 9 (1998): 227-230
Struyf, S. et al., Am.J Pathol. 163 (2003): 2065-2075
Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics. 9 (2008): 163
Su, Z. et al., Cancer Res. 63 (2003): 2127-2133
Subhash, V. V. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 550
Sui, Y. et al., Oncogene 26 (2007): 822-835
Sukocheva, O. A. et al., World J Gastroenterol. 21 (2015): 6146-6156
Sun, S. et al., Gene 584 (2016): 90-96
Sun, W. et al., World J Gastroenterol. 19 (2013): 2913-2920
Sutherland, C. L. et al., Blood 108 (2006): 1313-1319
Suzuki, N. et al., J Orthop.Res 32 (2014): 915-922
Tabares-Seisdedos, R. et al., Mol.Psychiatry 14 (2009): 563-589
Takahashi, M. et al., Int.J Oncol 27 (2005): 1483-1487
Takatsu, H. et al., J Biol Chem 286 (2011): 38159-38167
Takayama, M. A. et al., Genes Cells 5 (2000a): 481-490
Takayama, T. et al., Cancer 68 (1991): 2391-2396
Takayama, T. et al., Lancet 356 (2000b): 802-807
Taketani, T. et al., Cancer Res 62 (2002): 33-37
Tang, C. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 4782-4794
Tatenhorst, L. et al., J Neuropathol.Exp.Neurol. 63 (2004): 210-222
Taverniti, V. et al., Nucleic Acids Res 43 (2015): 482-492
Taylor, M. et al., Breast Cancer Res 9 (2007): R46
Terabayashi, T. et al., PLoS.One. 7 (2012): e39714
Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci. 62 (2005): 1755-1762
Thakkar, J. P. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 23 (2014): 1985-1996
Tian, Y. et al., Diagn.Pathol. 9 (2014): 42
Ting, L. et al., DNA Repair (Amst) 9 (2010): 1241-1248
Toda, M. et al., Meta Gene 2 (2014): 686-693
Toomey, P. G. et al., Cancer Control 20 (2013): 32-42
Torelli, G. F. et al., Haematologica 99 (2014): 1248-1254
Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645
Tsujikawa, T. et al., Int.J Cancer 132 (2013): 2755-2766
Tumova, L. et al., Mol.Cancer Ther. 13 (2014): 812-822
Urata, Y. N. et al., Sci.Rep. 5 (2015): 13676
Ushiku, T. et al., Histopathology 61 (2012): 1043-1056
Utrera, R. et al., EMBO J 17 (1998): 5015-5025
Vainio, P. et al., Am.J Pathol. 178 (2011a): 525-536
Vainio, P. et al., Oncotarget. 2 (2011b): 1176-1190
Valque, H. et al., PLoS.One. 7 (2012): e46699
van de Klundert, M. A. et al., PLoS.One. 7 (2012): e48940
Van Ginkel, P. R. et al., Biochim.Biophys.Acta 1448 (1998): 290-297
van Muijen, G. N. et al., Recent Results Cancer Res 139 (1995): 105-122
Van, Seuningen, I et al., Biochem.J 348 Pt 3 (2000): 675-686
Vater, I. et al., Leukemia 29 (2015): 677-685
Ventela, S. et al., Oncotarget. 6 (2015): 144-158
Verreman, K. et al., Biochem.J 439 (2011): 469-477
Vici, P. et al., J Exp.Clin Cancer Res 33 (2014): 29
Von Hoff, D. D. et al., N.Engl.J Med. 369 (2013): 1691-1703
von Rundstedt, F. C. et al., Transl.Androl Urol. 4 (2015): 244-253
Wallrapp, C. et al., Ann.Oncol 10 Suppl 4 (1999): 64-68
Walsh, M. D. et al., Mod.Pathol. 26 (2013): 1642-1656
Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978
Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261
Walton, E. L. et al., Biology.(Basel) 3 (2014): 578-605
Wan, W. et al., World J Surg.Oncol 12 (2014): 185
Wang, C. et al., Nucleic Acids Res 43 (2015a): 4893-4908
Wang, C. Q. et al., Oral Surg.Oral Med.Oral Pathol.Oral Radiol. 117 (2014a): 353-360
Wang, D. et al., Chin Med.Sci.J 14 (1999a): 107-111
Wang, G. et al., Tumour.Biol 36 (2015b): 1055-1065
Wang, G. H. et al., Oncol Lett. 5 (2013a): 544-548
Wang, H. et al., Carcinogenesis 30 (2009a): 1314-1319
Wang, J. et al., Ann.Surg.Oncol 22 (2015c): 685-692
Wang, J. et al., J Exp.Clin Cancer Res 34 (2015d): 13
Wang, J. W. et al., Oncogene 23 (2004): 4089-4097
Wang, L. et al., J Cutan.Pathol. 42 (2015e): 361-367
Wang, L. et al., Mol.Biol Rep. 38 (2011a): 229-236
Wang, L. et al., Diagn.Pathol. 8 (2013b): 190
Wang, N. et al., Arch.Gynecol.Obstet. 283 (2011b): 103-108
Wang, Q. et al., Cell 138 (2009b): 245-256
Wang, Q. et al., BMC.Cancer 11 (2011c): 271
Wang, Q. et al., Onco.Targets.Ther. 8 (2015f): 1971-1977
Wang, Q. et al., PLoS.One. 8 (2013c): e61640
Wang, R. et al., Mol.Cell Biochem. 405 (2015g): 97-104
Wang, S. et al., J Cell Sci. 120 (2007): 567-577
Wang, W. Z. et al., J Exp.Clin Cancer Res 29 (2010): 140
Wang, X. W. et al., Gut Liver 8 (2014b): 487-494
Wang, X. Z. et al., Oncogene 18 (1999b): 5718-5721
Wang, Y. et al., Cancer Cell 26 (2014c): 374-389
Wang, Y. P. et al., Ai.Zheng. 27 (2008): 243-248
Wang, Z. et al., J Cancer Res Clin Oncol 141 (2015h): 1353-1361
Wang, Z. et al., Oncotarget. (2016)
Wang, Z. et al., Glycobiology 22 (2012): 930-938
Watanabe, N. et al., J Biol Chem 278 (2003): 26102-26110
Watts, C. A. et al., Chem Biol 20 (2013): 1399-1410
Wells, J. et al., J Biol Chem 284 (2009): 29125-29135
Weng, Y. R. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1389-1398
Wheler, J. J. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 442
Whitaker, H. C. et al., Oncogene 33 (2014): 5274-5287
Wierda, W. G. et al., Blood 118 (2011): 5126-5129
Wierinckx, A. et al., Endocr.Relat Cancer 14 (2007): 887-900
Wilhelm, S. M. et al., Cancer Res 64 (2004): 7099-7109
Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423
Williams, G. L. et al., Cell Cycle 6 (2007): 1699-1704
Wilson, P. M. et al., Nat Rev.Clin Oncol 11 (2014): 282-298
Wilzen, A. et al., Int.J Oncol 34 (2009): 697-705
Wittig, B. et al., Hum.Gene Ther. 12 (2001): 267-278
Wlcek, K. et al., Cancer Biol Ther. 11 (2011): 801-811
Wong, R. P. et al., Pigment Cell Melanoma Res 25 (2012): 213-218
World Cancer Report, (2014)
World Health Organization, (2014), http://www.who.int/en/ Wu,J. et al., ACS Chem Biol 8 (2013): 2201-2208
Wu, Y. et al., Cancer Lett. 356 (2015): 646-655
Xie, B. et al., Pathol.Oncol Res 19 (2013): 611-617
Xie, C. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 445 (2014): 263-268
Xiong, D. et al., Carcinogenesis 33 (2012): 1797-1805
Xu, X. et al., Oncogene 26 (2007): 7371-7379
Xu, X. et al., J Biol Chem 289 (2014): 8881-8890
Xue, J. H. et al., Acta Pharmacol.Sin. 32 (2011): 1019-1024
Yamada, T. et al., Br.J Cancer 108 (2013): 2495-2504
Yamashita, J. et al., Acta Derm.Venereol. 92 (2012): 593-597
Yamazoe, S. et al., J Exp.Clin Cancer Res 29 (2010): 53
Yan-Chun, L. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol. (2015)
Yan-Fang, T. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0126566
Yang, J. J. et al., Haematologica 99 (2014a): e11-e13
Yang, L. et al., J Biol Chem 291 (2016): 3905-3917
Yang, L. et al., PLoS.One. 10 (2015a): e0133896
Yang, T. T. et al., Sci.Rep. 5 (2015b): 14096
Yang, Y. et al., Oncol Lett. 9 (2015c): 1833-1838
Yang, Y. et al., PLoS.One. 9 (2014b): e97578
Yang, Y. M. et al., Cancer Sci. 102 (2011): 1264-1271
Yao, Y. et al., Cell Physiol Biochem. 35 (2015): 983-996
Ye, B. G. et al., Oncotarget. (2016)
Yeh, I. et al., Nat.Commun. 6 (2015): 7174
Yeh, S. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97 (2000): 11256-11261
Yonezawa, S. et al., Pathol.Int. 49 (1999): 45-54
Yoshimaru, T. et al., Nat Commun. 4 (2013): 2443
Yoshimaru, T. et al., Sci.Rep. 4 (2014): 7355
Young, A. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 808
Yu, C. J. et al., Int.J Cancer 69 (1996): 457-465
Yu, H. et al., Nat Chem Biol 11 (2015a): 847-854
Yu, T. et al., Cell Res 24 (2014): 1214-1230
Yu, X. et al., Tumour.Biol 36 (2015b): 967-972
Yuan, M. et al., Oncotarget. 5 (2014): 2820-2826
Zaganjor, E. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 111 (2014): 10568-10573
Zamuner, F. T. et al., Mol.Cancer Ther. 14 (2015): 828-834
Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577
Zavala-Zendejas, V. E. et al., Cancer Invest 29 (2011): 1-11
Zekri, A. R. et al., BMC.Res Notes 1 (2008): 106
Zeng, B. et al., Curr.Cancer Drug Targets. 13 (2013a): 103-116
Zeng, S. et al., Eur.J Cancer 49 (2013b): 3752-3762
Zeng, X. et al., Ai.Zheng. 26 (2007): 1080-1084
Zeng, X. X. et al., Eur.Rev Med.Pharmacol.Sci. 19 (2015): 4353-4361
Zhan, W. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0142596
Zhang, B. et al., J Huazhong.Univ Sci.Technolog.Med.Sci. 30 (2010a): 322-325
Zhang, G. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 310
Zhang, J. et al., Theor.Biol Med.Model. 9 (2012a): 53
Zhang, Q. et al., Zhongguo Fei.Ai.Za Zhi. 13 (2010b): 612-616
Zhang, W. et al., Clin Cancer Res 7 (2001): 822s-829s
Zhang, W. et al., Biochem.J (2016)
Zhang, X. et al., EMBO J 30 (2011): 2177-2189
Zhang, X. et al., Med.Oncol 32 (2015): 148
Zhang, X. et al., Int.J Med.Sci. 10 (2013a): 1795-1804
Zhang, Y. et al., Gene 497 (2012b): 93-97
Zhang, Y. et al., J Ovarian.Res 6 (2013b): 55
Zhao, J. et al., Int.J Med.Sci. 11 (2014a): 1089-1097
Zhao, J. G. et al., FEBS Lett. 588 (2014b): 4536-4542
Zhen, T. et al., Oncotarget. 5 (2014): 3756-3769
Zheng, M. et al., Breast Cancer Res Treat. 148 (2014): 423-436
Zheng, M. Z. et al., J Transl.Med. 5 (2007): 36
Zhong, M. et al., Mol.Cancer Res 8 (2010): 1164-1172
Zhong, T. et al., Biomed.Pharmacother. 69 (2015): 317-325
Zhou, X. et al., J Cancer Res Clin Oncol 141 (2015): 961-969
Zhou, Y. et al., Front Biosci.(Landmark.Ed) 16 (2011): 1109-1131
Zhou, Z. et al., Gastroenterology 147 (2014): 1043-1054
Zhu, H. H. et al., Asian Pac.J Trop.Med. 7 (2014): 488-491
Zhu, J. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015a): 9479-9486
Zhu, P. et al., Oncol Lett. 10 (2015b): 1487-1494
Zighelboim, I. et al., J Clin Oncol 27 (2009): 3091-3096
Zimmerman, K. M. et al., Mol.Cancer Res 11 (2013): 370-380
Zocchi, M. R. et al., Blood 119 (2012): 1479-1489
Zou, J. X. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 539-549
Zou, T. T. et al., Oncogene 21 (2002): 4855-4862
<110> 德商英麥提克生物技術股份有限公司(immatics biotechnologies GmbH)
<120> 用於多種癌症之免疫治療的新穎胜肽、胜肽的組合物及支架
<150> GB 1515321.6
<151> 2015-08-28
<150> US62/211,276
<151> 2015-08-28
<160> 419
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 110107429-A0202-12-0286-93
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Figure 110107429-A0202-12-0292-163
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Figure 110107429-A0202-12-0292-164
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Figure 110107429-A0202-12-0293-165
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Figure 110107429-A0202-12-0293-166
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Figure 110107429-A0202-12-0293-167
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Figure 110107429-A0202-12-0293-168
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Figure 110107429-A0202-12-0293-169
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Figure 110107429-A0202-12-0293-170
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Figure 110107429-A0202-12-0294-171
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Figure 110107429-A0202-12-0294-172
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Figure 110107429-A0202-12-0294-173
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Figure 110107429-A0202-12-0294-174
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Figure 110107429-A0202-12-0294-175
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Figure 110107429-A0202-12-0295-176
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Figure 110107429-A0202-12-0295-177
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Figure 110107429-A0202-12-0295-178
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Figure 110107429-A0202-12-0295-179
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Figure 110107429-A0202-12-0295-180
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Figure 110107429-A0202-12-0295-181
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Figure 110107429-A0202-12-0296-182
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Figure 110107429-A0202-12-0296-183
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Figure 110107429-A0202-12-0296-184
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Figure 110107429-A0202-12-0296-185
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Figure 110107429-A0202-12-0296-186
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Figure 110107429-A0202-12-0296-187
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Figure 110107429-A0202-12-0297-188
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Figure 110107429-A0202-12-0297-189
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Figure 110107429-A0202-12-0297-190
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Figure 110107429-A0202-12-0297-191
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Figure 110107429-A0202-12-0297-192
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Figure 110107429-A0202-12-0297-193
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Figure 110107429-A0202-12-0298-194
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Figure 110107429-A0202-12-0298-195
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Figure 110107429-A0202-12-0298-196
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
Figure 110107429-A0202-12-0298-197
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Figure 110107429-A0202-12-0298-198
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Figure 110107429-A0202-12-0299-199
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Figure 110107429-A0202-12-0299-200
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Figure 110107429-A0202-12-0299-201
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Figure 110107429-A0202-12-0299-202
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Figure 110107429-A0202-12-0299-203
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Figure 110107429-A0202-12-0299-204
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Figure 110107429-A0202-12-0300-205
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Figure 110107429-A0202-12-0300-206
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Figure 110107429-A0202-12-0300-207
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Figure 110107429-A0202-12-0300-208
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Figure 110107429-A0202-12-0300-209
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Figure 110107429-A0202-12-0300-210
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Figure 110107429-A0202-12-0301-211
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Figure 110107429-A0202-12-0301-212
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Figure 110107429-A0202-12-0301-213
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Figure 110107429-A0202-12-0301-214
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Figure 110107429-A0202-12-0301-215
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Figure 110107429-A0202-12-0302-216
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Figure 110107429-A0202-12-0302-217
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Figure 110107429-A0202-12-0302-218
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Figure 110107429-A0202-12-0302-219
<210> 94
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Figure 110107429-A0202-12-0302-220
<210> 95
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Figure 110107429-A0202-12-0302-221
Figure 110107429-A0202-12-0303-222
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Figure 110107429-A0202-12-0303-223
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Figure 110107429-A0202-12-0303-224
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Figure 110107429-A0202-12-0303-225
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Figure 110107429-A0202-12-0303-226
<210> 100
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Figure 110107429-A0202-12-0303-227
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Figure 110107429-A0202-12-0304-228
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Figure 110107429-A0202-12-0304-229
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Figure 110107429-A0202-12-0304-230
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Figure 110107429-A0202-12-0304-231
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Figure 110107429-A0202-12-0304-232
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Figure 110107429-A0202-12-0304-233
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Figure 110107429-A0202-12-0305-234
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
Figure 110107429-A0202-12-0305-235
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Figure 110107429-A0202-12-0305-236
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Figure 110107429-A0202-12-0305-237
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Figure 110107429-A0202-12-0305-238
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Figure 110107429-A0202-12-0305-239
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Figure 110107429-A0202-12-0306-240
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Figure 110107429-A0202-12-0306-241
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Figure 110107429-A0202-12-0306-242
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
Figure 110107429-A0202-12-0306-244
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
Figure 110107429-A0202-12-0306-243
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
Figure 110107429-A0202-12-0307-245
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
Figure 110107429-A0202-12-0307-246
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Figure 110107429-A0202-12-0307-247
<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Figure 110107429-A0202-12-0307-248
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
Figure 110107429-A0202-12-0307-249
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
Figure 110107429-A0202-12-0307-250
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
Figure 110107429-A0202-12-0308-251
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
Figure 110107429-A0202-12-0308-252
<210> 126
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Figure 110107429-A0202-12-0308-253
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
Figure 110107429-A0202-12-0308-254
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Figure 110107429-A0202-12-0308-255
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 129
Figure 110107429-A0202-12-0308-256
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 130
Figure 110107429-A0202-12-0309-257
<210> 131
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 131
Figure 110107429-A0202-12-0309-258
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 132
Figure 110107429-A0202-12-0309-259
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 133
Figure 110107429-A0202-12-0309-260
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 134
Figure 110107429-A0202-12-0309-261
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
Figure 110107429-A0202-12-0309-262
Figure 110107429-A0202-12-0310-263
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
Figure 110107429-A0202-12-0310-264
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
Figure 110107429-A0202-12-0310-265
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Figure 110107429-A0202-12-0310-266
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
Figure 110107429-A0202-12-0310-267
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
Figure 110107429-A0202-12-0310-268
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 141
Figure 110107429-A0202-12-0311-270
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Figure 110107429-A0202-12-0311-271
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Figure 110107429-A0202-12-0311-272
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Figure 110107429-A0202-12-0311-275
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Figure 110107429-A0202-12-0311-273
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Figure 110107429-A0202-12-0311-274
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
Figure 110107429-A0202-12-0312-276
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
Figure 110107429-A0202-12-0312-277
<210> 149
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 149
Figure 110107429-A0202-12-0312-278
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
Figure 110107429-A0202-12-0312-280
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
Figure 110107429-A0202-12-0312-279
<210> 152
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Figure 110107429-A0202-12-0312-281
<210> 153
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Figure 110107429-A0202-12-0313-282
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Figure 110107429-A0202-12-0313-283
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
Figure 110107429-A0202-12-0313-284
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
Figure 110107429-A0202-12-0313-285
<210> 157
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
Figure 110107429-A0202-12-0313-286
<210> 158
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 158
Figure 110107429-A0202-12-0314-287
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
Figure 110107429-A0202-12-0314-288
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Figure 110107429-A0202-12-0314-289
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Figure 110107429-A0202-12-0314-290
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
Figure 110107429-A0202-12-0314-291
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Figure 110107429-A0202-12-0315-292
<210> 165
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Figure 110107429-A0202-12-0315-293
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
Figure 110107429-A0202-12-0315-294
<210> 167
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 167
Figure 110107429-A0202-12-0315-295
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
Figure 110107429-A0202-12-0315-296
<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
Figure 110107429-A0202-12-0315-297
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 170
Figure 110107429-A0202-12-0316-298
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 171
Figure 110107429-A0202-12-0316-299
<210> 172
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 172
Figure 110107429-A0202-12-0316-300
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
Figure 110107429-A0202-12-0316-302
<210> 174
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 174
Figure 110107429-A0202-12-0316-301
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 175
Figure 110107429-A0202-12-0317-303
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 176
Figure 110107429-A0202-12-0317-304
<210> 177
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 177
Figure 110107429-A0202-12-0317-305
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
Figure 110107429-A0202-12-0317-306
<210> 179
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 179
Figure 110107429-A0202-12-0317-307
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 180
Figure 110107429-A0202-12-0317-308
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 181
Figure 110107429-A0202-12-0318-309
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 182
Figure 110107429-A0202-12-0318-310
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 183
Figure 110107429-A0202-12-0318-311
<210> 184
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 184
Figure 110107429-A0202-12-0318-314
<210> 185
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 185
Figure 110107429-A0202-12-0318-312
<210> 186
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 186
Figure 110107429-A0202-12-0318-313
<210> 187
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 187
Figure 110107429-A0202-12-0319-316
<210> 188
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 188
Figure 110107429-A0202-12-0319-317
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 189
Figure 110107429-A0202-12-0319-318
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 190
Figure 110107429-A0202-12-0319-320
<210> 191
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 191
Figure 110107429-A0202-12-0319-319
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 192
Figure 110107429-A0202-12-0319-321
<210> 193
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 193
Figure 110107429-A0202-12-0320-322
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 194
Figure 110107429-A0202-12-0320-323
<210> 195
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 195
Figure 110107429-A0202-12-0320-324
<210> 196
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 196
Figure 110107429-A0202-12-0320-326
<210> 197
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 197
Figure 110107429-A0202-12-0320-325
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 198
Figure 110107429-A0202-12-0321-327
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 199
Figure 110107429-A0202-12-0321-328
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 200
Figure 110107429-A0202-12-0321-329
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 201
Figure 110107429-A0202-12-0321-330
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 202
Figure 110107429-A0202-12-0321-331
<210> 203
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 203
Figure 110107429-A0202-12-0321-332
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 204
Figure 110107429-A0202-12-0322-333
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 205
Figure 110107429-A0202-12-0322-334
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 206
Figure 110107429-A0202-12-0322-335
<210> 207
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 207
Figure 110107429-A0202-12-0322-336
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 208
Figure 110107429-A0202-12-0322-337
<210> 209
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 209
Figure 110107429-A0202-12-0322-338
<210> 210
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 210
Figure 110107429-A0202-12-0323-339
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 211
Figure 110107429-A0202-12-0323-340
<210> 212
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 212
Figure 110107429-A0202-12-0323-341
<210> 213
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 213
Figure 110107429-A0202-12-0323-343
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 214
Figure 110107429-A0202-12-0323-342
<210> 215
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 215
Figure 110107429-A0202-12-0324-344
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 216
Figure 110107429-A0202-12-0324-345
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 217
Figure 110107429-A0202-12-0324-346
<210> 218
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 218
Figure 110107429-A0202-12-0324-347
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 219
Figure 110107429-A0202-12-0324-348
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 220
Figure 110107429-A0202-12-0324-349
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 221
Figure 110107429-A0202-12-0325-350
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 222
Figure 110107429-A0202-12-0325-351
<210> 223
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 223
Figure 110107429-A0202-12-0325-352
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 224
Figure 110107429-A0202-12-0325-353
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 225
Figure 110107429-A0202-12-0325-354
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 226
Figure 110107429-A0202-12-0325-355
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 227
Figure 110107429-A0202-12-0326-356
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 228
Figure 110107429-A0202-12-0326-357
<210> 229
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 229
Figure 110107429-A0202-12-0326-358
<210> 230
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 230
Figure 110107429-A0202-12-0326-361
<210> 231
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 231
Figure 110107429-A0202-12-0326-359
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 232
Figure 110107429-A0202-12-0326-360
Figure 110107429-A0202-12-0327-362
<210> 233
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 233
Figure 110107429-A0202-12-0327-363
<210> 234
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 234
Figure 110107429-A0202-12-0327-364
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 235
Figure 110107429-A0202-12-0327-365
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 236
Figure 110107429-A0202-12-0327-368
<210> 237
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 237
Figure 110107429-A0202-12-0327-367
<210> 238
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 238
Figure 110107429-A0202-12-0328-369
<210> 239
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 239
Figure 110107429-A0202-12-0328-370
<210> 240
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 240
Figure 110107429-A0202-12-0328-371
<210> 241
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 241
Figure 110107429-A0202-12-0328-372
<210> 242
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 242
Figure 110107429-A0202-12-0328-373
<210> 243
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 243
Figure 110107429-A0202-12-0328-374
<210> 244
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 244
Figure 110107429-A0202-12-0329-375
<210> 245
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 245
Figure 110107429-A0202-12-0329-376
<210> 246
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 246
Figure 110107429-A0202-12-0329-377
<210> 247
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 247
Figure 110107429-A0202-12-0329-380
<210> 248
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 248
Figure 110107429-A0202-12-0329-378
<210> 249
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 249
Figure 110107429-A0202-12-0329-379
<210> 250
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 250
Figure 110107429-A0202-12-0330-381
<210> 251
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 251
Figure 110107429-A0202-12-0330-382
<210> 252
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 252
Figure 110107429-A0202-12-0330-383
<210> 253
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 253
Figure 110107429-A0202-12-0330-384
<210> 254
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 254
Figure 110107429-A0202-12-0330-385
<210> 255
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 255
Figure 110107429-A0202-12-0331-386
<210> 256
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 256
Figure 110107429-A0202-12-0331-387
<210> 257
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 257
Figure 110107429-A0202-12-0331-388
<210> 258
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 258
Figure 110107429-A0202-12-0331-389
<210> 259
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 259
Figure 110107429-A0202-12-0331-390
<210> 260
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 260
Figure 110107429-A0202-12-0331-391
<210> 261
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 261
Figure 110107429-A0202-12-0332-392
<210> 262
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 262
Figure 110107429-A0202-12-0332-393
<210> 263
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 263
Figure 110107429-A0202-12-0332-396
<210> 264
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 264
Figure 110107429-A0202-12-0332-399
<210> 265
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 265
Figure 110107429-A0202-12-0332-397
<210> 266
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 266
Figure 110107429-A0202-12-0332-398
<210> 267
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 267
Figure 110107429-A0202-12-0333-400
<210> 268
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 268
Figure 110107429-A0202-12-0333-401
<210> 269
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 269
Figure 110107429-A0202-12-0333-402
<210> 270
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 270
Figure 110107429-A0202-12-0333-403
<210> 271
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 271
Figure 110107429-A0202-12-0333-404
<210> 272
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 272
Figure 110107429-A0202-12-0333-405
Figure 110107429-A0202-12-0334-406
<210> 273
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 273
Figure 110107429-A0202-12-0334-407
<210> 274
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 274
Figure 110107429-A0202-12-0334-408
<210> 275
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 275
Figure 110107429-A0202-12-0334-409
<210> 276
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 276
Figure 110107429-A0202-12-0334-410
<210> 277
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 277
Figure 110107429-A0202-12-0334-411
<210> 278
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 278
Figure 110107429-A0202-12-0335-412
<210> 279
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 279
Figure 110107429-A0202-12-0335-413
<210> 280
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 280
Figure 110107429-A0202-12-0335-414
<210> 281
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 281
Figure 110107429-A0202-12-0335-415
<210> 282
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 282
Figure 110107429-A0202-12-0335-416
<210> 283
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 283
Figure 110107429-A0202-12-0335-417
<210> 284
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 284
Figure 110107429-A0202-12-0336-418
<210> 285
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 285
Figure 110107429-A0202-12-0336-419
<210> 286
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 286
Figure 110107429-A0202-12-0336-420
<210> 287
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 287
Figure 110107429-A0202-12-0336-421
<210> 288
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 288
Figure 110107429-A0202-12-0336-422
<210> 289
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 289
Figure 110107429-A0202-12-0336-423
<210> 290
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 290
Figure 110107429-A0202-12-0337-424
<210> 291
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 291
Figure 110107429-A0202-12-0337-425
<210> 292
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 292
Figure 110107429-A0202-12-0337-426
<210> 293
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 293
Figure 110107429-A0202-12-0337-428
<210> 294
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 294
Figure 110107429-A0202-12-0337-427
<210> 295
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 295
Figure 110107429-A0202-12-0338-429
<210> 296
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 296
Figure 110107429-A0202-12-0338-430
<210> 297
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 297
Figure 110107429-A0202-12-0338-431
<210> 298
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 298
Figure 110107429-A0202-12-0338-432
<210> 299
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 299
Figure 110107429-A0202-12-0338-433
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 300
Figure 110107429-A0202-12-0338-434
<210> 301
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 301
Figure 110107429-A0202-12-0339-435
<210> 302
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 302
Figure 110107429-A0202-12-0339-436
<210> 303
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 303
Figure 110107429-A0202-12-0339-438
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 304
Figure 110107429-A0202-12-0339-439
<210> 305
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 305
Figure 110107429-A0202-12-0339-440
<210> 306
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 306
Figure 110107429-A0202-12-0339-441
<210> 307
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 307
Figure 110107429-A0202-12-0340-442
<210> 308
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 308
Figure 110107429-A0202-12-0340-443
<210> 309
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 309
Figure 110107429-A0202-12-0340-444
<210> 310
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 310
Figure 110107429-A0202-12-0340-447
<210> 311
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 311
Figure 110107429-A0202-12-0340-445
<210> 312
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 312
Figure 110107429-A0202-12-0340-446
Figure 110107429-A0202-12-0341-448
<210> 313
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 313
Figure 110107429-A0202-12-0341-449
<210> 314
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 314
Figure 110107429-A0202-12-0341-450
<210> 315
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 315
Figure 110107429-A0202-12-0341-451
<210> 316
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 316
Figure 110107429-A0202-12-0341-452
<210> 317
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 317
Figure 110107429-A0202-12-0341-453
<210> 318
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 318
Figure 110107429-A0202-12-0342-454
<210> 319
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 319
Figure 110107429-A0202-12-0342-455
<210> 320
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 320
Figure 110107429-A0202-12-0342-456
<210> 321
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 321
Figure 110107429-A0202-12-0342-459
<210> 322
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 322
Figure 110107429-A0202-12-0342-457
<210> 323
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 323
Figure 110107429-A0202-12-0342-458
<210> 324
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 324
Figure 110107429-A0202-12-0343-461
<210> 325
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 325
Figure 110107429-A0202-12-0343-462
<210> 326
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 326
Figure 110107429-A0202-12-0343-463
<210> 327
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 327
Figure 110107429-A0202-12-0343-464
<210> 328
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 328
Figure 110107429-A0202-12-0343-465
<210> 329
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 329
Figure 110107429-A0202-12-0343-466
<210> 330
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 330
Figure 110107429-A0202-12-0344-467
<210> 331
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 331
Figure 110107429-A0202-12-0344-468
<210> 332
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 332
Figure 110107429-A0202-12-0344-469
<210> 333
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 333
Figure 110107429-A0202-12-0344-470
<210> 334
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 334
Figure 110107429-A0202-12-0344-471
<210> 335
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 335
Figure 110107429-A0202-12-0345-472
<210> 336
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 336
Figure 110107429-A0202-12-0345-473
<210> 337
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 337
Figure 110107429-A0202-12-0345-474
<210> 338
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 338
Figure 110107429-A0202-12-0345-475
<210> 339
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 339
Figure 110107429-A0202-12-0345-476
<210> 340
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 340
Figure 110107429-A0202-12-0345-477
<210> 341
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 341
Figure 110107429-A0202-12-0346-478
<210> 342
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 342
Figure 110107429-A0202-12-0346-479
<210> 343
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 343
Figure 110107429-A0202-12-0346-480
<210> 344
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 344
Figure 110107429-A0202-12-0346-481
<210> 345
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 345
Figure 110107429-A0202-12-0346-482
<210> 346
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 346
Figure 110107429-A0202-12-0346-483
<210> 347
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 347
Figure 110107429-A0202-12-0347-484
<210> 348
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 348
Figure 110107429-A0202-12-0347-485
<210> 349
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 349
Figure 110107429-A0202-12-0347-486
<210> 350
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 350
Figure 110107429-A0202-12-0347-487
<210> 351
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 351
Figure 110107429-A0202-12-0347-488
<210> 352
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 352
Figure 110107429-A0202-12-0348-489
<210> 353
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 353
Figure 110107429-A0202-12-0348-490
<210> 354
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 354
Figure 110107429-A0202-12-0348-491
<210> 355
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 355
Figure 110107429-A0202-12-0348-492
<210> 356
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 356
Figure 110107429-A0202-12-0348-493
<210> 357
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 357
Figure 110107429-A0202-12-0348-494
<210> 358
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 358
Figure 110107429-A0202-12-0349-495
<210> 359
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 359
Figure 110107429-A0202-12-0349-496
<210> 360
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 360
Figure 110107429-A0202-12-0349-497
<210> 361
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 361
Figure 110107429-A0202-12-0349-498
<210> 362
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 362
Figure 110107429-A0202-12-0349-499
<210> 363
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 363
Figure 110107429-A0202-12-0349-500
<210> 364
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 364
Figure 110107429-A0202-12-0350-501
<210> 365
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 365
Figure 110107429-A0202-12-0350-502
<210> 366
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 366
Figure 110107429-A0202-12-0350-503
<210> 367
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 367
Figure 110107429-A0202-12-0350-504
<210> 368
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 368
Figure 110107429-A0202-12-0350-505
<210> 369
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 369
Figure 110107429-A0202-12-0350-506
<210> 370
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 370
Figure 110107429-A0202-12-0351-507
<210> 371
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 371
Figure 110107429-A0202-12-0351-508
<210> 372
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 372
Figure 110107429-A0202-12-0351-509
<210> 373
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 373
Figure 110107429-A0202-12-0351-510
<210> 374
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 374
Figure 110107429-A0202-12-0351-511
<210> 375
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 375
Figure 110107429-A0202-12-0352-512
<210> 376
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 376
Figure 110107429-A0202-12-0352-513
<210> 377
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 377
Figure 110107429-A0202-12-0352-514
<210> 378
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 378
Figure 110107429-A0202-12-0352-515
<210> 379
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
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Figure 110107429-A0202-12-0352-516
<210> 380
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 380
Figure 110107429-A0202-12-0352-517
<210> 381
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 381
Figure 110107429-A0202-12-0353-518
<210> 382
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 382
Figure 110107429-A0202-12-0353-519
<210> 383
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 383
Figure 110107429-A0202-12-0353-520
<210> 384
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 384
Figure 110107429-A0202-12-0353-521
<210> 385
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 385
Figure 110107429-A0202-12-0353-522
<210> 386
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 386
Figure 110107429-A0202-12-0353-523
<210> 387
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
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Figure 110107429-A0202-12-0354-524
<210> 388
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 388
Figure 110107429-A0202-12-0354-525
<210> 389
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 389
Figure 110107429-A0202-12-0354-526
<210> 390
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 390
Figure 110107429-A0202-12-0354-527
<210> 391
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 391
Figure 110107429-A0202-12-0354-528
<210> 392
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 392
Figure 110107429-A0202-12-0355-529
<210> 393
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 393
Figure 110107429-A0202-12-0355-530
<210> 394
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 394
Figure 110107429-A0202-12-0355-531
<210> 395
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 395
Figure 110107429-A0202-12-0355-532
<210> 396
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 396
Figure 110107429-A0202-12-0355-533
<210> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 397
Figure 110107429-A0202-12-0355-534
<210> 398
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 398
Figure 110107429-A0202-12-0356-535
<210> 399
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 399
Figure 110107429-A0202-12-0356-537
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 400
Figure 110107429-A0202-12-0356-538
<210> 401
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 401
Figure 110107429-A0202-12-0356-539
<210> 402
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 402
Figure 110107429-A0202-12-0356-540
<210> 403
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 403
Figure 110107429-A0202-12-0356-541
<210> 404
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 404
Figure 110107429-A0202-12-0357-542
<210> 405
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 405
Figure 110107429-A0202-12-0357-543
<210> 406
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 406
Figure 110107429-A0202-12-0357-544
<210> 407
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 407
Figure 110107429-A0202-12-0357-546
<210> 408
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 408
Figure 110107429-A0202-12-0357-545
<210> 409
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 409
Figure 110107429-A0202-12-0357-547
Figure 110107429-A0202-12-0358-548
<210> 410
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 410
Figure 110107429-A0202-12-0358-549
<210> 411
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 411
Figure 110107429-A0202-12-0358-550
<210> 412
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 412
Figure 110107429-A0202-12-0358-551
<210> 413
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 413
Figure 110107429-A0202-12-0358-552
<210> 414
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 414
Figure 110107429-A0202-12-0358-553
<210> 415
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 415
Figure 110107429-A0202-12-0359-554
<210> 416
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 416
Figure 110107429-A0202-12-0359-556
<210> 417
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 417
Figure 110107429-A0202-12-0359-557
<210> 418
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 418
Figure 110107429-A0202-12-0359-558
<210> 419
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 419
Figure 110107429-A0202-12-0359-560

Claims (24)

  1. 一種肽或其藥用鹽，該肽由SEQ ID NO：156的氨基酸序列所組成。
  2. 如請求項1所述之肽或其藥用鹽，其中該肽有能力與MHC-I類分子結合，以及其中該肽與該MHC結合時能夠被CD8 T細胞識別。
  3. 如請求項1所述之肽或其藥用鹽，其中該肽被修飾及/或包含非肽鍵。
  4. 如請求項1所述之肽或其藥用鹽，其中該肽為融合蛋白的一部分，包含HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的N-端氨基酸。
  5. 一種核酸，編碼如請求項1所述的肽。
  6. 一種表達載體，表達如請求項5所述的核酸。
  7. 一種重組宿主細胞，包括如請求項1至4中任一項所述的肽、如請求項5所述的核酸、如請求項6所述的表達載體，其中該重組宿主細胞為抗原提呈細胞。
  8. 一種製備如請求項1至4中任一項所述的肽的方法，該方法包括培養如請求項7所述的重組宿主細胞，該重組宿主細胞提呈如請求項1至4中任一項所述的肽，或表達如請求項5所述的核酸或如請求項6所述的表達載體，以及從該重組宿主細胞或該重組宿主細胞 的培養基中分離出該肽。
  9. 一種體外製備活化的T淋巴細胞的方法，該方法包括將T細胞與載有抗原的人MHC-I類分子進行體外連接足夠的一段時間，從而以一抗原特異性方式活化所述T細胞，該等人MHC-I類分子是表達在合適的抗原提呈細胞表面上或類比抗原提呈細胞的人工構築體表面上，其中所述抗原為如請求項1至3中任一項所述的肽。
  10. 一種活化的T淋巴細胞，以如請求項9所述的方法製成，該活化的T淋巴細胞選擇性地識別一細胞，該細胞提呈一多肽，該多肽包含如請求項1至3中任一項所述的氨基酸序列。
  11. 一種有效量的如請求項10所述的活化的T淋巴細胞用於製造一藥物的用途，該藥物用於殺滅一患者體內的靶向細胞，其中該等靶向細胞提呈一多肽，該多肽包含如請求項1至3中任一項所述的氨基酸序列。
  12. 一種抗體，當如請求項1至4中任一項所述的肽與MHC-I類分子結合時，該抗體特異性地識別該肽。
  13. 一種如請求項1至4中任一項所述的肽、如請求項5所述的核酸、如請求項6所述的表達載體、如請求項7所述的重組宿主細胞、如請求項10所述的活化的T淋巴細胞或如請求項12所述的抗體在製造抗癌藥劑中的用途。
  14. 如請求項13所述的用途，其中該癌症為選自下述所組成的組：腦膠質細胞瘤(GB)、乳腺癌(BRCA)、結直腸癌(CRC)、腎細胞癌(RCC)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、肝細胞癌(HCC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、卵巢癌(OC)、胰腺癌(PC)、攝護腺癌和良性攝護腺增生(PCA)、包括胃食管交界癌的食管癌(OSCAR)、小細胞肺癌(SCLC)、膽囊腺癌和膽管癌(GBC_CCC)、黑色素瘤(MEL)、胃癌(GC)、膀胱癌(UBC)、子宮癌(UTC)、腎上腺皮質癌(ACC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、宮頸鱗狀細胞癌和宮頸腺癌(CESC)、淋巴腫瘤彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBC)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)、肉瘤(SARC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、胃腺癌(STAD)、睾丸生殖細胞腫瘤(TGCT)、胸腺瘤(THYM)、子宮體子宮內膜癌(UCEC)及子宮癌肉瘤(UCS)。
  15. 一種套件，包括：一容器，包含溶液或凍乾形式的一藥物組合物，該藥物組合物含有如請求項1至4中任一項所述的肽、如請求項5所述的核酸、如請求項6所述的表達載體、如請求項7所述的重組宿主細胞、如請求項10所述的活化的T淋巴細胞或如請求項12所述的抗體。
  16. 如請求項15所述的套件，進一步包括一緩衝劑、一稀釋劑、一過濾液、一針或一注射器中的一或 多者。
  17. 一種T細胞受體，其與HLA配體反應，其中該配體具有SEQ ID NO：156的氨基酸序列。
  18. 如請求項17所述的T細胞受體，其中該T細胞受體為可溶性分子。
  19. 如請求項18所述的T細胞受體，其中該配體為一肽-MHC複合體的一部分。
  20. 一種核酸，編碼如請求項17至19中任一項所述的T細胞受體。
  21. 一種表達載體，能表達如請求項20所述的核酸。
  22. 一種宿主細胞，包括如請求項20所述的核酸，或包括編碼如請求項12所述的抗體的核酸，或包括如請求項21所述的表達載體。
  23. 一種製備如請求項17至19中任一項所述的T細胞受體的方法，所述方法包括培養如請求項22所述的宿主細胞，以及從該宿主細胞及/或其培養基中分離出該T細胞受體。
  24. 一種藥物組合物，包括至少一種活性成分，該成分選自以下項組成的組：a)一肽，該肽具有SEQ ID NO：156的氨基酸序列；b)一T細胞受體，與如a)所述的肽及/或肽-MHC-I 類複合體產生反應；c)一融合蛋白，包含如a)所述的肽以及HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的第1至80個N-端氨基酸；d)一核酸或一表達載體，該核酸編碼a)至c)中的任一項，該表達載體包含該核酸；e)一宿主細胞，包括d)的表達載體；f)一活化的T淋巴細胞，透過下列方法獲得：該方法包括將T細胞與如a)所述的肽進行體外連接足夠的一段時間，從而以一抗原特異性方式活化所述T細胞，該如a)所述的肽在合適的抗原提呈細胞表面上表達；g)一抗體或可溶性T細胞受體，與a)中的肽及/或肽-MHC-I類複合體及/或提呈如a)所述的肽的細胞反應，並有可能透過與免疫活化結構域或毒素融合而修飾；及h)一如a)至g)中任一項所述的共軛或標記之肽以及一藥用載體。
TW110107429A 2015-08-28 2016-08-26 用於多種癌症之免疫治療的新穎胜肽、胜肽的組合物及支架 TWI782434B (zh)

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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108250286B (zh) * 2016-12-28 2021-06-08 香雪生命科学技术（广东）有限公司 源自于pasd1的肿瘤抗原短肽
CN110907647B (zh) * 2019-10-29 2022-08-30 南通大学附属医院 Clec5a基因的新用途
CN114107345A (zh) * 2021-11-22 2022-03-01 北京大学人民医院 子宫内膜样腺癌相关融合基因检测及其临床应用
CN115785277B (zh) * 2022-09-09 2023-06-20 上海百英生物科技股份有限公司 一种抗IL4i1纳米抗体的制备及其应用
CN117194771B (zh) * 2023-08-01 2024-09-17 广东工业大学 一种图模型表征学习的动态知识图谱服务推荐方法
CN117195280A (zh) * 2023-08-10 2023-12-08 甘肃省水利厅信息中心 一种基于区块链的生态流量监测数据共享系统、服务器及存储介质
CN118095658A (zh) * 2024-04-24 2024-05-28 山东林安热能科技有限公司 一种环保工程用监控系统

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015018805A1 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumors, such as lung cancer, including nsclc

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7294459B1 (en) 1997-10-15 2007-11-13 President And Fellows Of Harvard College Cell regulatory genes, encoded products, and uses related thereto
CA2323632A1 (en) 1998-03-13 1999-09-16 Epimmune Inc. Hla-binding peptides and their uses
JP4315301B2 (ja) 1998-10-30 2009-08-19 独立行政法人科学技術振興機構 ヒトＨ３７タンパク質と、このタンパク質をコードする ｃＤＮＡ
US6680197B2 (en) 1998-12-28 2004-01-20 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
CA2311201A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
EP1425393A4 (en) 2001-08-21 2005-08-17 Millennium Pharm Inc SEARCH FOR CDC7 INHIBITORS
DE10316701A1 (de) 2003-04-09 2004-11-04 Hinzmann, Bernd, Dr. Humane Nukleinsäuresequenzen aus Bronchialkarzinomen
EP1622934A2 (en) 2003-05-05 2006-02-08 Pharmacia Italia S.p.A. Truncated forms of human dbf4, complexes with their interacting partners and methods for identification of inhibitors thereof
EP1892306A3 (en) 2003-10-06 2008-06-11 Bayer HealthCare AG Methods and kits for investigating cancer
JP4721903B2 (ja) 2004-01-29 2011-07-13 大日本住友製薬株式会社 新規腫瘍抗原蛋白質及びその利用
DK1806359T3 (da) 2005-09-05 2010-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumorassocierede peptider, der bindes promiskuøst til Humant Leukocyt-Antigen (HLA) klasse II molekyler
PL2338907T3 (pl) 2007-07-27 2016-03-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Nowe immunogenne epitopy do immunoterapii
US20110111711A1 (en) 2008-03-31 2011-05-12 Agency For Science, Technology And Research High Efficiency Linear Transmitter
TW201000115A (en) 2008-06-11 2010-01-01 Oncotherapy Science Inc IQGAP3 epitope peptides and vaccines containing the same
EP2337795A2 (en) 2008-10-01 2011-06-29 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring
EP2172211B1 (en) 2008-10-01 2014-12-03 Immatics Biotechnologies GmbH Composition of tumor-associated peptides and related anti-cancer vaccine for the treatment of glioblastoma (GBM) and other cancers
GB201004551D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201006360D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for differentially quantifying naturally processed HLA-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development
CN106526186A (zh) 2011-09-12 2017-03-22 克里蒂科斯有限责任公司 检测靶分子的非侵入性方法
WO2013070603A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for treatment of kidney diseases
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
US9500651B2 (en) * 2012-08-15 2016-11-22 Université de Montréal Method for identifying novel minor histocompatibility antigens
EP2962113B1 (en) 2013-02-28 2019-04-03 Biocare Medical, LLC Anti-p40 antibodies systems and methods
US9134326B2 (en) 2013-03-14 2015-09-15 Battelle Memorial Institute Biomarkers for liver fibrosis
WO2015092710A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Contralateral co-administration of vaccines
WO2017184590A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 The Broad Institute Inc. Improved hla epitope prediction

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015018805A1 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumors, such as lung cancer, including nsclc

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
網路文獻 Strausber RL et al. GINS complex subunit 2 (Psf2 homolog) [Homo sapiens] NCBI GenBank accession no.AAH62444 2006/07/15 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAH62444.1 *

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Publication number Publication date
CA3223546A1 (en) 2017-03-09
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