TW201907937A - 阿爾法病毒新抗原載體 - Google Patents

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卡琳 約斯
艾米 瑞秋 雷帕波特
夏蘭 丹尼爾 斯卡倫
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Abstract

本文揭示阿爾法病毒(alphavirus)載體，其包括衍生自個體腫瘤之新抗原編碼核酸序列。本文亦揭示與該等載體相關之核苷酸、細胞及方法，包括其作為疫苗之用途。

Description

阿爾法病毒新抗原載體
基於腫瘤特異性新抗原之治療性疫苗很有希望作為次世代個人化癌症免疫療法1-3 。鑒於新抗原產生之相對較大之可能性，具有高突變負荷之癌症(例如非小細胞肺癌(NSCLC)及黑色素瘤)係該療法之尤具吸引力之靶標4,5 。早期證據顯示，基於新抗原之疫苗接種可引發T細胞反應6 且在所選患者中在某些情況下新抗原靶向細胞療法可引起腫瘤消退7 。
新抗原疫苗設計之一個問題在於，存在於標的腫瘤中之許多編碼突變中的哪些可產生「最優」治療性新抗原，例如可引發抗腫瘤免疫且引起腫瘤消退之抗原。
業內已提出利用次世代測序、RNA基因表現及候選新抗原肽之MHC結合親和力預測納入基於突變之分析之初始方法8 。然而，該等所提出方法可能無法對整個表位產生過程建模，該過程除基因表現及MHC結合外亦含有許多步驟(例如TAP轉運、蛋白酶體裂解及/或TCR識別)9 。因此，現有方法可能會減小低陽性預測值(PPV)。(圖1A)
實際上，由多個組實施之對腫瘤細胞所呈遞之肽的分析已顯示，在腫瘤表面MHC上可發現利用基因表現及MHC結合親和力預測呈遞之＜5%之肽10,11 (圖1B)。以下最新觀察結果進一步強化結合預測與MHC呈遞之間之此低關聯性：缺少結合限制性新抗原對於僅針對突變數量之檢查點抑制劑反應之預測準確度改良12 。
用於預測呈遞之現有方法之此低陽性預測值(PPV)呈現基於新抗原之疫苗設計之問題。若使用具有低PPV之預測來設計疫苗，則大多數患者不太可能接受治療性新抗原且極少數仍可能接受一種以上之抗原(即使假設所有經呈遞之肽皆具免疫原性)。因此，使用當前方法進行新抗原疫苗接種在大量患有腫瘤之個體中不太可能成功。(圖1C)。
另外，先前方法僅利用順式作用突變產生候選新抗原，且極大地忽視了考慮neo-ORF之其他來源，包括發生在多個腫瘤類型中且引起許多基因之異常剪接13 之剪接因子之突變及產生或去除蛋白酶裂解位點之突變。
最後，腫瘤基因體及轉錄體分析之標準方法可因文庫構築、外顯子體及轉錄體捕獲、測序或數據分析中之次最佳條件而漏失產生候選新抗原之體細胞突變。同樣，標準腫瘤分析方法可不經意地促進將序列假影或生殖系多型性作為新抗原，此分別導致疫苗能力之無效使用或自體免疫性風險。
除當前新抗原預測方法之挑戰外，可用於人類中之新抗原遞送之可用載體系統亦存在某些挑戰，該等可用載體系統中之許多衍生自人類。舉例而言，許多人因先前自然暴露而對人類病毒具有預先存在之免疫性，且此免疫性可為使用重組人類病毒進行新抗原遞送來治療癌症之主要障礙。
本文揭示用於遞送新抗原表現系統之組合物，其包含：新抗原表現系統，其中新抗原表現系統包含一或多種載體，一或多種載體包含：(a) RNA阿爾法病毒(alphavirus)主鏈，其中RNA阿爾法病毒主鏈包含：(i)至少一個啟動子核苷酸序列，及(ii)至少一個多腺苷酸化(聚(A))序列；及(b)新抗原盒，其中新抗原盒包含：(i)至少一個衍生自存在於個體內之腫瘤之新抗原編碼核酸序列，其包含：(I)至少一個腫瘤特異性及個體特異性I類MHC新抗原編碼核酸序列，其衍生自腫瘤且包含：(A) I類MHC表位編碼核酸序列，其具有至少一個變化使得經編碼肽序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列，及(B)視情況5’端連接體序列，及(C)視情況3’端連接體序列；(ii)視情況第二啟動子核苷酸序列，其可操作地連接至新抗原編碼核酸序列；及(iii)視情況至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列；(iv)視情況至少一個編碼GPGPG胺基酸連接體序列(SEQ ID NO:56)之核酸序列；及(v)視情況至少一個第二聚(A)序列，其中第二聚(A)序列係阿爾法病毒之天然聚(A)序列或外源聚(A)序列。
本文亦揭示用於遞送新抗原表現系統之組合物，其包含：新抗原表現系統，其中新抗原表現系統包含一或多種載體，一或多種載體包含：(a) RNA阿爾法病毒主鏈，其中RNA阿爾法病毒主鏈包含SEQ ID NO:6中所示之核酸序列，其中RNA阿爾法病毒主鏈序列包含26S啟動子核苷酸序列及聚(A)序列，其中26S啟動子序列對於RNA阿爾法病毒主鏈係內源的，且其中聚(A)序列對於RNA阿爾法病毒主鏈係內源的；及(b)新抗原盒，其整合在26S啟動子核苷酸序列與聚(A)序列之間，其中新抗原盒包含：(i)至少一個衍生自存在於個體內之腫瘤之新抗原編碼核酸序列，其包含：(I)至少10個腫瘤特異性及個體特異性I類MHC新抗原編碼核酸序列，其彼此線性連接與各自包含：(A) I類MHC表位編碼核酸序列，其具有至少一個變化使得經編碼肽序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列，其中I類MHC表位編碼核酸序列編碼長度為7至15個胺基酸之I類MHC表位，(B) 5’端連接體序列，其中5’端連接體序列編碼I類MHC表位之天然N端胺基酸序列，且其中5’端連接體序列編碼長度為至少3個胺基酸之肽，(C) 3’端連接體序列，其中3’端連接體序列編碼I類MHC表位之天然C端胺基酸序列，且其中3’端連接體序列編碼長度為至少3個胺基酸之肽，且其中新抗原盒可操作地連接至26S啟動子核苷酸序列，其中每一I類MHC新抗原編碼核酸序列編碼長度在13與25個胺基酸之間之多肽，且其中每一I類MHC新抗原編碼核酸序列之每一3’端連接至下一I類MHC新抗原編碼核酸序列之5’端，新抗原盒中之最末I類MHC新抗原編碼核酸序列除外；及(ii)至少兩個II類MHC抗原編碼核酸序列，其包含：(I) PADRE II類MHC序列(SEQ ID NO:48)，(II)破傷風類毒素II類MHC序列(SEQ ID NO:46)，(III)第一核酸序列，其編碼連接PADRE II類MHC序列及破傷風類毒素II類MHC序列之GPGPG胺基酸連接體序列，(IV)第二核酸序列，其編碼連接至少兩個II類MHC抗原編碼核酸序列之5’端與至少20個腫瘤特異性及個體特異性I類MHC新抗原編碼核酸序列之GPGPG胺基酸連接體序列，(V)視情況第三核酸序列，其編碼至少兩個II類MHC抗原編碼核酸序列之3’端之GPGPG胺基酸連接體序列。
在一些態樣中，新抗原盒之每一元件之有序序列述於下式中，自5’端至3’端包含： Pa-(L5b-Nc-L3d)X-(G5e-Uf)Y-G3g
其中P包含第二啟動子核苷酸序列，其中a = 0或1，N包含一個I類MHC表位編碼核酸序列，其中c = 1，L5包含5’端連接體序列，其中b = 0或1，L3包含3’端連接體序列，其中d = 0或1，G5包含至少一個編碼GPGPG胺基酸連接體之核酸序列中之一者，其中e = 0或1，G3包含至少一個編碼GPGPG胺基酸連接體之核酸序列中之一者，其中g = 0或1，U包含至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列中之一者，其中f = 1，X = 1至400，其中對於每一X，相應Nc係表位編碼核酸序列，且Y = 0、1或2，其中對於每一Y，相應Uf係抗原編碼核酸序列。在一些態樣中，對於每一X，相應Nc係不同的I類MHC表位編碼核酸序列。在一些態樣中，對於每一Y，相應Uf係不同的II類MHC抗原編碼核酸序列。
在一些態樣中，a = 0，b = 1，d = 1，e = 1，g = 1，h = 1，X = 20，Y = 2，至少一個啟動子核苷酸序列係由RNA阿爾法病毒主鏈提供之單一26S啟動子核苷酸序列，至少一個多腺苷酸化聚(A)序列係由RNA阿爾法病毒主鏈提供之至少100個連續A核苷酸之聚(A)序列，每一N編碼長度為7至15個胺基酸之I類MHC表位，L5係編碼I類MHC表位之天然N端胺基酸序列之天然5’端連接體序列，且其中5’端連接體序列編碼長度為至少3個胺基酸之肽，L3係編碼I類MHC表位之天然C端胺基酸序列之天然3’端連接體序列，且其中3’端連接體序列編碼長度為至少3個胺基酸之肽，U係PADRE II類序列及破傷風類毒素II類MHC序列中之每一者，RNA阿爾法病毒主鏈係SEQ ID NO:6中所示之序列，且每一I類MHC新抗原編碼核酸序列編碼長度在13與25個胺基酸之間之多肽。
在一些態樣中，任一上述組合物進一步包含奈米微粒遞送媒劑。在一些態樣中，奈米微粒遞送媒劑可為脂質奈米粒子(LNP)。在一些態樣中，LNP包含可離子化胺基脂質。在一些態樣中，可離子化胺基脂質包含MC3樣(二亞麻油基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯)分子。在一些態樣中，奈米微粒遞送媒劑囊封新抗原表現系統。
在一些態樣中，組合物進一步包含複數個LNP，其中LNP包含：新抗原表現系統；陽離子脂質；非陽離子脂質；及抑制LNP聚集之結合脂質，其中複數個LNP中之至少約95%之LNP：具有非層狀形態；或係電子密集的。
在一些態樣中，非陽離子脂質係(1)磷脂及(2)膽固醇或膽固醇衍生物之混合物。
在一些態樣中，抑制LNP聚集之結合脂質係聚乙二醇(PEG)-脂質結合物。在一些態樣中，PEG-脂質結合物選自由以下組成之群：PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG二烷基氧基丙基(PEG-DAA)結合物、PEG-磷脂結合物、PEG-神經醯胺(PEG-Cer)結合物及其混合物。在一些態樣中，PEG-DAA結合物係選自由以下組成之群之成員：PEG-二癸基氧基丙基(C10 )結合物、PEG-二月桂基氧基丙基(C12 )結合物、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14 )結合物、PEG-二棕櫚基氧基丙基(C16 )結合物、PEG-二硬脂醯基氧基丙基(C18 )結合物及其混合物。
在一些態樣中，新抗原表現系統完全囊封於LNP中。
在一些態樣中，LNP之非層狀形態包含反六方(H II )或立方相結構。
在一些態樣中，陽離子脂質包含LNP中存在之總脂質之約10 mol%至約50 mol%。在一些態樣中，陽離子脂質包含LNP中存在之總脂質之20 mol%至約50 mol%。在一些態樣中，陽離子脂質包含LNP中存在之總脂質之20 mol%至約40 mol%。
在一些態樣中，非陽離子脂質包含LNP中存在之總脂質之10 mol%至約60 mol%。在一些態樣中，非陽離子脂質包含LNP中存在之總脂質之20 mol%至約55 mol%。在一些態樣中，非陽離子脂質包含LNP中存在之總脂質之25 mol%至約50 mol%。
在一些態樣中，結合脂質包含LNP中存在之總脂質之約0.5 mol%至約20 mol%。在一些態樣中，結合脂質包含LNP中存在之總脂質之約2 mol%至約20 mol%。在一些態樣中，結合脂質包含LNP中存在之總脂質之約1.5 mol%至約18 mol%。
在一些態樣中，大於95%之LNP具有非層狀形態。在一些態樣中，大於95%之LNP係電子密集的。
在一些態樣中，組合物進一步包含複數個LNP，其中LNP包含：陽離子脂質，其包含LNP中存在之總脂質之50 mol%至65 mol%；抑制LNP聚集之結合脂質，其包含LNP中存在之總脂質之0.5 mol%至2 mol%；及非陽離子脂質，其包含：磷脂及膽固醇或其衍生物之混合物，其中磷脂包含LNP中存在之總脂質之4 mol%至10 mol%且膽固醇或其衍生物包含LNP中存在之總脂質之30 mol%至40 mol%；磷脂及膽固醇或其衍生物之混合物，其中磷脂包含LNP中存在之總脂質之3 mol%至15 mol%且膽固醇或其衍生物包含LNP中存在之總脂質之30 mol%至40 mol%；或LNP中存在之總脂質之至多49.5 mol%且包含磷脂及膽固醇或其衍生物之混合物，其中膽固醇或其衍生物包含LNP中存在之總脂質之30 mol%至40 mol%。
在一些態樣中，組合物進一步包含複數個LNP，其中LNP包含：陽離子脂質，其包含LNP中存在之總脂質之50 mol%至85 mol%；抑制LNP聚集之結合脂質，其包含LNP中存在之總脂質之0.5 mol%至2 mol%；及非陽離子脂質，其包含LNP中存在之總脂質之13 mol%至49.5 mol%。
在一些態樣中，磷脂包含二棕櫚醯基磷酯醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷酯醯膽鹼(DSPC)或其混合物。
在一些態樣中，結合脂質包含聚乙二醇(PEG)-脂質結合物。在一些態樣中，PEG-脂質結合物包含PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG-二烷基氧基丙基(PEG-DAA)結合物或其混合物。在一些態樣中，PEG-DAA結合物包含PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(PEG-DMA)結合物、PEG-二硬脂醯基氧基丙基(PEG-DSA)結合物或其混合物。在一些態樣中，結合物之PEG部分具有約2,000道爾頓之平均分子量。
在一些態樣中，結合脂質包含LNP中存在之總脂質之1 mol%至2 mol%。
在一些態樣中，LNP包含具有式I結構之化合物：或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物、前藥或立體異構物，其中：L1 及L2 各自獨立地係-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)x -、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-Ra C(=O)-、-C(=O) Ra -、-Ra C(=O) Ra -、-OC(=O) Ra -、-Ra C(=O)O-或直接鍵；G1 係C1 -C2 伸烷基、-(C=O)-、-O(C=O)-、-SC(=O)-、-Ra C(=O)-或直接鍵；-C(=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)S-、-C(=O) Ra -或直接鍵；G係C1 -C6 伸烷基；Ra 係H或C1 -C12 烷基；R1a 及R1b 在每次出現時獨立地係：(a) H或C1 -C12 烷基；或(b) R1a 係H或C1 -C12 烷基，且R1b 及其所結合之碳原子與相鄰R1b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R2a 及R2b 在每次出現時獨立地係：(a) H或C1 -C12 烷基；或(b) R2a 係H或C1 -C12 烷基，且R2b 及其所結合之碳原子與相鄰R2b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R3a 及R3b 在每次出現時獨立地係：(a) H或C1 -C12 烷基；或(b) R3a 係H或C1 -C12 烷基，且R3b 及其所結合之碳原子與相鄰R3b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R4a 及R4b 在每次出現時獨立地係：(a) H或C1 -C12 烷基；或(b) R4a 係H或C1 -C12 烷基，且R4b 及其所結合之碳原子與相鄰R4b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R5 及R6 各自獨立地係H或甲基；R7 係C4 -C20 烷基；R8 及R9 各自獨立地係C1 -C12 烷基；或R8 及R9 與其所連接之氮原子一起形成5員、6員或7員雜環；a、b、c及d各自獨立地係1至24之整數；且x係0、1或2。
在一些態樣中，LNP包含具有式II結構之化合物：或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物、前藥或立體異構物，其中：L1 及L2 各自獨立地係-O(C=O)-、-(C=O)O-或碳-碳雙鍵；R1a 及R1b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R1a 係H或C1 -C12 烷基，且R1b 及其所結合之碳原子與相鄰R1b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R2a 及R2b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R2a 係H或C1 -C12 烷基，且R2b 及其所結合之碳原子與相鄰R2b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R3a 及R3b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R3a 係H或C1 -C12 烷基，且R3b 及其所結合之碳原子與相鄰R3b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R4a 及R4b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R4a 係H或C1 -C12 烷基，且R4b 及其所結合之碳原子與相鄰R4b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R5 及R6 各自獨立地係甲基或環烷基；R7 在每次出現時獨立地係H或C1 -C12 烷基；R8 及R9 各自獨立地係未經取代之C1 -C12 烷基；或R8 及R9 與其所連接之氮原子一起形成包含一個氮原子之5員、6員或7員雜環；a及d各自獨立地係0至24之整數；b及c各自獨立地係1至24之整數；且e係1或2，條件係：R1a 、R2a 、R3a 或R4a 中之至少一者係C1 -C12 烷基，或L1 或L2 中之至少一者係-O(C=O)-或-(C=O)O-；且R1a 及R1b 在a係6時不為異丙基或在a係8時不為正丁基。
在一些態樣中，組合物進一步包含一或多種包含中性脂質、類固醇及聚合物結合脂質之賦形劑。在一些態樣中，中性脂質包含以下中之至少一者：1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)及1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一些態樣中，中性脂質係DSPC。
在一些態樣中，化合物對中性脂質之莫耳比在約2:1至約8:1範圍內。
在一些態樣中，類固醇係膽固醇。在一些態樣中，化合物對膽固醇之莫耳比在約2:1至1:1範圍內。
在一些態樣中，聚合物結合脂質係聚乙二醇化脂質。在一些態樣中，化合物對聚乙二醇化脂質之莫耳比在約100:1至約25:1範圍內。在一些態樣中，聚乙二醇化脂質係PEG-DAG、PEG聚乙烯(PEG-PE)、PEG-琥珀醯基-二醯基甘油(PEG-S-DAG)、PEG-cer或PEG胺基甲酸二烷基氧基丙基酯。在一些態樣中，聚乙二醇化脂質具有以下結構III：或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物或立體異構物，其中：R10 及R11 各自獨立地係含有10至30個碳原子之直鏈或具支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，其中烷基鏈視情況雜有一或多個酯鍵；且z具有在30至60範圍內之平均值。在一些態樣中，R10 及R11 各自獨立地係具有12至16個碳原子之直鏈飽和烷基鏈。在一些態樣中，z平均值為約45。
在一些態樣中，LNP在與多陰離子核酸混合時自組裝成非雙層結構。在一些態樣中，非雙層結構具有在60 nm與120 nm之間之直徑。在一些態樣中，非雙層結構具有約70 nm、約80 nm、約90 nm或約100 nm之直徑。在一些態樣中，其中奈米微粒遞送媒劑具有約100 nm之直徑。
在一些態樣中，新抗原盒整合在至少一個啟動子核苷酸序列與至少一個聚(A)序列之間。在一些態樣中，至少一個啟動子核苷酸序列可操作地連接至新抗原編碼核酸序列。
在一些態樣中，一或多種載體包含一或多種正義股RNA載體。在一些態樣中，一或多種正義股RNA載體包含5’端7-甲基鳥苷(m7g)帽。在一些態樣中，一或多種正義股RNA載體係藉由活體外轉錄產生。在一些態樣中，一或多種載體在哺乳動物細胞內自我複製。
在一些態樣中，RNA阿爾法病毒主鏈包含奧拉病毒(Aura virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、羅氏河病毒(Ross River virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、辛得比斯病毒(Sindbis virus)或馬亞羅病毒(Mayaro virus)之至少一個核苷酸序列。在一些態樣中，RNA阿爾法病毒主鏈包含委內瑞拉馬腦炎病毒之至少一個核苷酸序列。在一些態樣中，RNA阿爾法病毒主鏈包含至少由奧拉病毒、摩根堡病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、羅氏河病毒、塞姆利基森林病毒、辛得比斯病毒或馬亞羅病毒之核苷酸序列編碼之用於非結構蛋白介導之擴增之序列、26S啟動子序列、聚(A)序列、非結構蛋白1 (nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因及nsP4基因。在一些態樣中，RNA阿爾法病毒主鏈包含至少由奧拉病毒、摩根堡病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、羅氏河病毒、塞姆利基森林病毒、辛得比斯病毒或馬亞羅病毒之核苷酸序列編碼之用於非結構蛋白介導之擴增之序列、26S啟動子序列及聚(A)序列。在一些態樣中，用於非結構蛋白介導之擴增之序列選自由以下組成之群：阿爾法病毒5’端UTR、51-nt CSE、24-nt CSE、26S亞基因體啟動子序列、19-nt CSE、阿爾法病毒3’端UTR或其組合。
在一些態樣中，RNA阿爾法病毒主鏈不編碼結構病毒粒子蛋白衣殼E2及E1。在一些態樣中，新抗原盒代替結構病毒粒子蛋白插入奧拉病毒、摩根堡病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、羅氏河病毒、塞姆利基森林病毒、辛得比斯病毒或馬亞羅病毒之核苷酸序列內。
在一些態樣中，委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)包含品系TC-83。在一些態樣中，委內瑞拉馬腦炎病毒包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中所示之序列。在一些態樣中，委內瑞拉馬腦炎病毒包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之序列，該序列進一步包含鹼基對7544與11175之間之缺失。在一些態樣中，RNA阿爾法病毒主鏈係SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示之序列。在一些態樣中，插入新抗原盒以替代SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之序列中所示之鹼基對7544與11175之間之缺失。
在一些態樣中，插入新抗原盒提供包含nsP1-4基因及至少一個抗原編碼核酸序列之多順反子RNA之轉錄，其中nsP1-4基因及至少一個抗原編碼核酸序列處於各別開放閱讀框中。
在一些態樣中，至少一個啟動子核苷酸序列係由RNA阿爾法病毒主鏈編碼之天然26S啟動子核苷酸序列。在一些態樣中，至少一個啟動子核苷酸序列係外源RNA啟動子。在一些態樣中，第二啟動子核苷酸序列係26S啟動子核苷酸序列。在一些態樣中，第二啟動子核苷酸序列包含多個26S啟動子核苷酸序列，其中每一26S啟動子核苷酸序列提供一或多個各別開放閱讀框之轉錄。
在一些態樣中，一或多種新抗原表現載體之大小各自為至少300nt。在一些態樣中，一或多種新抗原表現載體之大小各自為至少1kb。在一些態樣中，一或多種新抗原表現載體之大小各自為2kb。在一些態樣中，一或多種新抗原表現載體之大小各自小於5kb。
在一些態樣中，至少一種新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼由腫瘤細胞上之I類MHC呈遞之多肽序列或其部分。在一些態樣中，每一抗原編碼核酸序列彼此直接連接。在一些態樣中，至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者利用編碼連接體之核酸序列連接至不同的抗原編碼核酸序列。在一些態樣中，連接體連接兩個I類MHC序列或連接I類MHC序列與II類MHC序列。在一些態樣中，連接體選自由以下組成之群：(1)長度為至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個殘基之連續甘胺酸殘基；(2)長度為至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個殘基之連續丙胺酸殘基；(3)兩個精胺酸殘基(RR)；(4)丙胺酸、丙胺酸、酪胺酸(AAY)；(5)長度為至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸殘基之共有序列，其有效地由哺乳動物蛋白酶體加工；及(6)一或多個天然序列，其側接衍生自起源之同源蛋白之抗原且長度為至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或2至20個胺基酸殘基。在一些態樣中，連接體連接兩個II類MHC序列或連接II類MHC序列與I類MHC序列。在一些態樣中，連接體包含序列GPGPG。
在一些態樣中，至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一個序列可操作或直接連接至單獨或鄰接序列，以增強至少一個抗原編碼核酸序列之表現、穩定性、細胞輸送、加工及呈遞及/或免疫原性。在一些態樣中，單獨或鄰接序列包含以下中之至少一者：泛素序列、經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列(例如泛素序列含有在76位置處之Gly至Ala取代)、免疫球蛋白信號序列(例如IgK)、I類主要組織相容性序列、溶酶體相關膜蛋白(LAMP)-1、人類樹突細胞溶酶體相關膜蛋白及II類主要組織相容性序列；視情況其中經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列係A76。
在一些態樣中，相對於經轉譯之相應野生型核酸序列，至少一種新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼具有增加的與其相應MHC對偶基因之結合親和力之多肽序列或其部分。在一些態樣中，相對於經轉譯之相應野生型核酸序列，複數個中至少一種新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼具有增加的與其相應MHC對偶基因之結合穩定性之多肽序列或其部分。在一些態樣中，相對於經轉譯之相應野生型核酸序列，複數個中至少一種新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼具有增加的呈遞於其相應MHC對偶基因上之似然度之多肽序列或其部分。
在一些態樣中，至少一個突變包含點突變、框移突變、非框移突變、缺失突變、插入突變、剪接變體、基因體重排或蛋白酶體產生之剪接抗原。
在一些態樣中，腫瘤選自由以下組成之群：肺癌、黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、膀胱癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、成人急性淋巴母細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。
在一些態樣中，至少一種新抗原編碼核酸序列包含至少2至10個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個核酸序列。在一些態樣中，至少一種新抗原編碼核酸序列包含至少11至20個、15至20個、11至100個、11至200個、11至300個、11至400個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或至多400個核酸序列。
在一些態樣中，至少一種新抗原編碼核酸序列包含至少2至400個核酸序列且其中至少兩種新抗原編碼核酸序列編碼由腫瘤細胞表面上之I類MHC呈遞之多肽序列或其部分。在一些態樣中，至少兩種新抗原編碼核酸序列編碼由腫瘤細胞表面上之I類MHC呈遞之多肽序列或其部分。在一些態樣中，在投與個體及轉譯時，至少一種由至少一種新抗原編碼核酸序列編碼之新抗原呈遞於抗原呈遞細胞上，引起靶向腫瘤細胞表面上之至少一種新抗原之免疫反應。在一些態樣中，至少一種新抗原編碼核酸序列在投與個體及轉譯時，I類或II類MHC新抗原中之至少一者呈遞於抗原呈遞細胞上，引起靶向腫瘤細胞表面上之至少一種新抗原之免疫反應，且視情況其中至少一種新抗原編碼核酸序列中每一者之表現係由至少一個啟動子核苷酸序列驅動。
在一些態樣中，每一I類MHC新抗原編碼核酸序列編碼長度在8與35個胺基酸之間、視情況長度為9至17個、9至25個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個或35個胺基酸之多肽序列。
在一些態樣中，存在至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列。在一些態樣中，存在至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列且其包含至少一個II類MHC新抗原編碼核酸序列，該新抗原編碼核酸序列包含至少一個使其不同於相應野生型親代核酸序列之突變。在一些態樣中，至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列之長度為12至20個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或20至40個胺基酸。在一些態樣中，存在至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列且其包含至少一個通用II類MHC抗原編碼核酸序列，視情況其中至少一個通用序列包含破傷風類毒素及PADRE中之至少一者。
在一些態樣中，至少一個啟動子核苷酸序列或第二啟動子核苷酸序列為誘導型。在一些態樣中，至少一個啟動子核苷酸序列或第二啟動子核苷酸序列為非誘導型。
在一些態樣中，至少一個聚(A)序列包含阿爾法病毒之天然聚(A)序列。在一些態樣中，至少一個聚(A)序列包含阿爾法病毒之外源聚(A)序列。在一些態樣中，至少一個聚(A)序列可操作地連接至至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者。在一些態樣中，至少一個聚(A)序列係至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個或至少90個連續A核苷酸。在一些態樣中，至少一個聚(A)序列係至少100個連續A核苷酸。
在一些態樣中，新抗原盒進一步包含以下中之至少一者：內含子序列、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)序列、內部核糖體進入序列(IRES)、編碼2A自裂解肽序列之核苷酸序列、編碼弗林蛋白酶(Furin)裂解位點之核苷酸序列或在5’端或3’端非編碼區中已知增強mRNA之核輸出、穩定性或轉譯效率之序列，可操作地連接至至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者。
在一些態樣中，新抗原盒進一步包含報導基因、包括(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)、GFP變體、分泌性鹼性磷酸酶、螢光素酶、螢光素酶變體或可檢測肽或表位。在一些態樣中，可檢測肽或表位選自由以下組成之群：HA標籤、Flag標籤、His標籤或V5標籤。
在一些態樣中，一或多種載體進一步包含一或多個編碼至少一種免疫調節劑之核酸序列。在一些態樣中，免疫調節劑係抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段係Fab片段、Fab’片段、單鏈Fv (scFv)、呈單特異性或連接在一起之多特異性之單域抗體(sdAb) (例如駱駝科動物抗體域)或全長單鏈抗體(例如全長IgG，其重鏈及輕鏈藉由撓性連接體連接)。在一些態樣中，抗體之重鏈及輕鏈序列係藉由自裂解序列(例如2A或IRES)分隔開之鄰接序列；或抗體之重鏈及輕鏈序列係藉由撓性連接體(例如連續甘胺酸殘基)連接。
在一些態樣中，免疫調節劑係細胞介素。在一些態樣中，細胞介素係IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21或其各自之變體中之至少一者。
本文亦揭示包含新抗原盒之腺病毒載體，新抗原盒包含：衍生自存在於個體內之腫瘤之複數個抗原編碼核酸序列，該複數個包含：至少兩個I類MHC新抗原編碼核酸序列，其各自包含至少一個使其不同於相應野生型親代核酸序列之變化，及視情況至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列；及至少一個啟動子序列，其可操作地連接至該複數個之至少一個序列。
在一些態樣中，腺病毒載體係黑猩猩腺病毒(ChAd)載體，視情況C68載體。在一些態樣中，腺病毒載體包含SEQ ID NO:1中所示之序列。在一些態樣中，腺病毒載體包含SEQ ID NO:1中所示之序列，只是該序列之至少一個選自由SEQ ID NO: 1中所示之序列之黑猩猩腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因組成之群之基因完全缺失或功能缺失，視情況其中該序列之以下基因完全缺失或功能缺失：(1) SEQ ID NO: 1中所示之序列之E1A及E1B；(2) E1A、E1B及E3；或(3) E1A、E1B、E3及E4。在一些態樣中，腺病毒載體包含自SEQ ID NO: 1之序列獲得之基因或調節序列，視情況其中基因選自由以下組成之群：黑猩猩腺病毒反向末端重複(ITR)、SEQ ID NO: 1中所示之序列之E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。
在一些態樣中，新抗原盒插入腺病毒載體中之E1區、E3區及/或允許納入新抗原盒之任何缺失AdV區。
在一些態樣中，腺病毒載體之至少一個啟動子序列為誘導型。在一些態樣中，腺病毒載體之至少一個啟動子序列為非誘導型。在一些態樣中，腺病毒載體之至少一個啟動子序列係CMV、SV40、EF-1、RSV、PGK或EBV啟動子序列。
在一些態樣中，腺病毒載體之新抗原盒進一步包含至少一個可操作地連接至複數個序列中之至少一者之聚A序列，視情況其中聚A序列位於複數個序列中之至少一者之3’端。
在一些態樣中，腺病毒載體係自第一代、第二代或輔助病毒依賴性腺病毒載體產生。
在一些態樣中，腺病毒載體包含一或多個在鹼基對編號577與3407之間之缺失且視情況其中腺病毒載體進一步包含一或多個在SEQ ID NO:1中所示之序列之鹼基對27,141與32,022之間或在鹼基對27,816與31,332之間的缺失。在一些態樣中，腺病毒載體進一步包含一或多個在SEQ ID NO:1中所示之序列之鹼基對編號3957與10346之間、鹼基對編號21787與23370之間及鹼基對編號33486與36193之間的缺失。
在一些態樣中，至少一個I類MHC新抗原編碼核酸序列係藉由實施以下步驟來選擇：(a)從腫瘤獲得外顯子體、轉錄體或全基因體之腫瘤核苷酸測序數據中之至少一者，其中使用腫瘤核苷酸測序數據來獲得代表新抗原集中各者之肽序列之數據；(b)將每一新抗原之肽序列輸入呈遞模型中以產生每一新抗原由腫瘤之腫瘤細胞表面上之一或多個MHC對偶基因呈遞的數值似然度集，該數值似然度集業已至少基於所獲得之質譜數據鑑別；及(c)基於數值似然度集選擇出新抗原集之子集，以產生經選擇新抗原集，其係用於產生至少一個I類MHC新抗原編碼核酸序列。
在一些態樣中，至少一個I類MHC新抗原編碼核酸序列中之每一者係藉由實施以下步驟來選擇：(a)從腫瘤活得外顯子體、轉錄體或全基因之體腫瘤核苷酸測序數據中之至少一者，其中使用腫瘤核苷酸測序數據來獲得代表新抗原集中各者之肽序列之數據；(b)將每一新抗原之肽序列輸入呈遞模型中以產生每一新抗原由腫瘤之腫瘤細胞表面上之一或多個MHC對偶基因呈遞的數值似然度集，該數值似然度集業已至少基於所獲得之質譜數據鑑別；及(c)基於數值似然度集選擇出新抗原之子集以產生經選擇新抗原集，其係用以產生至少一個I類MHC新抗原編碼核酸序列。
在一些態樣中，經選擇新抗原集之數量為2-20。
在一些態樣中，呈遞模型代表以下之間之依賴性：MHC對偶基因中之特定一者及肽序列特定位置之特定胺基酸之對的存在；與藉由該對之MHC對偶基因中之特定一者，該包含特定位置之特定胺基酸之肽序列呈遞於腫瘤細胞表面上的似然度。
在一些態樣中，選擇經選擇新抗原集包含基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加的呈遞於腫瘤細胞表面上之似然度的新抗原。在一些態樣中，選擇經選擇新抗原集包含基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加的能夠誘導個體中之腫瘤特異性免疫反應之似然度的新抗原。在一些態樣中，選擇經選擇新抗原集包含基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加的能夠藉由專業抗原呈遞細胞(APC)呈遞至初始T細胞之似然度的新抗原，視情況其中APC係樹突細胞(DC)。在一些態樣中，選擇經選擇新抗原集包含基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有減小的經歷經由中樞或周邊耐受性抑制之似然度的新抗原。在一些態樣中，選擇經選擇新抗原集包含基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有減小的能夠誘導個體中之針對正常組織之自體免疫反應之似然度的新抗原。在一些態樣中，外顯子體或轉錄體核苷酸測序數據係藉由對腫瘤組織實施測序來獲得。在一些態樣中，測序係次世測序(NGS)或任一大量平行測序方法。
在一些態樣中，新抗原盒包含由新抗原盒中之相鄰序列形成之接合表位序列。在一些態樣中，至少一個或每一接合表位序列具有大於500 nM之MHC親和力。在一些態樣中，每一接合表位序列係非自身的。在一些態樣中，新抗原盒不編碼包含經轉譯之野生型核酸序列之非治療性I類或II類MHC表位核酸序列，其中非治療性表位經預測展示於個體之MHC對偶基因上。在一些態樣中，非治療性經預測I類或II類MHC表位序列係由新抗原盒中之相鄰序列形成之接合表位序列。在一些態樣中，預測係基於藉由將非治療性表位之序列輸入呈遞模型中產生之呈遞似然度。在一些態樣中，新抗原盒中至少一個抗原編碼核酸序列之順序係藉由包含以下之一系列步驟來確定：(a)產生對應於至少一個抗原編碼核酸序列之不同順序之候選新抗原盒序列集；(b)基於候選新抗原盒序列中之非治療性表位之呈遞判定每一候選新抗原盒序列之呈遞分數；及(c)選擇與低於預定臨限值之呈遞分數相關之候選盒序列作為新抗原疫苗之新抗原盒序列。
本文亦揭示醫藥組合物，其包含本文所揭示之任一組合物(例如本文所揭示基於阿爾法病毒或基於ChAd之載體)及醫藥上可接受之載劑。在一些態樣中，組合物進一步包含佐劑。在一些態樣中，組合物進一步包含免疫調節劑。在一些態樣中，免疫調節劑係抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
本文亦揭示經分離核苷酸序列或經分離核苷酸序列集，其包含前述組合物技術方案中任一項之新抗原盒及一或多個自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之序列獲得之元件，視情況其中一或多個元件選自由以下組成之群：非結構蛋白介導之擴增所需之序列、26S啟動子核苷酸序列、聚(A)序列及SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中所示之序列之nsP1-4基因，且視情況其中核苷酸序列係cDNA。在一些態樣中，序列或經分離核苷酸序列集包含在SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示序列之7544位置插入之本文所揭示新抗原盒。在一些態樣中，經分離核苷酸序列進一步包含自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之序列獲得之一或多個元件5’端之T7或SP6 RNA聚合酶啟動子核苷酸序列，及視情況聚(A)序列3’端之一或多個限制位點。在一些態樣中，本文所揭示之新抗原盒係插入在SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之7563位置。在另一態樣中，SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中所示序列進一步包含在17位置插入之另一腺嘌呤核苷酸。
本文亦揭示經分離核苷酸序列，其包含本文所揭示之新抗原盒及至少一個本文所揭示之啟動子。在一些態樣中，經分離核苷酸序列進一步包含基於ChAd之基因。在一些態樣中，基於ChAd之基因係自SEQ ID NO: 1之序列獲得，視情況其中基因選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1中所示之序列之黑猩猩腺病毒ITR、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因，且視情況其中核苷酸序列係cDNA。
本文亦揭示包含本文所揭示之經分離核苷酸序列之經分離細胞，視情況其中細胞係BHK-21、CHO、HEK293或其變體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a細胞。
本文亦揭示包含本文所揭示之經分離核苷酸序列之載體。
本文亦揭示套組，其包含本文所揭示之載體或組合物及使用說明書。
本文亦揭示治療患有癌症之個體之方法，該方法包含向個體投與本文所揭示之載體或本文所揭示之醫藥組合物。在一些態樣中，至少一個衍生自腫瘤之I類MHC新抗原編碼核酸序列係衍生自患有癌症之個體之腫瘤。在一些態樣中，至少一個I類MHC新抗原編碼核酸序列並非衍生自患有癌症之個體之腫瘤。
本文亦揭示誘導個體中之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與本文所述組合物、載體或醫藥組合物中之任一者。
在一些態樣中，載體或組合物係經肌內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)或靜脈內(IV)投與。
在一些態樣中，該方法進一步包含投與一或多種免疫調節劑，視情況其中免疫調節劑係在投與組合物或醫藥組合物之前、與其同時或在其之後投與。在一些態樣中，一或多種免疫調節劑選自由以下組成之群：抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，免疫調節劑係經靜脈內(IV)、肌內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。在一些態樣中，皮下投與係在組合物或醫藥組合物投與位點附近或緊密靠近一或多種載體或組合物引流淋巴結。
在一些態樣中，本文所述之方法進一步包含向個體投與第二疫苗組合物。在一些態樣中，第二疫苗組合物係在投與上文所述之組合物或醫藥組合物之前投與。在一些態樣中，第二疫苗組合物係在投與上文所述之組合物或醫藥組合物之後投與。在一些態樣中，第二疫苗組合物與上文所述之組合物或醫藥組合物相同。在一些態樣中，第二疫苗組合物與上文所述之組合物或醫藥組合物不同。在一些態樣中，第二疫苗組合物包含編碼至少一個抗原編碼核酸序列之黑猩猩腺病毒載體。在一些態樣中，至少一個由黑猩猩腺病毒載體編碼之抗原編碼核酸序列與任一上述組合物或載體之至少一個抗原編碼核酸序列相同。
本文亦揭示製造本文所揭示之任一上述組合物之一或多種載體，該方法包含：獲得包含RNA阿爾法病毒主鏈及新抗原盒之線性化DNA序列；藉由將線性化DNA序列添加至活體外轉錄反應來活體外轉錄線性化DNA序列，該活體外轉錄反應含有所有使線性化DNA序列轉錄成RNA所需之組分，視情況進一步包含將m7g帽活體外添加至所得RNA；及自活體外轉錄反應分離一或多種載體。在一些態樣中，線性化DNA序列係藉由線性化DNA質體序列或藉由使用PCR擴增產生。在一些態樣中，DNA質體序列係利用細菌重組、或全基因體DNA合成、或全基因體DNA合成及合成之DNA在細菌細胞中擴增中之一者產生。在一些態樣中，自活體外轉錄反應分離一或多種載體涉及酚氯仿萃取、基於二氧化矽管柱之純化或類似RNA純化方法中之一或多者。
本文亦揭示製造本文所揭示組合物之方法，該方法包含：提供奈米微粒遞送媒劑之組分；提供新抗原表現系統；及提供足以使奈米微粒遞送媒劑及新抗原表現系統產生用於遞送新抗原表現系統之組合物之條件。在一些態樣中，各條件係藉由微流體混合來提供。
本文亦揭示製造本文所揭示之腺病毒載體之方法，該方法包含：獲得包含至少一個啟動子序列及新抗原盒之質體序列；使質體序列轉染至一或多個宿主細胞中；及自一或多個宿主細胞分離腺病毒載體。
在一些態樣中，分離包含：使宿主細胞溶解以獲得包含腺病毒載體之細胞溶解物；及自細胞溶解物純化腺病毒載體。
在一些態樣中，質體序列係利用細菌重組、或全基因體DNA合成、或全基因體DNA合成及合成之DNA在細菌細胞中擴增中之一者產生。在一些態樣中，一或多個宿主細胞係CHO、HEK293或其變體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6及AE1-2a細胞中之至少一者。在一些態樣中，自細胞溶解物純化腺病毒載體涉及層析分離、離心、病毒沈澱及過濾中之一或多者。
序列表
本申請案含有經由EFS-Web提交之序列表且其以引用方式全文併入本文中。該ASCII拷貝創建於20XX年XX月，命名為XXXXXUS_sequencelisting.txt，且大小為X,XXX,XXX個位元組。I. 定義
一般而言，申請專利範圍及說明書中所用術語意欲理解為具有熟習此項技術者所理解之普通含義。某些術語定義於下文中以提供額外清晰性。在普通含義與所提供定義衝突之情形下，欲使用所提供之定義。
如本文所用術語「抗原」係引起免疫反應之物質。
如本文所用術語「新抗原」係例如經由腫瘤細胞中之突變或腫瘤細胞所特有之轉譯後修飾具有至少一個使其不同於相應野生型抗原之變化的抗原。新抗原可包括多肽序列或核苷酸序列。突變可包括框移或非框移插入/缺失、誤義或無義取代、剪接位點變化、基因體重排或基因融合或產生neoORF之任何基因體或表現變化。突變亦可包括剪接變體。腫瘤細胞所特有之轉譯後修飾可包括異常磷酸化。腫瘤細胞所特有之轉譯後修飾亦可包括蛋白酶體產生之剪接抗原。參見Liepe等人，A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides; Science. 2016年10月21日;354(6310):354-358。
如本文所用術語「腫瘤新抗原」係存在於個體之腫瘤細胞或組織中、但不存在於個體之相應正常細胞或組織中之新抗原。
如本文所用術語「基於新抗原之疫苗」係基於一或多種新抗原(例如複數種新抗原)之疫苗構築體。
如本文所用術語「候選新抗原」係產生可代表新抗原之新序列之突變或其他畸變。
如本文所用術語「編碼區」係基因之編碼蛋白質之部分。
如本文所用術語「編碼突變」係出現在編碼區中之突變。
如本文所用術語「ORF」意指開放閱讀框。
如本文所用術語「NEO-ORF」係源自突變或其他畸變(例如剪接)之腫瘤特異性ORF。
如本文所用術語「誤義突變」係引起一個胺基酸至另一者之取代之突變。
如本文所用術語「無義突變」係引起胺基酸至終止密碼子之取代或引起典型起始密碼子去除之突變。
如本文所用術語「框移突變」係引起蛋白質之框架變化之突變。
如本文所用術語「插入/缺失」係插入或缺失一或多個核酸。
如本文所用術語「一致性」百分數在兩個或更多個核酸或多肽序列背景下係指如利用下文所述序列比較演算法中之一者(例如，BLASTP及BLASTN或熟習此項技術者可獲得之其他演算法)或藉由目視檢查所量測，當針對最大對應比較及比對時，兩個或更多個序列或子序列具有指定的相同核苷酸或胺基酸殘基百分比。端視應用，「一致性」百分數可存在於所比較之序列區域內(例如功能結構域內)，或者存在於欲比較之兩個序列之全長內。
就序列比較而言，一個序列通常用作與測試序列進行比較之參考序列。當利用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列坐標，並指定序列演算法程式參數。隨後，序列比較演算法將基於所指定之程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分數。或者，可藉由特定核苷酸之共同存在或不存在來確立序列相似性或相異性，或對於所轉譯序列藉由所選序列位置(例如，序列基序)之胺基酸來確立序列相似性或相異性。
可藉由例如以下方法實施序列之最佳比對以供比較：Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源性演算法；Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)之同源性比對演算法；Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之相似性方法之探索；該等演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)或目視檢查(通常參見Ausubel等人，參見下文)。
適於測定序列一致性及序列相似性百分數之演算法之一個實例係BLAST演算法，其闡述於Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中。用於實施BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。
如本文所用術語「不終止或通讀」係使得天然終止密碼子去除之突變。
如本文所用術語「表位」係抗原之通常由抗體或T細胞受體結合之特異性部分。
如本文所用術語「免疫原性」係例如經由T細胞、B細胞或二者引發免疫反應之能力。
如本文所用術語「HLA結合親和力」、「MHC結合親和力」意指特異性抗原與特異性MHC對偶基因之間之結合親和力。
如本文所用術語「餌」係用於自樣品富集特異性DNA或RNA序列之核酸探針。
如本文所用術語「變體」係個體核酸與用作對照之參考人類基因體之間的差異。
如本文所用術語「變體呼叫」係通常根據測序之變體存在之演算法測定。
如本文所用術語「多型性」係生殖系變體，即在個體之所有帶有DNA之細胞中發現之變體。
如本文所用術語「體細胞變體」係在個體之非生殖系細胞中出現之變體。
如本文所用術語「對偶基因」係基因之形式或遺傳序列之形式或蛋白質之形式。
如本文所用術語「HLA型」係HLA基因對偶基因之補體。
如本文所用術語「無義介導之衰變」或「NMD」係因早熟的終止密碼子所致之細胞對mRNA之降解。
如本文所用術語「幹枝性突變」係起始於腫瘤形成早期且存在於腫瘤細胞之實質性部分中之突變。
如本文所用術語「亞純系突變」係起始於腫瘤形成晚期且僅存在於腫瘤細胞之亞組中之突變。
如本文所用術語「外顯子體」係編碼蛋白質之基因體之亞組。外顯子體可為基因體之集體外顯子。
如本文所用術語「邏輯式迴歸」係來自統計之二進制數據之迴歸模型，其中將應變數等於1之羅吉特機率(logit of the probability)建模為應變數之線性函數。
如本文所用術語「神經網路」係機器學習分類或迴歸模型，其係由多個線性轉換層、隨後通常經由隨機梯度下降及反向傳播訓練之逐元素非線性組成。
如本文所用術語「蛋白質體」係由細胞、細胞之群或個體表現及/或轉譯之所有蛋白質之集合。
如本文所用術語「肽體」係由細胞表面上之MHC-I或MHC-II呈遞之所有肽之集合。肽體可指細胞或細胞集合之總稱(例如，腫瘤肽體意指包含腫瘤之所有細胞之肽體的組合)。
如本文所用術語「ELISPOT」意指酶聯免疫吸附斑點分析，其係監測人類及動物中之免疫反應之常用方法。
如本文所用術語「表位肽多聚體(dextramer)」係用於流式細胞術中之抗原特異性T細胞染色之基於聚葡萄糖之肽-MHC多聚體。
如本文所用術語「耐受性或免疫耐受性」係針對一或多種抗原(例如自身抗原)之免疫非反應性之狀態。
如本文所用術語「中樞耐受性」係藉由缺失自身反應性T細胞純系或藉由促使自身反應性T細胞純系分化成免疫抑制調節T細胞(Treg)而在胸腺中受影響之耐受性。
如本文所用術語「周邊耐受性」係藉由使倖免於中樞耐受性之自身反應性T細胞下調或無反應或促使該等T細胞分化成Treg而在周邊中受影響之耐受性。
術語「樣品」可包括藉由包括靜脈穿刺、排泄、射精、按摩、生檢、針抽吸、灌洗樣品、刮擦、手術切口或介入在內之方式或業內已知之其他方式自個體獲取之單個細胞或多個細胞或細胞之片段或體液之等份。
術語「個體」涵蓋人類或非人類細胞、組織或生物體，無論活體內、離體或活體外、雄性或雌性。術語個體包括哺乳動物，包括人類。
術語「哺乳動物」涵蓋人類及非人類二者且包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、犬、貓、鼠類、牛、馬及豬。
術語「臨床因素」係指個體病況(例如疾病活動性或嚴重程度)之量度。「臨床因素」涵蓋個體健康狀況之所有標記物(包括非樣品標記物)及/或個體之其他特徵，例如(但不限於)年齡及性別。臨床因素可為可自評估個體或測定條件下之個體之樣品(或樣品之群)獲得的分數、值或值集。臨床因素亦可藉由標記物及/或其他參數(例如基因表現代用品)來預測。臨床因素可包括腫瘤類型、腫瘤亞型及吸煙史。
術語「衍生自腫瘤之抗原編碼核酸序列」係指例如經由RT-PCR直接自腫瘤提取之核酸序列；或藉由對腫瘤測序且然後使用測序數據例如經由業內已知之多種合成或基於PCR之方法合成核酸序列獲得之序列數據。
術語「阿爾法病毒」係指披膜病毒科(Togaviridae )之成員，且為正義單股RNA病毒。阿爾法病毒通常分類為舊世界病毒(Old World virus)，例如辛得比斯病毒(Sindbis virus)、羅氏河病毒(Ross River virus)、馬亞羅病毒(Mayaro virus)、屈公熱病毒(Chikungunya virus)及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)；或新世界病毒(New World virus)，例如東方馬腦炎病毒(eastern equine encephalitis virus)、奧拉病毒(Aura virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)或委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)及其衍生物品系TC-83。阿爾法病毒通常係自我複製RNA病毒。
術語「阿爾法病毒主鏈」係指阿爾法病毒之允許病毒基因體自我複製之最小序列。最小序列可包括用於非結構蛋白介導之擴增之保守序列、非結構蛋白1 (nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因、nsP4基因及聚A序列以及表現包括26S啟動子元件之亞基因體病毒RNA之序列。
術語「用於非結構蛋白介導之擴增之序列」包括業內熟知之阿爾法病毒保守序列元件(CSE)。CSE包括(但不限於)阿爾法病毒5’端UTR、51-nt CSE、24-nt CSE或其他26S亞基因體啟動子序列、19-nt CSE及阿爾法病毒3’端UTR。
術語「RNA聚合酶」包括催化RNA多核苷酸根據DNA模板產生之聚合酶。RNA聚合酶包括(但不限於)噬菌體衍生之聚合酶，包括T3、T7及SP6。
術語「脂質」包括疏水及/或兩親性分子。脂質可為陽離子、陰離子或中性的。脂質可為合成或天然衍生的且在一些情況下為生物可降解的。脂質可包括膽固醇、磷脂、脂質結合物(包括但不限於聚乙二醇(PEG)結合物(聚乙二醇化脂質))、蠟、油、甘油酯、脂肪及脂溶性維生素。脂質亦可包括二亞麻油基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(MC3)及MC3樣分子。
術語「脂質奈米粒子」或「LNP」包括使用包圍水性內部之含脂質之膜形成之囊泡樣結構，亦稱為脂質體。脂質奈米粒子包括基於脂質之組合物，其含有藉由表面活性劑穩定之固體脂質核心。核心脂質可為脂肪酸、醯基甘油、蠟及該等表面活性劑之混合物。生物膜脂質(例如磷脂、鞘磷脂、膽汁鹽(牛磺膽酸鈉)及固醇(膽固醇))可用作穩定劑。脂質奈米粒子可使用所定義比率之不同脂質分子、包括(但不限於)所定義比率之一或多種陽離子、陰離子或中性脂質形成。脂質奈米粒子可將分子囊封於外膜殼內且隨後可與靶細胞接觸以將所囊封分子遞送至宿主細胞胞質液。脂質奈米粒子可經非脂質分子(包括在其表面上)改質或功能化。脂質奈米粒子可為單層的(單層)或多層的(多層)。脂質奈米粒子可與核酸複合。單層脂質奈米粒子可與核酸複合，其中核酸處於水性內部。多層脂質奈米粒子可與核酸複合，其中核酸處於水性內部，或夾在雙層脂質之間。
縮寫：MHC：主要組織相容性複合體；HLA：人類白血球抗原或人類MHC基因座；NGS：次世代測序；PPV：陽性預測值；TSNA：腫瘤特異性新抗原；FFPE：經福馬林固定、石蠟包埋；NMD：無義介導之衰變；NSCLC：非小細胞肺癌；DC：樹突細胞。
應注意，除非上下文另外明確指明，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a、an)」及「該」包括複數個指示物。
除非明確說明或另外自上下文顯而易見，否則如本文所用術語「約」應理解為在業內正常耐受性之範圍內，例如在平均值之2個標準偏差內。約可理解為在所述值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%內。除非上下文另外明確說明，否則本文所提供之所有數值均由術語約修飾。
本文中未直接定義之任何術語應理解為具有通常與如本發明領域內所理解相關之含義。在本文中論述某些術語以向實踐者提供闡述本發明各態樣之組合物、裝置、方法及諸如此類以及如何製備或使用其之額外指導。應瞭解，同一事物可以有一種以上之說法。因此，對於本文中所論述術語中之任一或多者可使用替代性語言及同義詞。術語是否詳述或論述於本文中並不重要。提供一些同義詞或可取代方法、材料及諸如此類。除非明確說明，否則一個或幾個同義詞或等效物之陳述並不排除使用其他同義詞或等效物。使用實例(包括術語之實例)係僅出於說明目的且並不限制本文之本發明各態樣之範圍及含義。
出於所有目的，本說明書主體內所引用之所有參考文獻、已頒佈專利及專利申請案之全文皆以引用方式併入本文中。II. 鑑別新抗原之方法
本文揭示自個體腫瘤鑑別新抗原之方法，該等新抗原可能呈遞於腫瘤或免疫細胞(包括專業抗原呈遞細胞，例如樹突細胞)之細胞表面上，及/或可能具有免疫原性。作為實例，一種該方法可包含以下步驟：獲得個體腫瘤細胞之外顯子體、轉錄體或全基因體腫瘤核苷酸測序數據中之至少一者，其中使用腫瘤核苷酸測序數據來獲得代表新抗原集中每一者之肽序列之數據，且其中每一新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之變化；將每一新抗原之肽序列輸入一或多種呈遞模型中以產生每一新抗原由個體腫瘤細胞之腫瘤細胞表面或存在於腫瘤中之細胞上的一或多個MHC對偶基因呈遞之數值似然度集，該數值似然度集已至少基於所獲得之質譜數據鑑別；及基於數值似然度集選擇新抗原集之子集以產生經選擇新抗原集。
呈遞模型可包含對包含相應標記集之參考數據集(亦稱為訓練數據集)進行訓練之統計迴歸或機器學習(例如深度學習)模型，其中參考數據集係自複數個不同個體中之每一者獲得，其中視情況一些個體可患有腫瘤，且其中參考數據集包含以下中之至少一者：代表腫瘤組織之外顯子體核苷酸序列之數據、代表正常組織之外顯子體核苷酸序列之數據、代表腫瘤組織之轉錄體核苷酸序列之數據、代表腫瘤組織之蛋白質體序列之數據以及代表腫瘤組織之MHC肽體序列之數據及代表正常組織之MHC肽體序列之數據。參考數據可進一步包含單一對偶基因細胞系(其經改造以表現預定MHC對偶基因且隨後暴露於合成蛋白)、正常及腫瘤人類細胞系以及新鮮及冷凍原始樣品及T細胞分析(例如，ELISPOT)之質譜數據、測序數據、RNA-seq數據及蛋白質體學數據。在某些態樣中，參考數據集包括參考數據之每一形式。
呈遞模型可包含至少部分衍生自參考數據集之特徵集，且其中特徵集包含對偶基因依賴性特徵及對偶基因非依賴性特徵中之至少一者。在某些態樣中包括每一特徵。
本文亦揭示產生構築個人化癌症疫苗之輸出之方法，其係藉由自個體之一或多個腫瘤細胞鑑別可能呈遞於腫瘤細胞表面上之一或多種新抗原來實施。作為實例，一種該方法可包含以下步驟：獲得個體之腫瘤細胞及正常細胞之外顯子體、轉錄體或全基因體核苷酸測序數據中之至少一者，其中核苷酸測序數據用於獲得代表新抗原集中每一者之肽序列之數據，該新抗原集係藉由比較腫瘤細胞之核苷酸測序數據與正常細胞之核苷酸測序數據來鑑別，且其中每一新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於自個體之正常細胞鑑別之相應野生型肽序列之變化；將每一新抗原之肽序列編碼至相應數值載體中，每一數值載體包括關於構成肽序列之複數個胺基酸及肽序列中胺基酸之位置集的資訊；使用電腦處理器將數值載體輸入深度學習呈遞模型中以產生新抗原集之呈遞似然度集，該集中之每一呈遞似然度代表相應新抗原由個體腫瘤細胞表面上之一或多個II類MHC對偶基因呈遞之似然度；基於呈遞似然度集選擇新抗原集之子集以產生經選擇新抗原集；及基於經選擇新抗原集產生構築個人化癌症疫苗之輸出。
在一些實施例中，呈遞模型包含至少基於訓練數據集鑑別之複數個參數及基於數值載體及參數代表作為輸入接收之數值載體與作為輸出產生之呈遞似然度之間的關係之函數。在某些實施例中，訓練數據集包含藉由質譜獲得之標記，該質譜量測鑑別為存在於複數個樣品中之至少一者之結合至至少一個II類MHC對偶基因之肽的存在；訓練肽序列，其編碼為包括關於構成肽序列之複數個胺基酸及肽序列中胺基酸之位置集之資訊的數值載體；及至少一個與訓練肽序列相關之HLA對偶基因。
樹突細胞對初始T細胞特徵之呈遞可包含以下中之至少一者：上文所述之特徵。疫苗中抗原之劑量及類型。(例如，肽、mRNA、病毒等)：(1)樹突細胞(DC)吸收抗原類型之途徑(例如，胞吞作用、微胞飲作用)；及/或(2) DC所吸收抗原之效能。疫苗中佐劑之劑量及類型。疫苗抗原序列之長度。疫苗投與之次數及位點。基線患者免疫功能(例如，如藉由最近感染史、血球計數等所量測)。對於RNA疫苗：(1)樹突細胞中mRNA蛋白質產物之轉換率；(2) mRNA在由樹突細胞攝取後之轉譯速率，如在活體外或活體內實驗中所量測；及/或(3) mRNA在由樹突細胞攝取後之轉譯次數或週期，如藉由活體內或活體外實驗所量測。肽中蛋白酶裂解基序之存在，該等裂解基序視情況給予通常在樹突細胞中表現之蛋白酶額外重量(如藉由RNA-seq或質譜所量測)。典型活化樹突細胞中蛋白酶體及免疫蛋白酶體之表現量(其可藉由RNA-seq、質譜、免疫組織化學或其他標準技術來量測)。所討論個體中特定MHC對偶基因之表現量(例如，如藉由RNA-seq或質譜所量測)，視情況在活化樹突細胞或其他免疫細胞中特異性量測。在表現特定MHC對偶基因之其他個體中藉由特定MHC對偶基因之肽呈遞機率，視情況在活化樹突細胞或其他免疫細胞中特異性量測。在其他個體中藉由同一家族分子中之MHC對偶基因(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)之肽呈遞機率，視情況在活化樹突細胞或其他免疫細胞中特異性量測。
免疫耐受性逃脫特徵可包含以下中之至少一者：經由對一或若干細胞類型實施之蛋白質質譜直接量測自身肽體。藉由聯合自身蛋白質之所有k聚體(例如5-25)子串來估計自身肽體。利用與上文所述應用於所有非突變自身蛋白質之呈遞模型相似之呈遞模型來估計自身肽體，視情況將生殖系變體考慮在內。
可至少部分基於數值似然度使用由至少一種模型提供之複數種新抗原來實施分級。在分級後，可根據選擇準則實施選擇以選擇經分級新抗原之子集。在選擇後，可提供經分級肽之子集作為輸出。
經選擇新抗原集之數量可為20。
呈遞模型可代表以下之間之依賴性：MHC對偶基因中之特定一者及肽序列特定位置之特定胺基酸之對的存在；與藉由該對之MHC對偶基因中之特定一者，該包含特定位置之特定胺基酸之肽序列呈遞於腫瘤細胞表面上的似然度。
本文所揭示之方法亦可包括將一或多種呈遞模型應用於相應新抗原之肽序列以產生一或多個MHC對偶基因中每一者之依賴性分數，其指示MHC對偶基因是否將基於至少相應新抗原之肽序列之胺基酸位置來呈遞相應新抗原。
本文所揭示之方法亦可包括轉換依賴性分數以產生每一MHC對偶基因之相應每一對偶基因似然度，其指示相應MHC對偶基因將呈遞相應新抗原之似然度；及組合每一對偶基因似然度以產生數值似然度。
轉換依賴性分數之步驟可將相應新抗原之肽序列之呈遞建模為互斥。
本文所揭示之方法亦可包括轉換依賴性分數之組合以產生數值似然度。
轉換依賴性分數之組合之步驟可將相應新抗原之肽序列之呈遞建模為MHC對偶基因之間之干擾。
數值似然度集可進一步藉由至少一個對偶基因非相互作用特徵來鑑別，且本文所揭示之方法亦可包括將一或多種呈遞模型中之對偶基因非相互作用者應用於對偶基因非相互作用特徵以產生對偶基因非相互作用特徵之依賴性分數，其指示相應新抗原之肽序列是否將基於對偶基因非相互作用特徵來呈遞。
本文所揭示之方法亦可包括組合一或多個MHC對偶基因中之每一MHC對偶基因之依賴性分數與對偶基因非相互作用特徵之依賴性分數；轉換每一MHC對偶基因之經組合依賴性分數以產生MHC對偶基因之相應每一對偶基因似然度，其指示相應MHC對偶基因將呈遞相應新抗原之似然度；及組合每一對偶基因似然度以產生數值似然度。
本文所揭示之方法亦可包括轉換每一MHC對偶基因之依賴性分數及對偶基因非相互作用特徵之依賴性分數的組合以產生數值似然度。
呈遞模型之數值參數集可基於訓練數據集來訓練，該訓練數據集包括至少鑑別為存在於複數個樣品中之訓練肽序列集及一或多個與每一訓練肽序列相關之MHC對偶基因，其中訓練肽序列係經由自衍生自複數個樣品之MHC對偶基因溶析之分離肽的質譜來鑑別。
樣品亦可包括經改造以表現單一I類或II類MHC對偶基因之細胞系。
樣品亦可包括經改造以表現複數個I類或II類MHC對偶基因之細胞系。
樣品亦可包括自複數個患者獲得或衍生之人類細胞系。
樣品亦可包括自複數個患者獲得之新鮮或冷凍腫瘤樣品。
樣品亦可包括自複數個患者獲得之新鮮或冷凍組織樣品。
樣品亦可包括利用T細胞分析鑑別之肽。
訓練數據集可進一步包括與以下相關之數據：存在於樣品中之訓練肽集之肽豐度；樣品中訓練肽集之肽長度。
訓練數據集可經由與包含已知蛋白質序列集之數據庫比對比較訓練肽序列集來產生，其中訓練蛋白質序列集長於且包括訓練肽序列。
訓練數據集可基於對細胞系實施或已實施核苷酸測序來產生以獲得細胞系之外顯子體、轉錄體或全基因體測序數據中之至少一者，測序數據包括至少一個包括變化之核苷酸序列。
訓練數據集可基於獲得正常組織樣品之外顯子體、轉錄體及全基因體正常核苷酸測序數據中之至少一者來產生。
訓練數據集可進一步包括與樣品相關之蛋白質體序列相關之數據。
訓練數據集可進一步包括與樣品相關之MHC肽體序列相關之數據。
訓練數據集可進一步包括與至少一個分離肽之肽-MHC結合親和力量測值相關之數據。
訓練數據集可進一步包括與針對至少一個分離肽之肽-MHC結合穩定性量測值相關之數據。
訓練數據集可進一步包括與樣品相關之轉錄體相關之數據。
訓練數據集可進一步包括與樣品相關之基因體相關之數據。
訓練肽序列可具有介於k聚體範圍內之長度，其中對於I類MHC，k介於8-15之間且包括8及15，或對於II類MHC，k介於6-30之間且包括6及30。
本文所揭示之方法亦可包括利用獨熱編碼方案來編碼肽序列。
本文所揭示之方法亦可包括利用左填充獨熱編碼方案來編碼訓練肽序列。
治療患有腫瘤之個體之方法，其包含實施本文所述任一新抗原鑑別方法之步驟，且進一步包含獲得包含經選擇新抗原集之腫瘤疫苗，及向個體投與腫瘤疫苗。
本文所揭示之方法亦可包括鑑別一或多種對子集中之至少一種新抗原具有抗原特異性之T細胞。在一些實施例中，鑑別包含在擴增一或多種抗原特異性T細胞之條件下共培養一或多種T細胞與子集中之一或多種新抗原。在其他實施例中，鑑別包含使一或多種T細胞與包含子集中之一或多種新抗原之四聚體在允許T細胞與四聚體結合之條件下接觸。在甚至其他實施例中，本文所揭示之方法亦可包括鑑別一或多種經鑑別T細胞之一或多種T細胞受體(TCR)。在某些實施例中，鑑別一或多種T細胞受體包含對一或多種經鑑別T細胞之T細胞受體序列進行測序。本文所揭示之方法可進一步包含對複數種T細胞進行遺傳改造以表現一或多種經鑑別T細胞受體中之至少一者；在使複數種T細胞擴增之條件下培養複數種T細胞；及將所擴增T細胞輸注至個體中。在一些實施例中，對複數種T細胞進行遺傳改造以表現一或多種經鑑別T細胞受體中之至少一者包含將一或多種經鑑別T細胞之T細胞受體序列選殖至表現載體中；及用表現載體轉染複數種T細胞中之每一者。在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包含在使一或多種經鑑別T細胞擴增之條件下培養一或多種經鑑別T細胞；及將所擴增T細胞輸注至個體中。
本文亦揭示經分離T細胞，其對子集中之至少一種經選擇新抗原具有抗原特異性。
本文亦揭示製造腫瘤疫苗之方法，其包含以下步驟：獲得個體腫瘤細胞之外顯子體、轉錄體或全基因體腫瘤核苷酸測序數據中之至少一者，其中使用腫瘤核苷酸測序數據來獲得代表新抗原集中每一者之肽序列之數據，且其中每一新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之變化；將每一新抗原之肽序列輸入一或多種呈遞模型中以產生每一新抗原由個體腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上的一或多個MHC對偶基因呈遞之數值似然度集，該數值似然度集已至少基於所接收之質譜數據鑑別；及基於數值似然度集選擇新抗原集之子集以產生經選擇新抗原集；及產生或已產生包含經選擇新抗原集之腫瘤疫苗。
本文亦揭示包括經選擇新抗原集之腫瘤疫苗，其係藉由實施包含以下步驟之方法來選擇：獲得個體腫瘤細胞之外顯子體、轉錄體或全基因體腫瘤核苷酸測序數據中之至少一者，其中使用腫瘤核苷酸測序數據來獲得代表新抗原集中每一者之肽序列之數據，且其中每一新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之變化；將每一新抗原之肽序列輸入一或多種呈遞模型中以產生每一新抗原由個體腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上之一或多個MHC對偶基因呈遞的數值似然度集，該數值似然度集已至少基於所接收之質譜數據鑑別；及基於數值似然度集選擇新抗原集之子集以產生經選擇新抗原集；及產生或已產生包含經選擇新抗原集之腫瘤疫苗。
腫瘤疫苗可包括核苷酸序列、多肽序列、RNA、DNA、細胞、質體或載體中之一或多者。
腫瘤疫苗可包括一或多種呈遞於腫瘤細胞表面上之新抗原。
腫瘤疫苗可包括一或多種在個體中具有免疫原性之新抗原。
腫瘤疫苗可不包括一或多種誘導針對個體中之正常組織之自體免疫反應之新抗原。
腫瘤疫苗可包括佐劑。
腫瘤疫苗可包括賦形劑。
本文所揭示之方法亦可包括基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加的呈遞於腫瘤細胞表面上之似然度的新抗原。
本文所揭示之方法亦可包括基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加的能夠誘導個體中之腫瘤特異性免疫反應之似然度的新抗原。
本文所揭示之方法亦可包括基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加的能夠藉由專業抗原呈遞細胞(APC)呈遞至初始T細胞之似然度的新抗原，視情況其中APC係樹突細胞(DC)。
本文所揭示之方法亦可包括基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有減小的經歷經由中樞或周邊耐受性抑制之似然度的新抗原。
本文所揭示之方法亦可包括基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有減小的能夠誘導個體中之針對正常組織之自體免疫反應之似然度的新抗原。
外顯子體或轉錄體核苷酸測序數據可藉由對腫瘤組織實施測序來獲得。
測序可為次世代測序(NGS)或任一大量平行測序方法。
數值似然度集可進一步藉由至少MHC對偶基因相互作用特徵步來鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者：MHC對偶基因及新抗原編碼肽結合之預測親和力；新抗原編碼肽-MHC複合體之預測穩定性；新抗原編碼肽之序列及長度；具有相似序列之新抗原編碼肽在表現特定MHC對偶基因之其他個體之細胞中之呈遞機率，如藉由質譜蛋白質體學或其他方式所評價；特定MHC對偶基因在所討論個體中之表現量(例如如藉由RNA-seq或質譜所量測)；在表現特定MHC對偶基因之其他不同個體中藉由特定MHC對偶基因呈遞之總體新抗原編碼肽序列非依賴性機率；在其他不同個體中之同一家族分子(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)中藉由MHC對偶基因呈遞之總體新抗原編碼肽序列非依賴性機率。
數值似然度集係進一步藉由至少MHC對偶基因非相互作用特徵來鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者：在其源蛋白序列內側接新抗原編碼肽之C端及N端序列；在新抗原編碼肽中存在蛋白酶裂解基序，視情況根據相應蛋白酶在腫瘤細胞中之表現(如藉由RNA-seq或質譜所量測)來加權；如在適宜細胞類型中量測之源蛋白之轉換率；源蛋白之長度，視情況考慮在腫瘤細胞中最高表現之特異性剪接變體(「異型體」)，如藉由RNA-seq或蛋白質體質譜所量測，或如根據在DNA或RNA序列數據中檢測到之生殖系或體細胞剪接突變之註解所預測；蛋白酶體、免疫蛋白酶體、胸腺蛋白酶體或其他蛋白酶在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質體質譜或免疫組織化學來量測)；新抗原編碼肽之源基因之表現(例如，如藉由RNA-seq或質譜所量測)；新抗原編碼肽之源基因在細胞週期之各個階段期間之典型組織特異性表現；源蛋白及/或其結構域之特徵總目，如可參見例如uniProt或PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do；闡述含有肽之源蛋白之結構域性質之特徵，例如：二級或三級結構(例如，α螺旋對β褶板)；選擇式剪接；所討論新抗原編碼肽之源蛋白之肽在其他不同個體中之呈遞機率；因技術偏差無法藉由質譜檢測到肽或該肽過表現之機率；如藉由RNASeq所量測之多個基因模組/路徑(其無需含有肽之源蛋白)之表現，其為腫瘤細胞、基質或腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之狀態之資訊；腫瘤細胞中新抗原編碼肽之源基因之拷貝數；肽結合至TAP之機率或經量測或預測之肽與TAP之結合親和力；TAP在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質體質譜、免疫組織化學來量測)；存在或不存在腫瘤突變，包括(但不限於)：諸如EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3等已知癌症驅動基因，及在編碼參與抗原呈遞機制之蛋白質之基因(例如，B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體之組分之基因中的任一者)中。依賴於抗原呈遞機制之在腫瘤中經歷功能喪失型突變之組分呈遞之肽具有減小的呈遞機率；存在或不存在功能生殖系多型性，包括(但不限於)：在編碼參與抗原呈遞機制之蛋白質之基因(例如，B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體之組分之基因中的任一者)中；腫瘤類型(例如，NSCLC、黑色素瘤)；臨床腫瘤亞型(例如，鱗狀肺癌對非鱗狀)；吸煙史；肽之源基因在相關腫瘤類型或臨床亞型中之典型表現，視情況藉由驅動突變分層。
至少一個變化可為框移或非框移插入/缺失、誤義或無義取代、剪接位點變化、基因體重排或基因融合或產生neoORF之任何基因體或表現變化。
腫瘤細胞可選自由以下組成之群：肺癌、黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病及T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。
本文所揭示之方法亦可包括獲得包含經選擇新抗原集或其子集之腫瘤疫苗，視情況進一步包含向個體投與腫瘤疫苗。
經選擇新抗原集中之至少一種新抗原在呈多肽形式時可包括以下中之至少一者：與MHC之結合親和力之IC50值小於1000 nM；對於I類MHC多肽，長度為8-15個(8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個)胺基酸，對於II類MHC多肽，長度為6-30個(6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)胺基酸；在親代蛋白質序列中之多肽內或附近存在促進蛋白酶體裂解之序列基序；及存在促進TAP轉運之序列基序。對於II類MHC，在肽內或附近存在促進藉由細胞外或溶酶體蛋白酶(例如細胞自溶酶)裂解之序列基序或HLA-DM催化之HLA結合。
本文亦揭示產生用於鑑別一或多種可能呈遞於腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上之新抗原之模型的方法，其包含以下步驟：接收質譜數據，其包含與自衍生自複數個樣品之主要組織相容性複合體(MHC)溶析之複數個分離肽相關之數據；藉由至少鑑別存在於樣品中之訓練肽序列集及一或多個與每一訓練肽序列相關之MHC來獲得訓練數據集；利用包含訓練肽序列之訓練數據集來訓練呈遞模型之數值參數集，該呈遞模型提供腫瘤細胞之肽序列由腫瘤細胞表面上之一或多個MHC對偶基因呈遞之複數種數值似然度。
呈遞模型可代表以下之間之依賴性：肽序列特定位置之特定胺基酸之存在；與腫瘤細胞上之一個MHC對偶基因對含有特定位置之特定胺基酸之肽序列的呈遞似然度。
樣品亦可包括經改造以表現單一I類或II類MHC對偶基因之細胞系。
樣品亦可包括經改造以表現複數個I類或II類MHC對偶基因之細胞系。
樣品亦可包括自複數個患者獲得或衍生之人類細胞系。
樣品亦可包括自複數個患者獲得之新鮮或冷凍腫瘤樣品。
樣品亦可包括利用T細胞分析鑑別之肽。
訓練數據集可進一步包括與以下相關之數據：存在於樣品中之訓練肽集之肽豐度；樣品中訓練肽集之肽長度。
本文所揭示之方法亦可包括經由與包含已知蛋白質序列集之數據庫比對比較訓練肽序列集來獲得基於訓練肽序列之訓練蛋白質序列集，其中該訓練蛋白質序列集長於且包括訓練肽序列。
本文所揭示之方法亦可包括對細胞系實施或已實施質譜以獲得細胞系之外顯子體、轉錄體或全基因體核苷酸測序數據中之至少一者，該核苷酸測序數據包括至少一個包括突變之蛋白質序列。
本文所揭示之方法亦可包括：利用獨熱編碼方案來編碼訓練肽序列。
本文所揭示之方法亦可包括獲得正常組織樣品之外顯子體、轉錄體及全基因體正常核苷酸測序數據中之至少一者；及利用正常核苷酸測序數據來訓練呈遞模型之參數集。
訓練數據集可進一步包括與樣品相關之蛋白質體序列相關之數據。
訓練數據集可進一步包括與樣品相關之MHC肽體序列相關之數據。
訓練數據集可進一步包括與至少一個分離肽之肽-MHC結合親和力量測值相關之數據。
訓練數據集可進一步包括與針對至少一個分離肽之肽-MHC結合穩定性量測值相關之數據。
訓練數據集可進一步包括與樣品相關之轉錄體相關之數據。
訓練數據集可進一步包括與樣品相關之基因體相關之數據。
本文所揭示之方法亦可包括使參數集邏輯迴歸。
訓練肽序列可具有介於k聚體範圍內之長度，其中對於I類MHC，k介於8-15之間且包括8及15，或對於II類MHC，k介於6-30之間且包括6及30。
本文所揭示之方法亦可包括利用左填充獨熱編碼方案來編碼訓練肽序列。
本文所揭示之方法亦可包括利用深度學習演算法來確定參數集之值。
本文揭示用於鑑別一或多種可能呈遞於腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上之新抗原之方法，其包含執行以下步驟：接收質譜數據，其包含與自衍生自複數個新鮮或冷凍腫瘤樣品之主要組織相容性複合體(MHC)溶析之複數個分離肽相關之數據；藉由至少鑑別存在於腫瘤樣品中且呈遞於一或多個與每一訓練肽序列相關之MHC對偶基因上之訓練肽序列集來獲得訓練數據集；基於訓練肽序列獲得訓練蛋白質序列集；及利用訓練蛋白質序列及訓練肽序列來訓練呈遞模型之數值參數集，該呈遞模型提供腫瘤細胞之肽序列由腫瘤細胞表面上之一或多個MHC對偶基因呈遞之複數種數值似然度。
呈遞模型可代表以下之間之依賴性：MHC對偶基因中之特定一者及肽序列特定位置之特定胺基酸之對的存在；與藉由該對之MHC對偶基因中之特定一者，該包含特定位置之特定胺基酸之肽序列呈遞於腫瘤細胞表面上的似然度。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中選擇新抗原之子集之原因在於，相對於一或多種不同的腫瘤新抗原，每一者具有增加的呈遞於腫瘤細胞表面上之似然度。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中選擇新抗原之子集之原因在於，相對於一或多種不同的腫瘤新抗原，每一者具有增加的能夠誘導個體中之腫瘤特異性免疫反應之似然度。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中選擇新抗原之子集之原因在於，相對於一或多種不同的腫瘤新抗原，每一者具有增加的能夠藉由專業抗原呈遞細胞(APC)呈遞至初始T細胞之似然度，視情況其中該APC係樹突細胞(DC)。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中選擇新抗原之子集之原因在於，相對於一或多種不同的腫瘤新抗原，每一者具有減小的經歷經由中樞或周邊耐受性抑制之似然度。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中選擇新抗原之子集之原因在於，相對於一或多種不同的腫瘤新抗原，每一者具有減小的能夠誘導針對個體中之正常組織之自體免疫反應之似然度。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中選擇新抗原之子集之原因在於，在腫瘤細胞對APC中每一者具有減小的經差別轉譯後修飾之似然度，視情況其中該APC係樹突細胞(DC)。
除非另有指示，否則本文方法之實踐將採用熟習此項技術者所熟知之習用蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學方法。該等技術於文獻中充分解釋。例如，參見T.E. Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc.，目前新增)；Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編輯，Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences ，第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey及SundbergAdvanced Organic Chemistry 第3 版 (Plenum Press) A卷及B卷(1992)。III. 新抗原中腫瘤特異性突變之鑑別
本文亦揭示用於鑑別某些突變(例如，存在於癌細胞中之變體或對偶基因)之方法。具體而言，該等突變可存在於患有癌症之個體癌細胞中之基因體、轉錄體、蛋白質體或外顯子體中，但不存在於該個體之正常組織中。
若腫瘤中之遺傳突變排他性地引起腫瘤中蛋白質之胺基酸序列變化，則可認為該等遺傳突變可用於腫瘤之免疫靶向。有用突變包括：(1)非同義突變，其產生蛋白質中之不同胺基酸；(2)通讀突變，其中終止密碼子經修飾或缺失，使得在C端具有新穎腫瘤特異性序列之較長蛋白質轉譯；(3)剪接位點突變，其使得在成熟mRNA中納入內含子且因此產生獨特的腫瘤特異性蛋白質序列；(4)染色體重排，其產生在2種蛋白質之接合處具有腫瘤特異性序列之嵌合蛋白(即，基因融合)；(5)框移突變或缺失，其產生具有新穎腫瘤特異性蛋白質序列之新開放閱讀框。突變亦可包括以下中之一或多者：非框移插入/缺失、誤義或無義取代、剪接位點變化、基因體重排或基因融合或產生neoORF之任何基因體或表現變化。
腫瘤細胞中具有突變之肽或源自例如剪接位點、框移、通讀或基因融合突變之突變多肽可藉由對腫瘤對正常細胞中之DNA、RNA或蛋白質測序來鑑別。
突變亦可包括先前鑑別之腫瘤特異性突變。已知腫瘤突變可參見癌症之體細胞突變目錄(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer，COSMIC)數據庫。
可使用多種方法來檢測個體DNA或RNA中具體突變或對偶基因之存在。在此領域中之先進性已提供準確、容易且廉價之大規模SNP基因分型。舉例而言，業內已闡述若干技術，包括動態對偶基因特異性雜交(DASH)、微量板陣列對角線凝膠電泳(MADGE)、焦磷酸測序、寡核苷酸特異性連結、TaqMan系統以及多種DNA「晶片」技術(例如Affymetrix SNP晶片)。該等方法利用通常藉由PCR來擴增靶遺傳區域。其他方法基於藉由侵入性裂解產生小信號分子，然後進行質譜或經固定扣鎖探針及滾環擴增。業內已知用於檢測特異性突變之若干方法概述於下文中。
基於PCR之檢測方法可包括複數個標記物之同時多重擴增。舉例而言，業內熟知選擇PCR引子來產生大小不重疊且可同時分析之PCR產物。或者，可用經差別標記且因此各自可經差別檢測之引子來擴增不同標記物。當然，基於雜交之檢測方法允許差別檢測樣品中之多個PCR產物。其他技術為業內已知以允許複數個標記物之多重分析。
業內已研發出若干方法來幫助分析基因體DNA或細胞RNA中之單核苷酸多型性。舉例而言，可藉由使用專門外核酸酶抗性核苷酸來檢測單鹼基多型性，如例如Mundy, C. R. (美國專利第4,656,127號)中所揭示。根據該方法，容許與緊接多型性位點3'端之對偶基因序列互補之引子與自具體動物或人類獲得之靶分子雜交。若靶分子上之多型性位點含有與所存在之具體外核酸酶抗性核苷酸衍生物互補之核苷酸，則該衍生物將納入雜交引子之末端上。該納入使得引子對外核酸酶有抗性，且藉此容許其檢測。由於已知樣品之外核酸酶抗性衍生物之屬性，引子已變得對外核酸酶有抗性之發現揭露，存在於靶分子之多型性位點中之核苷酸與用於反應中之核苷酸衍生物之核苷酸互補。此方法之優點在於其無需測定大量外源序列數據。
可使用基於溶液之方法來確定多型性位點之核苷酸之屬性。Cohen, D.等人(法國專利2,650,840；PCT申請案第WO91/02087號)。如在美國專利第4,656,127號之Mundy方法中，採用與緊接多型性位點3'端之對偶基因序列互補之引子。該方法利用經標記之二去氧核苷酸衍生物確定該位點之核苷酸之屬性，該等二去氧核苷酸衍生物若與多型性位點之核苷酸互補，則將變得納入引子之末端上。
稱為遺傳位元分析或GBA之替代方法闡述於Goelet, P.等人(PCT申請案第92/15712號)中。Goelet, P.等人之方法使用經標記終止子及與多型性位點3'端之序列互補之引子的混合物。因此，所納入之經標記終止子係由存在於所評估靶分子之多型性位點中之核苷酸確定且與其互補。與Cohen等人之方法(法國專利2,650,840；PCT申請案第WO91/02087號)不同，Goelet, P.等人之方法可為異質相分析，其中將引子或靶分子固定至固相。
業內已闡述用於分析DNA中之多型性位點之若干引子引導之核苷酸納入程序(Komher, J. S.等人，Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989)；Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990)；Syvanen, A.-C.等人，Genomics 8:684-692 (1990)；Kuppuswamy, M. N.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991)；Prezant, T. R.等人，Hum. Mutat. 1:159-164 (1992)；Ugozzoli, L.等人，GATA 9:107-112 (1992)；Nyren, P.等人，Anal. Biochem. 208:171-175 (1993))。該等方法與GBA之不同之處在於，其利用納入經標記去氧核苷酸來區分多型性位點之鹼基。在該格式中，由於信號與所納入去氧核苷酸之數量成比例，故在相同核苷酸之運行中出現之多型性可產生與運行之長度成比例之信號(Syvanen, A.-C.等人，Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993))。
大量行動直接自數百萬個個別DNA或RNA分子並行獲得序列資訊。即時單分子合成測序技術依賴於螢光核苷酸在納入與所測序模板互補之初生DNA股中時之檢測。在一方法中，將長度為30-50個鹼基之寡核苷酸之5'末端共價錨定至玻璃蓋玻片。該等錨定股具有兩種功能。第一，其在模板經構形具有與表面結合寡核苷酸互補之捕獲尾時用作靶模板股之捕獲位點。其亦作為引子用於形成序列讀取基礎之模板引導之引子延伸。捕獲引子用作固定位置位點利用多個合成、檢測及化學裂解染料-連接體以去除染料之週期進行序列測定。每一週期係由添加聚合酶/經標記核苷酸混合物、沖洗、成像及裂解染料組成。在替代方法中，聚合酶經螢光供體分子修飾且固定於載玻片上，而每一核苷酸經附接至γ-磷酸酯之受體螢光部分色彩編碼。在經螢光修飾之核苷酸變得納入新生鏈中時，該系統檢測帶有螢光標籤之聚合酶與該核苷酸之間的相互作用。業內亦存在其他合成測序技術。
可使用任何適宜合成測序平臺來鑑別突變。如上文所述，當前可獲得四個主要的合成測序平臺：來自Roche/454 Life Sciences之基因體測序儀、來自Illumina/Solexa之1G分析儀、來自Applied BioSystems之SOLiD系統及來自Helicos Biosciences之Heliscope系統。合成測序平臺亦已闡述於Pacific BioSciences and VisiGen Biotechnologies中。在一些實施例中，使複數個所測序核酸分子結合至載體(例如，固體載體)。為使核酸固定於載體上，可在模板之3'及/或5'末端添加捕獲序列/通用啟動位點。可藉由使捕獲序列與共價附接至載體之互補序列雜交使核酸結合至載體。捕獲序列(亦稱為通用捕獲序列)係與附接至載體之序列互補之核酸序列，其可雙重地用作通用引子。
作為捕獲序列之替代，偶合對(例如抗體/抗原對、受體/配體對或抗生物素蛋白-生物素對，如例如美國專利申請案第2006/0252077號中所述)之成員可連接至每一片段以在經該偶合對之各別第二成員塗覆之表面上被捕獲。
在捕獲後，可例如藉由單分子檢測/測序來分析序列，例如如實例中及美國專利第7,283,337號中所述，包括模板依賴性合成測序。在合成測序中，使表面結合分子在聚合酶存在下暴露於複數個經標記之核苷酸三磷酸酯。根據經標記核苷酸納入生長鏈之3'末端中之順序來確定模板之序列。此可即時進行或可以分步重複模式進行。對於即時分析，可納入針對每一核苷酸之不同光學標記，且可使用多個雷射來刺激所納入之核苷酸。
測序亦可包括其他大量平行測序或次世代測序(NGS)技術及平臺。大量平行測序技術及平臺之其他實例係Illumina HiSeq或MiSeq、Thermo PGM或Proton、Pac Bio RS II或Sequel、Qiagen基因讀取器及Oxford Nanopore MinION。可使用其他類似當前大量平行測序技術以及該等技術之未來世代。
可使用任何細胞類型或組織來獲得用於本文所述方法中之核酸樣品。舉例而言，可自腫瘤或體液(例如藉由已知技術(例如靜脈穿刺)獲得之血液或唾液)獲得DNA或RNA樣品。或者，可對乾燥樣品(例如毛髮或皮膚)實施核酸測試。另外，可自腫瘤獲得樣品用於測序且可自正常組織獲得另一樣品用於測序，其中正常組織具有與腫瘤相同之組織類型。可自腫瘤獲得樣品用於測序且可自正常組織獲得另一樣品用於測序，其中正常組織具有相對於腫瘤不同之組織類型。
腫瘤可包括以下中之一或多者：肺癌、黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病及T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。
或者，可使用蛋白質質譜來鑑別或驗證結合至腫瘤細胞上之MHC蛋白之突變肽之存在。肽可自腫瘤細胞或自腫瘤免疫沈澱之HLA分子進行酸溶析，且然後利用質譜鑑別。IV. 新抗原
新抗原可包括核苷酸或多肽。舉例而言，新抗原可為編碼多肽序列之RNA序列。因此，可用於疫苗中之新抗原可包括核苷酸序列或多肽序列。
本文揭示包含藉由本文所揭示之方法鑑別之腫瘤特異性突變之分離肽、包含已知腫瘤特異性突變之肽及藉由本文所揭示之方法鑑別之突變體多肽或其片段。新抗原肽可闡述於其編碼序列背景下，其中新抗原包括編碼相關多肽序列之核苷酸序列(例如，DNA或RNA)。
一或多種由新抗原核苷酸序列編碼之多肽可包含以下中之至少一者：與MHC之結合親和力之IC50值小於1000 nM；對於I類MHC肽，長度為8-15個(8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個)胺基酸；在肽內或附近存在促進蛋白酶體裂解之序列基序；及存在促進TAP轉運之序列基序。對於II類MHC肽，長度為6-30個(6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個)胺基酸；在肽內或附近存在促進藉由細胞外或溶酶體蛋白酶(例如細胞自溶酶)裂解之序列基序或HLA-DM催化之HLA結合。
一或多種新抗原可呈遞於腫瘤之表面上。
一或多種新抗原在患有腫瘤之個體中可具有免疫原性，例如能夠引發個體中之T細胞反應或B細胞反應。
在患有腫瘤之個體之疫苗產生背景下可不予考慮一或多種誘導個體中之自體免疫反應之新抗原。
至少一種新抗原肽分子之大小可包含(但不限於)約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、約25個、約26個、約27個、約28個、約29個、約30個、約31個、約32個、約33個、約34個、約35個、約36個、約37個、約38個、約39個、約40個、約41個、約42個、約43個、約44個、約45個、約46個、約47個、約48個、約49個、約50個、約60個、約70個、約80個、約90個、約100個、約110個、約120個或更多個胺基分子殘基及其中衍生之任一範圍。在特定實施例中，新抗原肽分子等於或小於50個胺基酸。
新抗原肽及多肽可為：對於I類MHC，長度為15個殘基或更短且通常係由約8個至約11個殘基、具體而言9個或10個殘基組成；對於II類MHC，長度為6-30個殘基且包括6個及30個。
若需要，可以若干方式設計較長肽。在一情形下，當預測或已知HLA對偶基因上之肽呈遞似然度時，較長肽可由以下中之任一者組成：(1)朝向每一相應基因產物之N端及C端延伸2-5個胺基酸之個別經呈遞肽；(2)一些或所有經呈遞肽與各自之延伸序列之串聯。在另一情形下，當測序揭露存在於腫瘤中之長(＞10個殘基)新表位序列(例如歸因於產生新穎肽序列之框移、通讀或內含子納入)時，較長肽將由以下組成：(3)整段新穎腫瘤特異性胺基酸，因此不需要最強HLA呈遞之較短肽之計算選擇或基於活體外測試之選擇。在兩種情形下，使用較長肽允許藉由患者細胞進行內源加工且可引起更有效的抗原呈遞及T細胞反應誘導。
新抗原肽及多肽可呈遞於HLA蛋白上。在一些態樣中，新抗原肽及多肽以大於野生型肽之親和力呈遞於HLA蛋白上。在一些態樣中，新抗原肽或多肽之IC50可為至少小於5000 nM、至少小於1000 nM、至少小於500 nM、至少小於250 nM、至少小於200 nM、至少小於150 nM、至少小於100 nM、至少小於50 nM或更小。
在一些態樣中，新抗原肽及多肽在投與個體時並不誘導自體免疫反應及/或引起免疫耐受性。
本文亦提供包含至少兩個或更多種新抗原肽之組合物。在一些實施例中，組合物含有至少兩個不同肽。至少兩個不同肽可衍生自同一多肽。不同多肽意指肽之長度、胺基酸序列或二者有所變化。肽衍生自已知或已經發現含有腫瘤特異性突變之任何多肽。可衍生出新抗原肽之適宜多肽可參見例如COSMIC數據庫。COSMIC策展(curate)關於人類癌症中之體細胞突變之全面資訊。肽含有腫瘤特異性突變。在一些態樣中，腫瘤特異性突變係具體癌症類型之驅動突變。
具有期望活性或性質之新抗原肽及多肽可經修飾以提供某些期望屬性，例如經改良之藥理學特徵，同時增加或至少保留未經修飾肽之實質上所有的生物活性以結合期望MHC分子並活化適宜T細胞。例如，新抗原肽及多肽可經歷多種變化，例如保守或非保守取代，其中該等變化可提供其應用中之某些優點，例如經改良之MHC結合、穩定性或呈遞。保守取代意指用在生物及/或化學上類似之另一胺基酸殘基替代胺基酸殘基，例如用一個疏水殘基替代另一疏水殘基，或用一個極性殘基替代另一極性殘基。取代包括諸如以下等組合：Gly、Ala；Val、Ile、Leu、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。單一胺基酸取代之效應亦可利用D-胺基酸來探測。該等修飾可利用如例如以下文獻中所述之熟知肽合成程序來製備：Merrifield, Science 232:341-347 (1986)；Barany及Merrifield, The Peptides, Gross及Meienhofer編輯(N.Y., Academic Press)，第1-284頁(1979)；以及Stewart及Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce)第2版(1984)。
用多種胺基酸模擬物或非天然胺基酸修飾肽及多肽尤其可用於增加活體內肽及多肽之穩定性。穩定性可以多種方式來分析。例如，已使用肽酶及各種生物介質(例如人類血漿及血清)來測試穩定性。例如，參見Verhoef等人，Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291-302 (1986)。可便捷地利用25%人類血清(v/v)分析來測定肽之半衰期。方案通常如下所述。在使用之前藉由離心對經彙集之人類血清(AB型，非熱不活化)脫脂。然後用RPMI組織培養基將血清稀釋至25%且用於測試肽穩定性。以預定時間間隔去除少量反應溶液且添加至6%三氯乙酸水溶液或乙醇中。將渾濁反應樣品冷卻(4℃) 15分鐘且然後旋轉以使沈澱的血清蛋白成團。然後藉由反相HPLC利用穩定性特異性層析條件來確定肽之存在。
肽及多肽可經修飾以提供除經改良之血清半衰期外之期望屬性。例如，可藉由連接至含有至少一個能夠誘導T輔助細胞反應之表位之序列來增強肽誘導CTL活性之能力。免疫原性肽/T輔助結合物可藉由間隔體分子來連接。間隔體通常包含在生理條件下實質上不帶電之相對較小之中性分子，例如胺基酸或胺基酸模擬物。間隔體通常選自例如Ala、Gly或非極性胺基酸或中性極性胺基酸之其他中性間隔體。應理解，視情況存在之間隔體無需包含相同殘基且因此可為異源或同源寡聚物。當存在時，間隔體通常將為至少一或兩個殘基，更通常3至6個殘基。或者，肽可不經間隔體連接至T輔助肽。
新抗原肽可直接或經由肽之胺基或羧基末端之間隔體連接至T輔助肽。新抗原肽或T輔助肽之胺基末端可經醯化。實例性T輔助肽包括破傷風類毒素830-843、流行性感冒307-319、瘧疾環子孢子382-398及378-389。
蛋白質或肽可藉由熟習此項技術者已知之任何技術來製備，該技術包括經由標準分子生物技術表現蛋白質、多肽或肽、自天然來源分離蛋白質或肽、或化學合成蛋白或肽。先前已揭示對應於各個基因之核苷酸及蛋白質、多肽及肽序列，且可參見熟習此項技術者已知之電腦化數據庫。一個該數據庫係國家生物技術資訊中心之基因庫及位於國立衛生研究院(National Institutes of Health)網站之GenPept數據庫。已知基因之編碼區可利用本文所揭示或如熟習此項技術者已知之技術來擴增及/或表現。或者，熟習此項技術者已知蛋白質、多肽及肽之多種商業製劑。
在另一態樣中，新抗原包括編碼新抗原肽或其部分之核酸(例如多核苷酸)。多核苷酸可為例如DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA (例如，mRNA)，單股及/或雙股或天然或穩定形式之多核苷酸，例如具有硫代磷酸酯主鏈之多核苷酸，或其組合，且其可或可不含內含子。另一態樣提供能夠表現多肽或其部分之表現載體。用於不同細胞類型之表現載體為業內所熟知且可無需過多實驗來選擇。一般而言，將DNA以適當取向及正確閱讀框插入表現載體(例如質體)中用於表現。若需要，可將DNA連接至由期望宿主識別之適宜轉錄及轉譯調節控制核苷酸序列，但該等控制通常可用於表現載體中。然後經由標準技術將載體引入宿主中。指導可參見例如Sambrook等人(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y。V. 疫苗組合物
本文亦揭示能夠引起特異性免疫反應(例如腫瘤特異性免疫反應)之免疫原性組合物，例如疫苗組合物。疫苗組合物通常包含複數種例如利用本文所述之方法選擇之新抗原。疫苗組合物亦可稱為疫苗。
疫苗可含有1至30種肽，2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種、25種、26種、27種、28種、29種或30種不同的肽，6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種或14種不同的肽，或12種、13種或14種不同的肽。肽可包括轉譯後修飾。疫苗可含有1至100個或更多個核苷酸序列，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個或更多個不同核苷酸序列，6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個或14個不同核苷酸序列，或12個、13個或14個不同核苷酸序列。疫苗可含有1至30種新抗原序列，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個或更多個不同新抗原序列，6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個或14個不同新抗原序列，或12個、13個或14個不同新抗原序列。
在一個實施例中，選擇不同的肽及/或多肽或編碼其之核苷酸序列，以使得肽及/或多肽能夠與不同的MHC分子(例如不同的I類MHC分子及/或不同的II類MHC分子)締合。在一些態樣中，一種疫苗組合物包含能夠與最常出現之I類MHC分子及/或不同的II類MHC分子締合之肽及/或多肽之編碼序列。因此，疫苗組合物可包含能夠與至少2種較佳、至少3種較佳或至少4種較佳I類MHC分子及/或不同的II類MHC分子締合之不同片段。
疫苗組合物可能夠引起特異性細胞毒性T細胞反應及/或特異性輔助T細胞反應。
疫苗組合物可進一步包含佐劑及/或載劑。有用佐劑及載劑之實例於下文給出。組合物可與載劑(例如蛋白質或抗原呈遞細胞，例如能夠將肽呈遞至T細胞之樹突細胞(DC))締合。
佐劑係於疫苗組合物中之混合物增加或以其他方式改質針對新抗原之免疫反應之任何物質。載劑可為新抗原能夠締合之支架結構，例如多肽或多醣。視情況，佐劑共價或非共價結合。
佐劑增加針對抗原之免疫反應之能力通常表現為免疫介導之反應顯著或實質性增加或疾病症狀減輕。舉例而言，體液免疫性之增加通常表現為針對抗原產生之抗體效價之顯著增加，且T細胞活性之增加通常係以增加的細胞增殖或細胞細胞毒性或細胞介素分泌來表現。佐劑亦可例如藉由將原發性體液或Th反應變成原發性細胞或Th反應來改變免疫反應。
適宜佐劑包括(但不限於) 1018 ISS、明礬、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(Imiquimod)、ImuFact IMP321、IS貼片、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯脂質A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel載體系統、PLG微粒、雷西莫特(resiquimod)、SRL172、病毒體及其他類病毒粒子、YF-17D、VEGF捕集器、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、衍生自皂素之Aquila QS21刺激子(Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA)、分枝桿菌提取物及合成細菌細胞壁模擬物及其他專有佐劑(例如Ribi之Detox. Quil或Superfos)。諸如弗氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant)或GM-CSF等佐劑係有用的。先前已闡述特異性針對樹突細胞之若干免疫佐劑(例如，MF59)及其製備(Dupuis M等人，Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27；Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11)。亦可使用細胞介素。若干細胞介素與以下直接相關：影響樹突細胞至淋巴組織之遷移(例如，TNF-α)、加速樹突細胞至T淋巴球之有效抗原呈遞細胞之成熟(例如GM-CSF、IL-1及IL-4) (美國專利第5,849,589號，其全文以引用方式明確併入本文中)及用作免疫佐劑(例如，IL-12) (Gabrilovich D I等人，J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418)。
亦已報導CpG免疫刺激寡核苷酸增強佐劑在疫苗環境中之效應。亦可使用其他TLR結合分子，例如結合TLR 7、TLR 8及/或TLR 9之RNA。
有用佐劑之其他實例包括(但不限於)經化學修飾之CpG (例如CpR, Idera)、聚(I:C) (例如聚i:CI2U)、非CpG細菌DNA或RNA以及免疫活性小分子及抗體，例如環磷醯胺、舒尼替尼(sunitinib)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、西樂葆(celebrex)、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉菲尼(sorafinib)、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼(pazopanib)、ZD2171、AZD2171、伊匹單抗(ipilimumab)、曲美目單抗(tremelimumab)及SC58175，其可用於治療及/或用作佐劑。佐劑及添加劑之量及濃度可容易地由熟習此項技術者無需過多實驗來確定。其他佐劑包括群落刺激因子，例如粒子球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF、沙格司亭(sargramostim))。
疫苗組合物可包含一種以上之不同佐劑。此外，治療組合物可包含包括上述任一者或其組合之任何佐劑物質。亦預期疫苗及佐劑可一起投與或以任一適宜序列分開投與。
載劑(或賦形劑)可獨立於佐劑存在。載劑之功能可為例如增加具體而言突變體之分子量以增加活性或免疫原性、賦予穩定性、增加生物活性或延長血清半衰期。此外，載劑可幫助將肽呈遞至T細胞。載劑可為熟習此項技術者已知之任何適宜載劑，例如蛋白質或抗原呈遞細胞。載體蛋白可為(但不限於)鑰孔帽貝血藍蛋白、血清蛋白(例如運鐵蛋白、牛血清白蛋白、人類血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或卵白蛋白)、免疫球蛋白或激素(例如胰島素或棕櫚酸)。為對人類進行免疫，載劑通常為生理上可接受之為人類可接受且安全之載劑。然而，破傷風類毒素及/或白喉類毒素係適宜載劑。或者，載劑可為聚葡萄糖，例如瓊脂糖。
細胞毒性T細胞(CTL)識別呈結合至MHC分子之肽形式之抗原而非完整外源性抗原自身。MHC分子自身位於抗原呈遞細胞之細胞表面上。因此，若存在肽抗原、MHC分子及APC之三聚複合體，則可活化CTL。相應地，若不僅使用肽來活化CTL，且若另外一起添加APC與各別MHC分子，則其可增強免疫反應。因此，在一些實施例中，疫苗組合物另外含有至少一種抗原呈遞細胞。
新抗原亦可納入基於病毒載體之疫苗平臺中，例如牛痘、雞痘、自我複製α病毒、馬拉巴病毒(marabavirus)、腺病毒(例如，參見Tatsis等人，Adenoviruses,Molecular Therapy (2004) 10, 616-629)或慢病毒屬，包括(但不限於)第二代、第三代或雜合第二代/第三代慢病毒屬及經設計以靶向特定細胞類型或受體之任一代重組慢病毒屬(例如，參見Hu等人，Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases,Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61；Sakuma等人，Lentiviral vectors: basic to translational,Biochem J. (2012) 443(3):603-18；Cooper等人，Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690；Zufferey等人，Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery,J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880)。端視上文所提及基於病毒載體之疫苗平臺之封裝能力，此方法可遞送一或多個編碼一或多種新抗原肽之核苷酸序列。該等序列可側接有非突變序列，可藉由連接體分開或之前可為一或多個靶向亞細胞隔室之序列(例如，參見Gros等人，Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients,Nat Med. (2016) 22 (4):433-8；Stronen等人，Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires,Science. (2016) 352 (6291):1337-41；Lu等人，Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions,Clin Cancer Res . (2014) 20(13):3401-10)。在引入宿主中後，受感染細胞表現新抗原，且由此引發針對肽之宿主免疫(例如CTL)反應。可用於免疫方案中之牛痘載體及方法闡述於例如美國專利第4,722,848號中。另一載體係BCG (卡介苗)。BCG載體闡述於Stover等人(Nature 351:456-460 (1991))中。熟習此項技術者根據本文描述將明瞭可用於新抗原之治療性投與或免疫之眾多種其他疫苗載體，例如傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhi)載體及諸如此類。V.A. 新抗原盒
鑒於本文所提供之教示，用於選擇一或多種新抗原、選殖及構築「盒」以及將其插入病毒載體中之方法為業內所熟知。「新抗原盒」意指一種經選擇新抗原或複數種新抗原與轉錄新抗原及表現經轉錄產物所需之其他調節元件之組合。一種新抗原或複數種新抗原可以容許轉錄之方式可操作地連接至調節組分。該等組分包括可驅動新抗原在經病毒載體轉染之細胞中表現之習用調節元件。因此，新抗原盒亦可含有經選擇啟動子，其連接至新抗原且與其他可選調節元件一起位於重組載體之經選擇病毒序列內。
有用啟動子可為組成型啟動子或調節型(誘導型)啟動子，其將使得能夠控制欲表現新抗原之量。舉例而言，合意啟動子係巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子[例如，參見Boshart等人，Cell, 41:521-530 (1985)]。另一合意啟動子包括勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus) LTR啟動子/增強子。另一啟動子/增強子序列係雞細胞質β-肌動蛋白啟動子[T. A. Kost等人，Nucl. Acids Res., 11(23):8287 (1983)]。其他適宜或合意啟動子可由熟習此項技術者來選擇。
新抗原盒亦可包括病毒載體序列之異源核酸序列，包括提供轉錄本之有效多腺苷酸化信號之序列(聚(A)、聚A或pA)及具有功能性剪接供體及受體位點之內含子。常用於本發明實例性載體中之聚A序列係衍生自乳多泡病毒SV-40者。聚A序列通常可插入在基於新抗原之序列之後且在病毒載體序列之前的盒中。常用內含子序列亦可衍生自SV-40，且稱為SV-40 T內含子序列。新抗原盒亦可含有位於啟動子/增強子序列與新抗原之間之該內含子。該等及其他常用載體元件之選擇係習用的[例如，參見Sambrook等人，「Molecular Cloning. A Laboratory Manual.」，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)及其中所引用之參考文獻]且許多該等序列可購自商業及工業來源以及基因庫。
新抗原盒可具有一或多種新抗原。舉例而言，給定盒可包括1-10種、1-20種、1-30種、10-20種、15-25種、15-20種、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種或更多種新抗原。新抗原可彼此直接連接。新抗原亦可利用連接體彼此連接。新抗原可相對於彼此呈任一定向，包括N至C或C至N。
如上文所述，新抗原盒可位於病毒載體之任何所選缺失之位點，例如尤其可選擇E1基因區缺失或E3基因區缺失之位點。V.B. 免疫檢查點
本文所述之載體(例如本文所述之C68載體或本文所述之阿爾法病毒載體)可包含編碼至少一種新抗原之核酸，且相同或單獨載體可包含編碼至少一種免疫調節劑(例如抗體，例如scFv)之核酸，該免疫調節劑結合且阻斷免疫檢查點分子之活性。載體可包含新抗原盒及一或多個編碼檢查點抑制劑之核酸分子。
可經靶向以阻斷或抑制之說明性免疫檢查點分子包括(但不限於) CTLA-4、4-1BB (CD137)、4-1BBL (CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4 (屬CD2分子家族且在所有NK、γδ及記憶CD8+ (αβ) T細胞上表現)、CD160 (亦稱為BY55)及CGEN-15049。免疫檢查點抑制劑包括結合並阻斷或抑制以下中之一或多者之活性的抗體或其抗原結合片段或其他結合蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160及CGEN-15049。說明性免疫檢查點抑制劑包括曲美目單抗(CTLA-4阻斷抗體)、抗OX40、PD-L1單株抗體(抗B7-H1；MEDI4736)、伊匹單抗、MK-3475 (PD-1阻斷劑)、尼沃魯單抗(抗PD1抗體)、CT-011 (抗PD1抗體)、BY55單株抗體、AMP224 (抗PDL1抗體)、BMS-936559 (抗PDL1抗體)、MPLDL3280A (抗PDL1抗體)、MSB0010718C (抗PDL1抗體)及益伏(Yervoy)/伊匹單抗(抗CTLA-4檢查點抑制劑)。可使用業內普通技術將抗體編碼序列改造至載體(例如C68)中。實例性方法闡述於Fang等人，Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide.Nat Biotechnol. 2005年5月;23(5):584-90. Epub 2005年4月17日中；其出於所有目的以引用方式併入本文中。V.C. 關於疫苗設計及製造之其他考慮因素 V.C.1. 涵蓋所有腫瘤亞純系之肽集之測定
可對幹枝性肽(意指由所有或大部分腫瘤亞純系呈遞之彼等)進行優先級排序以納入疫苗中53 。視情況，若不存在經預測以高機率呈遞且具免疫原性之幹枝性肽，或若經預測以高機率呈遞且具免疫原性之幹枝性肽之數量足夠小使得其他非幹枝性肽可納入疫苗中，則可藉由估計腫瘤亞純系之數量及屬性並選擇肽來對其他肽進行優先級排序以最大化疫苗所涵蓋之腫瘤亞純系之數量54 。V.C.2. 新抗原優先級排序
在施加所有上述新抗原過濾器後，仍可將多於疫苗技術可支持之候選新抗原用於疫苗納入。另外，可保留關於新抗原分析之多個態樣之不確定性且在候選疫苗新抗原之不同性質之間可存在取捨。因此，可考慮整合多維模型來代替選擇過程之每一步驟之預定過濾器，該多維模型將候選新抗原置於具有至少以下軸線之空間中且利用積分方法來最佳化選擇。 1. 自體免疫性或耐受性風險(生殖系風險) (較低的自體免疫性風險通常較佳) 2. 測序假影機率(較低假影機率通常較佳) 3. 免疫原性機率(較高免疫原性機率通常較佳) 4. 呈遞機率(較高呈遞機率通常較佳) 5. 基因表現(較高表現通常較佳) 6. HLA基因之覆蓋率(參與新抗原集呈遞之較大量HLA分子可經由使HLA分子下調或突變來降低腫瘤逃脫免疫攻擊之機率) 7. HLA類別之覆蓋率(覆蓋HLA-I及HLA-II二者可增加治療性反應之機率且減小腫瘤逃脫之機率)
另外，視情況，若新抗原經預測由在所有或一部分患者腫瘤中丟失或不活化之HLA對偶基因呈遞，則該等新抗原可自疫苗接種去優先級排序(例如排除)。HLA對偶基因丟失可由基因座之體細胞突變、喪失異型接合性或同型接合缺失引起。用於檢測HLA對偶基因體細胞突變之方法為業內所熟知，例如(Shukla等人，2015)。同樣詳細闡述用於檢測體細胞LOH及同型接合缺失(包括對於HLA基因座)之方法。(Carter等人，2012；McGranahan等人，2017；Van Loo等人，2010)。V.D. 阿爾法病毒 V.D.1. 阿爾法病毒生物學
阿爾法病毒係披膜病毒科之成員且為正義單股RNA病毒。阿爾法病毒亦可稱為自我複製RNA或srRNA。各成員通常分類為舊世界病毒，例如辛得比斯病毒、羅氏河病毒、馬亞羅病毒、屈公熱病毒及塞姆利基森林病毒；或新世界病毒，例如東方馬腦炎病毒、奧拉病毒、摩根堡病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒及其衍生物品系TC-83 (Strauss Microbrial Review 1994)。天然阿爾法病毒基因體之長度通常為約12kb，其前三分之二含有編碼非結構蛋白(nsP)之基因，該等非結構蛋白形成用於病毒基因體之自我複製之RNA複製複合物，且其後三分之一含有用於病毒粒子產生之編碼結構蛋白之亞基因體表現盒(Frolov RNA 2001)。
阿爾法病毒之模型生命週期涉及若干不同步驟(Strauss Microbrial Review 1994；Jose Future Microbiol 2009)。在病毒附接至宿主細胞後，病毒粒子在胞吞隔室內與膜融合，使得基因體RNA最終釋放至胞質液中。使呈正義股定向且包含5’端甲基鳥苷酸帽及3’端聚A尾之基因體RNA進行轉譯以產生形成複製複合物之非結構蛋白nsP1-4。在感染早期，正義股隨後藉由複合物複製負義股模板。在當前模型中，隨著感染進展進一步加工複製複合物，且切換所得經加工複合物以使負義股轉錄成全長正義股基因體RNA以及含有結構基因之26S亞基因體正義股RNA二者。阿爾法病毒之若干保守序列元件(CSE)經鑑別可潛在地在多個RNA複製步驟中起作用，包括：5’端UTR之補體在自負義股模板複製正義股RNA中，51-nt CSE在自基因體模板複製負義股合成中，nsP與26S RNA之間之接合區中之24-nt CSE在自負義股轉錄亞基因體RNA中，及3’端19-nt CSE在自正義股模板合成負義股中。
在多種RNA物質複製後，病毒粒子隨後通常組裝於病毒之天然生命週期中。使26S RNA轉譯且進一步加工所得蛋白質以產生包括衣殼蛋白、醣蛋白E1及E2及兩種小多肽E3及6K之結構蛋白(Strauss 1994)。病毒RNA發生殼體化，且封裝通常僅對基因體RNA具有特異性之衣殼蛋白，然後病毒粒子組裝且在膜表面上出芽。V.D.2. 阿爾法病毒作為遞送載體
阿爾法病毒先前已經改造以用作表現載體系統(Pushko 1997；Rheme 2004)。阿爾法病毒具有若干優點，尤其在異源抗原表現可能合意之疫苗環境中。由於其可在宿主胞質液中自我複製，阿爾法病毒載體通常能夠在細胞內產生高拷貝數之表現盒，從而引起大量異源抗原產生。另外，載體通常為瞬時的，此可改良生物安全性且減少對載體之免疫耐受性之誘導。一般而言，與其他標準病毒載體(例如人類腺病毒)相比，公眾亦缺少針對阿爾法病毒載體之預先存在的免疫性。基於阿爾法病毒之載體亦通常引起針對受感染細胞之細胞毒性反應。細胞毒性在一定程度上在疫苗設定適當地引發針對所表現異源抗原之免疫反應方面可能至關重要。然而，期望細胞毒性之程度可為平衡措施，且因此已研發出若干減毒阿爾法病毒，包括VEE之TC-83品系。因此，本文所述之新抗原表現載體之實例可使用允許大量新抗原表現、引發穩健的針對新抗原之免疫反應、不引發針對載體自身之免疫反應且可以安全方式使用之阿爾法病毒主鏈。此外，新抗原表現盒可經設計以經由最佳化載體所用之阿爾法病毒序列(包括但不限於衍生自VEE或其減毒衍生物TC-83之序列)引發不同程度之免疫反應。
已使用阿爾法病毒序列改造了若干表現載體設計策略(Pushko 1997)。在一策略中，阿爾法病毒載體設計包括將26S啟動子序列元件之第二拷貝在結構蛋白基因下游插入，其後為異源基因(Frolov 1993)。因此，除天然非結構及結構蛋白外，產生表現異源蛋白質之其他亞基因體RNA。在此系統中，存在用於產生感染性病毒粒子之所有元件，且因此可在未受感染細胞中進行表現載體之重複多輪感染。
另一表現載體設計利用輔助病毒系統(Pushko 1997)。在此策略中，由異源基因替代結構蛋白。因此，在病毒RNA之自我複製由仍完整之非結構基因調介後，26S亞基因體RNA提供異源蛋白質之表現。傳統上，隨後反式(例如藉由共轉染細胞系)供應表現結構蛋白之其他載體，以產生感染性病毒。系統詳細闡述於USPN 8,093,021中，其全文出於所有目的以引用方式併入本文中。輔助載體系統提供限制形成感染性粒子之可能性之益處且因此改良生物安全性。另外，輔助載體系統減小總載體長度，潛在地改良複製及表現效率。因此，本文所述之新抗原表現載體之實例可使用阿爾法病毒主鏈，其中結構蛋白由新抗原盒替代，所得載體減少生物安全性問題，同時因總體表現載體大小減小而促進有效表現。V.D.3. 活體外 阿爾法病毒產生
阿爾法病毒遞送載體通常係正義RNA多核苷酸。業內熟知用於RNA產生之便捷技術係活體外轉錄IVT。在此技術中，首先藉由業內熟知之技術產生期望載體之DNA模板，該等技術包括標準分子生物學技術，例如選殖、限制性消化、連結、基因合成及聚合酶鏈式反應(PCR)。DNA模板在序列之5’端含有轉錄成RNA合意之RNA聚合酶啟動子。啟動子包括(但不限於)噬菌體聚合酶啟動子，例如T3、T7或SP6。然後將DNA模板與適當RNA聚合酶、緩衝劑及核苷酸(NTP)一起培育。可視情況進一步修飾所得RNA多核苷酸，包括(但不限於)添加5’端帽結構(例如7-甲基鳥苷或相關結構)及視情況修飾3’端以包括多腺苷酸(聚A)尾。然後可使用領域中熟知之技術(例如酚-氯仿萃取)來純化RNA。V.D.4. 經由脂質奈米粒子遞送
在疫苗載體設計中需考慮之重要態樣係針對載體自身之免疫性(Riley 2017)。此可呈預先存在之針對載體自身之免疫性(例如使用某些人類腺病毒系統)之形式或呈在投與疫苗後形成針對載體之免疫性之形式。後者在實施相同疫苗之多次投與(例如各別初免及加強劑量)時或在使用相同疫苗載體系統來遞送不同新抗原盒時係重要的考慮因素。
在阿爾法病毒載體之情形下，標準遞送方法係先前論述之輔助病毒系統，其反式提供衣殼、E1及E2蛋白以產生感染性病毒粒子。然而，重要的是應注意，E1及E2蛋白通常係中和抗體之主要靶標(Strauss 1994)。因此，若感染性粒子係由中和抗體靶向，則使用阿爾法病毒載體將所關注新抗原遞送至靶細胞之效能可能降低。
病毒粒子介導之基因遞送之替代方式係使用奈米材料來遞送表現載體(Riley 2017)。重要的是，奈米材料媒劑可由非免疫原性材料製得且通常避免引發針對遞送載體自身之免疫性。該等材料可包括(但不限於)脂質、無機奈米材料及其他聚合材料。脂質可為陽離子、陰離子或中性的。材料可為合成或天然衍生的且在一些情況下為生物可降解的。脂質可包括脂肪、膽固醇、磷脂、脂質結合物(包括但不限於聚乙二醇(PEG)結合物(聚乙二醇化脂質))、蠟、油、甘油酯及脂溶性維生素。
脂質奈米粒子(LNP)因脂質之兩親性使得能夠形成膜及囊泡樣結構而係吸引性遞送系統(Riley 2017)。一般而言，該等囊泡藉由吸收至靶細胞之膜中並將核酸釋放至胞質液中來遞送表現載體。另外，LNP可經進一步改質或功能化以有助於特定細胞類型之靶向。LNP設計之另一考慮因素係靶向效率與細胞毒性之間之平衡。脂質組合物通常包括陽離子、中性、陰離子及兩親性脂質之所定義混合物。在一些情況下，包括特定脂質以防止LNP聚集，防止脂質氧化，或提供有助於其他部分附接之功能性化學基團。脂質組合物可影響總體LNP大小及穩定性。在實例中，脂質組合物包含二亞麻油基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(MC3)或MC3樣分子。MC3及MC3樣脂質組合物可經調配以包括一或多種其他脂質，例如PEG或PEG結合脂質、固醇或中性脂質。
直接暴露於血清之核酸載體(例如表現載體)可具有若干不期望之結果，包括血清核酸酶對核酸之降解或游離核酸對免疫系統之脫靶刺激。因此，可利用囊封阿爾法病毒載體來避免降解，同時亦避免潛在的脫靶效應。在某些實例中，阿爾法病毒載體完全囊封在遞送媒劑內，例如囊封在LNP之水性內部內。將阿爾法病毒載體囊封在LNP內可藉由熟習此項技術者所熟知之技術(例如微流體混合及在微流體液滴產生裝置上實施之液滴產生)來實施。該等裝置包括(但不限於)標準T型匯流裝置或流動彙聚裝置。在實例中，將期望脂質調配物(例如含MC3或MC3樣分子之組合物)與阿爾法病毒遞送載體及其他期望藥劑並行提供至液滴產生裝置，使得遞送載體及期望藥劑完全囊封在基於MC3或MC3樣分子之LNP之內部內。在實例中，液滴產生裝置可控制所產生LNP之大小範圍及大小分佈。舉例而言，LNP可具有直徑在1奈米至1000奈米範圍內(例如1奈米、10奈米、50奈米、100奈米、500奈米或1000奈米)之大小。在液滴產生後，囊封表現載體之遞送媒劑可經進一步處理或改質以使其準備用於投與。V.E. 黑猩猩腺病毒 (ChAd) V.E.1. 利用黑猩猩腺病毒之病毒遞送
用於遞送一或多種新抗原(例如經由新抗原盒)之疫苗組合物可藉由提供黑猩猩起源之腺病毒核苷酸序列、多種新穎載體及表現黑猩猩腺病毒基因之細胞系來產生。可將黑猩猩C68腺病毒(在本文中亦稱為ChAdV68)之核苷酸序列用於新抗原遞送之疫苗組合物中(參見SEQ ID NO: 1)。C68腺病毒衍生載體之使用進一步詳細闡述於USPN 6,083,716中，其全文出於所有目的以引用方式併入本文中。
在另一態樣中，本文提供重組腺病毒，其包含黑猩猩腺病毒(例如C68)之DNA序列及可操作地連接至調節序列之新抗原盒，該等調節序列引導新抗原盒之表現。重組病毒能夠感染哺乳動物(較佳人類)細胞且能夠在細胞中表現新抗原盒產物。在此載體中，天然黑猩猩E1基因及/或E3基因及/或E4基因可缺失。新抗原盒可插入該等基因缺失位點中之任一者中。新抗原盒可包括為所引發免疫反應合意之新抗原。
在另一態樣中，本文提供用黑猩猩腺病毒(例如C68)感染之哺乳動物細胞。
在另一態樣中，提供新穎哺乳動物細胞系，其表現黑猩猩腺病毒基因(例如來自C68)或其功能片段。
在另一態樣中，本文提供將新抗原盒遞送至哺乳動物細胞中之方法，其包含將有效量之已經改造以表現新抗原盒之黑猩猩腺病毒(例如C68)引入細胞中之步驟。
另一態樣提供引發哺乳動物宿主中之免疫反應來治療癌症之方法。該方法可包含向宿主投與有效量之重組黑猩猩腺病毒(例如C68)之步驟，該重組黑猩猩腺病毒包含編碼來自免疫反應所靶向之腫瘤之一或多種新抗原之新抗原盒。
亦揭示非猿猴哺乳動物細胞，其表現自SEQ ID NO: 1之序列獲得之黑猩猩腺病毒基因。該基因可選自由SEQ ID NO: 1之腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5組成之群。
亦揭示核酸分子，其包含包括自SEQ ID NO: 1之序列獲得之基因之黑猩猩腺病毒DNA序列。該基因可選自由SEQ ID NO: 1之該等黑猩猩腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因組成之群。在一些態樣中，核酸分子包含SEQ ID NO: 1。在一些態樣中，核酸分子包含SEQ ID NO: 1之序列，缺少至少一個選自由SEQ ID NO: 1之E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因組成之群之基因。
亦揭示載體，其包含自SEQ ID NO: 1獲得之黑猩猩腺病毒DNA序列及可操作地連接至一或多個調節序列之新抗原盒，該一或多個調節序列引導該新抗原盒在異源宿主細胞中之表現，視情況其中黑猩猩腺病毒DNA序列包含至少複製及病毒粒子殼體化所需之順式元件、側接新抗原盒之順式元件及調節序列。在一些態樣中，黑猩猩腺病毒DNA序列包含選自由SEQ ID NO: 1之E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因序列組成之群之基因。在一些態樣中，載體可缺少E1A及/或E1B基因。
本文亦揭示宿主細胞，其用經改造以表現新抗原盒之本文所揭示之載體(例如C68載體)轉染。本文亦揭示人類細胞，其表現經由將本文所揭示之載體引入細胞中而引入其中之所選基因。
本文亦揭示將新抗原盒遞送至哺乳動物細胞之方法，其包含將有效量之經改造以表現新抗原盒之本文所揭示之載體(例如C68載體)引入該細胞中。
本文亦揭示產生新抗原之方法，其包含將本文所揭示之載體引入哺乳動物細胞中，在適宜條件下培養細胞及產生新抗原。V.E.2. E1 表現互補細胞系
為產生本文所述之任一基因缺失之重組黑猩猩腺病毒(Ad)，若病毒之複製及感染性需要，則缺失基因區域之功能可藉由輔助病毒或細胞系(即互補或封裝細胞系)供應至重組病毒。舉例而言，為產生複製缺陷性黑猩猩腺病毒載體，可使用表現人類或黑猩猩腺病毒之E1基因產物之細胞系；該細胞系可包括HEK293或其變體。可遵循用於產生表現黑猩猩E1基因產物之細胞系之方案(USPN 6,083,716之實例3及4)以產生表現任一所選黑猩猩腺病毒基因之細胞系。
可使用AAV強化分析來鑑別黑猩猩腺病毒E1表現細胞系。此分析可用於鑑別藉由使用其他未經表徵之腺病毒(例如來自其他物種)之E1基因製得之細胞系之E1功能。該分析闡述於USPN 6,083,716之實例4B中。
所選黑猩猩腺病毒基因(例如E1)可在啟動子之轉錄控制下用於在所選親代細胞系中表現。誘導型或組成型啟動子可用於此目的。誘導型啟動子尤其包括鋅誘導型綿羊金屬硫蛋白啟動子或糖皮質激素、尤其地塞米松(dexamethasone)誘導型小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子。亦可使用其他誘導型啟動子(例如在國際專利申請案WO95/13392中鑑別之彼等，該申請案以引用方式併入本文中)來產生封裝細胞系。亦可使用控制黑猩猩腺病毒基因之表現之組成型啟動子。
可選擇親代細胞以產生表現任何期望C68基因之新穎細胞系。該親代細胞系可為(但不限於) HeLa [ATCC登錄號CCL 2]、A549 [ATCC登錄號CCL 185]、KB [CCL 17]、Detroit [例如Detroit 510、CCL 72]及WI-38 [CCL 75]細胞。其他適宜親代細胞系可自其他來源獲得。親代細胞系可包括CHO、HEK293或其變體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a。
E1表現細胞系可用於產生重組黑猩猩腺病毒E1缺失載體。使用基本上相同之程序構築之表現一或多種其他黑猩猩腺病毒基因產物之細胞系可用於產生編碼彼等產物之基因缺失之重組黑猩猩腺病毒載體。此外，表現其他人類Ad E1基因產物之細胞系亦可用於產生黑猩猩重組Ad。V.E.3. 重組病毒粒子作為載體
本文所揭示之組合物可包含將至少一種新抗原遞送至細胞之病毒載體。該等載體包含黑猩猩腺病毒DNA序列(例如C68)及可操作地連接至調節序列之新抗原盒，該等調節序列引導盒之表現。C68載體能夠在受感染哺乳動物細胞中表現盒。C68載體之一或多個病毒基因可為功能缺失的。新抗原盒包含至少一種在一或多個調節序列(例如啟動子)之控制下之新抗原。可選輔助病毒及/或封裝細胞系可將缺失腺病毒基因之任何所需產物供應至黑猩猩病毒載體。
術語「功能缺失」意指去除或以其他方式改變(例如藉由突變或修飾)足量基因區域，以使得基因區域不再能夠產生基因表現之一或多種功能產物。可引起功能缺失之突變或修飾包括(但不限於)無義突變、例如引入早熟終止密碼子及去除典型及非典型起始密碼子、改變mRNA剪接或其他轉錄加工之突變或其組合。若期望，可去除整個基因區域。
形成本文所揭示載體之核酸序列之修飾(包括序列缺失、插入及其他突變)可使用標準分子生物學技術產生且在本發明之範圍內。V.E.4. 病毒質體載體之構築
可用於本發明中之黑猩猩腺病毒C68載體包括重組缺陷性腺病毒，亦即E1a或E1b基因之功能缺失及視情況帶有其他突變(例如其他基因之溫度敏感性突變或缺失)之黑猩猩腺病毒序列。預期該等黑猩猩序列亦可用於自其他腺病毒及/或腺相關病毒序列形成雜交載體。自人類腺病毒製備之同源腺病毒載體闡述於公開文獻[例如，參見上文引用之Kozarsky I及II及其中引用之參考文獻、美國專利第5,240,846號]中。
在構築可用於將新抗原盒遞送至人類(或其他哺乳動物)細胞之黑猩猩腺病毒C68載體中，一系列腺病毒核酸序列可用於載體中。包含最小黑猩猩C68腺病毒序列之載體可與輔助病毒結合使用以產生感染性重組病毒粒子。輔助病毒提供最小黑猩猩腺病毒載體之病毒感染性及繁殖所需之基本基因產物。當在原本具有功能性之病毒載體中製得黑猩猩腺病毒基因之僅一個或多個所選缺失時，可在病毒載體產生過程中藉由使病毒在反式提供缺失基因功能之所選封裝細胞系中繁殖來供應缺失基因產物。V.E.5. 重組最小腺病毒
最小黑猩猩Ad C68病毒係僅含複製及病毒粒子殼體化所需之腺病毒順式元件之病毒粒子。亦即，載體含有腺病毒之順式作用5'端及3'端反向末端重複(ITR)序列(其用作複製起點)及天然5'端封裝/增強子域(其含有封裝線性Ad基因體所需之序列及用於E1啟動子之增強子元件)。例如，參見國際專利申請案WO96/13597中經闡述用於製備「最小」人類Ad載體且以引用方式併入本文中之技術。V.E.6. 其他缺陷性腺病毒
重組複製缺陷型腺病毒亦可含有超過最小之黑猩猩腺病毒序列。該等其他Ad載體之特徵可在於病毒基因區域之多個部分缺失及藉由視情況使用輔助病毒及/或封裝細胞系形成之感染性病毒粒子。
作為一個實例，適宜載體可藉由缺失C68腺病毒立即早期基因E1a及延遲型早期基因E1b之所有或足夠部分以消除其正常生物功能來形成。複製缺陷性E1缺失病毒在生長於含有反式提供相應基因產物之功能性腺病毒E1a及E1b基因之黑猩猩腺病毒轉換之互補細胞系上時能夠複製並產生感染性病毒。基於與已知腺病毒序列之同源性，預期所得重組黑猩猩腺病毒能夠感染許多細胞類型且可表現新抗原，但無法在大多數不攜帶黑猩猩E1區DNA之細胞中複製，除非以極高感染複數感染細胞，對於業內之人類重組E1缺失腺病毒亦如此。
作為另一實例，C68腺病毒延遲型早期基因E3之全部或一部分可自形成重組病毒之一部分之黑猩猩腺病毒序列消除。
亦可構築具有E4基因缺失之黑猩猩腺病毒C68載體。另一載體可含有延遲型早期基因E2a之缺失。
缺失亦可在黑猩猩C68腺病毒基因體之任一晚期基因L1至L5中製得。類似地，中間基因IX及IVa2之缺失可用於一些目的。可在其他結構或非結構腺病毒基因中製得其他缺失。
上文所論述之缺失可個別地使用，即腺病毒序列可僅含E1之缺失。或者，可有效地破壞或降低其生物活性之整個基因或其部分之缺失可以任一組合使用。舉例而言，在一個實例性載體中，腺病毒C68序列可具有E1基因及E4基因、或E1、E2a及E3基因、或E1及E3基因、或E1、E2a及E4基因之缺失，含或不含E3之缺失等。如上文所論述，該等缺失可與其他突變(例如溫度敏感性突變)組合使用以達成期望結果。
包含新抗原之盒可視情況插入黑猩猩C68 Ad病毒之任一缺失區域中。或者，若期望，該盒可插入現有基因區域中以破壞該區域之功能。V.E.7. 輔助病毒
端視用於攜帶新抗原盒之病毒載體之黑猩猩腺病毒基因含量，可使用輔助腺病毒或非複製病毒片段來提供足以產生含有盒之感染性重組病毒粒子之黑猩猩腺病毒基因序列。
有用輔助病毒含有不存在於腺病毒載體構築體中及/或不由載體所轉染之封裝細胞系表現之所選腺病毒基因序列。輔助病毒可具有複製缺陷性且含有多個腺病毒基因以及上文所述之序列。輔助病毒可與本文所述之E1表現細胞系組合使用。
對於C68，「輔助」病毒可為藉由用SspI修剪C68基因體之C端以自病毒之左端去除約1300 bp形成之片段。然後用質體DNA將此經修剪的病毒共轉染至E1表現細胞系中，藉此藉由與質體中之C68序列同源重組形成重組病毒。
輔助病毒亦可形成至聚陽離子結合物中，如Wu等人，J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989)；K. J. Fisher及J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (1994年4月1日)中所述。輔助病毒可視情況含有報導基因。業內已知多個該等報導基因。不同於腺病毒載體上之新抗原盒之輔助病毒上之報導基因的存在允許獨立地監測Ad載體及輔助病毒二者。使用此第二報導基因使得在純化時能夠分離所得重組病毒與輔助病毒。V.E.8. 病毒粒子之組裝及細胞系之感染
將腺病毒、新抗原盒及其他載體元件之所選DNA序列組裝至各種中間質體及穿梭載體中及使用該等質體及載體製造重組病毒粒子皆可使用習用技術來達成。該等技術包括習用cDNA選殖技術、活體外重組技術(例如吉普森組裝(Gibson assembly))、使用腺病毒基因體之重疊寡核苷酸序列、聚合酶鏈式反應及提供期望核苷酸序列之任何適宜方法。採用標準轉染及共轉染技術，例如CaPO4 沈澱技術或脂質體介導之轉染方法(例如lipofectamine)。其他所用習用方法包括病毒基因體之同源重組、在瓊脂覆蓋層中形成病毒斑、量測信號產生之方法及諸如此類。
舉例而言，在構築及組裝含有期望新抗原盒之病毒載體後，可在輔助病毒存在下將載體活體外轉染至封裝細胞系中。同源重組發生在輔助序列與載體序列之間，此容許載體中之腺病毒-新抗原序列複製且封裝至病毒粒子衣殼中，產生重組病毒載體粒子。
所得重組黑猩猩C68腺病毒可用於將新抗原盒轉移至所選細胞。在使用生長於封裝細胞系中之重組病毒之活體內實驗中，E1缺失之重組黑猩猩腺病毒展示將盒轉移至非黑猩猩(較佳人類)細胞之效用。 V.E.9. 重組病毒載體之用途
因此，含有新抗原盒之所得重組黑猩猩C68腺病毒(藉由腺病毒載體及輔助病毒或腺病毒載體及封裝細胞系之協作產生，如上文所述)提供可將新抗原活體內或離體遞送至個體之有效基因轉移媒劑。
根據基因療法之公開方法將上文所述之重組載體投與人類。可將帶有新抗原盒之黑猩猩病毒載體投與患者，較佳懸浮於生物相容性溶液或醫藥上可接受之遞送媒劑中。適宜媒劑包括無菌鹽水。已知為醫藥上可接受之載劑及熟習此項技術者所熟知之其他水性及非水性等滲無菌注射溶液以及水性及非水性無菌懸浮液可用於此目的。
投與足以轉導人類細胞且提供足量新抗原轉移及表現之量之黑猩猩腺病毒載體以提供治療益處而無過度不良效應或具有醫學上可接受之生理效應，其可由熟習醫學技術者確定。習用及醫藥上可接受之投與途徑包括(但不限於)直接遞送至肝、鼻內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、經口及其他非經腸投與途徑。若期望，可組合投與途徑。
病毒載體之劑量將主要取決於諸如所治療病況、患者之年齡、體重及健康狀況等因素，且因此可因患者而變化。將調整劑量以平衡治療益處與任何副作用且該等劑量可端視採用重組載體之治療應用而變化。可監測新抗原之表現量以確定劑量投與之頻率。
重組複製缺陷性腺病毒可以「醫藥有效量」、亦即在投與途徑中可有效地轉染期望細胞且提供所選基因之足夠表現量之重組腺病毒的量投與以提供疫苗益處，即一定可量測程度之保護性免疫。包含新抗原盒之C68載體可與佐劑共投與。佐劑可與載體(例如alum)分離或編碼在載體內，尤其若佐劑係蛋白質時。佐劑為業內所熟知。
習用及醫藥上可接受之投與途徑包括(但不限於)鼻內、肌內、氣管內、皮下、皮內、直腸、經口及其他經腸投與途徑。若期望，可組合或端視免疫原或疾病調整投與途徑。舉例而言，在狂犬病之預防中，皮下、氣管內及鼻內途徑較佳。投與途徑主要將端視所治療疾病之性質而定。
可監測對新抗原之免疫程度以確定對追加注射之需要(若有)。在評估血清中之抗體效價後，例如，可能需要視情況追加注射免疫。VI. 治療及製造方法
本文亦提供誘導個體中之腫瘤特異性免疫反應、對腫瘤進行疫苗接種、治療及或緩和個體癌症之症狀的方法，其係藉由向個體投與一或多種新抗原(例如複數種利用本文所揭示之方法鑑別之新抗原)來實施。
在一些態樣中，個體已經診斷患有癌症或具有罹患癌症之風險。個體可為人類、狗、貓、馬或腫瘤特異性免疫反應合意之任何動物。腫瘤可為任何實體腫瘤，例如乳房腫瘤、卵巢腫瘤、前列腺腫瘤、肺腫瘤、腎腫瘤、胃腫瘤、結腸腫瘤、睪丸腫瘤、頭頸腫瘤、胰臟腫瘤、腦腫瘤、黑色素瘤，及其他組織器官腫瘤及血液腫瘤，例如淋巴瘤及白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病及B細胞淋巴瘤。
新抗原可以足以誘導CTL反應之量來投與。
新抗原可單獨投與或與其他治療劑組合投與。治療劑係例如化學治療劑、輻射或免疫療法。可對具體癌症投與任何適宜治療性治療。
另外，可向個體進一步投與抗免疫抑制/免疫刺激劑，例如檢查點抑制劑。舉例而言，可向個體進一步投與抗CTLA抗體或抗PD-1或抗PD-L1。藉由抗體阻斷CTLA-4或PD-L1可增強患者對癌細胞之免疫反應。具體而言，已顯示CTLA-4阻斷在遵循疫苗接種方案時係有效的。
可確定欲納入疫苗組合物中之每一新抗原之最佳量及最佳投藥方案。舉例而言，可製備新抗原或其變體用於靜脈內(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮內(i.d.)注射、腹膜內(i.p.)注射、肌內(i.m.)注射。注射方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.及i.v.。DNA或RNA注射方法包括i.d.、i.m.、s.c.、i.p.及i.v.。疫苗組合物之其他投與方法為熟習此項技術者已知。
疫苗可經編譯以使得存在於組合物中之新抗原之選擇、數量及/或量具有組織、癌症及/或患者特異性。例如，可藉由親代蛋白質在給定組織中之表現模式來指導肽之確切選擇。該選擇可端視癌症之特定類型、疾病之狀況、早期治療方案、患者之免疫狀況及當然患者之HLA-單倍型而定。此外，根據具體患者之個人需要，疫苗可含有個別化組分。實例包括根據新抗原在具體患者中之表現或對第一輪後之二次治療或治療時間表之調整來改變新抗原之選擇。
對於欲作為癌症疫苗之組合物，具有在正常組織中大量表現之相似正常自身肽之新抗原可避免或以少量存在於本文所述之組合物中。另一方面，若已知患者之腫瘤表現大量某些新抗原，用於治療此癌症之各別醫藥組合物可以大量存在及/或可包括一種以上之特異性針對此具體新抗原或此新抗原路徑之新抗原。
包含新抗原之組合物可投與已患有癌症之個體。在治療性應用中，組合物係以足以引發針對腫瘤抗原之有效CTL反應並治癒或至少部分地阻止症狀及/或併發症的量投與患者。足以實現此效果之量定義為「治療有效劑量」。可有效地用於此應用之量將端視例如組合物、投與方式、所治療疾病之階段及嚴重程度、患者之體重及一般健康狀態以及開處醫師之判斷而定。應理解，組合物通常可用於嚴重疾病狀態，亦即危及生命或可能危及生命之情形，尤其當癌症已轉移時。在該等情形下，鑒於外源物質之最小化及新抗原之相對無毒性質，可投與實質上過量之該等組合物且治療醫師可認為合意。
對於治療性用途，投與可開始於檢測或手術移除腫瘤。此後為加強劑量直至至少症狀實質上減退且之後保持一定時段。
用於治療性治療之醫藥組合物(例如，疫苗組合物)欲用於非經腸、外用、經鼻、經口或局部投與。醫藥組合物可非經腸(例如靜脈內、皮下、皮內或肌內)投與。組合物可投與手術切口之位點來誘導針對腫瘤之局部免疫反應。本文揭示包含新抗原溶液之用於非經腸投與之組合物，且將疫苗組合物溶解或懸浮於可接受之載劑(例如水性載劑)中。可使用多種水性載劑，例如水、緩衝水、0.9%鹽水、0.3%甘胺酸、玻尿酸及諸如此類。該等組合物可藉由習用熟知滅菌技術來滅菌，或可經無菌過濾。可將所得水性溶液封裝以供原樣使用或將其凍乾，將凍乾製劑在投與之前與無菌溶液合併。組合物可含有如近似生理條件所需之醫藥上可接受之輔助物質，例如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑及諸如此類，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、去水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
新抗原亦可經由脂質體來投與，該等脂質體使該等新抗原靶向具體細胞組織，例如淋巴組織。脂質體亦可用於延長半衰期。脂質體包括乳液、發泡體、膠束、不可溶單層、液晶、磷脂分散液、層狀層及諸如此類。在該等製劑中，欲遞送之新抗原係作為脂質體之一部分單獨或結合其所結合之分子(例如盛行於淋巴樣細胞中之受體，例如結合至CD45抗原之單株抗體)或其他治療或免疫原性組合物納入。因此，可將填充有期望新抗原之脂質體引導至淋巴樣細胞之位點，其中脂質體隨後遞送所選治療/免疫原性組合物。脂質體可自標準囊泡形成脂質形成，該等脂質通常包括中性及帶負電之磷脂及固醇，例如膽固醇。脂質之選擇通常係藉由考慮例如脂質體大小、酸不穩定性及脂質體在血流中之穩定性來指導。多種方法可用於製備脂質體，如例如Szoka等人，Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980)、美國專利第4,235,871號、第4,501,728號、第4,501,728號、第4,837,028號及第5,019,369號中所述。
為靶向免疫細胞，欲納入脂質體中之配體可包括例如特異性針對期望免疫系統細胞之細胞表面決定子之抗體或其片段。脂質體懸浮液可以靜脈內、局部、外用等方式以根據尤其投與方式、所遞送之肽及所治療疾病之階段變化之劑量來投與。
出於治療或免疫目的，亦可向患者投與編碼肽及視情況本文所述肽中之一或多者之核酸。便捷地使用多種方法將核酸遞送至患者。例如，核酸可作為「裸DNA」直接遞送。此方法闡述於例如Wolff等人，Science 247: 1465-1468 (1990)以及美國專利第5,580,859號及第5,589,466號中。核酸亦可利用如例如美國專利第5,204,253號中所述之彈道遞送來投與。可投與僅包含DNA之粒子。或者，可使DNA黏附至粒子，例如金粒子。用於遞送核酸序列之方法可包括用或不用電穿孔之病毒載體、mRNA載體及DNA載體。
核酸亦可複合遞送至陽離子化合物，例如陽離子脂質。脂質介導之基因遞送方法闡述於例如9618372WOAWO 96/18372；9324640 WOAWO 93/24640；Mannino及Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988)；美國專利第5,279,833號(Rose)美國專利第5,279,833號；9106309WOAWO 91/06309；及Felgner等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987)。
新抗原亦可納入基於病毒載體之疫苗平臺中，例如牛痘、雞痘、自我複製α病毒、馬拉巴病毒、腺病毒(例如，參見Tatsis等人，Adenoviruses,Molecular Therapy (2004) 10, 616-629)或慢病毒屬，包括(但不限於)第二代、第三代或雜合第二代/第三代慢病毒屬及經設計以靶向特定細胞類型或受體之任一代重組慢病毒屬(例如，參見Hu等人，Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases,Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61；Sakuma等人，Lentiviral vectors: basic to translational,Biochem J. (2012) 443(3):603-18；Cooper等人，Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl . Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690；Zufferey等人，Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery,J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880)。端視上文所提及基於病毒載體之疫苗平臺之封裝能力，此方法可遞送一或多個編碼一或多種新抗原肽之核苷酸序列。該等序列可側接有非突變序列，可藉由連接體分開或之前可為一或多個靶向亞細胞隔室之序列(例如，參見Gros等人，Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients,Nat Med. (2016) 22 (4):433-8；Stronen等人，Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires,Science. (2016) 352 (6291):1337-41；Lu等人，Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions,Clin Cancer Res . (2014) 20(13):3401-10)。在引入宿主中後，受感染細胞表現新抗原，且由此引發針對肽之宿主免疫(例如，CTL)反應。可用於免疫方案中之牛痘載體及方法闡述於例如美國專利第4,722,848號中。另一載體係BCG (卡介苗)。BCG載體闡述於Stover等人(Nature 351:456-460 (1991))中。熟習此項技術者根據本文描述將明瞭可用於新抗原之治療性投與或免疫之眾多種其他疫苗載體，例如傷寒沙氏桿菌載體及諸如此類。
投與核酸之方式利用編碼一或多個表位之袖珍基因構築體。為產生編碼所選CTL表位(袖珍基因)以在人類細胞中表現之DNA序列，反轉譯表位之胺基酸序列。使用人類密碼子使用表來指導每一胺基酸之密碼子選擇。使該等表位編碼DNA序列直接鄰接，以產生連續多肽序列。為最佳化表現及/或免疫原性，可將其他元件納入袖珍基因設計中。可經反轉譯且納入袖珍基因序列中之胺基酸序列之實例包括：輔助T淋巴球、表位、前導(信號)序列及內質網滯留信號。另外，可藉由納入毗鄰CTL表位之合成(例如聚丙胺酸)或天然側接序列來改良CTL表位之MHC呈遞。藉由組裝編碼袖珍基因之正義股及負義股之寡核苷酸將袖珍基因序列轉化至DNA。在適宜條件下利用熟知技術合成重疊寡核苷酸(長30-100個鹼基)，將其磷酸化，純化且退火。利用T4 DNA連結酶來接合寡核苷酸之末端。然後可將編碼CTL表位多肽之此合成袖珍基因選殖至期望表現載體中。
可使用多種調配來製備經純化質體DNA用於注射。該等調配中之最簡單者係將凍乾DNA重構於無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。業內已闡述多種方法，且可使用新技術。如上所述，將核酸便捷地與陽離子脂質調配在一起。另外，亦可將醣酯、促融脂質體、肽及化合物(統稱為保護性、相互作用、非凝聚化合物) (PINC)複合至經純化質體DNA以影響諸如穩定性、肌內分散或至特定器官或細胞類型之輸送等變量。
本文亦揭示製造腫瘤疫苗之方法，其包含以下步驟：實施本文所揭示之方法；及產生包含複數種新抗原或複數種新抗原之子集之腫瘤疫苗。
本文所揭示之新抗原可利用業內已知之方法來製造。舉例而言，本文所揭示產生新抗原或載體(例如，包括至少一個編碼一或多種新抗原之序列之載體)之方法可包括在適於表現新抗原或載體之條件下培養宿主細胞，其中宿主細胞包含至少一個編碼新抗原或載體之多核苷酸，及純化新抗原或載體。標準純化方法包括層析技術、電泳、免疫、沈澱、透析、過濾、濃縮及層析聚焦技術。
宿主細胞可包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、酵母或HEK293細胞。可用一或多種包含至少一個編碼本文所揭示新抗原或載體之核酸序列之多核苷酸來轉換宿主細胞，視情況其中經分離之多核苷酸進一步包含可操作地連接至至少一個編碼新抗原或載體之核酸序列之啟動子序列。在某些實施例中，經分離之多核苷酸可為cDNA。VII. 新抗原使用及投與
可利用疫苗接種方案向個體投用一或多種新抗原。可使用初免疫苗及加強疫苗來投用個體。初免疫苗可基於C68 (例如SEQ ID NO:1或2中所顯示之序列)或srRNA (例如SEQ ID NO:3或4中所顯示之序列)且加強疫苗可基於C68 (例如SEQ ID NO:1或2中所顯示之序列)或srRNA (例如SEQ ID NO:3或4中所顯示之序列)。每一載體通常包括包含新抗原之盒。盒可包括約20種新抗原，由間隔體(例如通常包圍每一抗原之天然序列或其他非天然間隔體序列(例如AAY))分開。盒亦可包括MHCII抗原(例如破傷風類毒素抗原及PADRE抗原)，其可視為通用II類抗原。盒亦可包括靶向序列，例如泛素靶向序列。另外，每一疫苗劑量可與檢查點抑制劑(CPI)結合(例如同時、在其之前或之後)投與個體。CPI可包括抑制CTLA4、PD1及/或PDL1之彼等，例如抗體或其抗原結合部分。該等抗體可包括曲美目單抗或德瓦魯單抗(durvalumab)。
可在個體中注射(例如肌內)初免疫苗。可使用每劑量雙側注射。舉例而言，可使用ChAdV68 (C68)之一或多個注射(例如總劑量為1×1012 個病毒粒子)；可使用選自0.001至1 ug RNA、尤其0.1或1 ug範圍之低疫苗劑量之自我複製RNA (srRNA)之一或多個注射；或可使用選自1至100 ug RNA、尤其10或100 ug範圍之高疫苗劑量之srRNA之一或多個注射。
可在初免疫苗接種後注射(例如肌內)疫苗加強(加強疫苗)。加強疫苗可在初免後約每1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週或10週、例如每4週及/或8週投與。可使用每劑量雙側注射。舉例而言，可使用ChAdV68 (C68)之一或多個注射(例如總劑量為1×1012 個病毒粒子)；可使用選自0.001至1 ug RNA、尤其0.1或1 ug範圍之低疫苗劑量之自我複製RNA (srRNA)之一或多個注射；或可使用選自1至100 ug RNA、尤其10或100 ug範圍之高疫苗劑量之srRNA之一或多個注射。
亦可將抗CTLA-4 (例如曲美目單抗)投與個體。舉例而言，可將抗CTLA4皮下投與在肌內疫苗注射(ChAdV68初免或srRNA低劑量)位點附近以確保引流至相同淋巴結中。曲美目單抗係CTLA-4之選擇性人類IgG2 mAb抑制劑。抗CTLA-4 (曲美目單抗)皮下靶劑量通常為70-75 mg (尤其75 mg)且劑量範圍為例如1-100 mg或5-420 mg。
在某些情況下，可使用抗PD-L1抗體，例如德瓦魯單抗(MEDI 4736)。德瓦魯單抗係選擇性高親和力人類IgG1 mAb，其阻斷PD-L1與PD-1及CD80之結合。德瓦魯單抗通常係以20 mg/kg i.v.每4週投與。
可在疫苗投與之前、期間及/或之後實施免疫監測。該監測可通知安全性及效能等參數。
為實施免疫監測，通常使用PBMC。PBMC可在初免疫苗接種之前及初免疫苗接種之後(例如4週及8週)分離。PBMC可在即將加強疫苗接種之前及每一加強疫苗接種之後不久(例如4週及8週)收穫。
可評價T細胞反應作為免疫監測方案之一部分。T細胞反應可使用業內已知之一或多種方法(例如ELISpot、細胞內細胞介素染色、細胞介素分泌及細胞表面捕獲、T細胞增殖、MHC多聚體染色或藉由細胞毒性分析)來量測。針對在疫苗中編碼之表位之T細胞反應可自PBMC藉由使用ELISpot分析量測細胞介素(例如IFN-γ)之誘導來監測。針對在疫苗中編碼之表位之特異性CD4或CD8 T細胞反應可自PBMC藉由使用流式細胞術量測細胞內或細胞外捕獲之細胞介素(例如IFN-γ)之誘導來監測。針對在疫苗中編碼之表位之特異性CD4或CD8 T細胞反應可自PBMC藉由使用MHC多聚體染色量測表現特異性針對表位/I類MHC複合物之T細胞受體之T細胞群體來監測。針對在疫苗中編碼之表位之特異性CD4或CD8 T細胞反應可自PBMC藉由在納入3H-胸苷、溴去氧尿苷及羧基螢光黃-二乙酸-琥珀醯亞胺基酯(CFSE)後量測T細胞群體之離體擴增來監測。可藉由鉻釋放分析或替代性比色細胞毒性分析在功能上評價特異性針對在疫苗中編碼之表位之PBMC衍生之T細胞的抗原識別能力及溶解活性。VIII. 新抗原鑑別 VIII.A. 新抗原候選者鑑別
用於腫瘤及正常外顯子體及轉錄體之NGS分析之研究方法已闡述且應用於新抗原鑑別領域中6,14,15 。下文實例考慮針對臨床環境中之新抗原鑑別具更大靈敏性及特異性之某些最佳化。該等最佳化可分成兩個區域，與實驗室製程相關之彼等及與NGS數據分析相關之彼等。VIII.A.1. 實驗室製程最佳化
此處所呈現之製程改良解決了自具有低腫瘤含量及小體積之臨床樣本發現高準確度新抗原的挑戰，此係藉由將對靶向癌症面板中之可靠癌症驅動基因評價研發出之概念16 延伸至為新抗原鑑別所需之整個外顯子體及轉錄體環境來達成。特定而言，該等改良包括： 1. 橫跨腫瘤外顯子體靶向深度(＞500×)獨特平均覆蓋率以檢測因低腫瘤含量或亞純系狀態所致以低突變體對偶基因頻率存在之突變。 2. 橫跨腫瘤外顯子體靶向均一覆蓋率，其中＜5%之鹼基以＜100×覆蓋，以使得最少可能的新抗原因例如以下原因而丟失： a. 採用基於DNA之捕獲探針及個別探針QC17 b. 對於較差覆蓋之區域納入其他餌 3. 橫跨正常外顯子體靶向均一覆蓋率，其中＜5%之鹼基以＜20×覆蓋，以使得最少可能的新抗原保持體細胞/生殖系狀況未分類(且因此不如TSNA有用) 4. 為最小化所需測序之總量，將僅針對基因之編碼區來設計序列捕獲探針，此乃因非編碼RNA無法產生新抗原。其他最佳化包括： a. HLA基因之補充性探針，其富含GC且被標準外顯子體測序較差捕獲18 b. 排除經預測因諸如不充分表現、蛋白酶體之次最佳消化或不尋常序列特徵等因素產生極少或不產生候選新抗原之基因。 5. 同樣以高深度(＞100M讀段(reads))對腫瘤RNA進行測序以實現變體檢測、基因及剪接變體(「異型體」)表現之量化及融合物檢測。將利用基於探針之富集19 、使用與捕獲DNA中之外顯子體所用相同或相似之探針來提取FFPE樣品之RNA。VIII.A.2. NGS 數據分析最佳化
分析方法之改良解決了普通研究突變呼叫方法之次最佳靈敏性及特異性，且明確考慮與臨床環境中之新抗原鑑別相關之客製化。該等改良包括： 1. 利用HG38參考人類基因體或更高版本進行比對，此乃因其含有較佳反映群體多型性之多個MHC區域總成，此與先前基因體釋放不同。 2. 藉由歸併不同程式之結果.5 克服單一變體呼叫者之限制20 a. 利用一組工具檢測腫瘤DNA、腫瘤RNA及正常DNA之單核苷酸變體及插入/缺失，該組工具包括：基於比較腫瘤DNA與正常DNA之程式，例如Strelka21 及Mutect22 ；及納入腫瘤DNA、腫瘤RNA及正常DNA之程式，例如UNCeqR，其在低純度樣品中尤其有利23 。 b. 利用執行局部再組裝之程式(例如Strelka及ABRA24 )來測定插入/缺失。 c. 利用專用工具(例如Pindel25 或Breakseq26 )來測定結構重排。 3. 為檢測且防止樣品調換，以所選多型性位點數比較同一患者之樣品之變體呼叫。 4. 人工呼叫之廣泛過濾將例如藉由以下來實施： a. 移除於正常DNA中所發現之變體，可能地在低覆蓋率之情形下使用鬆弛檢測參數，且在插入/缺失之情形下使用容許接近標準 b. 移除因低映射品質或低鹼基品質所致之變體27 。 c. 移除源自複現性測序假影之變體，即使在相應正常組織中未觀察到27 。實例包括主要在一個股上檢測到之變體。 d. 移除在不相關對照集中檢測到之變體27 5. 利用seq2HLA28 、ATHLATES29 或Optitype中之一者亦及組合外顯子體及RNA測序數據28 自正常外顯子體準確呼叫HLA。其他潛在最佳化包括採取專用HLA分型分析(例如長讀DNA測序30 )或改編接合RNA片段之方法以保持連續性31 。 6. 利用CLASS32 、Bayesembler33 、StringTie34 或類似程式以其參考文獻指導之模式(即，利用已知轉錄本結構而非嘗試自每一實驗再產生其整體轉錄本)藉由根據RNA-seq數據組裝轉錄本來實施源自腫瘤特異性剪接變體之neo-ORF之穩健檢測。儘管Cufflinks35 常用於此目的，但其經常產生難以置信地大量剪接變體，其中之許多遠遠短於全長基因，且可無法重新獲得簡單的陽性對照。使用諸如SpliceR36 及MAMBA37 等工具及再引入之突變體序列來測定編碼序列及無義介導之衰變潛能。使用諸如Cufflinks35 或Express等工具來測定基因表現(Roberts及Pachter, 2013)。使用針對該等目的研發出之工具(例如ASE38 或HTSeq39 )來測定野生型及突變體特異性表現計數及/或相對量。潛在過濾步驟包括： a. 移除視為不充分表現之候選neo-ORF。 b. 移除經預測以觸發無義介導之衰變(NMD)之候選neo-ORF。 7. 根據其他參數、例如藉由考慮以下，將僅在RNA中觀察到之無法直接驗證為腫瘤特異性之候選新抗原(例如，neoORF)歸類為可能腫瘤特異性： a. 支持僅腫瘤DNA順式作用框移或剪接位點突變之存在 b. 確證剪接因子中僅腫瘤DNA反式作用突變之存在。例如，在三個使用R625突變體SF3B1之獨立公開實驗中，即使一個實驗檢查葡萄膜黑色素瘤患者40 ，第二個實驗檢查葡萄膜黑色素瘤細胞系41 ，且第三個實驗檢查乳癌患者42 ，但展現最大差別剪接之基因係一致的。 c. 對於新穎剪接異型體，確證RNASeq數據中之「新穎」剪接接合處讀段。 d. 對於新穎重排，確證腫瘤DNA中之在正常DNA中不存在之並置外顯子讀段之存在 e. 不存在於諸如GTEx43 等基因表現編匯中(即，使生殖系起源較不可能) 8. 藉由直接比較組裝的DNA腫瘤與正常讀段(或來自該等讀段之k聚體)來補充基於參考基因體比對之分析以避免基於比對及註解之誤差及假影。(例如對於在生殖系變體附近出現之體細胞變體或重複內容脈絡插入/缺失)
在含有多腺苷酸化RNA之樣品中，利用RNA CoMPASS44 或用於鑑別可預測患者反應之其他因素之類似方法來評價RNA-seq數據中病毒及微生物RNA之存在。VIII.B. HLA 肽之分離及檢測
在裂解及溶解組織樣品後利用經典免疫沈澱(IP)方法來實施HLA肽分子之分離(55-58)。將澄清裂解物用於HLA特異性IP。
使用偶合至珠粒之抗體來實施免疫沈澱，其中該抗體特異性針對HLA分子。對於泛I類HLA免疫沈澱，使用泛I類CR抗體，對於II類HLA-DR，使用HLA-DR抗體。在過夜培育期間抗體共價附接至NHS-瓊脂糖珠粒。在共價附接後，洗滌珠粒且等分用於IP。(59、60) 亦可使用並不共價附接至珠粒之抗體實施免疫沈澱。通常，此係使用經蛋白質A及/或蛋白質G包覆之sepharose或磁珠來進行以將抗體保持於管柱。可用於選擇性富集MHC/肽複合物之一些抗體列示於下文中。
將澄清組織裂解物添加至抗體珠粒中用於免疫沈澱。在免疫沈澱後，自裂解物移除珠粒且儲存裂解物用於其他實驗，包括其他IP。洗滌IP珠粒以移除非特異性結合，且利用標準技術自珠粒溶析HLA/肽複合體。利用分子量旋轉管柱或C18分級分離自肽移除蛋白質組分。藉由SpeedVac蒸發使所得肽乾燥且在一些情況下在MS分析之前儲存在-20℃下。
將乾燥肽重構於適於反相層析之HPLC緩衝液中且裝載至C-18微毛細管HPLC管柱上以供在Fusion Lumos質譜儀(Thermo)中進行梯度溶析。在Orbitrap檢測器中在高解析度下收集肽質量/電荷(m/z)之MS1光譜，然後在所選離子之HCD片段化後在離子捕集檢測器中收集MS2低解析度掃描。另外，可使用CID或ETD片段化方法或三種技術之任一組合來獲得MS2光譜以得到肽之較大胺基酸覆蓋率。MS2光譜亦可在Orbitrap檢測器中以高解析度質量準確度來量測。
利用Comet針對蛋白質數據庫檢索每一分析之MS2光譜(61、62)且利用Percolator對肽鑑別進行評分(63-65)。使用PEAKS studio (Bioinformatics Solutions Inc.)實施額外測序且可使用其他搜尋引擎或測序方法，包括光譜匹配及重新測序(97)。VIII.B.1. 支持全面 HLA 肽測序之檢測研究之 MS 限值 .
利用肽YVYVADVAAK，使用裝載至LC管柱上之不同量之肽來確定檢測限值。所測試肽之量為1 pmol、100 fmol、10 fmol、1 fmol及100 amol。(表1) 結果顯示於圖1F中。該等結果指示，最低檢測限值(LoD)介於阿莫耳(attomol)範圍內(10-18 )，動態範圍跨越5個數量級，且在低飛莫耳(femtomol)範圍(10-15 )下之信號對雜訊似乎足以用於測序。表 1 IX. 呈遞模型 IX.A. 系統概述
圖2A係根據實施例用於鑑別患者中之肽呈遞似然度之環境100之概述。環境100提供內容脈絡以引入呈遞鑑別系統160，其自身包括呈遞資訊儲存區165。
呈遞鑑別系統160係一種電腦模型，具體化於下文針對圖14所論述之計算系統，其接收與MHC對偶基因集相關之肽序列且確定肽序列將由相關MHC對偶基因集中之一或多者呈遞之似然度。呈遞鑑別系統160可應用於I類及II類MHC對偶基因二者。此可用於多個內容脈絡中。呈遞鑑別系統160之一個特定使用情形在於，其能夠接收與患者110之腫瘤細胞之MHC對偶基因集相關之候選新抗原的核苷酸序列，且確定候選新抗原將由腫瘤之一或多個相關MHC對偶基因呈遞及/或誘導患者110之免疫系統中之免疫原性反應的似然度。如藉由系統160所測定具有高似然度之彼等候選新抗原可經選擇以納入疫苗118中，該抗腫瘤免疫反應可自提供腫瘤細胞之患者110之免疫系統引發。
呈遞鑑別系統160經由一或多種呈遞模型來測定呈遞似然度。特定而言，呈遞模型產生相關MHC對偶基因集是否呈遞給定肽序列之似然度，且係基於儲存區165中所儲存之呈遞資訊來產生。舉例而言，呈遞模型可產生樣品細胞表面上之對偶基因集HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-B*07:02、HLA-B*08:03、HLA-C*01:04、HLA-A*06:03、HLA-B*01:04是否呈遞肽序列「YVYVADVAAK」之似然度。呈遞資訊165含有關於肽是否結合至不同類型之MHC對偶基因使得彼等肽係由MHC對偶基因呈遞之資訊，在該等模型中該呈遞資訊係端視肽序列中胺基酸之位置來確定。呈遞模型可基於呈遞資訊165預測未經識別之肽序列是否與相關MHC對偶基因集一起呈遞。如先前所提及，呈遞模型可應用於I類及II類MHC對偶基因二者。IX.B. 呈遞資訊
圖2圖解說明根據實施例獲得呈遞資訊之方法。呈遞資訊165包括兩大類資訊：對偶基因相互作用資訊及對偶基因非相互作用資訊。對偶基因相互作用資訊包括影響依賴於MHC對偶基因之類型之肽序列呈遞之資訊。對偶基因非相互作用資訊包括影響不依賴於MHC對偶基因之類型之肽序列呈遞之資訊。IX.B.1. 對偶基因相互作用資訊
對偶基因相互作用資訊主要包括已知由一或多個來自人類、小鼠等之經鑑別MHC分子呈遞之經鑑別肽序列。應注意，此可包括或可不包括自腫瘤樣品獲得之數據。經呈遞肽序列可自表現單一MHC對偶基因之細胞來鑑別。在此情形下，經呈遞肽序列通常係自經改造以表現預定MHC對偶基因且隨後暴露於合成蛋白之單一對偶基因細胞系收集。呈遞於MHC對偶基因上之肽係藉由諸如酸溶析等技術來分離且經由質譜來鑑別。圖2B顯示此之實例，其中呈遞於預定MHC對偶基因HLA-A*01:01上之實例性肽YEMFNDKS經分離且經由質譜來鑑別。圖2D顯示此之另一實例，其中呈遞於預定MHC對偶基因HLA-DRB1*12:01上之實例肽YEMFNDKSQRAPDDKMF經分離且經由質譜來鑑別。由於在此情況下肽係經由經改造以表現單一預定MHC蛋白之細胞來鑑別，故明確已知經呈遞肽與其所結合之MHC蛋白之間之直接相關性。
經呈遞肽序列亦可自表現多個MHC對偶基因之細胞收集。通常在人類中，細胞表現6種不同類型之MHC-I及至多12種不同類型之MHC-II分子。該等經呈遞肽序列可自經改造以表現多個預定MHC對偶基因之多對偶基因細胞系來鑑別。該等經呈遞肽序列亦可自組織樣品(正常組織樣品或腫瘤組織樣品)來鑑別。在此情形下，具體而言，MHC分子可自正常或腫瘤組織進行免疫沈澱。呈遞於多個MHC對偶基因上之肽可類似地藉由諸如酸溶析等技術來分離且經由質譜來鑑別。圖2C顯示此之實例，其中6個實例性肽YEMFNDKSF、HROEIFSHDFJ、FJIEJFOESS、NEIOREIREI、JFKSIFEMMSJDSSU及KNFLENFIESOFI呈遞於經鑑別MHC對偶基因HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01、HLA-C*01:03及HLA-C*01:04上且經分離並經由質譜來鑑別。在另一實例中，圖2C顯示6個實例性肽YEMFNDKSF、HROEIFSHDFJ、FJIEJFOESS、NEIOREIREI、JFKSIFEMMSJDSSUIFLKSJFIEIFJ及KNFLENFIESOFI呈遞於經鑑別I類MHC對偶基因HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01及II類MHC對偶基因HLA-DRB1*10:01、HLA-DRB1:11:01上且經分離並經由質譜來鑑別。與單一對偶基因細胞系不同，經呈遞肽與其所結合之MHC蛋白之間之直接相關性可能未知，此乃因結合肽係在經鑑別之前自MHC分子分離。
對偶基因相互作用資訊亦可包括質譜離子流，其取決於肽-MHC分子複合體之濃度及肽之離子化效率二者。離子化效率以序列依賴性方式自肽至肽變化。通常，離子化效率自肽至肽在約兩個數量級內變化，而肽-MHC複合體之濃度在更大範圍內變化。
對偶基因相互作用資訊亦可包括給定MHC對偶基因與給定肽之間之結合親和力之量測或預測(94、95、96)。一或多種親和力模型可產生該等預測。舉例而言，返回至圖1D中所示之實例，呈遞資訊165可包括肽YEMFNDKSF與I類對偶基因HLA-A*01:01之間1000 nM之結合親和力預測。IC50 ＞ 1000 nM之極少肽由MHC呈遞，且較低IC50值增加呈遞之機率。呈遞資訊165可包括肽KNFLENFIESOFI與II類對偶基因HLA-DRB1:11:01之間之結合親和力預測。
對偶基因相互作用資訊亦可包括量測或預測MHC複合體之穩定性。一或多種穩定性模型可產生該等預測。更穩定之肽-MHC複合體(即，具有較長半衰期之複合體)更可能以高拷貝數呈遞於遇到疫苗抗原之腫瘤細胞及抗原呈遞細胞上。舉例而言，返回至圖2C中所示之實例，呈遞資訊165可包括對I類分子HLA-A*01:01之1 h半衰期之穩定性預測。呈遞資訊165亦可包括對II類分子HLA-DRB1:11:01之半衰期之穩定性預測。
對偶基因相互作用資訊亦可包括經量測或預測之肽-MHC複合體之形成反應速率。以較高速率形成之複合體更可能以高濃度呈遞於細胞表面上。
對偶基因相互作用資訊亦可包括肽之序列及長度。I類MHC分子通常偏好呈遞長度介於8個與15個肽之間之肽。60%-80%之經呈遞肽具有長度9。來自若干細胞系之經呈遞肽長度之直方圖顯示於圖5中。II類MHC分子通常偏好呈遞長度介於6-30個肽之間之肽。
對偶基因相互作用資訊亦可包括新抗原編碼肽上激酶序列基序之存在及新抗原編碼肽上特異性轉譯後修飾之不存在或存在。激酶基序之存在影響轉譯後修飾之機率，轉譯後修飾可增強或干擾MHC結合。
對偶基因相互作用資訊亦可包括參與轉譯後修飾過程之蛋白質(例如激酶)之表現量或活性程度(如根據RNAseq、質譜或其他方法所量測或預測)。
對偶基因相互作用資訊亦可包括具有相似序列之肽在表現特定MHC對偶基因之其他個體之細胞中之呈遞機率，如藉由質譜蛋白質體學或其他方式所評價。
對偶基因相互作用資訊亦可包括特定MHC對偶基因在所討論個體中之表現量(例如如藉由RNA-seq或質譜所量測)。最強結合至大量表現之MHC對偶基因之肽比最強結合至少量表現之MHC對偶基因之肽更可能被呈遞。
對偶基因相互作用資訊亦可包括在表現特定MHC對偶基因之其他個體中藉由特定MHC對偶基因呈遞之總體新抗原編碼肽序列非依賴性機率。
對偶基因相互作用資訊亦可包括在其他個體中藉由同一家族分子(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)中之MHC對偶基因呈遞之總體肽序列非依賴性機率。舉例而言，HLA-C分子通常係以低於HLA-A或HLA-B分子之量表現，且因此HLA-C對肽之呈遞較不可能優先於HLA-A或HLA-B之呈遞。對於另一實例，HLA-DP通常係以低於HLA-DR或HLA-DQ之量表現；因此，HLA-DP對肽之呈遞較不可能優先於HLA-DR或HLA-DQ之呈遞。
對偶基因相互作用資訊亦可包括特定MHC對偶基因之蛋白質序列。
以下部分中所列示之任何MHC對偶基因非相互作用資訊亦可建模為MHC對偶基因相互作用資訊。IX.B.2. 對偶基因非相互作用資訊
對偶基因非相互作用資訊可包括在其源蛋白序列內側接新抗原編碼肽之C端序列。對於MHC-I，C端側接序列可影響肽之蛋白酶體處理。然而，C端側接序列在肽轉運至內質網且遇到細胞表面上之MHC對偶基因之前由蛋白酶體自肽裂解。因此，MHC分子不接收關於C端側接序列之資訊，且因此C端側接序列之效應無法端視MHC對偶基因類型而變化。舉例而言，返回至圖2C中所示之實例，呈遞資訊165可包括自肽之源蛋白鑑別之經呈遞肽FJIEJFOESS之C端側接序列FOEIFNDKSLDKFJI。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括mRNA量化量測。舉例而言，可獲得提供質譜訓練數據之同一樣品之mRNA量化數據。如下文參考圖13H所述，RNA表現經鑑別為肽呈遞之強預測子。在一個實施例中，mRNA量化量測係根據軟體工具RSEM來鑑別。RSEM軟體工具之詳細實施可參見Bo Li及Colin N. Dewey.RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics , 12:323, 2011年8月。在一個實施例中，mRNA量化係以片段/每千鹼基轉錄本/每百萬映射讀段(FPKM)為單位來量測。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括在其源蛋白序列內側接肽之N端序列。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括肽序列之源基因。源基因可定義為肽序列之Ensembl蛋白家族。在其他實例中，源基因可定義為肽序列之源DNA或源RNA。源基因可例如表示為編碼蛋白質之一串核苷酸，或或者更明確地基於一組命名的已知編碼特定蛋白質之已知DNA或RNA序列表示。在另一實例中，對偶基因非相互作用資訊亦可包括該源轉錄本或異型體或自數據庫(例如Ensembl或RefSeq)抽取之肽序列之潛在源轉錄本或異型體集。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括在肽中存在蛋白酶裂解基序，視情況根據相應蛋白酶在腫瘤細胞中之表現來加權(如藉由RNA-seq或質譜所量測)。含有蛋白酶裂解基序之肽不太可能被呈遞，此乃因其更容易被蛋白酶降解，且因此在細胞內較不穩定。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括如在適宜細胞類型中量測之源蛋白之轉換率。較快轉換率(即較短半衰期)增加呈遞之機率；然而，此特徵之預測力在不相似細胞類型中量測時較低。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括源蛋白之長度，視情況考慮在腫瘤細胞中最高表現之特異性剪接變體(「異型體」)，如藉由RNA-seq或蛋白質體質譜所量測，或如根據在DNA或RNA序列數據中檢測到之生殖系或體細胞剪接突變之註解所預測。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括蛋白酶體、免疫蛋白酶體、胸腺蛋白酶體或其他蛋白酶在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質體質譜或免疫組織化學來量測)。不同蛋白酶體具有不同的裂解位點偏好。對於與其表現量成比例之每一類型之蛋白酶體之裂解偏好將給予更大權重。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括肽之源基因之表現(例如，如藉由RNA-seq或質譜所量測)。可能的最佳化包括調節所量測之表現以計及腫瘤樣品內存在基質細胞及腫瘤浸潤淋巴球。來自更高表現之基因之肽更可能被呈遞。可不予考慮來自具有無法檢測表現量之基因之肽。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括新抗原編碼肽之源mRNA將經歷無義介導之衰變之機率，如藉由無義介導之衰變模型(例如Rivas等人，Science 2015之模型)所預測。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括肽之源基因在細胞週期之各個階段期間之典型組織特異性表現。總體上少量表現(如藉由RNA-seq或質譜蛋白質體學所量測)但已知在細胞週期之特定階段期間大量表現之基因可能產生比以極低量穩定表現之基因更多之呈遞肽。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括源蛋白之特徵總目，如例如uniProt或PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do中所給出。該等特徵尤其可包括：蛋白質之二級及三級結構、亞細胞定位11、基因本體論(GO)術語。特定而言，此資訊可含有在蛋白質層面上起作用之註解(例如5’端UTR長度)及在特定殘基層面上起作用之註解(例如殘基300與310之間之螺旋基序)。該等特徵亦可包括轉角基序、褶板基序及無序殘基。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括闡述含有肽之源蛋白之結構域性質之特徵，例如：二級或三級結構(例如，α螺旋對β褶板)；選擇式剪接。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括闡述在肽之源蛋白中之肽位置存在或不存在呈遞熱點之特徵。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括來自所討論肽之源蛋白之肽在其他個體中之呈遞機率(在調節源蛋白在彼等個體中之表現量及彼等個體之不同HLA類型之影響後)。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括因技術偏差無法藉由質譜檢測到肽或該肽過表現之機率。
如藉由基因表現分析(例如RNASeq、微陣列、靶向面板(例如Nanostring))所量測之多個基因模組/路徑、或藉由諸如RT-PCR等分析量測之基因模組之單/多基因代表的表現(其無需含有肽之源蛋白)，其為腫瘤細胞、基質或腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之狀態之資訊。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括腫瘤細胞中肽之源基因之拷貝數。舉例而言，來自在腫瘤細胞中經歷同型接合缺失之基因之肽可分配0之呈遞機率。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括肽結合至TAP之機率或經量測或預測之肽與TAP之結合親和力。更可能結合至TAP之肽或以較高親和力結合TAP之肽更可能由MHC-I呈遞。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括TAP在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質體質譜、免疫組織化學來量測)。對於MHC-I，較高TAP表現量增加所有肽之呈遞機率。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括存在或不存在腫瘤突變，包括(但不限於)： i. 諸如以下等已知癌症驅動基因中之驅動突變：EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3 ii. 在編碼參與抗原呈遞機制之蛋白質之基因(例如，B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體之組分之基因中的任一者)中。依賴於抗原呈遞機制之在腫瘤中經歷功能喪失型突變之組分呈遞之肽具有減小的呈遞機率。
存在或不存在功能生殖系多型性，包括(但不限於)：i. 在編碼參與抗原呈遞機制之蛋白質之基因(例如，B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體之組分之基因中的任一者)中
對偶基因非相互作用資訊亦可包括腫瘤類型(例如NSCLC、黑色素瘤)。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括HLA對偶基因之已知功能性，如藉由例如HLA對偶基因後綴所反映。舉例而言，對偶基因名稱HLA-A*24:09N中之N後綴指示不表現且因此不可能呈遞表位之無效對偶基因；完整HLA對偶基因後綴命名闡述於https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/nomenclature/suffixes.html上。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括臨床腫瘤亞型(例如鱗狀肺癌對非鱗狀肺癌)。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括吸煙史。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括曬傷史、日曬史或暴露於其他誘變劑史。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括肽之源基因在相關腫瘤類型或臨床亞型中之典型表現，視情況藉由驅動突變分層。通常在相關腫瘤類型中大量表現之基因更可能被呈遞。
對偶基因非相互作用資訊亦可包括所有腫瘤、或相同類型之腫瘤、或具有至少一個共用MHC對偶基因之個體之腫瘤、或具有至少一個共用MHC對偶基因之個體之相同類型之腫瘤中的突變頻率。
在突變腫瘤特異性肽之情形下，用於預測呈遞機率之特徵之列表亦可包括突變(例如誤義、通讀、框移、融合等)或突變是否經預測產生無義介導之衰變(NMD)之註解。舉例而言，因同型接合早期終止突變而不在腫瘤細胞中轉譯之蛋白質區段之肽可分配0之呈遞機率。NMD使得mRNA轉譯減少，此降低呈遞之機率。IX.C. 呈遞鑑別系統
圖3係圖解說明一個實施例之呈遞鑑別系統160之電腦邏輯組件的高階方塊圖。在此實例性實施例中，呈遞鑑別系統160包括數據管控模組312、編碼模組314、訓練模組316及預測模組320。呈遞鑑別系統160亦包含訓練數據儲存區170及呈遞模型儲存區175。模型管控系統160之一些實施例具有不同於此處所述彼等之模組。類似地，多種功能可以不同於此處所述之方式分佈在各模組中。IX.C.1. 數據管控模組
數據管控模組312自呈遞資訊165產生多組訓練數據170。每組訓練數據含有複數個數據實例，其中每一數據實例i 含有一組自變數 zi ，其包括至少經呈遞或未經呈遞之肽序列 pi 、 與肽序列 pi 相關之一或多個相關MHC對偶基因 ai 、及代表在預測新自變數值中受關注之呈遞鑑別系統160之資訊的應變數yi 。
在本說明書其餘部分通篇中所提及之一個具體實施中，應變數yi 係指示肽 pi 是否由一或多個相關MHC對偶基因 ai 呈遞之二進制標記。然而，應瞭解，在其他實施中，應變數 yi 可代表在端視自變數 zi 預測中受關注之呈遞鑑別系統160之任何其他類別之資訊。舉例而言，在另一實施中，應變數 yi 亦可為指示針對數據實例鑑別之質譜離子流之數值。
針對數據實例 i 之肽序列 pi 係ki 個胺基酸之序列，其中ki 可在一定範圍內之數據實例i 之間變化。舉例而言，對於I類MHC該範圍可為8-15或對於II類MHC該範圍可為6-30。在系統160之一個特定實施中，訓練數據集中之所有肽序列 pi 可具有相同長度，例如9。肽序列中胺基酸之數量可端視MHC對偶基因之類型(例如人類等中之MHC對偶基因)而變化。針對數據實例i 之MHC對偶基因 ai 指示存在哪些MHC對偶基因與相應肽序列 pi 相關。
數據管控模組312亦可包括其他對偶基因相互作用變量，例如結合含於訓練數據170中之肽序列 pi 及相關MHC對偶基因 ai 之結合親和力 bi 及穩定性 si 預測。舉例而言，訓練數據170可含有肽 pi 與以 ai 指示之每一相關MHC分子之間的結合親和力預測 bi 。作為另一實例，訓練數據170可含有針對以 ai 指示之每一MHC對偶基因之穩定性預測 si 。
數據管控模組312亦可包括對偶基因非相互作用變量 wi ，例如結合肽序列 pi 之C端側接序列及mRNA量化量測。
數據管控模組312亦鑑別不由MHC對偶基因呈遞之肽序列以產生訓練數據170。通常，此涉及在呈遞之前鑑別包括經呈遞肽序列之「較長」源蛋白序列。當呈遞資訊含有經改造細胞系時，數據管控模組312鑑別合成蛋白中並不呈遞於細胞之MHC對偶基因上之一系列肽序列，該等細胞暴露於該合成蛋白。當呈遞資訊含有組織樣品時，數據管控模組312鑑別經呈遞肽序列所源自之源蛋白，且鑑別源蛋白中不呈遞於組織樣品細胞之MHC對偶基因上之一系列肽序列。
數據管控模組312亦可人工產生具有隨機胺基酸序列之肽且將所產生之序列鑑別為不呈遞於MHC對偶基因上之肽。此可藉由隨機產生肽序列以允許數據管控模組312容易地產生大量關於不呈遞於MHC對偶基因上之肽之合成數據來實現。由於實際上較小百分比之肽序列係由MHC對偶基因呈遞，故合成產生之肽序列即使納入經細胞處理之蛋白質中亦很可能不會由MHC對偶基因呈遞。
圖4A圖解說明一個實施例之訓練數據170A之實例性集合。特定而言，訓練數據170A中之前3個數據實例指示涉及對偶基因HLA-C*01:03及3個肽序列QCEIOWARE、FIEUHFWI及FEWRHRJTRUJR之單一對偶基因細胞系之肽呈遞資訊。訓練數據170A中之第四個數據實例指示涉及對偶基因HLA-B*07:02、HLA-C*01:03、HLA-A*01:01及肽序列QIEJOEIJE之多對偶基因細胞系之肽資訊。第一個數據實例指示，肽序列QCEIOWARE並非由對偶基因HLA-C*01:03呈遞。如先前兩段中所論述，肽序列可由數據管控模組312隨機產生或自經呈遞肽之源蛋白來鑑別。訓練數據170A亦包括針對肽序列-對偶基因對之1000 nM之結合親和力預測及1 h半衰期之穩定性預測。訓練數據170A亦包括對偶基因非相互作用變量，例如肽FJELFISBOSJFIE之C端側接序列及102 TPM之mRNA量化量測。第四個數據實例指示，肽序列QIEJOEIJE係由對偶基因HLA-B*07:02、HLA-C*01:03或HLA-A*01:01中之一者呈遞。訓練數據170A亦包括針對每一對偶基因之結合親和力預測及穩定性預測以及肽之C端側接序列及肽之mRNA量化量測。
圖4B圖解說明一個實施例之另一實例訓練數據集170A。特定而言，訓練數據170A中之第一數據實例指示涉及II類對偶基因HLA-DRB3:01:01及肽序列QCEIOWAREFLKEIGJ之單一對偶基因細胞系之肽呈遞資訊。第一數據實例指示肽序列QCEIOWAREFLKEIGJ並不由對偶基因HLA-DRB3:01:01呈遞。IX.C.2. 編碼模組
編碼模組314將含於訓練數據170中之資訊編碼成可用於產生一或多種呈遞模型之數值表示。在一個實施中，編碼模組314針對預定20字母胺基酸字母表對序列(例如，肽序列或C端側接序列)進行獨熱編碼。特定而言，具有ki 個胺基酸之肽序列 pi 表示為20 個ki 元素之列向量，其中在pi 20∙(j-1)+1 , pi 20∙(j-1)+2 , …, pi 20∙j 中對應於肽序列之j 位之胺基酸之字母表的單一元素具有值1。另外，其餘元素具有值0。作為實例，對於給定字母表{A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y}，針對數據實例i 之3個胺基酸之肽序列EAF可表示為60個元素之列向量 pi =[0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0]。C端側接序列 ci 以及MHC對偶基因之蛋白質序列 dh 及呈遞資訊中之其他序列數據可類似地如上文所述來編碼。
當訓練數據170含有不同長度之胺基酸之序列時，編碼模組314可藉由添加PAD字符來延長預定字母表進一步將肽編碼成等長向量。舉例而言，此可藉由用PAD字符左填充肽序列直至肽序列之長度達到具有訓練數據170中之最大長度之肽序列來實施。因此，當具有最大長度之肽序列具有kmax 個胺基酸時，編碼模組314在數值上將每一序列表示為(20+1 )∙kmax 個元素之列向量。作為實例，對於延長字母表{PAD、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y}及kmax =5 之最大胺基酸長度，3個胺基酸之相同實例性肽序列EAF可表示為105個元素之列向量 pi =[1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0]。C端側接序列 ci 或其他序列數據可類似地如上文所述來編碼。因此，肽序列 pi 或 ci 中之每一自變數或欄表示序列特定位置之特定胺基酸之存在。
儘管上述編碼序列數據之方法係參考具有胺基酸序列之序列來闡述，但該方法可類似地延伸至其他類型之序列數據，例如DNA或RNA序列數據及諸如此類。
編碼模組314亦將針對數據實例i 之一或多個MHC對偶基因 ai 編碼為m 個元素之列向量，其中每一元素h=1, 2, …, m 對應於經鑑別之獨特MHC對偶基因。對應於針對數據實例i 鑑別之MHC對偶基因之元素具有值1。另外，其餘元素具有值0。作為實例，對應於多對偶基因細胞系(其中m=4 種經鑑別之獨特MHC對偶基因類型{HLA-A*01:01、HLA-C*01:08、HLA-B*07:02、HLA-C*01:03})之數據實例i 之對偶基因HLA-B*07:02及HLA-C*01:03可表示為4個元素之列向量 ai =[0 0 1 1]，其中a3 i =1且a4 i =1。作為另一實例，對應於針對數據實例i 鑑別之MHC對偶基因之元素具有值1。另外，其餘元素具有值0。作為實例，對應於多對偶基因細胞系(其中m=4 種經鑑別之MHC對偶基因類型{HLA-A*01:01、HLA-C*01:08、HLA-B*07:02、HLA-DRB1*10:01})之數據實例i 之對偶基因HLA-B*07:02及HLA-DRB1*10:01可表示為4個元素之列向量 ai =[0 0 1 1]，其中a3 i =1且a4 i =1。儘管本文闡述具有4種經鑑別MHC對偶基因類型之實例，但在實踐中MHC對偶基因類型之數量可為數百或數千。如先前所論述，每一數據實例i 通常含有至多6種與肽序列 pi 相關之不同I類MHC對偶基因類型，及/或至多4種與肽序列 pi 相關之不同II類MHC DR對偶基因類型，及/或至多12種與肽序列 pi. 相關之不同II類MHC對偶基因類型。
編碼模組314亦將每一數據實例i 之標記yi 編碼為具有集{0, 1}之值之二進制變量，其中值1指示肽 xi 係由一個相關MHC對偶基因 ai 呈遞，且值0指示肽 xi 並非由任一相關MHC對偶基因 ai 呈遞。當應變數yi 代表質譜離子流時，編碼模組314可另外利用多個函數(例如對於介於[0, ∞]之間之離子流值具有[-∞, ∞]範圍之對數函數)縮放該等值。
編碼模組314可將針對肽pi 及相關MHC對偶基因h 之對偶基因相互作用變量對 xh i 表示為將對偶基因相互作用變量之數值表示依序串聯在一起之列向量。舉例而言，編碼模組314可將 xh i 表示為等於[pi ] 、[pi bh i ] 、[pi sh i ] 或[pi bh i sh i ] 之列向量，其中bh i 係對肽pi 及相關MHC對偶基因h 之結合親和力預測，且類似地sh i 係穩定性預測。或者，可個別地儲存(例如作為個別向量或矩陣)對偶基因相互作用變量之一或多種組合。
在一個實例中，編碼模組314藉由將經量測或預測之結合親和力值納入對偶基因相互作用變量 xh i 中來表示結合親和力資訊。
在一個實例中，編碼模組314藉由將經量測或預測之結合穩定性值納入對偶基因相互作用變量 xh i 中來表示結合穩定性資訊。
在一個實例中，編碼模組314藉由將經量測或預測之結合速率值納入對偶基因相互作用變量 xh i 中來表示結合速率資訊。
在一個實例中，對於由I類MHC分子呈遞之肽，編碼模組314將肽長度表示為向量 Tk =[(Lk =8) (Lk =9) (Lk =10) (Lk =11) (Lk =12) (Lk =13) (Lk =14) (Lk =15)]，其中係指示函數，且Lk 表示肽 pk 之長度。向量 Tk 可包括在對偶基因相互作用變量 xh i 中。在另一實例中，對於由II類MHC分子呈遞之肽，編碼模組314將肽長度表示為向量 Tk =[ (Lk =6) (Lk =7) (Lk =8) (Lk =9) (Lk =10) (Lk =11) (Lk =12) (Lk =13) (Lk =14) (Lk =15) (Lk =16) (Lk =17) (Lk =18) (Lk =19) (Lk =20) (Lk =21) (Lk =22) (Lk =23) (Lk =24) (Lk =25) (Lk =26) (Lk =27) (Lk =28) (Lk =29) (Lk =30)]，其中係指示函數，且Lk 表示肽 pk 之長度。向量 Tk 可包括在對偶基因相互作用變量 xh i 中。
在一個實例中，編碼模組314藉由將MHC對偶基因之基於RNA-seq之表現量納入對偶基因相互作用變量 xh i 中來表示MHC對偶基因之RNA表現資訊。
類似地，編碼模組314可代表為列向量之對偶基因非相互作用變量 wi ，其中對偶基因非相互作用變量之數值係一個串聯在另一個後面。舉例而言， wi 可為等於[ci ] 或[ci mi wi ] 之列向量，其中 wi 係表示除肽 pi 之C端側接序列及與該肽相關之mRNA量化量測 mi 外之任何其他對偶基因非相互作用變量之列向量。或者，可個別地儲存(例如，作為個別向量或矩陣)對偶基因非相互作用變量之一或多種組合。
在一個實例中，編碼模組314藉由將轉換率或半衰期納入對偶基因非相互作用變量 wi 中來表示肽序列之源蛋白轉換率。
在一個實例中，編碼模組314藉由將蛋白質長度納入對偶基因非相互作用變量 wi 中來表示源蛋白或異型體之長度。
在一個實例中，編碼模組314藉由將免疫蛋白酶體特異性蛋白酶體亞單位(包括β1 i 、β2 i 、β5 i 亞單位)之平均表現納入對偶基因非相互作用變量 wi 中來表示免疫蛋白酶體之活化。
在一個實例中，編碼模組314表示肽之源蛋白之RNA-seq豐度，或肽之基因或轉錄本(藉由諸如RSEM等技術以FPKM、TPM為單位來量化)可將源蛋白之豐度納入對偶基因非相互作用變量 wi 中。
在一個實例中，編碼模組314表示如藉由例如Rivas等人Science, 2015中之模型所估計肽起源之轉錄本會經歷無義介導之衰變(NMD)之機率，其係藉由將此機率納入對偶基因非相互作用變量 wi 中來達成。
在一個實例中，編碼模組314表示經由RNA-seq評價之基因模組或路徑之活化狀況，其係藉由例如對路徑中之每一基因使用例如RSEM以TPM為單位量化路徑中基因之表現，然後計算路徑中之基因之概括統計量(例如平均值)來實施。該平均值可納入對偶基因非相互作用變量 wi 中。
在一個實例中，編碼模組314藉由將拷貝數納入對偶基因非相互作用變量 wi 中來表示源基因之拷貝數。
在一個實例中，編碼模組314藉由將經量測或預測之TAP結合親和力(例如以奈莫耳單位表示)納入對偶基因非相互作用變量 wi 中來表示TAP結合親和力。
在一個實例中，編碼模組314藉由將藉由RNA-seq量測(且藉由例如RSEM以TPM為單位量化)之TAP表現量納入對偶基因非相互作用變量 wi 中來表示TAP表現量。
在一個實例中，編碼模組314將腫瘤突變表示為對偶基因非相互作用變量 wi 中指示變量之向量(即，若肽 pk 來自具有KRAS G12D突變之樣品則 dk = 1，否則 dk = 0)。
在一個實例中，編碼模組314將抗原呈遞基因之生殖系多型性表示為指示變量之向量(即，若肽 pk 來自具有TAP中之特定生殖系多型性之樣品，則 dk = 1)。可將該等指示變量納入對偶基因非相互作用變量 wi 中。
在一個實例中，編碼模組314將腫瘤類型表示為針對腫瘤類型(例如NSCLC、黑色素瘤、結腸直腸癌等)之字母之長度1獨熱編碼向量。可將該等獨熱編碼變量納入對偶基因非相互作用變量 wi 中。
在一個實例中，編碼模組314藉由用不同後綴處理4數位HLA對偶基因來表示MHC對偶基因後綴。舉例而言，出於該模型之目的，HLA-A*24:09N視為與HLA-A*24:09不同之對偶基因。或者，N後綴之MHC對偶基因對所有肽之呈遞機率可設定為0，因為以N後綴結尾之HLA對偶基因不表現。
在一個實例中，編碼模組314將腫瘤亞型表示為針對腫瘤亞型(例如肺腺癌、肺鱗狀細胞癌等)之字母之長度1獨熱編碼向量。可將該等獨熱編碼變量納入對偶基因非相互作用變量 wi 中。
在一個實例中，編碼模組314將吸煙史表示為二進制指示變量(若患者具有吸煙史則 dk = 1，否則 dk = 0)，其可納入對偶基因非相互作用變量 wi 中。或者，吸煙史可編碼為針對吸煙嚴重程度之字母之長度1獨熱編碼變量。舉例而言，可將吸煙狀況分級成1-5級，其中1指示不吸煙者，且5指示當前重度吸煙者。由於吸煙史主要與肺腫瘤相關，當對多個腫瘤類型訓練模型時，若患者具有吸煙史且腫瘤類型係肺腫瘤，則此變量亦可定義為等於1，否則定義為等於0。
在一個實例中，編碼模組314將曬傷史表示為二進制指示變量(若患者具有嚴重曬傷史則 dk = 1，否則 dk = 0)，其可納入對偶基因非相互作用變量 wi 中。由於嚴重曬傷主要與黑色素瘤相關，當對多個腫瘤類型訓練模型時，若患者具有嚴重曬傷史且腫瘤類型係黑色素瘤，則此變量亦可定義為等於1，否則定義為等於0。
在一個實例中，編碼模組314藉由利用諸如TCGA等參考數據庫將用於人類基因體中每一基因或轉錄本之具體基因或轉錄本之表現量分佈表示為表現量分佈之概括統計量(例如平均值、中值)。特定而言，對於具有腫瘤類型黑色素瘤之樣品中之肽 pk ，不僅可將肽 pk 起源之基因或轉錄本之經量測基因或轉錄本表現量納入對偶基因非相互作用變量 wi 中，且亦納入黑色素瘤中肽 pk 起源之基因或轉錄本之平均值及/或中值基因或轉錄本表現，如藉由TCGA所量測。
在一個實例中，編碼模組314將突變類型表示為針對突變類型(例如誤義、框移、NMD誘導等)之字母表之長度1獨熱編碼變量。可將該等獨熱編碼變量納入對偶基因非相互作用變量 wi 中。
在一個實例中，編碼模組314將蛋白質之蛋白質層級特徵表示為對偶基因非相互作用變量 wi 中源蛋白之註解值(例如5’端UTR長度)。在另一實例中，編碼模組314藉由將指示變量納入對偶基因非相互作用變量 wi 中來表示肽 pi 之源蛋白之殘基層級註解，若肽 pi 與螺旋基序重疊則該指示變量等於1，否則等於0，或若肽 pi 完全含於螺旋基序內則該指示變量等於1。在另一實例中，可將表示含於螺旋基序註解內之肽 pi 中之殘基比例之特徵納入對偶基因非相互作用變量 wi 中。
在一個實例中，編碼模組314將人類蛋白質體中之蛋白質或異型體之類型表示為指示向量 ok ，其具有等於人類蛋白質體中之蛋白質或異型體數量之長度，且若肽 pk 來自蛋白質i 則相應元素ok i 為1，否則ok i 為0。
在一個實例中，編碼模組314將肽 pi 之源基因G =基因( pi )表示為具有L 個可能類別之類別變量，其中L 表示索引源基因1, 2, …,L 之數量之上限。
編碼模組314亦可將針對肽 pi 及相關MHC對偶基因h 之變量 zi 之總集表示為將對偶基因相互作用變量 xi 及對偶基因非相互作用變量 wi 之數值表示依序串聯在一起之列向量。舉例而言，編碼模組314可將 zh i 表示為等於[xh i wi ] 或[wi xh i ] 之列向量。X. 訓練模組
訓練模組316構築一或多種產生肽序列是否將由與該等肽序列相關之MHC對偶基因呈遞之似然度的呈遞模型。特定而言，給定肽序列 pk 及與肽序列 pk 相關之一組MHC對偶基因 ak ，每一呈遞模型產生估計uk ，其指示肽序列 pk 將由一或多個相關MHC對偶基因 ak 呈遞之似然度。X.A. 概述
訓練模組316基於自儲存於165中之呈遞資訊產生之儲存於儲存區170中之訓練數據集構築另一呈遞模型。通常，無論呈遞模型之特定類型如何，所有呈遞模型皆捕獲訓練數據170中之自變數與應變數之間之依賴性，使得損失函數最小化。特定而言，損失函數(yi ∈S , ui ∈S ; θ )表示訓練數據170中一或多個數據實例S 之應變數yi ∈S 值與由呈遞模型產生之對數據實例S 估計之似然度ui ∈S 之間的差異。在本說明書其餘部分通篇中所提及之一個具體實施中，損失函數(yi ∈S , ui ∈S ; θ )係藉由如下等式(1a)給出之負對數似然度函數：然而，在實踐中，可使用另一損失函數。舉例而言，當對質譜離子流進行預測時，損失函數係藉由如下等式1b給出之均方損失：
呈遞模型可為其中一或多個參數 θ 以數學方式指定自變數與應變數之間之依賴性之參數模型。通常，參數型呈遞模型之最小化損失函數(yi ∈S , ui ∈S ; θ )之各個參數係經由基於梯度之數值最佳化演算法(例如批梯度演算法、隨機梯度演算法及諸如此類)來確定。或者，呈遞模型可為其中模型結構係根據訓練數據170來確定且並不嚴格基於固定參數集之非參數模型。X.B. 每一對偶基因模型
訓練模組316可構築呈遞模型以基於每一對偶基因來預測肽之呈遞似然度。在此情形下，訓練模組316可基於自表現單一MHC對偶基因之細胞產生之訓練數據170中之數據實例S 來訓練呈遞模型。
在一個實施中，訓練模組316藉由下式對針對特定對偶基因h 之肽 pk 估計之呈遞似然度uk 建模：其中肽序列 xh k 表示針對肽 pk 及相應MHC對偶基因h 之經編碼對偶基因相互作用變量，f (∙)係任一函數，且為便於描述在本文通篇中稱為轉換函數。此外，gh (∙)係任一函數，且為便於描述在本文通篇中稱為依賴性函數，且基於對MHC對偶基因h 確定之參數集 θh 產生對偶基因相互作用變量 xh k 之依賴性分數。每一MHC對偶基因h 之參數集 θh 之值可藉由針對 θh 最小化損失函數來測定，其中i 係自表現單一MHC對偶基因h 之細胞產生之訓練數據170之子集S 中的每一實例。
依賴性函數gh ( xh k ;θh )之輸出表示MHC對偶基因h 之依賴性分數，其指示MHC對偶基因h 是否將基於至少對偶基因相互作用特徵 xh k 、且具體而言基於肽 pk 之肽序列之胺基酸位置來呈遞相應新抗原。舉例而言，若MHC對偶基因h 可能呈遞肽 pk 則MHC對偶基因h 之依賴性分數可具有高值，且若呈遞係不可能的則MHC對偶基因h 之依賴性分數可具有低值。在此情形下，轉換函數f (∙)轉換輸入，且更特定而言，將由gh ( xh k ; θh )產生之依賴性分數轉換成適宜值以指示肽 pk 將由MHC對偶基因呈遞之似然度。
本說明書其餘部分通篇中所提及之一個具體實施中，f (∙)係對於適宜域範圍具有[0, 1]內之範圍之函數。在一個實例中，f (∙)係藉由下式給出之expit函數：作為另一實例，當域z 之值等於或大於0時，f (∙)亦可為藉由下式給出之雙曲正切函數：或者，當對具有範圍[0, 1]外之值之質譜離子流進行預測時，f (∙)可為任一函數，例如恒等函數、指數函數、對數函數及諸如此類。
因此，肽序列 pk 將由MHC對偶基因h 呈遞之每一對偶基因似然度可藉由以下方式來產生：將MHC對偶基因h之依賴性函數gh (∙)應用於肽序列 pk 之編碼形式以產生相應依賴性分數。可藉由轉換函數f (∙)轉換依賴性分數以產生肽序列 pk 將由MHC對偶基因h 呈遞之每一對偶基因似然度。X.B.1 對偶基因相互作用變量之依賴性函數
在本說明書通篇所提及之一個具體實施中，依賴性函數gh (∙)係藉由下式給出之仿射函數：其將 xh k 中之每一對偶基因相互作用變量與對相關MHC對偶基因h 確定之參數集 θh 中之相應參數線性組合在一起。
在本說明書通篇所提及之另一具體實施中，依賴性函數 gh (∙) 係藉由下式給出之網路函數：其表示為具有排列在一或多個層中之一系列結點之網路模型NNh (∙)。結點可經由各自具有參數集 θh 中之相關參數之連接連接至其他結點。一個具體結點處之值可表示為由與具體結點相關之激活函數所映射之相關參數加權之連接至具體結點之結點值之和。與仿射函數不同，網路模型有利之原因在於，呈遞模型可納入具有不同長度之胺基酸序列之非線性及過程數據。特定而言，經由非線性建模，網路模型可捕獲肽序列中不同位置之胺基酸之間的相互作用及此相互作用如何影響肽呈遞。
一般而言，網路模型NNh (∙)可結構化為前饋網路，例如人工神經網路(ANN)、捲積神經網路(CNN)、深度神經網路(DNN)及/或遞歸網路，例如長短時記憶網路(LSTM)、二維遞歸網路、深度二維遞歸網路及諸如此類。
在本說明書通篇所提及之一個實例中，h=1,2,…, m 中之每一MHC對偶基因與單獨網路模型相關，且NNh (∙)表示來自與MHC對偶基因h 相關之網路模型之輸出。
圖5圖解說明與任意MHC對偶基因h= 3相關之實例性網路模型NN3 (∙)。如圖5中所示，MHC對偶基因h=3 之網路模型NN3 (∙)包括層l=1 處之三個輸入結點、層l=2 處之四個結點、層l=3 處之兩個結點及層l=4 處之一個輸出結點。 網路模型NN3 (∙)與10參數集θ3 (1), θ3 (2), …, θ3 (10)相關。網路模型NN3 (∙)接收MHC對偶基因h=3 之三個對偶基因相互作用變量x3 k (1)、x3 k (2)及x3 k (3)之輸入值(個別數據實例包括經編碼多肽序列數據及所用之任何其他訓練數據)且輸出值NN3 (x3 k )。網路函數亦可包括一或多種各自採用不同的對偶基因相互作用變量作為輸入之網路模型。
在另一實例中，經鑑別MHC對偶基因h=1, 2, …, m 與單一網路模型NNH (∙)相關，且NNh (∙)表示與MHC對偶基因h 相關之單一網路模型之一或多個輸出。在該實例中，參數集 θh 可對應於單一網路模型之參數集，且因此參數集 θh 可為所有MHC對偶基因共用。
圖6A圖解說明為MHC對偶基因h=1,2, …,m 所共用之實例性網路模型NNH (∙)。如圖6A中所示，網路模型NNH (∙)包括各自對應於MHC對偶基因之m 個輸出結點。網路模型NN3 (∙)接收MHC對偶基因h=3 之對偶基因相互作用變量 x3 k 且輸出m 值，包括對應於MHC對偶基因h=3 之值NN3 (x3 k )。
在另一實例中，給定對偶基因相互作用變量 xh k 及MHC對偶基因h 之經編碼蛋白質序列 dh ，單一網路模型NNH (∙)可為輸出依賴性分數之網路模型。在該實例中，參數集 θh 亦可對應於單一網路模型之參數集，且因此參數集 θh 可為所有MHC對偶基因共用。因此，在該實例中，給予單一網路模型輸入[ xh k dh ] ，NNh (∙)可表示單一網路模型NNH (∙)之輸出。該網路模型有利之原因在於，在訓練數據中未知之MHC對偶基因之肽呈遞機率可僅藉由鑑別其蛋白質序列來預測。
圖6B圖解說明為MHC對偶基因所共用之實例性網路模型NNH (∙)。如圖6B中所示，網路模型NNH (∙)接收MHC對偶基因h=3 之對偶基因相互作用變量及蛋白質序列作為輸入，且輸出對應於MHC對偶基因h=3 之依賴性分數NN3 (x3 k )。
在另一實例中，依賴性函數 gh (∙) 可表示為：其中g’h ( xh k ; θ’h )係具有參數集 θ’h 之仿射函數、網路函數或諸如此類，其中MHC對偶基因之對偶基因相互作用變量之參數集中之偏差參數 θh 0 代表MHC對偶基因h 之基線呈遞機率。
在另一實施中，偏差參數 θh 0 可根據MHC對偶基因h 之基因家族來共用。亦即，MHC對偶基因h 之偏差參數 θh 0 可等於 θ 基因(h) 0 ，其中基因 (h )係MHC對偶基因h 之基因家族。舉例而言，I類MHC對偶基因HLA-A*02:01、HLA-A*02:02及HLA-A*02:03可分配至「HLA-A」之基因家族，且可共用該等MHC對偶基因中每一者之偏差參數 θh 0 。作為另一實例，II類MHC對偶基因HLA-DRB1:10:01、HLA-DRB1:11:01及HLA-DRB3:01:01可分配至「HLA-DRB」之基因家族，且可共用該等MHC對偶基因中每一者之偏差參數 θh 0 。
返回至等式(2)，作為實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用仿射依賴性函數gh (∙)藉由下式來產生：， 其中 x3 k 係MHC對偶基因h=3 之經鑑別對偶基因相互作用變量，且 θ3 係經由損失函數最小化對MHC對偶基因h=3 確定之參數集。
作為另一實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用單獨網路轉換函數gh (∙)藉由下式來產生：， 其中 x3 k 係MHC對偶基因h=3 之經鑑別對偶基因相互作用變量，且 θ3 係對與MHC對偶基因h=3 相關之網路模型NN3 (∙)確定之參數集。
圖7圖解說明利用實例性網路模型NN3 (∙)產生與MHC對偶基因h= 3相關之肽 pk 之呈遞似然度。如圖7中所示，網路模型NN3 (∙)接收MHC對偶基因h=3 之對偶基因相互作用變量 x3 k 且產生輸出NN3 ( x3 k )。輸出係藉由函數 f (∙) 來映射以產生所估計之呈遞似然度uk 。X.B.2. 具有對偶基因非相互作用變量之每一對偶基因 模型
在一個實施中，訓練模組316納入對偶基因非相互作用變量且藉由下式對所估計之肽 pk 之呈遞似然度uk 建模：其中 wk 表示肽 pk 之經編碼對偶基因非相互作用變量，gw (∙)係基於對對偶基因非相互作用變量確定之參數集 θw 之對偶基因非相互作用變量 wk 之函數。特定而言，每一MHC對偶基因h 之參數集 θh 及對偶基因非相互作用變量之參數集 θw 的值可藉由針對 θh 及 θw 最小化損失函數來確定，其中i 係自表現單一MHC對偶基因之細胞產生之訓練數據170之子集S 中的每一實例。
依賴性函數gw ( wk ;θw )之輸出表示對偶基因非相互作用變量之依賴性分數，其指示基於對偶基因非相互作用變量之影響，肽 pk 是否將由一或多個MHC對偶基因呈遞。舉例而言，若肽 pk 與已知積極地影響肽 pk 之呈遞之C端側接序列相關，則對偶基因非相互作用變量之依賴性分數可具有高值，且若肽 pk 與已知消極地影響肽 pk 之呈遞之C端側接序列相關，則對偶基因非相互作用變量之依賴性分數可具有低值。
根據等式(8)，肽序列 pk 將由MHC對偶基因h 呈遞之每一對偶基因似然度可藉由以下方式來產生：將MHC對偶基因h 之函數gh (∙)應用於肽序列 pk 之編碼形式以產生對偶基因相互作用變量之相應依賴性分數。亦將對偶基因非相互作用變量之函數gw (∙)應用於對偶基因非相互作用變量之編碼形式以產生對偶基因非相互作用變量之依賴性分數。組合兩個分數，且藉由轉換函數f (∙)轉換經組合分數以產生肽序列 pk 將由MHC對偶基因h 呈遞之每一對偶基因似然度。
或者，訓練模組316可藉由將對偶基因非相互作用變量 wk 添加至等式(2)中之對偶基因相互作用變量 xh k 將對偶基因非相互作用變量 wk 納入預測中。因此，呈遞似然度可藉由下式給出： X.B.3 對偶基因非相互作用變量之依賴性函數
與對偶基因相互作用變量之依賴性函數gh (∙)類似，對偶基因非相互作用變量之依賴性函數gw (∙)可為其中單獨網路模型與對偶基因非相互作用變量 wk 相關之仿射函數或網路函數。
特定而言，依賴性函數gw (∙)係藉由下式給出之仿射函數：其將 wk 中之對偶基因非相互作用變量與參數集 θw 中之相應參數線性組合在一起。
依賴性函數 gw (∙) 亦可為藉由下式給出之網路函數：， 其表示為具有參數集 θw 中之相關參數之網路模型NNw (∙)。網路函數亦可包括一或多種各自採用不同的對偶基因非相互作用變量作為輸入之網路模型。
在另一實例中，對偶基因非相互作用變量之依賴性函數 gw (∙) 可藉由下式給出：其中g’w ( wk ; θ’w )係仿射函數、具有對偶基因非相互作用參數集 θ’w 之網路函數或諸如此類，mk 係肽 pk 之mRNA量化量測，h (∙)係轉換量化量測之函數，且θw m 係對偶基因非相互作用變量之參數集中與mRNA量化量測組合以產生mRNA量化量測之依賴性分數之參數。在本說明書其餘部分通篇所提及之一個具體實施例中，h (∙)係對數函數，然而在實踐中h (∙)可為多種不同函數中之任一者。
在另一實例中，對偶基因非相互作用變量之依賴性函數 gw (∙) 可藉由下式給出：其中g’w ( wk ; θ’w )係仿射函數、具有對偶基因非相互作用參數集 θ’w 之網路函數或諸如此類， ok 係上文所述針對肽 pk 之代表人類蛋白質體中之蛋白質及異型體之指示向量，且 θw o 係對偶基因非相互作用變量之參數集中與指示向量組合之參數集。在一種變化形式中，當 ok 之維數及參數集 θw o 顯著較高時，當確定參數之值時，可將參數正則化術語(例如，其中||∙||表示L1範數、L2範數、組合或諸如此類)添加至損失函數中。超參數λ之最佳值可經由適當方法來確定。
在另一實例中，對偶基因非相互作用變量之依賴性函數 gw (∙) 可藉由下式給出：其中g’w ( wk ; θ’w )係仿射函數、具有對偶基因非相互作用參數集 θ’w 之網路函數或諸如此類， (基因( pk =l ))係當肽 pk 如上文針對對偶基因非相互作用變量所述係來自源基因l 時等於1之指示函數，且 θw l 係指示源基因l 之「抗原性」之參數。在一變化形式中，當L 顯著較高且因此參數 θw l=1, 2, …, L 之數值顯著較高時，參數正則化術語(例如，其中||∙||表示L1範數、L2範數、組合或諸如此類)可在確定參數之值時添加至損失函數。超參數λ之最佳值可經由適當方法來確定。
在實踐中，可組合等式(10)、(11)及(12)中任一者之其他術語以產生對偶基因非相互作用變量之依賴性函數gw (∙)。舉例而言，可將等式(10)中指示mRNA量化量測之術語h (∙)及等式(12)中指示源基因抗原性之術語以及任何其他仿射或網路函數加和在一起以產生對偶基因非相互作用變量之依賴性函數。
返回至等式(8)，作為實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用仿射轉換函數gh (∙)、gw (∙)藉由下式來產生：其中 wk 係針對肽 pk 之經鑑別對偶基因非相互作用變量，且 θw 係對對偶基因非相互作用變量確定之參數集。
作為另一實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用網路轉換函數gh (∙)、gw (∙)藉由下式來產生：其中 wk 係針對肽 pk 之經鑑別對偶基因相互作用變量，且 θw 係對對偶基因非相互作用變量確定之參數集。
圖8圖解說明利用實例性網路模型NN3 (∙)及NNw (∙)產生與MHC對偶基因h= 3相關之肽 pk 之呈遞似然度。如圖8中所示，網路模型NN3 (∙)接收MHC對偶基因h=3 之對偶基因相互作用變量 x3 k 且產生輸出NN3 ( x3 k )。網路模型NNw (∙)接收針對肽 pk 之對偶基因非相互作用變量 wk 且產生輸出NNw ( wk )。將輸出組合且藉由函數f (∙)映射以產生所估計之呈遞似然度uk 。X.C. 多對偶基因模型
訓練模組316亦可構築呈遞模型來預測在存在兩個或更多個MHC對偶基因之多對偶基因環境中肽之呈遞似然度。在此情形下，訓練模組316可基於自表現單一MHC對偶基因之細胞、表現多個MHC對偶基因之細胞或其組合產生之訓練數據170中之數據實例S 來訓練呈遞模型。X.C.1. 實例 1 ：每一對偶基因模型之最大值
在一個實施中，如上文結合等式(2)-(11)所述，訓練模組316將與多個MHC對偶基因集H 相關之肽 pk 之所估計呈遞似然度uk 建模為對基於表現單一對偶基因之細胞測定之集H 中之每一MHC對偶基因h 確定之呈遞似然度之函數uk h ∈H 。特定而言，呈遞似然度uk 可為uk h ∈H 之任一函數。在一個實施中，如等式(12)中所示，該函數係最大值函數，且呈遞似然度uk 可測定為集H 中之每一MHC對偶基因h 之呈遞似然度之最大值。 X.C.2. 實例 2.1 ：相加函數模型
在一個實施中，訓練模組316藉由下式對所估計之肽 pk 之呈遞似然度uk 建模：其中對於與肽序列 pk 相關之多個MHC對偶基因H 元素ah k 為1，且 xh k 表示肽 pk 及相應MHC對偶基因之經編碼對偶基因相互作用變量。每一MHC對偶基因h 之參數集 θh 之值可藉由針對 θh 最小化損失函數來確定，其中i 係自表現單一MHC對偶基因之細胞及/或表現多個MHC對偶基因之細胞產生之訓練數據170之子集S 中的每一實例。依賴性函數 gh 可呈上文在部分X.B.1中所引入之任一依賴性函數 gh 形式。
根據等式(13)，肽序列 pk 將由一或多個MHC對偶基因h 呈遞之呈遞似然度可藉由以下方式來產生：將依賴性函數gh (∙)應用於針對MHC對偶基因H 中每一者之肽序列 pk 之經編碼形式以產生對偶基因相互作用變量之相應分數。將每一MHC對偶基因h 之分數組合，且藉由轉換函數f (∙)轉換以產生肽序列 pk 將由MHC對偶基因集H 呈遞之呈遞似然度。
等式(13)之呈遞模型與等式(2)之每一對偶基因模型之不同之處在於，針對每一肽 pk 之相關對偶基因之數量可大於1。換言之，對於與肽序列 pk 相關之多個MHC對偶基因H ，在ah k 中一個以上之元素可具有值1。
作為實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=2 、h=3 呈遞之似然度(其中m=4 後不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用仿射轉換函數gh (∙)藉由下式來產生：其中 x2 k 、 x3 k 係針對MHC對偶基因h=2 、 h=3 之經鑑別對偶基因相互作用變量，且 θ2 、 θ3 係對MHC對偶基因h=2 、 h=3 確定之參數集。
作為另一實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=2 、h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用網路轉換函數gh (∙)、gw (∙)藉由下式來產生：其中NN2 (∙) 、 NN3 (∙)係MHC對偶基因h=2, h=3 之經鑑別網路模型，且 θ2 、 θ3 係對MHC對偶基因h=2 、 h=3 確定之參數集。
圖9圖解說明利用實例性網路模型NN2 (∙)及NN3 (∙)產生與MHC對偶基因h= 2、h= 3相關之肽 pk 之呈遞似然度。如圖9中所示，網路模型NN2 (∙)接收MHC對偶基因h=2 之對偶基因相互作用變量 x2 k 並產生輸出NN2 ( x2 k )，且網路模型NN3 (∙)接收MHC對偶基因h=3 之對偶基因相互作用變量 x3 k f並產生輸出NN3 ( x3 k )。將輸出組合且藉由函數f (∙)映射以產生所估計之呈遞似然度uk 。X.C.3. 實例 2.2 ：具有對偶基因非相互作用變量之相加函數模型
在一個實施中，訓練模組316納入對偶基因非相互作用變量且藉由下式對所估計之肽 pk 之呈遞似然度uk 建模：其中 wk 表示肽 pk 之經編碼對偶基因非相互作用變量。特定而言，每一MHC對偶基因h 之參數集 θh 及對偶基因非相互作用變量之參數集 θw 的值可藉由針對 θh 及 θw 最小化損失函數來確定，其中i 係自表現單一MHC對偶基因之細胞及/或表現多個MHC對偶基因之細胞產生之訓練數據170中之子集S 的每一實例。依賴性函數 gw 可呈上文在部分X.B.3中所引入之任一依賴性函數 gw 形式。
因此，根據等式(14)，肽序列 pk 將由一或多個MHC對偶基因H 呈遞之呈遞似然度可藉由以下方式來產生：將函數gh (∙)應用於針對MHC對偶基因H 中每一者之肽序列 pk 之經編碼形式以產生針對每一MHC對偶基因h 之對偶基因相互作用變量之相應依賴性分數。亦將對偶基因非相互作用變量之函數gw (∙)應用於對偶基因非相互作用變量之經編碼形式以產生對偶基因非相互作用變量之依賴性分數。將分數組合，且藉由轉換函數f (∙)轉換經組合分數以產生肽序列 pk 將由MHC對偶基因H 呈遞之呈遞似然度。
在等式(14)之呈遞模型中，針對每一肽 pk 之相關對偶基因之數量可大於1。換言之，對於與肽序列 pk 相關之多個MHC對偶基因H ，在ah k 中一個以上之元素可具有值1。
作為實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=2 、h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用仿射轉換函數gh (∙)、gw (∙)藉由下式來產生：其中 wk 係針對肽 pk 之經鑑別對偶基因非相互作用變量，且 θw 係對對偶基因非相互作用變量確定之參數集。
作為另一實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=2 、h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用網路轉換函數gh (∙)、gw (∙)藉由下式來產生：其中 wk 係針對肽 pk 之經鑑別對偶基因相互作用變量，且 θw 係對對偶基因非相互作用變量確定之參數集。
圖10圖解說明利用實例性網路模型NN2 (∙)、NN3 (∙)及NNw (∙)產生與MHC對偶基因h=2 、h= 3相關之肽 pk 之呈遞似然度。如圖10中所示，網路模型NN2 (∙)接收針對MHC對偶基因h=2 之對偶基因相互作用變量 x2 k 且產生輸出NN2 ( x2 k )。網路模型NN3 (∙)接收針對MHC對偶基因h=3 之對偶基因相互作用變量 x3 k 且產生輸出NN3 ( x3 k )。網路模型NNw (∙)接收針對肽 pk 之對偶基因非相互作用變量 wk 且產生輸出NNw ( wk )。將輸出組合且藉由函數f (∙)映射以產生所估計之呈遞似然度uk 。
或者，訓練模組316可藉由將對偶基因非相互作用變量 wk 添加至等式(15)中之對偶基因相互作用變量 xh k 中將對偶基因非相互作用變量 wk 納入預測中。因此，呈遞似然度可藉由下式給出： X.C.4. 實例 3.1 ： 利用內含每一對偶基因似然度之模型
在另一實施中，訓練模組316藉由下式對所估計之肽 pk 之呈遞似然度uk 建模：其中對於與肽序列 pk 相關之多個MHC對偶基因h ∈ H ，元素ah k 為1，u’k h 係MHC對偶基因h 之內含每一對偶基因呈遞似然度，向量 v 係元素vh 對應於ah k ∙u’k h 之向量，s (∙)係映射 v 之元素之函數，且r (∙)係將輸入之值修剪至給定範圍內之修剪函數。如下文更詳細闡述，s (∙)可為求和函數或二階函數，但應瞭解在其他實施例中，s (∙)可為諸如最大值函數等任一函數。內含每一對偶基因似然度之參數集 θ 之值可藉由針對 θ 最小化損失函數來確定，其中i 係自表現單一MHC對偶基因之細胞及/或表現多個MHC對偶基因之細胞產生之訓練數據170之子集S 中的每一實例。
等式(17)係呈遞模型中之呈遞似然度建模為各自對應於肽 pk 將由個別MHC對偶基因h 呈遞之似然度的內含每一對偶基因呈遞似然度u’k h 之函數。內含每一對偶基因似然度與部分X.B之每一對偶基因呈遞似然度之不同之處在於，內含每一對偶基因似然度之參數可自多對偶基因環境學習，其中除單一對偶基因環境外，未知經呈遞肽與相應MHC對偶基因之間之直接相關。因此，在多對偶基因環境中，呈遞模型不僅可估計肽 pk 是否將由MHC對偶基因集H 整體呈遞，且亦可提供指示哪個MHC對偶基因h 最可能呈遞肽 pk 之個別似然度u’k h ∈H 。此之優點在於，呈遞模型可無需訓練表現單一MHC對偶基因之細胞之數據而產生內含似然度。
在本說明書其餘部分通篇中所提及之一個具體實施中，r (∙)係具有範圍[0, 1]之函數。舉例而言，r (∙)可為修剪函數：r(z) = min(max(z,0),1) 其中選擇z 與1之間之最小值作為呈遞似然度uk 。在另一實施中，當域z 之值等於或大於0時，r (∙)係藉由下式給出之雙曲正切函數：r(z) = tanh(z)。X.C.5. 實例 3.2 ：函數相加模型
在一個具體實施中，s (∙)係求和函數，且呈遞似然度係藉由將內含每一對偶基因呈遞似然度相加來給出：
在一個實施中，藉由下式產生針對MHC對偶基因h 之內含每一對偶基因呈遞似然度：使得呈遞似然度係藉由下式來估計：
根據等式(19)，肽序列 pk 將由一或多個MHC對偶基因H 呈遞之呈遞似然度可藉由以下方式來產生：將函數gh (∙)應用於針對MHC對偶基因H 中每一者之肽序列 pk 之經編碼形式以產生對偶基因相互作用變量之相應依賴性分數。首先藉由函數f (∙)轉換每一依賴性分數以產生內含每一對偶基因呈遞似然度u’k h 。將每一對偶基因似然度u’k h 組合，且可將修剪函數應用於經組合似然度以將各值修剪至範圍[0, 1]內，以產生肽序列 pk 將由MHC對偶基因集H 呈遞之呈遞似然度。依賴性函數 gh 可呈上文在部分X.B.1中所引入之任一依賴性函數 gh 形式。
作為實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=2 、h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用仿射轉換函數gh (∙)藉由下式來產生：其中 x2 k 、 x3 k 係針對MHC對偶基因h=2 、 h=3 之經鑑別對偶基因相互作用變量，且 θ2 、 θ3 係對MHC對偶基因h=2 、 h=3 確定之參數集。
作為另一實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=2 、h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用網路轉換函數gh (∙)、gw (∙)藉由下式來產生：其中NN2 (∙) 、 NN3 (∙)係針對MHC對偶基因h=2 、 h=3 之經鑑別網路模型，且 θ2 、 θ3 係對MHC對偶基因h=2 、 h=3 確定之參數集。
圖11圖解說明利用實例性網路模型NN2 (∙)及NN3 (∙)產生與MHC對偶基因h= 2、h= 3相關之肽 pk 之呈遞似然度。如圖9中所示，網路模型NN2 (∙)接收針對MHC對偶基因h=2 之對偶基因相互作用變量 x2 k 並產生輸出NN2 ( x2 k )，且網路模型NN3 (∙)接收針對MHC對偶基因h=3 之對偶基因相互作用變量 x3 k 並產生輸出NN3 ( x3 k )。每一輸出係藉由函數f (∙)映射且組合以產生所估計之呈遞似然度uk 。
在另一實施中，當對質譜離子流之對數進行預測時，r (∙)係對數函數且f (∙)係指數函數。X.C.6. 實例 3.3 ：具有對偶基因非相互作用變量之函數相加模型
在一個實施中，藉由下式產生針對MHC對偶基因h 之內含每一對偶基因呈遞似然度：使得呈遞似然度係藉由下式來產生：以納入對偶基因非相互作用變量對肽呈遞之影響。
根據等式(21)，肽序列 pk 將由一或多個MHC對偶基因H 呈遞之呈遞似然度可藉由以下方式來產生：將函數gh (∙)應用於針對MHC對偶基因H 中每一者之肽序列 pk 之經編碼形式以產生針對每一MHC對偶基因h 之對偶基因相互作用變量之相應依賴性分數。亦將針對對偶基因非相互作用變量之函數gw (∙)應用於對偶基因非相互作用變量之經編碼形式以產生對偶基因非相互作用變量之依賴性分數。將對偶基因非相互作用變量之分數與對偶基因相互作用變量之每一依賴性分數組合。藉由函數f (∙)轉換每一經組合分數以產生內含每一對偶基因呈遞似然度。將內含似然度組合，且可將修剪函數應用於經組合輸出以將各值修剪至範圍[0,1]內，以產生肽序列 pk 將由MHC對偶基因H 呈遞之呈遞似然度。依賴性函數 gw 可呈上文在部分X.B.3中所引入之任一依賴性函數 gw 形式。
作為實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=2 、h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用仿射轉換函數gh (∙)、gw (∙)藉由下式來產生：其中 wk 係針對肽 pk 之經鑑別對偶基因非相互作用變量，且 θw 係對對偶基因非相互作用變量確定之參數集。
作為另一實例，肽 pk 將由MHC對偶基因h=2 、h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別MHC對偶基因)可利用網路轉換函數gh (∙)、gw (∙)藉由下式來產生：其中 wk 係針對肽 pk 之經鑑別對偶基因相互作用變量，且 θw 係對對偶基因非相互作用變量確定之參數集。
圖12圖解說明利用實例性網路模型NN2 (∙)、NN3 (∙)及NNw (∙)產生與MHC對偶基因h=2 、h= 3相關之肽 pk 之呈遞似然度。如圖12中所示，網路模型NN2 (∙)接收針對MHC對偶基因h=2 之對偶基因相互作用變量 x2 k 並產生輸出NN2 ( x2 k )。網路模型NNw (∙)接收針對肽 pk 之對偶基因非相互作用變量 wk 並產生輸出NNw ( wk )。將輸出組合且藉由函數f (∙)映射。網路模型NN3 (∙)接收針對MHC對偶基因h=3 之對偶基因相互作用變量 x3 k 並產生輸出NN3 ( x3 k )，亦將其與相同網路模型NNw (∙)之輸出NNw ( wk )組合且藉由函數f (∙)映射。將兩個輸出組合以產生所估計之呈遞似然度uk 。
在另一實施中，藉由下式產生針對MHC對偶基因h 之內含每一對偶基因呈遞似然度：使得呈遞似然度係藉由下式來產生：。X.C.7. 實例 4 ：二階模型
在一個實施中，s (∙)係二階函數，且所估計之肽 pk 之呈遞似然度uk 係藉由下式給出：其中元素u’k h 係針對MHC對偶基因h 之內含每一對偶基因呈遞似然度。針對內含每一對偶基因似然度之參數集 θ 之值可藉由針對 θ 最小化損失函數來確定，其中i 係自表現單一MHC對偶基因之細胞及/或表現多個MHC對偶基因之細胞產生之訓練數據170之子集S 中的每一實例。內含每一對偶基因呈遞似然度可呈上文所述之等式(18)、(20)及(22)中所示之任一形式。
在一態樣中，等式(23)之模型可暗示存在肽 pk 將由兩個MHC對偶基因同時呈遞之概率，其中兩個HLA對偶基因之呈遞係統計學上獨立的。
根據等式(23)，肽序列 pk 將由一或多個MHC對偶基因H 呈遞之呈遞似然度可藉由以下方式來產生：組合內含每一對偶基因呈遞似然度並自總和減去每一對MHC對偶基因將同時呈遞肽 pk 之似然度以產生肽序列 pk 將由MHC對偶基因H 呈遞之呈遞似然度。
作為實例，肽 pk 將由HLA對偶基因h=2 、h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別HLA對偶基因)可利用仿射轉換函數gh (∙)藉由下式來產生：其中 x2 k 、 x3 k 係針對HLA對偶基因h=2 、 h=3 之經鑑別對偶基因相互作用變量，且 θ2 、 θ3 係對HLA對偶基因h=2 、 h=3 確定之參數集。
作為另一實例，肽 pk 將由HLA對偶基因h=2 、h=3 呈遞之似然度(其中m=4 個不同的經鑑別HLA對偶基因)可利用網路轉換函數gh (∙)、gw (∙)藉由下式來產生：其中NN2 (∙) 、 NN3 (∙)係針對HLA對偶基因h=2 、 h=3 之經鑑別網路模型，且 θ2 、 θ3 係對HLA對偶基因h=2 、 h=3 確定之參數集。XI.A 實例 5 ：預測模組
預測模組320接收序列數據且利用呈遞模型在序列數據中選擇候選新抗原。特定而言，序列數據可為自患者之腫瘤組織細胞提取之DNA序列、RNA序列及/或蛋白質序列。預測模組320將序列數據處理成複數個具有8-15個胺基酸(對於MHC-I)或6-30個胺基酸(對於MHC-II)之肽序列 pk 。舉例而言，預測模組320可將給定序列「IEFROEIFJEF」處理成三個具有9個胺基酸之肽序列「IEFROEIFJ」、「EFROEIFJE」及「FROEIFJEF」。在一個實施例中，預測模組320可藉由以下方式來鑑別為突變肽序列之候選新抗原：比較自患者之正常組織細胞提取之序列數據與自患者之腫瘤組織細胞提取之序列數據以鑑別出含有一或多個突變之部分。
呈遞模組320將一或多個呈遞模型應用於經處理之肽序列以估計該等肽序列之呈遞似然度。特定而言，預測模組320可藉由將呈遞模型應用於候選新抗原來選擇一或多個可能呈遞於腫瘤HLA分子上之候選新抗原肽序列。在一個實施中，呈遞模組320選擇具有大於預定臨限值之經估計呈遞似然度之候選新抗原序列。在另一實施中，呈遞模型選擇N 個具有最高經估計呈遞似然度之候選新抗原序列(其中N 通常為可在疫苗中遞送之最大表位數)。可將包括針對給定患者選擇之候選新抗原之疫苗注射至患者中來誘導免疫反應。XI.B. 實例 6 ：盒設計模組 XI.B.1 概述
盒設計模組324基於v 個用於注射至患者中之經選擇候選肽產生疫苗盒序列。具體而言，對於納入能力v 之疫苗中之經選擇肽集 pk ,k=1, 2, …, v ，盒序列係藉由使一系列各自包括相應肽 pk 之序列之治療性表位序列 p’k ,k=1, 2, …, v 串聯在一起給出。在一個實施例中，盒設計模組324可使表位彼此相鄰直接串聯在一起。舉例而言，疫苗盒C 可表示為：其中 p’ti 表示盒之第i 表位。因此，ti 對應於盒之i 位之經選擇肽之指數k=1, 2, …, v 。在另一實施例中，盒設計模組324可利用相鄰表位之間之一或多個可選連接體序列將表位串聯在一起。舉例而言，疫苗盒C 可表示為：其中 l(ti,tj) 表示位於盒之第i 表位 p’ti 與第j=i+1 表位 p’j=i+1 之間之連接體序列。盒設計模組324決定經選擇表位 p’k ,k=1, 2, …, v 中之哪些排列在盒之不同位置以及位於表位之間之任何連接體序列。盒序列C 可基於本說明書中所述之任一方法作為疫苗負載。
在一個實施例中，治療性表位集可基於藉由與高於預定臨限值之呈遞似然度相關之預測模組320測定之經選擇肽來產生，其中呈遞似然度係由呈遞模型確定。然而應瞭解，在其他實施例中，治療性表位集可基於多種方法中之任一者或多者(單獨或組合)、例如基於與患者之I類或II類HLA對偶基因之結合親和力或預測結合親和力、與患者之I類或II類HLA對偶基因之結合穩定性或預測結合穩定性、隨機取樣及諸如此類來產生。
在一個實施例中，治療性表位 p’k 可對應於經選擇肽 pk 自身。在另一實施例中，治療性表位 p’k 除經選擇肽外亦可包括C端及/或N端側接序列。舉例而言，包括在盒中之表位 p’k 可表示為序列[ nk pk ck ]，其中 ck 係附接至經選擇肽 pk C端之C端側接序列，且 nk 係附接至經選擇肽 pk N端之N端側接序列。在本說明書其餘部分通篇中所提及之一個實例中，N端及C端側接序列在其源蛋白之情況下係治療性疫苗表位之天然N端及C端側接序列。在本說明書其餘部分通篇中所提及之一個實例中，治療性表位 p’k 表示固定長度之表位。在另一實例中，治療性表位 p’k 可表示可變長度之表位，其中表位之長度可端視例如C或N側接序列之長度而變化。舉例而言，C端側接序列 ck 及N端側接序列 nk 各自可具有2-5個殘基之不同長度，從而產生表位 p’k 之16個可能之選擇。
在一個實施例中，盒設計模組324藉由將跨越盒中之一對治療性表位之間之接合處的接合處表位之呈遞考慮在內產生盒序列。接合處表位係新穎非自身但不相關之表位序列，其因將治療性表位及連接體序列串聯於盒中之過程而出現於盒中。新穎的接合處表位序列不同於盒自身之治療性表位。跨越表位 p’ti 及 p’tj 之接合處表位可包括與 p’ti 或 p’tj 二者重疊之任何表位序列，其不同於治療性表位 p’ti 及 p’tj 自身之序列。具體而言，具或不具可選連接體序列 l(ti,tj) 之盒之表位 p’ti 與相鄰表位 p’tj 之間之每一接合處可與n(ti,tj) 接合處表位 e n (ti,tj) ,n=1, 2, …, n(ti,tj) 相關。接合處表位可為與表位 p’ti 及 p’tj 二者至少部分重疊之序列，或可為與位於表位 p’ti 與 p’tj 之間之連接體序列至少部分重疊之序列。接合處表位可由I類MHC、II類MHC或二者呈遞。
圖38顯示兩個實例盒序列，盒1 (C1 )及盒2 (C2 )。每一盒具有v=2 之疫苗能力，且包括治療性表位 p’t1 = p1 = SINFEKL及 p’t2 = p2 = LLLLLVVVV及在兩個表位之間之連接體序列 l (t1,t2) = AAY。具體而言，盒C1 之序列係藉由[ p1 l (t1,t2) p2 ]給出，而盒C2 之序列係藉由[ p2 l (t1,t2) p1 ]給出。盒C1 之實例性接合處表位 e n (1,2) 可為跨越盒中之表位 p’1 及 p’2 二者之序列(例如EKLAAYLLL、KLAAYLLLLL及FEKLAAYL)，且可為跨越盒中之連接體序列及單一所選表位之序列(例如AAYLLLLL及YLLLLLVVV)。類似地，盒C2 之實例性接合處表位 e m (2,1) 可為諸如VVVVAAYSIN、VVVVAAY及AYSINFEK等序列。儘管兩個盒涉及相同的序列集 p1 、l (c1,c2) 及 p2 ，但端視盒內治療性表位之有序序列，經鑑別之接合處表位集係不同的。
在一個實施例中，盒設計模組324產生減小接合處表位在患者中呈遞之似然度之盒序列。具體而言，當將盒注射至患者中時，接合處表位具有由患者之I類HLA或II類HLA對偶基因呈遞之潛能，且分別刺激CD8或CD4 T細胞反應。該等反應通常係不合時宜的，此乃因對接合處表位具反應性之T細胞不具治療益處，且可藉由抗原競爭減輕對盒中所選治療性表位之免疫反應76 。
在一個實施例中，盒設計模組324迭代通過一或多個候選盒，且確定與該盒序列相關之接合處表位之呈遞分數低於數值臨限值之盒序列。接合處表位呈遞分數係與盒中接合處表位之呈遞似然度相關之量，且接合處表位呈遞分數之較高值指示盒之接合處表位將由I類HLA或II類HLA或二者呈遞之較高似然度。
在一個實施例中，盒設計模組324可確定候選盒序列中與最低接合處表位呈遞分數相關之盒序列。在一個實例中，給定盒序列C 之呈遞分數係基於一組各自與盒C 中之接合處相關之距離度量d ( e n (ti,tj) ,n=1, 2, …, n(ti,tj) ) =d(ti,tj) 來確定。具體而言，距離度量d(ti,tj) 指定將呈遞一或多個跨越一對相鄰治療性表位 p’ti 與 p’tj 之間之接合處表位之似然度。然後可藉由將函數(例如求和、統計函數)應用於盒C之距離度量集來確定盒C 之接合處表位呈遞分數。在數學上，呈遞分數係藉由下式給出：其中h (∙)係將每一接合處之距離度量映射至分數之某一函數。在本說明書其餘部分通篇中所提及之一個具體實例中，函數h (∙)係橫跨盒之距離度量之求和函數。
盒設計模組324可迭代通過一或多個候選盒序列，確定候選盒之接合處表位呈遞分數，並鑑別與低於臨限值之接合處表位呈遞分數相關之最佳盒序列。在本說明書其餘部分所提及之一個特定實施例中，給定接合處之距離度量d (∙)可根據呈遞似然度或經呈遞接合處表位之預期數量之和來確定，如藉由說明書之VII及VIII部分中所述之呈遞模型所測定。然而，應瞭解，在其他實施例中，距離度量可自其他因子單獨或與模型(如上文所例示者)之組合導出，其中該等其他因子可包括自以下中之任一者或多者(單獨或組合)導出距離度量：I類HLA或II類HLA之HLA結合親和力或穩定性量測或預測，及I類HLA或II類HLA之對HLA質譜或T細胞表位數據進行訓練之呈遞或免疫原性模型。在一個實施例中，距離度量可組合關於I類HLA及II類HLA呈遞之資訊。舉例而言，距離度量可為經預測結合患者之I類HLA或II類HLA對偶基因中之任一者且結合親和力低於臨限值之接合處表位之數量。在另一實例中，距離度量可為經預測由患者之I類HLA或II類HLA對偶基因中之任一者呈遞之表位之預期數量。
盒設計模組324可進一步檢查一或多個候選盒序列以鑑別候選盒序列中之任一接合處表位是否係為其設計疫苗之給定患者之自身表位。為實現此目的，盒設計模組324針對已知數據庫(例如BLAST)檢查接合處表位。在一個實施例中，盒設計模組可經構形以設計藉由將表位對ti ,tj 之距離度量d(ti,tj) 設定為極大值(例如100)避免接合處自身表位之盒，其中將表位ti 串聯至表位tj 之N端可形成接合處自身表位。
返回至圖38中之實例，盒設計模組324確定(例如)盒C1 中單一接合處(t1 ,t2 )之距離度量d(t1,t2) =d(1,2) = 0.39，其係藉由對長度為例如8至15個胺基酸(對於I類MHC)或6-30個胺基酸(對於II類MHC)之所有可能接合處表位 e n (t1,t2) = e n (1,2) 之呈遞似然度求和給出。由於在盒C1 中不存在其他接合處，故橫跨盒C1 之距離度量求和之接合處表位呈遞分數亦給出為0.39。盒設計模組324亦確定盒C2 中單一接合處之距離度量d(t1,t2) =d(2,1) = 0.068，其係藉由對長度為8至15個胺基酸(對於I類MHC)或9-30個胺基酸(對於II類MHC)之所有可能接合處表位 e n (t1,t2) = e n (2,1) 之呈遞似然度求和給出。在此實例中，盒C2 之接合處表位呈遞分數亦藉由單一接合處之距離度量0.068給出。盒設計模組324將C2 之盒序列輸出為最佳盒，此乃因接合處表位呈遞分數低於C1 之盒序列。
在一些情形下，盒設計模組324可實施蠻力法且迭代通過所有或大多數可能的候選盒序列以選擇具有最小接合處表位呈遞分數之序列。然而，該等候選盒之數量可隨著疫苗能力v 增加而過大。舉例而言，對於v=20 個表位之疫苗能力，盒設計模組324必須迭代通過約1018 個可能的候選盒以確定具有最低接合處表位呈遞分數之盒。對於盒設計模組324在合理時間量內完成以產生用於患者之疫苗而言，此確定可能在計算上係繁重的(根據所需之計算處理資源)，且有時係難以處理的。此外，考慮每一候選盒之可能接合處表位可能更為繁重。因此，盒設計模組324可基於迭代通過多個候選盒序列之方法選擇盒序列，候選盒序列之數量顯著小於蠻力法之候選盒序列之數量。
在一個實施例中，盒設計模組324產生隨機或至少假隨機產生之候選盒之子集，且選擇與低於預定臨限值之接合處表位呈遞分數相關之候選盒作為盒序列。另外，盒設計模組324可自具有最低接合處表位呈遞分數之子集選擇候選盒作為盒序列。舉例而言，盒設計模組324可產生用於v=20 經選擇表位集之約1百萬個候選盒，且選擇具有最小接合處表位呈遞分數之候選盒。儘管產生隨機盒序列之子集及在子集中選擇出具有低接合處表位呈遞分數之盒序列相對於蠻力法可為次最佳的，但其需要顯著較少之計算資源，由此使其實施在技術上係可行的。此外，實施與此更有效技術不同之蠻力法僅可引起接合處表位呈遞分數最小或甚至可忽略之改良，因此使其自資源配置之角度來看係不值得的。
在另一實施例中，盒設計模組324藉由將盒之表位序列公式化為非對稱旅行銷售員問題(TSP)來確定改良之盒構形。給定節點及每一對節點之間之距離的列表，TSP確定與最短總距離相關之節點序列以恰好訪問每一節點一次並返回至原始節點。舉例而言，給定彼此之間距離已知之城市A、B及C，TSP之解決方案產生城市之閉合序列，因此旅行以恰好訪問每一城市一次之總距離在可能途徑中係最小的。當一對結點之間之距離係不對稱時，TSP之不對稱形式確定結點之最佳序列。舉例而言，自結點A旅行至結點B之「距離」可不同於自結點B旅行至結點A之「距離」。
盒設計模組324藉由解決非對稱TSP來確定改良之盒序列，其中每一節點對應於治療性表位 p’k 。對應於表位 p’k 之結點至對應於表位 p’m 之另一結點之距離係藉由接合處表位距離度量d(k,m) 給出，而對應於表位 p’m 之結點至對應於表位 p’k 之結點之距離係藉由可不同於距離度量d(k,m) 之距離度量d(m,k) 給出。藉由使用不對稱TSP解決改良之最佳盒，盒設計模組324可發現減小橫跨盒表位之間之接合處之呈遞分數的盒序列。不對稱TSP之解決方案指示治療性表位之序列，該等治療性表位對應於表位應串聯於盒中之順序以最小化橫跨盒接合處之接合處表位呈遞分數。具體而言，鑒於治療性表位集k=1, 2, …, v ， 盒設計模組324確定盒中之每一對可能有序之治療性表位之距離度量d(k,m) ,k,m = 1, 2, …, v 。換言之，對於表位之給定對k,m ，確定將治療性表位 p’m 串聯在表位 p’k 後之距離度量d(k,m) 及將治療性表位 p’k 串聯在表位 p’m 後之距離度量d(m,k) ，此乃因該等距離度量可彼此不同。
在一個實施例中，盒設計模組324經由整數線性規劃問題解決了不對稱TSP。具體而言，盒設計模組324產生路徑矩陣P ，其藉由下式給出：。v xv 矩陣D 係不對稱距離矩陣，其中每一元素D(k, m ),k=1, 2, …, v; m=1, 2, …, v 對應於自表位 p’k 至表位 p’m 之接合處距離度量。P 之列k = 2, …, v 對應於原始表位之結點，而列1及行1對應於距所有其他結點為0距離之「虛擬結點」。將「虛擬結點」添加至矩陣編碼疫苗盒係線性而非環形之概念，因此在第一表位與最末表位之間不存在接合處。換言之，序列並非環形的，且假設在序列中第一表位並不串聯在最末表位之後。使表示二進制變量，若存在表位 p’k 串聯至表位 p’m 之N端之有向路徑(即在盒中為表位-表位接合處)則其值為1，否則其值為0。另外，使E 表示所有v 個治療性疫苗表位之集合，且使表示表位之子集。對於任一該子集S ，使out(S )表示表位-表位接合處之數量，其中k 係S 中之表位且m 係E\S 中之表位。鑒於已知路徑矩陣P ，盒設計模組324發現解決以下整數線性規劃問題之路徑矩陣X ：其中Pkm 表示路徑矩陣P 之元素P(k,m )，其經歷以下約束：前兩個約束保證每一表位在盒中恰好出現一次。最後一個約束確保盒係連接的。換言之，由x 編碼之盒係經連接之線性蛋白質序列。
等式(27)之整數線性規劃問題中xkm , k,m = 1, 2, …, v+1 之解決方案指示結點及虛擬結點之封閉序列，其可用於推斷降低接合處表位之呈遞分數之盒之治療性表位的一或多個序列。具體而言，xkm = 1之值指示自結點k 至結點m 存在「路徑」，或換言之，在改良之盒序列中治療性表位 p’m 應串聯在治療性表位 p’k 之後。xkm = 0之解決方案指示不存在該路徑，或換言之，在改良之盒序列中治療性表位 p’m 不應串聯在治療性表位 p’k 之後。方程式(27)之整數規劃問題中xkm 之值共同代表節點及虛擬節點之序列，其中路徑恰好進入及退出每一節點一次。舉例而言，x 虛擬,1 =1 、x13 =1 、x32 =1 及x2, 虛擬 =1 (否則為0)之值可指示結點及虛擬結點之序列虛擬→ 1 →3 →2 →虛擬 。
一旦序列得以解決，虛擬結點即自序列缺失以產生僅具有對應於盒中之治療性表位之原始結點之精細化序列。精細化序列指示經選擇表位應串聯於盒中以改良呈遞分數之順序。舉例而言，繼續於先前段落中之實例，可缺失虛擬結點以產生精細化序列1 →3 →2 。精細化序列指示一種可能的將表位串聯於盒中之方式，即 p1 → p3 → p2 。
在一個實施例中，當治療性表位 p’k 係可變長度之表位時，盒設計模組324確定對應於治療性表位 p’k 及 p’m 之不同長度之候選距離度量，且將距離度量d(k,m) 鑑別為最小候選距離度量。舉例而言，表位 p’k =[ nk pk ck ]及 p’m =[ nm pm cm ]可各自包括可自(在一個實施例中) 2-5個胺基酸變化之相應N端及C端側接序列。因此，基於位於接合處中之 nk 之4個可能的長度值及 cm 之4個可能的長度值，表位 p’k 與 p’m 之間之接合處與16個不同的接合處表位集相關。盒設計模組324可確定每一接合處表位集之候選距離度量，且將距離度量d(k,m) 確定為最小值。盒設計模組324隨後可構築路徑矩陣P 且解決等式(27)中之整數線性規劃問題以確定盒序列。
與隨機取樣法相比，使用整數規劃問題解決盒序列需要確定各自對應於疫苗中之一對治療性表之v x (v-1 )距離度量。尤其在所產生候選盒序列之數量較大時，經由此方法確定之盒序列可產生與隨機取樣法相比具有顯著較少之接合處表位呈遞、同時潛在地需要顯著較少之計算資源之序列。XI.B.2. 藉由隨機取樣對不對稱 TSP 產生之盒序列之接合處表位呈遞之比較
藉由對1,000,000個排列隨機取樣(盒序列C1 )及藉由解決等式(27)中之整數線性規劃問題(盒序列C2 )產生兩個包括v =20治療性表位之盒序列。基於等式(14)中所述之呈遞模型確定距離度量及因此呈遞分數，其中f 係S型函數， xh i 係肽 pi 之序列，gh (∙)係神經網路函數，w 包括側接序列、肽 pi 之log每百萬每千鹼基轉錄本(TPM)、肽 pi 之蛋白質之抗原性及肽 pi 起源之樣品ID，且側接序列及log TPM之gw (∙)分別係神經網路函數。gh (∙)之每一神經網路函數包括具有輸入維數231 (11個殘基 × 21個字符/殘基，包括墊入字符)、寬度256、隱藏層中之修正線性單元(ReLU)活化、輸出層中之線性活化之單隱藏層多層感知器(MLP)之一個輸出結點及訓練數據集中每一HLA對偶基因之一個輸出結點。用於側接序列之神經網路函數係單隱藏層MLP，其具有輸入維數210 (N端側接序列之5個殘基 + C端側接序列之5個殘基 × 21個字符/殘基，包括墊入字符)、寬度32、隱藏層中之ReLU活化及輸出層中之線性活化。用於RNA log TPM之神經網路函數係單隱藏層MLP，其具有輸入維數1、寬度16、隱藏層中之ReLU活化及輸出層中之線性活化。構築用於HLA對偶基因HLA-A*02:04、HLA-A*02:07、HLA-B*40:01、HLA-B*40:02、HLA-C*16:02及HLA-C*16:04之呈遞模型。比較指示兩個盒序列之經呈遞接合處表位之預期數量之呈遞分數。結果顯示，藉由解決等式(27)產生之盒序列之呈遞分數與比藉由隨機取樣產生之盒序列之呈遞分數改良約4倍相關。
具體而言，v= 20表位係藉由以下給出： 在第一實例中，使用20個治療性表位隨機產生1,000,000個不同的候選盒序列。產生每一候選盒序列之呈遞分數。經鑑別具有最低呈遞分數之候選盒序列係：其呈遞分數為6.1，即經呈遞接合處表位之預期數量。1,000,000個隨機序列之中值呈遞分數為18.3。實驗顯示，藉由鑑別隨機取樣之盒中之盒序列可顯著減少經呈遞接合處表位之預期數量。
在第二實例中，盒序列C2 係藉由解決等式(27)中之整數線性規劃問題來鑑別。具體而言，確定一對治療性表位之間之每一潛在接合處之距離度量。利用距離度量來解決整數規劃問題之解決方案。藉由此方法鑑別之盒序列係：其呈遞分數為1.7。盒序列C2 之呈遞分數顯示比盒序列C1 之呈遞分數改良約4倍，且比1,000,000個隨機產生之候選盒之中值呈遞分數改良約11倍。在2.30 GHz Intel Xeon E5-2650 CPU之單引線上用於產生盒C1 之運行時間為20秒。在同一CPU之單引線上用於產生盒C2 之運行時間為1秒。因此在此實例中，藉由解決等式(27)之整數規劃問題鑑別之盒序列在降低20倍之計算成本下產生約4倍較佳之解決方案。
結果顯示，整數規劃問題可潛在地提供經呈遞接合處表位之數量低於自隨機取樣鑑別之數量、潛在地使用較少計算資源的盒序列。XI.B.3. 藉由 MHCflurry 及呈遞模型產生之盒序列選擇之接合處表位呈遞之比較
在此實例中，基於肺癌樣品之腫瘤/正常外顯子體測序、腫瘤轉錄體測序及HLA分型選擇包括v =20治療性表位之盒序列，其係藉由對1,000,000個排列隨機取樣及藉由解決等式(27)中之整數線性規劃問題產生。基於藉由MHCflurry預測之接合處表位之數量(HLA-肽結合親和力預測子)確定距離度量及因此呈遞分數，以低於多個臨限值之親和力(例如50-1000nM或更高或更低)結合患者之HLA。在此實例中，選擇作為治療性表位之20種非同義體細胞突變選自98種體細胞突變，該等突變係在腫瘤樣品中藉由根據上文部分XI.B中之呈遞模型對突變分級來鑑別。然而，應瞭解，在其他實施例中，治療性表位可基於其他準則來選擇；例如基於穩定性之準則或諸如呈遞分數、親和力等準則之組合。另外，應瞭解，用於對治療性表位進行優先級排序以納入疫苗中之準則無需與用於確定盒設計模組324中所用之距離度量D(k, m )之準則相同。
患者之I類HLA對偶基因係HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-B*07:02、HLA-B*35:03、HLA-C*07:02、HLA-C*14:02。
具體而言，在此實例中，v=20治療性表位係
下表中此實例之結果比較藉由MHCflurry預測以低於臨限值行(其中nM代表奈莫耳濃度)中之值之親和力結合患者之HLA的接合處表位之數量，如經由三種實例性方法所發現。對於第一種方法，經由上文所述之旅行銷售員問題(ATSP)公式化以1s運行時間發現最佳盒。對於第二種方法，藉由獲取在1百萬個隨機樣品後發現之最佳盒確定最優盒。對於第三種方法，在1百萬個隨機樣品中發現接合處表位之中值數量。
此實例之結果說明，可使用多種準則中之任一者來鑑別給定盒設計是否滿足設計要求。具體而言，如藉由先前實例所展示，在許多候選者中選擇出之盒序列可藉由具有最低接合處表位呈遞分數或至少低於經鑑別臨限值之該分數之盒序列來指定。此實例表示可使用另一準則(例如結合親和力)來指定給定盒設計是否滿足設計要求。對於此準則，可設定臨限值結合親和力(例如50-1000或更高或更低)，指定盒設計序列應具有少於高於臨限值(例如0)之接合處表位之一定臨限值數量，且可使用多種方法中之任一者(例如表中所說明之方法1至3)來鑑別給定候選盒序列是否滿足彼等要求。該等實例性方法進一步說明，端視所用方法，可需要以不同方式設定臨限值。可設想其他準則，例如基於穩定性之準則或諸如呈遞分數、親和力等準則之組合。
在另一實例中，相同的盒係使用相同的HLA類型及此部分(XI.C)前面之20個治療性表位、而非使用基於結合親和力預測之距離度量來產生，表位m、k之距離度量係經預測由患者之I類HLA對偶基因呈遞且呈遞機率高於一系列臨限值(機率介於0.005與0.5之間或更高或更低)之跨越m至k接合處之肽之數量，其中呈遞機率係藉由上文部分XI.B中之呈遞模型確定。此實例進一步說明可在鑑別給定候選盒序列是否滿足疫苗所用之設計要求中考慮之準則之寬度。
上述實例已鑑別出，用於確定是否可根據實施改變候選盒序列之準則。該等實例中之每一者已說明，高於或低於準則之接合處表位之數量之計數可為用於確定候選盒序列是否滿足該準則之計數。舉例而言，若準則係表位之數量滿足或超過HLA之臨限值結合親和力，則候選盒序列具有多於或少於該數量可確定候選盒序列是否滿足用作疫苗之所選盒之準則。此在準則係接合處表位之數量超過臨限值呈遞似然度時類似。
然而，在其他實施例中，可實施計算而非計數來確定候選盒序列是否滿足設計準則。舉例而言，可確定超過或低於臨限值之接合處表位之比例而非對超過/低於一定臨限值之表位計數，例如前X%之接合處表位是否具有高於一定臨限值Y之呈遞似然度，或X%之接合處表位是否具有小於或大於Z nM之HLA結合親和力。該等僅為實例，準則通常可基於個別接合處表位或自一些或所有接合處表位之聚集導出之統計學之任一屬性。在此處，X通常可為介於0與100%之間之任一數值(例如75%或更小)且Y可為介於0與1之間之任一值，且Z可為適用於所討論準則之任一數值。該等值可憑經驗確定，且端視所用模型及準則以及所用訓練數據之數量而定。
因此，在某些態樣中，可去除具有高呈遞機率之接合處表位；可保留具有低呈遞機率之接合處表位；可去除緊密結合之接合處表位，即結合親和力低於1000nM或500nM或一定其他臨限值之接合處表位；及/或可保留弱結合之接合處表位，即結合親和力高於1000nM或500nM或一定其他臨限值之接合處表位。
儘管上述實例已使用上文所述呈遞模型之實施鑑別出候選序列，但該等原理同樣適用於亦基於其他類型之模型(例如基於親和力、穩定性等之彼等)鑑別盒序列中之排列之表位之實施。XII. 實例 7 ：顯示實例性呈遞模型性能之實驗結果
針對測試數據T 測試上述各個呈遞模型之有效性，測試數據T 係訓練數據170之未用於訓練呈遞模型之子集或來自訓練數據170之具有與訓練數據170相似之變量及數據結構的單獨數據集。
呈遞模型性能之相關度量指示係： 陽性預測值(PPV) =其指示經正確預測以呈遞於相關HLA對偶基因上之肽實例數對經預測以呈遞於HLA對偶基因上之肽實例數的比率。在一個實施中，若相應似然度估計ui 大於或等於給定臨限值t ，則測試數據T 中之肽 pi 經預測以呈遞於一或多個相關HLA對偶基因上。呈遞模型性能之另一相關度量指示係： 重新叫用=其指示經正確預測以呈遞於相關HLA對偶基因上之肽實例數對已知呈遞於HLA對偶基因上之肽實例數的比率。呈遞模型性能之另一相關度量指示係接收者操作特徵(ROC)之曲線下面積(AUC)。ROC繪製重新叫用對偽陽性率(FPR)，其係藉由下式給出：.XII.A. 針對質譜數據之呈遞模型性能與現有技術模型之比較
圖13A比較如本文所呈現實例性呈遞模型與用於預測針對多對偶基因質譜數據之肽呈遞之現有技術模型的性能結果。結果顯示，實例性呈遞模型在預測肽呈遞方面之性能顯著優於基於親和力及穩定性預測之現有技術模型。
具體而言，利用仿射依賴性函數gh (∙)及expit函數f (∙)，在圖13A中顯示為「MS」之實例性呈遞模型係等式(12)中所示每一對偶基因呈遞模型之最大值。實例性呈遞模型係基於來自IEDB數據集(數據集「D1」)之單一對偶基因HLA-A*02:01質譜數據(數據可參見http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zip)的子集及來自IEDB數據集(數據集「D2」)之單一對偶基因HLA-B*07:02質譜(數據可參見http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zip)的子集來訓練。自訓練數據消除來自含有測試集中之經呈遞肽之源蛋白之所有肽，使得實例性呈遞模型可不僅僅記憶經呈遞抗原之序列。
在圖13A中顯示為「親和力」之模型係類似於基於親和力預測NETMHCpan預測肽呈遞之當前現有技術模型的模型。NETMHCpan之實施詳細提供於http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/ 上。在圖13A中顯示為「穩定性」之模型係類似於基於穩定性預測NETMHCstab預測肽呈遞之當前現有技術模型的模型。NETMHCstab之實施詳細提供於http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCstab-1.0/ 上。測試數據係來自Bassani-Sternberg數據集(數據集「D3」)之多對偶基因JY細胞系HLA-A*02:01及HLA-B*07:02質譜數據(數據可參見www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD000394) 之子集。誤差槓(如以實線指示)顯示95%信賴區間。
如圖13A之結果中所示，相對於基於MHC結合親和力預測或MHC結合穩定性預測來預測肽呈遞之現有技術模型，對質譜數據進行訓練之實例性呈遞模型在10%重新叫用率下具有顯著較高之PPV值。具體而言，實例性呈遞模型具有比基於親和力預測之模型高約14%之PPV，且具有比基於穩定性預測之模型高約12%之PPV。
該等結果展示，即使實例性呈遞模型未基於含有經呈遞肽之蛋白質序列進行訓練，實例性呈遞模型仍具有顯著優於基於MHC結合親和力或MHC結合穩定性預測來預測肽呈遞之現有技術模型的性能。XII.B. 針對 T 細胞表位數據之呈遞模型性能與現有技術模型之比較
圖13B比較如本文所呈現之另一實例性呈遞模型與用於預測針對T細胞表位數據之肽呈遞之現有技術模型的性能結果。T細胞表位數據含有由細胞表面上之MHC對偶基因呈遞且由T細胞識別之肽序列。結果顯示，即使實例性呈遞模型係基於質譜數據來訓練，實例性呈遞模型在預測T細胞表位方面之性能仍顯著優於基於親和力及穩定性預測之現有技術模型。換言之，圖13B之結果指示，不僅實例性呈遞模型在預測針對質譜測試數據之肽呈遞方面之性能優於現有技術模型，且實例性呈遞模型在預測實際上由T細胞識別之表位方面之性能亦顯著優於現有技術模型。此指示如本文所呈現之多種呈遞模型可提供可能誘導免疫系統中之免疫原性反應之抗原的經改良鑑別。
具體而言，利用仿射轉換函數gh (∙)及expit函數f (∙)，在圖13B中顯示為「MS」之實例性呈遞模型係等式(2)中所示之基於數據集D1之子集訓練之每一對偶基因呈遞模型。自訓練數據消除來自含有測試集中之經呈遞肽之源蛋白之所有肽，使得呈遞模型可不僅僅記憶經呈遞抗原之序列。
將每一模型應用於測試數據，其為HLA-A*02:01 T細胞表位數據(數據集「D4」)上之質譜數據(數據可參見www.iedb.org/doc/tcell full v3.zip)之子集。在圖13B中顯示為「親和力」之模型係類似於基於親和力預測NETMHCpan預測肽呈遞之當前現有技術模型之模型，且在圖13B中顯示為「穩定性」之模型係類似於基於穩定性預測NETMHCstab預測肽呈遞之當前現有技術模型之模型。誤差槓(如以實線指示)顯示95%信賴區間。
如圖13A之結果中所示，即使呈遞模型未基於含有經呈遞肽之蛋白質序列進行訓練，對質譜數據進行訓練之每一對偶基因呈遞模型在10%重新叫用率下仍具有顯著高於基於MHC結合親和力或MHC結合穩定性預測預測肽呈遞之現有技術模型的PPV值。具體而言，每一對偶基因呈遞模型具有比基於親和力預測之模型高約9%之PPV，且具有比基於穩定性預測之模型高約8%之PPV。
該等結果展示，對質譜數據進行訓練之實例性呈遞模型在預測由T細胞識別之表位方面之性能顯著優於現有技術模型。XII.C. 針對質譜數據之不同呈遞模型性能之比較
圖13C比較實例性相加函數模型(等式(13))、實例性函數相加模型(等式(19))及實例性二階模型(等式(23))在預測針對多對偶基因質譜數據之肽呈遞方面的性能結果。結果顯示函數相加模型及二階模型之性能優於相加函數模型。此乃因相加函數模型暗示當實際上肽之呈遞係有效地獨立時，多對偶基因環境中之對偶基因可彼此干擾肽呈遞。
具體而言，在圖13C中標記為「相加S型(sigmoid-of-sums)」之實例性呈遞模型係利用網路依賴性函數gh (∙)、恒等函數f (∙)及expit函數r (∙)之相加函數模型。標記為「S型相加(sum-of-sigmoids)」之實例性模型係等式(19)中利用網路依賴性函數gh (∙)、expit函數f (∙)及恒等函數r (∙)之函數相加模型。標記為「雙曲正切」之實例性模型係等式(19)中利用網路依賴性函數gh (∙)、expit函數f (∙)及雙曲正切函數r (∙)之函數相加模型。標記為「二階」之實例性模型係等式(23)中利用等式(18)中所示利用網路依賴性函數gh (∙)及expit函數f (∙)之內含每一對偶基因呈遞似然度形式之二階模型。每一模型係基於數據集D1、D2及D3之子集來訓練。將實例性呈遞模型應用於測試數據，其為數據集D3之不與訓練數據重疊之隨機子集。
如圖13C中所示，第一欄係指將每一呈遞模型應用於測試集時ROC之AUC，第二欄係指負對數似然度損失之值，且第三欄係指10%重新叫用率下之PPV。如圖13C中所示，在10%重新叫用下，呈遞模型「S型相加」、「雙曲正切」及「二階」之性能大致等於約15%-16% PPV，而模型「相加S型」之性能稍低於約11%。
如先前部分X.C.4.中所論述，結果顯示，呈遞模型「S型相加」、「雙曲正切」及「二階」具有與「相加S型」模型相比較高之PPV值，此乃因該等模型正確地解釋肽係如何獨立地經多對偶基因環境中之每一MHC對偶基因呈遞。XII.D. 對單一對偶基因質譜數據進行訓練或不訓練之呈遞模型性能之比較
圖13D比較使用或不使用單一對偶基因質譜數據進行訓練之兩種實例性呈遞模型在預測多對偶基因質譜數據之肽呈遞方面的性能結果。結果指示，不使用單一對偶基因數據進行訓練之實例性呈遞模型達成與使用單一對偶基因數據進行訓練之實例性呈遞模型相當之性能。
「使用A2/B7單一對偶基因數據」之實例性模型係等式(19)中利用網路依賴性函數gh (∙)、expit函數f (∙)及恒等函數r (∙)之「S型相加」呈遞模型。該模型係基於數據集D3之子集及來自IEDB數據庫之多個MHC對偶基因之單一對偶基因質譜數據(數據可參見：http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zip)進行訓練。「不使用A2/B7單一對偶基因數據」之實例性模型係相同模型，但基於不含對偶基因HLA-A*02:01及HLA-B*07:02之單一對偶基因質譜數據、但含有其他對偶基因之單一對偶基因質譜數據的多對偶基因D3數據集之子集進行訓練。在多對偶基因訓練數據內，細胞系HCC1937表現HLA-B*07:02但不表現HLA-A*02:01，且細胞系HCT116表現HLA-A*02:01但不表現HLA-B*07:02。將實例性呈遞模型應用於測試數據，其係數據集D3之隨機子集且不與訓練數據重疊。
如圖13D中所示，基於MHC對偶基因HLA-A*02:01之內含每一對偶基因呈遞似然度的預測之性能顯著優於基於MHC對偶基因HLA-A*02:01而非MHC對偶基因HLA-B*07:02之單一對偶基因測試數據的預測。對MHC對偶基因HLA-B*07:02顯示類似結果。
該等結果指示，即使在訓練數據中未知肽與每一個別MHC對偶基因之間之直接相關，呈遞模型之內含每一對偶基因呈遞似然度仍可正確地預測並區分結合至個別MHC對偶基因之基序。XII.E. 不對單一對偶基因質譜數據進行訓練之每一對偶基因預測性能之比較
圖13E顯示圖13D中所示之「不使用A2/B7單一對偶基因數據」及「使用A2/B7單一對偶基因數據」之實例性模型對於圖13D中所示之分析中提供之對偶基因HLA-A*02:01及HLA-B*07:02之單一對偶基因質譜數據之性能。結果指示，即使實例性呈遞模型不使用該兩個對偶基因之單一對偶基因質譜數據進行訓練，該模型仍能夠學習每一MHC對偶基因之結合基序。
欄「關聯性」係指在測試數據中指示肽是否呈遞於相應對偶基因上之實際標記與預測標記之間的關聯性。如圖13E中所示，「A2模型預測B7」指示當基於MHC對偶基因HLA-A*02:01之內含每一對偶基因呈遞似然度估計針對單一對偶基因HLA-B*07:02數據預測肽呈遞時模型之性能。類似地，「A2模型預測A2」指示當基於MHC對偶基因HLA-A*02:01之內含每一對偶基因呈遞似然度估計針對單一對偶基因HLA-A*02:01預測肽呈遞時模型之性能。「B7模型預測B7」指示當基於MHC對偶基因HLA-B*07:02之內含每一對偶基因呈遞似然度估計針對單一對偶基因HLA-B*07:02數據預測肽呈遞時模型之性能。「B7模型預測A2」指示當基於MHC對偶基因HLA-B*07:02之內含每一對偶基因呈遞似然度估計針對單一對偶基因HLA-A*02:01預測肽呈遞時模型之性能。
如圖13E中所示，HLA對偶基因之內含每一對偶基因似然度對預期對偶基因之預測能力顯著較高，且對另一HLA對偶基因之預測能力顯著較低。與圖13D中所示之結果類似，實例性呈遞模型正確地學習區別個別對偶基因HLA-A*02:01及HLA-B*07:02之肽呈遞，即使在多對偶基因訓練數據中不存在肽呈遞與該等對偶基因之間之直接相關。XII.F. 在每一對偶基因預測中頻繁出現之錨定殘基匹配已知典型錨定基序
圖13F顯示由圖13D中所示之「不使用A2/B7單一對偶基因數據」之實例性模型預測之九聚物中之位置2及9的常見錨定殘基。該等肽經預測以在所估計似然度大於5%時被呈遞。結果顯示，經鑑別以呈遞於MHC對偶基因HLA-A*02:01及HLA-B*07:02上之肽中之大多數常見錨定殘基匹配先前已知之該等MHC對偶基因之錨定基序。此指示實例性呈遞模型基於肽序列之胺基酸之特定位置正確地學習肽結合，如所預期。
如圖13F中所示，已知位置2之胺基酸L/M及位置9之胺基酸V/L係HLA-A*02:01之典型錨定殘基基序(如https://link.springer.com/article/10.1186/1745-7580-4-2 之表4中所示)，且已知位置2之胺基酸P及位置9之胺基酸L/V係HLA-B*07:02之典型錨定殘基基序。該模型所鑑別之肽之位置2及9之最常見錨定殘基基序匹配兩個HLA對偶基因之已知典型錨定殘基基序。XII.G. 具及不具對偶基因非相互作用變量之呈遞模型性能之比較
圖13G比較納入C端及N端側接序列作為對偶基因相互作用變量之實例性呈遞模型與納入C端及N端側接序列作為對偶基因非相互作用變量之實例性呈遞模型之間的性能結果。結果顯示納入C端及N端側接序列作為對偶基因非相互作用變量顯著改良模型性能。更具體而言，頗具價值的是，鑑別為不同MHC對偶基因共用之適於肽呈遞之特徵，且對其建模使得該等對偶基因非相互作用變量之統計強度在不同MHC對偶基因之間共用以改良呈遞模型性能。
實例性「對偶基因相互作用」模型係利用網路依賴性函數gh (∙)及expit函數f (∙)納入C端及N端側接序列作為對偶基因相互作用變量之等式(22)中之內含每一對偶基因呈遞似然度形式之函數相加模型。實例性「對偶基因-非相互作用」模型係等式(21)中所示之利用網路依賴性函數gh (∙)及expit函數f (∙)納入C端及N端側接序列作為對偶基因非相互作用變量之函數相加模型。經由單獨網路依賴性函數gw (∙)對對偶基因非相互作用變量建模。兩種模型皆係針對數據集D3之子集及來自IEDB數據庫之多個MHC對偶基因之單一對偶基因質譜數據(數據可參見：http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zip)進行訓練。將每一呈遞模型應用於測試數據集，其係數據集D3之不與訓練數據重疊之隨機子集。
如圖13G中所示，將C端及N端側接序列納入實例性呈遞模型中作為對偶基因非相互作用變量相對於將其建模為對偶基因相互作用變量達成約3%之PPV值改良。一般而言，此乃因「對偶基因非相互作用」實例性呈遞模型能夠藉由利用單獨網路依賴性函數及計算能力之極小增加對效應建模來共用不同MHC對偶基因之對偶基因非相互作用變量之統計強度。XII.H. 經呈遞肽與 mRNA 量化之間之依賴性
圖13H圖解說明基於腫瘤細胞之質譜數據之mRNA量化的基因之經呈遞肽之分數之間的依賴性。結果顯示在mRNA表現與肽呈遞之間存在強依賴性。
具體而言，圖13G中之水平軸指示以每百萬轉錄本(TPM)四分位數表示之mRNA表現。圖13G中之垂直軸指示以相應mRNA表現四分位數表示之來自基因之經呈遞表位之分數。每一實線係關於腫瘤樣品之與相應質譜數據及mRNA表現量測相關之兩個量測的曲線。如圖13G中所示，在mRNA表現與相應基因中之肽分數之間存在強正相關。具體而言，RNA表現之最高四分位數之基因之肽被呈遞之可能性比最低四分位數大20倍。此外，自經由RNA未檢測到之基因呈遞基本上0個肽。
結果指示，藉由納入mRNA量化量測可極大地改良呈遞模型之性能，此乃因該等量測強烈地預測肽呈遞。XII.I. 納入 RNA 量化數據之呈遞模型性能之比較
圖13I顯示兩種實例性呈遞模型之性能，其中之一者係基於質譜腫瘤細胞數據進行訓練，其中之另一者納入mRNA量化數據及質譜腫瘤細胞數據。如根據圖13H所預期，結果指示藉由將mRNA量化量測納入實例性呈遞模型中可顯著改良性能，此乃因mRNA表現係肽呈遞之強指示劑。
「MHCflurry + RNA過濾器」係類似於基於親和力預測預測肽呈遞之當前現有技術模型之模型。其係利用MHCflurry以及自蛋白質移除mRNA量化量測小於3.2 FPKM之所有肽之標準基因表現過濾器來實施。MHCflurry之實施詳細提供於https://github.com/hammerlab/mhcflurry/ 及http://biorxiv.org/content/early/2016/05/22/054775上。「實例性模型，無RNA」模型係等式(21)中所示利用網路依賴性函數gh (∙)、網路依賴性函數gw (∙)及expit函數f (∙)之「S型相加」實例性呈遞模型。「實例性模型，無RNA」模型經由網路依賴性函數gw (∙)納入C端側接序列作為對偶基因非相互作用變量。
「實例性模型，具RNA」模型係等式(19)中所示利用網路依賴性函數gh (∙)、等式(10)中經由對數函數納入mRNA量化數據之網路依賴性函數gw (∙)及expit函數f (∙)的「S型相加」呈遞模型。「實例性模型，具RNA」模型經由網路依賴性函數gw (∙)納入C端側接序列作為對偶基因非相互作用變量且經由對數函數納入mRNA量化量測。
每一模型係針對來自IEDB數據集之單一對偶基因質譜數據、來自Bassani-Sternberg數據集之多對偶基因質譜數據之7種細胞系及20個質譜腫瘤樣品的組合進行訓練。將每一模型應用於包括來自7個腫瘤樣品之5,000個保留蛋白質之測試集，該等蛋白質構成總共52,156,840個肽中之9,830個經呈遞肽。
如圖13I之前兩個條形圖中所示，「實例性模型，無RNA」模型在20%重呼叫下具有21%之PPV值，而現有技術模型之PPV值為約3%。此指示甚至在不納入mRNA量化量測下PPV值之18%之初始性能改良。如圖13I之第三個條形圖中所示，將mRNA量化數據納入呈遞模型中之「實例性模型，具RNA」模型顯示約30%之PPV值，其性能與不具mRNA量化量測之實例性呈遞模型相比幾乎增加10%。
因此，結果指示，如根據圖13H中之發現所預期，mRNA表現實際上係肽預測之強預測子，其允許顯著改良呈遞模型之性能且極少增加計算複雜性。XII.J. 對 MHC 對偶基因 HLA-C*16:04 測定之參數之實例
圖13J比較由參考圖13I所述之「實例性模型，具RNA」呈遞模型產生的結果與由在預測肽呈遞時未將肽長度考慮在內之現有技術模型預測的結果之間之對不同肽長度之肽呈遞之機率。結果指示，圖13I之「實例性模型，具RNA」實例性呈遞模型捕獲不同長度之肽之似然度變化。
水平軸表示具有長度8、9、10及11之肽之樣品。垂直軸表示針對肽長度條件化之肽呈遞機率。曲線「真(盲性測試數據)」顯示根據測試數據集中樣品之肽長度之經呈遞肽之比例。呈遞似然度隨肽長度而變化。舉例而言，如圖13J中所示，具有典型HLA-A2 L/V錨定基序之10聚體肽被呈遞之可能性比具有相同錨定殘基之9聚體小約3倍。曲線「忽略長度之模型」指示欲將忽略肽長度之現有技術模型應用於相同測試數據集用於呈遞預測時之經預測量測。該等模型可為4.0版前之NetMHC版、3.0版前之NetMHCpan版及未將肽呈遞隨肽長度之變化考慮在內之MHCflurry。如圖13J中所示，經呈遞肽之比例在不同肽長度值之間將恆定，此指示該等模型將無法捕獲肽呈遞隨長度之變化。曲線「實例性模型，具RNA」指示自「實例性模型，具RNA」呈遞模型產生之量測值。如圖13J中所示，由「實例性模型，具RNA」模型產生之量測值緊密地遵循「真(盲性測試數據)」中所示之彼等且正確地解釋針對長度8、9、10及11之不同肽呈遞程度。
因此，結果顯示，如本文所呈現之實例性呈遞模型不僅針對9聚體肽、且亦針對介於8-15之間之其他長度之肽產生經改良之預測，此佔據I類HLA對偶基因中經呈遞肽之高達40%。XII.K. 對 MHC 對偶基因 HLA-C*16:04 測定之參數之實例
下文顯示對由h 表示之MHC對偶基因HLA-C*16:04之每一對偶基因呈遞模型(等式(2))之變化測定的參數集：其中relu(∙)係修正線性單元(RELU)函數，且 Wh 1 、 bh 1 、 Wh 2 及bh 2 係對該模型測定之參數集 θ 。對偶基因相互作用變量 xh k 係由肽序列組成。 Wh 1 之維度係(231 × 256)， bh 1 之維度係(1 × 256)， Wh 2 之維度係(256 × 1)，且 bh 2 係純量。出於展示之目的， bh 1 、bh 2 、 Wh 1 及 Wh 2 之值詳細闡述於PCT公開案WO2017106638中，其所教示之全文皆以引用方式併入本文中。XII.L. MHC II 實例 1
用於確定II類MHC新抗原之方法更詳細闡述於國際申請案PCT/US2018/028438中，其所教示之全文皆以引用方式併入本文中。
圖13K係利用質譜自人類腫瘤細胞及腫瘤浸潤淋巴球(TIL)上之II類MHC對偶基因溶析之肽之長度的直方圖。具體而言，對HLA-DRB1*12:01同型合子對偶基因(「數據集1」)及HLA-DRB1*12:01、HLA-DRB1*10:01多對偶基因樣品(「數據集2」)實施質譜肽體學。結果顯示，自II類MHC對偶基因溶析之肽之長度介於6-30個胺基酸範圍內。圖13K中所顯示之頻率分佈類似於使用如參考文獻91之圖1C中所顯示之現有技術質譜技術自II類MHC對偶基因溶析之肽之長度的頻率分佈。
圖13L圖解說明數據集1及數據集2之mRNA量化與每一殘基之呈遞肽之間之依賴性。結果顯示，II類MHC對偶基因之mRNA表現與肽呈遞之間存在強依賴性。
具體而言，圖13B中之水平軸指示mRNA表現，以log10 每百萬轉錄本(TPM)倉表示。圖13L中之垂直軸指示呈對應於10-2 ＜ log10 TPM ＜ 10-1 之間之mRNA表現之最低倉之倍數的每一殘基之肽呈遞。一個實線係關於數據集1之mRNA量化及肽呈遞之曲線，且另一實線係關於數據集2。如圖13L中所顯示相應基因之mRNA表現與每一殘基之肽呈遞之間存在強正相關。具體而言，來自RNA表現在101 ＜ log10 TPM ＜ 102 範圍內之基因之肽呈遞之可能性比底倉大5倍。
結果指示，藉由納入mRNA量化量測值可極大地改良呈遞模型之性能，此乃因該等量測值強烈地預測肽呈遞。
圖13M比較例如使用數據集1及數據集2訓練及測試之呈遞模型之性能結果。對於實例性呈遞模型之每一模型特徵集，圖13M繪示在模型特徵集中之特徵分類為對偶基因相互作用特徵時及或者在模型特徵集中之特徵分類為對偶基因非相互作用特徵變量時10%重新叫用下之PPV值。如圖13M中可見，對於實例性呈遞模型之每一模型特徵集，在模型特徵集中之特徵分類為對偶基因相互作用特徵時鑑別之10%重新叫用下之PPV值顯示於左側，且在模型特徵集中之特徵分類為對偶基因非相互作用特徵時鑑別之10%重新叫用下之PPV值顯示於右側。注意，出於圖13M之目的，肽序列之特徵始終分類為對偶基因相互作用特徵。結果顯示，呈遞模型在10%重新叫用下達成自14%至29%變化之PPV值，其顯著高於(約500倍)隨機預測之PPV。
長度為9-20之肽序列考慮用於此實驗。將數據劃分成訓練集、驗證集及測試集。將數據集1及數據集2二者之50個殘基塊之肽塊分配至訓練集及測試集。去除蛋白質體中任一處重複之肽，確保在訓練集及測試集二者中不出現肽序列。訓練集及測試集中肽呈遞之普遍性因去除未經呈遞之肽增加50倍。此乃因數據集1及數據集2係來自人類腫瘤樣品，其中僅一部分細胞為II類HLA對偶基因，使得肽產量比II類HLA對偶基因之純樣品中低約10倍，其仍因不完美質譜靈敏度而低估。訓練集含有1,064個經呈遞肽及3,810,070個未經呈遞肽。測試集含有314個經呈遞肽及807,400個未經呈遞肽。
實例性模型1係等式(22)中使用網路依賴性函數g h (∙)、expit函數f(∙)及恒等函數r(∙)之函數相加模型。網路依賴性函數g h (∙)結構化為具有256個隱藏結點及修正線性單元(ReLU)活化之多層感知器(MLP)。除肽序列外，偶基因相互作用變量 w 含有獨熱編碼之C端及N端側接序列、指示肽 pi 之源基因指數G =基因( pi )之類別變量及指示mRNA量化量測之變量。實例性模型2與實例性模型1一致，只是自對偶基因相互作用變量省略C端及N端側接序列。實例性模型3與實例性模型1一致，只是自對偶基因相互作用變量省略源基因之指數。實例性模型4與實例性模型1一致，只是自對偶基因相互作用變量省略mRNA量化量測值。
實例性模型5係使用等式(12)之網路依賴性函數gh (∙)、expit函數f(∙)、恒等函數r(∙)及依賴性函數gw (∙)之等式(20)中之函數相加模型。依賴性函數gw (∙)亦包括採用mRNA量化量測值作為輸入、結構化為具有16個隱藏結點及ReLU活化之MLP的網路模型，及採用C-側接序列作為輸入、結構化為具有32個隱藏結點及ReLU活化之MLP的網路模型。網路依賴性函數g h (∙)結構化為具有256個隱藏結點及修正線性單元(ReLU)活化之多層感知器。實例性模型6與實例性模型5一致，只是省略網路模型之C端及N端側接序列。實例性模型7與實例性模型5一致，只是自對偶基因非相互作用變量省略源基因之指數。實例性模型8與實例性模型5一致，只是省略網路模型之mRNA量化量測值。
測試集中經呈遞肽之普遍性為約1/2400，且因此隨機預測之PPV亦將為約1/2400 = 0.00042。如圖13M中所顯示，最優實施呈遞模型達成約29%之PPV值，其比隨機預測之PPV值優約500倍。XII.M. MHC II 實例 2
圖13N係繪示利用質譜對包含II類HLA分子之總共39個樣品中之每一樣品測序之肽量的直方圖。此外，對於複數個樣品中之每一樣品，圖13N中所顯示之直方圖繪示利用質譜在不同之q值臨限值下測序之肽量。具體而言，對於複數個樣品中之每一樣品，圖13N繪示利用q值小於0.01、q值小於0.05及q值小於0.2之質譜測序之肽量。
如上所述，圖13N之39個樣品中之每一樣品包含II類HLA分子。更特定而言，圖13N之39個樣品中之每一樣品包含HLA-DR分子。HLA-DR分子係一類II類HLA分子。甚至更具體而言，圖13N之39個樣品中之每一樣品包含HLA-DRB1分子、HLA-DRB3分子、HLA-DRB4分子及/或HLA-DRB5分子。HLA-DRB1分子、HLA-DRB3分子、HLA-DRB4分子及HLA-DRB5分子係HLA-DR分子類型。
儘管此具體實驗係使用包含HLA-DR分子及尤其HLA-DRB1分子、HLA-DRB3分子、HLA-DRB4分子及HLA-DRB5分子之樣品實施，但在替代實施例中，此實驗可使用包含任何類型之II類HLA分子中之一或多者之樣品實施。舉例而言，在替代實施例中，可使用包含HLA-DP及/或HLA-DQ分子之樣品實施相同實驗。此使用相同技術對任何類型之II類MHC分子建模且仍達成可靠結果之能力為熟習此項技術者所熟知。例如，Jensen、Kamilla Kjaergaard等人76 係使用相同方法對HLA-DR分子以及HLA-DQ及HLA-DP分子之結合親和力建模之最新科學論文之一個實例。因此，熟習此項技術者將理解，本文所述之實驗及模型不僅可用於單獨或同時對HLA-DR分子建模，且亦可用於對任何其他II類MHC分子建模，同時仍產生可靠結果。
為對總共39個樣品中之每一樣品之肽進行測序，對每一樣品實施質譜。然後利用Comet檢索樣品之所得質譜且利用Percolator進行分數以對肽進行測序。然後，針對複數個不同Percolator q值臨限值鑑別樣品中經測序之肽量。具體而言，對於樣品，確定在Percolator q值小於0.01、Percolator q值小於0.05及Percolator q值小於0.2下測序之肽量。
對於39個樣品中之每一樣品，在每一不同Percolator q值臨限值下測序之肽量繪示於圖13N中。舉例而言，如圖13N中可見，對於第一樣品，利用質譜在q值小於0.2下對約4000個肽進行測序，利用質譜在q值小於0.05下對約2800個肽進行測序，且利用質譜在q值小於0.01下對約2300個肽進行測序。
總之，圖13N展示利用質譜在低q值下對含有II類MHC分子之樣品之大量肽進行測序之能力。換言之，圖13N中所繪示之數據展示利用質譜可靠地對可由II類MHC分子呈遞之肽進行測序之能力。
圖13O係繪示其中特定II類MHC分子對偶基因經鑑別之樣品之量的直方圖。更特定而言，對於總共39個包含II類HLA分子之樣品，圖13O繪示其中某些II類MHC分子對偶基因經鑑別之樣品之量。
如上文針對圖13N所論述，圖13N之39個樣品中之每一樣品包含HLA-DRB1分子、HLA-DRB3分子、HLA-DRB4分子及/或HLA-DRB5分子。因此，圖13O繪示其中HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4及HLA-DRB5分子之某些對偶基因經鑑別之樣品之量。為鑑別存在於樣品中之HLA對偶基因，對樣品實施II類HLA DR分型。然後，為鑑別其中特定HLA對偶基因經鑑別之樣品之量，簡單地匯總其中使用II類HLA DR分型鑑別HLA對偶基因之樣品之數量。舉例而言，如圖13O中所繪示，總共39個樣品中之19個樣品含有II類HLA分子對偶基因HLA-DRB4*01:03。換言之，總共39個樣品中之19個樣品含有HLA-DRB4分子之對偶基因HLA-DRB4*01:03。總之，圖13O繪示自39個包含II類HLA分子之樣品鑑別寬範圍之II類HLA分子對偶基因之能力。
圖13P係繪示對於一系列肽長度之每一肽長度，總共39個樣品中由II類MHC分子呈遞之肽之比例的直方圖。為確定總共39個樣品之每一樣品中每一肽之長度，如上文針對圖13N所論述利用質譜對每一肽進行測序，且然後簡單地量化經測序肽中殘基之數量。
如上所述，II類MHC分子通常呈遞長度介於9-20個胺基酸之間之肽。因此，圖13P繪示對於介於9-20個胺基酸之間且包括9及20個之每一肽長度，39個樣品中由II類MHC分子呈遞之肽之比例。舉例而言，如圖13P中所顯示，39個樣品中約22%之由II類MHC分子呈遞之肽包含14個胺基酸之長度。
基於圖13P中所繪示之數據，39個樣品中由II類MHC分子呈遞之肽之模態長度經鑑別長度為14及15個胺基酸。對39個樣品中由II類MHC分子呈遞之肽鑑別之該等模態長度與由II類MHC分子呈遞之肽之模態長度的先前報導一致。另外，如亦與先前報導一致，圖13P之數據指示，39個樣品中大於60%之由II類MHC分子呈遞之肽包含除14及15個胺基酸外之長度。換言之，圖13P指示，儘管由II類MHC分子呈遞之肽之長度最通常為14或15個胺基酸，但大比例之由II類MHC分子呈遞之肽之長度不為14或15個胺基酸。因此，其係一個不好的假設，假設所有長度之肽具有相等的由II類MHC分子呈遞之機率，或僅包含14或15個胺基酸長度之肽由II類MHC分子呈遞。如下文針對圖13T所詳細論述，該等錯誤假設目前用於許多用於預測藉由II類MHC分子之肽呈遞之現有技術模型中，且因此藉由該等模型預測之呈遞似然度通常並不可靠。
圖13Q係繪示對於存在於39個樣品中之基因，基因表現與II類MHC分子對基因表現產物之呈遞普遍性之間的關係之線圖。更特定而言，圖13Q繪示基因表現與源自基因表現之形成由II類MHC分子呈遞之肽之N端之殘基的比例之間之關係。為量化總共39個樣品中每一樣品之基因表現，對包括在每一樣品中之RNA實施RNA測序。在圖13Q中，藉由RNA測序以每百萬轉錄本(TPM)為單位量測基因表現。為鑑別39個樣品中每一樣品之基因表現產物之呈遞之普遍性，對每一樣品實施II類HLA DR肽體學數據之鑑別。
如圖13Q中所繪示，對於39個樣品，基因表現量與藉由II類MHC分子對所表現基因產物之殘基之呈遞之間存在強相關。具體而言，如圖13Q中所顯示，源自最少表現基因之表現之肽由II類MHC分子呈遞之可能性比源自最多表現基因之表現的肽大100倍。簡言之，更高表現基因之產物更通常由II類MHC分子呈遞。
圖13H-J係比較各個呈遞模型在預測肽之測試數據集中之肽將由存在於測試數據集中之至少一個II類MHC分子呈遞之似然度方面的性能之線圖。如圖13H-J中所顯示，測定模型在預測肽將由存在於測試數據集中之至少一個II類MHC分子呈遞之似然度方面的性能係藉由鑑別模型作出之每一預測之真陽性率對偽陽性率之比率來確定。在具有量化偽陽性率之x軸及量化真陽性率之y軸之線圖中，對給定模型鑑別之該等比率可以可視化為ROC (接受者操作特徵)曲線。利用曲線下面積(AUC)來量化模型之性能。具體而言，具有較大AUC之模型相對於具有較小AUC之模型具有較高之性能(即較大準確度)。在圖13H-J中，斜率為1 (即真陽性率對偽陽性率之比率為1)之黑色虛線繪示用於隨機猜測肽呈遞之似然度之預期曲線。虛線的AUC為0.5。ROC曲線及AUC度量詳細論述於上文部分XII.之前半部分中。
圖13R係鑒於不同的對偶基因相互作用及對偶基因非相互作用變量集，比較5種實例性呈遞模型在預測肽之測試數據集中之肽將由II類MHC分子呈遞之似然度方面的性能之線圖。換言之，圖13R量化各個對偶基因相互作用及對偶基因非相互作用變量於預測肽將由II類MHC分子呈遞之似然度之相對重要性。
用於產生圖13R線圖之ROC曲線之5種實例性呈遞模型之每一實例性呈遞模型的模型架構包含5種S型相加模型之系綜。系綜中之每一S型相加模型經構形以對每樣品至多4個獨特的HLA-DR對偶基因之肽呈遞建模。此外，系綜中之每一S型相加模型經構形以基於以下對偶基因相互作用及對偶基因非相互作用變量預測肽呈遞似然度：肽序列、側接序列、以TPM為單位之RNA表現、基因標識符及樣品標識符。系綜中每一S型相加模型之對偶基因相互作用組分係具有ReLu活化作為256個隱藏單元之單隱藏層MLP。
在使用實例性模型來預測肽之測試數據集中之肽將由II類MHC分子呈遞之似然度之前，對實例性模型進行訓練及驗證。為訓練、驗證及最後測試實例性模型，將上文針對39個樣品闡述之數據劃分成訓練數據集、驗證數據集及測試數據集。
為確保肽在訓練數據集、驗證數據集及測試數據集中之不超過一者中出現，實施以下程序。首先，去除總共39個樣品中在蛋白質體中之一個以上位置出現之所有肽。然後，將總共39個樣品之肽分配至10個相鄰肽之塊中。將總共39個樣品之肽之每一塊獨特地分配至訓練數據集、驗證數據集或測試數據集。以此方式，在訓練數據集、驗證數據集及測試數據集中之一個以上數據集中皆無肽出現。
在總共39個樣品中之28,081,944個肽中，訓練數據集包含來自總共39個樣品中之38個的21,077個由II類MHC分子呈遞之肽。包括在訓練數據集中之21,077個肽之長度介於9個與20個胺基酸之間，包括9個及20個。使用ADAM最佳化器及早期停止對訓練數據集訓練用於產生圖13R中之ROC曲線之實例性模型。
驗證數據集係由來自與訓練數據集中所用相同的38個樣品之2,346個由II類MHC分子呈遞之肽組成。驗證集僅用於早期停止。
測試數據集包含利用質譜自腫瘤樣品鑑別之由II類MHC分子呈遞之肽。具體而言，測試數據集包含203個由II類MHC分子呈遞之肽，具體而言HLA-DRB1*07:01、HLA-DRB1*15:01、HLA-DRB4*01:03及HLA-DRB5*01:01分子，其係自腫瘤樣品鑑別。包括在測試數據集中之肽保持在上文所述之訓練數據集之外。
如上所述，圖13R量化各個對偶基因相互作用變量及對偶基因非相互作用變量於預測肽將由II類MHC分子呈遞之似然度之相對重要性。亦如上文所述，用於產生圖13R線圖之ROC曲線之實例性模型經構形以基於以下對偶基因相互作用及對偶基因非相互作用變量預測肽呈遞似然度：肽序列、側接序列、以TPM為單位之RNA表現、基因標識符及樣品標識符。為量化該5種變量中之4者(肽序列、側接序列、RNA表現及基因標識符)於預測肽將由II類MHC分子呈遞之似然度之相對重要性，使用測試數據集之數據及4種變量之不同組合測試上文所述5種實例性模型中之每一實例性模型。具體而言，對於測試數據集之每一肽，實例性模型1基於肽序列、側接序列、基因標識符及樣品標識符而不基於RNA表現產生肽呈遞似然度之預測。類似地，對於測試數據集之每一肽，實例性模型2基於肽序列、RNA表現、基因標識符及樣品標識符而不基於側接序列產生肽呈遞似然度之預測。類似地，對於測試數據集之每一肽，實例性模型3基於側接序列、RNA表現、基因標識符及樣品標識符而不基於肽序列產生肽呈遞似然度之預測。類似地，對於測試數據集之每一肽，實例性模型4基於側接序列、RNA表現、肽序列及樣品標識符而不基於基因標識符產生肽呈遞似然度之預測。最後，對於測試數據集之每一肽，實例性模型5基於所有5種變量側接序列、RNA表現、肽序列、樣品標識符及基因標識符產生肽呈遞似然度之預測。
該5種實例性模型中每一者之性能繪示於圖13R之線圖中。具體而言，5種實例性模型中之每一者與繪示模型作出之每一預測之真陽性率對偽陽性率之比率的ROC曲線相關。例如，圖13R繪示基於肽序列、側接序列、基因標識符及樣品標識符而不基於RNA表現產生肽呈遞似然度之預測之實例性模型1之曲線。圖13R繪示基於肽序列、RNA表現、基因標識符及樣品標識符而不基於側接序列產生肽呈遞似然度之預測之實例性模型2之曲線。圖13R亦繪示基於側接序列、RNA表現、基因標識符及樣品標識符而不基於肽序列產生肽呈遞似然度之預測之實例性模型3之曲線。圖13R亦繪示基於側接序列、RNA表現、肽序列及樣品標識符而不基於基因標識符產生肽呈遞似然度之預測之實例性模型4之曲線。且最後圖13R繪示基於所有5種變量側接序列、RNA表現、肽序列、樣品標識符及基因標識符產生肽呈遞似然度之預測之實例性模型5之曲線。
如上所述，模型在預測肽將由II類MHC分子呈遞之似然度方面之性能係藉由鑑別繪示模型作出之每一預測之真陽性率對偽陽性率之比率的ROC曲線之AUC來量化。具有較大AUC之模型相對於具有較小AUC之模型具有較高之性能(即較大準確度)。如圖13R中所顯示，基於所有5種變量側接序列、RNA表現、肽序列、樣品標識符及基因標識符產生肽呈遞似然度之預測之實例性模型5之曲線達成0.98之最高AUC。因此，使用所有5種變量產生肽呈遞預測之實例性模型5達成最優性能。基於肽序列、RNA表現、基因標識符及樣品標識符而不基於側接序列產生肽呈遞似然度之預測之實例性模型2之曲線達成0.97之第二高AUC。因此，側接序列可鑑別為預測肽將由II類MHC分子呈遞之似然度之最不重要的變量。基於側接序列、RNA表現、肽序列及樣品標識符而不基於基因標識符產生肽呈遞似然度之預測之實例性模型4之曲線達成0.96之第三高AUC。因此，基因標識符可鑑別為預測肽將由II類MHC分子呈遞之似然度之第二不重要的變量。基於側接序列、RNA表現、基因標識符及樣品標識符而不基於肽序列產生肽呈遞似然度之預測之實例性模型3之曲線達成0.88之最低AUC。因此，肽序列可鑑別為預測肽將由II類MHC分子呈遞之似然度之最重要的變量。基於肽序列、側接序列、基因標識符及樣品標識符而不基於RNA表現產生肽呈遞似然度之預測之實例性模型1之曲線達成0.95之第二低AUC。因此，RNA表現可鑑別為預測肽將由II類MHC分子呈遞之似然度之第二重要的變量。
圖13S係比較四種不同的呈遞模型在預測肽之測試數據集中之肽將由II類MHC分子呈遞之似然度方面之性能的線圖。
圖13S中所測試之第一模型在本文中稱為「完全非相互作用模型」。完全非相互作用模型係上文所述呈遞模型之一個實施例，其中將對偶基因非相互作用變量 wk 及對偶基因相互作用變量 xh k 輸入各別依賴性函數(例如神經網路)中，且然後添加該等各別依賴性函數之輸出。具體而言，完全非相互作用模型係上文所述呈遞模型之一個實施例，其中將對偶基因非相互作用變量 wk 輸入依賴性函數 gw 中，將對偶基因相互作用變量 xh k 輸入各別依賴性函數 gh 中，且將依賴性函數 gw 及依賴性函數 gh 之輸出添加在一起。因此，在一些實施例中，完全非相互作用模型使用等式8確定肽呈遞之似然度，如上文所顯示。此外，其中將對偶基因非相互作用變量 wk 輸入依賴性函數 gw 中、將對偶基因相互作用變量 xh k 輸入各別依賴性函數 gh 中、且添加依賴性函數 gw 及依賴性函數 gh 之輸出之完全非相互作用模型的實施例詳細論述於上文部分X.B.2.之前半部分、部分X.B.3.之後半部分、部分X.C.3.之前半部分及部分X.C.6.之前半部分中。
圖13S中所測試之第二模型在本文中稱為「完全相互作用模型」。完全相互作用模型係上文所述呈遞模型之一個實施例，其中將對偶基因非相互作用變量 wk 直接串聯至對偶基因相互作用變量 xh k ，然後輸入依賴性函數(例如神經網路)中。因此，在一些實施例中，完全相互作用模型使用等式9確定肽呈遞之似然度，如上文所顯示。此外，其中將對偶基因非相互作用變量 wk 與對偶基因相互作用變量 xh k 串聯、然後將變量輸入依賴性函數中之完全相互作用模型之實施例詳細論述於上文部分X.B.2.之後半部分、部分X.C.2.之後半部分及部分X.C.5.之後半部分中。
圖13S中所測試之第三模型在本文中稱為「CNN模型」。CNN模型包含捲積神經網路，且類似於上文所述之完全非相互作用模型。然而，CNN模型之捲積神經網路之各層不同於完全非相互作用模型之神經網路之各層。具體而言，CNN模型之捲積神經網路之輸入層接受20聚體肽串且隨後將該20聚體肽串作為(n, 20, 21)張量嵌入。CNN模型之捲積神經網路之下一層包含大小為5且步幅為1之1-D捲積核層、全域最大池化層、p=0.2之捨棄層及最後具有ReLu活化之緻密34節點層。
圖13S中所測試之第四及最後模型在本文中稱為「LSTM模型」。LSTM模型包含長短期記憶神經網路。LSTM模型之長短期記憶神經網路之輸入層接受20聚體肽串且隨後將該20聚體肽串作為(n, 20, 21)張量嵌入。LSTM模型之長短期記憶神經網路之下一層包含長短期具有128個結點之記憶層、p =0.2之捨棄層及最後具有ReLu活化之緻密34結點層。
在使用圖13S之4種模型中之每一者來預測肽之測試數據集中之肽將由II類MHC分子呈遞之似然度之前，使用上文所述之38樣品訓練數據集對模型進行訓練且使用上文所述之驗證數據集驗證。在模型之此訓練及驗證後，使用上文所述之保留的第39個樣品測試數據集測試4種模型中之每一者。具體而言，對於4種模型中之每一者，將測試數據集之每一肽輸入模型中，且模型隨後輸出肽之呈遞似然度。
4種模型中每一者之性能繪示於圖13S中之線圖中。具體而言，4種模型中之每一者與繪示模型作出之每一預測之真陽性率對偽陽性率之比率的ROC曲線相關。例如，圖13S繪示CNN模型之ROC曲線、完全相互作用模型之ROC曲線、LSTM模型之ROC曲線及完全非相互作用模型之ROC曲線。
如上所述，模型在預測肽將由II類MHC分子呈遞之似然度方面之性能係藉由鑑別繪示模型作出之每一預測之真陽性率對偽陽性率之比率的ROC曲線之AUC來量化。具有較大AUC之模型相對於具有較小AUC之模型具有較高之性能(即較大準確度)。如圖13S中所顯示，完全相互作用模型之曲線達成0.982之最高AUC。因此，完全相互作用模型達成最優性能。完全非相互作用模型之曲線達成0.977之第二高AUC。因此，完全非相互作用模型達成第二優性能。CNN模型之曲線達成0.947之最低AUC。因此，CNN模型達成最差性能。LSTM模型之曲線達成0.952之第二低AUC。因此，LSTM模型達成第二差性能。然而，應注意，圖13S中所測試之所有模型之AUC皆大於0.9。因此，儘管其之間存在建築方差，但圖13S中所測試之所有模型皆能夠達成相對準確之肽呈遞預測。
圖13T係比較給出兩種不同準則之兩種實例性同類最優之先前技術模型、及給出兩個不同的對偶基因相互作用及對偶基因非相互作用變量集之兩種實例性呈遞模型在預測肽之測試數據集中之肽將由II類MHC分子呈遞之似然度方面的性能之線圖。具體而言，圖13T係比較使用最小NetMHCII 2.3預測之結合親和力作為產生預測之準則的實例性同類最優之先前技術模型(實例性模型1)、使用最小NetMHCII 2.3預測之結合秩作為產生預測之準則的實例性同類最優之先前技術模型(實例性模型2)、基於II類MHC分子類型及肽序列產生肽呈遞似然度之預測的實例性呈遞模型(實例性模型4)及基於II類MHC分子類型、肽序列、RNA表現、基因標識符及側接序列產生肽呈遞似然度之預測的實例性呈遞模型(實例性模型3)之性能之線圖。
用作圖13T中之實例性模型1及實例性模型2之同類最優之先前技術模型係NetMHCII 2.3模型。NetMHCII 2.3模型基於II類MHC分子類型及肽序列產生肽呈遞似然度之預測。NetMHCII 2.3模型係使用NetMHCII 2.3網站(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/, PMID 29315598)來測試76 。
如上所述，NetMHCII 2.3模型係根據兩種不同的準則來測試。具體而言，實例性模型1係根據最小NetMHCII 2.3預測之結合親和力產生肽呈遞似然度之預測，且實例性模型2係根據最小NetMHCII 2.3預測之結合秩產生肽呈遞似然度之預測。
用作實例性模型3及實例性模型4之呈遞模型係使用經由質譜獲得之數據訓練之本文所揭示呈遞模型之實施例。如上所述，呈遞模型基於兩個不同的對偶基因相互作用及對偶基因非相互作用變量集產生肽呈遞似然度之預測。具體而言，實例性模型4基於II類MHC分子類型及肽序列(由NetMHCII 2.3模型使用之相同變量)產生肽呈遞似然度之預測，且實例性模型3基於II類MHC分子類型、肽序列、RNA表現、基因標識符及側接序列產生肽呈遞似然度之預測。
在使用圖13T之實例性模型來預測肽之測試數據集中之肽將由II類MHC分子呈遞之似然度之前，對模型進行訓練及驗證。NetMHCII 2.3模型(實例性模型1及實例性模型2)係使用其自身訓練及驗證數據集基於免疫表位數據庫(IEDB, www.iedb.org)中所儲存之HLA-肽結合親和力分析來訓練及驗證。已知用於訓練NetMHCII 2.3模型之訓練數據集幾乎唯一地包含15聚體肽。另一方面，實例性模型3及4係使用上文針對圖13R闡述之訓練數據集訓練且使用上文針對圖13R闡述之驗證數據集驗證。
在模型之訓練及驗證後，使用測試數據集測試每一模型。如上所述，NetMHCII 2.3模型係針對幾乎唯一地包含15聚體肽之數據集訓練，此意指NetMHCII 3.2無法將不同的優先性給予不同重量之肽，由此降低NetMHCII 3.2對含有所有長度之肽之II類HLA呈遞質譜數據之預測性能。因此，為提供模型之間不受可變肽長度影響之公平比較，測試數據集唯一地包括15聚體肽。具體而言，測試數據集包含933個15聚體肽。測試數據集中933個肽中之40個係由II類MHC分子呈遞，具體而言由HLA-DRB1*07:01、HLA-DRB1*15:01、HLA-DRB4*01:03及HLA-DRB5*01:01分子呈遞。包括在測試數據集中之肽保持在上文所述之訓練數據集之外。
為使用測試數據集測試實例性模型，對於每一實例性模型，對於測試數據集中933個肽中之每一肽，模型產生肽之呈遞似然度之預測。具體而言，對於測試數據集中之每一肽，實例1模型使用II類MHC分子類型及肽序列產生藉由II類MHC分子之肽之呈遞分數，其係藉由最小NetMHCII 2.3預測之結合親和力橫跨測試數據集中之四個II類HLA DR對偶基因對肽分級來實施。類似地，對於測試數據集中之每一肽，實例2模型使用II類MHC分子類型及肽序列產生藉由II類MHC分子之肽之呈遞分數，其係藉由最小NetMHCII 2.3預測之結合秩(即分位數正規化之結合親和力)橫跨測試數據集中之四個II類HLA DR對偶基因對肽分級來實施。對於測試數據集中之每一肽，實例4模型藉由II類MHC分子基於II類MHC分子類型及肽序列產生肽之呈遞似然度。類似地，對於測試數據集中之每一肽，實例性模型3藉由II類MHC分子基於II類MHC分子類型、肽序列、RNA表現、基因標識符及側接序列產生肽之呈遞似然度。
四種實例性模型中每一者之性能繪示於圖13T中之線圖中。具體而言，四種實例性模型中之每一者與繪示模型作出之每一預測之真陽性率對偽陽性率之比率的ROC曲線相關。例如，圖13T繪示使用最小NetMHCII 2.3預測之結合親和力產生預測之實例1模型的ROC曲線、使用最小NetMHCII 2.3預測之結合秩產生預測之實例2模型的ROC曲線、基於II類MHC分子類型及肽序列產生肽呈遞似然度之實例4模型的ROC曲線、及基於II類MHC分子類型、肽序列、RNA表現、基因標識符及側接序列產生肽呈遞似然度之實例3模型的ROC曲線。
如上所述，模型在預測肽將由II類MHC分子呈遞之似然度方面之性能係藉由鑑別繪示模型作出之每一預測之真陽性率對偽陽性率之比率的ROC曲線之AUC來量化。具有較大AUC之模型相對於具有較小AUC之模型具有較高之性能(即較大準確度)。如圖13T中所顯示，基於II類MHC分子類型、肽序列、RNA表現、基因標識符及側接序列產生肽呈遞似然度之實例3模型之曲線達成0.95之最高AUC。因此，基於II類MHC分子類型、肽序列、RNA表現、基因標識符及側接序列產生肽呈遞似然度之實例3模型達成最優性能。基於II類MHC分子類型及肽序列產生肽呈遞似然度之實例4模型之曲線達成0.91之第二高AUC。因此，基於II類MHC分子類型及肽序列產生肽呈遞似然度之實例4模型達成第二優性能。使用最小NetMHCII 2.3預測之結合親和力產生預測之實例1模型之曲線達成0.75之最低AUC。因此，使用最小NetMHCII 2.3預測之結合親和力產生預測之實例1模型達成最差性能。使用最小NetMHCII 2.3預測之結合秩產生預測之實例2模型之曲線達成0.76之第二低AUC。因此，使用最小NetMHCII 2.3預測之結合秩產生預測之實例2模型達成第二差性能。
如圖13T中所顯示，實例性模型1及2與實例性模型3及4之間性能之偏差較大。具體而言，NetMHCII 2.3模型(其使用最小NetMHCII 2.3預測之結合親和力或最小NetMHCII 2.3預測之結合秩中之任一準則)之性能比本文所揭示呈遞模型(其基於II類MHC分子類型及肽序列或基於II類MHC分子類型、肽序列、RNA表現、基因標識符及側接序列產生肽呈遞似然度)之性能低幾乎25%。因此，圖13T展示，本文所揭示之呈遞模型能夠達成比當前同類最優之先前技術模型NetMHCII 2.3模型顯著更準確之呈遞預測。
另外，如上文所論述，NetMHCII 2.3模型係針對幾乎唯一地包含15聚體肽之訓練數據集進行訓練。因此，NetMHCII 2.3模型經訓練並不獲悉更可能由II類MHC分子呈遞之肽長度。因此，NetMHCII 2.3模型並不對其根據肽之長度預測藉由II類MHC分子之肽呈遞之似然度加權。換言之，NetMHCII 2.3模型並不改進其對長度在15個胺基酸之模態肽長度之外之肽藉由II類MHC分子之肽呈遞之似然度的預測。因此，NetMHCII 2.3模型過度預測長度大於或小於15個胺基酸之肽之呈遞似然度。
另一方面，本文所揭示之呈遞模型係使用經由質譜獲得之肽數據進行訓練，且因此可對包含所有不同長度之肽之訓練數據集進行訓練。因此，本文所揭示之呈遞模型能夠獲悉更可能由II類MHC分子呈遞之肽長度。因此，本文所揭示之呈遞模型可對根據肽之長度預測藉由II類MHC分子之肽呈遞之似然度進行加權。換言之，本文所揭示之呈遞模型能夠改進其對長度在15個胺基酸之模態肽長度之外之肽藉由II類MHC分子之肽呈遞之似然度的預測。因此，本文所揭示之呈遞模型能夠達成比當前同類最優之先前技術模型NetMHCII 2.3模型顯著更準確之長度大於或小於15個胺基酸之肽之呈遞預測。此係使用本文所揭示之呈遞模型預測藉由II類MHC分子之肽呈遞之似然度的一個優點。XII.N. 對 MHC II 對偶基因確定之參數之實例
下文顯示對產生隱式II類MHC對偶基因HLA-DRB1*12:01及HLA-DRB1*10:01之每一對偶基因呈遞似然度之多對偶基因呈遞模型(等式(16))之變化確定之參數集：其中relu(∙)係修正線性單元(RELU)函數，W1 、b1 、W2 及b2 係對模型確定之參數集 θ 。對偶基因相互作用變量X 含於由1列獨熱編碼且中間填充之肽序列/輸入肽組成之(1 × 399)矩陣中。W1 之維數係(399 × 256)，b1 之維數係(1 × 256)，W2 之維數係(256 × 2)，且b2 係(1 × 2)。輸出之第一行指示肽序列由對偶基因HLA-DRB1*12:01呈遞之隱式每一對偶基因機率，且輸出之第二行指示由對偶基因HLA-DRB1*10:01呈遞之肽序列之隱式每一對偶基因。出於展示之目的，W1 、b1 、W2 及b2 之值詳細闡述於國際申請案PCT/US2018/028438中，其所教示之全文皆以引用方式併入本文中。XIII. 實例性電腦
圖14圖解說明用於執行圖1及3中所示之實體之實例性電腦1400。電腦1400包括至少一個耦合至晶片集1404之處理器1402。晶片集1404包括記憶體控制器集線器1420及輸入/輸出(I/O)控制器集線器1422。記憶體1406及圖形配接器1412耦合至記憶體控制器集線器1420，且顯示器1418耦合至圖形配接器1412。儲存裝置1408、輸入裝置1414及網路配接器1416耦合至I/O控制器集線器1422。電腦1400之其他實施例具有不同架構。
儲存裝置1408係非暫時性電腦可讀儲存媒體，例如硬驅動機、唯讀光碟記憶體(CD-ROM)、DVD或固態記憶體裝置。記憶體1406容納處理器1402所用之指令及數據。輸入介面1414係觸控螢幕介面、鼠標、跟蹤球或其他類型之指向裝置、鍵盤或其一些組合，且用於將數據輸入電腦1400中。在一些實施例中，電腦1400可經組態以經由使用者之手勢自輸入介面1414接收輸入(例如命令)。圖形配接器1412在顯示器1418上顯示影像及其他資訊。網路配接器1416將電腦1400耦合至一或多個電腦網路。
電腦1400經配接以執行用於提供本文所述之功能之電腦程式模組。如本文所用術語「模組」係指用於提供所規定功能之電腦程式邏輯。因此，模組可以硬體、韌體及/或軟體來實施。在一個實施例中，程式模組儲存於儲存裝置1408上，裝載至記憶體1406中，且由處理器1402來執行。
圖1之實體所用之電腦1400之類型可端視實施例及實體所需之處理能力而變化。舉例而言，呈遞鑑別系統160可在單一電腦1400或經由例如呈伺服器農場中之網路彼此連通多個電腦1400中運行。電腦1400可缺少上文所述之一些組分，例如圖形配接器1412及顯示器1418。XIV. 新抗原遞送載體實例
下文係用於實施本發明之具體實施例之實例。提供該等實例僅用於說明性目的，而不意欲以任何方式限制本發明之範圍。已努力確保所用數字(例如量、溫度等)之準確度，但當然應允許一些實驗誤差及偏差。
除非另外指示，否則本發明之實踐將採用熟習此項技術者熟知之蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習用方法。該等技術全面闡釋於文獻中。例如，參見T.E. Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc.,新增)；Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編輯，Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences ，第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey及SundbergAdvanced Organic Chemistry 第3 版 (Plenum Press)第A及B卷(1992)。XIV.A. 新抗原盒設計
經由疫苗接種，可遞送多種刺激相應細胞免疫反應之I類MHC限制性腫瘤特異性新抗原(TSNA)。在一個實例中，疫苗盒經改造以將多個表位編碼為單一基因產物，其中表位嵌入其天然周圍肽序列內或藉由非天然連接體序列間隔開。鑑別出若干設計參數，其可潛在地影響抗原加工及呈遞，且因此影響TSNA特異性CD8 T細胞反應之量值及寬度。在本實例中，設計及構築若干模型盒以評估：(1)是否可產生針對納入單一表現盒中之多個表位之穩健的T細胞反應；(2)什麼使得最佳連接體位於表現盒內之TSNA之間從而引起所有表位之最佳加工及呈遞；(3)盒內表位之相對位置是否影響T細胞反應；(4)盒內之表位數是否影響針對個別表位之T細胞反應之量值或品質；(5)細胞靶向序列之添加是否改良T細胞反應。
形成兩個讀出以評估特異性針對模型盒內之標記物表位之抗原呈遞及T細胞反應：(1)基於細胞之活體外篩選，其允許評價抗原呈遞，如藉由經特定改造之報導基因T細胞之活化(Aarnoudse等人，2002；Nagai等人，2012)所計量；及(2)活體內分析，其使用HLA-A2轉基因小鼠(Vitiello等人，1991)藉由其相應表位特異性T細胞反應(Cornet等人，2006；Depla等人，2008；Ishioka等人，1999)來評價人類起源之盒衍生表位之疫苗接種後免疫原性。XIV.B. 新抗原盒設計評估 XIV.B.1. 方法及材料 TCR 以及盒設計及選殖
所選TCR在由A*0201呈遞時識別肽NLVPMVATV (PDB編號5D2N)、CLGGLLTMV (PDB編號3REV)、GILGFVFTL (PDB編號1OGA)、LLFGYPVYV (PDB編號1AO7)。構築含有2A肽連接之TCR亞單位(β後為α)、EMCV IRES及2A連接之CD8亞單位(β後為α及藉由嘌呤黴素(puromycin)抗性基因)之轉移載體。開放閱讀框序列係密碼子最佳化的且係藉由GeneArt合成。用於活體外表位加工及呈遞研究之細胞系產生
肽係購自ProImmune或Genscript，用10mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)於水/DMSO (2:8, v/v)中稀釋至10mg/mL。除非另外註明，否則細胞培養基及補充物係來自Gibco。熱不活化胎牛血清(FBShi)係來自Seradigm。QUANTI-Luc受質吉歐黴素(Zeocin)及嘌呤黴素係來自InvivoGen。使Jurkat-Lucia NFAT細胞(InvivoGen)維持在補充有10% FBShi、丙酮酸鈉及100µg/mL吉歐黴素之RPMI 1640中。轉導後，立即使該等細胞另外接受0.3 µg/mL嘌呤黴素。將T2細胞(ATCC CRL-1992)培養於Iscove培養基(IMDM)加20% FBShi中。使U-87 MG (ATCC HTB-14)細胞維持在補充有10% FBShi之MEM伊格爾培養基(Eagles Medium)中。
Jurkat-Lucia NFAT細胞含有NFAT誘導型Lucia報導基因構築體。Lucia基因在藉由T細胞受體(TCR)接合活化時引起利用腔腸素(coelenterazine)之螢光素酶分泌至培養基中。此螢光素酶可使用QUANTI-Luc螢光素酶檢測試劑來量測。用慢病毒屬(lentivirus)轉導Jurkat-Lucia細胞以表現抗原特異性TCR。自GeneCopoeia獲得HIV衍生之慢病毒屬轉移載體，且自Cell Design Labs獲得表現VSV-G (pCMV-VsvG)、Rev (pRSV-Rev)及Gag-pol (pCgpV)之慢病毒屬支持質體。
藉由用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher)使用40 µl lipofectamine及20 µg DNA混合物(以轉移質體:pCgpV:pRSV-Rev:pCMV-VsvG之重量計為4:2:1:1)轉染HEK293細胞之50-80鋪滿%之T75燒瓶來製備慢病毒屬。使用Lenti-X系統(Clontech)濃縮8-10 mL含病毒培養基，且將病毒重懸浮於100-200 µl新鮮培養基中。使用此體積覆蓋等體積之Jurkat-Lucia細胞(將5×10E4-1×10E6個細胞用於不同實驗中)。在含0.3 µg/ml嘌呤黴素之培養基中培養後，分選細胞以獲得純系形成能力。使用肽負載之T2細胞測試該等Jurkat-Lucia TCR純系之活性及選擇性。活體外表位加工及呈遞分析
T2細胞通常用於檢查TCR之抗原識別。T2細胞缺少用於抗原加工之肽運輸蛋白(TAP缺陷)且無法使內源肽負載於內質網中以供在MHC上呈遞。然而，T2細胞可容易地負載有外源肽。將5種標記物肽(NLVPMVATV、CLGGLLTMV、GLCTLVAML、LLFGYPVYV、GILGFVFTL)及兩種不相關肽(WLSLLVPFV、FLLTRICT)負載至T2細胞上。簡言之，對T2細胞計數且用IMDM加1% FBShi稀釋至1×106 個細胞/mL。添加肽以產生10 µg肽/1×106 個細胞。然後將細胞在37℃下培育90分鐘。用IMDM加20% FBShi將細胞洗滌兩次，稀釋至5×10E5個細胞/mL且將100 µL平鋪至96孔Costar組織培養板中。對Jurkat-Lucia TCR純系計數且在RPMI 1640加10% FBShi中稀釋至5×10E5個細胞/mL並將100 µL添加至T2細胞。將板在37℃、5% CO2 下培育過夜。然後將板在400g下離心3分鐘且取出20 µL上清液至白色平底Greiner板。根據說明書製備QUANTI-Luc受質且添加50 µL/孔。在Molecular Devices SpectraMax iE3x上讀取螢光素酶表現。
為測試藉由腺病毒盒之標記物表位呈遞，使用U-87 MG細胞作為代用抗原呈遞細胞(APC)且用腺病毒載體轉導。收穫U-87 MG細胞且以5×10E5個細胞/100 µl平鋪於96孔Costar組織培養板中之培養基中。將板在37℃下培育約2小時。用MEM加10% FBShi將腺病毒盒稀釋至100、50、10、5、1及0之MOI且以5µl/孔添加至U-87 MG細胞。將板在37℃下再培育約2小時。對Jurkat-Lucia TCR純系計數且於RPMI加10% FBShi中稀釋至5×10E5個細胞/mL並以100 µL/孔添加至U-87 MG細胞。然後將板在37℃、5% CO2 下培育約24小時。將板在400g下離心3分鐘且取出20 µL上清液至白色平底Greiner板。根據說明書製備QUANTI-Luc受質且添加50 µL/孔。在Molecular Devices SpectraMax iE3x上讀取螢光素酶表現。用於免疫原性研究之小鼠品系
自Taconic Labs, Inc獲得轉基因HLA-A2.1 (HLA-A2 Tg)小鼠。該等小鼠攜帶由包含人類HLA-A2.1前導序列、α1及α2域及鼠類H2-Kb α3、跨膜及細胞質域(Vitiello等人，1991)之嵌合I類分子組成之轉基因。用於該等研究之小鼠係在C57Bl/6背景下野生型BALB/cAnNTac雌性及同型接合HLA-A2.1 Tg雄性之第一代後代(F1)。腺病毒載體 (Ad5v) 免疫
用1×1010 至1×106 個腺病毒載體病毒粒子經由雙側肌內注射至脛骨前肌中來免疫HLA-A2 Tg小鼠。在免疫後12天量測免疫反應。淋巴球分離
自經免疫小鼠之新鮮收穫之脾及淋巴結分離淋巴球。在含有10%胎牛血清及青黴素(penicillin)及鏈黴素(streptomycin)之RPMI (完全RPMI)中使用GentleMACS組織解離器根據製造商之說明書使組織解離。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析
根據ELISPOT協調指導(Janetzki等人，2015)使用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)實施ELISPOT分析。將1×105 個脾細胞與10uM所指示肽在96孔IFNg抗體包覆之板中一起培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯影。將反應定時10分鐘且藉由使板在自來水下運行來淬滅。使用AID vSpot讀取器光譜對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和＞50%之孔記錄為「太多以致於難以計數」。自分析排除重複孔之偏差＞ 10%之樣品。然後針對孔鋪滿使用下式校正斑點計數：斑點計數+ 2 × (斑點計數 × 鋪滿%/[100% - 鋪滿%])。藉由自抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多以致於難以計數之孔設定為觀察到之最高校正值，捨進至最近百位數。離體細胞內細胞介素染色 (ICS) 及流式細胞術分析
將密度為2-5×106 個細胞/mL之新鮮分離之淋巴球與10uM所指示肽一起培育2小時。2小時後，將佈雷菲德菌素A (brefeldin A)添加至5ug/ml之濃度且將細胞與刺激劑一起再培育4小時。刺激後，根據製造商之方案用可固定活力染料eFluor780標記活細胞且用抗CD8 APC (純系53-6.7, BioLegend)以1:400稀釋染色。將抗IFNg PE (純系XMG1.2, BioLegend)以1:100用於細胞內染色。在Attune NxT流式細胞計數器(Thermo Scientific)上收集樣品。使用FlowJo繪製及分析流式細胞術數據。為評價抗原特異性反應之程度，計算因應每一肽刺激劑之CD8+細胞之IFNg+%及總IFNg+細胞數/1×106 個活細胞二者。XIV.B.2. 新抗原盒設計之活體外評估
作為新抗原盒設計評估之實例，研發出基於細胞之活體外分析以評價模型疫苗盒內之所選人類表位是否經表現、加工及由抗原呈遞細胞呈遞(圖15)。在識別時，經改造以表現特異性針對經充分表徵之肽-HLA組合之5種TCR中之一者的Jurkat-Lucia報導基因T細胞變得活化且使經活化T細胞之核因子(NFAT)易位至核中，引起螢光素酶報導基因之轉錄活化。藉由生物發光量化個別報導基因CD8 T細胞系之抗原性刺激。
藉由用表現構築體慢病毒轉導來修飾各別Jurkat-Lucia報導基因系，該表現構築體包括藉由P2A核糖體間越序列分隔開之抗原特異性TCR β及TCR α鏈以確保等莫耳量之轉譯產物(Banu等人，2014)。將第二CD8 β-P2A-CD8 α元件添加至慢病毒構築體提供CD8輔受體之表現，親代報導基因細胞系缺少該CD8輔受體，此乃因細胞表面上之CD8對於靶向pMHC分子之結合親和力至關重要且增強經由接合其胞質尾區之信號傳導(Lyons等人，2006；Yachi等人，2006)。
在慢病毒轉導後，使Jurkat-Lucia報導基因在嘌呤黴素選擇下擴增，經受單細胞螢光輔助細胞分選(FACS)，且測試單株群體之螢光素酶表現。此產生具有功能性細胞反應之特異性肽抗原1、2、4及5之穩定轉導之報導基因細胞系。(表2)。表 2 ： 活體外T細胞活化分析之研發。如藉由螢光素酶之誘導量測之肽特異性T細胞識別指示疫苗盒抗原之有效加工及呈遞。 *表位3之報導基因T細胞尚未產生
在另一實例中，將一系列短盒、所有標記物表位納入同一位置(圖16A)且僅改變分隔開HLA-A*0201限制性表位之連接體(圖16B)。使報導基因T細胞個別地與用表現該等短盒之腺病毒構築體感染之U-87抗原呈遞細胞(APC)混合，且量測相對於未受感染之對照之螢光素酶表現。藉由匹配報導基因T細胞、展示多種抗原之有效加工及呈遞來識別模型盒中之所有四種抗原。T細胞反應之量值遵循天然及AAY-連接體之大致相似之趨勢。自基於RR-連接體之盒釋放之抗原顯示較低的螢光素酶誘導(表3)。經設計以破壞抗原加工之DPP-連接體產生引起較差表位呈遞之疫苗盒(表3)。表 3 ： 短盒中連接體序列之評估。活體外T細胞活化分析中之螢光素酶誘導指示，除基於DPP之盒外，所有連接體皆促進盒抗原之有效釋放。僅T細胞表位(無連接體) = 9AA，一側天然連接體= 17AA，兩側天然連接體= 25AA，非天然連接體= AAY、RR、DPP *表位3之報導基因T細胞尚未產生
在另一實例中，構築另一系列短盒，除人類及小鼠表位外含有靶向序列(例如泛素(Ub)、MHC及Ig-κ信號肽(SP))及/或位於盒N端或C端之MHC跨膜(TM)基序。(圖17)。在藉由腺病毒載體遞送至U-87 APC時，報導基因T細胞再次展示多種盒衍生之抗原之有效加工及呈遞。然而，T細胞反應之量值不受各個靶向特徵之顯著影響(表4)。表 4 ： 添加至模型疫苗盒之細胞靶向序列之評估。採用活體外T細胞活化分析展示，四種HLA-A*0201限制性標記物表位有效地自模型盒釋放且靶向序列不會顯著改良T細胞識別及活化。 *表位3之報導基因T細胞尚未產生XIV.B.3. 新抗原盒設計之活體內評估
作為新抗原盒設計評估之另一實例，疫苗盒經設計以含有5個經充分表徵之人類I類MHC表位，已知其以HLA-A*02:01限制性方式刺激CD8 T細胞(圖16A、17、19A)。為評估其活體內免疫原性，將含有該等標記物表位之疫苗盒納入腺病毒載體中且用於感染HLA-A2轉基因小鼠(圖18)。此小鼠模型攜帶部分地由人類HLA-A*0201及小鼠H2-Kb組成之轉基因，因此編碼由人類HLA-A2.1前導序列、連結至鼠類α3之α1及α2域、跨膜及細胞質H2-Kb域組成之嵌合I類MHC分子(Vitiello等人，1991)。嵌合分子允許HLA-A*02:01限制性抗原呈遞，同時維持CD8輔受體與MHC上之α3域之物種匹配之相互作用。
對於短盒，所有標記物表位產生有力的T細胞反應，如藉由IFN-γ ELISPOT所測定，該T細胞反應比通常已報導者(Cornet等人，2006；Depla等人，2008；Ishioka等人，1999)強約10-50×。在所評估之所有連接體中，25聚體序列(其各自含有側接有其天然胺基酸序列之最小表位)之串聯體產生最大且最寬之T細胞反應(表5)。細胞內細胞介素染色(ICS)及流式細胞術分析揭露抗原特異性T細胞反應係衍生自CD8 T細胞。表 5 ： 短盒中連接體序列之活體內評估。ELISPOT數據指示，HLA-A2轉基因小鼠在用1e11個腺病毒病毒粒子感染後17天產生針對盒中之所有I類MHC限制性表位之T細胞反應。
在另一實例中，構築一系列長疫苗盒且將其納入腺病毒載體中，該等載體在緊靠原始5標記物表位處含有具有已知CD8 T細胞反應性之另外16個HLA-A*02:01、A*03:01及B*44:05表位(圖19A、B)。該等長盒之大小與最終臨床盒設計密切相關，且僅改變表位相對於彼此之位置。對於長及短疫苗盒二者之CD8 T細胞反應之量值及寬度係相當的，此證實(a)添加更多表位不會影響針對原始表位集之免疫反應之量值，及(b)盒中表位之位置不會影響針對其之後續T細胞反應(表6)。表 6 ： 長盒中之表位位置之影響之活體內評估。ELISPOT數據指示，HLA-A2轉基因小鼠在用5e10個腺病毒病毒粒子感染後17天產生對於長及短疫苗盒二者量值相當之T細胞反應。 *所懷疑技術誤差引起T細胞反應之不存在。XIV.B.4. 用於免疫原性及毒物學研究之新抗原盒設計
總之，模型盒評估之發現(圖16-19、表2-6)展示，對於模型疫苗盒，在採用在基於腺病毒之載體之情況下編碼約20個表位之「珠粒串」方法時達成最佳免疫原性。該等表位係藉由串聯25聚體序列最優組裝，該等25聚體序列各自嵌入在兩側側接有其天然周圍肽序列(例如在每一側8個胺基酸殘基)之最小CD8 T細胞表位(例如9個胺基酸殘基)。如本文所用之「天然(natural)」或「天然(native)」側接序列係指在給定表位在其源蛋白內之天然背景下該表位之N端及/或C端側接序列。舉例而言，HCMV pp65 I類MHC表位NLVPMVATV在其5’端側接有天然5’端序列WQAGILAR且在其3’端側接有天然3’端序列QGQNLKYQ，由此產生在HCMV pp65源蛋白內發現之WQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQ 25聚體肽。天然(natural)或天然(native)序列亦可指編碼側接有天然側接序列之表位之核苷酸序列。每一25聚體序列直接連接至下一25聚體序列。在最小CD8 T細胞表位大於或小於9個胺基酸之情況下，可調整側接肽長度使得總長度仍為25聚體肽序列。舉例而言，10胺基酸CD8 T細胞表位可側接有8胺基酸序列及7胺基酸序列。串聯體之後為兩個通用II類MHC表位，其經納入以刺激CD4 T輔助細胞且改良疫苗盒抗原之總體活體內免疫原性。(Alexander等人，1994；Panina-Bordignon等人，1989) II類表位藉由GPGPG胺基酸連接體(SEQ ID NO:56)連接至最終I類表位。兩個II類表位亦藉由GPGPG胺基酸連接體彼此連接，且在C端側接有GPGPG胺基酸連接體。位置及表位數皆不證明實質性影響T細胞識別或反應。靶向序列亦似乎不會實質性影響盒衍生之抗原之免疫原性。
作為另一實例，基於使用模型盒獲得之活體外及活體內數據(圖16-19、表2-6)，產生已知在人類靈長類動物(NHP)、小鼠及人類中具有非免疫原性之經充分表徵之T細胞表位交替的盒設計。20個表位(皆嵌入其天然25聚體序列中)之後為兩個存在於所評估之所有模型盒中之通用II類MHC表位(圖20)。此盒設計用於研究多個物種中之免疫原性以及藥理學及毒物學研究。XV. ChAd 新抗原盒遞送載體 XV.A. ChAd 新抗原盒遞送載體構築
在一個實例中，黑猩猩腺病毒(ChAd)經改造以為新抗原盒之遞送載體。在另一實例中，基於AC_000011.1 (來自專利US 6083716之序列2)合成全長ChAdV68載體，其中E1 (nt 457至3014)及E3 (nt 27,816- 31,332)序列缺失。插入在CMV啟動子/增強子控制下之報導基因來代替缺失的E1序列。將此純系轉染至HEK293細胞中不會產生感染性病毒。為確認野生型C68病毒之序列，自ATCC獲得分離物VR-594，傳代且然後獨立地測序(SEQ ID NO:10)。在比較野生型ChAdV68病毒之AC_000011.1序列與ATCC VR-594序列(SEQ ID NO:10)時，鑑別出6處核苷酸差異。在一個實例中，基於AC_000011.1產生經修飾ChAdV68載體，其中相應ATCC VR-594核苷酸在5個位置經取代(ChAdV68.5WTnt SEQ ID NO:1)。
在另一實例中，基於AC_000011.1產生經修飾ChAdV68載體，其中E1 (nt 577至3403)及E3 (nt 27,816-31,332)序列缺失且相應ATCC VR-594核苷酸在4個位置經取代。插入在CMV啟動子/增強子控制下之GFP報導基因(ChAdV68.4WTnt.GFP; SEQ ID NO:11)或模型新抗原盒(ChAdV68.4WTnt.MAG25聚體；SEQ ID NO:12)來代替缺失的E1序列。
在另一實例中，基於AC_000011.1產生經修飾ChAdV68載體，其中E1 (nt 577至3403)及E3 (nt 27,125-31,825)序列缺失且相應ATCC VR-594核苷酸在5個位置經取代。插入在CMV啟動子/增強子控制下之GFP報導基因(ChAdV68.5WTnt.GFP; SEQ ID NO:13)或模型新抗原盒(ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體；SEQ ID NO:2)來代替缺失的E1序列。 XV.B. ChAd 新抗原盒遞送載體測試 XV.B.1. ChAd 載體評估方法及材料 使用 lipofectamine 轉染 HEK293A 細胞
製備用於ChAdV68構築體(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25聚體及ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體)之DNA且使用以下方案將其轉染至HEK293A細胞中。
用PacI消化10 ug質體DNA以釋放病毒基因體。然後使用用於長DNA片段之GeneJet DNA清潔Micro管柱(Thermo Fisher)根據製造商之說明書純化DNA，且在20 ul預加熱水中溶析；在溶析步驟之前使管柱在37℃下靜置0.5-1小時。
在轉染前14-18小時將HEK293A細胞以106 個細胞/孔之細胞密度引入6孔板中。用1 ml新鮮培養基(DMEM-10% hiFBS，含有pen/strep及麩胺酸鹽)/孔覆蓋細胞。根據製造商之方案每孔使用1-2 ug經純化DNA以兩倍ul體積(2-4 ul)之Lipofectamine2000來轉染。將0.5 ml含有轉染混合物之OPTI-MEM培養基添加至每孔中之1 ml正常生長培養基中，且使細胞靜置過夜。
將經轉染細胞培養物在37℃下培育至少5-7天。若截至轉染後第7天病毒蝕斑不可見，則將細胞以1:4或1:6分流且在37℃下培育以監測蝕斑形成。或者，收穫經轉染細胞且使其經受3個冷凍及解凍週期並將細胞溶解物用於感染HEK293A細胞且培育細胞直至觀察到病毒蝕斑。使用磷酸鈣將 ChAdV68 載體轉染至 HEK293A 細胞中且產生三級病毒原液
製備ChAdV68構築體(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25聚體、ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體)之DNA且使用以下方案將其轉染至HEK293A細胞中。
在轉染前1天將HEK293A細胞以6孔板之106 個細胞/孔接種於5% BS/DMEM/ 1×P/S、1×Glutamax中。每次轉染需要兩個孔。在轉染前2至4小時，將培養基更換為新鮮培養基。用PacI將ChAdV68.4WTnt.GFP質體線性化。然後對線性化DNA進行酚氯仿萃取且使用1/10體積之3M乙酸鈉(pH 5.3)及2體積之100%乙醇沈澱。藉由在12,000×g下離心5 min使沈澱的DNA沉降，然後用70%乙醇洗滌1×。將沉降物風乾且重懸浮於50 µL無菌水中。使用NanoDropTM (ThermoFisher)測定DNA濃縮物且將體積調整至5 µg DNA/50 µL。
將169 µL無菌水添加至微量離心管。然後將5 µL 2M CaCl2 添加至水且藉由抽吸輕輕混合。將50 µL DNA逐滴添加至CaCl2 水溶液。然後添加26 µL 2M CaCl2 且藉由用微量移液管抽吸兩次輕輕混合。此最終溶液應由250 µL 0.25M CaCl2 中之5 µg DNA組成。然後準備含有250 µL 2×HBS (Hepes緩衝溶液)之第二管。使用附接至Pipet-Aid之2 mL無菌吸量管，使空氣緩慢鼓泡通過2×HBS溶液。同時，逐滴添加0.25M CaCl2 溶液中之DNA溶液。在添加最終DNA液滴後繼續鼓泡約5秒。然後將溶液在室溫下培育至多20分鐘，隨後添加至293A細胞。將250 µL DNA/磷酸鈣溶液逐滴添加至在前1天以6孔板之106 個細胞/孔接種之單層293A細胞。使細胞返回至培育器且培育過夜。在24h後更換培養基。在72h後將細胞以1:6分流至6孔板中。藉由光學顯微術每天監測單層用於細胞病變效應(CPE)之證據。在轉染後7-10天觀察到病毒蝕斑且藉由抽吸孔中之培養基以舉離細胞來收穫單層。將收穫之細胞及培養基轉移至50 mL離心管，然後進行三輪冷凍解凍(在-80℃及37℃下)。藉由在臺式離心機(4300×g)上全速離心使後續溶解物(稱為初級病毒原液)澄清且使用一定比例之溶解物(10-50%)來感染T25燒瓶中之293A細胞。將受感染細胞培育48h，然後在完全CPE下收穫細胞及培養基。再次收穫細胞，冷凍解凍且澄清，然後使用此二級病毒原液來感染以1.5× 107 個細胞/燒瓶接種之T150燒瓶。在72h達成完全CPE後，收穫培養基及細胞且用早期病毒原液處理以產生三級原液。293F 細胞中之產生
在培育器中在8% CO2 下在生長於293 FreeStyleTM (ThermoFisher)培養基中之293F細胞中實施ChAdV68病毒產生。在感染當天，將細胞稀釋至106 個細胞/mL，活力為98%，且將400 mL用於1L搖瓶(Corning)中之每一產生運行。將4 mL之目標MOI ＞3.3之三級病毒原液用於每次感染。將細胞培育48-72h直至活力＜70%，如藉由台盼藍(Trypan blue)所量測。然後藉由離心(全速臺式離心機)收穫受感染細胞且在1×PBS中洗滌，再離心且然後重懸浮於20 mL 10mM Tris pH7.4中。藉由冷凍解凍3×溶解細胞沉降物且藉由在4,300×g下離心5分鐘澄清。藉由 CsCl 離心純化
藉由CsCl離心來純化病毒DNA。實施兩次不連續梯度運行。首先自細胞組分純化病毒，且然後進一步自細胞組分精細分離並將缺陷性與感染性粒子分開。
將10 mL 1.2 (26.8g CsCl溶解於92 mL 10 mM Tris pH 8.0中) CsCl添加至聚異質同晶體管。然後使用吸量管遞送至管底部小心地添加8 mL 1.4 CsCl (53g CsCl溶解於87 mL 10 mM Tris pH 8.0中)。澄清病毒小心地在1.2層之頂部分層。若需要，再添加10 mM Tris以平衡管。然後將管置於SW-32Ti轉子中且在10℃下離心2h 30 min。然後將管取出至層流櫃且使用18號針及10 mL注射器拉下病毒條帶。注意不要去除污染的宿主細胞DNA及蛋白質。然後用10 mM Tris pH 8.0將條帶稀釋至少2×且如前在如上文所述之不連續梯度上分層。如前文所述實施允許，只是此次將運行實施過夜。第二天小心地拉下條帶以避免拉下任一缺陷性粒子條帶。然後使用Slide-a-LyzerTM 盒(Pierce)針對ARM緩衝液(20 mM Tris pH 8.0、25 mM NaCl、2.5%甘油)透析病毒。將此實施3×，每1h更換緩衝液。然後將病毒等分儲存在-80℃下。病毒分析
藉由使用OD 260分析基於等效於OD260 nm下之吸光度值1之1.1× 1012 個病毒粒子(VP)之消光係數來實施VP濃縮。在病毒溶解緩衝液(0.1% SDS、10 mM Tris pH 7.4、1mM EDTA)中製備腺病毒之兩種稀釋(1:5及1:10)。在兩種稀釋下以一式兩份量測OD且藉由用OD260值 × 稀釋因子 × 1.1× 1012 VP來量測VP濃縮/ mL。
藉由限制病毒原液之稀釋分析來計算感染單位(IU)效價。首先將病毒於DMEM/5% NS/ 1× PS中稀釋100×且然後隨後使用10倍稀釋稀釋至1× 10-7 。然後將100 µL之該等稀釋添加至之前至少1小時以24孔板之3e5個細胞/孔接種之293A細胞。將此以一式兩份實施。將板在CO2 (5%)培育器中在37℃下培育48h。然後用1×PBS洗滌細胞且然後用100%冷甲醇(-20℃)固定。然後將板在-20℃下培育最短20分鐘。用1×PBS洗滌各孔，然後在室溫下在1×PBS/0.1% BSA中封阻1 h。在封阻緩衝液(0.25 ml/孔)中以1:8,000稀釋添加兔抗Ad抗體(Abcam, Cambridge, MA)且在室溫下培育1 h。用0.5 mL PBS/孔將孔洗滌4×。向每孔添加以1000×稀釋之HRP結合之Goat抗兔抗體(Bethyl Labs, Montgomery Texas)且培育1h，然後進行最後一輪洗滌。實施5次PBS洗滌且使用含0.01% H2 O2 之Tris緩衝鹽水(0.67 mg/mL DAB於50 mM Tris pH 7.5中、150 mM NaCl)中之DAB (二胺基聯苯胺四鹽酸鹽)受質使板顯影。使各孔顯影5 min，然後計數。在10×物鏡下使用給出每視野4-40個之間之染色細胞之稀釋對細胞計數。所用視野係0.32 mm2 之網格，其在24孔板上等效於每視野625個。感染病毒數/ mL可藉由每網格之染色細胞數乘以每視野之網格數乘以稀釋因子10來確定。類似地，當使用GFP表現細胞工作時，可利用螢光而非衣殼染色來確定每mL之GFP表現病毒粒子數。免疫
向C57BL/6J雌性小鼠及Balb/c雌性小鼠注射100 uL體積之ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體之1×108 個病毒粒子(VP)，雙側肌內注射(50 uL/腿)。脾細胞解離
將每一小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI (RPMI、10% FBS、青黴素/鏈黴素)中。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)遵循製造商之方案實施機械性解離。將經解離細胞透過40微米過濾器進行過濾，並用ACK溶解緩衝液(150mM NH4 Cl、10mM KHCO3 、0.1mM Na2 EDTA)溶解紅血球。該等細胞再經30微米過濾器過濾且然後再懸浮於完全RPMI中。該等細胞在Attune NxT流式細胞計數器(Thermo Fisher)上使用碘化丙啶(propidium iodide)染色進行細胞計數以排除死細胞及凋亡細胞。然後將該等細胞調整至適當濃度之活細胞用於後續分析。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析
根據ELISPOT協調指導{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}使用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)實施ELISPOT分析。將5×104 個脾細胞與10uM所指示肽在96孔IFNg抗體塗覆之板中一起培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯影。將反應定時10分鐘且藉由將板在自來水下流動以終止反應。使用AID vSpot光譜讀取器進行斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和＞50%之孔記錄為「太多以致於難以計數」。重複孔之偏差＞ 10%之樣品排除分析。然後使用下式針對孔鋪滿來校正斑點計數：斑點計數+ 2 × (斑點計數 × 鋪滿%/[100% - 鋪滿%])。藉由自抗原刺激孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多以致於難以計數之孔設定為觀察到之最高校正值，捨進至最近百位數。XV.B.2. 在 DNA 轉染後產生 ChAdV68 病毒遞送粒子
在一個實例中，將ChAdV68.4WTnt.GFP (圖21)及ChAdV 68.5WTnt.GFP (圖22) DNA轉染至HEK293A細胞中且在轉染後7-10天觀察到病毒複製(病毒蝕斑)。使用光學(圖21A及22A)及螢光顯微術(圖21 B-C及圖22 B-C)使ChAdV68病毒蝕斑可視化。GFP表示產生性ChAdV68病毒遞送粒子產生。XV.B.3. ChAdV68 病毒遞送粒子擴增
在一個實例中，使ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5 WTnt.GFP及ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體病毒在HEK293F細胞中擴增且在轉染後18天產生經純化之病毒原液(圖23)。在經純化之ChAdV68病毒原液中量化病毒粒子且與使用相同方案產生之5型腺病毒(Ad5)及ChAdVY25 (密切相關之ChAdV; Dicks, 2012, PloS ONE 7, e40385)病毒原液比較。ChAdV68病毒效價與Ad5及ChAdVY25相當(表7)。表 7. 293F懸浮液細胞中之腺病毒載體產生 *SD僅在已實施多個產生運行時報告XV.B.4. 腫瘤模型中之免疫原性之評估
在小鼠免疫原性研究中評估C68載體表現小鼠腫瘤抗原以證實C68載體引發T細胞反應。在C57BL/6J雌性小鼠中量測針對I類MHC表位SIINFEKL之T細胞反應且在Balb/c小鼠中量測針對I類MHC表位AH1-A5之T細胞反應(Slansky等人，2000, Immunity13:529-538)。如圖29中所顯示，在用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體免疫小鼠後量測到強T細胞反應。在用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體分別免疫C57BL/6J或Balb/c小鼠時，在免疫後10天，在ELISpot分析中觀察到8957或4019個斑點形成細胞(SFC)/106 個脾細胞之平均細胞免疫反應。XVI. 阿爾法病毒新抗原盒遞送載體 XVI.A. 阿爾法病毒遞送載體評估材料及方法 活體外轉錄以產生 RNA
對於活體外測試 ：藉由用PmeI限制性消化將質體DNA線性化，遵循製造商之方案(GeneJet DNA清潔套組, Thermo)管柱純化且用作模板。使用RiboMAX大規模RNA產生系統(Promega)及m7 G帽類似物(Promega)根據製造商之方案實施活體外轉錄。使用RNeasy套組(Qiagen)根據製造商之方案純化mRNA。
對於活體內研究 ：藉由TriLInk Biotechnologies產生及純化RNA且用酶Cap1封端。RNA 之轉染
在轉染前約16小時，將HEK293A細胞以96孔之6e4個細胞/孔及24孔之2e5細胞/孔接種。使用MessengerMAX lipofectamine (Invitrogen)且遵循製造商之方案用mRNA轉染細胞。對於96孔，使用每孔0.15 uL lipofectamine及10 ng mRNA，且對於24孔，使用每孔0.75 uL lipofectamine及150 ng mRNA。使用GFP表現mRNA (TriLink Biotechnologies)作為轉染對照。螢光素酶分析
在白壁96孔板中以每一條件一式三份使用ONE-Glo螢光素酶分析(Promega)遵循製造商之方案實施螢光素酶報導基因分析。使用SpectraMax量測發光。qRT-PCR
將經轉染細胞沖洗且在轉染後2小時更換為新鮮培養基以去除任何未經轉染之mRNA。然後在不同時間點在RLT plus溶解緩衝液(Qiagen)中收穫細胞，使用QiaShredder (Qiagen)均質化且使用RNeasy套組(Qiagen)提取RNA，其皆根據製造商之方案。使用Nanodrop (Thermo Scientific)量化總RNA。使用Quantitect探針一步RT-PCR套組(Qiagen)在qTower3 (Analytik Jena)上根據製造商之方案使用20 ng總RNA/反應來實施qRT-PCR。對於每一探針以一式三份運行每一樣品。使用肌動蛋白或GusB作為參考基因。藉由IDT產生定製引子/探針(表8)。表 8. qPCR引子/探針 B16-OVA 腫瘤模型
向C57BL/6J小鼠之左下腹側注射105 個B16-OVA細胞/動物。在免疫之前允許腫瘤生長3天。CT26 腫瘤模型
向Balb/c小鼠之左下腹側注射106 個CT26細胞/動物。在免疫之前允許腫瘤生長7天。免疫
對於srRNA疫苗，向小鼠注射10 ug RNA，體積為100 uL，雙側肌內注射(50 uL/腿)。對於Ad5疫苗，向小鼠注射5×1010 個病毒粒子(VP)，體積為100 uL，雙側肌內注射(50 uL/腿)。向動物注射抗CTLA-4 (純系9D9, BioXcell)、抗PD-1 (純系RMP1-14, BioXcell)或抗IgG (純系MPC-11, BioXcell)，250 ug劑量，每週2次，經由腹膜內注射。活體內生物發光成像
在每一時間點經由腹膜內注射向小鼠注射150 mg/kg螢光素受質，且在注射後10-15分鐘使用IVIS活體內成像系統(PerkinElmer)量測生物發光。脾細胞解離
使每一小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI (RPMI、10% FBS、青黴素/鏈黴素)中。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)遵循製造商之方案實施機械解離。經40微米過濾器過濾解離的細胞且用ACK溶解緩衝液(150mM NH4 Cl、10mM KHCO3 、0.1mM Na2 EDTA)溶解紅血球。再經30微米過濾器過濾細胞且然後再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞計數器(Thermo Fisher)上使用碘化丙啶染色對細胞計數以排除死細胞及凋亡細胞。然後將細胞調整至適當濃度之活細胞用於後續分析。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析
根據ELISPOT協調指導{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}使用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)實施ELISPOT分析。將5×104 個脾細胞與10uM所指示肽在96孔IFNg抗體塗覆之板中一起培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯影。對反應定時10分鐘且藉由使板在自來水下運行來終止。使用AID vSpot讀取器光譜對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和＞50%之孔記錄為「太多以致於難以計數」。重複孔之偏差＞ 10%之樣品排除分析。然後使用下式針對孔鋪滿來校正斑點計數：斑點計數+ 2 × (斑點計數 × 鋪滿%/[100% - 鋪滿%])。藉由自抗原刺激孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多以致於難以計數之孔設定為觀察到之最高校正值，捨進至最近百位數。XVI.B. 阿爾法病毒載體 XVI.B.1. 阿爾法病毒載體活體外評估
在本發明之一個實施中，自基於委內瑞拉馬腦炎(VEE) (Kinney, 1986, Virology 152: 400-413)之自我複製RNA (srRNA)載體產生用於新抗原表現系統之RNA阿爾法病毒主鏈。在一個實例中，使編碼位於26S亞基因體啟動子3’端之VEE之結構蛋白的序列缺失(VEE序列7544至11,175缺失；基於Kinney等人1986編號；SEQ ID NO:6)且由抗原序列(SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:4)或螢光素酶報導基因(例如VEE-螢光素酶，SEQ ID NO:15)替代(圖24)。在活體外自srRNA DNA載體轉錄RNA，轉染至HEK293A細胞中，且量測螢光素酶報導基因表現。另外，轉染編碼螢光素酶之(非複製) mRNA用於比較。在比較23小時量測值對2小時量測值時，對於VEE-螢光素酶srRNA觀察到srRNA報導基因信號增加約30,000倍(表9)。相比之下，在相同時間段內mRNA報導基因展現信號增加＜ 10倍(表9)。表 9 . 螢光素酶自VEE自我複製載體之表現隨時間增加。用96孔中之10 ng之VEE-螢光素酶srRNA或10 ng之非複製螢光素酶mRNA (TriLink L-6307)/孔轉染HEK293A細胞。在轉染後之不同時間量測發光。螢光素酶表現報告為相對發光單位(RLU)。每一數據點係3個經轉染孔之平均值+/- SD。
在另一實例中，藉由利用定量反轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)量測螢光素酶編碼srRNA (VEE-螢光素酶)或編碼多表位盒之srRNA (VEE-MAG25聚體)轉染後之RNA含量直接確認srRNA之複製。對於VEE-螢光素酶srRNA觀察到RNA增加約150倍(表10)，同時對於VEE-MAG25聚體srRNA觀察到RNA增加30-50倍(表11)。該等數據確認VEE srRNA載體在轉染至細胞中時進行複製。表 10. VEE-螢光素酶srRNA轉染之細胞中RNA複製之直接量測。用VEE-螢光素酶srRNA (150 ng/孔，24孔)轉染HEK293A細胞且在轉染後之不同時間藉由qRT-PCR量化RNA含量。基於肌動蛋白參考基因將每一量測值正規化且呈現相對於2小時時間點之倍數變化。 表 11 . VEE-MAG25聚體srRNA轉染之細胞中RNA複製之直接量測。用VEE-MAG25聚體srRNA (150 ng/孔，24孔)轉染HEK293細胞且在轉染後之不同時間藉由qRT-PCR量化RNA含量。基於GusB參考基因將每一量測值正規化且呈現相對於2小時時間點之倍數變化。圖上之不同線代表2種不同的qPCR引子/探針集，其二者皆檢測srRNA之表位盒區域。 XVI.B.2. 阿爾法病毒載體活體內評估
在另一實例中，活體內評估VEE-螢光素酶報導基因表現。向小鼠注射10 ug囊封於脂質奈米粒子(MC3)中之VEE-螢光素酶srRNA且在注射後24小時及48小時以及7天及14天成像以確定生物發光信號。螢光素酶信號在注射後24小時檢測到且隨時間增加並在srRNA注射後7天出現峰值(圖25)。XVI.B.3. 阿爾法病毒載體腫瘤模型評估
在一個實施中，為確定VEE srRNA載體是否引導活體內抗原特異性免疫反應，產生表現2種不同I類MHC小鼠腫瘤表位SIINFEKL及AH1-A5 (Slansky等人，2000, Immunity 13:529-538)之VEE srRNA載體(VEE-UbAAY, SEQ ID NO:14)。SFL (SIINFEKL)表位係由B16-OVA黑色素瘤細胞系表現，且AH1-A5 (SPSYAYHQF；Slansky等人，2000, Immunity)表位誘導T細胞靶向由CT26結腸癌細胞系表現之相關表位(AH1/SPSYVYHQF；Huang等人，1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:9730-9735)。在一個實例中，對於活體內研究，藉由活體外轉錄使用T7聚合酶(TriLink Biotechnologies)產生VEE-UbAAY srRNA且將其囊封於脂質奈米粒子(MC3)中。
在用MC3調配之VEE-UbAAY srRNA免疫帶有B16-OVA腫瘤之小鼠後兩週觀察到靶向SFL之強抗原特異性T細胞反應。在一個實例中，在ELISpot分析中在用SFL肽刺激後量測3835個斑點形成細胞(SFC)/106 個脾細胞之中值(圖26A、表12)且1.8% (中值)之CD8 T細胞具有SFL抗原特異性，如藉由五聚體染色所量測(圖26B、表12)。在另一實例中，共投與抗CTLA-4單株抗體(mAb)與VEE srRNA疫苗使得總體T細胞反應適度增加，具有在ELISpot分析中量測之4794.5個SFC/106 個脾細胞之中值(圖26A、表12)。表 12 . 在帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠中在VEE srRNA免疫後14天ELISPOT及MHCI-五聚體染色分析之結果。 *注意， Vax 組中 6 號小鼠之結果因一式三份孔之間之高可變性而自分析排除。
在另一實施中，為模擬臨床方法，在B16-OVA及CT26小鼠腫瘤模型中實施異源初免/加強，其中首先用表現相同抗原盒之腺病毒載體(Ad5-UbAAY)免疫帶有腫瘤之小鼠，然後在Ad5-UbAAY初免後14天用VEE-UbAAY srRNA疫苗加強免疫。在一個實例中，藉由Ad5-UbAAY疫苗誘導抗原特異性免疫反應，產生在ELISpot分析中量測之7330 (中值)個SFC/106 個脾細胞(圖27A、表13)及如藉由五聚體染色量測之2.9% (中值)之靶向SFL抗原之CD8 T細胞(圖27C、表13)。在另一實例中，T細胞反應在B16-OVA模型中在VEE-UbAAY srRNA加強後維持2週，具有在ELISpot分析中量測之3960 (中值)個SFL特異性SFC/106 個脾細胞(圖27B、表13)及如藉由五聚體染色量測之3.1% (中值)之靶向SFL抗原之CD8 T細胞(圖27D、表13)。表 13 . 在用Ad5疫苗初免及srRNA加強進行異源初免/加強後B16-OVA小鼠之免疫監測。
在另一實施中，在CT26小鼠模型中在Ad5-UbAAY初免及VEE-UbAAY srRNA加強後觀察到類似結果。在一個實例中，在Ad5-UbAAY初免後(第14天)觀察到AH1抗原特異性反應，且平均值為在ELISpot分析中量測之5187個SFC/106 個脾細胞(圖28A、表14)及在VEE-UbAAY srRNA加強後(第28天)在ELISpot分析中量測之3799個SFC/106 個脾細胞(圖28B、表14)。表 14 . 在CT26腫瘤小鼠模型中在異源初免/加強後之免疫監測。 XVII. ChAdV/srRNA 組合腫瘤模型評估
在鼠類CT26腫瘤模型中評估使用ChAdV68及自我複製RNA (srRNA)之多個投藥方案。XVII.A ChAdV/srRNA 組合腫瘤模型評估方法及材料 腫瘤注射
向Balb/c小鼠注射CT26腫瘤細胞系。在腫瘤細胞注射後7天，將小鼠隨機化至不同研究臂(28-40隻小鼠/組)且開始治療。向Balb/c小鼠之左下腹側注射106 個CT26細胞/動物。在免疫之前允許腫瘤生長7天。研究臂詳細闡述於表15中。 表15 - ChAdV/srRNA組合腫瘤模型評估研究臂 免疫
對於srRNA疫苗，向小鼠注射10 ug VEE-MAG25聚體srRNA，體積為100 uL，雙側肌內注射(50 uL/腿)。對於C68疫苗，向小鼠注射ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體之1×1011 個病毒粒子(VP)，體積為100 uL，雙側肌內注射(50 uL/腿)。向動物注射抗PD-1 (純系RMP1-14, BioXcell)或抗IgG (純系MPC-11, BioXcell)，250 ug劑量，每週2次，經由腹膜內注射。脾細胞解離
使每一小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI (RPMI、10% FBS、青黴素/鏈黴素)中。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)遵循製造商之方案實施機械解離。經由40微米過濾器過濾解離的細胞且用ACK溶解緩衝液(150mM NH4 Cl、10mM KHCO3 、0.1mM Na2 EDTA)溶解紅血球。經由30微米過濾器再過濾細胞且然後重懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞計數器(Thermo Fisher)上使用碘化丙啶染色對細胞計數以排除死細胞及凋亡細胞。然後將細胞調整至活細胞之適當濃度用於後續分析。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析
根據ELISPOT協調指導{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}使用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)實施ELISPOT分析。將5×104 個脾細胞與10uM所指示肽在96孔IFNg抗體包覆之板中一起培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯影。對反應定時10分鐘且藉由使板在自來水下運行來終止。使用AID vSpot讀取器光譜對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和＞50%之孔記錄為「太多以致於難以計數」。自分析排除重複孔之偏差＞ 10%之樣品。然後針對孔鋪滿使用下式來校正斑點計數：斑點計數+ 2 × (斑點計數 × 鋪滿%/[100% - 鋪滿%])。藉由自抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多以致於難以計數之孔設定為觀察到之最高校正值，捨進至最近百位數。XVII.B CT26 腫瘤模型中之 ChAdV/srRNA 組合評估
在CT26小鼠腫瘤模型中評估ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體/VEE-MAG25聚體srRNA異源初免/加強或VEE-MAG25聚體srRNA同源初免/加強疫苗之免疫原性及效能。向Balb/c小鼠注射CT26腫瘤細胞系。在腫瘤細胞注射後7天，將小鼠隨機化至不同研究臂且開始治療。研究臂詳細闡述於表15中且更通常闡述於表16中。 表16 -初免/加強研究臂
在初免疫苗接種後14天收穫脾用於免疫監測。每週兩次進行腫瘤及體重量測且監測存活。在所有活性疫苗組中觀察到強免疫反應。
在初次免疫後14天分別用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體(ChAdV/組3)、ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體+抗PD-1 (ChAdV + PD-1/組4)、VEE-MAG25聚體srRNA (srRNA/組5及7組合之中值)或VEE-MAG25聚體srRNA +抗PD-1 (srRNA + PD-1/組6及8組合之中值)免疫之小鼠中，在ELISpot分析中觀察到10,630個、12,976個、3319個或3745個斑點形成細胞(SFC)/106 個脾細胞之中值細胞免疫反應(圖30及表17)。相比之下，疫苗對照(組1)或疫苗對照及抗PD-1 (組2)分別展現296個或285個SFC/106 個脾細胞之中值細胞免疫反應。 表17 - CT26腫瘤模型中之細胞免疫反應
與ELISpot數據一致，在初次免疫後14天分別用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體(ChAdV/組3)、ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體+抗PD-1 (ChAdV + PD-1/組4)、VEE-MAG25聚體srRNA (srRNA/組5及7組合之中值)或VEE-MAG25聚體srRNA +抗PD-1 (srRNA + PD-1/組6及8組合之中值)免疫之小鼠的細胞內細胞介素染色(ICS)分析中，5.6%、7.8%、1.8%或1.9%之CD8 T細胞(中值)展現抗原特異性反應(圖31及表18)。用疫苗對照或疫苗對照與抗PD-1之組合免疫之小鼠分別顯示0.2%及0.1%之抗原特異性CD8反應。 表18 - CT26腫瘤模型中之CD8 T細胞反應
在CT26結腸腫瘤模型中量測所有組之腫瘤生長且呈現直至開始治療後21天(注射CT-26腫瘤細胞後28天)之腫瘤生長。在開始治療後21天基於大腫瘤大小(＞2500 mm3 )將小鼠殺死；因此，僅呈現前21天以避免分析偏差。ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初免/VEE-MAG25聚體srRNA加強(組3)、ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初免/VEE-MAG25聚體srRNA加強+抗PD-1 (組4)、VEE-MAG25聚體srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體加強(組5)、VEE-MAG25聚體srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體加強+抗PD-1 (組6)、VEE-MAG25聚體srRNA初免/VEE-MAG25聚體srRNA加強(組7)及VEE-MAG25聚體srRNA初免/VEE-MAG25聚體srRNA加強+抗PD-1 (組8)的21天之平均腫瘤體積分別為1129 mm3 、848 mm3 、2142 mm3 、1418 mm3 、2198 mm3 及1606 mm3 (圖32及表19)。疫苗對照或疫苗對照與抗PD-1之組合之平均腫瘤體積分別為2361 mm3 或2067 mm3 。基於該等數據，使用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體/VEE-MAG25聚體srRNA (組3)、ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體/VEE-MAG25聚體srRNA +抗PD-1 (組4)、VEE-MAG25聚體srRNA/ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體+抗PD-1 (組6)及VEE-MAG25聚體srRNA/VEE-MAG25聚體srRNA +抗PD-1 (組8)之疫苗治療可降低21天之腫瘤生長，此顯著不同於對照(組1)。 表19 - 在CT26模型中量測之第21天之腫瘤大小
監測在CT-26腫瘤模型中在開始治療後(在注射CT-26腫瘤細胞後42天)持續35天之存活率。在用4個所測試組合對小鼠進行疫苗接種後觀察到改良之存活率。在疫苗接種後，使用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初免/VEE-MAG25聚體srRNA加強與抗PD-1之組合(組4；P＜0.0001相對於對照組1)、VEE-MAG25聚體srRNA初免/VEE-MAG25聚體srRNA加強與抗PD-1之組合(組8；P=0.0006相對於對照組1)、ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初免/VEE-MAG25聚體srRNA加強(組3；P=0.0003相對於對照組1)及VEE-MAG25聚體srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體加強與抗PD-1之組合(組6；P=0.0016相對於對照組1)，分別有64%、46%、41%及36%之小鼠存活(圖33及表20)。其餘治療組[VEE-MAG25聚體srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體加強(組5)、VEE-MAG25聚體srRNA初免/VEE-MAG25聚體srRNA加強(組7)及單獨抗PD-1 (組2)]之存活率並不顯著不同於對照組1 (≤14%) 。 表20 - CT26模型中之存活率
總之，ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體及VEE-MAG25聚體srRNA引發針對由疫苗編碼之小鼠腫瘤抗原之強T細胞反應。向帶有腫瘤之小鼠投與ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初免及VEE-MAG25聚體srRNA加強(共投與或不共投與抗PD-1、VEE-MAG25聚體srRNA初免及ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體加強與抗PD-1之組合)或投與作為同源初免加強免疫之VEE-MAG25聚體srRNA與抗PD-1之組合可改良存活率。XVIII. 非人類靈長類動物研究
在非人類靈長類動物(NHP)中評估使用ChAdV68及自我複製RNA (srRNA)之多種投藥方案。材料及方法
在每一NHP中肌內注射初免疫苗以起始研究(疫苗初免)。根據表中所概述及下文所匯總之組投與雙側注射/劑量。免疫
用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體之1×1012 個病毒粒子(5×1011 個病毒粒子/注射)、調配於LNP-1或LNP-2中之30 ug VEE-MAG25聚體srRNA、100 ug VEE-MAG25聚體srRNA或300 ug VEE-MAG25聚體srRNA雙側免疫Mamu-A*01印度恒河獼猴(Indian rhesus macaque)。在初免疫苗接種後之所指示時間下肌內投與30 ug、100 ug或300 ug VEE-MAG25聚體srRNA疫苗加強。免疫監測
在初免疫苗接種後之所指示時間下使用淋巴球分離培養基(LSM, MP Biomedicals)及LeucoSep分離管(Greiner Bio-One)分離PBMC且重懸浮於含有10% FBS及青黴素/鏈黴素之RPMI中。在Attune NxT流式細胞計數器(Thermo Fisher)上使用碘化丙啶染色對細胞計數以排除死細胞及凋亡細胞。然後將細胞調整至活細胞之適當濃度用於後續分析。對於研究中之每一猴，使用ELISpot或流式細胞術方法量測T細胞反應。藉由使用離體酶聯免疫斑點(ELISpot)分析量測細胞介素(例如IFN-γ)之誘導自PBMC監測針對在疫苗中編碼之6種不同恒河獼猴Mamu-A*01 I類表位之T細胞反應。根據ELISPOT協調指導{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}使用猴IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)實施ELISpot分析。將200,000個PBMC與10uM所指示肽在96孔IFNg抗體包覆之板中一起培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯影。對反應定時10分鐘且藉由使板在自來水下運行來終止。使用AID vSpot讀取器光譜對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和＞50%之孔記錄為「太多以致於難以計數」。自分析排除重複孔之偏差＞ 10%之樣品。然後針對孔鋪滿使用下式來校正斑點計數：斑點計數+ 2 × (斑點計數 × 鋪滿%/[100% - 鋪滿%])。藉由自抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多以致於難以計數之孔設定為觀察到之最高校正值，捨進至最近百位數。
藉由使用流式細胞術量測細胞內細胞介素(例如IFN-γ)之誘導自PBMC監測針對在疫苗中編碼之6種不同恒河獼猴Mamu-A*01 I類表位之特異性CD4及CD8 T細胞反應。兩種方法之結果指示，細胞介素係以針對表位之抗原特異性方式誘導。恒河獼猴中之免疫原性
此研究經設計以(a)評估作為同源初免/加強或異源初免/加強之VEE-MAG25聚體srRNA 30 µg及100 µg劑量與ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體之組合的免疫原性及初步安全性；(b)比較VEE-MAG25聚體srRNA在使用LNP1對LNP2之脂質奈米粒子中之免疫反應；(c)評估針對VEE-MAG25聚體srRNA及ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體免疫之T細胞反應之動力學。
在Mamu-A*01印度恒河獼猴中實施研究臂以證實免疫原性。在恒河獼猴中僅識別經選擇用於此研究中之抗原，具體而言具有Mamu-A*01 I類MHC單倍型之彼等。將Mamu-A*01印度恒河獼猴隨機化至不同的研究臂(6隻獼猴/組)，且雙側投與含有ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體或VEE-MAG25聚體srRNA載體編碼模型抗原之IM注射，該等抗原包括多個Mamu-A*01限制性表位。研究臂係如下文所述。
表21 ： 印度恒河獼猴中之非GLP免疫原性研究
在免疫之前及初次免疫後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週及第10週收集PBMC用於免疫監測。結果
在免疫之前及初次免疫後1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、9週及10週量測外周血單核細胞(PBMC)中針對6種不同Mamu-A*01限制性表位之抗原特異性細胞免疫反應。動物在第4週及第8週接受30 µg或100 µg劑量且與LNP1或LNP2一起調配之VEE-MAG25聚體srRNA之加強免疫，如表21中所述。繪製每一免疫監測時間點之針對所有6種表位之組合免疫反應(圖34A-D及表22-25)。
在初始VEE-MAG25聚體srRNA-LNP1(30 µg)初免免疫後1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、9週或10週，在使用170個、14個、15個、11個、7個、8個、14個、17個、12個SFC/106 個PBMC (6個表位組合)之所有量測下分別觀察到組合抗原特異性免疫反應(圖34A)。在初始VEE-MAG25聚體srRNA-LNP1(100 µg)初免免疫後1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、9週或10週，在使用108個、-3個、14個、1個、37個、4個、105個、17個、25個SFC/106 個PBMC (6個表位組合)之所有量測下分別觀察到組合抗原特異性免疫反應(圖34B)。在初始VEE-MAG25聚體srRNA-LNP2(100 µg)初免免疫後1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、9週或10週，在使用-17個、38個、14個、-2個、87個、21個、104個、129個、89個SFC/106 個PBMC (6個表位組合)之所有量測下分別觀察到組合抗原特異性免疫反應(圖34C)。負值係正規化至每一表位/動物之採血前值之結果。
在初始ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初免免疫後1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、9週或10週，在使用1218個、1784個、1866個、973個、1813個、747個、797個、1249個及547個SFC/106 個PBMC (6個表位組合)之所有量測下分別觀察到組合抗原特異性免疫反應(圖34D)。免疫反應顯示預期概況，且在初免免疫後約2-3週量測到峰值免疫反應，隨後在4週後免疫反應減少。在用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初次免疫後5週(即，在用VEE-MAG25聚體srRNA首次加強後1週)量測1813個SFC/106 個PBMC (6個表位組合)之組合抗原特異性細胞免疫反應。在用VEE-MAG25聚體srRNA首次加強後1週(第5週)量測之免疫反應與對ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初免免疫(第3週)量測之峰值免疫反應相當(圖34D)。在用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初次免疫後9週(即，在用VEE-MAG25聚體srRNA第二次加強後1週)分別量測1249個SFC/106 個PBMC (6個表位組合)之組合抗原特異性細胞免疫反應。在用VEE-MAG25聚體srRNA第二次加強後1週(第9週)量測之免疫反應比在即將加強免疫前量測之免疫反應高約2倍(圖34D)。
表22 ：VEE-MAG25聚體srRNA-LNP1(30 µg) (組1)之每一表位之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC ± SEM
表23 ：VEE-MAG25聚體srRNA-LNP1(100 µg) (組2)之每一表位之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC ± SEM
表24 ：VEE-MAG25聚體srRNA-LNP2(100 µg) (組3)之每一表位之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC ± SEM
表25 ：ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初免之每一表位之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC ± SEM 印度恒河獼猴中之非 GLP RNA 劑量範圍研究 ( 較高劑量 )
此研究經設計以(a)評估作為同源初免/加強或異源初免/加強之300 µg劑量之VEE-MAG25聚體srRNA與ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體之組合的免疫原性；(b)比較300 µg劑量之VEE-MAG25聚體srRNA在使用LNP1對LNP2之脂質奈米粒子中之免疫反應；及(c)評估針對VEE-MAG25聚體srRNA及ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體免疫之T細胞反應之動力學。
在Mamu-A*01印度恒河獼猴中實施研究臂以證實免疫原性。非人類靈長類動物物種(例如恒河猴)中之疫苗免疫原性係人類中疫苗功效之最優預測子。此外，在恒河獼猴中僅識別經選擇用於此研究中之抗原，具體而言具有Mamu-A*01 I類MHC單倍型之彼等。將Mamu-A*01印度恒河獼猴隨機化至不同研究臂(6隻獼猴/組)且雙側投與含有ChAdV68.5-WTnt.MAG25聚體或VEE-MAG25聚體srRNA編碼模型抗原之IM注射，該等抗原包括多個Mamu-A*01限制性抗原。研究臂係如下文所述。
在免疫之前及初次免疫後4週、5週、6週、7週、8週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、21週、22週、23週或24週收集PBMC用於組1 (異源初免/加強)之免疫監測。在免疫之前及初次免疫後4週、5週、6週、7週、8週、10週、11週、12週、13週、14週或15週收集PBMC用於組2及3 (同源初免/加強)之免疫監測。
表26 ： 印度恒河獼猴中之非GLP免疫原性研究 結果
用ChAdV68.5-WTnt.MAG25聚體免疫Mamu-A*01印度恒河獼猴。在在免疫之前及初次免疫後4週、5週、6週、7週、8週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、21週、22週、23週或24週量測外周血單核細胞(PBMC)中針對6種不同Mamu-A*01限制性表位之抗原特異性細胞免疫反應(圖35及表27)。動物在第4、12及20週接受使用LNP2調配物之VEE-MAG25聚體srRNA之加強免疫。在用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體初次免疫後4週、5週、6週、7週、8週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、21週、22週、23週或24週，量測1750個、4225個、1100個、2529個、3218個、1915個、1708個、1561個、5077個、4543個、4920個、5820個、3395個、2728個、1996個、1465個、4730個、2984個、2828個或3043個SFC/106 個PBMC (6個表位組合)之組合抗原特異性免疫反應(圖35)。在用VEE-MAG25聚體srRNA第二次加強免疫後1週(第13週)量測之免疫反應比即將加強免疫之前(第12週)量測之免疫反應高約3倍。在用VEE-MAG25聚體srRNA第三次加強免疫後1週(第21週)量測之免疫反應比即將加強免疫之前(第20週)量測之免疫反應高約3倍，類似於對第二次加強觀察到之反應。
亦用VEE-MAG25聚體srRNA使用兩種不同的LNP調配物(LNP1及LNP2)來免疫Mamu-A*01印度恒河獼猴。在免疫之前及初次免疫後4週、5週、6週、7週、8週、10週、11週、12週、13週、14週或15週，量測外周血單核細胞(PBMC)中針對6種不同Mamu-A*01限制性表位之抗原特異性細胞免疫反應(圖36及37、表28及29)。動物在第4及12週接受使用各別LNP1或LNP2調配物之VEE-MAG25聚體srRNA之加強免疫。在用VEE-MAG25聚體srRNA-LNP2免疫後4週、5週、6週、7週、8週、10週、11週、13週、14週、15週，量測168個、204個、103個、126個、140個、145個、330個、203個及162個SFC/106 個PBMC (6個表位組合)之組合抗原特異性免疫反應(圖36)。在用VEE-MAG25聚體srRNA-LNP1免疫後4週、5週、6週、7週、8週、10週、11週、12週、13週、14週、15週，量測189個、185個、349個、437個、492個、570個、233個、886個、369個及381個SFC/106 個PBMC (6個表位組合)之組合抗原特異性免疫反應(圖37)。
表27 ： 用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體(組1)初免疫苗接種之每一表位之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC ± SEM
表28 ： 用VEE-MAG25聚體srRNA-LNP2 (300 µg) (組2)初免疫苗接種之每一表位之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC ± SEM
表29 ： 用VEE-MAG25聚體srRNA-LNP1 (300 µg) (組3)初免疫苗接種之每一表位之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC ± SEM srRNA 劑量範圍研究
在本發明之一個實施中，可在mamu A01印度恒河獼猴中實施srRNA劑量範圍研究以鑑別進展至NHP免疫原性研究之srRNA劑量。在一個實例中，可藉由IM注射向Mamu A01印度恒河獼猴投與包括多個mamu A01限制性表位之srRNA載體編碼模型抗原。在另一實例中，在一組動物中可將抗CTLA-4單株抗體SC投與靠近IM疫苗注射位點處以靶向疫苗引流淋巴結。可在初始疫苗接種後每2週收集PBMC用於免疫監測。研究臂闡述於下文中(表30)。表 30 ： 印度恒河獼猴中之非GLP RNA劑量範圍研究 * srRNA之劑量範圍欲使用高劑量≤300 μg測定。印度恒河獼猴中之免疫原性研究
在本發明之一個實施中，可在mamu A01印度恒河獼猴中實施疫苗研究以證實免疫原性。在一個實例中，可向Mamu A01印度恒河獼猴投與含有ChAdV及/或srRNA載體編碼模型抗原之IM注射，該等抗原包括多種mamu A01限制性抗原。在另一實例中，將抗CTLA-4單株抗體SC投與一些組之靠近IM疫苗注射位點處。可在初始疫苗接種後每2週收集PBMC用於免疫監測。研究臂闡述於下文中(表31)。表 31 ： 印度恒河獼猴中之非GLP免疫原性研究 *srRNA劑量欲基於srRNA劑量範圍研究測定。XIX. MHC/ 肽靶標反應性 T 細胞及 TCR 之鑑別
可自患者之血液、淋巴結或腫瘤分離T細胞。可例如藉由分選抗原-MHC四聚體結合細胞或藉由分選在T細胞及抗原脈衝處理之抗原呈遞細胞之活體外共培養物中刺激之活化細胞針對抗原特異性T細胞富集T細胞。用於抗原特異性T細胞鑑別之多種試劑為業內已知，包括抗原負載之四聚體及其他基於MHC之試劑。
可藉由抗原特異性T細胞之TCR之單細胞測序來鑑別抗原相關α-β (或γ-δ) TCR二聚體。或者，可實施抗原特異性T細胞之批量TCR測序且可使用業內已知之TCR配對方法確定具有高匹配機率之α-β對。
或者或另外，可經由健康供體之初始T細胞之活體外初免來獲得抗原特異性T細胞。可藉由抗原脈衝處理之抗原呈遞細胞重複刺激自PBMC、淋巴結或臍帶血獲得之T細胞以引發經歷過抗原之T細胞之分化。然後可以與上文針對患者之抗原特異性T細胞所述類似之方式鑑別TCR。某些序列
載體、盒及抗體之序列顯示於下文中。 泛素(SEQ ID NO:38) ＞UbG76 0-228 ATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACCGGCAAGACCATCACCCTAGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAACGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAAGAGGGCATCCCCCCTGACCAGCAGAGGCTGATCTTTGCCGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACCCTCTCTGATTACAACATCCAGAAGGAGTCAACCCTGCACCTGGTCCTTCGCCTGAGAGGTGGC 泛素A76 (SEQ ID NO:39) ＞UbA76 0-228 ATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACCGGCAAGACCATCACCCTAGAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAGAACGTGAAGGCCAAGATCCAGGATAAAGAGGGCATCCCCCCTGACCAGCAGAGGCTGATCTTTGCCGGCAAGCAGCTGGAAGATGGCCGCACCCTCTCTGATTACAACATCCAGAAGGAGTCAACCCTGCACCTGGTCCTTCGCCTGAGAGGTGCC HLA-A2 (I類MHC)信號肽(SEQ ID NO:40) ＞MHC信號肽0-78 atggccgtcatggcgccccgaaccctcgtcctgctactctcgggggctctggccctgacccagacctgggcgggctct HLA-A2 (I類MHC)跨膜域(SEQ ID NO:41) ＞HLA A2 TM域0-201 CCGtcttcccagcccaccatccCCATCGTGGGCAtcattgctggcctggttctctttggagctgtgatcactggagctgtggtcgctgctgtgatgtggaggaggaagagctcagatagaaaaggagggagctactctcaggctgcaagcagtgacagtgcccagggctctgatgtgtctctcacagcttgtaaagtgtga IgK前導序列(SEQ ID NO:42) ＞IgK前導序列0-60 atggagaccgatacactgctgctgtgggtgctgctcctgtgggtgccaggaagcacaggc 人類DC-Lamp (SEQ ID NO:43) ＞人類DCLAMP 0-3178 ggcaccgattcggggcctgcccggacttcgccgcacgctgcagaacctcgcccagcgcccaccatgccccggcagctcagcgcggcggccgcgctcttcgcgtccctggccgtaattttgcacgatggcagtcaaatgagagcaaaagcatttccagaaaccagagattattctcaacctactgcagcagcaacagtacaggacataaaaaaacctgtccagcaaccagctaagcaagcacctcaccaaactttagcagcaagattcatggatggtcatatcacctttcaaacagcggccacagtaaaaattccaacaactaccccagcaactacaaaaaacactgcaaccaccagcccaattacctacaccctggtcacaacccaggccacacccaacaactcacacacagctcctccagttactgaagttacagtcggccctagcttagccccttattcactgccacccaccatcaccccaccagctcatacagctggaaccagttcatcaaccgtcagccacacaactgggaacaccactcaacccagtaaccagaccacccttccagcaactttatcgatagcactgcacaaaagcacaaccggtcagaagcctgatcaacccacccatgccccaggaacaacggcagctgcccacaataccacccgcacagctgcacctgcctccacggttcctgggcccacccttgcacctcagccatcgtcagtcaagactggaatttatcaggttctaaacggaagcagactctgtataaaagcagagatggggatacagctgattgttcaagacaaggagtcggttttttcacctcggagatacttcaacatcgaccccaacgcaacgcaagcctctgggaactgtggcacccgaaaatccaaccttctgttgaattttcagggcggatttgtgaatctcacatttaccaaggatgaagaatcatattatatcagtgaagtgggagcctatttgaccgtctcagatccagagacagtttaccaaggaatcaaacatgcggtggtgatgttccagacagcagtcgggcattccttcaagtgcgtgagtgaacagagcctccagttgtcagcccacctgcaggtgaaaacaaccgatgtccaacttcaagcctttgattttgaagatgaccactttggaaatgtggatgagtgctcgtctgactacacaattgtgcttcctgtgattggggccatcgtggttggtctctgccttatgggtatgggtgtctataaaatccgcctaaggtgtcaatcatctggataccagagaatctaattgttgcccggggggaatgaaaataatggaatttagagaactctttcatcccttccaggatggatgttgggaaattccctcagagtgtgggtccttcaaacaatgtaaaccaccatcttctattcaaatgaagtgagtcatgtgtgatttaagttcaggcagcacatcaatttctaaatactttttgtttattttatgaaagatatagtgagctgtttattttctagtttcctttagaatattttagccactcaaagtcaacatttgagatatgttgaattaacataatatatgtaaagtagaataagccttcaaattataaaccaagggtcaattgtaactaatactactgtgtgtgcattgaagattttattttacccttgatcttaacaaagcctttgctttgttatcaaatggactttcagtgcttttactatctgtgttttatggtttcatgtaacatacatattcctggtgtagcacttaactccttttccactttaaatttgtttttgttttttgagacggagtttcactcttgtcacccaggctggagtacagtggcacgatctcggcttatggcaacctccgcctcccgggttcaagtgattctcctgcttcagcttcccgagtagctgggattacaggcacacactaccacgcctggctaatttttgtatttttattatagacgggtttcaccatgttggccagactggtcttgaactcttgacctcaggtgatccacccacctcagcctcccaaagtgctgggattacaggcatgagccattgcgcccggccttaaatgttttttttaatcatcaaaaagaacaacatatctcaggttgtctaagtgtttttatgtaaaaccaacaaaaagaacaaatcagcttatattttttatcttgatgactcctgctccagaattgctagactaagaattaggtggctacagatggtagaactaaacaataagcaagagacaataataatggcccttaattattaacaaagtgccagagtctaggctaagcactttatctatatctcatttcattctcacaacttataagtgaatgagtaaactgagacttaagggaactgaatcacttaaatgtcacctggctaactgatggcagagccagagcttgaattcatgttggtctgacatcaaggtctttggtcttctccctacaccaagttacctacaagaacaatgacaccacactctgcctgaaggctcacacctcataccagcatacgctcaccttacagggaaatgggtttatccaggatcatgagacattagggtagatgaaaggagagctttgcagataacaaaatagcctatccttaataaatcctccactctctggaaggagactgaggggctttgtaaaacattagtcagttgctcatttttatgggattgcttagctgggctgtaaagatgaaggcatcaaataaactcaaagtatttttaaatttttttgataatagagaaacttcgctaaccaactgttctttcttgagtgtatagccccatcttgtggtaacttgctgcttctgcacttcatatccatatttcctattgttcactttattctgtagagcagcctgccaagaattttatttctgctgttttttttgctgctaaagaaaggaactaagtcaggatgttaacagaaaagtccacataaccctagaattcttagtcaaggaataattcaagtcagcctagagaccatgttgactttcctcatgtgtttccttatgactcagtaagttggcaaggtcctgactttagtcttaataaaacattgaattgtagtaaaggtttttgcaataaaaacttactttgg 小鼠LAMP1 (SEQ ID NO:44) ＞小鼠Lamp1 0-1858 attccggaggtgaaaaacaatggcacaacgtgtataatggccagcttctctgcctcctttctgaccacctacgagactgcgaatggttctcagatcgtgaacatttccctgccagcctctgcagaagtactgaaaaatggcagttcttgtggtaaagaaaatgtttctgaccccagcctcacaattacttttggaagaggatatttactgacactcaacttcacaaaaaatacaacacgttacagtgtccagcatatgtattttacatataacttgtcagatacagaacattttcccaatgccatcagcaaagagatctacaccatggattccacaactgacatcaaggcagacatcaacaaagcataccggtgtgtcagtgatatccgggtctacatgaagaatgtgaccgttgtgctccgggatgccactatccaggcctacctgtcgagtggcaacttcagcaaggaagagacacactgcacacaggatggaccttccccaaccactgggccacccagcccctcaccaccacttgtgcccacaaaccccactgtatccaagtacaatgttactggtaacaacggaacctgcctgctggcctctatggcactgcaactgaatatcacctacctgaaaaaggacaacaagacggtgaccagagcgttcaacatcagcccaaatgacacatctagtgggagttgcggtatcaacttggtgaccctgaaagtggagaacaagaacagagccctggaattgcagtttgggatgaatgccagctctagcctgtttttcttgcaaggagtgcgcttgaatatgactcttcctgatgccctagtgcccacattcagcatctccaaccattcactgaaagctcttcaggccactgtgggaaactcatacaagtgcaacactgaggaacacatctttgtcagcaagatgctctccctcaatgtcttcagtgtgcaggtccaggctttcaaggtggacagtgacaggtttgggtctgtggaagagtgtgttcaggatggtaacaacatgttgatccccattgctgtgggcggtgccctggcagggctgatcctcatcgtcctcattgcctacctcattggcaggaagaggagtcacgccggctatcagaccatctagcctggtgggcaggtgcaccagagatgcacaggggcctgttctcacatccccaagcttagataggtgtggaagggaggcacactttctggcaaactgttttaaaatctgctttatcaaatgtgaagttcatcttgcaacatttactatgcacaaaggaataactattgaaatgacggtgttaattttgctaactgggttaaatattgatgagaaggctccactgatttgacttttaagacttggtgtttggttcttcattcttttactcagatttaagcctatcaaagggatactctggtccagaccttggcctggcaagggtggctgatggttaggctgcacacacttaagaagcaacgggagcagggaaggcttgcacacaggcacgcacagggtcaacctctggacacttggcttgggctacctggccttgggggggctgaactctggcatctggctgggtacacacccccccaatttctgtgctctgccacccgtgagctgccactttcctaaatagaaaatggcattatttttatttacttttttgtaaagtgatttccagtcttgtgttggcgttcagggtggccctgtctctgcactgtgtacaataatagattcacactgctgacgtgtcttgcagcgtaggtgggttgtacactgggcatcagctcacgtaatgcattgcctgtaacgatgctaataaaaa 人類Lamp1 cDNA (SEQ ID NO:45) ＞人類Lamp1 0-2339 ggcccaaccgccgcccgcgcccccgctctccgcaccgtacccggccgcctcgcgccatggcggcccccggcagcgcccggcgacccctgctgctgctactgctgttgctgctgctcggcctcatgcattgtgcgtcagcagcaatgtttatggtgaaaaatggcaacgggaccgcgtgcataatggccaacttctctgctgccttctcagtgaactacgacaccaagagtggccctaagaacatgacctttgacctgccatcagatgccacagtggtgctcaaccgcagctcctgtggaaaagagaacacttctgaccccagtctcgtgattgcttttggaagaggacatacactcactctcaatttcacgagaaatgcaacacgttacagcgtccagctcatgagttttgtttataacttgtcagacacacaccttttccccaatgcgagctccaaagaaatcaagactgtggaatctataactgacatcagggcagatatagataaaaaatacagatgtgttagtggcacccaggtccacatgaacaacgtgaccgtaacgctccatgatgccaccatccaggcgtacctttccaacagcagcttcagcaggggagagacacgctgtgaacaagacaggccttccccaaccacagcgccccctgcgccacccagcccctcgccctcacccgtgcccaagagcccctctgtggacaagtacaacgtgagcggcaccaacgggacctgcctgctggccagcatggggctgcagctgaacctcacctatgagaggaaggacaacacgacggtgacaaggcttctcaacatcaaccccaacaagacctcggccagcgggagctgcggcgcccacctggtgactctggagctgcacagcgagggcaccaccgtcctgctcttccagttcgggatgaatgcaagttctagccggtttttcctacaaggaatccagttgaatacaattcttcctgacgccagagaccctgcctttaaagctgccaacggctccctgcgagcgctgcaggccacagtcggcaattcctacaagtgcaacgcggaggagcacgtccgtgtcacgaaggcgttttcagtcaatatattcaaagtgtgggtccaggctttcaaggtggaaggtggccagtttggctctgtggaggagtgtctgctggacgagaacagcatgctgatccccatcgctgtgggtggtgccctggcggggctggtcctcatcgtcctcatcgcctacctcgtcggcaggaagaggagtcacgcaggctaccagactatctagcctggtgcacgcaggcacagcagctgcaggggcctctgttcctttctctgggcttagggtcctgtcgaaggggaggcacactttctggcaaacgtttctcaaatctgcttcatccaatgtgaagttcatcttgcagcatttactatgcacaacagagtaactatcgaaatgacggtgttaattttgctaactgggttaaatattttgctaactggttaaacattaatatttaccaaagtaggattttgagggtgggggtgctctctctgagggggtgggggtgccgctgtctctgaggggtgggggtgccgctgtctctgaggggtgggggtgccgctctctctgagggggtgggggtgccgctttctctgagggggtgggggtgccgctctctctgagggggtgggggtgctgctctctccgaggggtggaatgccgctgtctctgaggggtgggggtgccgctctaaattggctccatatcatttgagtttagggttctggtgtttggtttcttcattctttactgcactcagatttaagccttacaaagggaaagcctctggccgtcacacgtaggacgcatgaaggtcactcgtggtgaggctgacatgctcacacattacaacagtagagagggaaaatcctaagacagaggaactccagagatgagtgtctggagcgcttcagttcagctttaaaggccaggacgggccacacgtggctggcggcctcgttccagtggcggcacgtccttgggcgtctctaatgtctgcagctcaagggctggcacttttttaaatataaaaatgggtgttatttttatttttttttgtaaagtgatttttggtcttctgttgacattcggggtgatcctgttctgcgctgtgtacaatgtgagatcggtgcgttctcctgatgttttgccgtggcttggggattgtacacgggaccagctcacgtaatgcattgcctgtaacaatgtaataaaaagcctctttcttttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 破傷風類毒素核酸序列(SEQ ID NO:46) CAGTACATCAAGGCCAACAGCAAGTTCATCGGCATCACCGAACTC 破傷風類毒素胺基酸序列(SEQ ID NO:47) QYIKANSKFIGITEL PADRE核苷酸序列(SEQ ID NO:48) GCTAAATTTGTGGCTGCCTGGACACTGAAAGCCGCCGCT PADRE胺基酸序列(SEQ ID NO:49) AKFVAAWTLKAAA WPRE (SEQ ID NO:50) ＞WPRE 0-593 aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctgt IRES (SEQ ID NO:51) ＞eGFP_IRES_SEAP_插入物1746-2335 tctcccccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatg GFP (SEQ ID NO:52) atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtag SEAP (SEQ ID NO:53) atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggcatcatcccagttgaggaggagaacccggacttctggaaccgcgaggcagccgaggccctgggtgccgccaagaagctgcagcctgcacagacagccgccaagaacctcatcatcttcctgggcgatgggatgggggtgtctacggtgacagctgccaggatcctaaaagggcagaagaaggacaaactggggcctgagatacccctggccatggaccgcttcccatatgtggctctgtccaagacatacaatgtagacaaacatgtgccagacagtggagccacagccacggcctacctgtgcggggtcaagggcaacttccagaccattggcttgagtgcagccgcccgctttaaccagtgcaacacgacacgcggcaacgaggtcatctccgtgatgaatcgggccaagaaagcagggaagtcagtgggagtggtaaccaccacacgagtgcagcacgcctcgccagccggcacctacgcccacacggtgaaccgcaactggtactcggacgccgacgtgcctgcctcggcccgccaggaggggtgccaggacatcgctacgcagctcatctccaacatggacattgacgtgatcctaggtggaggccgaaagtacatgtttcgcatgggaaccccagaccctgagtacccagatgactacagccaaggtgggaccaggctggacgggaagaatctggtgcaggaatggctggcgaagcgccagggtgcccggtatgtgtggaaccgcactgagctcatgcaggcttccctggacccgtctgtgacccatctcatgggtctctttgagcctggagacatgaaatacgagatccaccgagactccacactggacccctccctgatggagatgacagaggctgccctgcgcctgctgagcaggaacccccgcggcttcttcctcttcgtggagggtggtcgcatcgaccatggtcatcatgaaagcagggcttaccgggcactgactgagacgatcatgttcgacgacgccattgagagggcgggccagctcaccagcgaggaggacacgctgagcctcgtcactgccgaccactcccacgtcttctccttcggaggctaccccctgcgagggagctccatcttcgggctggcccctggcaaggcccgggacaggaaggcctacacggtcctcctatacggaaacggtccaggctatgtgctcaaggacggcgcccggccggatgttaccgagagcgagagcgggagccccgagtatcggcagcagtcagcagtgcccctggacgaagagacccacgcaggcgaggacgtggcggtgttcgcgcgcggcccgcaggcgcacctggttcacggcgtgcaggagcagaccttcatagcgcacgtcatggccttcgccgcctgcctggagccctacaccgcctgcgacctggcgccccccgccggcaccaccgacgccgcgcacccgggttactctagagtcggggcggccggccgcttcgagcagacatgataa 螢火蟲螢光素酶(SEQ ID NO:54) atggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaagcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcaaaagatcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccggcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggcagtaccggattgcccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatcatccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagcttcttcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgagatcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtgtaa 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A. 107, 16910-16915。 各個實施例 1. 本文揭示包含一種新抗原或複數種新抗原之病毒載體。在某些實施例中，新抗原係使用本文(例如下文)所揭示之方法來鑑別。在某些實施例中，新抗原具有至少一個如本文(例如下文)所揭示之特徵或性質。 2. 本文揭示自個體之腫瘤細胞鑑別一或多種可能呈遞於腫瘤細胞表面上之新抗原之方法，其包含以下步驟： 獲得個體腫瘤細胞之外顯子體、轉錄體或全基因體腫瘤核苷酸測序數據中之至少一者，其中使用腫瘤核苷酸測序數據來獲得代表新抗原集中每一者之肽序列之數據，且其中每一新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型親代肽序列之變化； 將每一新抗原之肽序列輸入一或多種呈遞模型中以產生每一新抗原由個體腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上之一或多個MHC對偶基因呈遞的數值似然度集，該數值似然度集已至少基於所接收之質譜數據鑑別；及 基於數值似然度集選擇新抗原集之子集以產生經選擇新抗原集。 3. 在某些實施例中，經選擇新抗原集之數量為20. 4. 在某些實施例中，呈遞模型代表以下之間之依賴性： MHC對偶基因中之特定一者及肽序列特定位置之特定胺基酸之對的存在；與 藉由該對之MHC對偶基因中之特定一者，該包含特定位置之特定胺基酸之肽序列呈遞於腫瘤細胞表面上的似然度。 5. 在某些實施例中，輸入肽序列包含： 將一或多種呈遞模型應用於相應新抗原之肽序列以產生一或多個MHC對偶基因中每一者之依賴性分數，其指示MHC對偶基因是否將基於至少相應新抗原之肽序列之胺基酸之位置來呈遞相應新抗原。 6. 在某些實施例中，該方法進一步包含： 轉換依賴性分數以產生每一MHC對偶基因之相應每一對偶基因似然度，其指示相應MHC對偶基因將呈遞相應新抗原之似然度；及 組合每一對偶基因似然度以產生數值似然度。 7. 在某些實施例中，轉換依賴性分數將相應新抗原之肽序列之呈遞建模為互斥。 8. 在某些實施例中，該方法進一步包含： 轉換依賴性分數之組合以產生數值似然度。 9. 在某些實施例中，轉換依賴性分數之組合將相應新抗原之肽序列之呈遞建模為MHC對偶基因之間之干擾。 10. 在某些實施例中，數值似然度集係進一步藉由至少一個對偶基因非相互作用特徵來鑑別，且進一步包含： 將一或多種呈遞模型之對偶基因非相互作用者應用於對偶基因非相互作用特徵以產生對偶基因非相互作用特徵之依賴性分數，其指示相應新抗原之肽序列是否將基於對偶基因非相互作用特徵來呈遞。 11. 在某些實施例中，該方法進一步包含： 組合一或多個MHC對偶基因中每一MHC對偶基因之依賴性分數與對偶基因非相互作用特徵之依賴性分數； 轉換每一MHC對偶基因之經組合依賴性分數以產生MHC對偶基因之相應每一對偶基因似然度，其指示相應MHC對偶基因將呈遞相應新抗原之似然度；及 組合每一對偶基因似然度以產生數值似然度。 12. 在某些實施例中，該方法進一步包含： 轉換每一MHC對偶基因之依賴性分數及對偶基因非相互作用特徵之依賴性分數的組合以產生數值似然度。 13. 在某些實施例中，呈遞模型之數值參數集係基於訓練數據集來訓練，該訓練數據集包括至少經鑑別存在於複數個樣品中之訓練肽序列集及一或多個與每一訓練肽序列相關之MHC對偶基因，其中訓練肽序列係經由自衍生自複數個樣品之MHC對偶基因溶析之分離肽上之質譜來鑑別。 14. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包括關於腫瘤細胞之mRNA表現量之數據。 15. 在某些實施例中，樣品包含經改造以表現單一I類或II類MHC對偶基因之細胞系。 16. 在某些實施例中，樣品包含經改造以表現複數個I類或II類MHC對偶基因之細胞系。 17. 在某些實施例中，樣品包含自複數個患者獲得或衍生之人類細胞系。 18. 在某些實施例中，樣品包含自複數個患者獲得之新鮮或冷凍腫瘤樣品。 19. 在某些實施例中，樣品包含自複數個患者獲得之新鮮或冷凍組織樣品。 20. 在某些實施例中，樣品包含利用T細胞分析鑑別之肽。 21. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與以下相關之數據： 存在於樣品中之訓練肽集之肽豐度； 樣品中訓練肽集之肽長度。 22. 在某些實施例中，訓練數據集係經由與包含已知蛋白質序列集之數據庫比對比較訓練肽序列集來產生，其中訓練蛋白質序列集長於且包括訓練肽序列。 23. 在某些實施例中，訓練數據集係基於對細胞系實施或已實施質譜以獲得細胞系之外顯子體、轉錄體或全基因體肽測序數據中之至少一者來產生，肽測序數據包括至少一個包括變化之蛋白質序列。 24. 在某些實施例中，訓練數據集係基於獲得正常組織樣品之外顯子體、轉錄體及全基因體正常核苷酸測序數據中之至少一者來產生。 25. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與樣品相關之蛋白質體序列相關之數據。 26. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與樣品相關之MHC肽體序列相關之數據。 27. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與至少一個分離肽之肽-MHC結合親和力量測值相關之數據。 28. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與至少一個分離肽之肽-MHC結合穩定性量測值相關之數據。 29. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與樣品相關之轉錄體相關之數據。 30. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與樣品相關之基因體相關之數據。 31. 在某些實施例中，訓練肽序列之長度在k聚體範圍內，其中k介於8-15之間且包括8及15。 32. 在某些實施例中，該方法進一步包含使用獨熱編碼方案編碼肽序列。 33. 在某些實施例中，方法進一步包含使用左填充獨熱編碼方案編碼訓練肽序列。 34. 本文亦揭示治療患有腫瘤之個體之方法，其包含實施本文所揭示方法之任一步驟，且進一步包含獲得包含經選擇新抗原集之腫瘤疫苗，及將腫瘤疫苗投與個體。 35. 本文亦揭示製造腫瘤疫苗之方法，其包含實施本文所揭示方法之任一步驟，且進一步包含產生或已產生包含經選擇新抗原集之腫瘤疫苗。 36. 本文亦揭示包含經選擇新抗原集之腫瘤疫苗，其係藉由實施本文所揭示之方法來選擇。 37. 在某些實施例中，腫瘤疫苗包含核苷酸序列、多肽序列、RNA、DNA、細胞、質體或載體中之一或多者。 38. 在某些實施例中，腫瘤疫苗包含一或多種呈遞於腫瘤細胞表面上之新抗原。 39. 在某些實施例中，腫瘤疫苗包含一或多種在個體中具有免疫原性之新抗原。 40. 在某些實施例中，腫瘤疫苗不包含一或多種在個體中誘導針對正常組織之自體免疫反應之新抗原。 41. 在某些實施例中，腫瘤疫苗進一步包含佐劑。 42. 在某些實施例中，腫瘤疫苗進一步包含賦形劑。 43. 在某些實施例中，選擇經選擇新抗原集包含基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加的呈遞於腫瘤細胞表面上之似然度的新抗原。 44. 在某些實施例中，選擇經選擇新抗原集包含基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加的能夠誘導個體中之腫瘤特異性免疫反應之似然度的新抗原。 45. 在某些實施例中，選擇經選擇新抗原集包含基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加的能夠藉由專業抗原呈遞細胞(APC)呈遞至初始T細胞之似然度的新抗原，視情況其中APC係樹突細胞(DC)。 46. 在某些實施例中，選擇經選擇新抗原集包含基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有減小的經歷經由中樞或周邊耐受性抑制之似然度的新抗原。 47. 在某些實施例中，選擇經選擇新抗原集包含基於呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有減小的能夠誘導個體中之針對正常組織之自體免疫反應之似然度的新抗原。 48. 在某些實施例中，外顯子體或轉錄體核苷酸測序數據係藉由對腫瘤組織實施測序來獲得。 49. 在某些實施例中，測序係次世代測序(NGS)或任一大量平行測序方法。 50. 在某些實施例中，數值似然度集係進一步藉由至少MHC-對偶基因相互作用特徵來鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者： a. MHC對偶基因及新抗原編碼肽結合之預測親和力。 b. 新抗原編碼之肽-MHC複合物之預測穩定性。 c. 新抗原編碼肽之序列及長度。 d. 具有相似序列之新抗原編碼肽在表現特定MHC對偶基因之其他個體之細胞中之呈遞機率，如藉由質譜蛋白質體學或其他方式所評價。 e. 特定MHC對偶基因在所討論個體中之表現量(例如如藉由RNA-seq或質譜所量測)。 f. 在表現特定MHC對偶基因之其他不同個體中藉由特定MHC對偶基因呈遞之總體新抗原編碼肽序列非依賴性機率。 g. 在其他不同個體中之同一家族分子(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)中藉由MHC對偶基因呈遞之總體新抗原編碼肽序列非依賴性機率。 51. 在某些實施例中，數值似然度集係進一步藉由至少MHC-對偶基因非相互作用特徵來鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者： a. 在其源蛋白序列內側接新抗原編碼肽之C端及N端序列。 b. 在新抗原編碼肽中存在蛋白酶裂解基序，視情況根據相應蛋白酶在腫瘤細胞中之表現(如藉由RNA-seq或質譜所量測)來加權。 c. 如在適宜細胞類型中量測之源蛋白之轉換率。 d. 源蛋白之長度，視情況考慮在腫瘤細胞中最高表現之特異性剪接變體(「異型體」)，如藉由RNA-seq或蛋白質體質譜所量測，或如根據在DNA或RNA序列數據中檢測到之生殖系或體細胞剪接突變之註解所預測。 e. 蛋白酶體、免疫蛋白酶體、胸腺蛋白酶體或其他蛋白酶在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質體質譜或免疫組織化學來量測)。 f. 新抗原編碼肽之源基因之表現(例如如藉由RNA-seq或質譜所量測)。 g. 新抗原編碼肽之源基因在細胞週期之各個階段期間之典型組織特異性表現。 h. 源蛋白及/或其結構域之特徵總目，如可參見例如uniProt或PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do。 i. 闡述含有肽之源蛋白之結構域性質之特徵，例如：二級或三級結構(例如α螺旋對β褶板)；選擇式剪接。 j. 所討論新抗原編碼肽之源蛋白之肽在其他不同個體中之呈遞機率。 k. 因技術偏差無法藉由質譜檢測到肽或該肽過表現之機率。 l. 如藉由RNASeq所量測之多個基因模組/路徑(其無需含有肽之源蛋白)之表現，其為腫瘤細胞、基質或腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之狀態之資訊。 m. 腫瘤細胞中新抗原編碼肽之源基因之拷貝數。 n. 肽結合至TAP之機率或肽與TAP之量測或預測之結合親和力。 o. TAP在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質體質譜、免疫組織化學來量測)。 p. 存在或不存在腫瘤突變，包括(但不限於)： i. 諸如EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3等已知癌症驅動基因中之驅動突變 ii. 在編碼參與抗原呈遞機制之蛋白質之基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、 CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體之組分之基因中的任一者)中。依賴於抗原呈遞機制之在腫瘤中經歷功能喪失型突變之組分呈遞之肽具有減小的呈遞機率。 q. 存在或不存在功能性生殖系多型性，包括(但不限於)： i. 在基因編碼參與抗原呈遞機制之蛋白質之基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體之組分之基因中的任一者)中 r. 腫瘤類型(例如NSCLC、黑色素瘤)。 s. 臨床腫瘤亞型(例如鱗狀肺癌對非鱗狀肺癌)。 t. 吸煙史。 u. 肽之源基因在相關腫瘤類型或臨床亞型中之典型表現，視情況藉由驅動突變分層。 52. 在某些實施例中，至少一個突變係框移或非框移插入/缺失、誤義或無義取代、剪接位點變化、基因體重排或基因融合或產生neoORF之任何基因體或表現變化。 53. 在某些實施例中，腫瘤細胞選自由以下組成之群：肺癌、黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病及T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。 54. 在某些實施例中，該方法進一步包含獲得包含經選擇新抗原集或其子集之腫瘤疫苗，視情況進一步包含將腫瘤疫苗投與個體。 55. 在某些實施例中，經選擇新抗原集中之至少一種新抗原當呈多肽形式時包含以下中之至少一者：與MHC之結合親和力之IC50值小於1000nM；對於1類MHC肽，長度為8-15個(8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個)胺基酸；在親代蛋白質序列中之多肽內或附近存在促進蛋白酶體裂解之序列基序；及存在促進TAP轉運之序列基序。 56. 本文亦揭示產生用於鑑別一或多種可能呈遞於腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上之新抗原之模型的方法，其包含執行以下步驟： 接收質譜數據，其包含與自衍生自複數個樣品之主要組織相容性複合體(MHC)溶析之複數個分離肽相關之數據； 藉由至少鑑別存在於樣品中之訓練肽序列集及一或多個與每一訓練肽序列相關之MHC來獲得訓練數據集； 使用包含訓練肽序列之訓練數據集訓練呈遞模型之數值參數集，呈遞模型提供腫瘤細胞之肽序列由腫瘤細胞表面上之一或多個MHC對偶基因呈遞之複數個數值似然度。 57. 在某些實施例中，呈遞模型代表以下之間之依賴性： 肽序列特定位置之特定胺基酸之存在；與 藉由腫瘤細胞上之MHC對偶基因中之一者，含有特定位置之特定胺基酸之肽序列之呈遞似然度。 58. 在某些實施例中，樣品包含經改造以表現單一I類或II類MHC對偶基因之細胞系。 59. 在某些實施例中，樣品包含經改造以表現複數個I類或II類MHC對偶基因之細胞系。 60. 在某些實施例中，樣品包含自複數個患者獲得或衍生之人類細胞系。 61. 在某些實施例中，樣品包含自複數個患者獲得之新鮮或冷凍腫瘤樣品。 62. 在某些實施例中，樣品包含利用T細胞分析鑑別之肽。 63. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與以下相關之數據： 存在於樣品中之訓練肽集之肽豐度； 樣品中訓練肽集之肽長度。 64. 在某些實施例中，獲得訓練數據集包含： 基於訓練肽序列經由與包含已知蛋白質序列集之數據庫比對比較訓練肽序列集來獲得訓練蛋白質序列集，其中訓練蛋白質序列集長於且包括訓練肽序列。 65. 在某些實施例中，獲得訓練數據集包含： 對細胞系實施或已實施質譜以獲得細胞系之外顯子體、轉錄體或全基因體核苷酸測序數據中之至少一者，核苷酸測序數據包括至少一個包括突變之蛋白質序列。 66. 在某些實施例中，訓練呈遞模型之參數集包含： 使用獨熱編碼方案編碼訓練肽序列。 67. 在某些實施例中，該方法進一步包含： 獲得正常組織樣品之外顯子體、轉錄體及全基因體正常核苷酸測序數據中之至少一者；及 使用正常核苷酸測序數據訓練呈遞模型之參數集。 68. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與樣品相關之蛋白質體序列相關之數據。 69. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與樣品相關之MHC肽體序列相關之數據。 70. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與至少一個分離肽之肽-MHC結合親和力量測值相關之數據。 71. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與至少一個分離肽之肽-MHC結合穩定性量測值相關之數據。 72. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與樣品相關之轉錄體相關之數據。 73. 在某些實施例中，訓練數據集進一步包含與樣品相關之基因體相關之數據。 74. 在某些實施例中，訓練數值參數集進一步包含： 使參數集邏輯迴歸。 75. 在某些實施例中，訓練肽序列之長度在k聚體範圍內，其中k介於8-15之間且包括8及15。 76. 在某些實施例中，訓練呈遞模型之數值參數集包含： 使用左填充獨熱編碼方案編碼訓練肽序列。 77. 在某些實施例中，訓練數值參數集進一步包含： 使用深度學習算法確定參數集之值。 78. 本文亦揭示產生用於鑑別一或多種可能呈遞於腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上之新抗原之模型的方法，其包含執行以下步驟： 接收質譜數據，其包含與自衍生自複數個新鮮或冷凍腫瘤樣品之主要組織相容性複合體(MHC)溶析之複數個分離肽相關之數據； 藉由至少鑑別存在於腫瘤樣品中且呈遞於一或多個與每一訓練肽序列相關之MHC對偶基因上之訓練肽序列集來獲得訓練數據集； 基於訓練肽序列獲得訓練蛋白質序列集；及 使用訓練蛋白質序列及訓練肽序列訓練呈遞模型之數值參數集，呈遞模型提供腫瘤細胞之肽序列由腫瘤細胞表面上之一或多個MHC對偶基因呈遞之複數個數值似然度。 79. 在某些實施例中，呈遞模型代表以下之間之依賴性： MHC對偶基因中之特定一者及肽序列特定位置之特定胺基酸之對的存在；及 藉由該對之MHC對偶基因中之特定一者，該包含特定位置之特定胺基酸之肽序列呈遞於腫瘤細胞表面上之似然度。
110‧‧‧患者
114‧‧‧候選新抗原序列
118‧‧‧疫苗
160‧‧‧呈遞鑑別系統
165‧‧‧呈遞資訊儲存區/呈遞資訊
170‧‧‧訓練數據儲存區/訓練數據
170A‧‧‧訓練數據
175‧‧‧呈遞模型儲存區
312‧‧‧數據管控模組
314‧‧‧編碼模組
316‧‧‧訓練模組
320‧‧‧預測模組
324‧‧‧盒設計模組
1400‧‧‧電腦
1402‧‧‧處理器
1404‧‧‧晶片集
1406‧‧‧記憶體
1408‧‧‧儲存裝置
1410‧‧‧鍵盤
1412‧‧‧圖形配接器
1414‧‧‧輸入裝置/輸入介面
1416‧‧‧網路配接器
1418‧‧‧顯示器
1420‧‧‧記憶體控制器集線器
1422‧‧‧輸入/輸出控制器集線器
參照以下描述及附圖將更好地理解本發明之該等及其他特徵、態樣及優點，其中：
圖(FIG.) 1A 顯示用於新抗原鑑別之當前臨床方法。
圖1B 顯示＜5%之經預測結合肽呈遞於腫瘤細胞上。
圖1C 顯示新抗原預測特異性問題之影響。
圖1D 顯示結合預測對於新抗原鑑別並不足夠。
圖1E 顯示MHC-I呈遞之機率隨肽長度之變化。
圖1F 顯示自Promega之動態範圍標準產生之實例肽光譜。
圖1G 顯示如何添加各特徵會增加模型陽性預測值。
圖2A 係根據實施例用於鑑別患者中之肽呈遞似然度之環境之概述。
圖2B 及圖 2C 圖解說明根據實施例獲得呈遞資訊之方法。
圖3 係圖解說明根據一個實施例呈遞鑑別系統之電腦邏輯組件之高階方塊圖。
圖4 圖解說明根據一個實施例之實例訓練數據集。
圖5 圖解說明與MHC對偶基因相關之實例網路模型。
圖6A 圖解說明根據一個實施例MHC對偶基因所共用之實例網路模型NNH(∙)。圖 6B 圖解說明根據另一實施例MHC對偶基因所共用之實例網路模型NNH (∙)。
圖7 圖解說明使用實例網路模型產生與MHC對偶基因相關之肽之呈遞似然度。
圖8 圖解說明使用實例網路模型產生與MHC對偶基因相關之肽之呈遞似然度。
圖9 圖解說明使用實例網路模型產生與MHC對偶基因相關之肽之呈遞似然度。
圖10 圖解說明使用實例網路模型產生與MHC對偶基因相關之肽之呈遞似然度。
圖11 圖解說明使用實例網路模型產生與MHC對偶基因相關之肽之呈遞似然度。
圖12 圖解說明使用實例網路模型產生與MHC對偶基因相關之肽之呈遞似然度。
圖13A 顯示藉由質譜比較多個肽呈遞模型測定之肽呈遞之性能結果。顯示每一對偶基因呈遞模型之最大值之結果，該呈遞模型顯示於使用仿射依賴性函數gh (∙)及expit函數f (∙)之等式(12)中且對HLA-A*02:01及HLA-B*07:02之質譜數據之子集(「MS」)進行訓練。亦顯示基於親和力預測NETMHCpan 「親和力」及基於穩定性預測NETMHCstab 「穩定性」之現有技術模型。數據顯示10%重新叫用率下之陽性預測值(PPV)，且誤差槓(如以實線所指示)顯示95%信賴區間。
圖13B 顯示根據T細胞表位比較多個肽呈遞模型測定之肽呈遞之性能結果。顯示每一對偶基因呈遞模型之最大值之結果，該呈遞模型顯示於使用仿射依賴性函數gh (∙)及expit函數f (∙)之等式(12)中且對HLA-A*02:01之質譜數據之子集進行訓練。亦顯示基於親和力預測NETMHCpan 「親和力」及基於穩定性預測NETMHCstab 「穩定性」之現有技術模型。數據顯示10%重新叫用率下之陽性預測值(PPV)，且誤差槓(如以實線所指示)顯示95%信賴區間。
圖13C 顯示藉由質譜測定之用於預測肽呈遞之實例相加函數模型(等式(13))、實例函數相加模型(等式(19))及實例二階模型(等式(23))之肽呈遞的性能結果。第一行係指在將每一呈遞模型應用於測試集時接受者操作特徵(ROC)之曲線下面積(AUC)，第二行係指負對數似然度損失之值，且第三行係指10%重新叫用率下之陽性預測值(PPV)。
圖13D 顯示藉由質譜測定之使用及不使用單一對偶基因質譜數據訓練之兩種實例性呈遞模型之肽呈遞的性能結果。第一行係指在將每一呈遞模型應用於測試集時接受者操作特徵(ROC)之曲線下面積(AUC)，第二行係指負對數似然度損失之值，且第三行係指10%重新叫用率下之陽性預測值(PPV)。
圖13E 顯示藉由質譜測定之使用及不使用單一對偶基因質譜數據訓練之兩種實例性呈遞模型之肽呈遞的性能結果。「相關性」係指指示肽是否呈遞於測試數據中之相應對偶基因上之實際標記與預測標記之間的相關性。
圖13F 顯示在藉由不使用單一對偶基因質譜數據訓練之呈遞模型預測之九聚物中2位置(P2)及9位置(P9)之常見錨定殘基之頻率。
圖13G 顯示藉由質譜測定之納入C端及N端側接序列作為對偶基因相互作用變量之實例性呈遞模型及納入C端及N端側接序列作為對偶基因非相互作用變量之實例性呈遞模型的肽呈遞之性能結果。第一行係指在將每一呈遞模型應用於測試集時接受者操作特徵(ROC)之曲線下面積(AUC)，第二行係指負對數似然度損失之值，且第三行係指10%重新叫用率下之陽性預測值(PPV)。
圖13H 顯示mRNA豐度與肽呈遞於腫瘤細胞上之頻率之間的依賴性，如藉由質譜所測定。水平軸指示以每百萬轉錄本(TPM)四分位數表示之mRNA表現。垂直軸指示以相應mRNA表現四分位數表示之來自基因之經呈遞表位之分數。每一實線係關於腫瘤樣品之與相應質譜數據及mRNA表現量測相關之兩個量測之曲線。
圖13I 顯示藉由質譜測定之實例性呈遞模型「MHCflurry + RNA過濾器」之肽呈遞之性能結果，該實例性呈遞模型係類似於基於親和力預測使用標準基因表現過濾器預測肽呈遞之當前現有技術模型之模型，該標準基因表現過濾器自蛋白質去除mRNA量化量測值小於3.2 FPKM之所有肽。「實例性模型，無RNA」模型係等式(21)中所顯示之「S型相加」實例性呈遞模型。「實例性模型，具RNA」模型係等式(19)中所顯示經由對數函數納入mRNA量化數據之「S型相加」呈遞模型。數據顯示20%重新叫用率下之陽性預測值(PPV)。
圖13J 顯示在預測肽呈遞時將肽長度考慮在內之呈遞模型及不考慮肽長度之現有技術模型對不同肽長度之肽呈遞的機率。曲線「真(盲性測試數據)」顯示根據肽長度在樣品測試數據集中經呈遞肽之比例。曲線「忽略長度之模型」指示在將忽略肽長度之現有技術模型應用於相同測試數據集用於呈遞預測時之經預測量測值。「實例性模型，具RNA」模型係等式(19)中所顯示經由對數函數納入mRNA量化數據之「S型相加」呈遞模型。
圖13K 係利用質譜自人類腫瘤細胞及腫瘤浸潤淋巴球(TIL)上之II類MHC對偶基因溶析之肽之長度的直方圖。
圖13L 圖解說明兩個實例數據集之mRNA量化與每一殘基之呈遞肽之間的依賴性。
圖13M 比較使用兩個實例數據集訓練及測試之實例性呈遞模型之性能結果。
圖13N 係繪示利用質譜對包含II類HLA分子之總共39個樣品之每一樣品測序之肽量的直方圖。
圖13-O 係繪示其中特定II類MHC分子對偶基因經鑑別之樣品量之直方圖。
圖13P 係繪示對於一系列肽長度之每一肽長度，總共39個樣品中由II類MHC分子呈遞之肽之比例的直方圖。
圖13Q 係繪示對於存在於39個樣品中之基因，基因表現與II類MHC分子對基因表現產物之呈遞普遍性之間的關係之線圖。
圖13R 係比較具有不同輸入之相同模型在預測肽之測試數據集中之肽將由II類MHC分子呈遞的似然度方面之性能之線圖。
圖13S 係比較四個不同模型在預測肽之測試數據集中之肽將由II類MHC分子呈遞之似然度方面的性能之線圖。
圖13T 係比較使用兩種不同準則之同類最優之先前技術模型及本文所揭示具有兩個不同輸入之呈遞模型在預測肽之測試數據集中的肽將由II類MHC分子呈遞之似然度方面之性能之線圖。
圖14 圖解說明用於執行圖1及3中所顯示之實體之實例性電腦。
圖15 圖解說明活體外T細胞活化分析之研發。其中將疫苗盒遞送至抗原呈遞細胞引起不同肽抗原之表現、加工及MHC限制性呈遞之分析之示意圖。匹配特異性肽-MHC組合之經T細胞受體改造之報導基因T細胞變得活化，使得螢光素酶表現。
圖16A 圖解說明短盒中之連接體序列之評估且顯示5個串聯在相對於彼此相同之位置中之I類MHC限制性表位(表位1至5)及隨後2個通用II類MHC表位(MHC-II)。使用不同連接體產生多個迭代。在一些情形下，T細胞表位彼此直接連接。在其他情形下，T細胞表位在一側或兩側側接有其天然序列。在其他迭代中，T細胞表位藉由非天然序列AAY、RR及DPP連接。
圖16B 圖解說明短盒中之連接體序列之評估且顯示關於嵌入短盒中之T細胞表位之序列資訊。
圖17 圖解說明添加至模型疫苗盒中之細胞靶向序列之評估。靶向盒使用泛素(Ub)、信號肽(SP)及/或跨膜(TM)域延長了短盒設計，其特徵亦在於2個小鼠T細胞表位SIINFEKL (SII)及SPSYAYHQF (A5)緊靠5個標記物人類T細胞表位(表位1至5)，且使用側接在T細胞表位兩側之非天然連接體AAY-或天然連接體(25聚體)。
圖18 圖解說明短盒中之連接體序列之活體內評估。A)使用HLA-A2轉基因小鼠之疫苗盒之活體內評估的實驗設計。
圖19A 圖解說明長21聚體盒中之表位位置之影響之活體內評估且顯示長盒之設計需要含於其25聚體天然序列(連接體=天然側接序列)中之5個標記物I類表位(表位1至5) (藉由含於其25聚體天然序列中之其他熟知之T細胞I類表位(表位6至21)間隔開)及2個通用II類表位(MHC-II)，且僅改變I類表位之相對位置。
圖19B 圖解說明長21聚體盒中之表位位置之影響之活體內評估且顯示關於所用T細胞表位之序列資訊。
圖20A 圖解說明臨床前申請臨床試驗研究(IND-enabling study)之最終盒設計且顯示最終盒之設計包含20個含於其25聚體天然序列(連接體=天然側接序列)中之I類MHC表位(由6個非人類靈長類動物(NHP)表位、5個人類表位、9個鼠類表位構成)以及2個通用II類MHC表位。
圖20B 圖解說明臨床前申請臨床試驗研究之最終盒設計且顯示呈遞於非人類靈長類動物、小鼠及人類起源之I類MHC上之所用T細胞表位以及2個通用II類MHC表位PADRE及破傷風類毒素之序列的序列資訊。
圖21A 圖解說明轉染後之ChAdV68.4WTnt.GFP病毒產生。使用磷酸鈣方案用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染後10天觀察到病毒複製且利用光學顯微術(40×放大倍數)使ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑可視化。
圖21B 圖解說明轉染後之ChAdV68.4WTnt.GFP病毒產生。使用磷酸鈣方案用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染後10天觀察到病毒複製且利用螢光顯微術在40×放大倍數下使ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑可視化。
圖21C 圖解說明轉染後之ChAdV68.4WTnt.GFP病毒產生。使用磷酸鈣方案用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染後10天觀察到病毒複製且使用螢光顯微術在100×放大倍數下使ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑可視化。
圖22A 圖解說明轉染後之ChAdV68.5WTnt.GFP病毒產生。使用lipofectamine方案用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染後10天觀察到病毒複製(蝕斑)。製備溶解物且將其用於再感染293A細胞之T25燒瓶。3天後利用光學顯微術(40×放大倍數)使ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑可視化並拍照
圖22B 圖解說明轉染後之ChAdV68.5WTnt.GFP病毒產生。使用lipofectamine方案用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染後10天觀察到病毒複製(蝕斑)。製備溶解物且將其用於再感染293A細胞之T25燒瓶。3天後利用螢光顯微術在40×放大倍數下使ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑可視化並拍照。
圖22C 圖解說明轉染後之ChAdV68.5WTnt.GFP病毒產生。使用lipofectamine方案用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染後10天觀察到病毒複製(蝕斑)。製備溶解物且將其用於再感染293A細胞之T25燒瓶。3天後利用螢光顯微術在100×放大倍數下使ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑可視化並拍照。
圖23 圖解說明病毒粒子產生方案。
圖24 圖解說明阿爾法病毒衍生之VEE自我複製RNA (srRNA)載體。
圖25 圖解說明在用VEE-螢光素酶srRNA接種C57BL/6J小鼠後之活體內報導基因表現。顯示在用VEE-螢光素酶srRNA (10 ug/小鼠，雙側肌內注射，MC3囊封)免疫C57BL/6J小鼠後之不同時間點螢光素酶信號之代表性影像。
圖26A 圖解說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中在用與MC3 LNP一起調配之VEE srRNA免疫後14天量測之T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射10 ug之VEE-螢光素酶srRNA (對照)、VEE-UbAAY srRNA (Vax)、VEE-螢光素酶srRNA及抗CTLA-4 (aCTLA-4)或VEE-UbAAY srRNA及抗CTLA-4 (Vax + aCTLA-4)。另外，在第7天開始用抗PD1 mAb處理所有小鼠。每一組係由8隻小鼠組成。在免疫後14天將小鼠殺死且收集脾及淋巴結。藉由IFN-γ ELISPOT評價SIINFEKL特異性T細胞反應且報告為斑點形成細胞(SFC)/106 個脾細胞。各線代表中值。
圖26B 圖解說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中在用與MC3 LNP一起調配之VEE srRNA免疫後14天量測之T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射10 ug之VEE-螢光素酶srRNA (對照)、VEE-UbAAY srRNA (Vax)、VEE-螢光素酶srRNA及抗CTLA-4 (aCTLA-4)或VEE-UbAAY srRNA及抗CTLA-4 (Vax + aCTLA-4)。另外，在第7天開始用抗PD1 mAb處理所有小鼠。每一組係由8隻小鼠組成。在免疫後14天將小鼠殺死且收集脾及淋巴結。藉由MHCI-五聚體染色評價SIINFEKL特異性T細胞反應，報告為五聚體陽性細胞，以CD8陽性細胞之百分數表示。各線代表中值。
圖27A 圖解說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中在異源初免/加強後之抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射腺病毒表現GFP (Ad5-GFP)且用與MC3 LNP一起調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)或Ad5-UbAAY加強並用VEE-UbAAY srRNA (Vax)加強。亦用IgG對照mAb處理對照及Vax組二者。用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA加強與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)處理第三組，同時用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY加強與抗CTLA-4之組合(Vax + aCTLA-4)處理第四組。另外，在第21天開始用抗PD-1 mAb處理所有小鼠。藉由IFN-γ ELISPOT量測T細胞反應。在用腺病毒免疫後14天時將小鼠殺死且收集脾及淋巴結。
圖27B 圖解說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中在異源初免/加強後之抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射腺病毒表現GFP (Ad5-GFP)且用與MC3 LNP一起調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)或Ad5-UbAAY加強並用VEE-UbAAY srRNA (Vax)加強。亦用IgG對照mAb處理對照及Vax組二者。用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA加強與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)處理第三組，同時用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY加強與抗CTLA-4之組合(Vax + aCTLA-4)處理第四組。另外，在第21天開始用抗PD-1 mAb處理所有小鼠。藉由IFN-γ ELISPOT量測T細胞反應。在用腺病毒免疫後14天及用srRNA加強後14天(初免後第28天)時將小鼠殺死且收集脾及淋巴結。
圖27C 圖解說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中在異源初免/加強後之抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射腺病毒表現GFP (Ad5-GFP)且用與MC3 LNP一起調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)或Ad5-UbAAY加強並用VEE-UbAAY srRNA (Vax)加強。亦用IgG對照mAb處理對照及Vax組二者。用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA加強與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)處理第三組，同時用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY加強與抗CTLA-4之組合(Vax + aCTLA-4)處理第四組。另外，在第21天開始用抗PD-1 mAb處理所有小鼠。藉由I類MHC五聚體染色量測T細胞反應。在用腺病毒免疫後14天時將小鼠殺死且收集脾及淋巴結。
圖27D 圖解說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中在異源初免/加強後之抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射腺病毒表現GFP (Ad5-GFP)且用與MC3 LNP一起調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)或Ad5-UbAAY加強並用VEE-UbAAY srRNA (Vax)加強。亦用IgG對照mAb處理對照及Vax組二者。用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA加強與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)處理第三組，同時用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY加強與抗CTLA-4之組合(Vax + aCTLA-4)處理第四組。另外，在第21天開始用抗PD-1 mAb處理所有小鼠。藉由I類MHC五聚體染色量測T細胞反應。在用腺病毒免疫後14天及用srRNA加強後14天(初免後第28天)時將小鼠殺死且收集脾及淋巴結。
圖28A 圖解說明在帶有CT26 (Balb/c)腫瘤之小鼠中在異源初免/加強後之抗原特異性T細胞反應。用Ad5-GFP免疫小鼠且在用與MC3 LNP一起調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)腺病毒初免後15天加強，或用Ad5-UbAAY初免並用VEE-UbAAY srRNA (Vax)加強。亦用IgG對照mAb處理對照及Vax組二者。向單獨組投與Ad5-GFP/VEE-螢光素酶srRNA初免/加強與抗PD-1之組合(aPD1)，同時第四組接受Ad5-UbAAY/VEE-UbAAY srRNA初免/加強與抗PD-1 mAb之組合(Vax + aPD1)。使用IFN-γ ELISPOT量測針對AH1肽之T細胞反應。在用腺病毒免疫後12天時將小鼠殺死且收集脾及淋巴結。
圖28B 圖解說明在帶有CT26 (Balb/c)腫瘤之小鼠中在異源初免/加強後之抗原特異性T細胞反應。用Ad5-GFP免疫小鼠且在用與MC3 LNP一起調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)之腺病毒初免後15天加強，或用Ad5-UbAAY初免並用VEE-UbAAY srRNA (Vax)加強。亦用IgG對照mAb處理對照及Vax組二者。向單獨組投與Ad5-GFP/VEE-螢光素酶srRNA初免/加強與抗PD-1之組合(aPD1)，同時第四組接受Ad5-UbAAY/VEE-UbAAY srRNA初免/加強與抗PD-1 mAb之組合(Vax + aPD1)。使用IFN-γ ELISPOT量測針對AH1肽之T細胞反應。在用腺病毒免疫後12天及用srRNA加強後6天(初免後第21天)時將小鼠殺死且收集脾及淋巴結。
圖29 圖解說明在小鼠中ChAdV68引發針對小鼠腫瘤抗原之T細胞反應。用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體免疫小鼠，且量測C57BL/6J雌性小鼠中針對I類MHC表位SIINFEKL (OVA)之T細胞反應並量測Balb/c小鼠中針對I類MHC表位AH1-A5之T細胞反應。呈現在ELISpot分析中量測之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個脾細胞。誤差槓表示標準偏差。
圖30 圖解說明在CT26腫瘤模型中在用ChAdV6、ChAdV +抗PD-1、srRNA、srRNA +抗PD-1或單獨抗PD-1單次免疫後之細胞免疫反應。使用ELISpot量測每一組之6隻小鼠之脾細胞中之抗原特異性IFN-γ產生。結果呈現為斑點形成細胞(SFC)/106 個脾細胞。每一組之中值藉由水平線指示。P值係利用Dunnett多重比較測試確定；*** P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV= ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體；srRNA= VEE-MAG25聚體srRNA。
圖31 圖解說明在CT26腫瘤模型中在用ChAdV6、ChAdV +抗PD-1、srRNA、srRNA +抗PD-1或單獨抗PD-1單次免疫後之CD8 T細胞反應。使用ICS量測CD8 T細胞中之抗原特異性IFN-γ產生且結果呈現為抗原特異性CD8 T細胞佔總CD8 T細胞之百分比。每一組之中值藉由水平線指示。P值係利用Dunnett多重比較測試確定；*** P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV= ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體；srRNA= VEE-MAG25聚體srRNA。
圖32 圖解說明在CT26腫瘤模型中在用ChAdV/srRNA異源初免/加強、srRNA/ChAdV異源初免/加強或srRNA/srRNA同源初免/加強免疫後之腫瘤生長。亦圖解說明於在初免及加強期間投與或不投與抗PD1之初免/加強免疫之比較中。每週兩次量測腫瘤體積且呈現研究之第一個21天之平均腫瘤體積。在研究開始時每組有22-28隻小鼠。誤差槓表示平均值之標準誤差(SEM)。P值係利用Dunnett測試確定；*** P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV= ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體；srRNA= VEE-MAG25聚體srRNA。
圖33 圖解說明在CT26腫瘤模型中在用ChAdV/srRNA異源初免/加強、srRNA/ChAdV異源初免/加強或srRNA/srRNA同源初免/加強免疫後之存活率。亦圖解說明於在初免及加強期間投與或不投與抗PD1之初免/加強免疫之比較中。P值係利用對數秩測試確定；*** P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.01。ChAdV= ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體；srRNA= VEE-MAG25聚體srRNA。
圖34 圖 解說明使用ELISpot量測之抗原特異性細胞免疫反應。在第一加強免疫後1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週、9週或10週，使用ELISpot量測VEE-MAG25聚體srRNA-LNP1(30 µg) (圖34A)、VEE-MAG25聚體srRNA-LNP1(100 µg) (圖34B)或VEE-MAG25聚體srRNA-LNP2(100 µg) (圖34C)同源初免/加強或ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體/VEE-MAG25聚體srRNA異源初免/加強組(圖34D) (6隻恒河獼猴(rhesus macaque))之PBMC中6種不同mamu A01限制性表位之抗原特異性IFN-γ產生。結果呈現為呈堆疊條形圖格式之每一表位之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC。將每一動物之值正規化至採血前(第0週)之程度。
圖35 顯示使用ELISpot量測之抗原特異性細胞免疫反應。在免疫之前及初次免疫後4週、5週、6週、7週、8週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、21週、22週、23週或24週，使用ELISpot量測PBMC中在用ChAdV68.5WTnt.MAG25聚體/VEE-MAG25聚體srRNA異源初免/加強方案免疫後6種不同mamu A01限制性表位之抗原特異性IFN-γ產生。結果呈現為呈堆疊條形圖格式之每一表位(6隻恒河獼猴/組)之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC。
圖36 顯示使用ELISpot量測之抗原特異性細胞免疫反應。在免疫之前及初次免疫後4週、5週、6週、7週、8週、10週、11週、12週、13週、14週或15週，使用ELISpot量測PBMC中在用VEE-MAG25聚體srRNA LNP2同源初免/加強方案免疫後6種不同mamu A01限制性表位之抗原特異性IFN-γ產生。結果呈現為呈堆疊條形圖格式之每一表位(6隻恒河獼猴/組)之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC。
圖37 顯示使用ELISpot量測之抗原特異性細胞免疫反應。在免疫之前及初次免疫後4週、5週、6週、7週、8週、10週、11週、12週、13週、14週或15週，使用ELISpot量測PBMC中在用VEE-MAG25聚體srRNA LNP1同源初免/加強方案免疫後6種不同mamu A01限制性表位之抗原特異性IFN-γ產生。結果呈現為呈堆疊條形圖格式之每一表位(6隻恒河獼猴/組)之平均斑點形成細胞(SFC)/106 個PBMC。
圖38 圖解說明測定兩個實例盒序列之距離度量。

Claims (173)

  1. 一種用於遞送新抗原表現系統之組合物，其包含： 新抗原表現系統， 其中該新抗原表現系統包含一或多種載體， 該一或多種載體包含： (a) RNA阿爾法病毒(alphavirus)主鏈，其中該RNA阿爾法病毒主鏈包含： (i)至少一個啟動子核苷酸序列，及 (ii)至少一個多腺苷酸化(聚(A))序列；及 (b) 新抗原盒，其中該新抗原盒包含： (i) 至少一個衍生自存在於個體內腫瘤之新抗原編碼核酸序列，其包含： (I) 至少一個腫瘤特異性及個體特異性I類MHC新抗原編碼核酸序列，其衍生自該腫瘤且包含： (A) I類MHC表位(epitope)編碼核酸序列，其具有至少一個變化使得該編碼肽序列不同於野生型核酸序列編碼之相應肽序列，及 (B)視情況5’端連接體序列，及 (C)視情況3’端連接體序列； (ii) 視情況第二啟動子核苷酸序列，其可操作地連接至該新抗原編碼核酸序列；及 (iii)視情況至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列； (iv)視情況至少一個編碼GPGPG胺基酸連接體序列(SEQ ID NO:56)之核酸序列；及 (v)視情況至少一個第二聚(A)序列，其中該第二聚(A)序列對於該阿爾法病毒係天然聚(A)序列或外源聚(A)序列。
  2. 一種用於遞送新抗原表現系統之組合物，其包含： 新抗原表現系統， 其中該新抗原表現系統包含一或多種載體， 該一或多種載體包含： (a) RNA阿爾法病毒主鏈，其中該RNA阿爾法病毒主鏈包含SEQ ID NO:6中所示之核酸序列，其中該RNA阿爾法病毒主鏈序列包含26S啟動子核苷酸序列及聚(A)序列，其中該26S啟動子序列對於該RNA阿爾法病毒主鏈係內源的，且其中該聚(A)序列對於該RNA阿爾法病毒主鏈係內源的；及 (b) 整合在該26S啟動子核苷酸序列與該聚(A)序列之間之新抗原盒，其中該新抗原盒包含： (i) 至少一個衍生自存在於個體內腫瘤之新抗原編碼核酸序列，其包含： (I) 至少10個腫瘤特異性及個體特異性I類MHC新抗原編碼核酸序列，彼此線性連接且各自包含： (A) I類MHC表位編碼核酸序列，其具有至少一個變化使得該編碼肽序列不同於野生型核酸序列編碼之相應肽序列，其中該I類MHC表位編碼核酸序列編碼長度7-15個胺基酸之I類MHC表位， (B) 5’端連接體序列，其中該5’端連接體序列編碼該I類MHC表位之天然N端胺基酸序列，且其中該5’端連接體序列編碼長度至少3個胺基酸之肽， (C) 3’端連接體序列，其中該3’端連接體序列編碼該I類MHC表位之天然C端胺基酸序列，且其中該3’端連接體序列編碼長度至少3個胺基酸之肽，且 其中該新抗原盒可操作地連接至該26S啟動子核苷酸序列，其中該等I類MHC新抗原編碼核酸序列中之每一者編碼長度在13與25個胺基酸之間之多肽，且其中每一I類MHC新抗原編碼核酸序列之每一3’端連接至下一I類MHC新抗原編碼核酸序列之5’端，該新抗原盒中之最末I類MHC新抗原編碼核酸序列除外；及 (ii)至少兩個II類MHC抗原編碼核酸序列，其包含： (I) PADRE II類MHC序列(SEQ ID NO:48)， (II)破傷風類毒素II類MHC序列(SEQ ID NO:46)， (III)第一核酸序列，其編碼連接該PADRE II類MHC序列與該破傷風類毒素II類MHC序列之GPGPG胺基酸連接體序列， (IV)第二核酸序列，其編碼連接該至少兩個II類MHC抗原編碼核酸序列之5’端與至少20個腫瘤特異性及個體特異性I類MHC新抗原編碼核酸序列之GPGPG胺基酸連接體序列， (V)視情況第三核酸序列，其編碼在該至少兩個II類MHC抗原編碼核酸序列之3’端之GPGPG胺基酸連接體序列。
  3. 如請求項1之組合物，其中該新抗原盒之每一元件之有序序列述於下式中，自5’端至3’端包含： Pa -(L5b -Nc -L3d )X -(G5e -Uf )Y -G3g 其中P包含該第二啟動子核苷酸序列，其中a = 0或1， N包含該等I類MHC表位編碼核酸序列中之一者，其中c = 1， L5包含該5’端連接體序列，其中b = 0或1， L3包含該3’端連接體序列，其中d = 0或1， G5包含該至少一個編碼GPGPG胺基酸連接體之核酸序列中之一者，其中e = 0或1， G3包含該至少一個編碼GPGPG胺基酸連接體之核酸序列中之一者，其中g = 0或1， U包含該至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列中之一者，其中f = 1， X = 1至400，其中對於每一X，該相應Nc 係表位編碼核酸序列，及 Y = 0、1或2，其中對於每一Y，該相應Uf 係抗原編碼核酸序列。
  4. 如請求項3之組合物，其中對於每一X，該相應Nc 係不同的I類MHC表位編碼核酸序列。
  5. 如請求項3或4之組合物，其中對於每一Y，該相應Uf 係不同的II類MHC抗原編碼核酸序列。
  6. 如請求項3至5中任一項之組合物，其中 a = 0，b = 1，d = 1，e = 1，g = 1，h = 1，X = 20，Y = 2， 該至少一個啟動子核苷酸序列係由該RNA阿爾法病毒主鏈提供之單一26S啟動子核苷酸序列， 該至少一個多腺苷酸化聚(A)序列係由該RNA阿爾法病毒主鏈提供之至少100個連續A核苷酸之聚(A)序列， 每一N編碼長度7至15個胺基酸之I類MHC表位， L5係編碼該I類MHC表位之天然N端胺基酸序列之天然5’端連接體序列，且其中該5’端連接體序列編碼長度至少3個胺基酸之肽， L3係編碼該I類MHC表位之天然C端胺基酸序列之天然3’端連接體序列，且其中該3’端連接體序列編碼長度至少3個胺基酸之肽， U係PADRE II類序列及破傷風類毒素II類MHC序列中之每一者， 該RNA阿爾法病毒主鏈係SEQ ID NO:6中所示之序列，且 該等I類MHC新抗原編碼核酸序列中之每一者編碼長度在13與25個胺基酸之間之多肽。
  7. 如前述請求項中任一項之組合物，該組合物進一步包含奈米微粒遞送媒劑。
  8. 如請求項7之組合物，其中該奈米微粒遞送媒劑係脂質奈米粒子(LNP)。
  9. 如請求項8之組合物，其中該LNP包含可離子化胺基脂質。
  10. 如請求項9之組合物，其中該可離子化胺基脂質包含MC3樣(二亞麻油基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯)分子。
  11. 如請求項7至10中任一項之組合物，其中該奈米微粒遞送媒劑囊封該新抗原表現系統。
  12. 如請求項8之組合物，其進一步包含複數個LNP，其中該等LNP包含： 該新抗原表現系統； 陽離子脂質； 非陽離子脂質；及 抑制該等LNP聚集之結合脂質(conjugated lipid)，其中該複數個LNP中之至少約95%之LNP： (a) 具有非層狀形態；或 (b) 係電子密集的。
  13. 如請求項12之組合物，其中該非陽離子脂質係(1)磷脂及(2)膽固醇或膽固醇衍生物之混合物。
  14. 如請求項12或13之組合物，其中抑制該等LNP聚集之結合脂質係聚乙二醇(PEG)-脂質結合物。
  15. 如請求項14之組合物，其中該PEG-脂質結合物選自由以下組成之群：PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG二烷基氧基丙基(PEG-DAA)結合物、PEG-磷脂結合物、PEG-神經醯胺(PEG-Cer)結合物及其混合物。
  16. 如請求項15之組合物，其中該PEG-DAA結合物係選自由以下組成之群之成員：PEG-二癸基氧基丙基(C10 )結合物、PEG-二月桂基氧基丙基(C12 )結合物、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14 )結合物、PEG-二棕櫚基氧基丙基(C16 )結合物、PEG-二硬脂醯基氧基丙基(C18 )結合物及其混合物。
  17. 如請求項12至16中任一項之組合物，其中該等LNP之非層狀形態包含反六方(inverse hexagonal)(H II )或立方相結構。
  18. 如請求項12至17之組合物，其中該陽離子脂質包含該等LNP中存在之總脂質的約10 mol%至約50 mol%。
  19. 如請求項12至17中任一項之組合物，其中該陽離子脂質包含該等LNP中存在之總脂質的約20 mol%至約50 mol%。
  20. 如請求項12至17中任一項之組合物，其中該陽離子脂質包含該等LNP中存在之總脂質的約20 mol%至約40 mol%。
  21. 如請求項12至20中任一項之組合物，其中該非陽離子脂質包含該等LNP中存在之總脂質的約10 mol%至約60 mol%。
  22. 如請求項12至20中任一項之組合物，其中該非陽離子脂質包含該等LNP中存在之總脂質的約20 mol%至約55 mol%。
  23. 如請求項12至20中任一項之組合物，其中該非陽離子脂質包含該等LNP中存在之總脂質的約25 mol%至約50 mol%。
  24. 如請求項12至23中任一項之組合物，其中該結合脂質包含該等LNP中存在之總脂質的約0.5 mol%至約20 mol%。
  25. 如請求項12至23中任一項之組合物，其中該結合脂質包含該等LNP中存在之總脂質的約2 mol%至約20 mol%。
  26. 如請求項12至23中任一項之組合物，其中該結合脂質包含該等LNP中存在之總脂質的約1.5 mol%至約18 mol%。
  27. 如請求項12至26中任一項之組合物，其中大於95%之該等LNP具有非層狀形態。
  28. 如請求項12至27中任一項之組合物，其中大於95%之該等LNP係電子密集的。
  29. 如請求項8至28中任一項之組合物，其進一步包含複數個LNP，其中該等LNP包含： 陽離子脂質，其包含該等LNP中存在之總脂質的50 mol%至65 mol%； 抑制LNP聚集之結合脂質，其包含該等LNP中存在之總脂質的0.5 mol%至2 mol%；及 非陽離子脂質，其包含以下中之任一者： (a) 磷脂及膽固醇或其衍生物之混合物，其中該磷脂包含該等LNP中存在之總脂質的4 mol%至10 mol%，且該膽固醇或其衍生物包含該等LNP中存在之總脂質的30 mol%至40 mol%； (b) 磷脂及膽固醇或其衍生物之混合物，其中該磷脂包含該等LNP中存在之總脂質的3 mol%至15 mol%，且該膽固醇或其衍生物包含該等LNP中存在之總脂質的30 mol%至40 mol%；或 (c) 該等LNP中存在之總脂質的多達49.5 mol%且包含磷脂及膽固醇或其衍生物之混合物，其中該膽固醇或其衍生物包含該等LNP中存在之總脂質的30 mol%至40 mol%。
  30. 如請求項8至28中任一項之組合物，其進一步包含複數個LNP，其中該等LNP包含： 陽離子脂質，其包含該等LNP中存在之總脂質的50 mol%至85 mol%； 抑制LNP聚集之結合脂質，其包含該等LNP中存在之總脂質的0.5 mol%至2 mol%；及 非陽離子脂質，其包含該等LNP中存在之總脂質的13 mol%至49.5 mol%。
  31. 如請求項29之組合物，其中該磷脂包含二棕櫚醯基磷酯醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷酯醯膽鹼(DSPC)或其混合物。
  32. 如請求項29或30之組合物，其中該結合脂質包含聚乙二醇(PEG)-脂質結合物。
  33. 如請求項32之組合物，其中該PEG-脂質結合物包含PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG-二烷基氧基丙基(PEG-DAA)結合物或其混合物。
  34. 如請求項33之組合物，其中該PEG-DAA結合物包含PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(PEG-DMA)結合物、PEG-二硬脂醯基氧基丙基(PEG-DSA)結合物或其混合物。
  35. 如請求項32至34中任一項之組合物，其中該結合物之PEG部分具有約2,000道爾頓之平均分子量。
  36. 如請求項29至35中任一項之組合物，其中該結合脂質包含該等LNP中存在之總脂質的1 mol%至2 mol%。
  37. 如請求項8至36中任一項之組合物，其中該等LNP包含具有式I結構之化合物：或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物、前藥或立體異構物，其中 L1 及L2 各自獨立地係-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)x -、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-Ra C(=O)-、-C(=O)Ra -、-Ra C(=O)Ra -、-OC(=O)Ra -、-Ra C(=O)O-或直接鍵； G1 係C1 -C2 伸烷基、-(C=O)-、-O(C=O)-、-SC(=O)-、-Ra C(=O)-或直接鍵； -C(=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)S-、-C(=O)Ra -或直接鍵； G係C1 -C6 伸烷基； Ra 係H或C1 -C12 烷基； R1a 及R1b 在每次出現時獨立地係：(a) H或C1 -C12 烷基；或(b) R1a 係H或C1 -C12 烷基，且R1b 及其所結合之碳原子與相鄰R1b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R2a 及R2b 在每次出現時獨立地係：(a) H或C1 -C12 烷基；或(b) R2a 係H或C1 -C12 烷基，且R2b 及其所結合之碳原子與相鄰R2b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R3a 及R3b 在每次出現時獨立地係：(a) H或C1 -C12 烷基；或(b) R3a 係H或C1 -C12 烷基，且R3b 及其所結合之碳原子與相鄰R3b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R4a 及R4b 在每次出現時獨立地係：(a) H或C1 -C12 烷基；或(b) R4a 係H或C1 -C12 烷基，且R4b 及其所結合之碳原子與相鄰R4b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R5 及R6 各自獨立地係H或甲基； R7 係C4 -C20 烷基； R8 及R9 各自獨立地係C1 -C12 烷基；或R8 及R9 與其所連接之氮原子一起形成5員、6員或7員雜環； a、b、c及d各自獨立地係1至24之整數；且x係0、1或2。
  38. 如請求項8至36中任一項之組合物，其中該等LNP包含具有式II結構之化合物：或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物、前藥或立體異構物，其中 L1 及L2 各自獨立地係-O(C=O)-、-(C=O)O-或碳-碳雙鍵； R1a 及R1b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R1a 係H或C1 -C12 烷基，且R1b 及其所結合之碳原子與相鄰R1b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R2a 及R2b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R2a 係H或C1 -C12 烷基，且R2b 及其所結合之碳原子與相鄰R2b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R3a 及R3b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R3a 係H或C1 -C12 烷基，且R3b 及其所結合之碳原子與相鄰R3b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R4a 及R4b 在每次出現時獨立地係(a) H或C1 -C12 烷基，或(b) R4a 係H或C1 -C12 烷基，且R4b 及其所結合之碳原子與相鄰R4b 及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R5 及R6 各自獨立地係甲基或環烷基； R7 在每次出現時獨立地係H或C1 -C12 烷基； R8 及R9 各自獨立地係未經取代之C1 -C12 烷基；或R8 及R9 與其所連接之氮原子一起形成包含一個氮原子之5員、6員或7員雜環； a及d各自獨立地係0至24之整數；b及c各自獨立地係1至24之整數；且e係1或2， 條件係： R1a 、R2a 、R3a 或R4a 中之至少一者係C1 -C12 烷基，或L1 或L2 中之至少一者係-O(C=O)-或-(C=O)O-；且 當a係6時，R1a 及R1b 不為異丙基，或當a係8時，R1a 及R1b 不為正丁基。
  39. 如請求項37或39之組合物，其進一步包含一或多種包含中性脂質、類固醇及聚合物結合脂質之賦形劑。
  40. 如請求項39之組合物，其中該中性脂質包含以下中之至少一者：1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)及1,2-二油醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
  41. 如請求項40之組合物，其中該中性脂質係DSPC。
  42. 如請求項39至41中任一項之組合物，其中該化合物對該中性脂質之莫耳比在約2:1至約8:1範圍內。
  43. 如請求項39至42中任一項之組合物，其中該類固醇係膽固醇。
  44. 如請求項43之組合物，其中該化合物對膽固醇之莫耳比在約2:1至1:1範圍內。
  45. 如請求項39至44中任一項之組合物，其中該聚合物結合脂質係聚乙二醇化脂質。
  46. 如請求項45之組合物，其中該化合物對該聚乙二醇化脂質之莫耳比在約100:1至約25:1範圍內。
  47. 如請求項45或46之組合物，其中該聚乙二醇化脂質係PEG-DAG、PEG聚乙烯(PEG-PE)、PEG-琥珀醯基-二醯基甘油(PEG-S-DAG)、PEG-cer或PEG胺基甲酸二烷基氧基丙基酯。
  48. 如請求項45或46之組合物，其中該聚乙二醇化脂質具有以下結構III：或其醫藥上可接受之鹽、互變異構物、前藥或立體異構物，其中 R10 及R11 各自獨立地係含有10至30個碳原子之直鏈或具支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，其中該烷基鏈視情況雜有一或多個酯鍵；且 z具有在30至60範圍內之平均值。
  49. 如請求項48之組合物，其中R10 及R11 各自獨立地係具有12至16個碳原子之直鏈、飽和烷基鏈。
  50. 如請求項48或49中任一項之組合物，其中z平均值為約45。
  51. 如請求項8至50中任一項之組合物，其中該等LNP當與多陰離子核酸混合時自組裝成非雙層結構。
  52. 如請求項51之組合物，其中該非雙層結構具有介於60 nm與120 nm之間之直徑。
  53. 如請求項51之組合物，其中該非雙層結構具有約70 nm、約80 nm、約90 nm或約100 nm之直徑。
  54. 如請求項7至53中任一項之組合物，其中該奈米微粒遞送媒劑具有約100 nm之直徑。
  55. 3至5或7至54中任一項之組合物，其中該新抗原盒整合在該至少一個啟動子核苷酸序列與該至少一個聚(A)序列之間。
  56. 3至5或7至55中任一項之組合物，其中該至少一個啟動子核苷酸序列可操作地連接至該新抗原編碼核酸序列。
  57. 3至5或7至56中任一項之組合物，其中該一或多種載體包含一或多種正義股RNA載體。
  58. 如請求項57之組合物，其中該一或多種正義股RNA載體包含5’端7-甲基鳥苷(m7g)帽。
  59. 如請求項57或58之組合物，其中該一或多種正義股RNA載體係藉由活體外轉錄產生。
  60. 3至5或7至59中任一項之組合物，其中該一或多種載體在哺乳動物細胞內自我複製。
  61. 3至5或7至60中任一項之組合物，其中該RNA阿爾法病毒主鏈包含至少以下一者之核苷酸序列：奧拉病毒(Aura virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、羅氏河病毒(Ross River virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、辛得比斯病毒(Sindbis virus)或馬亞羅病毒(Mayaro virus)。
  62. 3至5或7至60中任一項之組合物，其中該RNA阿爾法病毒主鏈包含委內瑞拉馬腦炎病毒之至少一個核苷酸序列。
  63. 如請求項61或62之組合物，其中該RNA阿爾法病毒主鏈包含至少由該奧拉病毒、該摩根堡病毒、該委內瑞拉馬腦炎病毒、該羅氏河病毒、該塞姆利基森林病毒、該辛得比斯病毒或該馬亞羅病毒之核苷酸序列編碼之用於非結構蛋白介導擴增之序列、26S啟動子序列、聚(A)序列、非結構蛋白1 (nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因及nsP4基因。
  64. 如請求項61或62之組合物，其中該RNA阿爾法病毒主鏈包含至少由該奧拉病毒、該摩根堡病毒、該委內瑞拉馬腦炎病毒、該羅氏河病毒、該塞姆利基森林病毒、該辛得比斯病毒或該馬亞羅病毒之核苷酸序列編碼之用於非結構蛋白介導擴增之序列、26S啟動子序列及聚(A)序列。
  65. 如請求項63或64之組合物，其中用於非結構蛋白介導擴增之序列選自由以下組成之群：阿爾法病毒5’端UTR、51-nt CSE、24-nt CSE、26S亞基因體啟動子序列、19-nt CSE、阿爾法病毒3’端UTR或其組合。
  66. 如請求項63至65中任一項之組合物，其中該RNA阿爾法病毒主鏈不編碼結構病毒粒子蛋白衣殼E2及E1。
  67. 如請求項66之組合物，其中該新抗原盒代替結構病毒粒子蛋白插入該奧拉病毒、該摩根堡病毒、該委內瑞拉馬腦炎病毒、該羅氏河病毒、該塞姆利基森林病毒、該辛得比斯病毒或該馬亞羅病毒之核苷酸序列內。
  68. 如請求項61或62之組合物，其中該委內瑞拉馬腦炎病毒包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之序列。
  69. 如請求項61或62之組合物，其中該委內瑞拉馬腦炎病毒包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之序列，該序列進一步包含鹼基對7544與11175之間之缺失。
  70. 如請求項69之組合物，其中該RNA阿爾法病毒主鏈包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示之序列。
  71. 如請求項69或70之組合物，其中該新抗原盒插入在7544位置以替代SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之序列中所示之鹼基對7544與11175之間之缺失。
  72. 如請求項67至71之組合物，其中該新抗原盒之插入提供包含該等nsP1-4基因及該至少一個抗原編碼核酸序列之多順反子RNA之轉錄，其中該等nsP1-4基因及該至少一個抗原編碼核酸序列係於各別開放閱讀框中。
  73. 3至5或7至72中任一項之組合物，其中該至少一個啟動子核苷酸序列係由該RNA阿爾法病毒主鏈編碼之天然26S啟動子核苷酸序列。
  74. 3至5或7至72中任一項之組合物，其中該至少一個啟動子核苷酸序列係外源RNA啟動子。
  75. 3至5或7至74中任一項之組合物，其中該第二啟動子核苷酸序列係26S啟動子核苷酸序列。
  76. 3至5或7至74中任一項之組合物，其中該第二啟動子核苷酸序列包含複數個26S啟動子核苷酸序列，其中每一26S啟動子核苷酸序列提供該等各別開放閱讀框中一或多者之轉錄。
  77. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多種載體之大小各自為至少300nt。
  78. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多種載體之大小各自為至少1kb。
  79. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多種載體之大小各自為2kb。
  80. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多種載體之大小各自小於5kb。
  81. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該至少一種新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼由該腫瘤細胞上之I類MHC呈遞之多肽序列或其部分。
  82. 3至5或7至81中任一項之組合物，其中每一抗原編碼核酸序列彼此直接連接。
  83. 3至5或7至82中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者利用編碼連接體之核酸序列連接至不同的抗原編碼核酸序列。
  84. 如請求項83之組合物，其中該連接體連接兩個I類MHC序列或連接I類MHC序列與II類MHC序列。
  85. 如請求項84之組合物，其中該連接體選自由以下組成之群：(1)長度至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個殘基之連續甘胺酸殘基；(2)長度至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個殘基之連續丙胺酸殘基；(3)兩個精胺酸殘基(RR)；(4)丙胺酸、丙胺酸、酪胺酸(AAY)；(5)長度至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸殘基之共有序列，其可有效地被哺乳動物蛋白酶體處理；及(6)一或多個天然序列，其側接衍生自起源之同源蛋白之抗原且長度至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或2至20個胺基酸殘基。
  86. 如請求項83之組合物，其中該連接體連接兩個II類MHC序列或連接II類MHC序列與I類MHC序列。
  87. 如請求項86之組合物，其中該連接體包含該序列GPGPG。
  88. 3至5或7至87中任一項之組合物，其中該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者可操作地或直接地連接至分開或鄰接序列，該分開或鄰接序列可增強該至少一個抗原編碼核酸序列之表現、穩定性、細胞輸送、加工及呈遞及/或免疫原性。
  89. 如請求項88之組合物，其中該分開或鄰接序列包含以下中之至少一者：泛素序列、經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列(例如該泛素序列含有在76位置之Gly至Ala取代)、免疫球蛋白信號序列(例如IgK)、I類主要組織相容性序列、溶酶體相關膜蛋白(LAMP)-1、人類樹突細胞溶酶體相關膜蛋白及II類主要組織相容性序列；視情況其中該經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列係A76。
  90. 如前述請求項中任一項之組合物，其中相對於經轉譯之相應野生型核酸序列，該至少一種新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼具有增加與其相應MHC對偶基因之結合親和力之多肽序列或其部分。
  91. 如前述請求項中任一項之組合物，其中相對於該經轉譯之相應野生型核酸序列，該至少一種新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼具有增加與其相應MHC對偶基因之結合穩定性之多肽序列或其部分。
  92. 如前述請求項中任一項之組合物，其中相對於該經轉譯之相應野生型核酸序列，該至少一種新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼具有增加呈遞於其相應MHC對偶基因上之似然度之多肽序列或其部分。
  93. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該至少一個變化包含點突變、框移突變、非框移突變、缺失突變、插入突變、剪接變體、基因體重排或蛋白酶體產生之剪接抗原。
  94. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該腫瘤選自由以下組成之群：肺癌、黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、膀胱癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、成人急性淋巴母細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。
  95. 3至5或7至94中任一項之組合物，其中該至少一種新抗原編碼核酸序列包含至少2至10個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個核酸序列。
  96. 3至5或7至94中任一項之組合物，其中該至少一種新抗原編碼核酸序列包含至少11至20個、15至20個、11至100個、11至200個、11至300個、11至400個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或多達400個核酸序列。
  97. 3至5或7至94中任一項之組合物，其中該至少一種新抗原編碼核酸序列包含至少2至400個核酸序列，且其中該等新抗原編碼核酸序列中之至少兩者編碼由該腫瘤細胞表面上之I類MHC呈遞之多肽序列或其部分。
  98. 如請求項2或6之組合物，其中該等新抗原編碼核酸序列中之至少兩者編碼由該腫瘤細胞表面上之I類MHC呈遞之多肽序列或其部分。
  99. 如前述請求項中任一項之組合物，其中在投與該個體及轉譯時，由該至少一種新抗原編碼核酸序列編碼之該等新抗原中之至少一者呈遞於抗原呈遞細胞上，造成靶向該腫瘤細胞表面上該等新抗原中之至少一者的免疫反應。
  100. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該至少一種新抗原編碼核酸序列在投與該個體及轉譯時，該I類或該II類MHC新抗原中之至少一者呈遞於抗原呈遞細胞上，造成靶向該腫瘤細胞表面上之該等新抗原中之至少一者的免疫反應，且視情況其中該至少一種新抗原編碼核酸序列中至少一者之表現係由該至少一個啟動子核苷酸序列驅動。
  101. 3至5或7至100中任一項之組合物，其中每一I類MHC新抗原編碼核酸序列編碼長度在8與35個胺基酸之間、視情況長度為9至17個、9至25個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個或35個胺基酸之多肽序列。
  102. 3或7至101中任一項之組合物，其中存在該至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列。
  103. 3至5或7至101中任一項之組合物，其中存在該至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列且其包含至少一個II類MHC新抗原編碼核酸序列，該新抗原編碼核酸序列包含至少一個變化使得該編碼肽序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列。
  104. 3至5或7至103中任一項之組合物，其中該至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列之長度為12至20個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或20至40個胺基酸。
  105. 3至5或7至104中任一項之組合物，其中存在該至少一個II類MHC抗原編碼核酸序列且其包含至少一個通用II類MHC抗原編碼核酸序列，視情況其中該至少一個通用序列包含破傷風類毒素及PADRE中之至少一者。
  106. 3至5或7至105中任一項之組合物，其中該至少一個啟動子核苷酸序列或該第二啟動子核苷酸序列為可誘導的。
  107. 3至5或7至105中任一項之組合物，其中該至少一個啟動子核苷酸序列或該第二啟動子核苷酸序列為不可誘導的。
  108. 3至5或7至107中任一項之組合物，其中該至少一個聚(A)序列包含對於該阿爾法病毒係天然之聚(A)序列。
  109. 3至5或7至107中任一項之組合物，其中該至少一個聚(A)序列包含對於該阿爾法病毒係外源之聚(A)序列。
  110. 3至5或7至109中任一項之組合物，其中該至少一個聚(A)序列可操作地連接至該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者。
  111. 3至5或7至110中任一項之組合物，其中該至少一個聚(A)序列係至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個或至少90個連續A核苷酸。
  112. 3至5或7至110中任一項之組合物，其中該至少一個聚(A)序列係至少100個連續A核苷酸。
  113. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該新抗原盒進一步包含以下中之至少一者，其可操作地連接至該至少一個抗原編碼核酸序列中之至少一者：內含子序列、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)序列、內部核糖體進入序列(IRES)、編碼2A自裂解肽序列之核苷酸序列、編碼弗林蛋白酶(Furin)裂解位點之核苷酸序列，或在5’端或3’端非編碼區中已知增強mRNA之核輸出、穩定性或轉譯效率之序列。
  114. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該新抗原盒進一步包含報導基因，包括(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)、GFP變體、分泌性鹼性磷酸酶、螢光素酶、螢光素酶變體，或可檢測肽或表位。
  115. 如請求項114之組合物，其中該可檢測肽或表位選自由以下組成之群：HA標籤、Flag標籤、His標籤或V5標籤。
  116. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多種載體進一步包含一或多個編碼至少一種免疫調節劑之核酸序列。
  117. 如請求項116之組合物，其中該免疫調節劑係抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  118. 如請求項117之組合物，其中該抗體或其抗原結合片段係Fab片段、Fab’片段、單鏈Fv (scFv)、呈單特異性或連接在一起之多特異性之單域抗體(sdAb) (例如駱駝科動物(camelid)抗體域)或全長單鏈抗體(例如全長IgG，其中重鏈及輕鏈藉由撓性連接體連接)。
  119. 如請求項117或118之組合物，其中該抗體之重鏈及輕鏈序列係藉由自裂解序列(諸如2A或IRES)分隔開之鄰接序列；或該抗體之重鏈及輕鏈序列係藉由撓性連接體(諸如連續甘胺酸殘基)連接。
  120. 如請求項116之組合物，其中該免疫調節劑係細胞介素。
  121. 如請求項120之組合物，其中該細胞介素係IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21或其各者變體中之至少一者。
  122. 3至5或7至121中任一項之組合物，其中該至少一個I類MHC新抗原編碼核酸序列係藉由實施以下步驟選擇： (a) 從該腫瘤獲得外顯子體(exome)、轉錄體或全基因體之腫瘤核苷酸測序數據中之至少一者，其中使用該腫瘤核苷酸測序數據來獲得代表新抗原集中之每一者之肽序列之數據； (b) 將每一新抗原之肽序列輸入呈遞模型中，以產生該等新抗原中之每一者由該腫瘤之腫瘤細胞表面上之該等MHC對偶基因中的一或多者呈遞之數值似然度集，該數值似然度集業已至少基於所獲得之質譜數據鑑別；及 (c) 基於該數值似然度集選擇該新抗原集之子集，以產生經選擇新抗原集，該等經選擇新抗原係用以產生該至少一個I類MHC新抗原編碼核酸序列。
  123. 如請求項2或6之組合物，其中該等I類MHC表位編碼核酸序列中之每一者係藉由實施以下步驟選擇： (a) 從該腫瘤獲得外顯子體、轉錄體或全基因體之腫瘤核苷酸測序數據中之至少一者，其中使用該腫瘤核苷酸測序數據來獲得代表新抗原集中之每一者之肽序列之數據； (b) 將每一新抗原之肽序列輸入呈遞模型中，以產生該等新抗原中之每一者由該腫瘤之該腫瘤細胞表面上之該等MHC對偶基因中的一或多者呈遞之數值似然度集，該數值似然度集業已至少基於所獲得之質譜數據鑑別；及 (c) 基於該數值似然度集選擇該新抗原集之子集以產生經選擇新抗原集，該等經選擇新抗原係用以產生該至少20個I類MHC新抗原編碼核酸序列。
  124. 如請求項122之組合物，其中該經選擇新抗原集之數量為2至20。
  125. 如請求項122至124之組合物，其中該呈遞模型代表以下之間之依賴性： (a) 該等MHC對偶基因中之特定一者及肽序列特定位置之特定胺基酸之配對的存在；與 (b) 藉由該配對之該等MHC對偶基因中之特定一者，包含該特定胺基酸在該特定位置之該肽序列呈遞於該腫瘤細胞表面上的似然度。
  126. 如請求項122至125之組合物，其中選擇該組經選擇新抗原包含基於該呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加呈遞於該腫瘤細胞表面上之似然度的新抗原。
  127. 如請求項122至126之組合物，其中選擇該經選擇新抗原集包含基於該呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加能夠誘導該個體中腫瘤特異性免疫反應之似然度的新抗原。
  128. 如請求項122至127之組合物，其中選擇該經選擇新抗原集包含基於該呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有增加能夠藉由專業抗原呈遞細胞(APC)呈遞至初始(naïve) T細胞之似然度的新抗原，視情況其中該APC係樹突細胞(DC)。
  129. 如請求項122至128之組合物，其中選擇該經選擇新抗原集包含基於該呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有減小經由中樞或周邊耐受性受抑制之似然度的新抗原。
  130. 如請求項122至129之組合物，其中選擇該經選擇新抗原集包含基於該呈遞模型選擇相對於未經選擇之新抗原具有減小能夠誘導該個體中針對正常組織自體免疫反應之似然度的新抗原。
  131. 如請求項122至130之組合物，其中外顯子體或轉錄體核苷酸測序數據係藉由對該腫瘤組織實施測序來獲得。
  132. 如請求項131之組合物，其中該測序係次世代測序(NGS)或任一大量平行測序方法。
  133. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該新抗原盒包含由該新抗原盒中之相鄰序列形成之接合表位序列。
  134. 如請求項133之組合物，其中至少一個或每一接合表位序列具有大於500 nM之MHC親和力。
  135. 如請求項133或134之組合物，其中每一接合表位序列係非自身的。
  136. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該新抗原盒不編碼包含經轉譯之野生型核酸序列之非治療性I類或II類MHC表位核酸序列，其中該非治療性表位經預測顯示於該個體之MHC對偶基因上。
  137. 如請求項136之組合物，其中該非治療性經預測I類或II類MHC表位序列係由該新抗原盒中之相鄰序列形成之接合表位序列。
  138. 如請求項133至137之組合物，其中該預測係基於藉由將該等非治療性表位之序列輸入呈遞模型中產生之呈遞似然度。
  139. 如請求項133至138中任一項之組合物，其中該新抗原盒中該至少一個抗原編碼核酸序列之順序係藉由包含以下之一系列步驟來確定： (a)產生候選新抗原盒序列集，其係對應於該至少一個抗原編碼核酸序列之不同順序； (b)基於該候選新抗原盒序列中之非治療性表位之呈遞，判定每一候選新抗原盒序列之呈遞分數；及 (c)選擇與低於預定臨限值之呈遞分數相關之候選盒序列作為新抗原疫苗之新抗原盒序列。
  140. 一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之組合物及醫藥上可接受之載劑。
  141. 如請求項140之組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
  142. 如請求項140或141之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含免疫調節劑。
  143. 如請求項142之醫藥組合物，其中該免疫調節劑係抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  144. 一種經分離之核苷酸序列或經分離之核苷酸序列集，其包含如前述組合物請求項中任一項之新抗原盒及一或多個自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之序列獲得之元件，視情況其中該一或多個元件選自由以下組成之群：非結構蛋白介導之擴增所需之序列、26S啟動子核苷酸序列、聚(A)序列，及SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中所示序列之nsP1-4基因，且視情況其中該核苷酸序列係cDNA。
  145. 如請求項144之經分離之核苷酸序列，其中該序列或該經分離之核苷酸序列集包含如前述組合物請求項中任一項之新抗原盒，其插入在SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示序列之7544位置。
  146. 如請求項144或145之經分離之核苷酸序列，其進一步包含： 該一或多個自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之序列獲得之元件5’端之T7或SP6 RNA聚合酶啟動子核苷酸序列；及 視情況該聚(A)序列3’端之一或多個限制位點。
  147. 如請求項144之經分離之核苷酸序列，其中如前述組合物請求項中任一項之新抗原盒插入在SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9之7563位置。
  148. 一種載體或載體集，其包含如請求項144至147之核苷酸序列。
  149. 一種經分離之細胞，其包含如請求項144至148之核苷酸序列或經分離之核苷酸序列集，視情況其中該細胞係BHK-21、CHO、HEK293或其變體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a細胞。
  150. 一種套組，其包含如前述組合物請求項中任一項之組合物及使用說明書。
  151. 一種治療患有癌症之個體之方法，該方法包含向該個體投與如前述組合物請求項中任一項之組合物或如請求項140至143中任一項之醫藥組合物。
  152. 如請求項151之方法，其中該至少一個衍生自腫瘤之I類MHC新抗原編碼核酸序列係衍生自該患有癌症之個體之腫瘤。
  153. 如請求項151之方法，其中該至少一個I類MHC新抗原編碼核酸序列並非衍生自該患有癌症之個體之腫瘤。
  154. 一種誘導個體中之免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與如前述組合物請求項中任一項之組合物或如請求項140至143中任一項之醫藥組合物。
  155. 如請求項151至154之方法，其中該組合物係經肌內(IM)、皮內(ID)、皮下(SC)或靜脈內(IV)投與。
  156. 如請求項151至154之方法，其中該組合物係經肌內投與。
  157. 如請求項151至156中任一項之方法，該方法進一步包含投與一或多種免疫調節劑，視情況其中該免疫調節劑係在投與該組合物或醫藥組合物之前、同時或之後投與。
  158. 如請求項157之方法，其中該一或多種免疫調節劑選自由以下組成之群：抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  159. 如請求項157或158之方法，其中該免疫調節劑係經靜脈內(IV)、肌內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。
  160. 如請求項159之方法，其中該皮下投與係在該組合物或醫藥組合物投與位點附近或緊靠近一或多種載體或組合物引流淋巴結。
  161. 如請求項151至160中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與第二疫苗組合物。
  162. 如請求項161之方法，其中投與該第二疫苗組合物係在投與如請求項151至160中任一項之組合物或醫藥組合物之前。
  163. 如請求項161之方法，其中投與該第二疫苗組合物係在投與如請求項151至160中任一項之組合物或醫藥組合物之後。
  164. 如請求項162或163之方法，其中該第二疫苗組合物與如請求項151至160中任一項之組合物或醫藥組合物相同。
  165. 如請求項162或163之方法，其中該第二疫苗組合物與如請求項151至160中任一項之組合物或醫藥組合物不同。
  166. 如請求項165之方法，其中該第二疫苗組合物包含編碼至少一個抗原編碼核酸序列之黑猩猩腺病毒載體。
  167. 如請求項166之方法，其中由該黑猩猩腺病毒載體編碼之該至少一個抗原編碼核酸序列與如前述組合物請求項中任一項之該至少一個抗原編碼核酸序列相同。
  168. 一種製造如前述組合物請求項中任一項之該一或多種載體之方法，該方法包含： (a) 獲得包含RNA阿爾法病毒主鏈及新抗原盒之線性化DNA序列； (b) 藉由將該線性化DNA序列添加至活體外轉錄反應中進行活體外轉錄該線性化DNA序列，該活體外轉錄反應含有所有使該線性化DNA序列轉錄成RNA所需之組分，視情況進一步在活體外包含將m7g帽添加至所得RNA中；及 (c) 自該活體外轉錄反應分離該一或多種載體。
  169. 如請求項168之製造方法，其中該線性化DNA序列係藉由將DNA質體序列線性化或藉由使用PCR擴增來產生。
  170. 如請求項169之製造方法，其中該DNA質體序列係利用在細菌細胞中以下之一者產生：細菌重組、或全基因體DNA合成、或全基因體DNA合成與經合成DNA之擴增。
  171. 如請求項168之製造方法，其中自該活體外轉錄反應分離該一或多種載體涉及酚氯仿萃取、基於二氧化矽管柱之純化、或類似RNA純化方法中之一或多者。
  172. 一種製造用於遞送新抗原表現系統之如前述組合物請求項中任一項之組合物之方法，該方法包含： (a) 提供該奈米微粒遞送媒劑之組分； (b) 提供該新抗原表現系統；及 (c) 提供足以使該奈米微粒遞送媒劑及該新抗原表現系統產生用於遞送該新抗原表現系統之組合物之條件。
  173. 如請求項172之製造方法，其中該等條件係藉由微流體混合(microfluidic mixing)來提供。
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