ES2710608T3 - Inmunoterapia novedosa contra diversos tumores, entre ellos tumores cerebrales y neuronales - Google Patents

Inmunoterapia novedosa contra diversos tumores, entre ellos tumores cerebrales y neuronales Download PDF

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Claudia Trautwein
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Abstract

Péptido consistente en la secuencia de aminoácidos acorde con la SEQ ID N.º 10.

Description

DESCRIPCION
Inmunoterapia novedosa contra diversos tumores, entre ellos tumores cerebrales y neuronales
La presente invencion se refiere a peptidos, acidos nucleicos y celulas destinados a la utilizacion en metodos inmunoterapeuticos. En particular, la presente invencion se refiere a la inmunoterapia contra el cancer. La presente invencion se refiere asimismo a epftopos peptidicos para linfocitos T citotoxicos (cTl ) asociados a tumores, solos o en combinacion con otros peptidos asociados a tumores que pueden servir como principios activos farmaceuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales. La presente invencion se refiere a 30 secuencias peptfdicas y sus variantes derivadas de moleculas HLA de clase I y clase II de celulas tumorales humanas, que pueden ser utilizadas en composiciones vacunales para desencadenar respuestas inmunitarias antitumorales.
Antecedentes de la invencion
Los gliomas son tumores cerebrales originados en las celulas gliales del sistema nervioso. Las celulas gliales, llamadas por lo comun neuroglia o simplemente glfa, son celulas no neuronales que proporcionan soporte y nutricion, mantienen la homeostasia, forman la mielina e intervienen en la transmision de senales en el sistema nervioso. Los dos tipos mas importantes de glioma son el astrocitoma y el oligodendroglioma, llamados asf por el tipo de celula glial que los origina, esto es, astrocitos y oligodendrocitos. En el grupo de los astrocitomas se encuentra el glioblastoma multiforme (denominado en lo sucesivo glioblastoma) que es el tumor cerebral maligno mas frecuente en adultos, pues supone alrededor del 40% de los tumores cerebrales malignos y alrededor del 50% de los gliomas. El glioblastoma invade con agresividad el sistema nervioso central y entre todos los gliomas es el que ostenta el nivel mas alto de malignidad (grado IV). Pese a los avances en el tratamiento logrados merced a mejoras en las tecnicas de neuroimagen, la microcirugfa y las opciones terapeuticas como la temozolomida o la radiacion, el glioblastoma sigue siendo incurable. La tasa de letalidad de este tumor cerebral es muy alta: la esperanza de vida media vana entre 9 y 12 meses desde el diagnostico. La supervivencia a 5 anos durante el penodo de observacion comprendido entre 1986 y 1990 fue del 8,0%. Hasta la fecha, la supervivencia a cinco anos despues del tratamiento agresivo que incluye la reseccion macroscopica del tumor sigue siendo inferior al 10%. A tenor de lo anterior, queda patente la necesidad de nuevos metodos terapeuticos eficaces.
El grado de indiferenciacion de las celulas tumorales del glioblastoma es el mas elevado de todos los tumores cerebrales, lo que explica su alto potencial de migracion y proliferacion y su elevada invasividad y, por ende, su pronostico funesto. Los glioblastomas provocan la muerte por el crecimiento rapido, agresivo e infiltrante que demuestran en el cerebro. El crecimiento infiltrante es el responsable del caracter inoperable de estos tumores. Los glioblastomas tambien son relativamente resistentes a la radioterapia y la quimioterapia, por lo que la recurrencia postratamiento es elevada. Ademas, la respuesta inmunitaria contra las celulas neoplasicas resulta claramente ineficaz a la hora de lograr su erradicacion total despues de la reseccion y la radioterapia.
El glioblastoma se clasifica en primario (de novo) y secundario dependiendo de las diferencias en el mecanismo genico de la transformacion maligna que experimentan los astrocitos indiferenciados o las celulas precursoras gliales. El glioblastoma secundario afecta a personas jovenes menores de 45 anos. A lo largo de 4 o 5 anos, en promedio, el glioblastoma secundario evoluciona de un astrocitoma de bajo grado a un astrocitoma indiferenciado. Por el contrario, el glioblastoma primario afecta sobre todo a personas mas mayores, con una media de edad de 55 anos. Por norma general, el glioblastoma primario aparece como un glioblastoma fulminante caracterizado por la progresion del tumor en 3 meses desde el estado sin anomalfas clmicas ni patologicas (Pathology and Genetics of the Nervous Systems, 29-39 (IARC Press, Lyon, Francia, 2000)).
El glioblastoma migra a lo largo de los nervios mielinizados y se disemina ampliamente por el sistema nervioso central. En la mayona de casos, el tratamiento quirurgico solo consigue un limitado efecto terapeutico sostenible. Las celulas del glioma maligno eluden la deteccion por el sistema inmunitario del anfitrion mediante la produccion de agentes inmunodepresores que alteran la proliferacion de los linfocitos T y la produccion por parte de estos de la citocina inmunoestimulante IL-2.
Las neoplasias intracraneales pueden surgir en cualquiera de las estructuras o tipos celulares del SNC: encefalo, meninges, glandula pituitaria, craneo, e incluso tejido embrionario residual. La incidencia anual total de tumores cerebrales primarios en Estados Unidos es de 14 casos por 100. 000. Los tumores cerebrales primarios mas frecuentes son los meningiomas, que representan el 27% de los tumores cerebrales primarios, y los glioblastomas, que suponen otro 23% (los glioblastomas suponen el 40% de los tumores cerebrales malignos en los adultos). Muchos de esos tumores son agresivos y presentan un alto grado. En la poblacion pediatrica los tumores cerebrales primarios son los tumores solidos mas frecuentes y la segunda causa de muerte por cancer despues de la leucemia. A dfa de hoy prosigue la busqueda de un tratamiento eficaz contra el glioblastoma. Para combatir tales celulas neoplasicas se esta estudiando la inmunoterapia, o el tratamiento basado en el reclutamiento del sistema inmunitario. Los primeros resultados alentadores en el tratamiento con inmunoterapia de los pacientes aquejados por el glioblastoma los obtuvo Northwest Biotherapeutics con «DCVax Brain», una vacuna celular que emplea celulas dendnticas procedentes del paciente cargadas con lisados de celulas tumorales autologas, y con Celldex, a base de un peptido del EGFRvIII destinado a estimular respuestas de CTL espedficos de antigeno; con ambos se aprecio una mediana del tiempo de supervivencia mas prolongada que las medianas de supervivencia obtenidas con el tratamiento convencional (Heimberger et al., 2006).
Carcinoma colorrectal
Segun la Sociedad Americana contra el Cancer (American Cancer Society), el cancer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cancer mas habitual en Estados Unidos puesto que afecta a mas de 175. 000 nuevos pacientes cada ano. En Estados Unidos, Japon, Francia, Alemania, Italia, Espana y Reino Unido el numero de pacientes afectados supera los 480. 000. Ello lo convierte en una de las principales causas de muerte por cancer en los pafses industrializados. La supervivencia relativa a 1 y 5 anos de los enfermos de cancer colorrectal asciende al 84% y el 64%. Pasados los cinco anos, la supervivencia sigue descendiendo hasta el 57% al cabo de diez anos del diagnostico. Cuando el cancer colorrectal se detecta en un estadio inicial y localizado la supervivencia a 5 anos es del 90%, pero solo el 39% de los casos se detectan en ese estadio, principalmente por el escaso alcance de los programas de deteccion sistematica. Cuando el cancer alcanza dimensiones regionales y afecta ya a organos adyacentes o ganglios linfaticos la supervivencia a 5 anos disminuye hasta el 68%. Y en el caso de las personas con metastasis a distancia la supervivencia a 5 anos vista se reduce al 10%.
Las investigaciones sugieren que el cancer colorrectal tiene su origen en la interaccion entre factores hereditarios y ambientales. En la mayor parte de los casos los polipos adenomatosos parecen ser los precursores de los tumores colorrectales, aunque el proceso de transicion puede durar muchos anos. El principal factor de riesgo del cancer colorrectal es la edad, ya que el 90% de los casos se diagnostican a partir de los 50 anos. Otros factores de riesgo referidos por la American Cancer Society son el consumo de alcohol, la alimentacion rica en grasas o carnes rojas y una ingesta insuficiente de frutas y verduras. La incidencia sigue aumentando especialmente en zonas como Japon, donde como posibles causas se barajan la adopcion de la alimentacion de estilo occidental, con la ingesta excesiva de grasas y carne y la reduccion del consumo de fibra. Con todo, la incidencia no aumenta al mismo ritmo que en el pasado, lo cual se atribuye al aumento de las exploraciones preventivas y a la extirpacion de los polipos, que de lo contrario se habnan convertido en tumores malignos.
A semejanza de la mayona de los tumores solidos el tratamiento de primera lmea consiste en cirugfa, aunque sus ventajas siguen estando limitadas a los pacientes en fase inicial y una parte importante de los casos se diagnostica cuando la enfermedad ya se encuentra en fases avanzadas. El tratamiento de referencia contra el cancer colorrectal avanzado consiste en regfmenes de quimioterapia basados en el fluorouracilo. Los protocolos denominados FOLFOX (leucovorina/5-FU mas oxaliplatino en infusion) y FOLFIRI (irinotecan y leucovorina en bolo y 5-FU en infusion continua) constituyen la mayor parte de tales regfmenes.
La introduccion de los citotoxicos de tercera generacion como el irinotecan y el oxaliplatino ha renovado las esperanzas de lograr mayor eficacia, pero el pronostico sigue siendo relativamente malo y el mdice de supervivencia suele rondar generalmente los 20 meses cuando la enfermedad es metastasica. Por tanto, sigue existiendo una importante necesidad de mejorar los resultados contra la enfermedad.
Recientemente ha aparecido una nueva generacion de medicamentos, agentes dirigidos contra moleculas, como, por ejemplo, Avastin® (bevacizumab) y Erbitux® (cetuximab), y cerca de 40 compuestos contra diferentes estadios del cancer colorrectal se hallan en las ultimas etapas de desarrollo clmico. Las combinaciones de varios de estos compuestos aumentan las posibles opciones de tratamiento que cabe esperar en el futuro. La gran mayona de las sustancias se encuentra en la fase II de desarrollo clmico, siendo el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) la diana de la mayor parte de ellos, puesto que alrededor del 80% de los pacientes afectados por el cancer colorrectal presentan regulada al alza la expresion de dicho receptor.
En la actualidad se estan efectuando ensayos clmicos con pacientes en estadio II que combinan la quimioterapia con los anticuerpos monoclonales (AcM) recientemente autorizados (cetuximab irinotecan o FOLFOX4; bevacizumab en monoterapia o con FOLFOX4). Se preven penodos de observacion de tres o cuatro anos para disponer de resultados estadfsticamente significativos de dichos ensayos.
Los anticuerpos monoclonales (AcM) que actualmente se utilizan en oncologfa ofrecen en general buenas garantfas de no interferir con la inmunoterapia activa. De hecho, existen datos preclmicos (GABRILOVICH 1999) y clmicos que apuntan a que la eliminacion del VEGF (mediante el bevacizumab) contribuye de modo positivo a la activacion de los linfocitos T por medio de las celulas dendnticas (Osada T, Chong G, Tansik R, Hong T, Spector N, Kumar R, Hurwitz HI, Dev I, Nixon AB, Lyerly HK, Clay T, Morse MA. The effect of anti-VEGF therapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patients. Cancer Immunol. Immunother. 2008 Jan 10).
Carcinoma de prostata y otros tumores
Con una cifra estimada de 27.050 fallecimientos en 2007, el cancer de prostata es la principal causa de muerte por cancer en varones. Aunque los indices de deceso se han reducido entre la poblacion blanca y afroamericana desde principios de los 90, el nivel registrado entre los varones afroamericanos duplica con creces el de los hombres de raza blanca. El cancer de prostata es el mas diagnosticado en los varones. Por motivos que siguen sin estar claros, la incidencia es significativamente mayor entre los varones afroamericanos que entre los de raza blanca. La incidencia del cancer de prostata ha cambiado notablemente durante los ultimos 20 anos: experimento un rapido incremento entre 1988 y 1992 para reducirse drasticamente entre 1992 y 1995 y volvio a repuntar ligeramente desde 1995. Estas tendencias reflejan en gran parte el aumento de los programas de deteccion del cancer de prostata mediante el analisis sangumeo del antfgeno espedfico de la prostata (PSA). El moderado incremento de la incidencia acaecido durante la ultima decada probablemente pueda atribuirse a la generalizacion del reconocimiento preventivo del PSA entre los varones menores de 65 anos. La incidencia del cancer de prostata se ha estabilizado entre los mayores de 65 anos. Los indices marcaron su maximo entre los hombres de raza blanca en 1992 (237,6 por cada 100.000 varones) y en 1993 entre los varones afroamericanos (342,8 por cada 100.000 varones).
El tratamiento del cancer de prostata puede implicar la espera en observacion, cirugfa, radioterapia, ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HIFU), quimioterapia, hormonoterapia o cierta combinacion de los anteriores. La mejor opcion depende de la fase de la enfermedad, de la escala Gleason y del nivel de PSA. Otros factores importantes incluyen la edad del varon, el estado general de salud y su actitud frente a los posibles tratamientos y los posibles efectos secundarios. Puesto que todos los tratamientos pueden provocar importantes efectos secundarios, como, por ejemplo, disfuncion erectil e incontinencia urinaria, los debates sobre dichos tratamientos suelen centrarse en equilibrar los objetivos de la terapia y las posibles alteraciones en el estilo de vida.
Cuando el cancer se ha extendido fuera de la glandula prostatica, las opciones de tratamiento cambian significativamente, por lo que la mayor parte de los medicos que tratan el cancer de prostata utiliza una serie de nomogramas para pronosticar la probabilidad de la propagacion. Los tratamientos consistentes en la espera en observacion, HIFU, radioterapia, criocirugfa y cirugfa suelen ofrecerse a los varones cuyo cancer permanece confinado en la prostata. La terapia hormonal y la quimioterapia suelen reservarse para los casos en que la enfermedad se ha extendido fuera de la prostata, aunque hay excepciones: la radioterapia puede utilizarse para algunos tumores avanzados y la terapia hormonal se emplea para algunos tumores en fase inicial. La crioterapia, la terapia hormonal y la quimioterapia tambien pueden ofrecerse si el tratamiento inicial falla y el cancer avanza.
En un numero importante de pacientes con carcinoma de prostata que son sometidos a prostatectoirna radical por la sospecha clrnica de que el crecimiento sigue limitado al organo, el analisis histologico confirmatorio de la preparacion quirurgica revela que el tumor esta extendido a nivel local y se propaga fuera de los ftmites del organo. Estos pacientes presentan un elevado riesgo de recidiva local precoz, normalmente detectable por un incremento de los niveles de PSA que se traduce en una recafda bioqmmica. Las opciones terapeuticas en esta situacion incluyen la radioterapia externa y la ablacion hormonal. No obstante, el valor de estos enfoques terapeuticos, especialmente en lo que concierne a prolongar la supervivencia del paciente a largo plazo, no deben considerarse como probados. Ademas, deben tenerse en cuenta posibles complicaciones asociadas con el tratamiento, como, por ejemplo, el desarrollo de estenosis uretral (radioterapia), la perdida de libido y la impotencia, el riesgo de reduccion de las sales calcicas del esqueleto que puede acarrear o agravar la osteoporosis y el notable incremento del riesgo de fracturas oseas patologicas (ablacion hormonal).
Mas del 90% de los casos de cancer de prostata se descubren en los estadios local y regional. El mdice de supervivencia relativa a 5 anos de los pacientes diagnosticados en dichos estadios se aproxima al 100%. Durante los ultimos 25 anos, el mdice de supervivencia a 5 anos de todos los estadios combinados ha pasado del 69% a casi el 90%. Segun los datos mas recientes, la supervivencia relativa a 10 anos es del 93%, mientras que a los 15 anos es del 77%. Las espectaculares mejoras de la supervivencia, especialmente a 5 anos, son atribuibles en parte a la mayor precocidad de los diagnosticos y a las mejoras del tratamiento. Con todo, la supervivencia desciende notablemente cuando el cancer se ha extendido a otros tejidos y organos.
Cancer de pulmon
Se calcula que en 2007 se diagnosticaran 210.000 nuevos casos en Estados Unidos, cifra que supone en torno al 15% de los diagnosticos de cancer. La incidencia esta cayendo notablemente entre los hombres, desde un maximo de 102 casos por cada 100.000 varones en 1984 hasta 78,5 en 2003. En las mujeres esta estabilizandose tras un largo penodo de incremento. Clmicamente el cancer de pulmon se divide, a efectos de tratamiento, en dos grupos: el carcinoma microcftico de pulmon (13%) y el no microcftico (87%).
El cancer de pulmon auna la mayor parte de fallecimientos relacionados con el cancer, tanto en hombres como en mujeres. Las previsiones para 2007 cifraban el numero de fallecimientos en 160. 390, lo cual supone en torno al 29% de todas las muertes causadas por el cancer.
Desde 1987 mueren cada ano mas mujeres por el cancer de pulmon que por el cancer de mama. La tasa de mortalidad en la poblacion masculina ha seguido cayendo notablemente entre 1991 y 2003, a un ritmo aproximado del 1,9% por ano. La mortalidad por cancer de pulmon entre las mujeres esta estabilizandose, tras haber experimentado un aumento incesante durante varias decadas. Estas tendencias en la mortalidad por cancer de pulmon reflejan el descenso del tabaquismo durante los ultimos 30 anos.
Las opciones de tratamiento vienen determinadas por el tipo (microcftico o no) y la fase del cancer, e incluyen cirugfa, radioterapia, quimioterapia y terapias biologicas dirigidas, como bevacizumab (Avastin®) y erlotinib (Tarceva®). La cirugfa suele ser el tratamiento de eleccion para los canceres localizados. Algunos estudios recientes indican que la tasa de supervivencia del cancer de pulmon no microcftico en fase inicial mejora si se aplica quimioterapia tras la cirugfa. Como la enfermedad acostumbra a estar extendida cuando se descubre, suele recurrirse a la radioterapia y la quimioterapia, a veces en combinacion con la cirugfa. La quimioterapia sola o combinada con radiacion es el tratamiento elegido habitualmente para el carcinoma microcftico de pulmon. Con este regimen un alto porcentaje de pacientes experimentan remision, que en algunos casos es duradera.
El mdice de supervivencia relativa para el cancer de pulmon despues de 1 ano se ha incrementado ligeramente desde el 37% en 1975-1979 hasta el 42% en 2002, en gran medida gracias a las mejoras en las tecnicas quirurgicas y las terapias combinadas. No obstante, el mdice combinado de supervivencia a 5 anos para todos los estadios es tan solo del 16%. El mdice de supervivencia es del 49% en los casos que son detectados cuando la enfermedad aun esta localizada. Pero solo el 16% de los canceres de pulmon se diagnostica en este estadio inicial.
Asf pues, sigue existiendo la necesidad de nuevas opciones terapeuticas eficaces y seguras para el glioblastoma, el tumor de prostata, cancer de mama, cancer de esofago, cancer colorrectal, carcinoma de celulas renales claras, cancer de pulmon, del SNC, cancer de ovario, melanoma, cancer de pancreas, carcinoma epidermoide, leucemia y meduloblastoma, asf como para otros tumores que muestran una sobreexpresion de survivina y/o de las otras protemas de la presente invencion, de forma que se mejore el bienestar de los pacientes sin utilizar quimioterapia u otros farmacos que puedan provocar efectos secundarios graves.
WO 02/074237 da a conocer en la SEQ ID N.° 1849 un antfgeno asociado a tumor que comprende la secuencia del peptido con SEQ ID N.° 10 de la presente solicitud y fragmentos que comprenden al menos 5, 10, 15, 20, 25, 50 o 100 aminoacidos contiguos del mismo. Ademas, WO 02/074237 da a conocer composiciones farmaceuticas o vacunales que comprenden esta protema y metodos para estimular la respuesta inmunitaria contra esta protema como tratamiento para el cancer.
Resumen de la invencion
En un primer aspecto de la misma, la presente invencion se refiere a un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos acorde con la SEQ ID N.° 10.
En un segundo aspecto de la misma, la presente invencion se refiere a un acido nucleico, que codifica un peptido conforme a la presente invencion o un vector de expresion capaz de expresar dicho acido nucleico.
En un tercer aspecto de la misma, la presente invencion se refiere a una celula hospedadora que comprende el acido nucleico o el vector de expresion acorde con la presente invencion, en que dicha celula hospedadora es preferiblemente una celula presentadora de antfgeno, en particular una celula dendrftica o celula presentadora de antfgeno.
En un cuarto aspecto de la misma, la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para producir linfocitos T citotoxicos (CTL) activados, el cual comprende la puesta en contacto en condiciones in vitro de CTL con moleculas MHC de clase I o II humanas cargadas con antfgeno expresadas en la superficie de una celula presentadora de antfgeno o un constructo artificial que imite a una celula presentadora de antfgeno durante un penodo de tiempo suficiente para activar dichos CTL de una manera espedfica de antfgeno, siendo dicho antfgeno un peptido conforme a la presente invencion.
En un quinto aspecto de la misma, la presente invencion se refiere al uso de un peptido acorde con la presente invencion, el acido nucleico o el vector de expresion acorde con la presente invencion, la celula acorde con la presente invencion, o un linfocito T citotoxico activado producido conforme a la presente invencion para el tratamiento del cancer o para la fabricacion de un medicamento contra el cancer, en que dicho medicamento preferiblemente es una vacuna. Preferiblemente, dicho cancer es seleccionado del grupo consistente en astrocitoma, astrocitoma pilodtico, tumor neuroepitelial disembrioplastico, oligodendrogliomas, ependimoma, glioblastoma multiforme, gliomas mixtos, oligoastrocitomas, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma, teratoma, gangliogliomas, gangliocitoma, gangliocitoma central, tumores neuroectodermicos primitivos (PNET, p. ej., meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma, ependimoblastoma), tumores del parenquima pineal (p. ej., pineocitoma, pineoblastoma), tumores de celulas ependimarias, tumores del plexo coroideo, tumores neuroepiteliales de origen incierto (p. ej., gliomatosis cerebral, astroblastoma), glioblastoma, tumor de prostata, cancer de mama, cancer de esofago, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma de celulas renales, carcinoma de celulas renales claras, cancer de pulmon, del SNC, ovario, melanoma, cancer de pancreas, carcinoma epidermoide, leucemia y meduloblastoma, asf como otros tumores o canceres que muestran una sobreexpresion de survivina y/o de las otras protemas de la presente invencion.
Un sexto aspecto de la presente invencion se refiere a un equipo, que comprende: (a) un envase que contiene una composicion farmaceutica que contiene un peptido conforme a la presente invencion, el acido nucleico conforme o el vector de expresion conformes a la presente invencion, una celula conforme a la presente invencion, o un linfocito T citotoxico activado conforme a la presente invencion, en forma de solucion o liofilizado; y (b), un segundo envase que contiene un diluyente o solucion de reconstitucion para la formulacion liofilizada . En una forma de realizacion preferida el peptido se selecciona del grupo de la SEQ ID N.° 10.
Se da a conocer un metodo para producir un anticuerpo recombinante que se une espedficamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II que esta formando un complejo con un antigeno restringido por HLA, comprendiendo dicho metodo: La inmunizacion de un mairnfero no humano geneticamente modificado que comprenda celulas que expresen dicho complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II con una forma soluble de una molecula MHC de clase I o II unida a dicho antfgeno restringido por HLA; el aislamiento de moleculas de ARNm a partir de celulas productoras de anticuerpos de dicho mamnfero no humano; la produccion de una fagoteca que contenga moleculas proteicas codificadas por dichas moleculas de ARNm; y el aislamiento de al menos un fago de dicha fagoteca, en que al menos ese fago contenga dicho anticuerpo capaz de unirse espedficamente al citado complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II unido con dicho antfgeno restringido por HLA.
La presente invencion se refiere a un anticuerpo que se une espedficamente a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I que a su vez forma un complejo con un antfgeno restringido por HLA acorde con la invencion, en que el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo quimerico.
Resumen de la invencion
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra los espectros de masas obtenidos en tandem con la cromatograffa de lfquidos-ESI que identifican a los peptidos asociados a tumor (TUMAP) IGF2BP3-001 de la muestra de glioblastoma GB6010 que fueron presentados por una molecula MHC de clase I de manera restringida.
La Figura 2 muestra el perfil de expresion de los ARNm de los genes de interes dados a conocer que aparecen fuertemente sobreexpresados en muestras de glioblastoma. La expresion de estos genes es nula o mfima en los tejidos normales, pero es muy elevada en muestras de glioblastoma. Se exponen las expresiones relativas del ARNm en varios tejidos normales y en muestras individuales de glioblastoma multiforme (GBM) medidas con un analisis con micromatrices de ADN («chips genicos»). Los valores son relativos con respecto a los niveles de expresion en el rinon normal (valores siempre ajustados arbitrariamente a 1,0). Los valores correspondientes a los tejidos normales se obtuvieron con conjuntos de ARNm comerciales. Las letras entre corchetes son los «indicadores de deteccion» dados por el software de analisis. El «indicador de deteccion» senala si un transcrito se ha detectado espedficamente en la muestra o si no se ha podido observar ninguna deteccion significativa. Puede tener los valores «P» (presente), «A» (ausente) o «M» (deteccion marginal).
La Figura 3 expone el analisis de los tetrameros resultantes de la proliferacion estimulada con microesferas de linfocitos CD8+ espedficos de CSP-001 y de NLGN4X-001 obtenidos de la sangre periferica de un donante sano.
1 x 106 celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) enriquecidas con c D8+ por pocillo se estimularon semanalmente con microesferas acopladas con anti-CD28 mas antfgeno tumoral A*0201/CSP-001 en alta densidad (panel izquierdo) o anti-CD28 mas antfgeno tumoral A*0201/NLGN4X-001 en alta densidad (panel derecho). Despues de tres estimulaciones in vitro, todas las celulas se tineron con anticuerpo CD8 FITC, y con tetrameros de A*0201/CSP-001 y A*0201/NLGN4X-001 marcados por fluorescencia. Las celulas se seleccionan entre los linfocitos CD8+; las cifras representan el porcentaje de celulas hallado en el cuadrante indicado entre los linfocitos CD8+.
La Figura 4 muestra la afinidad de los peptidos de HLA de clase I dados a conocer hacia la molecula del MHC codificada por el alelo HLA-A*0201. Las constantes de disociacion (Kd) de los TUMAP de HLA de clase I dados a conocer y del peptido de control HBV-001 (con potente afinidad hacia el alelo A*02) se midieron con un ensayo de replegamiento del MHC basado en un ELISA.
Descripcion detallada de la invencion
En la presente memoria todos los terminos corresponden a la definicion indicada a continuacion, salvo en los casos en que se indique otra cosa.
El termino «peptido» designa aqrn una serie de residuos de aminoacidos conectados entre sf tfpicamente mediante enlaces peptfdicos entre los grupos aminoalfa y carbonilo de los aminoacidos adyacentes. Los peptidos tienen normalmente 9 aminoacidos de longitud, pero pueden tener solo 8 aminoacidos de longitud o hasta 16, o bien 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoacidos de largo.
El termino «oligopeptido» designa aqrn una serie de residuos de aminoacidos conectados entre sf tfpicamente mediante enlaces peptfdicos entre los grupos aminoalfa y carbonilo de los aminoacidos adyacentes. La longitud del oligopeptido no es crucial en la invencion, siempre que se mantenga el epttopo o epftopos adecuados. Los oligopeptidos suelen tener una longitud inferior a unos 30 aminoacidos y mayor de 14, aproximadamente.
El termino «polipeptido» designa una serie de residuos de aminoacidos conectados entre sf tfpicamente por enlaces peptfdicos entre los grupos aminoalfa y carbonilo de los aminoacidos adyacentes. La longitud del polipeptido no es crucial para la invencion, siempre que se mantengan los epftopos correctos. En contraste con los terminos «peptido» y «oligopeptido», el termino «polipeptido» se refiere a las moleculas de mas de unos 30 residuos de aminoacidos de longitud.
Un peptido, oligopeptido, protema o polinucleotido que codifica dicha molecula es «inmunogenico» (y, por lo tanto, un «inmunogeno» en la presente invencion), si es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. En el caso de la presente invencion, la inmunogenicidad se define mas espedficamente como la capacidad para desatar una respuesta por parte de los linfocitos T. Por lo tanto, un «inmunogeno» sena una molecula que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria y, en el caso de la presente invencion, una molecula capaz de inducir una respuesta de los linfocitos T.
Un «epftopo» de un linfocito T requiere un peptido corto que este unido a un receptor MHC de clase I o clase II, formando un complejo ternario (cadena alfa de MHC de clase I, beta-2-microglobulina y peptido) que puede ser reconocido por un linfocito T que lleve un receptor de linfocito T que coincida y que se una al complejo MHC/peptido con la afinidad adecuada. Los peptidos que se unen a moleculas MHC de clase I suelen tener una longitud de entre 8 y 14 aminoacidos, y mas habitualmente de 9 aminoacidos. Los epftopos de linfocitos T que se unen a moleculas MHC de clase II suelen tener una longitud de entre 12 y 30 aminoacidos. En el caso de los peptidos que se unen a moleculas MHC de clase II, el mismo peptido y el epftopo del linfocito T correspondiente pueden compartir un segmento central comun pero en cambio diferir en la longitud total como consecuencia de secuencias de flanqueo de diferentes longitudes en direccion ascendente del extremo amino de la secuencia central y descendente con respecto a su terminal carboxflico, respectivamente. Los receptores MHC de clase II presentan una conformacion mas abierta; de la misma manera, los peptidos unidos a receptores MHC de clase II no se enclavan completamente en la estructura de la hendidura de union al peptido de la molecula MHC de clase II, como ocurre con la hendidura de union del peptido de la molecula MHC de clase I. Es de notar que este no es el caso para el peptido con arreglo a la SEQ ID N.° 1, puesto que pequenas variaciones en la longitud del peptido ocasionan un gran descenso de la actividad (vease mas abajo).
En el ser humano hay tres locus geneticos diferentes que codifican las moleculas MHC de clase I (las moleculas MHC del ser humano tambien se denominan antfgenos leucocitarios humanos [HLA]): HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 y HLA-A*11 son ejemplos de distintos alelos MHC de clase I que se pueden expresar a partir de estos locus.
Tres locus diferentes del genoma humano albergan los genes MHC de clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Los receptores MHC de clase II son heterodfmeros que constan de una cadena alfa y una beta, las cuales se enclavan en la membrana celular a traves de una region transmembrana. HLA-DRB1*04 y HLA-DRB1*07 son dos ejemplos de diferentes alelos beta MHC de clase II que se sabe que estan codificados en estos locus. Los alelos de clase II son muy polimorfos: por ejemplo, se han descrito varios cientos de alelos HLA-DRB1 distintos. Por tanto, a efectos terapeuticos y de diagnostico sena muy deseable contar con un peptido que se uniese, con la afinidad adecuada, a varios receptores HLA de clase II distintos. Un peptido que se une a varias moleculas HLA de clase II distintas recibe el nombre de ligando promiscuo.
En la presente memoria, la referencia a una secuencia de ADN incluye tanto ADN monocatenario como bicatenario. Por lo tanto, la secuencia espedfica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN monocatenario de dicha secuencia, a la doble cadena formada por dicha secuencia con su complementaria (ADN bicatenario) y a la cadena complementaria de dicha secuencia. El termino «region codificante» hace referencia a la porcion de un gen que, o bien de forma natural o normal, codifica el producto de expresion de dicho gen en su ambiente genomico natural, por ejemplo, la region que codifica in vivo el producto de expresion natural del gen.
La region codificante puede formar parte de un gen normal, mutado o alterado, o incluso puede provenir de una secuencia de ADN, o gen, sintetizada mtegramente en el laboratorio con metodos bien conocidos para los expertos en la smtesis de ADN.
El termino «secuencia nucleotfdica» hace referencia a un heteropolfmero de desoxirribonucleotidos.
La secuencia nucleotfdica que codifica un peptido, oligopeptido o polipeptido en particular puede ser natural o estar construida de forma sintetica. Generalmente los segmentos de ADN que codifican los peptidos, polipeptidos y protemas de esta invencion se ensamblan con fragmentos de ADNc y oligonucleotidos cortos de enlace, o con una serie de oligonucleotidos, quedan como resultado un gen sintetico capaz de expresarse en una unidad transcripcional recombinante que comprende elementos reguladores procedentes de un operon microbiano o vmco. El termino «producto de expresion» define el polipeptido o la protema que es el producto natural de la traduccion del gen y cualquier secuencia de acidos nucleicos que codifiquen los equivalentes resultantes de la degeneracion del codigo genetico y, por tanto, que codifican el mismo aminoacido o aminoacidos.
El termino «fragmento», cuando se refiere a una secuencia de codificacion, define una porcion de ADN que no comprende la region codificante completa, cuyo producto de expresion retiene esencialmente la misma actividad o funcion biologica que el producto de expresion de la region codificante completa.
El termino «segmento de ADN» hace referencia a un polfmero de ADN, en forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, exento de materiales endogenos contaminantes, y en una cantidad o concentracion que permite la identificacion, la manipulacion y la recuperacion del segmento y de sus secuencias nucleotidicas constituyentes mediante metodos bioqmmicos estandar como, por ejemplo, mediante un vector de clonacion. Dichos segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes corriente abajo (downstream) desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la manipulacion o la expresion de las regiones codificantes.
El termino «cebador» define una secuencia corta de acido nucleico que puede aparearse con una cadena de ADN y que proporciona un extremo 3'OH libre en el que una polimerasa de ADN puede comenzar la smtesis de una cadena de desoxirribonucleotidos.
El termino «promotor» define una region de ADN implicada en la union de la polimerasa de ARN para iniciar la transcripcion.
El termino «marco de lectura abierto (ORF)» designa una serie de tripletes que codifican aminoacidos sin ningun codon de terminacion y que forman una secuencia (potencialmente) traducible en protema.
El termino «aislado» define el material que se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleotido o un polipeptido natural presente en un animal vivo no esta aislado, pero ese mismo polinucleotido o polipeptido lo estara si es separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Tales polinucleotidos podran formar parte de un vector y/o tales polinucleotidos o polipeptidos podran formar parte de una composicion, y seguir estando aislados en dicho vector o composicion puesto que estos no forman parte de su entorno natural.
Los polinucleotidos y los polipeptidos recombinantes o inmunogenos descritos de acuerdo con la presente invencion tambien pueden presentarse en forma «purificada». El termino «purificado» no implica pureza absoluta; mas bien, se utiliza como definicion relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan solo parcialmente purificadas, tal y como los expertos en la materia entienden dichos terminos. Por ejemplo, los clones individuales aislados de una genoteca de ADNc se han purificado de manera convencional hasta obtener una homogeneidad electroforetica. Se contempla expresamente la purificacion del material de inicio o del material natural hasta, al menos, un orden de magnitud; preferiblemente, dos o tres ordenes de magnitud; y, con mayor preferencia, cuatro o cinco ordenes de magnitud. Ademas, se contempla expresamente el polipeptido reivindicado que tiene una pureza de, preferiblemente, el 99,999%, o, al menos, del 99,99% o el 99,9%; e incluso convenientemente, del 99% por peso o mayor.
Los productos de expresion de los polipeptidos y los acidos nucleicos descritos conforme a la presente invencion, asf como los vectores de expresion que contienen dichos acidos nucleicos y/o dichos polipeptidos, pueden utilizarse en “forma enriquecida”. Tal y como se usa aqrn, el termino «enriquecido» significa que la concentracion del material es, al menos, unas 2, 5, l0, 100 o 1000 veces su concentracion natural (por ejemplo), mas ventajosamente del 0,01% en peso, y preferiblemente de al menos 0,1% aproximadamente en peso. Tambien se contemplan preparaciones enriquecidas de alrededor del 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% en peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente invencion pueden utilizarse, segun convenga, en su forma enriquecida o aislada.
El termino «fragmento activo» define un fragmento que genera una respuesta inmunitaria(es decir, que posee actividad inmunogena) cuando se administra -solo u, opcionalmente, con un adyuvante adecuado- a un animal, que puede ser un mairnfero como, por ejemplo, un conejo o un raton, sin excluir a un ser humano; dicha respuesta inmunitaria adopta la forma de estimulacion de una respuesta de linfocitos T en el animal receptor como, por ejemplo, el ser humano. De forma alternativa, el «fragmento activo» tambien se puede usar para inducir una respuesta de linfocitos T in vitro.
Tal y como se usan en la presente memoria, los terminos «porcion», «segmento» y «fragmento», cuando se utilizan en relacion con los polipeptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoacidos, secuencia que es un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipeptido se somete a un tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas habituales, como la tripsina o la quimotripsina, los oligopeptidos resultantes de dicho tratamiento representaran porciones, segmentos o fragmentos del polipeptido inicial. Esto significa que cualquiera de esos fragmentos, necesariamente y como parte de su secuencia de aminoacidos, va a contener un segmento, fragmento o porcion que es sustancialmente identico, si no lo es exactamente, a una secuencia de las SEQ ID N.° 1 a 30, que corresponde a la estructura natural, o a las protemas «precursoras» de las SEQ ID N.° 1 a 30. Utilizados en relacion con los polinucleotidos, dichos terminos se refieren a los productos generados por el tratamiento de dichos polinucleotidos con cualquiera de las endonucleasas habituales.
Conforme a la presente invencion, el termino «identidad porcentual» o «porcentaje identico», al referirse a una secuencia, significa que una secuencia se compara con una secuencia reivindicada o descrita despues de alinear la secuencia que se va a comparer (la «secuencia comparada») con la secuencia descrita o reivindicada (la «secuencia de referencia»). La identidad porcentual se determina entonces con la siguiente formula:
Identidad porcentual = 100 [I -(C/R)]
donde C es el numero de diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada presentes en el tramo de alineacion entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada, donde:
(I) cada base o aminoacido de la secuencia de referencia que no tiene una base o aminoacido alineados en la secuencia comparada y
(II) cada hueco (gap) de la secuencia de referencia y
(III) cada base o aminoacido alineado de la secuencia de referencia que difiere de una base o aminoacido alineado de la secuencia comparada, constituye una diferencia;
y R es el numero de bases o aminoacidos de la secuencia de referencia presentes en el tramo de alineacion con la secuencia comparada, y cualquier hueco creado en la secuencia de referencia tambien se contabiliza como una base o un aminoacido.
Si existe una alineacion entre la secuencia comparada y la secuencia de referencia para la que la identidad porcentual, calculada como se ha especificado arriba, es aproximadamente igual o mayor que una identidad porcentual minima especificada, entonces la secuencia comparada guarda la identidad porcentual minima especificada con la secuencia de referencia, aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada arriba resulte menor que la identidad porcentual especificada.
Los peptidos originales descritos aqu se pueden modificar mediante la sustitucion de uno o mas residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptfdica, si no se especifica de otra manera. Dichas sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, si un aminoacido es reemplazado por un aminoacido de estructura y caractensticas similares, como en el caso de un aminoacido hidrofobico que es sustituido por otro aminoacido hidrofobico. Aun mas conservador sena el reemplazo de aminoacidos de tamano y naturaleza qrnmica igual o similar como, por ejemplo, el reemplazo de una leucina por una isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de protemas homologas naturales, determinadas sustituciones de aminoacidos se toleran con mas frecuencia que otras, y estas muestran a menudo una correlacion con similitudes de tamano, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoacido original y su reemplazo, siendo esta la base para la definicion de las «sustituciones conservadoras».
Las sustituciones conservadoras se definen como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: Grupo 1: residuos alifaticos pequenos, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro y Gly);
Grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu y Gln); Grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg y Lys); Grupo 4: residuos alifaticos grandes no polares (Met, Leu, Ile, Val y Cys); y Grupo 5: residuos grandes aromaticos (Phe, TyryTrp).
Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoacido por otro con caractensticas similares pero diferenciado de alguna manera en el tamano, como en el reemplazo de una alanina por un residuo de isoleucina. Los reemplazos muy poco o nada conservadores pueden implicar la sustitucion de un aminoacido acido por otro polar, o incluso por uno de caracter basico. Estas sustituciones «radicales» no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos qrnmicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien pueden provocar efectos inesperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios qrnmicos simples.
Naturalmente, dichas sustituciones pueden implicar otras estructuras distintas de los aminoacidos L habituales. De esta forma, aminoacidos D podnan sustituir a los aminoacidos L que habitualmente se encuentran en los peptidos antigenicos de la invencion y, aun asf, quedar englobados en la descripcion del presente documento. Ademas, los aminoacidos que poseen grupos R no estandar (es decir, grupos R distintos de los presentes en los 20 aminoacidos comunes de las protemas naturales) tambien pueden ser utilizados como sustitutos para producir polipeptidos inmunogenos e inmunogenicos, acordes con la presente invencion.
Si se descubre que las sustituciones en mas de una posicion resultan en un peptido con actividad antigenica sustancialmente equivalente o mayor, como se define mas abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probaran para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinergicos en la antigenicidad del peptido. Como maximo, se sustituiran hasta 4 posiciones simultaneamente dentro del peptido. El termino «respuesta de linfocitos T» define la proliferacion y la activacion espedficas de las funciones efectoras inducidas por un peptido in vitro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotoxicos (CTL) restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de celulas diana presentadoras naturales de peptido o bien sensibilizadas de manera repetida con un peptido o con un precursor del mismo; la secrecion de citocinas, preferiblemente de interferon gamma, TNF-alfa o IL-2 inducida por peptido; la secrecion de moleculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por peptido; o la desgranulacion. En lo que respecta a los linfocitos T cooperadores restringidos a las MHC de clase II, las funciones efectoras pueden consistir en la secrecion inducida por el peptido de citocinas, preferiblemente de IFN-gamma, TNF-alfa, IL-4, IL-5, IL-10 o IL-2, o la desgranulacion inducida por el peptido. Las posibles funciones efectoras de los CTL y de los linfocitos T cooperadores no se limitan a esta lista.
Preferiblemente, cuando los CTL espedficos para un peptido de SEQ ID N.° 10 se prueben para comprobar su respuesta a los peptidos sustituidos, la concentracion de peptido a la cual los peptidos sustituidos consiguen la mitad del aumento maximo de la lisis respecto al valor de fondo es como maximo de alrededor de 1 mM, preferiblemente como maximo de alrededor de 1 j M, mas preferiblemente como maximo de alrededor de 1 nM, y aun mas preferentemente como maximo de alrededor de 100 pM, y lo mas preferentemente como maximo de alrededor de 10 pM. Tambien se prefiere que el peptido sustituido sea reconocido por los CTL de mas de un individuo, de al menos dos, y mas preferiblemente de tres individuos.
La estimulacion de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antigenos que sean reconocidos como extranos por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antigenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para desencadenar una respuesta inmunitaria que es espedfica contra los antigenos expresados en la superficie de celulas tumorales y que a traves de este mecanismo de accion sea capaz de inducir la regresion, paralice o frene el crecimiento del tumor. Actualmente se estan explorando diversos mecanismos para aprovechar las defensas humorales y celulares del sistema inmunitario en la inmunoterapia contra el cancer.
Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer espedficamente y de destruir las celulas tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotoxicos (CTL) entre las celulas infiltradas en los tumores o en la sangre periferica hace pensar en que tales celulas desempenan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cancer (Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999). A partir del analisis de 415 espedmenes de pacientes aquejados de cancer colorrectal, Galon et al. fueron capaces de demostrar que el tipo, la densidad y la localizacion de las celulas inmunitarias en el tejido tumoral son realmente mejores predictores de la supervivencia del paciente que la ampliamente utilizada estadificacion TNM de los tumores (Galon et al., 2006).
Las moleculas MHC de clase I presentan peptidos procedentes de la proteolisis de protemas endogenas, DRiP y peptidos grandes. Las moleculas de MHC de clase II, presentes mayoritariamente en las celulas presentadoras de antigeno (APC) especializadas, presentan predominantemente peptidos de protemas exogenas o transmembrana que son captadas por las APC mediante endocitosis y despues son procesadas por las mismas (Cresswell, 1994). Los complejos constituidos por peptidos y moleculas MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T CD8-positivos portadores del receptor de linfocito T (TCR) adecuado, mientras que los complejos formados por peptidos y moleculas MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T colaboradores CD4-positivos portadores del TCR apropiado. Es bien sabido que el TCR, el peptido y el MHC estan presentes en una relacion estequiometrica de 1:1:1.
Los linfocitos T cooperadores CD4-positivos desempenan un papel importante en la induccion y el mantenimiento de respuestas eficaces por parte de los linfocitos T citotoxicos CD8-positivos (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003). Inicialmente, la sensibilizacion y la expansion de los CTL en los ganglios linfaticos esta sustentada por los linfocitos T CD4+ (Schoenberger et al., 1998). Asf pues, un mecanismo podna ser el direccionamiento de los linfocitos CD8+ vfrgenes hacia el lugar donde tiene lugar la interaccion funcional entre los linfocitos T CD4+ y las APC (Castellino et al., 2006). Por ultimo, la generacion de los linfocitos CD8+ de memoria funcionales depende casi siempre de la asistencia de los linfocitos T CD4+ (Sun and Bevan, 2003; Janssen et al., 2003). Por todas esas razones, la identificacion de epftopos derivados de antfgenos asociados a tumor (TAA) que sean reconocidos por los linfocitos T CD4-positivos reviste suma importancia para el desarrollo de medicamentos que estimulen una respuesta inmunitaria antitumoral (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). Los linfocitos T cooperadores generan en el seno del tumor un entorno de citocinas que es propicio para los CTL (Qin and Blankenstein, 2000; Mortara et al., 2006) y que atrae a las celulas efectoras, como, por ejemplo, los propios CTL, celulas NK, macrofagos y granulocitos (Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007).
En ausencia de inflamacion, la expresion de las moleculas MHC de clase II se circunscribe principalmente a las celulas del sistema inmunitario, en concreto a las celulas presentadoras de antfgeno (APC) especializadas, como, por ejemplo, monocitos, celulas derivadas de monocitos, macrofagos y celulas dendnticas. En pacientes con cancer se ha descubierto con sorpresa que las celulas tumorales expresan moleculas MHC de clase II (Dengjel et al., 2006). En modelos de mamffero como el raton se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden inhibir la manifestacion de los tumores sin el concurso de las celulas efectoras CTL (los linfocitos T CD8-positivos) a traves de la inhibicion de la angiogenia mediante la secrecion de interferon gamma (IFN-y) (Qin and Blankenstein, 2000). Tambien ha sido propuesta la destruccion directa de las celulas tumorales por los linfocitos T CD4+ citotoxicos a traves de linfotoxinas y granzima B (Penna et al., 1992; Littaua et al., 1992).
Ademas, se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden contrarrestar la progresion tumoral mediante la induccion de respuestas de anticuerpos al reconocer peptidos de antfgenos asociados a tumor presentados por moleculas HLA de clase II (Kennedy et al., 2003).
A diferencia de lo que sucede con los peptidos asociados a tumor reconocidos por moleculas HLA de clase I, hasta la fecha el numero descrito de ligandos de clase II derivados de antigenos asociados a tumor (TAA) es pequeno.
Dado que la expresion constitutiva de las moleculas HLA de clase II suele ser exclusiva de las celulas del sistema inmunitario (Mach et al., 1996), la posibilidad de aislar peptidos de clase II directamente de tumores primarios no se consideraba factible. Pero Dengjel et al. descubrieron varios epftopos de MHC de clase II en tumores (WO 2007/028574, EP 1760088 B1; (Dengjel et al., 2006).
Los antigenos que son reconocidos por los linfocitos T citotoxicos espedficos del tumor, esto es, los epftopos, pueden ser moleculas derivadas de todo tipo de protemas, tales como enzimas, receptores, factores de transcripcion, etc. que son expresados y que, en comparacion con celulas inalteradas del mismo origen, estan regulados al alza en las celulas del tumor correspondiente.
La clasificacion actual de los antigenos asociados a tumores (TAA) comprende los siguientes grupos principales (Novellino et al., 2005):
1. Antigenos cancer-testfculo: Los primeros TAA descubiertos que pueden ser reconocidos por linfocitos T pertenecen a esta clase (van der Bruggen et al., 1991), que inicialmente se denomino antigenos cancer-testmulo (CT) porque sus miembros se expresan en tumores humanos histologicamente diferentes y en los tejidos normales solo se encuentran en los espermatocitos/espermatogonias del testmulo y ocasionalmente en la placenta. Como las celulas del testmulo no expresan moleculas HLA de clase I y II, estos antfgenos no pueden ser reconocidos por los linfocitos T de los tejidos normales y, portanto, se consideran como espedficos de tumor desde el punto de vista inmunologico. Ejemplos conocidos de antfgenos CT son los miembros de la familia MAGE y el NY-ESO-1.
2. Antigenos de diferenciacion: Estos TAA estan presentes tanto en los tumores como en el tejido normal del que deriva el tumor; la mayona se encuentran en melanomas y en melanocitos normales. Muchas de esas protemas relacionadas con el linaje melanodtico participan en la biosmtesis de la melanina y no son espedficas de tumor, lo que no impide que sean muy utilizadas en la inmunoterapia contra el cancer. Algunos ejemplos son la tirosinasa y Melan-A/MART-1 en el melanoma y el PSA en el cancer de prostata.
3. TAA sobreexpresados: Se han detectado genes que codifican TAA de amplia expresion en tumores histologicamente distintos y en numerosos tejidos normales, en general con niveles de expresion mas bajos. Es posible que muchos de los epftopos procesados y posiblemente presentados por los tejidos normales lo sean por debajo del ftmite necesario para ser reconocidos por los linfocitos T, pero que la sobreexpresion por parte de las celulas tumorales rompa la tolerancia vigente hasta ese momento y desencadene la respuesta antitumoral. Ejemplos destacados de esta clase de TAA son Her-2/neu, survivina, telomerasa o WT1.
4. Antfgenos espedficos de tumor: Estos TAA unicos son fruto de mutaciones de genes normales (como pcatenina, CDK4, etc.). Algunos de esos cambios moleculares estan relacionados con la transformacion neoplasica y/o su progresion. Los antfgenos espedficos de tumor generalmente son capaces de inducir potentes respuestas inmunitarias sin riesgo de reacciones autoinmunitarias contra los tejidos normales. Por otro lado, casi siempre estos TAA solo son relevantes para el mismo tumor exacto en el que fueron identificados y normalmente no se encuentran en muchos otros tumores de su tipo.
5. TAA resultantes de modificaciones postraduccionales anormales: Estos TAA pueden surgir a partir de protemas que no son espedficas ni se sobreexpresan en los tumores, pese a lo cual aparecen asociados a tumores por procesos postraduccionales que se activan principalmente en los tumores. Ejemplos de este tipo surgen a rafz de patrones de glucosilacion alterados que generan epftopos nuevos en tumores como MUC1 o fenomenos como el ayuste de protemas durante la degradacion, que en algunos casos pueden ser espedficos de tumor (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004).
6. Protemas de oncovirus: Estos TAA son protemas virales que podnan desempenar un papel crftico en el proceso oncogenico y que, como extranas a causa de su origen no humano, pueden desencadenar una respuesta de los linfocitos T. Ejemplos de tales protemas son las protemas E6 y E7 del virus del papiloma humano detipo 16, que se expresan en el carcinoma de cuello uterino.
Para que las protemas sean reconocidas por los linfocitos T citotoxicos como antfgenos espedficos o asociados a tumor y puedan ser empleadas como parte de un tratamiento, deben cumplir ciertos prerrequisitos. El antfgeno debe ser expresado principalmente por celulas tumorales y no por tejidos sanos normales o, de hacerlo, debe serlo en cantidades comparativamente pequenas. Y no solo es conveniente que el antfgeno de interes este presente unicamente en un tipo de tumor, sino que lo este tambien en altas concentraciones (numero de copias del peptido por celula). Los antfgenos espedficos de tumor y asociados a tumor proceden a menudo de protemas que intervienen directamente en la transformacion de una celula normal en una tumoral a causa de su funcion, por ejemplo, porque intervienen en el control del ciclo celular o en la supresion de la apoptosis. Ademas, tambien las dianas ulteriores de las protemas que son las causantes directas de la transformacion pueden estar reguladas al alza y, portanto, estar asociadas indirectamente al tumor. Tales antfgenos asociados indirectamente a los tumores tambien pueden ser las dianas para una estrategia de vacunacion (Singh-Jasuja et al., 2004). En ambos casos es esencial que la secuencia de aminoacidos del antfgeno contenga epftopos, puesto que el peptido («peptido inmunogenico») derivado de un antfgeno asociado a tumor debe desencadenar una respuesta de los linfocitos T en condiciones in vitro o in vivo.
Basicamente, cualquier peptido capaz de unirse a una molecula de MHC puede actuar como un epftopo de linfocito T. Un prerrequisito para la induccion de una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo es la presencia de un linfocito T dotado del correspondiente TCR y la ausencia detolerancia inmunitaria hacia ese epftopo en particular.
Por consiguiente, los TAA son el punto de partida para el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los metodos para identificar y caracterizar los TAA estan basados, entre otros, en el uso de CTL que pueden aislarse de pacientes o de individuos sanos, o en la generacion de perfiles de transcripcion diferenciales o patrones de expresion peptfdica diferenciales entre los tumores y los tejidos normales (Lemmel et al., 2004; Weinschenk et al., 2002).
No obstante, la identificacion de genes sobreexpresados o expresados selectivamente en tejidos tumorales o en estirpes de celulas tumorales humanas no aporta informacion precisa acerca del uso de los antigenos transcritos de esos genes en la inmunoterapia. Ello se explica porque solo una subpoblacion individual de epftopos de esos antigenos resulta adecuada para aplicaciones de ese tipo, puesto que ha de haber un linfocito T con el TCR correspondiente y la inmunotolerancia hacia ese epftopo concreto ha de ser minima o nula. Portanto, es importante seleccionar solo aquellos peptidos derivados de protemas sobreexpresadas o selectivamente expresadas que sean presentados ligados a moleculas de MHC y que sean diana de linfocitos T funcionales. Un linfocito T funcional se define como un linfocito T que tras la estimulacion con un antigeno espedfico puede sufrir una expansion clonal y ser capaz de ejecutar funciones efectoras («linfocito T efector»).
Los linfocitos T cooperadores desempenan un papel importante en la coordinacion de la funcion efectora de los CTL en la inmunidad antitumoral. Los epftopos reconocidos por los linfocitos T cooperadores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T cooperadores del tipo Thi apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotoxicos CD8-positivos, que incluyen funciones citotoxicas dirigidas contra las celulas tumorales que muestran en su superficie complejos de MHC/peptido asociado a tumor. De esta forma, los epftopos de los peptidos asociados a tumores que son reconocidos por los linfocitos T cooperadores, solos o en combinacion con otros peptidos asociados a tumores, pueden servir como principios activos farmaceuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales.
Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinergicamente al efecto antitumoral, la identificacion y caracterizacion de los antigenos asociados a tumor reconocidos por los CTL CD8+ (ligando: moleculas de MHC de clase I epftopo peptfdico) o por los linfocitos T cooperadores CD4-positivos (ligando: moleculas de MHC de clase II epftopo peptfdico) es importante para el desarrollo de vacunas antitumorales.
A la luz de los efectos secundarios graves y los gastos que supone el tratamiento contra el cancer es evidente la urgente necesidad de mejora de los metodos pronosticos y diagnosticos. Asf pues, existe la necesidad de descubrir otros factores que puedan servir como biomarcadores para el cancer en general y el glioblastoma en particular. Existe igualmente la necesidad de identificar factores que puedan ser utilizados en el tratamiento contra el cancer en general y contra el glioblastoma en particular.
Y es mas, no existe ninguna pauta terapeutica pensada para los pacientes con cancer de prostata que presentan recidiva bioqmmica despues de la prostatectoirfta radical, normalmente causada por tumor residual in situ que no ha sido extirpado en presencia de crecimiento localmente avanzado del tumor. Sena deseable contar con nuevas estrategias terapeuticas de menor morbilidad y similar eficacia terapeutica a las estrategias terapeuticas disponibles en estos momentos.
La presente invencion proporciona un peptido que es util para el tratamiento del glioblastoma, el cancer de prostata y otros tumores. De los peptidos dados a conocer en la presente memoria se ha demostrado, en parte directamente con tecnicas de espectrometna de masas, que son presentados de forma natural por moleculas HLA en muestras de glioblastoma humano primario (veanse el ejemplo 1 y la figura 1), o en el caso de la SEQ ID N.° 26 predicha conforme al algoritmo de prediccion SYFPEITHI (Rammensee et al., 1995) son ligandos promiscuos de los alelos HLA-DR HLA-DRB1*01, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*11 y DRB1*15. A tenor de los datos anteriores y de las frecuencias de dichos alelos DRB1 frecuentes, se puede suponer que el 92% de las personas de raza blanca A*02-positivas expresan como mmimo un alelo DRB1 que se une al peptido acorde con la SEQ ID N.° 26.
Se ha demostrado que el gen originario del cual derivan las SEQ ID N.° 26 a 30 -survivina- esta altamente sobreexpresado en el glioblastoma, el tumor de prostata, cancer de mama, cancer de esofago, cancer colorrectal, carcinoma de celulas renales claras, cancer de pulmon, del SNC, de ovario, melanoma (Tamm et al. 1998), cancer de pancreas, carcinoma epidermoide, leucemia y meduloblastoma en comparacion con los tejidos normales (veanse el ejemplo 2 y la figura 2) demostrando un alto grado de asociacion del peptido con el tumor, es decir, que dichos peptidos aparecen claramente en el tejido tumoral pero no en los tejidos normales. WO 2004/067023 describe peptidos restringidos a MHC de clase I derivados del antfgeno asociado a tumor survivina, en la que los peptidos son capaces de unirse a moleculas de HLA de clase I con una alta afinidad.
Los peptidos unidos a HLA pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario, espedficamente por los linfocitos T. Los linfocitos T pueden destruir las celulas que presentan el complejo HLA/peptido reconocido, p. ej., celulas tumorales de glioblastoma que presenten los peptidos derivados. Los linfocitos T colaboradores activados por los peptidos derivados de la survivina pueden inhibir la vascularizacion del tumor, pueden atraer a las celulas efectoras del sistema inmunitario y facilitar la sensibilizacion y la proliferacion de los CTL, asf como la respuesta sostenida de los linfocitos TCD8+.
Todos los peptidos dados a conocer han demostrado ser capaces de estimular las respuestas de los linfocitos T (veanse el ejemplo 3 y la figura 3). Asf pues, los peptidos son utiles para generar en un paciente una respuesta inmunitaria con la que destruir celulas tumorales. La respuesta inmunitaria se puede inducir en el paciente con la administracion directa de los peptidos descritos o de sustancias precursoras adecuadas (p. ej., peptidos alargados, protemas o acidos nucleicos que codifiquen dichos peptidos), idealmente en combinacion con un agente que potencie la inmunogenicidad (un adyuvante). Cabe esperar que la respuesta inmunitaria generada por esa vacunacion terapeutica sea muy espedfica contra las celulas tumorales porque los tejidos normales no contienen los peptidos diana de la presente invencion en un numero comparable de copias, lo cual evita el riesgo de reacciones autoinmunitarias perjudiciales contra las celulas normales del paciente.
Las composiciones farmaceuticas pueden comprender los peptidos en forma libre o en forma de una sal farmaceuticamente aceptable.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, «sal farmaceuticamente aceptable» se refiere a un derivado de los peptidos descritos en el que el peptido es modificado para obtener sales acidas o basicas del agente. Por ejemplo, las sales acidas se preparan a partir de la base libre (normalmente la forma neutra del farmaco posee un grupo -NH2 neutro) haciendola reaccionar con un acido adecuado. Acidos adecuados para la preparacion de sales acidas incluyen tanto acidos organicos, p. ej., acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido piruvico, acido oxalico, acido malico, acido malonico, acido sucdnico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido dtrico, acido benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p-toluensulfonico, acido salidlico y similares, como acidos inorganicos, como p. ej., acido clortndrico, acido bromtndrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico y similares. A la inversa, la preparacion de sales basicas a partir de grupos acidos que pueden estar presentes en un peptido se realiza empleando una base farmaceuticamente aceptable como hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, hidroxido de amonio, hidroxido de calcio, trimetilamina o similares. En una forma de realizacion especialmente preferida, las composiciones farmaceuticas comprenden los peptidos en forma de sales de acido acetico (acetatos) o acido clortndrico (cloruros).
La Tabla 1 muestra los peptidos dados a conocer, sus respectivas SEQ ID N.°, los alelos HLA a los que se unen cada uno de ellos y las protemas originarias de las que pueden surgir tales peptidos. Reviste especial interes que el peptido conforme a la SEQ ID N.° 1 se una tanto a HLA-DR como a HLA-A*02, con lo que puede desencadenar dos respuestas distintas.
Tabla 1: Peptidos dados a conocer correspondientes a la SEQ ID N.° 10 de la presente invencion
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(continuacion)
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Proteoglucano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4)
El CSPG4 (proteoglucano sulfato de condroitina) es un proteoglucano integral de membrana presente en los pericitos nacientes que cumple un papel funcional en la neovascularizacion (Ozerdem, 2006). Durante la embriogenia, el proteoglucano CSPG4 se expresa en los capilares inmaduros, pero a medida que estos vasos maduran la expresion se pierde. Es conocido por ser un marcador superficial de progresion precoz del melanoma, implicado en la estimulacion de la proliferacion, la migracion y la invasion de las celulas tumorales. El CSPG4 se expresa intensamente en >90% de las lesiones de melanoma humano. Aunque el CSPG4 no es estrictamente espedfico de tumor, las respuestas de los linfocitos T CD4+ reactivos a tumores en pacientes con melanoma y en individuos sanos reconocen el CSPG4693-709 en celulas de melanoma que expresan el HLA-DR11 en ausencia de autoinmunidad (Erfurt et al., 2007).
La expresion del CSPG4 potencia la diseminacion de las celulas mediada por integrinas, la fosforilacion de FAK (cinasa de adhesion focal) y la activacion de ERK1/2 (cinasa regulada por senal extracelular) (Yang et al., 2004). Asimismo, existen cada vez mas indicios procedentes de datos in vitro de que el CSPG4 desempena un importante papel en la angiogenia tumoral. Asf, en los tumores positivos para CSPG4 se ha observado una tasa de neovascularizacion y volumenes vasculares notablemente elevados, y se ha comprobado que el CSPG4 secuestra la angiostatina, cosa que normalmente inhibe la proliferacion de las celulas endoteliales y la angiogenia. Los vasos inmaduros tambien contienen pericitos positivos para CSPG4, lo cual apunta a la intervencion de esta poblacion celular en la modulacion de la proliferacion de las celulas endoteliales por medio del bloqueo de los efectos inhibitorios de la angiostatina durante el desarrollo de los vasos (Chekenya et al., 2002b).
La expresion de CSPG4 tambien ha sido descrita en otros tejidos normales aparte de los pericitos activados, tales como las celulas endoteliales, condrocitos, miocitos lisos, ciertos queratinocitos basales de la epidermis, asf como en celulas del foftculo piloso (Campoli et al., 2004).
En el curso de la angiogenia y como respuesta a patolog^as del SNC, las celulas de alta motilidad que expresan el CSPG4 sufren rapidos cambios morfologicos y son reclutadas en puntos donde esta teniendo lugar crecimiento y reparacion vascular. El CSPG4 se sobreexpresa tanto en las celulas tumorales como en los pericitos de los vasos sangumeos de tumores cerebrales malignos (Chekenya and Pilkington, 2002). Con la implantacion de celulas procedentes de una estirpe celular humana de glioma positiva para CSPG4 en cerebros de ratas atimicas inmunodeficientes se pudo demostrar que estos tumores presentan una densidad microvascular superior a la de las ratas control, lo cual implica que la expresion del CSPG4 regula tanto la funcion como la estructura de la vasculatura tumoral derivada del hospedador (Brekke et al., 2006). En un experimento de xenoinjerto consistente en implantar material biopsico de glioblastoma a ratas atimicas, el CSPG4 se identifico como asociado principalmente a los vasos sangumeos tanto en los pericitos como en los componentes de la membrana basal de la vasculatura tumoral y su expresion tambien estuvo asociada con zonas de elevada proliferacion celular (Chekenya et al., 2002a). Ademas, la expresion del CSPG4 corrio paralela a la progresion del tumor en un modelo de implantacion de glioma (Wiranowska et al., 2006). La progresion maligna se mantiene por la intercomunicacion entre el tumor y su estroma, por la cual el estroma activado nutre a las celulas neoplasicas proliferativas e invasivas, aportando nueva vasculatura, componentes de la matriz extracelular y factores de crecimiento estimuladores. En ese contexto, el CSPG4 desempena un papel importante en la activacion del tumor-estroma a traves de alteraciones en la adhesion, migracion y proliferacion celulares y en la morfogenia vascular (Chekenya and Immervoll, 2007).
El CSPG4 se expresa diferencialmente en los gliomas humanos, con mayor expresion en los gliomas de alto grado que en los de bajo (Chekenya et al., 1999). La elevada expresion del CSpG4 aparece correlacionada con la multirresistencia farmacologica mediada por el aumento de la activacion de la via de senalizacion de la D3D1-integrina/PI3K y sus dianas ulteriores, que promueve la supervivencia de la celula (Chekenya et al., 2008).
CSP-001 ha sido hallado en los siguientes organos y tejidos y tipos de cancer:
Cerebro: - glioblastoma;- glioblastoma secundario (derivado de astrocitoma)
Colon: - adenocarcinoma (excluido el tipo mucinoso), primario;
Recto: - adenocarcinoma, metastasis
Estomago: - adenocarcinoma (excluido el tipo con celulas en anillo de sello), primario
Rinon: - carcinoma de celulas renales, estirpe celular;- carcinoma de celulas renales, tipo de celulas claras, metastasis, todos los focos secundarios;- carcinoma de celulas renales, tipo de celulas claras, primario; carcinoma de celulas renales, primario
Pulmon: -adenocarcinoma, primario:- carcinoma adenoescamoso, primario; - cancer primario;- carcinoma microcftico, primario; - carcinoma epidermoide, primario;
Pancreas: - adenocarcinoma, primario; - tumor de celulas de los islotes, maligno, metastasis
Prostata: - adenocarcinoma, primario
Piel: - melanoma maligno metastasico, metastasis ganglionar
Por consiguiente, se prefiere en particular una composicion farmaceutica que comprende un peptido acorde con la SEQ ID N.° 1 para el tratamiento de:
Cerebro: - glioblastoma; - glioblastoma secundario (derivado de astrocitoma)
Colon: - adenocarcinoma (excluido el tipo mucinoso), primario;
Recto: - adenocarcinoma, metastasis
Estomago: - adenocarcinoma (excluido el tipo con celulas en anillo de sello), primario
Rinon: - carcinoma de celulas renales, estirpe celular; carcinoma de celulas renales, tipo de celulas claras, metastasis, todos los focos secundarios; carcinoma de celulas renales, tipo de celulas claras, primario; carcinoma de celulas renales, primario
Pulmon:- adenocarcinoma, primario; estadio I,- carcinoma adenoescamoso, primario; - cancer primario;-carcinoma microcftico, primario; - carcinoma epidermoide, primario;
Pancreas: - adenocarcinoma, primario; - tumor de celulas de los islotes, maligno, metastasis
Prostata: - adenocarcinoma, primario
Piel: - melanoma maligno metastasico, metastasis ganglionar
Acil-CoA sintetasa, miembro 1 de la familia bubblegum (ACSBG1)
La protema codificada por este gen posee actividad sintetasa de grupos acilo de cadena larga y coenzima A. Se cree quejuega un papel central en el cerebro en la activacion del metabolismo de los acidos grasos de cadena muy larga y de la mielinogenia. La activacion de los acidos grasos mediante la tioesterificacion para formar acetil-CoA es un requisito necesario en la mayona de las reacciones en que intervienen esta clase de moleculas. Aun no se han descrito en la bibliograffa funciones que sean espedficas del cancer ni su sobreexpresion. El patron de expresion de la protema ACSBG1 en el cerebro, las glandulas suprarrenales, los testmulos y los ovarios, asf como su funcion, apuntan a su implicacion en la patologfa bioqmmica de la adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (XALD). XALD es un trastorno neurodegenerativo grave, a menudo mortal, que se caracteriza por la acumulacion en el plasma y en los tejidos de altos niveles de acidos grasos saturados de cadena muy larga (Asheuer et al., 2005; Pei et al., 2003).
Brevican (BCAN)
El brevican es una protema de la matriz extracelular que se expresa con profusion desde el nacimiento hasta los 8 anos de edad y que llegada la veintena es regulada a la baja hasta alcanzar niveles bajos que se mantienen en la corteza cerebral adulta normal. La isoforma con GPI se expresa en niveles uniformemente bajos a lo largo del desarrollo (Gary et al., 2000). Los gliomas malignos invaden agresivamente el cerebro normal circundante, fenomeno que podna ser facilitado por protemas extracelulares espedficas de tejido o de tumor. Asf pues, la matriz extracelular puede modular, en parte, la permisividad del tejido al movimiento celular. En consecuencia, la capacidad de los gliomas para modificar la matriz extracelular del SNC podna potenciar la invasividad de dichas celulas. Una molecula de la matriz extracelular que sufre una drastica regulacion al alza en los gliomas es el BCAN, un proteoglucano de sulfato de condroitina propio del cerebro. La expresion del BCAN tambien aparece regulada al alza durante los penodos de elevada motilidad de las celulas gliales, que tienen lugar durante el desarrollo y a consecuencia de lesiones cerebrales. En el glioma se puede detectar un incremento de la expresion de en torno a siete veces con respecto a los niveles normales (Gary et al., 2000; Gary et al., 1998). Ademas de la regulacion al alza del BCAN en el glioma, es posible que el procesamiento proteolftico de la protema entera tambien contribuya a la invasion (Gary et al., 1998; Nutt et al., 2001). El procesamiento por medio de la escision proteolftica del BCAN por parte de metaloproteasas de la familia ADAMTS es un paso necesario para que inicie su efecto favorecedor de la invasividad en el glioma. La forma mutante del BCAN que «no es susceptible de proteolisis» es incapaz de potenciar la invasion de las celulas del glioma in vitro y la progresion del tumor in vivo (Viapiano et al., 2008). El ARNm del BCAN no se detecta en la corteza cerebral humana adulta normal ni en ningun otro tumor que no sea el glioma, por lo que el BCAN se considera un marcador unico y selectivo del glioma (Jaworski et al., 1996). Asimismo, el analisis de protemas ha revelado no solo el aumento de la expresion del BCAN entero sino la presencia de otras isoformas exclusivas del glioma. A este respecto, B/b&g es un producto entero del ARNm del BCAN que surge como resultado de la glucosilacion incompleta o reducida de la protema central. B/b&g esta ausente en el cerebro adulto normal pero sf se halla en muestras de glioma de alto grado (Viapiano et al., 2005).
Se ha descrito la sobreexpresion selectiva del BCAN en un tipo de celula tumoral similar a un citoblasto derivada del glioblastoma (Gunther et al., 2008). Este subtipo de celulas similares a citoblastos han manifestado la maxima pluripotencia y oncogenicidad in vivo.
Similar a quitinasa 3, tipo 1 (glucoproteina del cartilago-39) (CHI3L1)
La CHI3L1 es un miembro de las «protemas similares a la quitinasa de mairnfero» que se expresa y es segregada en diversos tipos de tumores solidos. Producida por las celulas cancerosas y por los macrofagos asociados al tumor, muestra actividad de factor de crecimiento en las celulas implicadas en los procesos de remodelacion de los tejidos y podna intervenir en la proliferacion, la diferenciacion, la supervivencia, la invasividad y la metastasis de las celulas tumorales, asf como en la angiogenia, la inflamacion y la remodelacion de la matriz extracelular que envuelve el tumor (Johansen et al., 2006; Johansen et al., 2007; Ringsholt et al., 2007). Aparte, CHI3L1 es un autoantfgeno candidato en la artritis reumatoide. Estirpes de linfocitos T CD4 procedentes de donantes sanos que reconodan a CHI3L1 expresaron el CD25, el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides, y moleculas Foxp3, y fueron capaces de suprimir la respuestas de linfocitos T espedficos del antfgeno. Las respuestas en el 50% de los pacientes con artritis reumatoide revelan una polarizacion hacia el fenotipo proinflamatorio de linfocito T cooperador de tipo 1 (Th1) y son sensiblemente menos capaces de suprimir las respuestas de memoria espedficas de antfgeno (van Bilsen et al., 2004).
El CHI3L1 es regulado al alza por la oncostatina M, de la cual se sabe que es inducida por el sistema nervioso como resultado del estres celular, que se expresa en la mayona de los tumores cerebrales humanos y activa la via de senalizacion de JAK/STAT (Krona et al., 2007). La expresion de CHI3L1 tambien ha sido vinculada con la expresion de p-MAPK, p-mTOR y p-p70S6K en el glioblastoma (Pelloski et al., 2006).
En varios estudios de expresion genica, el CHI3L1 ha aparecido expresado con mayor profusion en el glioblastoma que en el cerebro normal, en concreto entre 3 y 62 veces mas que en este ultimo (Saidi et al., 2007; Kroes et al., 2007; Shostak et al., 2003; Tanwar et al., 2002). Los estudios de inmunohistoqmmica han revelado que todas las celulas dotadas de un nucleo funcional son capaces de expresar la CHI3L1 en su citoplasma, si bien la intensidad de dicha expresion depende de la actividad celular. Por ello, las celulas que poseen una gran actividad metabolica tienden a mostrar una tincion mas intensa en su citoplasma (Ringsholt et al., 2007). Asimismo, se ha podido demostrar por medio de tecnicas de inmunohistoqmmica que los glioblastomas expresan la CHI3L1 en mayor medida que los oligodendrogliomas anaplasicos (Nutt et al., 2005). El analisis por inmunoelectrotransferencia (Western blot) de muestras de glioma para determinar los niveles de la protema CHI3L1 ha revelado una elevacion sustancial en el 65% de los glioblastomas multiformes y niveles indetectables en los gliomas de bajo grado (grado II y III) en el tejido cerebral normal (Tanwar et al., 2002). En contraste con el astrocitoma pilodtico, que no se disemina y es posible curar con cirugfa, solo el glioblastoma expresa CHI3L1 (Colin et al., 2006).
Los niveles de CHI3L1 en suero aparecen elevados en diversos tipos de neoplasias malignas, circunstancia que ha sido vinculada con una supervivencia peor. Los niveles sericos mas elevados se han hallado en los pacientes con cancer metastasico que presentaban el intervalo sin recurrencia mas corto y la supervivencia global mas breve. En concreto, en el suero de pacientes con glioblastoma se ha detectado una elevada expresion de la CHI3L1 (Kim et al., 2007; Johansen et al., 2007; Johansen et al., 2006; Junker et al., 2005; Tanwar et al., 2002). Los pacientes con glioblastoma multiforme cuyo tumor esta activo presentan una concentracion notablemente mayor de CHI3L1 que aquellos que no presentan ningun indicio radiologico de la enfermedad. Asimismo, existe una significativa relacion inversa entre el CHI3L1 y la supervivencia al glioblastoma multiforme (Hormigo et al., 2006; Pelloski et al., 2005). La expresion elevada de CHI3L1 tambien se observa en el cancer de mama, donde aparece relacionada con un mayor tamano del tumor, menor diferenciacion tumoral y peor supervivencia sin enfermedad (Kim et al., 2007; Coskun et al., 2007). Asimismo, en el carcinoma epidermoide de cabeza y cuello se han detectado niveles elevados de la CHI3L1 en el suero en el 53% de los casos estudiados. Los pacientes que presentan un nivel serico elevado de CHI3L1 presentan una supervivencia menor que aquellos cuyo nivel en suero es normal (33 frente a 84 meses) (Roslind etal., 2008).
Pacientes aquejados de cancer de prostata presentaron niveles sericos de CHI3L1 significativamente mayores que los pacientes con HBP o personas sanas (Kucur et al., 2008).
Protema de enlace portadora de dominio CAP-GLY 2 (CLIP2)
La protema codificada por CLIP2 pertenece a la familia de las protemas de enlace citoplasmaticas, que han sido propuestas como mediadoras de la interaccion entre ciertos organulos membranosos y los microtubulos. CLIP2 ha sido hallada tanto en relacion con los microtubulos como con un organulo denominado el cuerpo lamelar dendntico (informacion general de la pagina web del NCBI).
A CLIP2 se la encuentra en los extremos de los microtubulos tirosinados, pero no en los de los microtubulos destirosinados. La tirosina-ligasa de tubulina (TTL), la enzima que cataliza la adicion de un residuo de tirosina C-terminal a la alfa-tubulina en el ciclo de tirosinacion de la tubulina, interviene en la progresion tumoral y desempena un papel vital en la organizacion neuronal (Peris et al., 2006). Un estudio del ADN genomico procedente de secciones congeladas de 30 casos de glioblastoma primario llevado a cabo con GenoSensor Array 300 caracterizo amplificaciones y eliminaciones de genes, asf como informacion cromosomica en el genoma entero. Entre los genes que aparecieron amplificados con frecuencia se hallaban: =CLIP2 (63,3%), EGFR (53,3%), IL6 (53,3%), ABCB1 (MDR1) (36,7%) y PDGFRA (26,7%) (Suzuki et al., 2004).
Transportador de aniones organicos de la familia de transportadores de solutos (SLC), miembro 1C1 (SLCO1C1)
SLCO1C1 se expresa selectivamente en la barrera hematoencefalica (Chu et al., 2008). SLCO1C1 presenta preferencia selectiva por los sustratos y podna desempenar un papel importante en la disposicion de las hormonas tiroideas en el cerebro y en los testmulos (Pizzagalli et al., 2002). SLCOlCl no se ha detectado espedficamente con inmunofluorescencia. SLCO1A2 y SLCO2B1 se han detectado con microscopfa de inmunofluorescencia en la membrana luminal de las celulas endoteliales que conforman la barrera hematoencefalica y en la barrera hematotumoral, pero no en las celulas de glioma (Bronger et al., 2005).
Distrobrevina, alfa (DTNA)
La alfa-distrobrevina ha sido descrita principalmente como un componente citoplasmatico del complejo de distrofinaglucoprotema en los miocitos esqueleticos. Las isoformas de la DTNA presentan localizacion dispar en las celulas y los tejidos; en las membranas basolaterales de las celulas epiteliales, las distrobrevinas median en el contacto con la matriz extracelular, las protemas perifericas y transmembrana y el citoesqueleto de filamentos de actina. Aparte de su papel estructural, se supone que las DTNa son importantes para la senalizacion y la diferenciacion celulares y estan vinculadas con las zonas de oclusion durante su reorganizacion (Sjo et al., 2005). La DTNA podna estar implicada en la formacion y la estabilidad de las sinapsis, asf como en el agrupamiento de los receptores colinergicos nicotmicos.
Receptor del factor de crecimiento epidermico (homologo del oncogen de la leucemia viral eritroblastica (verb-b), aviar) (EGFR)
Un ambito de interes novedoso es el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR), cuyas anomalfas constituyen una de las aberraciones moleculares mas frecuentes en el glioblastoma. En concreto el EGFRvIII (receptor del factor de crecimiento epidermico, variante III) es una forma mutante del EGFR oncogena y activa constitutivamente que se suele expresar con frecuencia en el glioblastoma (Zawrocki and Biernat, 2005). El EGFR esta implicado en la activacion de diversas vfas que regulan el fenotipo de las celulas progenitoras. La actividad de la cinasa de tirosina del EGFR potencia la migracion, la proliferacion y la supervivencia de los neurocitoblastos. Puesto que es sabido que la senalizacion del EGFR tambien interviene en el glioblastoma, se puede concluir que el glioblastoma deriva de oncocitoblastos y que las senales del EGFR se alteran habitualmente en esas celulas precursoras (Yuso-Sacido et al., 2006).
Los glioblastomas primarios surgen de novo en pacientes de edad avanzada y con frecuencia sobreexpresan el EGFR. La sobreexpresion del EGFR aparece correlacionada con el incremento de la angiogenia, el edema y la invasion (Aghi et al., 2005). Asimismo, los glioblastomas que presentan amplificacion del EGFR son radiorresistentes (Barker et al., 2001) y recidivan con mas rapidez tras el tratamiento (Schlegel et al., 1994).
El glioblastoma es el unico tumor humano no epitelial en que la activacion excesiva del EGFR ha sido vinculada con el crecimiento tumoral y con la supervivencia del paciente, y en que la activacion del EGFR promueve la infiltracion tumoral en condiciones in vitro (Penar et al., 1997).
El EGFR es el protoncogen del erbB. La sobreexpresion del EGFR potencia el crecimiento celular estimulando la formacion de complejos ligando:receptor activos. La amplificacion genica es el mecanismo responsable de la sobreexpresion de los receptores del EGF en los tumores de glioblastoma (Thompson and Gill, 1985). El gen EGFR radicado en el cromosoma 7 multiplica con frecuencia su numero de copias en los gliomas de alto grado (Okada et al., 2007). La neutralizacion del EGFR mediante ARN de interferencia cortos anula la oncogenia de las celulas de glioblastoma (Huang et al., 2007).
La sobreexpresion del EGFR se detecta entre el 40% y el 70% de los glioblastomas, mientras que los astrocitomas anaplasicos, pilodticos o de bajo grado son invariablemente negativos para dicho receptor. Los niveles elevados de EGFR en suero indican una supervivencia reducida (Quaranta et al., 2007). Asimismo, se ha demostrado que las personas afectadas por astrocitomas de alto grado que disfrutan de una supervivencia dilatada son negativas para el EGFRvIII (Liang et al., 2008).
Notch-1 regula al alza la expresion del EGFR y se hallan correlaciones entre los niveles de EGFR y el ARNm de Notch-1 en el glioma de alto grado primario humano (Purow et al.2008).
El EGFR en sf mismo esta implicado en la activacion constitutiva de la cinasa del extremo NH2-terminal de c-Jun (JNK), que contribuye a la proliferacion, la supervivencia y la oncogenia en algunos tumores, entre ellos los gliomas (Li et al., 2008a).
Aunque el EGFRvIII se expresa unicamente en un pequeno porcentaje de las celulas del glioma, la mayona de las celulas exhiben un fenotipo transformado. Se ha demostrado que la expresion del EGFRvIII en celulas de glioma indolentes estimula la formacion de microvesmulas relacionadas con las balsas lipfdicas que contienen EGFRvIII, las cuales son liberadas en el entorno de las celulas y pueden fusionarse con las membranas plasmaticas de las celulas cancerosas que carecen del EGFRvIII causando la transferencia de la actividad oncogena (Al-Nedawi et al., 2008).
Protema de union a acidos grasos 7, cerebro (FABP7)
Las protemas de union a acidos grasos (FABP) son protemas citosolicas de 14-15 kDa que supuestamente intervienen en la captacion, el transporte y el direccionamiento de los acidos grasos (AG). Podnan modular la concentracion de acidos grasos y de ese modo influir en la funcion de enzimas, membranas, canales ionicos y receptores, asf como en la expresion genica y el crecimiento y la diferenciacion celular. Se pueden diferenciar nueve tipos de FABP segun su distribucion espedfica en los tejidos. Si bien la identidad de la secuencia de aminoacidos vana entre el 30% y el 70%, la estructura terciaria de beta-clamp a la cual se une el acido graso es similar en todas ellas. El tejido nervioso alberga cuatro tipos de FABP, con una distribucion espacio-temporal distintiva (Veerkamp and Zimmerman, 2001). La FABP7 se expresa con profusion en el cerebro y en la retina en desarrollo, y su expresion disminuye notablemente en el s Nc adulto (Godbout et al., 1998). A rafz de resultados obtenidos in vitro, se ha planteado que la FABP7 sena necesaria para el establecimiento del sistema glial radial en el cerebro en desarrollo (Mita et al., 2007). La protema FABP7 del cerebro normal apenas es detectable pero presenta una expresion moderada o intensa en el nucleo y en el citoplasma en varios glioblastomas multiformes. Las celulas transfectadas con FABP7 presentan una migracion cinco veces mayor que las celulas de control. Asf pues, la supervivencia total mas breve asociada con la sobreexpresion de FABP7, especialmente en el glioblastoma, podna deberse al aumento de la migracion y la invasion de las celulas tumorales en el parenquima cerebral circundante (Liang et al., 2005). La translocacion nuclear de FABP7 esta relacionada espedficamente con la amplificacion del EGFR y con los tumores mas invasivos (Kaloshi et al., 2007). Asf pues, la activacion del EGFR puede estimular a la FABP7 nuclear y promover asf la migracion de las celulas tumorales del glioblastoma (Liang et al., 2006).
Tambien se ha demostrado que la expresion de FABP7 es un marcador del carcinoma de celulas renales. La expresion de FABP7 se detecta unicamente en los tejidos de carcinoma, pero no en las partes no cancerosas de las muestras renales (Teratani et al., 2007). La expresion de FABP7 en el carcinoma de las celulas renales ha demostrado ser 20 veces mayor en el tumor en comparacion con el tejido renal normal (Domoto et al., 2007; Buchner et al., 2007). Tambien se ha demostrado que FABP7 se expresa con frecuencia en el melanoma, donde podna intervenir en la proliferacion y la invasion celular (Goto et al., 2006).
Protema fibrilar acida de la glia (GFAP)
GFAP codifica una de las principales protemas de los filamentos intermedios de los astrocitos maduros. Se usa como marcador para distinguir los astrocitos de otras celulas gliales durante el desarrollo. Las mutaciones de este gen causan la enfermedad de Alexander, un raro trastorno de los astrocitos del sistema nervioso central. Se ha descrito otra variante de transcripcion, pero su secuencia entera no ha sido determinada. Se han descrito niveles elevados en el cerebro de personas autistas, en tanto que el cerebro de personas con depresion grave presento niveles reducidos de GFAP.
Se analizaron los cerebros de primates que hadan desarrollado tumores de novo diez anos despues de recibir radiacion en todo el organo cerebral. Las celulas precursoras tumorales evidenciaron atipia celular y mitosis, siendo negativas para los marcadores tumorales GFAP, EGFR y p53 (Lubensky et al., 2006).
En las neoplasias astrocfticas el numero de celulas positivas para GFAP y la intensidad de la tincion fueron directamente proporcionales al grado de malignidad. Los tres casos de oligodendroglioma presentaron una reaccion negativa a la GFAP (Reyaz et al., 2005). Los oligodendrogliomas puros son inmunohistologicamente negativos para la GFAP (Mokhtari et al., 2005). Las concentraciones sericas de GFAP en pacientes con glioma de alto grado presentan una correlacion lineal con el volumen tumoral (Brommeland et al., 2007). Incluso en los pacientes con glioblastoma se puede detectar una correlacion significativa entre el volumen tumoral, el volumen de necrosis tumoral, la cantidad de celulas necroticas positivas para la GFAP y la concentracion serica de esta protema (Jung et al., 2007).
Tras el tratamiento de estirpes celulares de glioblastoma con 4-fenilbutirato, un inhibidor de la histona-desacetilasa, se observaron concentraciones elevadas de la GFAP sin fosforilar, mientras que las isoformas fosforiladas permanecieron intactas (Asklund et al., 2004).
En una estirpe celular de glioblastoma tratada con TGF-alfa, la transcripcion del gen GFAP, el nivel de ARNm y la smtesis de la protema en cuestion descendieron en torno a un 50% (Zhou and Skalli, 2000).
Tecnicamente, el promotor de GFAP se usa a menudo como herramienta en modelos de raton para provocar la expresion de protemas espedficamente en el sistema nervioso.
Los islotes de Langerhans del pancreas estan envueltos por celulas de Schwann perinsulares (pSC) que expresan la GFAP. El ataque autoinmunitario contra elementos tisulares del sistema nervioso del pancreas parece ser parte integral inicial de la diabetes de tipo 1 (Winer et al., 2003). Esta expresion en el pancreas no es reflejada por Immatics ni por los datos de expresion genica externa en la mayona de los tejidos. Se ha publicado que la GFAP-001 es un epttopo contra el cual los diabeticos de tipo 1 y sus parientes no diabeticos que presentan una respuesta humoral contra autoantfgenos de la diabetes (riesgo elevado de sufrirla) muestran un aumento de la reactividad de los CTL secretores de granzima B (ELISPOT ex vivo) en comparacion con los donantes sanos (Standifer et al., 2006).
Un dato interesante es que parece existir una correlacion inversa entre la manifestacion de las enfermedades autoinmunitarias, sobre todo de la diabetes, y el riesgo de aparicion del glioma (Aronsonand Aronson, 1965; Schlehofer et al., 1999; Brenner et al., 2002; Schwartzbaum et al., 2003; Schwartzbaum et al., 2005).
Receptor acoplado a protema G, 56 (GPR56)
GPR56 es un receptor acoplado a protema G atfpico (GPCR) por estar dotado de una region extracelular N-terminal inusualmente grande, que contiene una larga region rica en Ser/Thr que forma un pedunculo similar al de la mucina y, debido a este rasgo, se cree que puede intervenir en las interacciones entre celulas y entre la celula y la matriz. Esto, sumado al elevado nivel de expresion del ARNm y a la amplia distribucion de este receptor, ha llevado a plantear su posible papel en los procesos de interaccion entre las celulas (Liu et al., 1999). GPR56 pertenece al GPCR de la familia de las secretinas que intervienen en el desarrollo de las celulas progenitoras neurales y ha sido vinculado con malformaciones del cerebro humano durante el desarrollo. La expresion elevada de GPR56 aparece relacionada con los fenotipos de transformacion celular de varios tejidos cancerosos en contraste con sus homologos normales, lo cual denota una funcion potencialmente oncogena. El silenciamiento del GPR56 mediante ARN de interferencia desencadena la apoptosis y reduce el crecimiento, independiente de la fijacion, de las celulas cancerosas a traves del aumento de la anoikis. El silenciamiento de GPR56 tambien reduce la adhesion celular a la matriz extracelular (Ke et al., 2007). La regulacion al alza de GPR56 ha sido demostrada en el glioblastoma multiforme con genomica funcional. Los estudios de inmunohistoqmmica han confirmado la expresion de GPR56 en la mayona de muestras tumorales de glioblastoma/astrocitoma, frente a niveles indetectables de expresion en el cerebro adulto normal (Shashidhar et al., 2005). En las celulas cancerosas pancreaticas, el ARNm del GPR56 se expresa con profusion, mientras que la protema homonima se halla en niveles mfimos o es indetectable, lo cual parece indicar que su expresion queda suprimida en dichas celulas (Huang et al., 2008). Estudios previos sobre la metastasis habfan mostrado que el GPR56 aparece notablemente regulado a la baja en variantes altamente metastasicas de una estirpe celular de melanoma humano, de lo que se deduce que su sobreexpresion suprime el crecimiento tumoral y la metastasis. Dicha supresion del crecimiento se cree mediada por la interaccion del GPR56 con una transglutaminasa tisular (TG2), un componente abundante en el tejido y el estroma, que ha sido implicado en la supresion de la progresion tumoral (Xu et al., 2006; Xu and Hynes, 2007). Se ha descrito otro efecto inhibidor de GPR56 sobre la migracion de las celulas progenitoras neurales (NPC). GPR56 se expresa con profusion en las NPC y probablemente participe en la regulacion del movimiento de las NPC a traves de la via de senalizacion de Rho y G alfa(12/13), lo cual apunta a un cometido importante de la misma en el desarrollo del sistema nervioso central (Iguchi et al., 2008).
Receptor de glutamato, ionotropico, AMPA 4 (GRIA4)
Los receptores del glutamato de tipo a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionato (AMPA), o AMPAR, intervienen en la neurotransmision rapida en las sinapsis excitadoras del SNC y estan compuestos por subunidades formadas por un conjunto de cuatro protemas, GluRl a GluR4 (GRIA4).
Las subunidades GRIA4 se expresan ubicuamente en las celulas de glioblastoma humanas, operando como AMPAR permeables al Ca2+. Su conversion a receptores impermeables al Ca2+ inhibe la locomocion celular y promueve la apoptosis, mientras que la sobreexpresion de los receptores de AMPA permeables al Ca2+ facilita la migracion y la proliferacion de las celulas tumorales. Por consiguiente, los receptores AMPA permeables al Ca2+ parecen tener un papel crucial en el crecimiento del glioblastoma (Ishiuchi et al., 2002).
Protema 3 de union al ARNm del factor de crecimiento insulinoide 2 (IGF2BP3)
La IGF2BP3 pertenece a la familia de las protemas de union al ARNm del factor de crecimiento insulinoide-II, implicada en la localizacion, el recambio y el control traduccional del ARNm. La protema codificada contiene varios dominios KH, que son importantes para la union al ARN y se sabe que intervienen en la smtesis y el metabolismo del ARN. Se expresa principalmente durante el desarrollo embrionario y en ciertos tumores. Por ello, la IGF2BP3 se considera una protema oncofetal (Liao et al., 2005). No se ha hallado informacion espedfica sobre la expresion de la IGF2BP3 en el glioblastoma, pero sf se ha descrito su sobreexpresion en otros tipos de neoplasias malignas. La IGF2BP3 se expreso en el 30% de un conjunto de 716 muestras analizadas de carcinoma de celulas renales claras. En este estudio, su expresion se relaciono con el estadio avanzado y el grado de los tumores primarios, asf como con otros rasgos adversos como la necrosis coagulativa del tumor y la diferenciacion sarcomatoide. Ademas, la expresion positiva de IGF2BP3 aparecio asociada con un aumento del riesgo de 5 a 10 veces de metastasis a distancia y con un incremento del 42% al 50% en el riesgo de muerte por carcinoma de celulas claras, lo cual apunta a que la expresion de la IGF2BP3 representa un predictor independiente del comportamiento tumoral del carcinoma de celulas renales claras agresivo (Hoffmann et al., 2008; Jiang et al., 2006; Jiang et al., 2008). La expresion de la IGF2BP3 tambien se ha detectado en el melanoma en comparacion con nevus benignos, en los que no se detecto expresion aun en presencia de rasgos displasicos (Pryor et al., 2008). En el cancer de endometrio, la expresion de IGF2BP3 esta estrechamente relacionada con el cancer de endometrio de tipo II y con un fenotipo histologico agresivo en las lesiones neoplasicas endometriales (Zheng et al., 2008). En 20 pacientes aquejados de carcinoma epidermoide esofagico, se pudo observar la induccion de respuestas espedficas de linfocitos T en TIL, asf como de linfocitos de los ganglios regionales y de la sangre periferica, contra un epftopo peptfdico de la IGF2BP3 restringido al HLA-A2402 en el 40% de los casos (Mizukami et al., 2008).
La IGF2BP3 tambien aparece expresada al alza en los carcinomas pancreaticos. En dos estudios mas del 90% de las muestras de tejido tumoral pancreatico presentaron expresion de la IGF2BP3 revelada por inmunotincion, mientras que los tejidos pancreaticos no neoplasicos dieron negativo. Asimismo, el ARNm de la IGF2BP3 aparecio sobreexpresado en carcinomas pancreaticos en comparacion con muestras de tejido no neoplasico y la expresion aumento progresivamente con el estadio tumoral (Yantiss et al., 2005; Yantiss et al., 2008). Tambien se ha hallado una elevacion significativa de la expresion de la IGF2BP3 en tumores uroteliales de alto grado, si bien en general no se expresa en el urotelio benigno ni en los tumores uroteliales de bajo grado. Asimismo, los pacientes con tumores IGF2BP3-positivos presentan unas tasas de supervivencia sin progresion y de supervivencia sin enfermedad mucho menores que los afectados por tumores IGF2BP3-negativos. Los pacientes IGF2BP3-positivos afectados por un carcinoma urotelial invasivo superficial como diagnostico inicial tambien acabaron desarrollando metastasis, mientras que en los pacientes IGF2BP3-negativos no se hallaron metastasis. Asimismo, los datos de esos estudios indican que la IGF2BP3 podna intervenir en la progresion de los tumores uroteliales de bajo a alto grado tanto en las lesiones papilares como en las planas (Li et al., 2008b; Sitnikova et al., 2008).
Leucoencefalopatfa megaloencefalica con quistes subcorticales 1 (MLC1)
La leucoencefalopatfa megaloencefalica con quistes subcorticales (MLC) es un trastorno autosomico recesivo de la sustancia blanca cerebral que afecta a los ninos. La MLC esta causada por mutaciones del gen MLC1 (Ilja Boor et al., 2006). Por lo que saben los inventores, en la bibliograffa no existe informacion sobre ninguna relacion entre el MLC1 con los tumores cerebrales.
Existe un artmulo publicado referente a la distribucion celular y regional del MLC1 en el cerebro de raton (Schmitt et al., 2003). La expresion maxima del MLC1 se hallo durante el penodo pre y perinatal en celulas precursoras neurales multipotenciales. En el cerebro adulto del raton el ARNm del gen se detecto exclusivamente en las celulas gliales. En contraste con los astrocitos en desarrollo y maduros, los oligodendrocitos no mostraron expresion del MLC1.
Nestina(NES)
Durante el desarrollo tiene lugar una amplia expresion de la nestina en los filamentos intermedios de las celulas neuroepiteliales del estrato ventricular 11 semanas despues de la concepcion en todas las partes del SNC, mientras que la inmunorreactividad a la nestina disminuye en el transcurso del segundo y el tercer trimestre (Takano and Becker, 1997; Lendahl et al., 1990; Zimmerman et al., 1994; Tohyama et al., 1992).
Durante o despues de la migracion del estrato ventricular en proliferacion, la expresion de la nestina aparece fuertemente regulada a la baja en las neuronas posmitoticas (Arnold and Trojanowski, 1996). La tincion de la nestina en tejido de cerebro adulto humano no neoplasico solo revelo una tincion debil en un muy escaso numero de celulas endoteliales (Dahlstrand et al., 1992). La nestina se puede reexpresar durante la transformacion neoplasica (Veselska et al., 2006). En los tejidos de glioma, la inmunorreactividad de la nestina solo aparece en las celulas tumorales y la cantidad producida de esta protema aumenta a medida que el grado del glioma gana en malignidad hacia el glioblastoma. Los glioblastomas (grado de malignidad IV) muestran la mayor incidencia de celulas positivas para la nestina y, en general, los mayores niveles de tincion de dicha protema. La expresion de la nestina se puede detectar en celulas tumorales de varios tipos de tumores primarios del SNC, que son de origen neuroectodermico, pero no en las celulas de carcinoma en metastasis (Dahlstrand et al., 1992; Tohyama et al., 1992). La nestina casi no se expresa en los astrocitomas difusos, se expresa variablemente en los astrocitomas anaplasicos y se expresa profusa e irregularmente en los glioblastomas, donde su distribucion vana de modo complementario con la de la GFAP y la vimentina (Schiffer et al., 2006). Clmicamente, los tumores de celulas germinales del SNC que son negativos para la nestina no exhiben diseminacion, si bien todos los tumores que exhiben diseminacion tambien expresan nestina con intensidad (Sakurada et al., 2007).
Las celulas tumorales que expresan profusamente la nestina suelen estar proximas a los vasos sangumeos (Dahlstrand et al., 1992), (Kurihara et al., 2000; Sugawara et al., 2002; Florenes et al., 1994; Strojnik et al., 2007) y se ha sugerido que la expresion de la misma por parte del endotelio activado servina como marcador de la angiogenia (Teranishi et al., 2007; Maderna et al., 2007; Amoh et al., 2005; Mokry et al., 2004).
El glioblastoma multiforme comprende precursores transformados que portan el complemento completo de las caractensticas funcionales que se esperan de los citoblastos, incluida la capacidad para la generacion de tumores. Estas celulas pueden crear un glioblastoma multiforme incluso tras el trasplante seriado, por lo que se las puede considerar como neurocitoblastos tumorales (Galli et al., 2004). Pertenecen a la subpoblacion de celulas CD133+ de los tumores cerebrales humanos y co-expresan el marcador de neurocitoblastos nestina, pero no asf marcadores diferenciados de linaje neural (Singh et al., 2004b; Singh et al., 2003; Singh et al., 2004a; Mao et al., 2007). La presencia de una poblacion CD133+/nestina+ en los tumores cerebrales sugiere que la celula iniciadora de los gliomas podna ser un neurocitoblasto normal (Shiras et al., 2007). Puesto que la senalizacion de Notch es activa en el tumor cerebral y en los citoblastos, se ha podido probar que el promotor de la nestina es activado en condiciones de cultivo por la actividad de Notch (Shih and Holland, 2006).
La transfeccion de la estirpe celular C6 de astrocitoma de rata con un duplex de ARNsi de la nestina revelo la influencia de la supresion ejercida por dichos ARNsi de la nestina sobre el crecimiento de las celulas de astrocitoma cultivadas de un modo dosis-dependiente (Wei et al., 2008).
Tambien se ha descrito la expresion de la nestina en oncocitoblastos de cancer de prostata (Gu et al., 2007; Gipp et al., 2007) y de pancreas (Carriere et al., 2007), asf como en el melanoma (Klein et al., 2007). Ademas, la nestina tambien se expresa en los tumores siguientes: GIST (Tsujimura et al., 2001; Sarlomo-Rikala et al., 2002), melanomas (Florenes et al., 1994; Brychtova et al., 2007), cancer colorrectal (Teranishi et al., 2007) y tumores pancreaticos (Ohike et al., 2007; Kleeberger et al., 2007).
La expresion de la nestina tambien se detecta en diversos tejidos normales: Se ha descrito en los podocitos de los glomerulos maduros normales del rinon humano. En condiciones normales, la nestina se expresa en varios tipos de celulas glomerulares en los primeros estadios del desarrollo, pero queda confinada a los podocitos en los glomerulos maduros (Ishizaki et al., 2006), lo cual indica su cometido esencial en algun aspecto de la funcion del podocito. Los glomerulos adultos muestran inmunorreactividad a la nestina en celulas que expresan la vimentina y que tienen la morfologfa propia del podocito (Bertelli et al., 2007). Posiblemente la interaccion de la nestina con la vimentina refuerza la resistencia mecanica de los podocitos, que sufren tensiones elevadas durante la filtracion glomerular (Perry et al., 2007). Asf pues, en el rinon humano, la nestina se expresa desde los primeros pasos de la glomerulogenia en los podocitos, las celulas mesangiales y las endoteliales. Esta expresion queda posteriormente restringida a los podocitos en los glomerulos maduros, sin que se pueda detectar en otras estructuras del rinon humano adulto (Su et al., 2007). La inmunohistoqmmica ha revelado la expresion constante de la nestina en la corteza de las glandulas suprarrenales humanas normales. Las celulas que expresan la nestina estan radicadas predominantemente en la zona reticular, donde los carcinomas suprarrenales muestra un numero variable de celulas inmunorreactivas a la nestina (Toti et al., 2005).
La expresion de la nestina tambien se ha descrito en las celulas intersticiales de Cajal (CIC) del tubo digestivo normal. La mayona de las CIC intramusculares del antro y todas las CIC mientericas del intestino delgado son inmunorreactivas a la nestina, de igual modo que algunas CIC mientericas y la mayona de las CIC de la musculatura circular del colon (Vanderwinden et al., 2002). En el pancreas se hallan celulas inmunorreactivas a la nestina en los islotes y en la fraccion exocrina. En las zonas de los grandes conductos pancreaticos, las celulas positivas para la nestina representan pequenos capilares dispersos por el tejido conjuntivo que envuelven el epitelio ductal. Asf pues, la nestina se expresa en las celulas del endotelio vascular del pancreas humano (Klein et al., 2003). En los propios islotes se pueden hallar celulas progenitoras de los mismos que la expresan. Se ha formulado la hipotesis de que las celulas progenitoras derivadas de los islotes que son positivas para la nestina constituyen una poblacion distinta de las celulas que residen en los islotes pancreaticos y que podnan participar en la neogenia de las celulas endocrinas de los islotes (Zulewski et al., 2001). En el tugado normal adulto es posible aislar una poblacion de citoblastos hepaticos humanos que son positivos para la vimentina y la nestina (Herrera et al., 2006). En ensayos con cultivos celulares, el analisis de la composicion del citoesqueleto y de la matriz mediante inmunotincion revelo que las celulas medulares adultas y las pulmonares fetales expresan las protemas vimentina y nestina en sus filamentos intermedios (Sabatini et al., 2005). En la denticion definitiva joven, la nestina se halla en los odontoblastos funcionales. Su expresion aparece regulada a la baja y la nestina no aparece en la denticion definitiva de mas edad, pero en cambio aparece de nuevo regulada al alza en los dientes cariados y danados (About et al., 2000).
Los citoblastos adultos que expresan la nestina tambien se encuentran en la region periluminal de la hipofisis anterior madura y, por medio de tecnicas de mapeo del destino genetico, se ha demostrado que sirven para generar subgrupos de los seis tipos de celulas endocrinas terminalmente diferenciadas que concurren en la glandula hipofisaria. Dichos citoblastos, si bien no desempenan ningun papel relevante en la organogenia, sufren una expansion posnatal y comienzan a engendrar una progenie diferenciada, que coloniza el organo que inicialmente consistfa enteramente en celulas diferenciadas derivadas de precursores embrionarios (Gleiberman et al., 2008). Subfamilia 2 del receptor nuclear, grupo E, miembro 1 (NR2E1)
El NR2E1 (TLX) es un factor de transcripcion esencial para la proliferacion y la autorrenovacion de los neurocitoblastos mediante el reclutamiento de las histona desacetilasas (HDAC) hacia los genes diana situados corriente abajo con el fin de reprimir su transcripcion, lo que a su vez regula la proliferacion de los neurocitoblastos. El reclutamiento de las HDAC conduce a la represion de la transcripcion de los genes diana TLX, el inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina p21(CIP1/WAF1)(p21) y el gen oncosupresor PTEN (Sun et al., 2007). La subfamilia TLX/HOXll de genes homeobox divergentes interviene en diversos aspectos de la embriogenia y, en el caso de TLX1/HOX11 y de TLX3/HOX11L2, destacan notablemente como oncogenes en la leucemia linfoblastica aguda de linfocitos T (Dixon et al., 2007). El NR2E1 dirige un programa de desarrollo fundamental de la organizacion retiniana y controla la generacion del numero apropiado de progenies retinianas y el desarrollo de los gliocitos durante el prolongado penodo de la retinogenia (Miyawaki et al., 2004). No se ha hallado informacion espedfica referente al glioblastoma.
Molecula de adhesion celular neuronal (NRCAM)
La NRCAM humana (Molecula de adhesion celular relacionada con la neuroglia) aparece sobreexpresada en el tejido de glioblastoma multiforme (GMT) con respecto al tejido cerebral normal. La NRCAM es descrita como una protema transmembrana detipo I de un solo paso que interacciona con la anquirina. La neutralizacion con hNRCAM antisentido causo la reduccion de la expresion de la hNRCAM natural, cambios en la morfologfa celular, redujo el ritmo de proliferacion celular y prolongo el ciclo celular. Ademas, la sobreexpresion de las hNRCAM antisentido en dichas celulas provoco un acusado descenso del numero de colonias en agar blando y de la invasion a traves del gel de la matriz extracelular en condiciones in vitro. La inyeccion subcutanea a ratones atfmicos de celulas de glioblastoma que sobreexpresaban las hNRCAM antisentido causo la completa inhibicion de la formacion de tumores en contraste con las celulas transfectadas unicamente con el vector. La inoculacion en el seno del tumor de un plasmido que expresaba hNRCAM antisentido tambien ralentizo el crecimiento tumoral en ratones atfmicos en condiciones in vivo (Sehgal et al., 1999). El analisis por RT-PCR espedfico del gen indico que la hNRCAM aparece sobreexpresada en los tejidos tumorales de glioblastoma, gliomas y astrocitomas de alto grado en comparacion con el tejido cerebral normal (Sehgal et al., 1998). La NRCAM, una molecula de adhesion intercelular perteneciente a la familia de las moleculas de adhesion celular similares a las inmunoglobulinas, conocida por su funcion en el crecimiento y la orientacion de las ramificaciones neuronales, ha sido identificada recientemente como un gen diana de la senalizacion de la beta-catenina en celulas y tejidos de melanoma y de carcinoma de colon humanos. La transduccion de la NRCAM en fibroblastos a traves de retrovirus estimula la motilidad celular y la oncogenia (Conacci-Sorrell et al., 2005). El fomento de la transcripcion de la NRCAM a traves de la beta-catenina o de la plakoglobina desempena un papel en la oncogenia del melanoma y del cancer de colon, probablemente al promover el crecimiento y la motilidad de las celulas (Conacci-Sorrell et al., 2002). Otras dianas de la via de senalizacion de la beta-catenina tambien aparecen reguladas al alza, como es el caso de MYC (Liu et al., 2008). La NRCAM aparece sobreexpresada en los carcinomas papilares de tiroides humanos a nivel del ARNm y de la protema, en cualquiera de los estadios tumorales (Gorka et al., 2007).
La sobreexpresion del ARNm de la NRCAM en los tumores esta relacionada con altos indices de proliferacion y se asocio a un desenlace negativo en ependimomas (Zangen et al., 2007).
Podoplanina (PDPN)
La PDPN es una glucoprotema integral de membrana de tipo I similar a la mucina que presenta una distribucion diversa en los tejidos humanos. Interviene en la migracion, la invasion y la metastasis de las celulas cancerosas, asf como en la progresion maligna y esta implicada en la agregacion plaquetaria. CLEC-2 es el primer receptor fisiopatologico de la podoplanina descubierto (Kato et al., 2008). Se estudio una serie de 115 glioblastomas mediante tecnicas de inmunohistoqmmica con un anticuerpo anti-PDPN. El 47% de ellos expresaban la PDPN en celulas de la superficie, sobre todo alrededor de las zonas necroticas y en las celulas endoteliales en proliferacion. Asimismo, la expresion del ARNm y de la protema de la PDPN resultaron notablemente superiores en el glioblastoma que en los astrocitomas anaplasicos, lo cual parece indicar que la expresion de dicha protema podna estar relacionada con la malignidad de los astrocitos (Mishima et al., 2006). En otros analisis, la PDPN tambien ha sido hallada expresada en el 82,9% de una serie de glioblastomas (29/35) (Shibahara et al., 2006). En otro estudio que investigo la expresion de la PDPN y la actividad estimuladora de la agregacion plaquetaria por parte de estirpes celulares de glioblastoma, la estirpe LN319 expreso con profusion la PDPN y fomento la agregacion. El NZ-1, un anticuerpo anti-PDPN altamente reactivo, neutralizo la agregacion plaquetaria facilitada por la LN319, lo cual apunta a que la PDPN sena el principal determinante de la agregacion estimulada por la misma (Kato et al., 2006). Los niveles de expresion genica de la PDPN fueron notablemente mayores en los glioblastomas que en la sustancia blanca no neoplasica, extremo confirmado por tecnicas inmunohistoqmmicas (Scrideli et al., 2008). La PDPN se expresa espedficamente en las celulas endoteliales linfaticas, pero no en las del endotelio vascular sangumeo en cultivo y en la linfangiogenia tumoral. Si bien la PDPN parece estar basicamente ausente en la epidermis humana normal, su expresion resulto muy intensa en 22 de 28 carcinomas espinocelulares, lo cual parece indicar su implicacion en la progresion tumoral (Schacht et al., 2005). La PDPN aparece regulada al alza en el frente invasor de ciertos carcinomas humanos. El analisis de la expresion de la PDPn en celulas de cancer de mama humano cultivadas, en un modelo murino de carcinogenia de las celulas beta pancreaticas, y en biopsias tumorales humanas indica que la PDPN promueve la invasion de las celulas tumorales en condiciones in vitro e in vivo. La PDPN induce la migracion colectiva de las celulas por medio de la formacion de filopodios a traves de la regulacion a la baja de las actividades de las GTPasas pequenas de la familia Rho. En conclusion, la PDPN estimula una via alternativa de invasion de las celulas tumorales en ausencia de la transicion epitelio-mesenquimatica (Wicki et al., 2006). El nivel de expresion de la PDPN aparecio potenciado en una mayona de pacientes con tumores colorrectales (Kato et al., 2003). Al TGF-beta se le atribuye la funcion de regulador fisiologico de la PDPN en celulas tumorales (Suzuki et al., 2008). La PDPN es expresada por celulas cancerosas procedentes del esofago, el pulmon, el hngado, el colon y la mama, asf como de las celulas endoteliales linfaticas (Kono et al., 2007).
Tenascina C (hexabraquion) (TNC)
La expresion de la glucoprotema de la matriz extracelular TNC en el glioblastoma, pero no en el cerebro normal y su relacion con las membranas basales del endotelio que prolifera en el marco del glioblastoma ya sugirieron en 1983 que la TNC podna servir como marcador de los gliomas (Bourdon et al., 1983). Durante la progresion tumoral, la matriz extracelular de los tejidos tumorales se remodela hasta convertirse en un entorno mas propicio para la progresion del tumor, proceso en el que la angiogenia es un paso esencial (Carnemolla et al., 1999). Ademas, la TNC aparece sobreexpresada en vasos tumorales que muestran un elevado mdice proliferativo, lo cual indica su implicacion en la angiogenia neoplasica (Kim et al., 2000). En los tumores, la hipoxia puede estimular la expresion de la TNC (Lal et al., 2001). La estimulacion de la TNC esta mediada por el TGF-beta1, que proporciona el mecanismo para la invasion del parenquima sano por parte de los gliomas de alto grado (Hau et al., 2006). Asimismo, la sobreexpresion de la TNC es consecuencia de la activacion espedfica del promotor del gen de la tenascina C por parte de la gastrina, que es conocida por modular notablemente la migracion de las celulas del glioblastoma humano (Kucharczak et al., 2001). La TNC regula a la baja la tropomiosina-1 y por ello desestabiliza las fibras de estres de actina. Ademas, causa la regulacion a la baja del inhibidor de la ruta de Wnt Dickkopfl. Dado que el descenso de la expresion de la tropomiosina-1 y el aumento de la via de senalizacion de las Wnt estan vinculados estrechamente con la transformacion y la oncogenia, la TNC modula espedficamente estas vfas de senalizacion potenciando la proliferacion de las celulas de glioma (Ruiz et al., 2004).
En los tejidos de glioblastoma se observa la tincion perivascular de la TNC alrededor de los vasos sangumeos que irrigan el tumor, mientras que esta es menos frecuente en los gliomas de grado II y III de la OMS, lo cual indica que la intensidad de la tincion de la TNC esta relacionada con el grado del tumor y que, a mayor intensidad, peor pronostico (Herold-Mende et al., 2002; Zukiel et al., 2006). La expresion maxima de la TNC se observa en el tejido conectivo que rodea los tumores (Chiquet-Ehrismann and Tucker, 2004). La TNC tambien contribuye a generar un nicho de citoblastos en la zona subventricular (ZSV), interviniendo en la orquestacion de la senalizacion de los factores de crecimiento para acelerar el desarrollo de los neurocitoblastos. La TNC es esencial para la expresion oportuna del EGFR en los neurocitoblastos y potencia la senalizacion del FGF2. El efecto predominante de la TNC sobre las celulas situadas en la ZSV consiste en la regulacion de la progresion del desarrollo (Garcion et al., 2004). La TNC es el inductor mas potente de la migracion dirigida de los neurocitoblastos humanos (haptotaxia). La matriz extracelular producida por el tumor ofrece, pues, un entorno permisivo para el tropismo de los neurocitoblastos en celulas tumorales diseminadas (Ziu et al., 2006).
La via de la TNC tambien desempena un papel destacado en el crecimiento y la metastasis de los tumores mamarios. Asf pues, el bloqueo de la senalizacion o la reduccion de la expresion de la TNC en celulas MDA-MB-435 derivo en una alteracion sustancial de la migracion celular y en la proliferacion celular independiente de la fijacion. Ratones a los que se inyectaron clones de celulas MDA-MB-435 que presentaban una expresion reducida de la TNC manifestaron un descenso sustancial del crecimiento del tumor primario, asf como de las recidivas tumorales tras la extirpacion quirurgica de dicho tumor y un descenso de la incidencia de las metastasis pulmonares (Calvo et al., 2008).
Survivina (BIRC5)
La expresion de BIRC5 (survivina), un miembro de la familia de protemas inhibidoras de la apoptosis (IAP), es elevada en tejidos fetales y en diversos canceres humanos mientras que su expresion esta enormemente reducida en los tejidos diferenciados normales del adulto, sobre todo en aquellos cuyo mdice de proliferacion es bajo. La survivina parece ser capaz de regular tanto la proliferacion celular como la muerte celular apoptosica. Aunque la survivina se localiza normalmente en la region citoplasmatica de la celula, donde esta asociada con un mal pronostico en el cancer, tambien se ha descrito en el nucleo, localizacion donde indica un pronostico favorable (O'Driscoll et al., 2003). Se han descrito varios mecanismos de regulacion a traves de la survivina y de ella misma. La survivina parece estar relacionada con la chaperona molecular Hsp60. En condiciones in vivo, la Hsp60 aparece abundantemente expresada en los tumores humanos primarios en comparacion con los correspondientes tejidos normales. El silenciamiento agudo de la Hsp60 con ARN pequenos de interferencia desestabiliza la reserva mitocondrial de survivina, induce la disfuncion mitocondrial y activa la apoptosis dependiente de caspasas (Ghosh et al., 2008). Ademas, la inhibicion de Ras libera el «freno» que ejerce la survivina sobre la apoptosis y provoca la activacion de la via apoptosica mitocondrial. Especialmente en el glioblastoma, la resistencia a la apoptosis se puede neutralizar con un inhibidor de Ras dirigido contra la survivina (Blum et al., 2006). Asimismo, parece haber una correlacion entre la hiperactividad del NF-kappaB en los gliomas y la hiperexpresion de la survivina, uno de los genes diana del factor NF-kappaB. En consecuencia, los genes antiapoptosicos activados por el NF-kappaB estan hiperexpresados en muestras tumorales. Y especialmente en el glioblastoma se detectan niveles sumamente elevados de expresion de la survivina (Angileri et al., 2008). Se ha planteado que la sobreexpresion de la survivina en los gliomas cerebrales podna desempenar un papel importante en la proliferacion maligna, los mecanismos antiapoptosicos y la angiogenia (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006b). Se han realizado diversos analisis para estudiar la expresion de la survivina y su repercusion en la supervivencia en el marco del glioblastoma. En resumen, la expresion de la survivina, sobre todo la expresion simultanea en el nucleo y el citoplasma en los tumores astrodticos aparecio relacionada significativamente con el grado de malignidad (con la mayor expresion de survivina en el glioblastoma) y con tiempos de supervivencia global mas cortos que los pacientes con tumores negativos para la survivina (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).
La sobreexpresion de la survivina tambien se ha descrito en otros tipos de tumores. En el cancer de mama, la expresion de la survivina aparece asociada con un grado mayor y con una menor supervivencia sin progresion (Yamashita et al., 2007; Al-Joudi et al., 2007; Span et al., 2004). En estirpes celulares de cancer de esofago, la actividad promotora de la survivina ha resultado ser 28,5 veces mas elevada que en los tejidos normales (Sato et al., 2006). La expresion de la survivina en el cancer colorrectal tambien esta relacionada con el grado patologico y la metastasis ganglionar (Tan et al., 2005). Tambien se ha demostrado que la agresividad del carcinoma de celulas renales claras esta relacionada con la expresion de la survivina. Asimismo, su expresion esta inversamente relacionada con la supervivencia dependiente espedficamente del cancer (Kosari et al., 2005). La expresion de la survivina se puede detectar en un conjunto de neoplasias queratinodticas y lesiones cutaneas hiperproliferativas, pero no en la piel normal (Bowen et al., 2004). En estirpes celulares de cancer de pancreas, la survivina apareda amplificada en el 58% de las estirpes celulares estudiadas (Mahlamaki et al., 2002). En el carcinoma epidermoide, la expresion de la survivina puede ayudar a identificar los casos con un fenotipo clfnico mas agresivo e invasivo (Lo et al., 2001).
Las posibilidades que ofrece la survivina como diana en el tratamiento contra el cancer han propiciado la realizacion de estudios con peptidos derivados de la misma en los cuales ha demostrado su inmunogenicidad en pacientes oncologicos al desencadenar respuestas mediadas por los linfocitos T CD8+. Asimismo, la survivina estimulo de forma espedfica la reactividad de los linfocitos T CD4+ en linfocitos de sangre periferica de los mismos pacientes (Casati et al., 2003; Piesche et al., 2007).
La survivina (SVN, BIRC) se sobreexpresa en multitud de tipos de cancer distintos. Por ello, en general su sobreexpresion se considera vinculada con una menor supervivencia global y mayor grado de malignidad.
Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y/o anticuerpos quimericos. Tambien forman parte de la presente invencion estirpes de celulas inmortales que producen un anticuerpo monoclonal.
Existe otro aspecto mas de la invencion que se refiere a un anticuerpo que se une espedficamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (m Hc ) de clase I que forma un complejo con un antfgeno restringido por HLA de la invencion (en lo sucesivo tambien denominado como «anticuerpo espedfico de complejo»). Se da a conocer un metodo para producir un anticuerpo recombinante que se une espedficamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II que esta formando un complejo con un antfgeno restringido por HLA, comprendiendo dicho metodo: La inmunizacion de un mamffero no humano geneticamente modificado que comprenda celulas que expresen dicho complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II con una forma soluble de una molecula MHC de clase I o II unida a dicho antfgeno restringido por HLA; el aislamiento de moleculas de ARNm a partir de celulas productoras de anticuerpos de dicho marnffero no humano; la produccion de una fagoteca que contenga moleculas proteicas codificadas por dichas moleculas de ARNm; y el aislamiento de al menos un fago de dicha fagoteca, en que al menos ese fago presente dicho anticuerpo capaz de unirse espedficamente al citado complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II unido con dicho antfgeno restringido por HLA. Metodos pertinentes para la produccion de tales anticuerpos y de complejos mayores de histocompatibilidad de clase I monocatenarios, asf como de otras herramientas para la produccion estos anticuerpos se revelan en WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, y en Cohen CJ, Denkberg G, Lev A, Epel M, Reiter Y. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptide-specific, T-cell receptor­ like specificity: new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit. 2003 Sep-Oct;16(5):324-32. ; Denkberg G, Lev A, Eisenbach L, Benhar I, Reiter Y. Selective targeting of melanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificity directed toward a melanoma differentiation antigen. J Immunol. 2003 Sep 1;171(5):2197-207; y en Cohen CJ, Sarig O, Yamano Y, Tomaru U, Jacobson S, Reiter Y. Direct phenotypic analysis of human MHC class I antigen presentation: visualization, quantitation, and in situ detection of human viral epitopes using peptide-specific, MHC-restricted human recombinant antibodies. J Immunol. 2003 Apr 15; 170(8):4349-61.
Preferiblemente el anticuerpo se une al complejo con una afinidad de union inferior a 20 nanomolar, preferentemente a 10 nanomolar, lo cual se considera «espedfico» en el contexto de la presente invencion.
El termino «anticuerpo» se utiliza en la presente memoria en sentido amplio e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. Ademas de las moleculas de inmunoglobulina intactas, el termino «anticuerpos» tambien incluye fragmentos o polfmeros de esas moleculas de inmunoglobulina y versiones humanizadas de moleculas de inmunoglobulina, siempre que posean alguna de las propiedades deseadas (p. ej., ser un anticuerpo espedfico de complejo como el susodicho, administracion de una toxina contra una celula cancerosa que exprese un gen marcador de glioblastoma con un nivel elevado, y/o inhibicion de la actividad de un polipeptido marcador del cancer, como la survivina) descritas en la presente memoria.
Si es posible, los anticuerpos de la invencion se podran adquirir de fuentes comerciales. Los anticuerpos de la invencion tambien se pueden fabricar con metodos consabidos. La persona versada en la tecnica entiende que para generar los anticuerpos dados a conocer se pueden emplear tanto los polipeptidos marcadores del glioblastoma enteros como fragmentos de los mismos. El polipeptido necesario para generar un anticuerpo dado a conocer se puede purificar parcial o completamente de una fuente natural o se puede producir con tecnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, un Ad Nc que codifica un polipeptido de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN, o un fragmento de los mismos, se puede expresar en celulas procariotas (p. ej., bacterias) o celulas eucariotas (p. ej., de levadura, insecto o mairnfero), a partir de las cuales se puede purificar una protema recombinante con la que generar una preparacion de anticuerpo monoclonal o policlonal que se una espedficamente al polipeptido marcador de glioblastoma usado para generar el anticuerpo.
Una persona versada en la tecnica sabra que la generacion de dos o mas conjuntos diferentes de anticuerpos monoclonales o policlonales maximiza la probabilidad de obtener un anticuerpo dotado de la especificidad y la afinidad necesarias para el uso previsto (p. ej., ELISA, inmunohistoqmmica, tecnicas de imagen in vivo, tratamiento con inmunotoxinas). Los anticuerpos son analizados para buscar la actividad deseada con metodos conocidos, de acuerdo con el fin previsto para los anticuerpos (p. ej., ELISA, inmunohistoqmmica, inmunoterapia, etc. ; para mas detalles sobre la generacion y el analisis de anticuerpos, vease por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1988). Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser analizados con pruebas ELISA, inmunotransferencia (Western blot), tincion inmunohistoqmmica de cortes de tejido de glioblastoma congelados o fijados en formol. Despues de la caracterizacion inicial in vitro, los anticuerpos destinados a uso terapeutico o diagnostico in vivo se analizan con metodos de ensayo clmicos conocidos.
El termino «anticuerpo monoclonal» tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion notablemente homogenea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por mutaciones posiblemente naturales que pueden estar presentes en pequeno numero. Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen espedficamente anticuerpos «quimericos» en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase concreta de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es identica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asf como a fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad antagonista deseada (N.° pat. de EE. UU. 4. 816. 567).
Los anticuerpos monoclonales de la invencion se pueden preparar con metodos basados en hibridomas. En el metodo del hibridoma, un raton u otro animal hospedador adecuado es vacunado con un agente inmunizante que estimula a los linfocitos para que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan espedficamente al agente inmunizante. Otra alternativa consiste en inmunizar los linfocitos in vitro.
Los anticuerpos monoclonales tambien se pueden fabricar con metodos de ADN recombinante, como los descritos en la Pat. de EE. UU. N.° 4. 816. 567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invencion puede ser facilmente aislado y secuenciado con procedimientos convencionales (p. ej., con sondas oligonucleotidicas capaces de unirse espedficamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de raton).
Los metodos in vitro tambien son adecuados para la preparacion de anticuerpos monovalentes. La digestion de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, en particular fragmentos Fab, se puede llevar a cabo con tecnicas ordinarias conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la digestion se puede realizar con papama. Ejemplos de la digestion con papama aparecen descritos en WO 94/29348, publicada el 22. 12. 1994 y en la Pat. de EE. UU. N.° 4. 342. 566. La digestion de anticuerpos con papama normalmente produce dos fragmented de union a antigeno identicos llamados fragmentos Fab, cada uno dotado de un sitio de union al antigeno, asf como un fragmento residual Fc. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento que tiene dos sitios de combinacion con antigenos y todav^a es capaz de reconocer antigenos de reactividad cruzada.
Los fragmentos de anticuerpo, esten unidos a otras secuencias o no, tambien pueden incluir inserciones, eliminaciones, sustituciones y otras modificaciones seleccionadas de regiones concretas o de residuos de aminoacidos espedficos, siempre que la actividad de los fragmentos no se vea significativamente alterada o afectada respecto al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo sin modificar. Estas modificaciones pueden ofrecer alguna propiedad adicional, como eliminar o anadir aminoacidos capaces de establecer puentes disulfuro para aumentar la biolongevidad, alterar las caractensticas de secrecion, etc. En cualquier caso el fragmento de anticuerpo debe poseer una propiedad bioactiva, como actividad de union, regulacion de union al dominio de union, etc. Las regiones activas o funcionales del anticuerpo pueden ser identificadas por mutagenesis de una region espedfica de la protema, seguida por la expresion y el analisis del polipeptido expresado. Tales metodos son obvios para toda persona versada en la tecnica, y pueden incluir la mutagenesis dirigida del acido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo.
Los anticuerpos de la invencion tambien pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., de raton) son inmunoglobulinas quimericas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos quimericos de las mismas (como Fv, Fab, Fab' u otras secuencias de union a antfgeno de los anticuerpos) que contienen una pequena secuencia derivada de inmunoglobulinas no humanas. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una region determinante de complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como raton, rata o conejo que esta dotada de la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos estructurales (FR) del fragmento Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados tambien pueden comprender residuos que no estan presentes ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprendera casi la totalidad de al menos uno, y normalmente de dos dominios variables, en los que todas o casi todas las regiones CDR corresponderan a las de la inmunoglobulina no humana y todas o casi todas las regiones FR seran las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado idealmente tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana.
Los metodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la tecnica. En general, a un anticuerpo humanizado se le introducen uno o varios residuos de aminoacidos de origen no humano. Estos residuos de aminoacidos no humanos con frecuencia son denominados residuos «importados», que normalmente se extraen del dominio variable «importado». La humanizacion se puede llevar a cabo basicamente sustituyendo la o las secuencias CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por tanto, tales anticuerpos «humanizados» son anticuerpos quimericos (Pat. EE. UU. N.° 4. 816. 567), en los que una parte notablemente mas pequena que un dominio variable humano intacto ha sido sustituida por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR por residuos de sitios analogos de anticuerpos de roedor.
Se pueden emplear animales transgenicos (p. ej., ratones) que tras la inmunizacion sean capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos sin producir inmunoglobulinas endogenas. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminacion homocigota del gen de la region de union de la cadena pesada del anticuerpo en ratones quimericos y mutantes germinales provoca la inhibicion completa de la produccion endogena de anticuerpos. La transferencia de la matriz genica de la inmunoglobulina de la lmea germinal humana a dichos ratones mutantes de la lmea germinal dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos tras la exposicion al antfgeno. Tambien se pueden producir anticuerpos humanos en fagotecas.
Los anticuerpos de la invencion se administran preferiblemente a un sujeto incorporandolos en un vehteulo farmaceuticamente aceptable. Normalmente a la formulacion se le anade una cantidad apropiada de una sal farmaceuticamente aceptable para que sea isotonica. Ejemplos de vehteulos farmaceuticamente aceptables son solucion salina, solucion de Ringer y solucion de dextrosa. Es preferible que el pH de la solucion este aproximadamente entre 5 y 8, y mas preferiblemente entre 7 y 7,5 aproximadamente. Otros vehteulos incluyen preparaciones de liberacion prolongada como matrices semipermeables de polfmeros hidrofobicos solidos que contengan el anticuerpo, en matrices con forma modelada, p. ej., pelteulas, liposomas o micropartteulas. Para las personas versadas en la tecnica sera evidente que son preferibles ciertos vehteulos dependiendo, por ejemplo, de la via de administracion y de la concentracion del anticuerpo que se va a administrar.
Los anticuerpos se pueden administrar al sujeto, al paciente o a las celulas mediante inyeccion (intravenosa, intraperitoneal, subcutanea, intramuscular, etc.), o con otros metodos como la infusion que aseguren su liberacion efectiva en el torrente sangumeo. Los anticuerpos tambien se pueden administrar por via intratumoral o peritumoral para ejercer un efecto terapeutico a la par sistemico y local. Se prefiere la inyeccion local o intravenosa.
Las dosis y pautas de administracion mas adecuadas se pueden determinar empmcamente; la toma de decisiones a este respecto forma parte de los conocimientos de la materia. Las personas versadas en la materia saben que la dosis de anticuerpos a administrar depende, por ejemplo, del sujeto que va a recibir al anticuerpo, la via de administracion, el tipo concreto de anticuerpo y de otros medicamentos que se le esten administrando. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds. Raven Press, Nueva York (1977) pags. 365-389. La dosis diaria tfpica de anticuerpo cuando se utiliza solo puede oscilar entre 1 pg/kg y 100 mg/kg de peso corporal o mas por dfa, dependiendo de los susodichos factores. Tras la administracion del anticuerpo como tratamiento contra el glioblastoma, su eficacia se puede evaluar de varios modos bien conocidos por el medico especialista. Por ejemplo, se puede controlar el tamano, el numero y/o la distribucion del glioblastoma en el sujeto receptor del tratamiento utilizando tecnicas de imagen oncologicas estandar. Todo anticuerpo administrado con fines terapeuticos que detenga el crecimiento del tumor, reduzca su extension y/o impida la aparicion de nuevos tumores en contraste con la evolucion de la enfermedad si no se produjera la administracion del anticuerpo, es un anticuerpo eficaz para el tratamiento del glioblastoma.
El principio de la terapia antisentido se basa en la hipotesis de que es posible suprimir la expresion genica de secuencias espedficas (ya sea por via transcripcional o traduccional) mediante la hibridacion en el interior de la celula del ADN genomico o del ARNm con una molecula antisentido complementaria a ellos. La formacion de ese acido nucleico bicatenario Idbrido trastoca la transcripcion del ADN genomico que codifica el antfgeno tumoral que constituye la diana, o altera el procesamiento/transporte/traduccion y/o la estabilidad del ARNm del antfgeno tumoral diana.
Los acidos nucleicos antisentido se pueden hacer llegar a las celulas con diversas estrategias. Por ejemplo, a un sujeto se le pueden administrar directamente oligonucleotidos antisentido o ARN antisentido (p. ej., por inyeccion intravenosa) de tal forma que puedan ser absorbidos por las celulas tumorales. Otra alternativa consiste en la introduccion en celulas in vivo de vectores virales o plasmfdicos que codifiquen ARN antisentido (o fragmentos de ARN). Los efectos antisentido tambien se pueden inducir con secuencias codificantes, pero la magnitud de los cambios fenotfpicos es muy variable. Los cambios fenotfpicos inducidos por la terapia antisentido se valoran en funcion de los cambios en, p. ej., las concentraciones del ARNm diana, concentraciones de la protema diana y/o niveles de actividad de dicha protema.
En un ejemplo concreto, la inhibicion de la funcion del marcador/diana del glioblastoma con terapia genica antisentido se puede lograr con la administracion directa de ARN antisentido del marcador del glioblastoma a un sujeto. El ARN antisentido del marcador tumoral se puede producir y aislar con una tecnica estandar, pero se produce mas facilmente con la transcripcion in vitro utilizando un ADNc antisentido del marcador tumoral controlado con un promotor eficiente (p. ej., el promotor de T7). La administracion a celulas del ARN antisentido del marcador tumoral se puede efectuar con cualquiera de los metodos de administracion directa de acidos nucleicos descritos a continuacion.
Una estrategia alternativa para inhibir la funcion de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN con terapia genica implica la expresion intracelular de un anticuerpo anti-BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN o de una porcion de un anticuerpo anti-BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN. Por ejemplo, el gen (o fragmento de gen) que codifica un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente a un polipeptido de BCA, CLIP2, DTNA, NLg Na X, NR2E1, NRCAM y PDPN y que inhibe su actividad biologica se situa bajo el control transcripcional de una secuencia reguladora espedfica (p. ej., espedfica de tejido o de tumor), dentro de un vector de expresion de acidos nucleicos. A continuacion el vector se administra al sujeto de tal modo que es captado por las celulas del glioblastomas u otras celulas, que despues segregaran el anticuerpo anti-BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN y de ese modo bloquearan la actividad biologica del polipeptido de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN. Preferentemente, los polipeptidos de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM y PDPN estaran presentes en la superficie externa de las celulas de glioblastoma.
En los metodos susodichos, que incluyen la administracion y la absorcion de ADN exogeno por las celulas del sujeto (transduccion o transfeccion genica), los acidos nucleicos dados a conocer pueden estar en forma de ADN desnudo o pueden estar incorporados en un vector para suministrar los acidos nucleicos a las celulas e inhibir la expresion de la protema marcadora del glioblastoma. El vector puede estar disponible en una preparacion comercial, como un vector adenovmico (Quantum Biotechnologies Inc., Laval, Quebec, Canada). La liberacion del acido nucleico o del vector en las celulas se puede materializar a traves de varios mecanismos. Como ejemplo, puede ser a traves de liposomas con preparaciones comerciales de liposomas como LIPOFECTIN, LIPOFEcTa MINE (GIBCO- 25 BRL, Inc., Gaithersburg, Maryland, EE. UU.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSfEcTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wisconsin, EE. UU.), asf como otros liposomas desarrollados segun los procedimientos habituales en la tecnica. Asimismo, el acido nucleico o el vector dados a conocer se pueden suministrar in vivo mediante electroporacion, una tecnologfa que ofrece Genetronics, Inc. (San Diego, California, EE. UU.) o mediante un aparato de s OnOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Arizona, EE. UU.).
Como ejemplo, el vector puede ser un sistema viral, como un sistema de vector retrovmco que puede encapsidar un genoma retrovmco recombinante. El retrovirus recombinante infecta las celulas y con ello inocula un acido nucleico antisentido que inhibe la expresion de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM o PDPN. El metodo exacto para introducir el acido nucleico alterado en celulas de mairnfero no se limita al uso de vectores retrovmcos. Existen otras tecnicas comunes para llevar a cabo este procedimiento, tales como vectores adenovmcos, vectores vmcos adenoasociados (AAV), vectores lentivmcos o vectores retrovmcos seudotipados. Tambien se pueden utilizar tecnicas de transduccion ffsica, como liposomas y a traves de receptores y otros mecanismos de endocitosis.
La presente invencion proporciona un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos acorde con la SEQ ID N.° 10.
El peptido de la invencion tiene la capacidad de unirse a una molecula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I.
En la presente invencion el termino «homologo» se refiere al grado de identidad entre las secuencias de dos secuencias de aminoacidos, es decir secuencias peptfdicas o polipeptfdicas. La susodicha «homologfa» se determina comparando las dos secuencias alineadas en condiciones optimas con las secuencias a comparar. Las secuencias que se comparan en la presente memoria pueden tener una adicion o eliminacion (por ejemplo, un hueco o similar) en la alineacion optima de las dos secuencias. La homologfa de secuencia se puede calcular creando una alineacion con el algoritmo ClustalW, por ejemplo, (Nucleic Acid Res., 22(22): 46734680 (1994). Bases de datos publicas proporcionan software para el analisis de secuencias, en concreto, Vector NTI, GENETYX y otras herramientas de analisis.
Una persona versada en la materia sera capaz de valorar si los linfocitos T inducidos por una variante del peptido espedfico seran capaces de reaccionar con el propio peptido (Fong et al., 2001); (Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006; Appay et al., 2006).
Tabla 2: Variantes y motivos de los peptidos acordes con las SEQ ID N.° 1 a 25
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Es sabido que los peptidos que son presentados por MHC de clase II estan compuestos por una «secuencia central» dotada de un secuencia de aminoacidos que se ajusta a cierto motivo espedfico del alelo de HLA y, opcionalmente, de extensiones N- y/o C-terminales que no interfieren con la funcion de la secuencia central (es decir, que se consideran irrelevantes para la interaccion del peptido y todos o una parte de los clones de linfocitos T que reconocen la contrapartida natural). Las extensiones N y/o C-terminales pueden, por ejemplo, tener entre 1 y 10 aminoacidos de longitud, respectivamente. Estos peptidos se pueden utilizar directamente para cargar las moleculas MHC de clase II o bien la secuencia se puede clonar en vectores de acuerdo con la descripcion ofrecida abajo en la presente memoria. Dado que estos peptidos constituyen el producto final del procesamiento de peptidos mas grandes en el interior de la celula, tambien pueden utilizarse peptidos mas largos.
En el caso de los peptidos restringidos a MHC de clase II, la molecula MHC puede presentar varios peptidos distintos dotados de la misma secuencia central. Como la interaccion con el linfocito T reconocedor (cooperador) depende de la secuencia central de 9 a 11 aminoacidos, el mismo clon de linfocito T (cooperador) puede reconocer varias variantes de longitud. Asf pues para la carga directa de moleculas MHC de clase II se pueden usar diversas variantes de longitud de una secuencia de union central sin necesidad de ningun procesamiento adicional ni recortes en los extremos N y C-terminal. En consecuencia, las variantes naturales o artificiales que estimulan la reaccion cruzada de los linfocitos T con un peptido dado a conocer son a menudo variantes de longitud.
Si un peptido mas largo de aproximadamente 12 residuos de aminoacidos se utiliza directamente para unirse a una molecula MHC de clase II, es preferible que los residuos que flanquean la region de union a HLA central sean residuos que no afecten sustancialmente a la capacidad del peptido para unirse espedficamente a la hendidura de union de la molecula MHC de clase II o presentar el peptido al linfocito T (cooperador). No obstante, como se ha indicado arriba, se apreciara que es posible usar peptidos mas grandes, p. ej., los codificados por un polinucleotido, ya que estos peptidos mas grandes pueden ser fragmentados por celulas presentadoras de antfgeno adecuadas. No obstante, en algunos casos se ha demostrado que las regiones que flanquean la secuencia central pueden influir en la union del peptido a la molecula MHC de clase II o en la interaccion del complejo dimerico MHC:peptido con el TCR en ambas direcciones en comparacion con un peptido de referencia dotado de la misma secuencia central. Las estructuras terciarias intramoleculares del peptido (p. ej., bucles) normalmente reducen la afinidad hacia el MHC o el TCR. Las interacciones intermoleculares de las regiones flanqueantes con otras partes del MHC o del TCR aparte de la misma hendidura de union al peptido pueden estabilizar la interaccion. Esos cambios de afinidad pueden ser determinantes para que el peptido de MHC de clase II estimule de forma efectiva la respuesta de los linfocitos T (cooperadores).
Tambien es posible que los epttopos de MHC de clase I, aunque suelen tener entre 8 y 10 aminoacidos de longitud, sean generados por el procesamiento de peptidos o protemas mas largos que incluyen el epttopo real. Se prefiere que los residuos que flanquean el epttopo de interes sean residuos que no afecten sustancialmente a la digestion proteolftica necesaria para exponer el epttopo durante el procesamiento.
Por supuesto, el peptido conforme a la presente invencion tendra la capacidad para unirse a una molecula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II. La union de un peptido o una variante a un complejo MHC puede ser analizada mediante metodos conocidos en la tecnica, como, por ejemplo, los descritos en la bibliograffa para diferentes alelos de MHC de clase II (p. ej. (Vogt et al., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici et al., 1999; Hammer et al., 1995; Tompkins et al., 1993; Boyton et al., 1998)).
En una forma de realizacion de la presente invencion, el peptido es una protema de fusion que comprende, por ejemplo, los 80 aminoacidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antfgeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo “Ii”) tal y como aparece en el NCBI, numero de acceso de GenBank X00497 (Strubin, M. et al. 1984).
Ademas, el peptido puede incluir enlaces no peptfdicos.
En un enlace peptfdico inverso los residuos de aminoacido no estan unidos por enlaces peptfdicos (-CO-NH-) sino que el enlace peptfdico esta invertido. Estos peptidomimeticos retro-inversos pueden sintetizarse con metodos conocidos en la tecnica, como, por ejemplo, los descritos por Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Esta estrategia implica la smtesis de seudopeptidos que contengan cambios en la estructura principal, pero no en la orientacion de las cadenas laterales. Meziere y cols. (1997) demuestran que estos seudopeptidos resultan utiles para la union al MHC y las respuestas de los linfocitos T cooperadores. Los peptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptfdicos CO-NH, son mucho mas resistentes a la proteolisis.
Enlaces no peptfdicos son, por ejemplo: -CH2-NH, -CH2 S-, -CH2 CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2 SO-. La patente de Estados Unidos 4. 897. 445 proporciona un metodo para la smtesis en fase solida de enlaces no peptfdicos (-CH2-NH) en cadenas polipeptfdicas que implica la obtencion de polipeptidos con procedimientos estandar y la smtesis del enlace no peptfdico mediante la reaccion de un aminoaldelddo y un aminoacido en presencia de NaCNBH3.
Un peptido que es modificado o incluye enlaces no peptfdicos es una forma de realizacion preferida de la invencion. En general, los peptidos (al menos aquellos que contienen enlaces peptfdicos entre los residuos de aminoacidos) pueden ser sintetizados utilizando la smtesis de peptidos en fase solida por el metodo de Fmoc-poliamida, como muestra Lu et al. (1981) y las referencias que aparecen en el mismo. La proteccion provisional del grupo N-amino se consigue con el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La escision repetida de este grupo protector muy sensible al pH basico se lleva a cabo con piperidina al 20% en N,N-dimetilformamida. Los grupos funcionales de las cadenas laterales se podnan proteger si se transformaran en eteres de butilo (en el caso de la serina, treonina y tirosina), esteres de butilo (en el caso del acido glutamico y aspartico), derivados butiloxicarbomlicos (en el caso de la lisina y la histidina), derivados tritilados (en el de la cistema) y derivados 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfomlicos (en el de la arginina). Cuando los residuos C-terminales son glutamina o asparragina se utiliza el grupo 4,4'-dimetoxibencidrilo para proteger los grupos funcionales amido de la cadena lateral. El soporte en fase solida se basa en un polfmero de polidimetil-acrilamida constituido por los tres monomeros dimetilacrilamida (monomero estructural), bisacriloiletilendiamina (entrelazante) y acriloilsarcosina metilester (funcionalizador). El agente escindible que mantiene unido el peptido a la resina es un derivado del acido 4-hidroximetilfenoxiacetico, sensible a pH acido. Todos los derivados de aminoacidos se anaden en forma de derivados anhndridos simetricos preformados, salvo la asparragina y la glutamina, que se anaden utilizando un procedimiento de acoplamiento inverso con N, N-diciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desproteccion se controlan con procedimientos de ensayo con ninhidrina, acido trinitrobencenosulfonico o isotina. Una vez completada la smtesis, los peptidos se separan del soporte de resina y al mismo tiempo se eliminan los grupos protectores de las cadenas laterales mediante el tratamiento con acido trifluoroacetico al 95% con una mezcla de capturadores (scavengers) al 50%. Los capturadores utilizados normalmente son etanditiol, fenol, anisol y agua, dependiendo de la eleccion exacta de los aminoacidos constituyentes del peptido que se esta sintetizando. La smtesis de peptidos tambien es posible combinando metodologfas de fase solida y de fase en solucion (vease, por ejemplo, Bruckdorfer et al., 2004, y las referencias citadas en la misma).
El acido trifluoroacetico se elimina por evaporacion en vacfo y se procede a la trituracion con dietileter para obtener el peptido bruto. Todos los capturadores (scavengers) se eliminan con un procedimiento de extraccion simple que con la liofilizacion de la fase acuosa proporciona el peptido bruto exento de ellos. Los reactivos para la smtesis de peptidos se pueden conseguir en general, por ejemplo, de Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Reino Unido.
La purificacion puede llevarse a cabo mediante una sola o una combinacion de tecnicas como la recristalizacion, cromatograffa por exclusion de tamano, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa por interaccion hidrofobica, y (normalmente) cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento con fase inversa utilizando, p. ej., la separacion con gradiente de acetonitrilo/agua.
El analisis de los peptidos puede efectuarse utilizando cromatograffa en capa fina, electroforesis, en particular electroforesis capilar, extraccion en fase solida (CSPE), cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento con fase inversa, analisis de aminoacidos tras hidrolisis acida y analisis con espectrometna de masas por bombardeo con atomos rapidos (FAB), asf como analisis con espectrometna de masas MALDI y ESI-Q-TOF.
Otro aspecto de la invencion proporciona un acido nucleico (por ejemplo, un polinucleotido) que codifica un peptido de la invencion. El polinucleotido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, ARN o combinaciones de los mismos, monocatenarios y/o bicatenarios, o formas nativas o estabilizadas de polinucleotidos, como por ejemplo, polinucleotidos con un esqueleto de fosforotioato, y que puede contener intrones siempre que codifique el peptido. Por supuesto, solo los peptidos que contengan residuos de aminoacidos naturales unidos por enlaces peptfdicos naturales pueden ser codificados por un polinucleotido. Otro aspecto mas de la invencion proporciona un vector de expresion capaz de expresar un polipeptido conforme a la invencion.
Se han desarrollado diversos metodos para unir polinucleotidos, especialmente ADN, a vectores, por ejemplo, a traves de extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, al segmento de ADN se le pueden anadir prolongaciones de homopolfmeros complementarios para insertarlo en el vector de ADN. El vector y el segmento de ADN se unen a continuacion por medio de puentes de hidrogeno entre las colas homopolimericas complementarias para formar moleculas de ADN recombinante.
Otro metodo alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores son los ligadores sinteticos que contienen uno o mas sitios de restriccion. Existen ligadores sinteticos comerciales que contienen diversas dianas para las endonucleasas de restriccion que facilitan varios proveedores como International Biotechnologies Inc. New Haven, Connecticut, EE. UU.
Un metodo deseable para modificar el ADN que codifica el polipeptido de la invencion emplea la reaccion en cadena de la polimerasa tal y como exponen Saiki et al., (1988). Este metodo puede ser utilizado para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo, disenando las dianas de restriccion adecuadas, o puede ser empleado para modificar el ADN de otros modos utiles conocidos en la tecnica. Si se opta por vectores virales, son preferibles los vectores poxvmicos o adenovmicos.
El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovmcos) se puede expresar en un hospedador adecuado para producir un polipeptido que comprenda el peptido de la invencion. Asf pues, el ADN que codifica el peptido de la invencion puede ser utilizado conforme a tecnicas conocidas, modificado adecuadamente siguiendo las ensenanzas contenidas en la presente memoria para construir un vector de expresion que se emplee para transformar una celula hospedadora a fin de que exprese y produzca el polipeptido de la invencion. Tales tecnicas incluyen las descritas en las patentes de EE. UU. N.° 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 y 4.810.648.
El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovmcos) que codifica el polipeptido que constituye el compuesto de la invencion se puede unir con una amplia variedad de secuencias de ADN distintas para introducirlo en un hospedador adecuado. El ADN acompanante dependera de la naturaleza del hospedador, el modo de introducir el ADN en su interior y de si se pretende que se integre o que se mantenga como un episoma.
En general, el ADN se inserta en un vector de expresion, como un plasmido, con la orientacion apropiada y el marco de lectura correcto para asegurar la expresion. Si es necesario, el ADN se puede enlazar con secuencias nucleotfdicas de control que regulan la transcripcion o la traduccion y que son reconocidas por el hospedador deseado, aunque en general tales controles ya suelen estar incluidos en el propio vector de expresion. A continuacion, el vector se introduce en el hospedador mediante tecnicas estandar. En general, el vector no consigue transformar todos los hospedadores, lo que hara necesario seleccionar las celulas hospedadoras que hayan quedado transformadas. Una tecnica de seleccion consiste en incorporar en el vector de expresion una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios que codifique un rasgo seleccionable en la celula transformada, como, por ejemplo, de resistencia a antibioticos.
Otra alternativa consiste en incorporar el gen de ese rasgo seleccionable en otro vector con el que se cotransforma la celula hospedadora.
Las celulas hospedadoras que hayan sido transformadas con el ADN recombinante de la invencion se cultivaran durante el tiempo suficiente y en las condiciones apropiadas que las personas versadas en la tecnica conocen a la vista de las ensenanzas reveladas en la presente memoria para que el polipeptido pueda expresarse y, finalmente, ser recuperado.
Son muchos los sistemas de expresion conocidos, como bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, etc.), hongos filamentosos (genero Aspergillus, etc.), celulas vegetales, animales o de insectos. Preferiblemente el sistema consistira en celulas de mairnfero, como las celulas CHO disponibles de la ATCC Cell Biology Collection.
Un tfpico vector plasmfdico de expresion constitutiva para celulas de mamffero comprende el promotor del CMV o del SV40 con una cola poli-A adecuada y un marcador de resistencia como la neomicina. Un ejemplo es el pSVL que ofrece Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. Uu . Un ejemplo de vector de expresion inducible para mamffero es el pMSG, tambien suministrado por Pharmacia. Otros vectores plasmfdicos de levadura son pRS403-406 y pRS413-416, en general provefdos por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Los plasmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plasmidos integrativos de levadura (YIp) que incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plasmidos pRS413-416 son plasmidos centromericos de levadura (Ycp). Los vectores dotados del promotor del CMV (por ejemplo, de Sigma-Aldrich) proporcionan una expresion transitoria o estable, expresion en el citoplasma o secrecion, y marcaje de los extremos N-terminal o C-terminal en varias combinaciones de FLAG, 3xFLAg , c-myc o MAT. Estas protemas de fusion permiten la deteccion, la purificacion y el analisis de la protema recombinante. Las fusiones con doble etiqueta aportan flexibilidad a la deteccion.
La potente region reguladora del promotor del citomegalovirus (CMV) humano ofrece niveles de expresion constitutiva de la protema muy elevados, de hasta 1 mg/l en celulas COS. En estirpes celulares menos potentes los niveles de protemas suelen rondar ~0,1 mg/l. La presencia del origen de replicacion del SV40 genera niveles elevados de replicacion del ADN en celulas COS que toleran la replicacion del SV40. Los vectores de CMV, por ejemplo, pueden contener el origen pMB1 (derivado del pBR322) para la replicacion en celulas bacterianas, el gen de la b-lactamasa para la seleccion por resistencia a la ampicilina, hGH poliA, y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia lfder de la preprotripsina (PPT) pueden canalizar la secrecion de las protemas de fusion FLAG hacia el medio de cultivo, donde se pueden purificar por medio de anticuerpos ANTI-FLAG, resinas y placas. En la tecnica se conocen otros vectores y sistemas de expresion aptos para el uso con una variedad de celulas hospedadoras.
La presente invencion tambien se refiere a una celula hospedadora transformada con un vector polinucleotfdico de la presente invencion. La celula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las celulas bacterianas pueden ser las celulas hospedadoras procariotas mas adecuadas en determinadas circunstancias; normalmente son cepas de E. coli, como, por ejemplo, las cepas DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, Maryland, EE. UU., y RR1 disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, Maryland, EE. UU. (N.° ATCC 31343). Las celulas hospedadoras eucariotas preferidas son celulas de levadura, de insecto y de marnffero, preferiblemente celulas de vertebrado como estirpes celulares de colon y de fibroblastos de raton, rata, mono o ser humano. Las celulas hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que en general estan disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Las celulas hospedadoras de mamffero preferidas incluyen las celulas de ovario de hamster chino (CHO) disponibles de la ATCC como CCL61, las celulas embrionarias de raton suizo NIH/3T3 disponibles de la ATCC como CRL 1658, las celulas COS-1 de rinon de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650 y las celulas 293, que son celulas renales embrionarias humanas. Las celulas de insecto preferidas son las celulas Sf9 que se pueden transfectar con vectores de expresion baculovmicos.
Se puede encontrar una revision general referente a la eleccion de las celulas hospedadoras mas adecuadas, por ejemplo, en el manual de Paulina Balbas y Argelia Lorence “Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols” Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, y otra bibliograffa conocida por las personas versadas en la materia.
La transformacion de las celulas hospedadoras adecuadas con el constructo de ADN de la presente invencion se consuma con metodos consabidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. En lo referente a la transformacion de celulas hospedadoras procariotas, veanse, por ejemplo, Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, y Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. La transformacion de celulas de levadura aparece descrita en Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. El metodo de Beggs (1978) Nature 275,104-109 tambien resulta util. En lo que concierne a los reactivos adecuados para transfectar las celulas de vertebrados, por ejemplo, el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE. UU. La electroporacion tambien es util para la transformacion y/o la transfeccion de las celulas y es perfectamente conocida su aplicacion en la transformacion de celulas de levadura, bacteria, insecto y vertebrado.
Las celulas transformadas con exito, es decir, las que contengan un constructo de ADN de la presente invencion, se pueden identificar con tecnicas bien conocidas como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la protema en el sobrenadante por medio de anticuerpos.
Se apreciara que ciertas celulas hospedadoras de la invencion son utiles para la preparacion de peptidos de la invencion, por ejemplo, las celulas bacterianas, de levadura e insecto. Con todo, para ciertos metodos terapeuticos pueden ser utiles otras celulas hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar celulas presentadoras de antfgeno como las celulas dendnticas para expresar los peptidos de la invencion de tal forma que puedan ser cargados en las moleculas MHC oportunas. Asf pues, la presente invencion proporciona una celula hospedadora que comprende un acido nucleico o un vector de expresion conforme a la invencion.
En una forma de realizacion preferida la celula hospedadora es una celula presentadora de antfgeno, en particular una celula dendntica o celula presentadora de antfgeno. Las APC cargadas con una protema de fusion recombinante que contiene fosfatasa acida prostatica (PAP) son en la actualidad objeto de investigacion como tratamiento contra el cancer de prostata (Sipuleucel-T) (Small EJ et al. 2006; Rini et al. 2006).
Otro aspecto de la invencion proporciona un metodo para la produccion de un peptido, comprendiendo dicho metodo el cultivo de una celula hospedadora y el aislamiento del peptido a partir de dicha celula o de su medio de cultivo. En otra forma de realizacion el peptido, el acido nucleico o el vector de expresion de la invencion se emplean en medicina. Por ejemplo, el peptido puede ser preparado para la inyeccion por via intravenosa (i. v.), subcutanea (s. c.), intradermica (i. d.), intraperitoneal (i. p.) o intramuscular (i. m.). Los metodos preferidos para la inyeccion del peptido incluyen s. c., i. d., i. p., i. m. e i. v. Los metodos preferidos para la inyeccion del ADN incluyen i. d., i. m., s. c., i. p. e i. v. Segun el peptido o ADN de que se trate se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 50 pg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 pg a 500 pg de peptido o ADN. Dosis en esos intervalos se han empleado en ensayos anteriores (Brunsvig et al. 2006; Staehler et al. 2007).
Otro aspecto de la presente invencion incluye un metodo in vitro para producir linfocitos T activados, comprendiendo dicho metodo la puesta en contacto en condiciones in vitro de linfocitos T con moleculas MHC humanas de clase I cargadas con antfgeno expresadas en la superficie de una celula presentadora de antfgeno adecuada por tiempo suficiente para activar los linfocitos T de una manera espedfica de antfgeno, siendo el antfgeno un peptido conforme a la invencion. Preferentemente se emplea una cantidad suficiente del antfgeno con una celula presentadora de antfgeno.
Cuando se este utilizando como antfgeno un epftopo de MHC de clase II, los linfocitos T seran linfocitos cooperadores CD4-positivos, preferiblemente del tipo Tm. Las moleculas MHC de clase II se pueden expresar en la superficie de cualquier celula adecuada. Preferiblemente la celula no debe expresar de forma natural moleculas MHC de clase II (de ser asf, la celula tendra que ser transfectada para que exprese dicha molecula). Si, en cambio, la celula expresa de forma natural moleculas MHC de clase II es preferible que sea defectuosa en los mecanismos de procesamiento o presentacion de antfgenos. De ese modo sera posible que la celula que expresa la molecula MHC de clase II quede completamente cargada con el antfgeno peptfdico escogido antes de activar el linfocito T. La celula presentadora de antfgeno (o celula estimuladora) normalmente posee moleculas MHC de clase II en su superficie y es preferible que sea basicamente incapaz de cargar dicha molecula de MHC de clase II con el antfgeno seleccionado. La molecula MHC de clase II puede cargarse facilmente in vitro con el antfgeno seleccionado.
Preferiblemente, la celula de mairnfero carece del transportador de peptidos TAP o bien este se presenta en un nivel reducido o funciona defectuosamente. Las celulas adecuadas que carecen del transportador de peptidos TAP incluyen las celulas T2, RMA-S y de Drosophila. TAP es el transportador relacionado con el procesamiento de los antfgenos.
La estirpe celular humana deficiente en carga de peptidos T2 esta disponible en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE. UU. con el N.° de catalogo CRL 1992; la estirpe de celulas de Drosophila “Schneider line 2” esta disponible en la ATCC con el N.° de catalogo CRL 19863; la estirpe de celulas de raton RMA-S esta descrita en Karre et al. 1985.
Preferentemente, la celula hospedadora no expresa sustancialmente moleculas MHC de clase I antes de la transfeccion. Tambien es preferible que la celula estimuladora exprese una molecula importante que proporcione una senal coestimuladora para los linfocitos T, como B7. 1, B7. 2, ICAM-1 y LFA 3. Las secuencias de acidos nucleicos de numerosas moleculas MHC de clase I y de las moleculas co-estimuladoras estan disponibles publicamente en las bases de datos GenBanky EMBL.
De forma similar, si se utiliza como antigeno un epftopo de MHC de clase I, los linfocitos T seran CTL CD8-positivos. Si una celula presentadora de antigeno es transfectada para expresar un epftopo de ese tipo, la celula comprendera preferentemente un vector de expresion capaz de expresar un peptido que contenga la SEQ ID N.° 10.
Existen otros metodos para generar CTL in vitro. Por ejemplo, los metodos descritos en Peoples et al. (1995) y Kawakami et al. (1992) emplean linfocitos autologos infiltrados en el tumor para generar los CTL. Plebanski et al. (1995) recurren a linfocitos autologos de sangre periferica (PLB) para la preparacion de los CTL. Jochmus et al. (1997) describen la produccion de CTL autologos estimulando celulas dendnticas con el peptido o el polipeptido, o a traves de la infeccion con virus recombinantes. Hill et al. (1995) y Jerome et al. (1993) emplean linfocitos B para la produccion de CTL autologos. Asimismo, para la preparacion de CTL autologos se pueden usar macrofagos estimulados con peptido o polipeptido o infectados con virus recombinantes. S. Walter et al. 2003 describen la sensibilizacion in vitro de linfocitos T mediante celulas presentadoras de antfgeno artificiales (aAPC), que es otro modo adecuado para generar linfocitos T contra el peptido de eleccion. En este estudio, las aAPC se generaron adhiriendo complejos MHC:peptido preformados a la superficie de partfculas de poliestireno (microperlas) mediante tecnicas con biotina:estreptavidina. Este sistema permite controlar con exactitud la densidad de m Hc en las aAPC, lo que permite desencadenar respuestas de linfocitos T espedficas de antfgeno con una avidez alta o baja a partir de muestras de sangre de una forma selectiva y altamente eficaz. Ademas de los complejos MHC:peptido, las aAPC deben incorporar acopladas en su superficie otras protemas con actividad co-estimuladora como anticuerpos anti-CD28. Tales sistemas de aAPC tambien precisan a menudo el concurso de factores solubles adecuados, por ejemplo, citocinas como la interleucina-12.
Para la preparacion de linfocitos T tambien se pueden utilizar celulas alogenicas; en WO 97/26328 se describe detalladamente un metodo. Por ejemplo, ademas de celulas de Drosophila y celulas T2, para presentar antfgenos se pueden usar otras celulas tales como celulas CHO, celulas de insecto infectadas con baculovirus, bacterias, levaduras, celulas diana infectadas con virus vacunal. Asimismo, se pueden utilizar virus vegetales (vease, por ejemplo, Porta et al. (1994), que describen el desarrollo del virus del mosaico del cfucharo como sistema de alto rendimiento para la presentacion de peptidos extranos).
Los linfocitos T activados que estan dirigidos contra los peptidos de la invencion son utiles como tratamiento. Asf pues, otro aspecto de la invencion proporciona linfocitos T activados obtenibles por los susodichos metodos de la invencion.
Los linfocitos T activados producidos con el susodicho metodo reconoceran selectivamente una celula que expresa de forma aberrante un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID N.° 10.
Preferiblemente el linfocito T reconoce la celula interaccionando a traves de su TCR con el complejo HLA/peptido, por ejemplo, uniendosele. Los linfocitos T son utiles en un metodo para destruir celulas diana en un paciente cuyas celulas diana expresen de forma aberrante un polipeptido que comprenda una secuencia de aminoacidos de la invencion y al cual se le administre un numero eficaz de linfocitos T activados. Los linfocitos T que se le administren pueden proceder del mismo paciente y ser activados del modo antes descrito, es decir, ser linfocitos T autologos. Otra alternativa consiste en que los linfocitos T no sean del paciente y procedan de otro individuo. Por supuesto, es preferible que dicho individuo este sano. Por «individuo sano» los inventores entienden un individuo que goce de buen estado de salud general, preferentemente con un sistema inmunitario competente y, mas preferentemente, no sufra ninguna enfermedad que analizada se le detecte.
En condiciones in vivo, las celulas diana de los linfocitos T CD4-positivos conformes con la presente invencion pueden ser celulas del tumor (que a veces expresan MHC de clase II) y/o celulas estromales circundantes al tumor (celulas tumorales) (que en ocasiones tambien expresan MHC de clase II (Dengjel et al., 2006)).
Los linfocitos T de la presente invencion se pueden usar como principios activos de una composicion terapeutica. Por tanto, la invencion tambien da a conocer un metodo para destruir celulas diana en un paciente cuyas celulas diana expresan de forma aberrante un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de la invencion, comprendiendo dicho metodo la administracion al paciente de un numero eficaz de linfocitos T como los definidos arriba.
Por «expresado de forma aberrante» los inventores tambien quieren decir que el polipeptido esta sobreexpresado en comparacion con los niveles normales de expresion o que el gen esta reprimido en el tejido del que deriva el tumor pero en cambio se expresa en este. Por «sobreexpresado» los inventores quieren decir que el nivel del polipeptido es como irftnimo 1,2 veces mayor que el nivel en el tejido normal; preferiblemente como mmimo 2 veces mayor, y mas preferiblemente como mmimo 5 o 10 veces mayor que el del tejido normal.
Los linfocitos T se pueden obtener por metodos conocidos en la materia, como, por ejemplo, los antes descritos.
Los protocolos para la llamada transferencia de linfocitos T a un receptor son perfectamente conocidos en la materia y se pueden encontrar, por ejemplo, en (Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1988; Dudley et al., 2002; Yee et al., 2002; Dudley et al., 2005); revisados en (Gattinoni et al., 2006) y (Morgan et al., 2006).
Cualquier molecula de la invencion, ya sea peptido, acido nucleico, vector de expresion, celula, CTL activado, receptor de linfocito T o el acido nucleico que lo codifique, es util para el tratamiento de trastornos caracterizados por celulas que eluden la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, cualquier molecula de la presente invencion puede ser utilizada como medicamento o en la fabricacion de un medicamento. La molecula puede ser utilizada sola o combinada con otra molecula o moleculas de la invencion o con cualquier o cualesquier moleculas conocidas.
Preferiblemente, el medicamento de la presente invencion es una vacuna. La vacuna puede administrarse directamente al paciente, en el organo afectado o por via sistemica de forma i.d., i.m, s.c., i.p. e i.v., o aplicarse ex vivo a celulas derivadas del paciente o a una lmea celular humana que despues se administra al paciente, o utilizarse in vitro para seleccionar una subpoblacion de celulas inmunitarias derivadas del paciente que despues se le vuelven a administrar. Si el acido nucleico se administra a celulas in vitro, puede ser util que estas celulas sean transfectadas para que expresen simultaneamente citocinas inmunoestimuladoras, como la interleucina-2. El peptido puede ser sustancialmente puro, o combinarse con un adyuvante inmunoestimulador (vease abajo) o utilizarse en combinacion con citocinas inmunoestimuladoras, o bien administrarse mediante otro sistema de liberacion adecuado, como, por ejemplo, liposomas. El peptido tambien se puede conjugar con un portador adecuado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el manano (veanse WO 95/18145 y Longenecker et al. (1993)). El peptido tambien se puede etiquetar, o puede ser una protema de fusion, o ser una molecula Idbrida. Se espera que los peptidos cuya secuencia se ofrece en la presente invencion estimulen a los linfocitos T CD8. No obstante, la estimulacion de los CTL CD8 es mas eficiente si cuentan con la ayuda de los linfocitos T cooperadores CD4. Asf pues, los epftopos de MHC de clase I que estimulan a los CTL CD8, el companero de fusion o las secciones de una molecula Idbrida adecuada proporcionan epftopos que estimulan a los linfocitos T CD4-positivos. Los epftopos estimuladores de los CD4 y los CD8 son bien conocidos en la tecnica e incluyen los identificados y dados a conocer.
En un aspecto, la vacuna comprende al menos un peptido dotado de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID N.° 10 y al menos otro peptido adicional, preferiblemente dos a 50, mas preferiblemente dos a 25, incluso mas preferiblemente dos a 15 y lo mas preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o trece peptidos. Los peptidos pueden derivar de uno o mas TAA espedficos y se pueden unir a moleculas MHC de clase I y/o II.
El polinucleotido puede ser sustancialmente puro, o estar contenido en un vector o en un sistema de liberacion adecuado. El acido nucleico puede ser ADN, ADNc, ARN o una combinacion de los mismos. Los metodos para disenar e introducir ese acido nucleico son bien conocidos por los expertos en la materia. Se puede consultar una revision general, por ejemplo, en Pascolo S. 2006; Stan R. 2006, o A Mahdavi 2006. Las vacunas polinucleotfdicas son faciles de preparar, pero el mecanismo por el cual tales vectores inducen la respuesta inmunitaria no se conoce con exactitud. Los vectores y sistemas de liberacion adecuados incluyen los de ADN y/o ARN viral, como los sistemas basados en adenovirus, virus vacunal, retrovirus, herpesvirus, virus adeno-asociados o Idbridos que contienen elementos de varios virus. Los sistemas de liberacion no virales incluyen ftpidos cationicos y poftmeros cationicos que son bien conocidos como tecnicas para la introduccion de ADN. Los metodos de introduccion ffsicos, como la «pistola genica», tambien pueden utilizarse. El peptido o peptidos codificados por el acido nucleico pueden ser una protema de fusion, por ejemplo, con un epftopo que estimule los linfocitos T para el respectivo CDR opuesto tal y como se ha indicado antes.
El medicamento de la invencion tambien puede incluir uno o varios adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que potencian o estimulan de forma inespedfica la respuesta inmunitaria (p. ej., respuestas inmunitarias mediadas por CTL y linfocitos T cooperadores (Th) contra un antfgeno, y podnan ser considerados utiles en el medicamento de la presente invencion. Entre los adyuvantes adecuados se incluyen, entre otros: 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, ligandos de flagelina o TLR5 derivados de flagelina, ligando de FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, imiquimod (ALDARA), resimiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferon alfa o beta o derivados pegilados de los mismos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune, LipoVac, MALP2, MF59, ftpido monofosforilo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vectores PepTel®, micropartmulas de dextrano y PLG, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partmulas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estimulon QS21 de Aquila, que deriva de la saponina, extractos de micobacterias y mimeticos sinteticos de la pared bacteriana, y otros adyuvantes patentados como Detox de Ribi, Quil o Superfos. Se prefieren los adyuvantes como el adyuvante de Freund o el GM-CSF. Con anterioridad se han descrito varios adyuvantes inmunologicos (p. ej., MF59) espedficos para las celulas dendnticas, asf como la preparacion de los mismos (Dupuis M et al. 1998; Allison 1998). Tambien se pueden usar citocinas. A varias citocinas se las ha atribuido una influencia directa en la migracion de las celulas dendnticas hacia los tejidos linfoides (p. ej., el TNF-a), como parte de un proceso que acelera su maduracion hasta convertirlas en celulas presentadoras de antigeno para los linfocitos T (p. ej., GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Patente de EE. UU. N.° 5. 849. 589) y en el que actuan como inmunoadyuvantes (p. ej., la IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al. 1996).
Tambien se ha descrito que los oligonucleotidos de CpG inmunoestimuladores potencian los efectos de los adyuvantes en las vacunas. Sin limitarse a la teona, los oligonucleotidos de CpG actuan activando el sistema inmunitario innato (no adaptativo) a traves de los receptores de tipo Toll (TLR), principalmente el TLR9. La activacion del TLR9 desencadenada por los CpG potencia las respuestas humorales y celulares espedficas de antigeno contra una amplia gama de antigenos, incluidos antigenos peptfdicos o proteicos, virus vivos o muertos, vacunas de celulas dendnticas, vacunas de celulas autologas y conjugados de polisacaridos, tanto en vacunas profilacticas como terapeuticas. Mas importante aun, potencian la maduracion y la diferenciacion de las celulas dendnticas, lo cual resulta en una mayor activacion de los linfocitos Thi y una generacion mas potente de linfocitos T citotoxicos (CTL), incluso sin la ayuda de los linfocitos T CD4. La tendencia hacia la respuesta Thi provocada por la estimulacion del TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes vacunales como el aluminio o el adyuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promueven un sesgo hacia la respuesta Th2. Los oligonucleotidos de CpG muestran incluso una mayor actividad adyuvante cuando se formulan o administran conjuntamente con otros adyuvantes o en formulaciones como micropardculas, nanopartfculas, emulsiones de lfpidos o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta potente cuando el antfgeno es relativamente debil. Tambien aceleran la respuesta inmunitaria y permiten reducir las dosis de antfgeno aproximadamente en dos ordenes de magnitud, habiendose obtenido en algunos experimentos respuestas de anticuerpos comparables a las conseguidas con la dosis completa de vacuna sin CpG (Krieg et al. 2006). La patente de EE. UU. N.° 6. 406. 705 B1 describe el uso combinado de oligonucleotidos de CpG, adyuvantes sin acidos nucleicos y un antfgeno para inducir una respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno. Un componente preferido de la composicion farmaceutica de la presente invencion es un antagonista CpG del TLR9 conocido como dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble), fabricado por Mologen (Berlin, Alemania). Tambien se pueden utilizar otras moleculas que se unen a los TLR como ARN que se unen a TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9.
Entre los ejemplos de adyuvantes utiles tambien se incluyen CpG modificados qmmicamente (p. ej., CpR, Idera), analogos de ARNdc como poli(I:C) y AmpliGen, ARN o ADN bacteriano sin CpG, asf como anticuerpos y moleculas pequenas inmunoactivas como ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, sorafenib, temozolomida, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 y SC58175, que pueden actuar de forma terapeutica y/o como adyuvantes. Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y de aditivos utiles en el contexto de la presente invencion pueden ser determinadas facilmente por las personas versadas en la tecnica sin demasiada experimentacion. Los adyuvantes preferidos son dSLIM, interferones alfa o beta, CpG7909, IC31, imiquimod, PeviTer, ARN, tadalafilo, temozolomida y JuvImmune. Los adyuvantes preferidos son dSLIM, BCG, OK432, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, interferon alfa, PeviTer y JuvImmune o combinaciones de los anteriores.
En una forma de realizacion preferida de la composicion farmaceutica dada a conocer, el adyuvante se selecciona del grupo consistente en factores estimuladores de colonias, como el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF, sargramostim), imiquimod, resiquimod e interferon alfa.
En otra forma de realizacion mas preferida de la composicion farmaceutica dada a conocer, el adyuvante es imiquimod o resiquimod. En otra forma de realizacion aun mas preferida de la composicion farmaceutica dada a conocer, el adyuvante es la combinacion de GM-CSF e imiquimod.
Esta composicion esta destinada a la administracion parenteral, como por via subcutanea, intradermica o intramuscular, o bien para la administracion oral. Para ello, los peptidos y opcionalmente otras moleculas se disuelven o se suspenden en un veldculo farmaceuticamente aceptable, preferiblemente acuoso. Ademas, la composicion puede contener excipientes, tales como tampones, aglutinantes, disgregantes, diluyentes, saborizantes, lubricantes, etc. Los peptidos tambien se pueden administrar junto con sustancias inmunoestimuladoras, como citocinas. En una composicion tal se puede usar una amplia lista de excipientes, como, por ejemplo, los tomados de A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3th Ed., 2000, American Pharmaceutical Association y Pharmaceutical Press. La composicion se puede utilizar para la prevencion, profilaxis y/o tratamiento de enfermedades adenomatosas o cancerosas.
La presente invencion proporciona un medicamento que es util para el tratamiento del cancer, en particular del glioma y del cancer cerebral, cancer de mama, cancer de prostata, cancer de esofago, cancer colorrectal, cancer renal, cancer de pancreas, carcinomas espinocelulares y neoplasias queratinodticas de la piel, leucemia, cancer de pulmon, cancer de ovario y melanoma.
La presente invencion incluye un equipo, que comprende:
(a) un envase que contiene una composicion farmaceutica , como la antes descrita, en forma de solucion o liofilizado; y (b) un segundo envase que contiene un diluyente o una solucion de reconstitucion para la formulacion liofilizada .
El equipo puede comprender, ademas, uno o mas de los siguientes componentes: (III) un tampon, (IV) un diluyente, (V) un filtro, (VI) una aguja, o (V) una jeringa. El envase es preferiblemente un frasco, un vial, una jeringa o un tubo de ensayo; puede ser un envase multiusos. Se prefiere que la composicion farmaceutica este liofilizada.
Los equipos de la presente invencion comprenden, preferiblemente, una formulacion liofilizada de la presente invencion en un envase adecuado e instrucciones para su reconstitucion y/o uso. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales (p. ej., viales con doble camara), jeringas (como jeringas con doble camara) y tubos de ensayo. El envase puede estar formado por materiales diversos como vidrio o plastico. Preferiblemente el kit y/o envase contienen o van acompanados de instrucciones de reconstitucion y/o uso. Por ejemplo, el prospecto puede indicar que la formulacion liofilizada debe reconstituirse para obtener ciertas concentraciones de peptidos como las descritas en paginas precedentes. La etiqueta puede indicar, ademas, que la formulacion puede administrarse o esta destinada a la administracion subcutanea.
El envase que contiene la formulacion puede ser un vial multiuso que permita varias administraciones (p. ej., de 2 a 6 administraciones) de la formulacion reconstituida. El equipo puede comprender, ademas, un segundo envase que contenga un diluyente adecuado (p. ej., una solucion de bicarbonato sodico).
Despues de mezclar el diluyente y la formulacion liofilizada, la concentracion final del peptido en la formulacion reconstituida es preferiblemente como mmimo de 0,15 mg/ml/peptido (=75 |jg) y preferiblemente como maximo de 3 mg/ml/peptido (=1500 jg). El equipo puede incluir, ademas, otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, tales como otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.
Los equipos de la presente invencion pueden tener un solo envase que contenga la formulacion de las composiciones farmaceuticas acordes con la presente invencion, acompanado o no de otros componentes (p. ej., otros compuestos o composiciones farmaceuticas de estos otros compuestos) o pueden contar con un envase distinto para cada componente.
Preferiblemente, los equipos de la invencion incluyen una formulacion de la invencion acondicionada para ser utilizada y administrada conjuntamente con un segundo compuesto (como adyuvantes (p. ej., GM-CSF), un agente de quimioterapia, un producto natural, una hormona o un antagonista, un inhibidor o agente anti-angiogenia, un inductor de la apoptosis o un quelante) o una composicion farmaceutica de los mismos. Los componentes del equipo pueden estar preagrupados o cada componente puede estar en un envase separado antes de la administracion al paciente. Los componentes del equipo pueden proporcionarse en una o varias soluciones lfquidas, preferiblemente en una solucion acuosa y, con mayor preferencia, en una solucion acuosa esteril. Los componentes del equipo tambien pueden facilitarse en forma de solidos, y pueden convertirse en lfquidos anadiendo los disolventes adecuados, que preferiblemente se proporcionan en otro envase distinto.
El envase de un equipo terapeutico puede ser un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa, o cualquier otro medio para contener un solido o lfquido. Si hay mas de un componente, normalmente el equipo contendra un segundo vial u otro envase para permitir la dosificacion por separado. El equipo tambien puede contener otro envase para un lfquido farmaceuticamente aceptable. Preferiblemente el equipo terapeutico contendra un aparato (p. ej., una o varias agujas, jeringas, cuentagotas, pipeta, etc.) para permitir la administracion de los agentes de la invencion que son componentes del presente equipo.
La presente formulacion puede ser toda aquella que sea adecuada para la administracion de los peptidos a traves de cualquier via aceptable como la oral (enterica), nasal, oftalmica, subcutanea, intradermica, intramuscular, intravenosa o transdermica. Se prefiere la administracion subcutanea y, con mayor preferencia, la intradermica. Se puede utilizar una bomba de infusion para la administracion.
A continuacion. se describira la presente invencion con los ejemplos y figuras siguientes que muestran las formas de realizacion preferidas de la misma a tftulo ilustrativo, sin que con ello se pretenda limitar la invencion.
Figura 1: Ejemplo de espectro de masas de IGF2BP3-001 que demuestra su presentacion en la muestra GB6010 de tumor primario. Se llevo a cabo una cromatograffa de lfquidos acoplada a espectrometna de masas nanoESI con una mezcla de peptidos eluida de la muestra de glioblastoma GB6010. El cromatograma de masas de m/z 536.3238 ± 0,001 Da, z = 2 muestra un pico de peptido en el tiempo de retencion 49,89 min. B). El pico detectado en el cromatograma de masa a los 48,76 min revelo una senal de m/z 536,3239 en el espectro de EM. C) El espectro de masas resultante de la desintegracion inducida por colisiones del precursor seleccionado m/z 536.3239 registrado en el experimento de CL-EM nanoESI en el tiempo de retencion indicado confirmo la presencia de IGF2BP3-001 en la muestra tumoral GB6010. D) Para verificar la secuencia se registro el patron de fragmentacion del peptido de referencia sintetico IGF2BP3-001 y se comparo con el patron de fragmentacion generado por el TUMAp natural mostrado en C.
La Figura 2a muestra los perfiles de expresion de ARNm de protemas seleccionadas en muestras de tejidos normales y en 19 muestras de glioblastoma.
La Figura 2b muestra los perfiles de expresion de ARNm de protemas seleccionadas en muestras de tejidos normales y en 19 muestras de glioblastoma.
La Figura 3 expone la inmunogenicidad in vitro de ejemplo de los TUMAP de clase I de IMA950
La Figura 4 muestra a tftulo de ejemplo las afinidades de peptidos de HLA de clase I dados a conocer hacia el HLA-A*02. Las SEQ ID N.° 1 a 24 muestran las secuencias de los peptidos asociados a tumor preferidos dados a conocer.
Ejemplos
Los peptidos FTELTLGEF (HLA-A1; PolyPeptide Laboratories, Wolfenbuttel, Alemania), LMLGEFLKL (HLA-A2; Clinalfa, Sissach, Suiza), y EPDLAQCFY (HLA-B35; PolyPeptide Laboratories) se obtuvieron todos con calidad farmaceutica.
Ejemplo 1:
Identificacion de los peptidos asociados a tumor presentados en la superficie celular
Muestras de tejido
Las muestras de tejido tumoral de pacientes fueron facilitadas por el Hopital Cantonal Universitaire de Geneve (Oncologfa Medica, Laboratorio de inmunologfa tumoral) y la Neurochirurgische Universitats-Klinik de Heidelberg (Laboratorio de biologfa molecular). Los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito antes de la intervencion quirurgica. Los tejidos se criogenizaron en nitrogeno lfquido inmediatamente despues de la operacion y permanecieron a -80 °C hasta el aislamiento de los TUMAP.
Aislamiento de los peptidos HLA de las muestras de tejido
Las mezclas de peptidos HLA de las muestras de tejido criogenizadas se obtuvieron por inmunoprecipitacion de los tejidos solidos siguiendo un protocolo ligeramente modificado (Falk, K., 1991; Seeger, F. H. T., 1999) con el anticuerpo espedfico de HLA-A*02 BB7. 2, el anticuerpo espedfico de HLA-A, B y C W6/32, sefarosa activada con CNBr, tratamiento con acido y ultrafiltracion.
Metodos:
Las mezclas de peptidos HLA se separaron en funcion de su hidrofobicidad con cromatograffa en fase inversa (sistema Acquity UPLC, Waters) y los peptidos eluidos se analizaron con un espectrometro de masas Idbrido LTQ-Orbitrap (ThermoElectron) equipado con una fuente de ESI. Las mezclas de peptidos se cargaron directamente en una columna microcapilar de sflice fundido (75 pm de d. i. x 250 mm) rellena con material de fase inversa C18 de 1,7 pm (Waters) aplicando un caudal de 400 nl por minuto. Posteriormente los peptidos se separaron con un gradiente binario de 180 minutos en dos fases con 10% al 33% de B con un caudal de 300 nl por minuto. El gradiente estaba compuesto por solvente A (acido formico al 0,1% en agua) y solvente B (acido formico al 0,1% en acetonitrilo). Para la introduccion en la fuente micro-ESI se empleo un capilar de vidrio recubierto de oro (PicoTip, New Objective). El espectrometro de masas LTQ-Orbitrap se hizo operar en el modo dependiente de datos con el metodo TOP5. En resumen, se inicio un ciclo de barrido con un barrido completo de alta precision de masa en el orbitrap (R = 30000), al que siguieron barridos EM/EM tambien en el orbitrap (R = 7500) con los 5 iones precursores mas abundantes y exclusion dinamica de los iones preseleccionados. Los espectros de masas en tandem se interpretaron con SEQUEST y control manual adicional. La secuencia peptfdica identificada se confirmo comparando el patron de fragmentacion generado por el peptido natural con el patron de fragmentacion de un peptido de referencia sintetico de identica secuencia. La Fig. 1 muestra un ejemplo de espectro obtenido de tejido tumoral correspondiente al peptido asociado a MHC de clase I IGF2BP3-001 y su perfil de elucion en el sistema de UPLC.
Ejemplo 2
Perfiles de expresion de los genes que codifican los peptidos dados a conocer
No todos los peptidos identificados como presentes en la superficie de las celulas tumorales a traves de las moleculas MHC son adecuados para la inmunoterapia, porque la mayona de ellos proceden de protemas celulares normales que se expresan en multitud de tipos de celulas. Muy pocos de esos peptidos estan asociados a tumores y probablemente sean capaces de estimular los linfocitos T con una alta especificidad de reconocimiento contra el tumor del cual derivan. A fin de descubrirlos y de minimizar el riesgo de que la vacuna genere autoinmunidad los inventores se centraron en los peptidos derivados de protemas que aparecen sobreexpresadas en las celulas tumorales en comparacion con la mayona de los tejidos normales.
El peptido ideal sena el derivado de una protema que sea exclusiva del tumor y no este presente en ningun otro tejido. Para identificar los peptidos que derivaban de genes dotados con un perfil de expresion similar al ideal los peptidos identificados se asignaron a las protemas y despues a los genes originarios y se generaron los perfiles de expresion de dichos genes.
Fuentes de ARN y preparacion
Las muestras de tejido extirpado fueron facilitadas por dos centros clmicos (vease Ejemplo 1); todos los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito. Las muestras de tejido tumoral se congelaron rapidamente en nitrogeno lfquido inmediatamente despues de la operacion y se homogeneizaron a mano en un mortero con nitrogeno Kquido. El ARN total se preparo a partir de estas muestras con TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y despues se purifico con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos metodos se efectuaron siguiendo las instrucciones del fabricante.
El ARN total procedente de tejidos humanos sanos se obtuvo por canales comerciales (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemania; Stratagene, Amsterdam, Holanda; BioChain, Hayward, California, EE. UU.). El ARN de varios individuos (de 2 a 123 individuos) se mezclo de tal modo que el ARN de cada uno de ellos estuviera representado en la misma proporcion. Cuatro voluntarios sanos donaron sangre de la que se extrajeron los leucocitos.
La calidad y la cantidad de las muestras de ARN se valoraron con un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania) y con el RNA6000 Pico Lab Chip Kit (Agilent)
Experimentos con micromatrices
El analisis de la expresion genica de todas las muestras de ARN de tejido tumoral y normal se efectuo con micromatrices oligonucleotidicas Affymetrix Human Genome (HG) U133A o HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, California, EE. UU.). Todos los pasos se llevaron a cabo siguiendo el manual de Affymetrix. En resumen, a partir de 5-8 |jg de ARN total se sintetizo ADNc bicatenario con Superscript RTII (Invitrogen) y el cebador oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) siguiendo las indicaciones del manual. La transcripcion in vitro se llevo a cabo con el BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, EE. UU.) en el caso de las matrices U133A, y con el GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) en el de las matrices U133 Plus 2.0, y despues se procedio a la fragmentacion del ARNc, a su hibridacion y tincion con estreptavidina-ficoeritrina y un anticuerpo anti-estreptavidina biotinilado (Molecular Probes, Leiden, Holanda). Las imagenes se analizaron con el Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133a ) o con el Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), y los datos se analizaron con el software GCOS (Affymetrix), aplicando los ajustes preprogramados en todos los parametros. Para la normalizacion se utilizaron 100 genes constitutivos (housekeeping) suministrados por Affymetrix. Los valores de expresion relativa se calcularon a partir de los ratios logantmicos de senal dados por el software y la muestra normal de rinon se ajusto de forma arbitraria en 1,0.
Los perfiles de expresion de los genes originarios dados a conocer que aparecen altamente sobreexpresados en el glioblastoma se muestran en la Fig. 2.
Ejemplo 3:
Inmunogenicidad in vitro de los peptidos presentados por MHC de clase I de IMA950
Para obtener informacion relativa a la inmunogenicidad de los TUMAP dados a conocer, llevamos a cabo analisis con una conocida plataforma de estimulacion in vitro descrita por (Walter S., Herrgen L., Schoor O., Jung G., Wernet D., Buhring H. J., Rammensee H. G., and Stevanovic S.; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 171, 4974-4978). De este modo pudimos descubrir la inmunogenicidad notablemente elevada de 13 TUMAP restringidos por HLA-A*201 dados a conocer (deteccion en > 50% de los CTL espedficos de TUMAP de donantes analizados), lo cual demuestra que dichos peptidos son epttopos de linfocitos T contra los que existen linfocitos T precursores CD8+ en el ser humano (Tabla 3).
Sensibilizacion in vitro de linfocitos T CD8+
Para llevar a cabo las estimulaciones in vitro con celulas presentadoras de antfgeno artificiales (aAPC) cargadas con un complejo peptido-MHC (pMHC) y anticuerpo anti-CD28, primero aislamos celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de capas leucodticas HLA-A*02+ frescas empleando un medio de separacion en gradiente de densidad ordinario (PAA, Colbe, Alemania). Las capas leucocticas procedfan del banco de sangre de Tubinga y del Katharinenhospital de Stuttgart. Las PBMC aisladas se incubaron hasta el dfa siguiente con medio para linfocitos T (TCM) para la sensibilizacion humana in vitro. El medio consistfa en RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) suplementado con suero AB humano termoinactivado al 10% (PAA, Colbe, Alemania), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 jg/ml (Cambrex, Verviers, Belgica), piruvato sodico 1 mM (CC Pro, Neustadt, Alemania) y gentamicina 20 jg/ml (Cambrex). Los linfocitos CD8+ se aislaron con un kit de seleccion positiva MACS para CD8+ (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los linfocitos T CD8+ obtenidos se incubaron hasta su uso en TCM suplementado con IL-72,5 ng/ml (PromoCell, Heidelberg, Alemania) e IL-2 10 U/ml (Chiron, Munich, Alemania). La fabricacion de las microperlas recubiertas de pMHC/anti-CD28, las estimulaciones de los linfocitos T y las lecturas se llevaron a cabo del modo descrito por otros (Walter et al., 2003) con pequenas modificaciones. En suma, con el metodo descrito por (Altman et al., 1996) se sintetizaron moleculas recombinantes y biotiniladas de HLA-A*0201 desprovistas del dominio transmembrana y biotiniladas en el extremo carboxi de la cadena pesada. El anticuerpo coestimulador purificado Ab 9. 3, una IgG2a de raton anti-CD28 humano (Jung et al., 1987) se biotinilo qmmicamente con sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina siguiendo las recomendaciones del fabricante (Perbio, Bonn, Alemania). Las microperlas utilizadas consistfan en partfculas de poliestireno de 5,60 pm recubiertas de estreptavidina (Bangs Laboratories, Illinois, EE. UU.). Los complejos pMHC usados como controles positivo y negativo fueron A*0201/MLA-001 (peptido ELAGIGILTV de Melan-A modificado/MART-1) y A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5) o A*0201/HBV-001 (FLPSDFFPSV), respectivamente.
Se tapizaron placas de 96 pocillos con 800. 000 microperlas/200 pl en presencia de 600 ng de anti-CD28 biotinilado mas 200 ng del pMHC-biotina relevante (microperlas de alta densidad) o de 2 ng del relevante mas 200 ng de MHC irrelevante (biblioteca de pMHC) (microperlas de baja densidad). Las estimulaciones se iniciaron en placas de 96 pocillos en las que se incubaron simultaneamente 1x106 linfocitos T CD8+ con 2x105 microperlas recubiertas y lavadas en 200 pl de TCM suplementado con IL-12 5 ng/ml (PromoCell) durante 3 o 4 dfas a 37 °C. La mitad del medio se renovo con TCM fresco suplementado con IL-280 U/ml y la incubacion continuo otros 3 o 4 dfas a 37 °C. Este ciclo de estimulacion se efectuo en total tres veces. Por ultimo, se llevaran a cabo analisis tetramericos de los tetrameros de MHC fluorescentes (producidos del modo descrito por (Altman et al., 1996) mas anticuerpo CD8-FITC del clon SK1 (BD, Heidelberg, Alemania) en un citometro FACSCalibur de cuatro colores (BD). Las celulas espedficas de peptido se calcularon en forma de porcentaje respecto al total de linfocitos T CD8+. La evaluacion del analisis tetramerico se hizo con el programa FCS Express (De Novo Software). La sensibilizacion in vitro de los linfocitos CD8+ tetramero+ espedficos se detecto aplicando el acotamiento de subpoblaciones (gating) adecuado y comparando los resultados con las estimulaciones del control negativo. La inmunogenicidad para un antfgeno dado quedaba confirmada si por lo menos un pocillo estimulado in vitro y evaluable de un donante sano contema una estirpe de linfocitos T CD8+ espedfica despues de la estimulacion (esto es, el pocillo contema al menos un 1% de tetramero+ espedfico entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de celulas tetramero+ espedficas era al menos 10x de la mediana de las estimulaciones del control negativo).
Inmunogenicidad in vitro de los peptidos de IMA950
En el caso de los peptidos de HLA de clase I analizados, la inmunogenicidad in vitro se puede demostrar con la generacion de lmeas de linfocitos T espedficos de ese peptido. En la Figura 3 se muestran a modo de ejemplo los resultados de la citometna de flujo de dos peptidos dados a conocer tras la tincion de multfmeros espedficos de TUMAP. Los resultados de 13 peptidos dados a conocer se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3: Inmunogenicidad in vitro de peptidos de HLA de clase I altamente inmunogenicos dados a conocer
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Ademas de esos resultados obtenidos de donantes de sangre sanos, los peptidos BCA-002, CHI3L1-001 y NLGN4X-001 tambien se analizaron en un pequeno numero de pacientes con glioblastoma. Todos los peptidos resultaron ser inmunogenicos en una magnitud similar a los de los donantes sanos, lo cual demuestra la existencia de linfocitos T precursores en una poblacion destinataria de la vacuna.
Ejemplo 4
Union de los peptidos restringidos a HLA de clase I dados a conocer a HLA-A*0201
Objetivo y resumen
El objetivo del analisis consistfa en evaluar la afinidad de los peptidos de HLA de clase I por la molecula de MHC codificada por el alelo HLA-A*0201 ya que este es un importante parametro del mecanismo de accion de los peptidos como parte de la inmunoterapia contra el cancer. Las afinidades hacia el HLA-A*0201 variaron entre medias y altas en todos los peptidos restringidos a HLA de clase I dados a conocer analizados; las constantes de disociacion resultaron del orden de las del peptido usado como control positivo HBV-001, un derivado del antfgeno central del virus de la hepatitis B que posee una fuerte afinidad de union por el alelo A*02. Estos resultados confirman la potente afinidad de union de todos los peptidos de HLA de clase I dados a conocer.
Principio de la prueba
Los complejos estables de HLA/peptido constan de tres moleculas: cadena pesada de HLA, beta-2 microglobulina (b2m) y el ligando peptidico. La actividad de las moleculas de cadena pesada recombinantes y desnaturalizadas del HLA-A*0201 solas se puede conservar convirtiendolas en equivalentes funcionales de «moleculas HLA-A*0201 vadas». Cuando se diluyen en un tampon acuoso que contiene b2m y un peptido adecuado, estas moleculas se pliegan con rapidez y con eficacia de un modo que depende totalmente del peptido. La disponibilidad de estas moleculas se utiliza en un ensayo ELISA para medir la afinidad de la interaccion entre el peptido y la molecula HLA de clase I (Sylvester-Hvid et al., 2002).
Moleculas recombinantes y purificadas de HLA-A*0201 se incubaron con b2m y dosis escalonadas del peptido de interes. La cantidad de complejos de HLA plegados de novo/peptido se determino con un ELISA cuantitativo. Las constantes de disociacion (valores KD) se calcularon con una curva patron trazada con disoluciones de un complejo HLA/peptido de calibracion.
Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 4. Cuanto mas bajo es el valor de KD mayor es la afinidad hacia el HLA-A*0201. Todos los peptidos dados a conocer analizados mostraron afinidades potentes hacia el HLA-A*0201, que rondaron el valor de la KD del peptido de control positivo HBV-001, poseedor de una potente afinidad de union para con el alelo A*02. Portanto, todos los TUMAP de clase I dados a conocer tienen una afinidad de union alta por las moleculas del MHC A*02.
Referencias
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Peptido consistente en la secuencia de aminoacidos acorde con la SEQ ID N.° 10.
2. El peptido conforme a la reivindicacion 1, en que dicho peptido incluye enlaces no peptfdicos.
3. El peptido conforme a la reivindicacion 1 o 2, en que dicho peptido forma parte de una protema de fusion.
4. Acido nucleico, que codifica un peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un vector de expresion capaz de expresar dicho acido nucleico.
5. El peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el uso en medicina.
6. Celula hospedadora que comprende el acido nucleico o el vector de expresion acordes con la reivindicacion 4, en que dicha celula hospedadora no es un citoblasto embrionario humano.
7. La celula hospedadora acorde con la reivindicacion 6, en que dicha celula hospedadora es una celula presentadora de antfgeno.
8. Metodo para producir un peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el metodo el cultivo de la celula hospedadora acorde con la reivindicacion 6 o 7 que expresa el acido nucleico o el vector de expresion de conformidad con la reivindicacion 4, y el aislamiento de dicho peptido a partir de la celula hospedadora o de su medio de cultivo.
9. Metodo in vitro para producir linfocitos T citotoxicos (CTL) activados, comprendiendo la puesta en contacto en condiciones in vitro de CTL con moleculas MHC de clase I humanas cargadas con antfgeno expresadas en la superficie de una celula presentadora de antfgeno o un constructo artificial que imite a una celula presentadora de antfgeno durante un penodo de tiempo suficiente para activar dichos CTL de una manera espedfica de antfgeno, siendo dicho antfgeno un peptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
10. Linfocito T citotoxico (CTL) activado, producido con el metodo acorde con la reivindicacion 9, que reconoce selectivamente una celula que expresa de forma aberrante un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos dada en la reivindicacion 1.
11. Peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un linfocito T citotoxico activado acorde con la reivindicacion 10, para el uso en el tratamiento del cancer.
12. El peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un linfocito T citotoxico activado acorde con la reivindicacion 10, para el uso acorde con la reivindicacion 11 en la forma de una vacuna contra el cancer.
13. Un anticuerpo que se une espedficamente al complejo MHC/peptido formado por el MHC con un peptido consistente en la SEQ ID N.° 10.
14. Un equipo que comprende:
(a) un envase que contiene una composicion farmaceutica que contiene un peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el acido nucleico o el vector de expresion acorde con la reivindicacion 4, una celula acorde con la reivindicacion 6 o 7, o un linfocito T citotoxico acorde con la reivindicacion 10, en solucion o en forma liofilizada; y
(b) un segundo envase que contiene un diluyente o solucion de reconstitucion para la formulacion liofilizada.
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