ES2300261T3 - Potenciacion de la respuesta inmune para aplicaciones de vacunas y terapia genetica. - Google Patents
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Abstract
Una caja de expresión, que comprende un promotor ligado de manera operable a una molécula de ácido nucleico que, cuando se transcribe in vivo, forma un ARN de doble hebra que induce la producción de interferón, en la que la caja de expresión está seleccionada entre el grupo constituido por: (a) una caja de expresión que, cuando se transcribe in vivo, forma ARN auto-complementario; y (b) una caja de expresión que comprende un primer promotor ligado de manera operable a una primera molécula de ácido nucleico, y un segundo promotor ligado de manera operable a una segunda molécula de ácido nucleico, en la que la primera y segunda moléculas de ácido nucleico, cuando se transcriben in vivo, forman un ARN de doble hebra que induce la producción de interferón.
Description
Potenciación de la respuesta inmune para
aplicaciones de vacunas y terapia genética.
La presente invención se refiere de manera
general a composiciones y procedimientos farmacéuticos, y más
específicamente, a una diversidad de composiciones y procedimientos
adecuados para el incremento, potenciación, o estimulación de una
respuesta inmune, particularmente para aplicaciones de vacunas
profilácticas y terapéuticas en las áreas de enfermedad infecciosa
y cáncer.
Se ha acometido una investigación substancial
con el fin de verificar la posibilidad de que el curso de la
enfermedad pueda ser afectada a través de la introducción de ácidos
nucleicos dentro de organismos vivos. Cuando se ha usado para fines
médicos, dicha terapia, denominada "terapia de genes", permite
la alteración del repertorio genético de células para un beneficio
terapéutico.
Se han descrito una diversidad de procedimientos
para el suministro de ácidos nucleicos a células, incluyendo por
ejemplo, el uso de vectores víricos obtenidos de retrovirus,
adenovirus, poxvirus, virus del herpes, y virus
adeno-asociados (véase, Jolly, Cancer Gene
Therapy, vol. 1, págs. 51-64, (1994)), así como
técnicas de transferencia directa de ácido nucleico, incluyendo
inyección directa de ADN (Donnelly, J.J. y otros, Ann. Rev.
Immunol., vol. 15, págs. 617-648, (1997)),
bombardeo con micro-proyectiles (Williams y otros,
PNAS, vol. 88, págs. 2726-2730, (1991)), y
complejos de ácido nucleico con lípidos de diversos tipos (Felgner
y otros, Proc. Ntal. Acad. Sci. USA, vol. 84, págs.
7413-7417, (1989)). Muchas de estas estrategias han
sido aplicadas ampliamente, con ensayos clínicos actualmente en
marcha para una amplia gama de enfermedades hereditarias (por
ejemplo, deficiencia de ADA, fibrosis cística, hemofilia) y
adquiridas (por ejemplo, cáncer, infección vírica) (Crystal,
Science, vol. 270, págs. 404-410,
(1995)).
Una aplicación particularmente importante de la
terapia de genes es en el campo de las vacunas. En resumen, las
vacunas de virus vivos (por ejemplo, vaccinia, polio, sarampión) han
sido enormemente satisfactorias y han tenido un impacto histórico y
dramático sobre la salud pública. Sin embargo, para ciertos
patógenos, tal como VIH, la seguridad que concierne tanto a la
reversión de cepas de vacunas atenuadas a fenotipos virulentos,
como a la inducción a una infección fulminante en individuos
inmuno-comprometidos, ha forzado el desarrollo de
vacunas de virus inactivados o subunidades. Desgraciadamente, en
muchos casos, estas vacunas no han provocado las potentes
respuestas inmunes humoral, celular, y mucosal de amplia base o de
memoria a plazo largo necesarias para conferir protección durante
un periodo largo de vida a individuos inmunizados. La inducción de
dichas respuestas inmunes potentes sería particularmente importante
para vacunas contra la infección por VIH y HCV, ambas de las cuales
han alcanzado proporciones epidémicas mundiales y han probado ser,
hasta la fecha, elusivas a las vacunas candidatas.
Las vacunas basadas en ADN plásmido, aún
relativamente nuevas, combinan los últimos desarrollos de biología
molecular con un conocimiento siempre creciente de la inmunología, y
muestran ser prometedoras para la inmunización contra la infección
con patógenos, tal como VIH, así como otras enfermedades para las
cuales se necesitan vacunas mejoradas (por ejemplo, virus de
influenza). De manera importante, la inmunización de ADN provoca
las respuestas inmunes humoral y celular en roedores y primates no
humanos. El ADN es un modo atractivo para la vacunación, ya que
proporciona las ventajas de la seguridad de las vacunas de virus
inactivados o subunidades, e induce las respuestas de célula T
citotóxica restringida al MHC de clase I típicas del virus vivo, o
vacunas de "antígeno replicante", las cuales pueden ser
críticas con respecto a la eficacia (Donnelly, J.J y otros, véase
cita anterior).
Sin embargo, desgraciadamente, los ensayos
clínicos de vacunas de ADN recientes han demostrado que, aunque se
observaron respuestas de linfocito T citotóxico específicas del
antígeno en individuos vacunados, estas respuestas fueron
insuficientes para proporcionar protección contra la exposición con
el agente infeccioso (Wang, R. y otros, Science, vol. 282,
págs. 476-480, (1998); Calarota, S. y otros,
Lancet, vol. 351, págs. 1320-1325, (1998)).
De acuerdo con ello, para que la vacunación a base de ADN llegue a
ser un procedimiento ampliamente usado para protección contra una
enfermedad infecciosa y cáncer, la tecnología debe ser mejorada
adicionalmente. En Gene, vol. 164, págs.
9-15, (1995), N. Mertens y otros, describen cajas de
expresión usadas para la transcripción de ARNs cortos, en los
cuales las cajas comprenden promotores procarióticos ligados de
manera operable a un gen heterólogo que codifica interferón humano o
murino. En Journal of interferon Research, vol. 9, págs.
543- 550, (1989), S. Gessani y otros, implican la inducción de
interferón en células C127 usando ARN de doble hebra exógeno.
La presente invención proporciona composiciones
y procedimientos para potenciar la eficacia de vectores de ADN, así
como una diversidad de otros vectores de suministro de genes, usados
para inmunización genética. Dichas mejoras pueden incluir
modificaciones inmunoestimuladoras al propio vector de expresión del
antígeno, o la administración in vivo, conjuntamente con el
vector de expresión del antígeno, de uno o más vectores de
suministro de genes adicionales que son inmunoestimuladores. Las
mejoras aquí descritas están dirigidas a las dificultades previas
asociadas con el uso de vectores de suministro de genes mediante la
potenciación de la extensión de la respuesta inmune específica del
antígeno, proporcionando, de esta forma, las respuestas amplias y
firmes críticas para la vacunación profiláctica o terapéutica
satisfactoria contra agentes infecciosos y cáncer.
Expresado de forma resumida, la presente
invención proporciona composiciones y procedimientos para el
incremento, potenciación, o estimulación de una respuesta inmune.
Por ejemplo, dentro de un aspecto de la invención, se proporcionan
cajas de expresión que comprenden un promotor ligado de manera
operable a una molécula de ácido nucleico que, cuando se transcribe
in vivo, forma un ARN de doble hebra que induce la producción
de interferón (alfa, beta o gamma) tanto directamente como
indirectamente, el cual a su vez puede sobreregular moléculas de
MHC de Clase I y/o Clase II, estimulando, de esta forma, una
respuesta inmune.
Dentro de un aspecto de la presente invención,
se proporcionan cajas de expresión que comprenden un promotor
ligado de manera operable a una molécula de ácido nucleico que,
cuando se transcribe in vivo, forma ARN de doble hebra que
induce la producción de interferón, en el que la caja de expresión
está seleccionada entre el grupo constituido por: (a) una caja de
expresión que, cuando se transcribe in vivo, forma ARN
auto-complementario; y (b) una caja de expresión
que comprende un primer promotor ligado de manera operable a una
primera molécula de ácido nucleico, y un segundo promotor ligado de
manera operable a una segunda molécula de ácido nucleico, en el que
la primera y segunda moléculas de ácido nucleico, cuando se
transcriben in vivo, forman un ARN de doble hebra que induce
la producción de interferón. Dentro de diversas realizaciones de la
invención, el ARN puede ser o bien de codificación o bien de no
codificación.
Pueden proporcionarse cajas de expresión que
comprenden un promotor ligado de manera operable a un ribozima o
molécula de ácido nucleico antisentido que, cuando se transcribe
in vivo, forma un ribozima o molécula de ARN antisentido que
estimula una respuesta inmune. El ribozima o molécula antisentido
puede inhibir la expresión de una proteína que puede inhibir al
menos un aspecto de una respuesta inmune. Los ejemplos
representativos de proteínas adecuadas que pueden se inhibidas de
acuerdo con ello, incluyen IRF2, YY1, IL-10,
TGF-\beta y ciclooxigenasa. Debería indicarse que
la inhibición de la expresión de la proteína puede producirse en
ciertos casos mediante la unión y/o escisión de ARNm por el
ribozima o molécula antisentido.
Pueden proporcionarse cajas de expresión que
comprenden un promotor ligado de manera operable a un ribozima o
molécula de ácido nucleico antisentido que, cuando se transcribe
in vivo, estimulan la apoptosis. Los ejemplos
representativos de ribozimas o moléculas antisentido adecuados
incluyen aquellos que escinden o inhiben dianas dentro de una
cascada de apoptosis, incluyendo por ejemplo Bcl-2 y
Bcl-xL.
Dentro de otros aspectos, se proporcionan cajas
de expresión que comprenden un primer promotor ligado de manera
operable a una molécula de ácido nucleico que, cuando se transcribe
in vivo, forma ARN de doble hebra que induce la producción
de interferón, y un segundo promotor ligado de manera operable a una
molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno a partir de un
agente patógeno. Las cajas de expresión pueden comprender un primer
promotor ligado de manera operable a un ribozima o molécula de ácido
nucleico antisentido que, cuando se transcribe in vivo,
estimula la apoptosis, y un segundo promotor ligado de manera
operable a una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno
a partir de un agente patógeno. Dentro de ciertas realizaciones, el
agente patógeno es un virus, bacteria, hongo, parásito o célula
cancerosa. Las cajas de expresión pueden dirigir la expresión tanto
de un polipéptido que promueve la apoptosis como de un antígeno a
partir de un agente patógeno. El antígeno a partir del agente
patógeno y el polipéptido que promueve la apoptosis están
expresados a partir de promotores separados. Los ejemplos
representativos de polipéptidos pro-apoptóticos
incluyen Bax, Bik, Bcl-xL. Como alternativa, el
polipéptido y el antígeno pueden transcribirse a partir del mismo
promotor y expresarse mediante un Sitio de Entrada de Ribosoma
Interno o ribosoma de lectura completa.
Dentro de diversas realizaciones, cualquiera de
las cajas de expresión anteriores pueden contener un promotor ARN
polimerasa I, ARN polimerasa II (por ejemplo, CMV, SV40, MoMLV LTR y
RSV LTR), o ARN polimerasa III (por ejemplo, un promotor Adenovirus
VA1).
Las cajas de expresión anteriormente indicadas
pueden comprender además un promotor adicional ligado de manera
operable a una molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido de interés. El promotor puede ser un promotor ARN
polimerasa II (por ejemplo, CMV, SV40, MoMLV LTR y RSV LTR). Pueden
expresarse una amplia variedad de polipéptidos, incluyendo por
ejemplo polipéptidos que promueven la apoptosis, antígenos a partir
de un agente patógeno, enzimas que convierten profármacos, y
citocinas (por ejemplo, gamma interferón, IL-2,
IL-12, e IL-15). Los agentes
patógenos pueden incluir virus (por ejemplo, VIH, HSV, HBV, HCV,
HPV, y FIV), bacterias, parásitos, hongos y tumores.
Dentro de aspectos relacionados, la presente
invención proporciona además vectores de suministro de genes que
contienen una o más de las cajas de expresión aquí descritas. Los
ejemplos representativos de vectores de suministro de genes
incluyen plásmidos y vectores víricos recombinantes obtenidos de
retrovirus, herpesvirus, poxvirus, adenovirus, AAV, parvovirus,
alfavirus, poliomavirus, y vesiculovirus.
Las cajas de expresión y vehículos de suministro
de genes tal como aquí se describen, pueden transformarse,
transfectarse o introducirse de otra forma dentro de una amplia
diversidad de células huéspedes, incluyendo por ejemplo, una amplia
diversidad de células de vertebrados (por ejemplo, células de
mamíferos tales como humano, primate no humano, caballo, perro,
ratón).
Las cajas de expresión y vehículos de suministro
de genes tal como se proporcionan aquí, pueden usarse para
estimular una respuesta inmune dentro de un huésped deseado,
comprendiendo la etapa general de administración a un animal de una
caja de expresión o un vector de suministro de gen tal como se
describen aquí, de manera tal que se genere una respuesta
inmune.
Estos y otros aspectos de la presente invención
resultarán evidentes con referencia a la descripción detallada
siguiente y a los dibujos adjuntos. Además, se establecen aquí
diversas referencias, las cuales describen con mayor detalle
ciertos procedimientos o composiciones (por ejemplo, constructos de
ADN).
La Figura 1 es una ilustración esquemática de
una clase de caja de expresión de ARNds que produce ARN con una
horquilla.
La Figura 2 es una ilustración esquemática de
una clase de caja de expresión de ARNds que produce ARN de doble
hebra verdadera.
La Figura 3 es una ilustración esquemática de
una clase de caja de expresión de ARNds que produce ARN
circular.
La Figura 4 es una ilustración esquemática de
vectores de ADN con cajas de expresión de ARN de doble hebra y de
antígeno.
Las Figuras 5A y 5B son ilustraciones
esquemáticas de vectores de plásmidos con cajas
pro-apoptóticas y de antígeno.
La Figura 6 describe diversos sitios de escisión
diana en ARNm de Cox2, IRF2, YY1 y IL-10.
Antes del establecimiento de la invención,
puede ser útil un conocimiento de la misma para establecer, en
primer lugar, las definiciones de ciertos términos que se usarán
aquí más adelante.
"Caja de expresión" se refiere a una
unidad de transcripción que comprende un promotor ligado de manera
operable a una molécula de ácido nucleico, de manera tal que dicha
transcripción a partir del promotor da como resultado la síntesis
de un ARN que corresponde a la molécula de ácido nucleico. La caja
de expresión puede comprender además un sitio de terminación de
transcripción y/o de poliadenilación.
"Molécula de ácido nucleico aislada"
es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN
genómico de un organismo o células obtenidas de un organismo. Por
ejemplo, una molécula de ADN que codifica un gen que ha sido
separada del ADN genómico de una célula eucariótica es una molécula
de ADN aislada. Otros ejemplos de moléculas de ácido nucleico
aisladas incluyen moléculas de ácido nucleico químicamente
sintetizadas, y moléculas de ácido nucleico que han sido obtenidas
por medios recombinantes (por ejemplo, PCR).
"Huésped recombinante" se refiere a
cualquier célula procariótica o eucariótica que contenga o bien un
vector de suministro de genes o bien un vector de expresión. Este
término incluye igualmente aquellas células procarióticas o
eucarióticas que han sido manipuladas genéticamente para contener
los genes clonados en el cromosoma o genoma de la célula
huésped.
Un "oligonucleótido antisentido" o
"molécula antisentido" se refiere a un oligonucleótido
que tiene una secuencia (a) capaz de formar un triplex estable con
una porción del gen, o (b) capaz de formar un dúplex estable con
una porción de un transcripto de ARNm.
"Ribozima" se refiere a una molécula
de ácido nucleico que es capaz de escindir una secuencia de ácido
ribonucleico específico. Los ribozimas pueden estar compuestos de
ARN, ADN, análogos de ácidos nucleicos (por ejemplo,
fosforotioatos), o cualquier combinación de estos (por ejemplo,
ADN/ARN quiméricos). Dentro de realizaciones particularmente
preferidas, un ribozima debería entenderse que se refiere a
moléculas de ARN que contienen secuencias antisentido para
reconocimiento específico, y una actividad enzimática de escisión de
ARN.
"Gen de ribozima" se refiere a una
molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) constituida por la
secuencia de ribozima, la cual, cuando se transcribe dentro de ARN,
proporcionará el ribozima.
"Promotor" es una secuencia de
nucleótido que dirige la transcripción de un gen o ARN que codifica
una no proteína. Típicamente, un promotor se localiza en la región
5' adyacente a la secuencia que codifica un gen o ARN que ha de
expresarse, y próximo al sitio de inicio de la transcripción. Si un
promotor es un promotor inducible, en ese caso, el nivel de
transcripción se incrementa en respuesta a un agente de
inducción.
"Vector de suministro de gen o GDV"
es un vehículo para el suministro de secuencias de ácido nucleico a
las células. Los GDV incluyen vectores víricos, vectores de ácido
nucleico tales como plásmidos, moléculas de ácido nucleico
desprotegidas tales como ADN o ARN, moléculas de ácido nucleico
acomplejadas a uno o más moléculas policatiónicas capaces de
neutralizar parte o la totalidad de la carga negativa sobre una
molécula de ácido nucleico y de condensar la molécula de ácido
nucleico en una estructura compacta, ácido nucleico asociado con
liposomas, bacterias, y ciertas células eucarióticas tales como
células productoras, capaces de suministrar una molécula de ácido
nucleico que tiene una o más propiedades deseables para las células
huéspedes en un organismo. Tal como se expone más adelante, las
propiedades deseables incluyen la capacidad para expresar una
substancia deseada, tal como una proteína (por ejemplo, una enzima,
anticuerpo, fragmento de anticuerpo, factor regulador, ligando) o
molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ARN antisentido, ARN con
sentido, ribozima), en la que la molécula de ácido nucleico portada
por el GDV puede ser ella misma el agente activo sin que requiera
la expresión de una substancia deseada. Un ejemplo de una molécula
de ácido nucleico es una molécula antisentido que se une a ARNm e
inhibe la traducción. Otro ejemplo, es aquel en el que la molécula
de ácido nucleico contiene el código de un ribozima que se une y
escinde el ARN, inhibiendo, de esta forma, la traducción.
"Vector retrovírico recombinante" se
refiere a un vector de suministro de gen que es capaz de dirigir la
expresión de una secuencia o secuencias de un gen o genes de
interés. Preferiblemente, el vector retrovírico recombinante
debería incluir un 5'LTR, u sitio de unión de ARNt, una señal de
encapsidación, una o más secuencias heterólogas, un origen de
síntesis de ADN de segunda hebra y un 3' LTR. Igualmente, el vector
retrovírico recombinante puede incluir un promotor/potenciador de
transcripción, u otros elementos que controlan la expresión del gen
por medios tales como corte y empalme alternativo, exportación de
ARN nuclear, modificación post-transcripción de
mensajero, o modificación post-transcripción de
proteína. Opcionalmente, el vector retrovírico recombinante puede
incluir igualmente marcadores seleccionables que confieran, a la
célula transducida o transfectada, resistencia o sensibilidad a uno
o más compuestos.
La presente invención se refiere a la
introducción de secuencias de ácido nucleico dentro de un vertebrado
para logar la expresión de ARN que estimule directa o
indirectamente de uno o más compuestos la respuesta inmune. Las
moléculas pueden expresarse a partir de cualquiera de entre un
cierto número de sistemas de suministro diferentes, bien solos o
bien co-expresados con u polipéptido antigénico o
terapéutico.
De acuerdo con ello, la presente invención puede
ser usada para una diversidad de fines terapéuticos, incluyendo por
ejemplo, para el fin de vacunación profiláctica o terapéutica, y
para otras aplicaciones de terapia de genes. Con el fin de un
conocimiento adicional de las invenciones aquí proporcionadas, se
proporciona una exposición más detallada de (A) cajas de expresión;
(B) generación de vectores de suministro de genes; y (C)
procedimientos para el uso de cajas de expresión y vectores de
suministro de genes para una diversidad de aplicaciones (por
ejemplo, para un fin terapéutico, o, para uso en trabajos de
laboratorio).
Tal como se ha indicado anteriormente, la
presente invención proporciona una diversidad de cajas de expresión
que dirigen la generación de ARN, así como opcionalmente, un gen
seleccionado de interés, lo que incrementa, potencia, o estimula
una respuesta inmune. Tal como se describe con mayor detalle más
adelante, las cajas de expresión (que comprenden un promotor ligado
de manera operable a una molécula de ácido nucleico de interés)
pueden generarse para expresar ARN de doble hebra, ribozimas y ARN
antisentido, así como antígenos o polipéptidos terapéuticos de
interés. Cada uno de estos se expone con mayor detalle más
adelante.
En resumen, mediante el uso de las cajas de
expresión y/o vectores de suministro de genes aquí descritos, puede
producirse ARN de doble hebra (ARNds) intracelularmente para una
diversidad de aplicaciones. La presencia intracelular de ARNds
induce la síntesis de interferones \alpha, \beta, y \gamma
(IFN-\alpha, IFN-\beta,
IFN-\gamma; interferón Tipo I:
IFN-\alpha e IFN-\beta;
interferón Tipo II: IFN-\gamma). La producción de
interferones de Tipo I y II, a su vez, induce tanto una respuesta
inmune específica del antígeno como no específica del antígeno,
estimulando directamente linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+,
células asesinas (NK) naturales, y monolitos/macrófagos. Además,
estos interferones potencian la presentación de antígeno a través
de la expresión incrementada de MHC de clase I y clase II sobre la
superficie de la célula. En la presente invención se proporcionan
composiciones y procedimientos para la expresión de ARNds no
codificante en el contexto de expresión de un antígeno deseado. La
expresión de ARNds de acuerdo con la invención potencia la robustez
general de las respuestas inmunes específicas del antígeno.
La inducción de interferones de Tipo I y II,
como un resultado de la presencia intracelular de ARNds, induce, a
su vez, la síntesis de proteína quinasa R (PKR), y
2',5'-oligoadenilato sintetasa (2,5' OAS) (Jacobs y
Langland, Virology, vol. 219, págs. 339-349,
(1996)). La activación de PKR y 2',5' OAS puede conducir, a su vez,
a la apoptosis en una célula dada, cuando la relación de agonistas
muertos, por ejemplo Bax y Bak, a antagonistas muertos, por ejemplo
Bcl-2, excede de la unidad (para revisiones, véase
Kroemer, Nat. Med., vol. 6, págs. 614-620,
(1997); y Adams y Cory, Science, vol. 281, págs.
1322-1326, (1998)). La PKR activada puede producir
directamente esta relación a través de la fosforilación e
inactivación del factor de traducción eif-2\alpha
e I\kappaB. La fosforilación de I\kappaB mediante PKR puede
conducir a la degradación de I\kappaB y subsiguiente activación
de NF-\kappaB (Maran, Virology, vol. 164,
págs. 106-113, (1994). El
NF-\kappaB es un factor de transcripción que
activa la transcripción de genes para citocinas inflamatorias,
incluyendo TNF\alpha (Gilmore, Cancer Biol., vol. 8, págs.
61-62, (1997)). La inducción de TNF\alpha puede
inducir la apoptosis a través de la
vía dependiente de caspasa sensible de CmA/P35 (Thomberry y Lazebnik, Science, vol. 281, págs. 1312-1316, (1998)).
vía dependiente de caspasa sensible de CmA/P35 (Thomberry y Lazebnik, Science, vol. 281, págs. 1312-1316, (1998)).
La inducción de interferones de Tipo I y II y la
apoptosis en el contexto de la expresión de antígeno potencia la
respuesta inmune específica, a través de el cebado eficaz de, por
ejemplo, células dendríticas (DCs). Como células que presentan
antígenos, las CDs fagocitan células apoptóticas, y procesan
antígenos dentro de péptidos en el citosol, que, a su vez, se une a
péptidos MCH de clase I o clase II, y son presentadas a linfocitos
T (Banchereau y Steinman, Nature, vol. 392, págs.
245-252, (1998)). La inducción de la apoptosis, o la
vía de la muerte, en el contexto de la expresión de antígeno con el
fin de potenciar la respuesta inmune, puede llevarse a cabo por una
diversidad de procedimientos diferentes incluyendo, por ejemplo, la
expresión de o bien genes dependientes de caspasa o bien
independientes de caspasa, o la expresión de receptores de muerte
(por ejemplo, CD95 o TNFR1).
Los ejemplos representativos de cajas de
expresión adecuadas se describen con mayor detalle más adelante,
así como en las figuras (véanse Figuras 1-3 para
ilustraciones esquemáticas de cajas de expresión que crean ARNds a
través del uso de horquillas (Figura 1), ARNds verdadero (Figura 2)
y ARN circular (Figura 3).
A partir de las cajas de expresión y/o los
vectores de suministro de genes pueden expresarse una amplia
diversidad de moléculas de ácido nucleico. Estas incluyen (1) ARN
antisentido; (2) ribozimas; (3) polipéptidos, incluyendo antígenos
y proteínas terapéuticas., y polipéptidos apoptópicos.
Dentro de una realización de la invención, se
proporcionan sistemas de suministro que producen una secuencia de
ARN antisentido tras la introducción dentro de una célula huésped.
En resumen, el arco de secuencias de ARN antisentido diseñadas para
unirse a transcriptos de ARN diana y, de esta forma, prevenir la
síntesis celular de una proteína particular o prevenir el uso de
dicha secuencia de ARN por la célula. En realizaciones preferidas,
los transcriptos de ARN codifican productos de genes que controlan o
regulan diversos aspectos de la respuesta inmune o de la vía
apopóptica.
Las secuencias antisentido de la presente
invención pueden ser de una diversidad de tamaños, incluyendo por
ejemplo de 40, 60, 100, 250, 500, o incluso 1000 nucleótidos. Para
realizaciones preferidas, la secuencia antisentido es menor de 100
nucleótidos. La secuencia antisentido puede ser igualmente 100%
complementaria a la secuencia diana, o puede contener una o más
"diferencias" que no son complementarias, siempre y cuando que
el ARN antisentido mantenga su capacidad para unir la secuencia
diana bajo las condiciones fisiológicas del huésped.
Los ejemplos representativos de dichas
secuencias antisentido adecuadas para uso dentro de la presente
invención, incluyen IRF2, YYK1, Cox2, IL-10,
Bcl-2, Bcl-xl, y
TGF-\beta antisentido. La secuencia antisentido
puede ser igualmente un ARN antisentido complementario a secuencias
de ARN necesarias para la patogenicidad. Como alternativa, la
molécula de ácido nucleico activa biológicamente puede ser un ARN (o
ADN) con sentido complementario a secuencias de ARN necesarias para
la patogenicidad.
Los sistemas de suministro pueden producir
ribozimas tras la introducción dentro de una célula huésped. En
resumen, los ribozimas son moléculas de ARN usadas para escindir
ARNs específicos y están diseñadas de manera tal que pueden afectar
únicamente a una secuencia de ARN específica. Generalmente, el
substrato que une la secuencia de un ribozima está comprendida
típicamente dentro de una longitud de 10 y 20 nucleótidos, aunque
pueden usarse igualmente secuencias más largas. La longitud de esta
secuencia es suficiente para permitir la hibridación con el ARN
diana y la disociación de la ribozima del ARN escindido. Pueden
construirse diversos tipos diferentes de ribozimas incluyendo, por
ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo (Rossi, J.J. y otros,
Pharmac. Ther., vol. 50, págs. 245-254,
(1991)) (Foster y Symons, Cell, vol. 48, págs.
211-220, (1987); Haseloff y Gerlach, Nature,
vol. 328, págs. 596-600, (1988); Walbot y Bruening,
Nature, vol. 334, pág. 196, (1988); Haseloff y Gerlach , Nature,
vol. 334, pág. 585, (1988), y patente de EE.UU. No. 5.254.678),
ribozimas de horquilla (Hampel y otros, Nucl. Acids Res.,
vol. 18, págs. 299-304, (1990), y patente de EE.UU.
No. 5.245.678), ribozimas del virus delta de la hepatitis (Perrotta
y Been, Biochem., vol. 31, pág. 16, (1992), ribozimas de
intrón Grupo I (Cech y otros, patente de EE.UU. No. 4.987.071) y
ribozimas RNase P (Takada y otros, Cell, vol. 35, pág. 849,
(1993); (véase, igualmente, patente WO 95/29241, titulada
"Ribozimas con eyección de producto mediante desplazamiento de
hebra", y la patente WO 95/31551, titulada "Nuevas moléculas de
ARN enzimático". (Véanse, igualmente, las patentes de EE.UU.
Nos. 5.116.742; 5.225.337 y 5.246.921). Los ribozimas preferidos
pueden incluir aquellos que identifican transcriptos de ARN que
codifican productos de genes que controlan o regulan diversos
aspectos de la respuesta inmune o la vía apopóptica. Los ribozimas
particularmente preferidos se describen con mayor detalle más
adelante.
Además de los ARNs inmunoestimuladores de la
presente invención, pueden incluirse una amplia diversidad de genes
que codifican polipéptidos antigénicos o terapéuticos, o bien
mediante co-expresión a partir de un vector o bien
co-administración de vectores separados, incluyendo
por ejemplo, secuencias que codifican paliativos tales como
linfocinas, toxinas, o profármacos, antígenos que estimulan una
respuesta inmune, y proteínas que modulan la respuesta inmune o la
vía apopóptica. Los sistemas de suministro pueden contener genes
para dos o más polipéptidos antigénicos o terapéuticos.
Dentro de la presente invención, se proporcionan
constructos que dirigen la expresión de porciones inmunogénicas de
antígenos a partir de organismos extraños u otros agentes patógenos
(por ejemplo, células cancerosas). Los antígenos de vacuna
preferidos a partir de organismos extraños son aquellos que protegen
a los animales de sangre caliente de enfermedades causadas por
agentes infecciosos, tales como bacterias, hongos, parásitos y
virus.
Los ejemplos representativos de dichos antígenos
particularmente relevantes para vacunas humanas incluyen: antígenos
víricos procedentes de arenavirus tales como virus de la fiebre de
Lassa; rotavirus; adenovirus; papilomavirus humano; retrovirus
tales como VIH, HTLV-I y -II; virus del herpes tal
como virus del herpes simple, virus de
Epstein-Barr, citomegalovirus, virus
vahcella-zoster, y virus 6 del herpes humano;
picornavirus tales como poliovirus, rinovirus humano, y virus de la
hepatitis A; togavirus tales como encefalitis equina de Venezuela,
y virus rubela; virus de la hepatitis B; flavivirus tales como virus
del dengue, virus de la encefalitis asociada con garrapatas, y
virus de la hepatitis C; coronavirus humano; rhabdovirus tales como
virus de la rabia, y virus de la estomatitis vesicular; filovirus
tales como virus Ebola y virus Marburg; paramixovirus tales como
virus de la parainfluenza humano, virus de la parotiditis, virus
sincitial respiratorio, y virus del sarampión; virus influenza;
bunyavirus tales como virus Hantaan, y virus de la fiebre del Valle
de Rift; antígenos bacterianos (por ejemplo, procedentes de E.
coli, estreptococos, estafilococos, micobacterias; meningicocos
o helicobacter), antígenos fúngicos y antígenos parasíticos (por
ejemplo, procedentes de Leishmania o malaria).
Los ejemplos representativos de antígenos
particularmente relevantes para aplicaciones veterinarias se
obtienen de Toxoplasma, Dirofilaria, Acanthocheilonema, Babesia,
Brugia, Candida, Cryptococcus, Cryptosporidium, Dipetalonema,
Eimeria, Encephalitozoon, Hepatozoon, Histoplasma, Isospora, Loa,
Microsporidia, Neospora, Nosema, Onchocerca, Parafilaria,
Plasmodium, Pneumocystis, Rochalimaea, Setaria, Stephanofilaria,
Theileria, Toxoplasma, y Wuchereria, virus tales como equino, virus
del herpes, virus de la rinotraqueítis felina, rotavirus porcino,
virus de la lengua azul, FIV, FeLV, BIV, papilomavirus bovino EIAV,
parvovirus canino, virus de la panleucopenia felina, virus de la
glosopeda, enterovirus porcino, TGEV, virus de la peritonitis
infecciosa felina, coronavirus bovino, virus de la rabia, virus del
moquillo canino.
"Porción inmunógena" se refiere a una
porción del antígeno respectivo que es capaz, bajo las condiciones
apropiadas, de inducir una respuesta inmune (por ejemplo, mediada
por células o humoral). Las "porciones" pueden ser de tamaño
variable, pero preferiblemente son de una longitud de al menos 9
aminoácidos, y pueden incluir el antígeno entero.
Las cajas de expresión y los vectores de
suministro de genes pueden dirigir la expresión de un producto de
gen que activa un compuesto con poca o nula citotoxicidad dentro de
un producto tóxico. En resumen, pueden usarse una amplia variedad
de productos de genes que o bien directamente o bien indirectamente
activan un compuesto con poca o nula citotoxicidad dentro de un
producto tóxico. Los ejemplos representativos de dichos productos
de genes incluyen HSVTK y VZVTK, los cuales monofosforilan de manera
selectiva ciertos arabinosidos de purina y compuestos pirimidino
substituidos, convirtiéndoles a metabolitos citotóxicos o
citostáticos. Más específicamente, la exposición de los fármacos
ganciclovir, acyclovir, o cualquiera de sus análogos (por ejemplo,
FIAC, DHPG) a HSVTK, fosforilan el fármaco en su forma nucleotido
trifosfato activa correspondiente.
Otros polipéptidos terapéuticos que pueden
expresarse a partir de las cajas y los vectores de suministro de
genes, incluyen citocinas, tales como IL-1,
IL-2 (Karupiah y otros, J. Immunology, vol.
144, págs. 290-298, (1990); Weber y otros, J.
Exp. Med., vol. 166, págs. 1716-1733, (1987);
Gansbacher y otros, J. Exp. Med., vol. 172, págs.
1217-1224, (1990); patente de EE.UU. No. 4.738.927),
IL-3, IL-4 (Tepper y otros,
Cell, vol. 57, págs. 503-512, (1989);
Golumbek y otros, Science, vol. 254, págs.
713-716, (1991); patente de EE.UU. No. 5.017.691),
IL-5, IL-6 (Brakenhof y otros, J.
Immonol., vol. 139, págs. 4116-4121, (1987);
patente WO 90/06370), IL-7 (patente de EE.UU. No.
4.965.195), IL-8, IL-9,
IL-10, IL-11, IL-12,
IL-13 (Cytokine Bulletin, Summer 1994),
IL-14 e IL-15, particularmente
IL-2, IL-4, IL-6,
IL-12, e IL-13, alfa interferón
(Finter y otros, Drugs, vol. 42, (No. 5), págs.
749-765, (1991); patente de EE.UU. No. 4.892.743;
patente de EE.UU. No. 4.966.843; patente WO 85/02862; Nagata y
otros, Nature, vol. 284, págs. 316-320,
(1980); Familletti y otros, Methods in Enz., vol. 78, págs.
387-394, (1981); Twu y otros, PNAS, vol. 86,
págs. 2046-2050, (1989); Faktor y otros,
Oncogene, vol. 5, págs. 867-872, (1990); beta
interferón (Seif y otros, J. Virol., vol. 65, págs.
664-671, (1991), gamma interferones (Radford y
otros, The American Society of Hepatology, págs.
2008-2015, (1991); Watanabe y otros, PNAS,
vol. 86, págs. 9456-9460, (1089); Gansbacher y
otros, Cancer Research, vol. 50, págs.
7820-7825, (1990); Maio y otros, Can. Immunol.
Immunother., vol. 30, págs. 34-42, (1989);
patente de EE.UU. No. 4.762.791; patente de EE.UU. No. 4.727.138),
G-CSF (patentes de EE.UU. Nos. 4.999.291 y
4.810.643), GM-CSF (patente WO 85/04188), factores
de necrosis de tumor (TNFs) (Jayaraman y otros, J.
Immunology, vol. 144,págs. 942-951, (1990), CD3
(Krissanen y otros, Immunogenetics, vol. 26, págs.
258-266, (1987), ICAM-1 (Altman y
otros, Nature, vol. 338, págs. 512-514,
(1989); Simmons y otros, Nature, vol. 331, págs.
624-627, (1988), ICAM-2,
LFA-1, LFA-3 (Wallner y otros, J.
Exp. Med., vol. 166, (No. 4), págs. 923-932,
(1987), moléculas MHC clase I, moléculas MHC clase II, B7.1-.3,
b_{2}-microglobu-lina (Parnes y
otros, PNAS, vol. 78, págs. 2253-2257,
(1981), acompañantes tales como calnixin, MCH ligadas a
transportadores de proteínas o análogos de las mismas (Powis y
otros, Nature, vol. 354, págs. 528-531,
(1991).
La apoptosis es el proceso normal de muerte
celular programado, que mantiene la homeostasia del tejido (Kerr,
J.F. y otros, Br. J. Cancer, vol. 26, págs.
239-257, (1972)). El proceso de apoptosis está
regulado por señales generadas cuando las citocinas se unen a sus
receptores, lo cual puede producir, a su vez, o bien señales
inductivas o bien inhibidoras que regulan el procesos apoptótico.
Tras la inducción de la apoptosis se produce una cascada de
activación de zimógeno, lo cual eventualmente conduce a la
activación de nucleasas endógenas que escinden la cromatina entre
nucleosomas y reducen el contenido de ADN intacto en células
apoptóticas, conduciendo, de esta forma, a la muerte celular.
Aunque la apoptosis está mediada por una diversidad de señales e
interacciones complejas de productos de genes celulares, los
resultados de estas interacciones desembocan finalmente en una vía
de muerte celular que es, por sí misma, una cascada de activación
de zimógeno (es decir, episodios proteolíticos) análogos a los de
la cascada de coagulación de la sangre.
Actualmente se han identificado diversas
familias de genes y productos que modulan el proceso apoptótico.
Una de dichas familias es la familia Bcl-2, la cual
incluye proteínas inhibidoras de la muerte celular
Bcl-2, Bcl-xL, y
CED-9 así como proteínas que promueven la apoptosis
bax, bak, bcl-xS, y bad. La Bcl-2
fue el primer componente reconocido de muerte celular programada
(Tsujimoto y otros, Science, vol. 228, págs.
1440-1443, (1985); Nunez y otros, J.
Immunol., vol. 144, págs. 3602-3610, (1990);
Reed, Nature, vol. 387, pág. 773, (1997)).
En resumen, la Bcl-2 y su
homóloga Bcl-xL son antagonistas de muerte que se
asocian fundamentalmente con la membrana mitocondrial exterior, el
retículo endoplásmico, y la envoltura nuclear y, más aún, han
documentado actividad del canal de iones (Reed, Nature, vol.
387, pág. 773, (1997)). Estas proteínas pueden prevenir la
apoptosis regulando la homeostasia eléctrica y osmótica del
mitocondria, un proceso que es necesario para prevenir el
hinchamiento mitocondrial, la rotura de la membrana exterior, y la
subsiguiente liberación del citocromo c (Heiden y otros,
Cell, vol. 91, págs. 627-637, (1997)). La
liberación del citocromo c a partir del mitocondria se estima que
es el episodio que inicia la cascada cisteina proteasa de muerte
celular, a través de la formación del complejo
Apaf-1/caspasa-9/citocromo c (Li y
otros, Cell, vol. 91, págs. 479-489, (1997);
Reed, Cell, vol. 91, págs. 559-562, (1997)).
Este complejo en combinación con dATP conduce, a su vez, a la
activación proteolítica del zimógeno caspasa-9, que
inicia, de esta manera, la cascada proteolítica.
Las cisteina proteasas responsables de esta
cascada son cisteina proteasas específicas del aspartato y se hace
referencia a ellas de manera colectiva como proteínas
"caspasa". El primer miembro de la familia caspasa se
identificó como Enzima de Conversión de
Interleuquina-1\beta (ICE), la cual se encontró
que estaba estructural y funcionalmente relacionada con la
CED-3 proteasa que funciona como un efector de
muerte celular en el gusano redondo C. elegans (Yuan y
otros, Cell, vol. 75, pág. 641, (1993)). Después de este
descubrimiento se han identificado muchos otros miembros de la
familia ICE/CED-3 e incluyen, por ejemplo, ICE
humano (enzima de conversión de
interleuquina-1\beta) (caspasa-1),
ICH-1 (caspasa-2), CPP32
(caspasa-3), ICE_{rel}II
(caspasa-4), ICE_{rel}III
(caspasa-5), Mch2 (caspasa-6),
ICE-LAP3 (caspasa-7), Mch5
(caspasa-8), ICE-LAP6
(caspasa-9), Mch4 (caspasa-10), y
otros.
Dado que el proceso apoptótico funciona para
mantener la homeostasis del tejido, pueden asociarse una diversidad
de estados patológicos con la regulación apopóptica anormal. Además,
la pérdida o inhibición de la apoptosis puede conducir a la
acumulación de células infectadas víricamente o a células
hiperproliferativas tales como células de tumores. De manera
similar, la inapropiada activación de la apoptosis puede contribuir
igualmente a una diversidad de estados de enfermedades patológicas
incluyendo, por ejemplo, lesión isquémica. De acuerdo con ello, los
tratamientos que han sido específicamente diseñados para modular las
vías apoptóticas en estas y otras afecciones patológicas pueden
alterar la progresión natural de muchas de estas enfermedades.
Las secuencias que codifican las secuencias
antisentido o ribozimas, antígenos, polipéptidos terapéuticos y
genes aopópticos anteriormente descritos, pueden generarse de manera
sintética o recombinante, u obtenerse a partir de una diversidad de
fuentes, incluyendo por ejemplo, la de depositarios tales como la
American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Las
moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican dichos antígenos
son generadas fácilmente por un experto en la técnica usando
metodologías mediante PCR convencionales, siempre y cuando se
encuentren disponibles al menos algunos datos de la secuencia. Como
alternativa, las secuencias de ADNc que codifican los antígenos
anteriormente descritos pueden obtenerse a partir de células o
cultivos que expresan o contienen las secuencias. En resumen, el
ARNm procedente de una célula que expresa el gen de interés puede
transcribirse de forma inversa con transcriptasa inversa usando
oligonucleótido dT o cebadores aleatorios. A continuación, el ADNc
monohebra puede amplificarse mediante PCR. (véanse las Patentes de
EE.UU. Nos. 4.683.202; 4.683.195 y 4.800.159. Véase, igualmente,
PCR Technology: Principles and Applications for DNA
Amplification, Erlich (ed.), Stockton Press, (1989)) usando
cebadores oligonucleótidos complementarios a las secuencias sobre
cada lado de las secuencias deseadas. En particular, puede
desnaturalizarse un ADN de doble hebra mediante calentamiento en la
presencia de una Taq polimerasa térmicamente estable, cebadores de
ADN específicos de la secuencia, dATP, dCTP, dGTP y dTTP. El ADN de
doble hebra se produce cuando se completa la síntesis. El ciclo
puede repetirse muchas veces, dando como resultado una amplificación
factorial del ADN deseado.
Las secuencias que codifican los antígenos
anteriormente descritos pueden sintetizarse, igualmente, por
ejemplo, sobre un sintetizador de ADN de Applied Biosystems Inc.
(Applied Biosystems, Foster City, CA).
Para contener y expresar las cajas de expresión
aquí descritas, pueden usarse una amplia variedad de vectores de
suministro de genes. El vector de suministro de genes puede ser de
origen o bien vírico o bien no vírico (véase, de manera general,
Jolly, Cancer Gene Therapy, vol. 1, págs.
51-64, (1994); Kimura, Human Gene Therapy,
vol. 5, págs. 845-852, (1994); Connelly, Human
Gene Therapy, vol. 6, págs. 185-193, (1995); y
Kaplitt, Nature Genetics, vol. 6, págs.
148-153, (1994); Donnelly y otros, véase cita
anterior). Los vehículos de terapia de genes para suministro de
constructos que incluyen una secuencia de codificación de una
terapéutica de la invención, pueden administrarse o bien localmente
o bien sistémicamente (por ejemplo, intravenosamente,
intramuscularmente, intradérmicamente, subcutáneamente,
intratumoralmente, intranasalmente, oralmente, intrahepáticamente,
intratraquealmente). Estos constructos pueden usar vías de vector
vírico o no vírico tanto en la modalidad in vivo como ex
vivo. La expresión de dicha secuencia de codificación puede
inducirse usando promotores heterólogos o mamíferos endógenos. La
expresión de la secuencia de codificación in vivo puede ser o
bien constitutiva o bien regulada tal como se describe en detalle
más adelante.
Dentro de un aspecto de la presente invención,
el vector de suministro de gen es un vector con base de plásmido.
Los ejemplos representativos de vectores adecuados en este aspecto,
incluyen los descritos dentro de la patente de EE.UU. No. 5.580.859
titulada "Suministro de secuencias de ADN exógeno en un
mamífero", la patente de EE.UU. No. 5.589.466 titulada
"Inducción de una respuesta inmune protectora en un mamífero
mediante inyección de una secuencia de ADN", las patentes de
EE.UU. Nos. 5.688.688, 5.814.482 y 5.580.859, y Donnelly y otros,
véase cita anterior).
Dentro de otros aspectos de la presente
invención, los vectores de suministro de genes pueden generarse
basados en un retrovirus. En resumen, los vectores de suministro de
genes retrovíricos de la presente invención pueden construirse
fácilmente a partir de una amplia variedad de retrovirus,
incluyendo, por ejemplo, retrovirus del tipo B, C y D así como
espumavirus y lentivirus (véase RNA Tumor Virases, Second
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, (1985)). Dichos retrovirus
pueden obtenerse fácilmente a partir de depositarios o colecciones
tales como la American Type Culture Collection ("ATCC",
Rockville, Maryland), o asilarse a partir de fuentes conocidas que
usan técnicas comúnmente disponibles. Los ejemplos representativos
de vectores de suministro de genes retrovíricos están descritos con
mayor detalle en la patente EP 0.415.731; las publicaciones PCT
Nos. WO 90/07936; WO 91/0285; WO 9311230; WO 9310218; WO 9403622; WO
9325698; WO 9325234; y las patentes de EE.UU. Nos. 5.219.740,
5.716.613, 5.851.529, 5.591.624, 5.716.826, 5.716.832, y
5.817.491.
Otros vectores de suministro de genes adecuados
pueden generarse a partir de alfavirus (véanse, por ejemplo, las
patentes de EE.UU. Nos. 5.091.309 y 5.217.879, 5.843.723, y
5.789.245), vectores adenovíricos recombinantes (véase, por
ejemplo, la patente de EE.UU. No. 5.872.005), y otros numerosos
virus tales como poxvirus, tal como poxvirus canario o virus
vaccinia (Fisher-Hoch y otros, PNAS, vol. 86,
págs. 317-321, (1989); Flexner y otros, Ann.
N.Y. Acad. Sci., vol. 569, págs. 86-103, (1989);
Flexner y otros, Vaccine, vol. 8, págs.
17-21, (1990); patentes de EE.UU. Nos. 4.603.112,
4.769.330 y 5.017.487; patente WO 89/01973); vectores
adeno-asociados (véase, por ejemplo, patente de
EE.UU. No. 5.872.005); SV40 (Mulligan y otros, Nature, vol.
277, págs. 108-114, (1979)); herpes (Kit, Adv.
Exp. Med. Biol., vol. 215, págs. 219-236,
(1989); patente de EE.UU. No. 5.288.641); y lentivirus tal como VIH
(Poznansky, J. Virol., vol. 65, págs.
532-536, (1991) o FIV.
La capacidad para reconocer y defenderse contra
agentes patógenos es un aspecto central de la función del sistema
inmune. Este sistema, a través del reconocimiento inmune, debe ser
capaz de distinguir "propio" de "no propio" (extraño), lo
cual es esencial para asegurar que los mecanismos defensivos están
dirigidos hacia la invasión de entidades más que contra tejidos
huéspedes. Las características fundamentales del sistema inmune son
la presencia de estructuras de reconocimiento de superficies de
células altamente polimórficas (receptores) y mecanismos efectores
(anticuerpos y células citolíticas) para la destrucción de patógenos
invasores.
Los linfocitos T citolíticos o citotóxicos (CTL)
están normalmente inducidos por la manifestación de péptidos
específicos de patógenos procesados conjuntamente con las proteínas
de superficie de célula MHC de clase I o clase II. Igualmente
estimulada por este tipo de presentación de antígeno se encuentra la
generación y producción de anticuerpos, células ayudantes y células
de memoria. Dentro de una realización de la presente invención, la
presentación de determinantes víricos inmunógenos en el contexto de
moléculas MHC apropiadas induce de manera eficaz respuestas de CTL
óptimas sin la exposición del paciente al patógeno. Esta vía vector
para la estimulación inmune proporciona un medio más eficaz de
inducción de respuestas potentes de CTL protectoras y terapéuticas
restringidas a la clase I, dado que el tipo de inmunidad inducida
por el vector se parece de manera más íntima a la inducida por
exposición a la infección natural. En base al conocimiento actual de
diversos sistemas víricos, es improbable que los antígenos víricos
no replicantes, suministrados exógenamente, tales como péptidos y
proteínas recombinantes purificadas, proporcionarán un estímulo
suficiente como para inducir respuestas óptimas de CTL restringidas
a la clase I. Como alternativa, la expresión suministrada por
vectores de proteínas víricas seleccionadas u otros antígenos que
corresponden a una afección patógena, tal como el cáncer, dentro de
las células diana tal como se describe dentro de la presente
invención, proporciona un estímulo de este tipo.
\newpage
A modo de ejemplo, en el caso de infecciones por
VIH-1, los pacientes desarrollan anticuerpos
específicos para una diversidad de determinantes de la región de
envoltura vírica, algunos de los cuales son capaces de
neutralización del virus in vitro. Sin embargo, la progresión
de la enfermedad continúa y los pacientes sucumben eventualmente a
la enfermedad. Las respuestas de CTL de bajo nivel contra células de
pacientes infectados (Plata y otros, Nature, vol. 328, págs.
348-351, (1987)) y contra células diana infectadas
con vectores de vaccinia recombinante que expresan VIH gag, pol o
env (Walker y otros, Nature, vol. 328, págs.
345-348, (1987); Walter y otros, Science,
vol. 240, págs. 64-66, (1988)) han sido detectadas
en algunos pacientes seropositivos de VIH-1.
Además, recientemente se ha mostrado que los CTL tanto murinos como
humanos pueden ser inducidos por células estimuladoras autólogas
que expresan VIH gp 120 vía transfección
(Langlade-Demoyan y otros, J. Immunol.. vol.
141, pág. 1949, (1988)). La inducción mejorada de CTL podría ser
terapéuticamente ventajosa para pacientes infectados y proporcionar
una terapia preventiva eficaz a individuos bajo condiciones no
infecciosas. La propia infección por VIH puede que no produzca una
respuesta adecuada de CTL debido a que otros elementos asociados
con la infección por VIH pueden prevenir una adecuada estimulación
inmune. Además, puede ser que la estimulación de células T por
células infectadas sea una interacción que conduzca a la infección
de las células T estimuladas.
El VIH es solamente un ejemplo. Esta vía puede
ser eficaz contra muchas enfermedades ligadas víricamente o
cánceres, en las cuales se expresa un antígeno característico (el
cual no necesita ser una proteína de membrana), tal como en HPV y
carcinoma cervical, leucemias inducidas por HTLV-1,
antígeno específico de la próstata (PSA) y cáncer de próstata,
carcinoma de colon y p53 mutado, melanoma y antígeno GD2.
Dentro de ciertos aspectos de la presente
invención, se proporcionan procedimientos para el suministro de una
o más secuencias de nucleótidos a un animal de sangre caliente, que
comprenden la etapa de administración al animal de sangre caliente
de un vector de suministro de gene, tal como ADN plásmido, vector
retrovirus, vector adenovirus, vector AVV, vector poxvirus, vector
herpesvirus, vector alfavirus, y sistema de iniciación de vector
extendido en capas eucariótico, que expresa la secuencia nucleótida
tal como se ha descrito anteriormente.
Los vectores de suministro de genes pueden
administrarse a los animales de sangre caliente o bien directamente
((por ejemplo, intravenosamente, intramuscularmente,
intraperitonealmente, subcutáneamente, oralmente, rectalmente,
intraocularmente, intranasalmente, intradémicamente,
intratumoralmente), o bien mediante diversos procedimientos físicos
tales como lipofección (Felgner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, vol. 84, págs. 7413-7417, (1989)),
inyección directa de ADN (Acsadi y otros, Nature, vol. 352,
págs. 815-818, (1991)); bombardeo con
microproyectiles (Williams y otros, PNAS, vol. 88, págs.
2726-2730, (1991)); liposomas de diversos tipos
(véase, por ejemplo, Wang y otros, PNAS, vol. 84, págs.
7851-7855, (1987)); CaPO_{4} (Dubensky y otros,
PNAS, vol. 81, págs. 7529-7533, (1984));
ligando de ADN (Wu y otros, J. of Biol. Chem., vol. 264,
págs. 16985-16987, (1989)); administración de
ácidos nucleicos solamente (patente WO 90/11092); o administración
de ADN ligado a adenovirus muerto (Curiel y otros, Human Gene
Ther., vol. 3, págs. 147-154, (1992)); vía
compuestos policationes tales como polilisina, que usan ligandos
específicos del receptor; así como virus inactivados con psoraleno
tal como Sendai o Adenovirus. Además, los sistemas de iniciación de
vectores extendidos en capas eucarióticos pueden administrarse tanto
directamente (es decir, in vivo), como a células que han
sido extraídas (ex vivo), y posteriormente retornadas.
Dentro de una realización de la invención, la
caja de expresión o vector de suministro de genes se suministra
(tanto in vivo como ex vivo) a células dendríticas
(DC). En resumen, las células dendríticas (DC) son células que
presentan antígeno profesional, el cual inicia y modula la respuesta
inmune. En particular, las DC son potentes estimuladores de
linfocitos B y T (para una revisión, véase Branchereau y Steinman,
Nature, vol. 392, págs. 245-252, (1998)). La
estimulación de los efectores específicos del antígeno del linfocito
T y B se produce por la presentación por las células de
presentación del antígeno dendrítico, en el cual el antígeno
procesado se manifiesta conjuntamente con moléculas del complejo de
histocompatibilidad principal (MHC) de dos tipos de alternativos
(MHC clase I, o MCH clase II), a linfocitos T, vía el receptor de
antígeno de célula T. La presentación del antígeno vía MHC clase I
da como resultado una respuesta de célula CD8+ (célula T
citotóxica, CTL) celular, en tanto que la presentación del antígeno
vía MHC clase II de cómo resultado la estimulación de células CD4+
y subsiguientemente linfocitos B, resultando una respuesta humoral
(anticuerpo, Ab).
La presente invención se refiere de una manera
amplia a composiciones y procedimientos para la estimulación de la
respuesta inmune a través del uso de diversos ARN y otras moléculas
sintetizadas in vivo a partir de una caja de expresión
contenida dentro de un vehículo de suministro de gen apropiado. Tal
como resultará evidente a partir de los ejemplos detallados más
adelante, dichas moléculas de ARN inmunoestimulantes pueden
comprender secuencias que forman estructuras de ARN de doble hebra
(ds) dentro de una célula deseada, o bien mediante emparejamiento
de bases con ARNs previamente presentes en la célula, o bien vía
secuencias de auto-complementación dentro de la
molécula de ARN expresada. La presencia de moléculas de ARNds de
este tipo dentro de una célula conducirá, típicamente, a la
inducción de uno o más elementos del sistema inmune, incluyendo
respuestas de interferón. Además, las moléculas de ARN
inmunoestimulantes pueden comprender igualmente secuencias
antisentido o ribozima que específicamente identifican uno o más
productos de genes celulares, de manera tal que la supresión o
sub-regulación del producto de gen identificado da
como resultado la sobre-regulación y expresión
incrementada de un segundo producto de gen asociado con una
respuesta inmune. Las moléculas de ARN de la presente invención
pueden expresarse solas o co-expresarse con uno o
más antígenos obtenidos de un agente patógeno (por ejemplo, agente
infeccioso, cáncer), y son adecuadas para uso en una amplia
diversidad de sistemas de suministro de genes, tales como ADN
plásmido, vectores retrovirus, vectores adenovirus, vectores AAV,
vectores poxvirus, vectores herpesvirus, y vectores
alfavirus.
alfavirus.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de
ilustración, y no a modo de limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se describe la construcción de
vectores de suministro de genes que proporcionan una respuesta
inmune potenciada a un antígeno deseado cuando se inoculan dentro de
un animal de sangre caliente. Como un ejemplo, se ilustran
plásmidos que expresan únicamente ARN de doble hebra que codifica
una no proteína, o además, que expresa igualmente un antígeno
deseado a partir de un agente patógeno.
En la presente invención, se proporcionan
construcciones de cajas de expresión que transcriben ARNds de no
codificación en células diana transfectadas in vivo (véanse
Figuras 1-3). Como un ejemplo preferido, es la
síntesis de ARNds a partir de una caja de expresión basada en un
promotor ARN polimerasa III. No obstante, pueden sustituirse
fácilmente otros promotores (por ejemplo, ARN polimerasa I y II). De
acuerdo con ello, en células transfectadas in vivo con los
constructos de ADN plásmido aquí descritos, se sintetizan niveles
de ARNds que codifican una no proteína bien solos, o además de un
antígeno deseado específico a partir de un agente patógeno. La
expresión del ARNds da como resultado una respuesta inmune
potenciada general al antígeno.
Específicamente, se construyó una caja de
expresión de ARNds no codificante basada en el promotor ARN
polimerasa III (pol III) (Figura 1) para contener los elementos
ordenados siguientes: promotor de ARN de Adenovirus 2 VA1
(nucleótidos -70/+30), nucleótidos 447-547 del gen
Rinovirus 1A 3C proteasa, en el cual se cambió el nucleótido A
presente en un codón ATG en cualquier marco de lectura alternativo,
una extensión de 10 nucleótidos de longitud de restos C,
nucleótidos 447-547 del gen Rinovirus 1A 3C
proteasa, en una orientación antisentido, y la secuencia de
terminación de transcripción de consenso de ARN polimerasa III.
Adicionalmente, se construyeron plásmidos los cuales contenían
adicionalmente una caja de expresión de ARN polimerasa II (pol II)
que expresa un antígeno (Figura 4), constituida por los elementos
ordenados siguientes: promotor de CMV, intrón, gen heterólogo (lac
Z o el gen de glicoproteína B procedente del virus del herpes simple
tipo 1), y la secuencia de terminación de
poliadenilación/transcripción de SV40. Se construyeron plásmidos en
los cuales los productos de ARN transcriptos a partir de las cajas
de expresión pol II y pol III estuvieron en las mismas direcciones o
en direcciones opuestas, en relación unas con otras. Estos
elementos ordenados en las cajas de expresión pol II y pol III
descritas anteriormente se clonaron dentro de un vector de ADN
plásmido resistente a kanamicina obtenido de pUC para propagación
en E. coli, tal como se describe más adelante, usando
técnicas de ADN recombinante convencionales (Maniatis y Sambrook).
Los plásmidos se construyeron sobre la estructura principal del
vector pBGS131 (Spratt y otros, Gene, vol. 41, págs.
337-342, (1986); ATCC #37443), la cual se modificó
para separar secuencias extrañas, para insertar un sitio de
clonación múltiple alterno
(PmeI-BglII-XhoI-NotI-EcoRI-PmeI),
y para volver no funcional un sitio XhoI existente dentro del
gen de resistencia a la kanamicina. Este vector modificado se
conoce como pBGSVG y ha sido ya descrito anteriormente (patente WO
97/38087).
Para la expresión de genes que codifican los
antígenos deseados, se insertó la caja de ARN polimerasa II
procedente del vector pCI (Promega, Madison, WI) dentro del vector
plásmido pBGSVG, descrito anteriormente. El ADN del vector pCI se
digirió primeramente con BamHI y los extremos colgantes 5' se
rellenaron mediante incubación con la enzima de Klenow y dNTPs.
Después de purificación con GeneCleanII (Bio 101, Vista, CA), el ADN
plásmido tratado se digirió, a continuación, con BglII y el
fragmento de 1348 bp, constituido, en orden, por el
promotor/potenciador prematuro inmediato del citomegalovirus humano
(CMV), un intrón quimérico compuesto del sitio de corte y empalme
5' para el intrón de \beta-globina y el sitio de
corte y empalme 3' procedente de un intrón de IgG, un sitio de
clonación múltiple, y la secuencia poli(A) de la región
tardía de SV40, se insertaron dentro del pBGSVG plásmido digerido
con EcoRI, rellenado de extremos colgantes 5', y se digirió
con BglII. La purificación sobre gel del fragmento que
contenía la caja de expresión pol II no fue necesaria, puesto que
los clones se seleccionaron con medios que contenían kanamicina
sobre los cuales pueden desarrollarse bacterias que contienen el
vector pBGSVG (gen kan^{r}), pero no el vector pCI (gen
amp^{r}). Este plásmido se le designó como
pBGSVG-pol II.
A continuación, el gen lac Z o el gen de la
glicoproteína B (gB) procedente de HSV-1 se insertó
dentro del poliligador de pBGSVG-pol II. La fuente
del gen lac Z fue el Vector de Control
pSV-\beta-galactosidasa (Promega,
Madison, WI), a partir del cual se le aisló en forma de un fragmento
HindII-BamHI de 3737 bp, ligado dentro del pKS+
plásmido (Stratagene, La Jolla, CA) y, a continuación, se volvió a
aislar mediante digestión con XhoIy NotI, y se ligó
dentro del pBGSVG-pol II plásmido que se digirió con
XhoIy NotI. Este plásmido se le designó como
pBGSVG-pol II/\beta-gal.
\newpage
El gen de la glicoproteína B (gB) de la cepa KOS
de HSV-1 se obtuvo del Dr. Martin Muggeridge (LSU
Medical Center, Shreveport, LA) y se subclonó dentro del
pBGSVG-pol II plásmido entre los sitios XhoIy
XbaI dentro de la secuencia de clonación múltiple. Este
plásmido se le designó como pBGSVG-pol
II/gB-1.
A continuación, la caja de expresión basada en
pol III se insertó dentro de los pBGSVG, pBGSVG-pol
II/\beta-gal, o pBGSVG-pol
II/gb-1 plásmidos, en el sitio único BglII.
El ensamblado de los componentes deseados en la caja de expresión
basada en pol III se llevó a cabo mediante PCR para yuxtaponer las
secuencias ordenadas siguientes:
Adicionalmente, se entremezclaron los sitios de
restricción siguientes dentro de la caja de expresión pol III con
el fin de facilitar el intercambio de los elementos ordenados
presentes dentro del constructo:
La configuración de los elementos de la
secuencia ordenados presentes en la caja de expresión pol III es
5'-BglII-Relleno de
Ad2-promotor de Ad2
VA1-XbaI-tallo con sentido de
Rinovirus-hélice-tallo antisentido
de Rinovirus-EcoRI- terminación pol
III-BspEI-BglII-3'.
La yuxtaposición de los elementos de la
secuencia mostrada anteriormente para construir la caja de expresión
basada en pol III se llevó a cabo en dos etapas. En la primera
etapa se usaron los oligonucleótidos complementarios parcialmente
mostrados más adelante, cada uno a una concentración de 1 \muM en
una amplificación mediante PCR corta (10 ciclos):
La amplificación mediante PCR de los
oligonucleótidos que comprenden la caja de expresión basada en pol
III mostrada anteriormente, se llevó a cabo un una única reacción,
usando la ADN polimerasa Vent_{R} (New England Biolabs, Beverly,
MA), y las condiciones de reacción sugeridas por el suministrador,
conteniendo además MgSO_{4} 2 mM, DMSO al 5%, y esférulas Hot
Start Wax (Perkin-Elmer), con el protocolo de
amplificación mediante PCR, tal como se muestra a continuación.
Los productos de PCR se purificaron (kit de
purificación de PCR QIAquick, QIAGEN, Chatsworth, California) y los
productos de reacción purificados se usaron en una segunda
amplificación mediante PCR, con el par cebador mostrado a
continuación:
La amplificación mediante PCR de la caja de
expresión a base de pol III procedente de la primera amplificación
PCR mostrada anteriormente, se llevó a cabo con la ADN polimerasa
Vent_{R} (New England Biolabs, Beverly, MA), y las condiciones de
reacción sugeridas por el suministrador, conteniendo además
MgSO_{4} 2 mM, DMSO al 5%, y esférulas Hot Start Wax
(Perkin-Elmer), con el protocolo de amplificación
mediante PCR mostrado a continuación.
Los productos de esta segunda reacción mediante
PCR se purificaron con un kit QIAquick y, a continuación, se
insertaron directamente dentro del vector de ADN plásmido pCR Blunt
(Invitrogen, Carlsbad, CA). Este plásmido se le designó como
pCR-pol III.
Como alternativa, los productos purificados de
esta segunda reacción mediante PCR se digirieron con BglII,
se purificaron, y se ligaron dentro de los pBGSVG,
pBGSVG-pol II/\beta-gal, o
pBGSVG-pol II/gb-1 plásmidos,
preparados mediante digestión con BglII, tratamiento con
fosfatasa alcalina intestinal de vacuno, y purificación. Con todos
los constructos plásmidos, se aislaron clones que contenían la caja
de expresión pol III en ambas orientaciones (F o R, véase más
adelante). Estos plásmidos se designaron como:
pBGSVG-pol III(F)
pBGSVG-pol III(R)
pBGSVG.pol
II/\beta-gal-pol III(F)
pBGSVG.pol
II/\beta-gal-pol III(R)
pBGSVG.pol
II/gB-1-pol III(F)
pBGSVG.pol
II/gB-1-pol III(R)
Para demostrar la funcionalidad de la caja de
expresión pol III, se transfectaron células cultivadas con
pBGSVG.pol II/\beta-gal-pol
III(F), pBGSVG.pol
II/\beta-gal-pol III(R), o
pBGSVG.pol II/gal plásmido, y la expresión de la especie de ARN de
doble hebra predicha se determinó mediante análisis de mancha de
puntos de ARN del ARN total purificado a las 48 horas de
transfección, y tratado subsiguientemente con DNasa. La secuencia
predicha de ARN de doble hebra (es decir, complementaria), debido a
su estructura, debería ser también resistente al tratamiento con
RNasa. Se transfectaron células de riñón-21 de
hamster infantil (BHK-21) con 1,0 \mug de ADNs
plásmidos acomplejados con 4,0 \mul de un lípido comercialmente
disponible (Lipofectamine, GIBCO-BRL). Se agregó
medio esencial mínimo de Eagle suplementado con suero bovino fetal
al 10% a las células a las 4 horas
post-transfección (hpt), salvo que se indique lo
contrario. Las células transfectadas se incubaron a 37ºC. A las 48
horas post-transfección, se determinó la expresión
del gen informador \beta-galactosidasa mediante
teñido in situ directo de células fijadas con
X-gal tal como se ha descrito anteriormente
(MacGregor, Cell Mol. Genet., vol. 13, págs.
253-265, (1987)). La eficacia de la transfección con
cada uno de los tres plásmidos ensayados fue equivalente y
aproximadamente del 10%. Como alternativa en otras muestras, el ARN
total se aisló usando un reactivo comercialmente disponible
(Tel-Test, TX), de acuerdo con las instrucciones
del suministrador. Todas las muestras se trataron con DNasa. La
mitad de las muestras se trataron también con RNasa, para reducir
la viscosidad de la muestra y para demostrar la presencia de una
especie de ARN de doble hebra, resistente a digestión con nucleasa.
Las muestras purificadas se cargaron sobre Zeta Probe
(Bio-Rad, Richmond, CA) tal como sigue, y se
hibridaron con sonda Ad2VA 3R marcada con ^{32}P. Se encontró que
el ARNds estaba expresado en células transfectadas con los
pBGSVG.pol II/\beta-gal-pol
III(F) y pBGSVG.pol
II/\beta-gal-pol III(R)
plásmidos, pero no con pBGSVG.pol II/gal plásmido, lo que demuestra
que, tal como se esperaba, las cajas de expresión basadas en pol
III sintetizan una especie de ARN de doble hebra que es resistente
a RNasa.
Además de la configuración del ARNds descrito
anteriormente, son fácilmente realizables para un experto en la
técnica un cierto número de variaciones o modificaciones de la caja
de ARNds. Estas incluyen secuencias alternativas que forman un
ARNds de horquilla similar, pero con la misma u otras secuencias que
forman un región más larga o mas corta de ARNds, dando como
resultado la substitución o substituciones de nucleótidos en menos
del 100% de emparejamiento de bases dentro de la estructura de
ARNds, la inserción de una secuencia de ribozima dentro de la
región de hélice de base no pareada para escisión en dos ARNs
complementarios, separados, que forman ARNds (Figura 2), secuencias
que forman ARNds de "tipo viroide"
auto-complementario, circular (Figura 3), y el uso
de dos cajas de expresión separadas para la transcripción de ARNs
complementarios que forman ARNds (Figura 2).
La presente invención proporciona también
composiciones y procedimientos para la estimulación de una respuesta
inmune específica para un agente patógeno mediante la expresión,
además de a un antígeno a partir del agente patógeno, de una o más
secuencias de ácido nucleico que promueven la apoptosis. La
secuencia de ácido nucleico expresada que promueve la apoptosis
puede ser de codificación (por ejemplo, contiene el código de un
polipéptido) o de no codificación (por ejemplo, ribozima, ARN
antisentido); y la promoción de la apoptosis puede ser directa (por
ejemplo, vía una señal inductiva) o indirecta (por ejemplo,
supresión de un gen anti-apoptótico). Además, las
cajas de expresión que contienen las secuencias de ácido nucleico
que promueven la apoptosis pueden ser parte del mismo vehículo de
suministro del gen que expresa el antígeno (Figura 5), como cajas
distintas o una única caja (es decir, usando un IRES), o puede
estar contenidas dentro de un vehículo que suministra un gen
diferente a partir del cual se expresa el antígeno. En aquellas
circunstancias en las que la secuencia
pro-apoptótica se expresa a partir de un vehículo de
suministro de gen diferente que el vehículo que suministra el gen
que expresa el antígeno, la administración a un animal de sangre
caliente puede ser simultánea, o de manera separada en cualquier
orden deseado.
Pueden seleccionarse numerosos elementos de la
cascada reguladora apoptótica para uso de acuerdo con las
directrices de la presente invención, incluyendo por ejemplo, la
expresión de productos de genes pro-apoptóticos
tales como Bax, Bak, Bok, Bik, Blk, Hrk, BNIP3, Bim_{L}, Bad,
Bid, ligando Fas y EGL-1, o la supresión de
productos de genes anti-apoptóticos tales como
Bcl-2, Bcl-xL y
CED-9. Además, debería tenerse en consideración por
los expertos en la técnica que aunque se ilustran construcciones de
vectores con únicamente un antígeno, este antígeno se proporciona
como un ejemplo y se basa en las directrices aquí proporcionadas,
pudiéndose elegir antígenos alternativos a partir de una diversidad
de agentes patógenos, incluyendo por ejemplo, virus, bacterias,
hongos, parásitos, y células de cáncer, siempre y cuando existan
disponibles datos de secuencias suficientes como para facilitar la
clonación de los antígenos.
Para demostrar los efectos inmunoestimulantes de
la expresión tanto de una secuencia pro-apoptótica
como de un antígeno de vacuna procedente de un único vector de
suministro de gen, se eligió, por ejemplo, la glicoproteína B del
virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) como el
antígeno y como el producto de gen pro-apoptótico se
eligió, por ejemplo, BAX\alpha murino. La glicoproteína B
proporciona una medida bien caracterizada tanto de inducción inmune
humoral y celular, como de protección frente a la exposición a HSV
virulenta en un modelo de ratón (Hariharan y otros, J.
Virol., vol. 72, págs. 950-958, (1998)). El
BAX\alpha murino se prefiere sobre el BAX\alpha humano para
estudios de vacunas en el modelo ratón; sin embargo, se proporcionan
igualmente detalles para constructos similares que contienen
BAX\alpha humano. La construcción de un vector de ADN plásmido
que expresa tanto glicoproteína B de HSV-1 como
BAX\alpha se llevó a cabo aislando primeramente un fragmento que
comprende los elementos ordenados de promotor temprano inmediato de
CMV, glicoproteína B de HSV-1, señal de
poliadenilación de SV40 procedente de pCl-gB
plásmido (Hariharan y otros, véase cita anterior). El
pCl-gB plásmido se digirió con BglII y
BamHI, el ADN se terminó con extremos romos usando enzima de
Klenow y dNTPs, el fragmento que contiene la glicoproteína B se
purificó a partir de un gel de agarosa usando GeneCleanII (BIO101,
Vista, CA) y, a continuación, se ligó dentro de un vector plásmido
anteriormente descrito pBGSVG (patente WO 97/38087) se digirió con
PacI e igualmente se terminó con extremos romos, usando ADN
polimerasa T4 y dNTPs. El constructo resultante se le designó como
pBGSV-gB.
La inserción de una caja de expresión para
BAX\alpha dentro de pBGSV-gB se llevó a cabo
aislando primeramente a partir de pCi plásmido (Promega, Madison,
WI), un fragmento que comprende los elementos ordenados de promotor
temprano inmediato de CMV, sitio de clonación múltiple, señal de
poliadenilación de SV40. El fragmento se aisló mediante digestión
con BglII y BamHI, se terminó con extremos romos con
Klenow y dNTPs, y purificación a partir de un gel de agarosa usando
GeneCleanII. A continuación, el fragmento se ligó dentro de un
pBGSVG plásmido que había sido digerido con PmeI, se trató
con fosfatasa alcalina, y se purificó a partir de un gel de
agarosa, produciendo el constructo
pBGSV-gB-cass2. El BAX\alpha se
obtuvo por amplificación mediante PCR usando dos cebadores
oligonucleótidos:
que contienen sitios de restricción
EcoRI flanqueantes, polimerasa PFU Turbo (Stratagene, San
Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones de fabricante, ADN
molde procedente de bibliotecas de ADNc de célula B de ratón o
humana CLONTECH, Palo Alto, CA), o procedente de plásmidos
comercialmente disponibles (INVIVOGEN, San Diego, CA). Como
alternativa, puede usarse ARN purificado polyA procedente de células
linfoides de ratón y humanas (por ejemplo, líneas de células RL7 y
FL5.12; Oltvai y otros, Cell, vol. 74, págs.
609-619, (1993)) como molde para reacciones
mediante PCR acopladas a transcriptasa inversa. Después de la
amplificación, el producto de PCR se purificó con un kit QIAquick
(QUIAGEN, Chatsworth, CA), se digirió con EcoRI, se volvió a
purificar con QIAquick, y se ligó con
pBGSV-gB-cass2 plásmido, el cual
había sido digerido igualmente con EcoRI y se trató con
fosfatasa alcalina. Se obtuvieron constructos con el inserto
BAX\alpha tanto en la orientación correcta como en la opuesta
(control negativo), designándose a estos plásmidos como
pBGSV-gB-BAX y
pBGSV-gB-BAXrev.
A partir de estas exposiciones, un experto en la
técnica construirá fácilmente construcciones similares que expresen
otros genes o antígenos pro-apoptóticos.
En constructos alternativos, se expresó a partir
de una caja, tal como ARN polimerasa III (pol III), una secuencia
de ribozima o antisentido, la cual se híbrida específicamente al
ARNm de un gen anti-apoptótico. Tal como se ha
descrito anteriormente, esta caja se construyó preferiblemente como
parte del mismo vector de suministro del gen (por ejemplo, ADN
plásmido) que expresa el antígeno deseado. Sin embargo, este puede
estar contenido también dentro de un vector separado que se
administra al mismo vacunado como el vector de suministro del gen
que expresa el antígeno.
Por ejemplo, se construyó una caja en la que un
promotor ARN polimerasa III está ligado de manera operable con una
secuencia, la cual, cuando se transcribe, da lugar a un ARN
antisentido que se une específicamente a la región 5' del ARNm del
gen Bcl-2 anti-apoptótico (Tsujimoto
y Croce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, págs.
5214-5218, (1986)). Específicamente, una caja que
comprende los elementos ordenados siguientes: sitio de restricción
EcoRI para clonación, promotor de ARN de Adenovirus 2 VA1
(nucleótidos -70/+30), nucleótidos 4-44 de la
secuencia que codifica el gen Bcl-2 humano,
secuencia de terminación de transcripción de consenso de ARN
polimerasa III, y sitio de restricción EcoRI para clonación.
Adicionalmente o como alternativa, las secuencias
Bcl-2 pueden substituirse igualmente por nucleótidos
4-44. Con el fin de proporcionar un mecanismo para
demostrar el efecto inmunoestimulante de esta vía, los elementos se
insertaron dentro del constructo pBGSV-gB
anteriormente descrito, el cual codifica la glicoproteína B de
HSV.
El ensamblado de los componentes deseados en la
caja de expresión basada en pol III, se llevó a cabo mediante PCR
para yuxtaponer las secuencias ordenadas siguientes:
La yuxtaposición de los elementos de la
secuencia mostrada anteriormente para construir la caja de expresión
basada en pol III se llevó a cabo en dos etapas. La primera etapa
usa los oligonucleótidos parcialmente complementarios mostrados a
continuación, cada uno de ellos a una concentración de 1 \muM en
una amplificación mediante PCR corta (10 ciclos):
La amplificación mediante PCR de los
oligonucleótidos que comprenden la caja de expresión basada en poli
III mostrada anteriormente, se llevó a cabo en una única reacción,
usando Vent polimerasa y las condiciones de reacción sugeridas por
el suministrador, conteniendo además MgSO_{4} 2 mM, DMSO al 5%, y
esférulas Hot Start Wax (Perkin-Elmer), con el
protocolo de amplificación mediante PCR tal como se muestra a
continuación.
El producto de PCR se purificó usando el kit de
PCR QIAquick, y el producto purificado se usó en una segunda
amplificación mediante PCR, con el par cebador mostrado a
continuación:
La segunda amplificación mediante PCR de la caja
de expresión basada en poli III, se llevó a cabo en con la Vent
polimerasa y condiciones de reacción similares, con el protocolo de
amplificación mediante PCR tal como se muestra a continuación.
El producto de esta segunda reacción mediante
PCR se purificó con el kit QIAquick, se digirió con EcoRI,
se volvió a purificar, y, a continuación, se insertó dentro del
vector pBGSV-gB que también había sido digerido con
EcoRI y se trató con fosfatasa alcalina. Este plásmido se le
designó como pBGSV-gB\alphaBcl.
Para un conjunto separado de amplificaciones
mediante PCR, se substituyó por un par adicional de cebadores
oligonucleótidos (mostrados a continuación) los Ad2V abcl 2F y Ad2V
bcl 2R, con el fin de generar una caja de control negativo que
permita la construcción de la secuencia Bcl-2 en la
orientación con sentido.
Estos cebadores se usaron tal como se ha
descrito anteriormente para generar un segundo fragmento con
extremos EcoRI, y que cuando se insertaron dentro de
pBGSV-gB, dieron como resultado un constructo
plásmido designado como pBGSV-gBBcl.
A partir de estas exposiciones, un experto en la
técnica construirá fácilmente construcciones similares que usan
secuencias de ribozima (véase más adelante) específicas para
Bcl-2, así como secuencias de ribozima o
antisentido específicas para otros genes
anti-apoptóticos.
Para demostrar los efectos inmunoestimulantes de
estas modificaciones de vectores, se inmunizaron intramuscularmente
múltiples ratones BALB/c con
pBGSV-gB-BAX,
pBGSV-BAXrev, pBGSV-gB\alphaBcl y
pBGSV-gBBcl plásmidos en solución salina, a dosis
que variaron desde 10 ug hasta 10 ng. Después de estas
inmunizaciones, se determinó el nivel de anticuerpo específico de
HSV-gB y de CTL inducido por cada constructo de
acuerdo con Hariharan y otros (véase cita anterior). Además, fueron
expuestos también animales representativos con HSV virulento para
determinar el nivel de protección (Hariharan y otros, véase cita
anterior). Unos niveles similares de respuesta inmune o de
protección a dosis de ADN más bajas mediante los vectores
modificados comparados con los vectores convencionales o de control
es indicativo de estimulación inmune por los elementos de la
presente invención.
Además de los ejemplos anteriores, la presente
invención proporciona también composiciones y procedimientos de
estimulación inmune que usan secuencias de ARN de ribozima o
antisentido específicas transcritas in vivo que identifican
uno o más ARNm que codifican componentes reguladores inmunes. Las
secuencias ribozima o antisentido pueden
co-expresarse con un antígeno deseado a partir de un
agente patógeno, o expresarse solas y administrarse a un animal de
sangre caliente con o sin el antígeno deseado o vector de suministro
de gen que expresa el antígeno.
El IFN\gamma juega un papel importante en la
respuesta inmune mediante la inducción de actividad antivírica y
bactericida, la estimulación de la presentación del antígeno a
través de moléculas MHC de clase I y clase II, y mediante la
inducción de la expresión de genes IFN\alpha e IFN\beta, así
como una diversidad de genes cuyas funciones no han sido todavía
determinadas. Un gen de respuesta primaria a IFN\gamma es el
factor 1 regulador del interferón (IRF1). El IRF1 es un factor de
transcripción que está expresado al nivel de pocas copias de ARNm
por célula antes de la inducción por IFN\gamma (Fujita y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, págs.
9936-9940, (1989); Harada y otros, Cell, vol.
58, págs. 729-739, (1989)). La expresión
constitutiva del IRF1 ratones transgénicos da como resultado una
mayor resistencia a ARN de virus (Pine, J. Virol., vol. 66,
págs. 4470-4478, (1992)) y la
sobre-expresión en células COS da como resultado la
inducción de IFN\alpha e IFN\beta sin estimulación vírica
(Fujita y otros, Nature, vol. 337, págs.
270-272, (1989)). El factor 2 regulador del
interferón (IRF2) es un inhibidor de la transcripción que está
expresado de manera constitutiva en muchas células y antagoniza la
actividad de IEF1, mediante unión al mismo elemento promotor en los
IFNs y genes inducibles de IFN. (Harada y otros, véase cita
anterior). De acuerdo con ello, el IRF2 es un regulador negativo de
la respuesta de IFN\gamma.
Un mecanismo para interferir con la expresión de
IRF2 en células que producen un antígeno de interés puede reforzar
la respuesta inmune a dicho antígeno. En particular, un ARN
antisentido o ribozima dirigido al ARNm de IRF2 se transcribe in
vivo a partir de una caja de expresión contenida dentro de un
vector de suministro de gen, para inhibir la expresión de IRF2 y
prolongar los efectos de IFN\gamma inducido por la expresión de
un antígeno de interés. Preferiblemente, el ARN antisentido o
ribozima se expresa a partir del mismo vector de suministro de gen
que codifica el antígeno(s) de interés, y se expresa usando
una caja de ARN polimerasa III. El ARN antisentido o ribozima puede
dirigirse (complementariamente) al ARNm del primer exón del gen
IRF2. Puesto que los 125 aminoácidos N-terminales
de IRF2, que contienen el código de la actividad reguladora de
transcripción, muestran un alto grado de homología con la misma
región en IRF1, los exones II, III y IV son menos adecuados para
identificación.
Por ejemplo, se construyó primeramente una caja
de expresión de ARN polimerasa III para expresar un ribozima de
cabeza de martillo específico para IRF2. Pueden elegirse una
diversidad de sitios de escisión diana en el ARNm de IRF2 y en la
Figura 6 se describen algunos, que se muestran un tipo negrita. Para
fines de esta ilustración, el sitio diana elegido está encajonado y
las secuencias "antisentido" complementarias usadas por el
ribozima para reconocimiento de la diana están subrayadas.
Específicamente, la caja pol III/ribozima se
construyó de manera que contuviera los elementos ordenados
siguientes: sitio de restricción PacI, promotor de ARN de
Adenovirus 2 VA1 (nucleótidos -70/+30), ribozima específico de
IRF2, secuencia de terminación de transcripción de consenso de ARN
pol III, sitio de restricción PacI. Estos elementos se
sintetizaron usando PCR de solapamiento y se clonaron dentro de un
vector de ADN plásmido resistente a la kanamicina obtenido de pUC,
pBGSVG (patente WO 97/38087), con una secuencia de poliligador
<PmeI-BglII-XhoI-NotI-EcoRI-PmeI>
y sitio PacI único sobre el lado opuesto de la estructura
principal del vector.
El ensamblado de los componentes deseados en la
caja de expresión basada en pol III, se llevó a cabo mediante PCR
para yuxtaponer las secuencias ordenadas siguientes:
La yuxtaposición de los elementos de la
secuencia mostrada anteriormente para construir la caja de expresión
basada en pol III se llevó a cabo en dos etapas. La primera etapa
usa los oligonucleótidos parcialmente complementarios mostrados a
continuación, cada uno de ellos a una concentración de 1 \muM en
una amplificación mediante PCR corta (10 ciclos):
La amplificación mediante PCR de los
oligonucleótidos que comprenden la caja de expresión basada en pol
III mostrada anteriormente, se llevó a cabo en una única reacción,
usando Vent polimerasa y las condiciones de reacción sugeridas por
el suministrador, conteniendo además MgSO_{4} 2 mM, DMSO al 5%, y
esférulas Hot Start Wax, con el protocolo de amplificación mediante
PCR tal como se muestra a continuación.
El producto de PCR se purificó usando el kit de
PCR QIAquick, y, a continuación, se usó en una segunda amplificación
mediante PCR, con los cebadores VAIRF2-1F y
VAIRF2-3R. La segunda amplificación mediante PCR de
la caja de expresión basada en pol III, se llevó a cabo con Vent
polimerasa y condiciones de reacción similares, con el protocolo de
amplificación mediante PCR tal como se muestra a continuación.
El producto de esta segunda reacción mediante
PCR se purificó con el kit QIAquick, se digirió con PacI, se
volvió a purificar y, a continuación, se insertó dentro del vector
pBGSVG-pol II (Ejemplo 1) que había sido igualmente
digerido con PacI y se trató con fosfatasa alcalina. Este
vector de suministro de gen basado en plásmido se le designó como
pBGSrIRF2.
Para demostrar la interrupción de la expresión
de IRF2 mediante ARNs antisentido o ribozima dirigidos, se usó un
sistema de gen informador similar al de Harada y otros (véase cita
anterior). En este sistema, se insertó un sitio de unión IRF1/IRF2
dentro de un constructo informador interpuesto entre un elemento
potenciador de SV40 y la expresión que impulsa el promotor más
abajo de un gen informador. La transfección de este plásmido
informados dentro de células que expresan IRF2 da como resultado la
supresión de la expresión del informador. La
co-transfección de las células que expresan IRF2 con
el plásmido informador y un vector de suministro de gen de la
presente invención (por ejemplo, el pBGSrIRF2 anterior) permiten una
medición directa de la inhibición de la expresión de IRF2.
La prostaglandina E2 (PGE2) es una de las
diversas moléculas inmunosupresoras secretadas por tumores y su
secreción se relaciona con la progresión del tumor. La presencia de
altos niveles de altos niveles de moléculas inmunosupresoras es al
menos parcialmente achacable a la capacidad de un tumor para escapar
a los mecanismos de vigilancia inmune del huésped. La
ciclooxigenasa-2 (COX-2) está
implicada directamente en la síntesis de PGE2. Se han encontrado
diversos tumores para expresar altos niveles de COX2 (Liu y otros,
Cancer Res., vol. 56, págs. 5125-5127,
(1996); Ristimaki y otros, Cancer Res., vol. 57, págs.
1276-1280, (1997)) y su expresión está relacionada
con los potenciales metastáticos (Tsujii y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, vol. 94, págs. 3336-3340,
(1997)). La presente invención proporciona vectores de suministro de
genes y procedimientos para la interrupción identificada de la
expresión de COX2 como un mecanismo para facilitar la terapia
anti-tumor. Puesto que ha sido establecida la
secuencia del ADNc de COX2 (Hla y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, vol. 89, págs. 7384-7388, (1992); O'Banion
y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, págs.
4888-4892, (1992)), pueden diseñarse ARNs dirigidos
contra el ARNm de COX2 para inserción dentro de la caja de expresión
deseada, preferiblemente una caja de ARN polimerasa III.
Igualmente, pueden elegirse otros productos de genes de la vía de
la biosíntesis de PEG2 para identificación de acuerdo con la
presente invención. Además, los vectores de suministro de genes
anteriormente descritos pueden igualmente codificar una o más
citocinas o antígenos de tumores.
Por ejemplo, puede construirse en primer lugar
una caja de expresión de ARN polimerasa III para expresar un
ribozima de horquilla específico para COX2. Pueden elegirse una
diversidad de sitios de escisión diana de ARNm de COX2 para
ribozimas de cabeza de martillo y horquilla, los cuales se
representan en la Figura 6, mostrándose en tipo negrita. Para fines
de esta ilustración, el sitio diana elegido está encajonado y las
secuencias "antisentido" complementarias usadas por el
ribozima para reconocimiento de la diana están subrayadas.
Específicamente, la caja pol III/ribozima puede
construirse para contener los elementos ordenados siguientes: sitio
de restricción PacI, promotor de ARN de Adenovirus 2 VA1
(nucleótidos -70/+30), ribozima específico de COX2, secuencia de
terminación de transcripción de consenso de ARN pol III, sitio de
restricción PacI. Estos elementos se sintetizaron usando PCR
de solapamiento y se clonaron dentro de pBGSVG tal como se ha
descrito en el ejemplo anterior. El ensamblado de los componentes
deseados en la caja de expresión basada en pol III, se llevó a cabo
mediante PCR para yuxtaponer las secuencias ordenadas
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La yuxtaposición de los elementos de la
secuencia mostrada anteriormente para construir la caja de expresión
basada en pol III se llevó a cabo en dos etapas, tal como se ha
descrito en el ejemplo anterior, usando los cebadores
oligonucleótidos siguientes
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de PCR procedente de la primera
reacción se purificó usando un kit de PCR QIAquick, y, a
continuación, se usó en una segunda amplificación mediante PCR con
los cebadores VACOX2-1F y VACOX2-3R.
El producto de esta segunda reacción mediante PCR se purificó con
el kit QIAquick, se digirió con PacI, se volvió a purificar
y, a continuación, se insertó dentro del vector
pBGSVG-polII el cual había sido también digerido con
PacI y se trató con fosfatasa alcalina. Este vector se le
designó como pBGSrCOX2.
La capacidad de los vectores de suministro de
genes de la presente invención para inhibir la expresión de COX2
puede controlarse en el cultivo de células mediante el ensayo de los
cambios de secreción de PEG2 dentro del medio de cultivo después de
la transfección de las células con pBGSrCOX2 o el plásmido de
control pBGSVG. Puesto que se ha encontrado que el cáncer de colon
produce altos niveles de PEG2, una línea de células obtenida a
partir de este cáncer puede ser particularmente adecuada para el
ensayo. El PEG2 puede detectarse con kits ELISA comercialmente
disponibles.
\vskip1.000000\baselineskip
En la regulación de la expresión de IFN\gamma
se encuentran implicados diversos factores de transcripción (Young,
J, Interferon & Cyt. Res., vol. 16, págs.
563-568, (1996)). El Yin-Yang 1
(YY1) es una proteína de unión de ADN omnipresente que regula la
transcripción de diversos genes, incluyendo los oncogenes
c-myc y c-fos. De acuerdo con el
contexto, el YY1 puede actuar o bien como un regulador positivo o
bien como un regulador negativo. El YY1 parece estar implicado en
la represión de la transcripción de la expresión de IFN\gamma
mediante interacción con múltiples sitios en el promotor. Las
mutaciones en los sitios de unión de YY1 dan como resultado un
incremento de la actividad del promotor IFN\gamma (Ye y otros,
Mol. Cell. Biol., vol. 16, págs. 4744-4753,
(1996)). Parece ser que el YY1 reprime el promotor IFN\gamma
mediante unión a un sitio de solapamiento con el sitio de unión de
AP1, el cual se requiere para la expresión de IFN\gamma (Ye y
otros, véase cita anterior).
La inmunización mediante vectores de suministro
de genes, en particular ADN plásmido, parece ser eficaz en modelos
animales, para la inducción de anticuerpos y respuestas de CTL
asociados a CD8+ al antígeno expresado. Una característica deseable
sería el incluir algunos mecanismos para la
co-inducción de respuestas asociadas a CD4+ Th1.
Puesto que el IFN\gamma juega un papel principal en estas
respuestas, se requiere la inducción de su expresión. Un ARN
antisentido o ribozima puede expresarse in vivo, para
identificar el ARNm de YY1 y sub-regular la
expresión, facilitando, en consecuencia, la
sobre-regulación de la expresión de IFN\gamma. Un
ARN antisentido o ribozima puede expresarse usando una caja de ARN
polimerasa III, así como otros promotores de ARN polimerasa,
generándose, de esta forma, una unidad que puede clonarse dentro del
mismo vector de suministro de gene que el antígeno de interés.
Igualmente, esta unidad puede usarse conjuntamente con otros
mecanismos para reforzar la respuesta inmune, y en particular las
aplicaciones de terapia de genes para las cuales la expresión de
IFN\gamma es un elemento deseable.
Por ejemplo, se construyó en primer lugar una
caja de expresión de ARN polimerasa III para expresar un ribozima
de cabeza de martillo específico para YY1. Pueden elegirse una
diversidad de sitios de escisión diana de ARNm de YY1 para
ribozimas de cabeza de martillo y horquilla, varias de los cuales se
representan en la Figura 6, mostrándose en tipo negrita. Para fines
de esta ilustración, el sitio diana elegido está encajonado y las
secuencias "antisentido" complementarias usadas por el ribozima
para reconocimiento de la diana están subrayadas. Específicamente,
se construyó una caja de ribozima basada en pol III en pBGSVG, tal
como se ha descrito en los ejemplos anteriores. El ensamblado de
los componentes se llevó a cabo nuevamente mediante PCR de
solapamiento, con los cebadores oligonucleótidos siguientes:
El producto de PCR se purificó usando un kit de
PCR QIAquick, y, a continuación, se usó en una segunda amplificación
mediante PCR, con los cebadores VAIYY1-1F y
VAIYY1-3R. A continuación, el producto de esta
segunda reacción mediante PCR se purificó con el kit QIAquick, se
digirió con PacI, se volvió a purificar y se insertó dentro
de pBGSVG-polII el cual había sido también digerido
con PacI y se trató con fosfatasa alcalina. Este vector de
suministro de gen basado en plásmido se le designó como
pBGSrYY1.
Se ha mostrado que algunos tumores expresan y
secretan una o más citocinas inmunosupresoras. La presencia de
altos niveles de estas citocinas es achacable al menos parcialmente
del escape de tumores de la inmunovigilancia del huésped. El IL 10
es capaz de bloquear la activación de diversas citocinas y diversas
funciones accesorias de macrófagos, células T, y células NK (Fortis
y otros, Cancer Lett., vol. 104, págs. 1-5,
(1996); Gotlieb y otros, Cytokine, vol. 4, págs.
385-90, (1992); Nagakomi y otros, Int. J.
Cancer, vol. 63, págs. 366-71, (1995);
Wojciechowska-Lacka y otros, Neoplasma, vol.
43, págs. 155-158, (1996)). La represión de la
expresión de IL 10 se usó en tumores para facilitar el lavado
inmune al huésped del tumor. Esta vía puede ser particularmente
eficaz cuando se usa en combinación con la inmunización para
antígenos de tumores definidos.
Específicamente, pueden construirse cajas de
expresión para el suministro de ARNs de ribozima o antisentido que
identifiquen específicamente y prevengan la expresión de IL 10. La
secuencia de ADNc de IL 10 ha sido determinada (Vieira y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, págs.
1172-1176, (1991)), y dichos ARNs pueden ser
suministrados y expresados in vivo usando cualquiera de entre
un cierto número de vectores de suministro de genes diferentes,
incluyendo ADN plásmido. Dichos vectores pueden usarse solos o en
combinación con cajas similares identificadas a otras citocinas
inmunosupresoras, y expresadas a partir del mismo vector de
suministro de gen o a partir de un vector
co-administrado separado. Además, los vectores
pueden usarse conjuntamente con otros genes que codifican o bien
citocinas o bien antígenos de tumores.
Por ejemplo, se construyó en primer lugar una
caja de expresión de ARN polimerasa III para expresar un ribozima
de cabeza de horquilla específico para IL-10. Pueden
elegirse una diversidad de sitios de escisión diana de ARNm de
IL-10 para ribozimas de cabeza de martillo y
horquilla, varios de los cuales se representan en la Figura 6,
mostrándose en tipo negrita. Para fines de esta ilustración, el
sitio diana elegido está encajonado y las secuencias
"antisentido" complementarias usadas por el ribozima para
reconocimiento de la diana están subrayadas. Específicamente, se
construyó una caja de ribozima basada en pol III en pBGSVG, tal como
se ha descrito en los ejemplos anteriores. El ensamblado de los
componentes se llevó a cabo nuevamente mediante PCR de
solapamiento, con los cebadores oligonucleótidos siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de PCR se purificó usando el kit de
PCR QIAquick, y, a continuación, se usó en una segunda amplificación
mediante PCR, con los cebadores VAIL10-1F y
VAIL10-3R. A continuación, el producto de esta
segunda reacción mediante PCR se purificó con el kit QIAquick, se
digirió con PacI, se volvió a purificar y se insertó dentro
de pBGSVG-polII el cual había sido también digerido
con PacI y se trató con fosfatasa alcalina. Este vector de
suministro de gen basado en plásmido se le designó como
pBGSrIL10.
Para cada uno de los ejemplos anteriores, son
fácilmente realizables cajas similares para un experto en la
técnica, en las que la secuencia de ribozima está substituida por un
ribozima alternativo o una secuencia antisentido con actividad no
catalítica. En dichos casos, la elección de secuencias para
identificación puede ser la misma que las descritas anteriormente,
o puede ser específica para otras regiones de la molécula de
ARNm.
\vskip1.000000\baselineskip
Los antígenos obtenidos a partir de una
diversidad de agentes patógenos (por ejemplo, tumor) pueden
insertarse dentro de la caja de ARN polimerasa III contenida dentro
de los plásmidos de expresión de ribozima o antisentido anteriores.
Como alternativa, los antígenos pueden co-expresarse
conjuntamente con los elementos ribozima o antisentido en otros
vehículos de suministro de genes, tales como retrovirus (véanse, por
ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.693.522, 5.691.177, 6.652.130,
5.591.624, y 5.830.458, referenciadas en su totalidad), adenovirus,
o AAV.
Por ejemplo, se construyó un vector de ADN
plásmido que expresa el antígeno Her2neu y un ribozima específico
para COX-2. Específicamente, el antígeno Her2neu se
clonó por ampliación mediante PCR, usando los cebadores
oligonucleótidos siguientes que incorporan los sitios de
restricciones XbaI y NotI flanqueantes.
Después de amplificación mediante PCR, el
producto se purificó usando el kit QIAquick, se digirió con
XbaI y NotI,se volvió a purificar con el kit
QIAquick, y se ligó dentro del pBGSrCOX2 plásmido el cual había
sido también digerido con XbaI y NotI. El nuevo
constructo se le designó como pBGSrCOX2/Her2. De una manera
similar, pueden generarse constructos adicionales que contienen
secuencias Her2neu modificadas.
En otro ejemplo, se construyó un vector de
suministro de gen plásmido que expresa el antígeno gp100 y un
ribozima específico para COX-2. Específicamente, el
antígeno gp100 se clonó por amplificación mediante PCR, usando
cebadores oligonucleótidos siguientes que incorporan sitios de
restricciones XbaI y NotI flanqueantes.
Después de amplificación mediante PCR, el
producto se purificó usando el kit QIAquick, se digirió con
XbaI y NotI,se volvió a purificar con el kit
QIAquick, y se ligó dentro del pBGSrCOX2 plásmido el cual había
sido también digerido con XbaI y NotI. El nuevo
constructo se le designó como pBGSrCOX2/gp100.
Como alternativa, pueden insertarse las cajas
pol III/ribozima y cajas de antígeno dentro de una diversidad de
otros vectores de suministro de genes (por ejemplo, retrovirus,
adenovirus) por un experto en la técnica usando las directrices de
esta invención y las referencias incorporadas en su totalidad.
Pueden usarse diversos modelos de tumor in
vivo para la evaluación de la eficacia terapéutica de estos
vectores recombinantes. Por ejemplo, usando un modelo de melanoma de
ratón singénico, se implantaron células B16F10 sin modificar en
ratones C57BL/6 a dosis de 1x10^{5} células o bien subcutáneamente
para desarrollar un nódulo de tumor sólido, o bien intravenosamente
para desarrollar metástasis pulmonar, o ambos. Se ha demostrado que
las células de melanoma de ratón B16F10 expresan gp100, un antígeno
de tumor asociado a melanoma. Se ha demostrado que las células de
melanoma humano expresan gp100 y una respuesta anticuerpo contra
gp100 está asociada con respuestas clínicas. Se han clonado y
caracterizado los genes humano y de ratón para gp100. Los nuevos
vectores de suministro de genes que expresan una combinación de
antígeno de tumor (por ejemplo, gp100) y ARN antisentido/ribozima
(por ejemplo, antisentido específico para COX2,
TGF-\beta) pueden evaluarse para determinar su
eficacia in vivo tal como se describe de manera general por
Karavodin y otros (Human Gene Therapy, vol. 9, págs.
2231-2241, (1998)). Específicamente, dichos vectores
se evaluaron para determinar la actividad terapéutica in
vivo mediante la implantación subcutáneamente (s.c.) de
1x10^{5} células de melanoma B16F10 dentro del abdomen ventral
inferior de ratones hembra de 6-8 semanas de edad.
Se dejó formar un nódulo de tumor palpable en el sitio de inyección
durante 7-10 días o hasta que el nódulo tenía
2-5 mm de diámetro. La medición y registro del
diámetro del tumor o del volumen del tumor s.c. antes, durante y
después del tratamiento se usó para indicar la eficacia
terapéutica. El sacrificio del animal y la extracción de los
pulmones con el fin de enumerar visualmente los focos de células de
tumor se usaron como una medición de la respuesta
anti-tumor sistémica. Como alternativa, pueden
ensayarse anticuerpos anti-tumor en suero o la
actividad de célula T citolítica (CTL) en masa in vitro,
usando vías inmunológicas convencionales para determinar respuestas
terapéuticas sistémicas. El vector terapéutico puede inyectarse
intratumoralmente, peritumoralmente, o una combinación de ambos en
volúmenes tales como de 50-100 \mul. Los esquemas
de tratamiento pueden ser de una o dos inyecciones por día
administradas durante 5 a 7 días consecutivos de vector, es decir
1x10^{8} cfu/ml ó 1-100 ug o más.
Como alternativa, puede llevarse a cabo la
evaluación de un vector de suministro de gen que expresa el antígeno
del tumor Her2/neu y un inhibidor antisentido/ribozima (por
ejemplo, específico para COX-2) en un modelo de
ratón transgénico Her2/neu tal como ha sido descrito por Boggio y
otros (J. Exp. Med., vol. 188, págs. 589-596,
(1998)). En resumen, los ratones transgénicos desarrollan tumores
mamarios espontáneos que implicarían a todas las glándulas mamarias
aproximadamente a los 33 meses de edad. En una aplicación de
vacunación, a los ratones se les administraron inyecciones del
vector terapéutico intramuscularmente o subcutáneamente antes del
desarrollo de tumores palpables. Se usaron diversos esquemas de
vacunación (por ejemplo, una vez a la semana durante
4-6 semanas, o una vez al mes durante
3-4 meses), con 50-100 \mul de
vector vírico a unos títulos de 1-100x10^{8}
cfu/ml ó 1-100 ug de un ADN vector. Estos vectores
pueden usarse igualmente en una aplicación terapéutica en la que se
inyectan ratones con tumores existentes. El vector terapéutico se
inyectó intratumoralmente, peritumoralmente, o una combinación de
ambos, en volúmenes de 50-100 \mul. Se usaron
diversos esquemas de tratamiento, por ejemplo, incluyendo una o dos
inyecciones por día administradas durante 5 a 7 días consecutivos
de vector, es decir 1x10^{8} cfu/ml o más.
A partir de lo anterior, se comprenderá que,
aunque se han descrito aquí realizaciones específicas de la
invención con fines ilustrativos, pueden llevarse a cabo diversas
modificaciones sin desviarse de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (25)
1. Una caja de expresión, que comprende un
promotor ligado de manera operable a una molécula de ácido nucleico
que, cuando se transcribe in vivo, forma un ARN de doble
hebra que induce la producción de interferón, en la que la caja de
expresión está seleccionada entre el grupo constituido por:
(a) una caja de expresión que, cuando se
transcribe in vivo, forma ARN
auto-complementario; y
(b) una caja de expresión que comprende un
primer promotor ligado de manera operable a una primera molécula de
ácido nucleico, y un segundo promotor ligado de manera operable a
una segunda molécula de ácido nucleico, en la que la primera y
segunda moléculas de ácido nucleico, cuando se transcriben in
vivo, forman un ARN de doble hebra que induce la producción de
interferón.
2. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dicha caja comprende una caja de
expresión de acuerdo con la reivindicación 1(a) y no la
reivindicación 1(b).
3. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dicha caja comprende una caja de
expresión de acuerdo con la reivindicación 1(b) y no la
reivindicación 1(a).
4. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dicho ARN no está traducido dentro de
la proteína in vivo.
5. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dicho promotor es un promotor pol I o
uno pol III.
6. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 5, en la que dicho promotor pol III es un promotor
de Adenovirus VA1.
7. Una caja de expresión, que comprende un
promotor ligado de manera operable a una molécula de ácido nucleico
antisentido o ribozima que, cuando se transcribe in vivo,
promueve la apoteosis, que comprende además un promotor ligado de
manera operable a una molécula de ácido nucleico que, cuando se
transcribe in vivo, forma un ARN de doble hebra que induce
la producción de interferón.
8. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende además un promotor ligado de manera
operable a una molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido de interés.
9. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 8, en la que dicho promotor que está ligado de manera
operable a una molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido de interés es un promotor pol II.
10. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 8, en la que dicho polipéptido promueve la
apoptosis.
11. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 8, en la que dicho polipéptido codifica un antígeno
a partir de un agente patógeno.
12. Una caja de expresión, que comprende un
primer promotor ligado de manera operable a una molécula de ácido
nucleico que, cuando se transcribe in vivo, forma un ARN de
doble hebra que induce la producción de interferón, y un segundo
promotor ligado de manera operable a una molécula de ácido nucleico
que codifica un antígeno a partir de un agente patógeno.
13. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 11 o la reivindicación 12, en la que dicho agente
patógeno es un virus.
14. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 13, en la que dicho virus está seleccionado entre el
grupo constituido por VIH, HSV, HBV, HCV. HPV y FIV.
15. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 11 o la reivindicación 12, en la que dicho agente
patógeno es una bacteria, parásito u hongo.
16. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 11 o la reivindicación 12, en la que dicho agente
patógeno es un tumor.
17. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 8, en la que dicho polipéptido es una citocina.
18. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 17, en la que dicha citocina está seleccionada entre
el grupo constituido por IL-2,
IL-12, IL-15 y
gamma-interferón.
\newpage
19. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 11 o la reivindicación 12, en la que dicho promotor
adicional es un promotor pol II.
20. La caja de expresión de acuerdo con la
reivindicación 9 ó 19, en la que dicho promotor está seleccionado
entre el grupo constituido por CMV, SV40, MoMLV LTR y RSV LTR.
21. Un vector de suministro de gen, que
comprende una caja de expresión de acuerdo con la reivindicación
1.
22. El vector de suministro de gen de acuerdo
con la reivindicación 21, en el que dicho vector es un plásmido, un
retrovirus recombinante, un herpesvirus recombinante, un poxvirus
recombinante, un adenovirus recombinante, un parvovirus
recombinante, un alfavirus recombinante, un polioma virus
recombinante, o un sistema de de iniciación de vector en capas
eucariótico.
23. Una célula que contiene una caja de
expresión de acuerdo con la reivindicación 1 o un vector de
suministro de gen de acuerdo con la reivindicación 21.
24. Un vector de suministro de gen de acuerdo
con la reivindicación 21, para uso en medicina.
25. Uso de un vector de suministro de gen de
acuerdo con la reivindicación 21, en la fabricación de un
medicamento para la estimulación de una respuesta inmune a un
antígeno seleccionado dentro de un huésped deseado.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US12840999P | 1999-04-08 | 1999-04-08 | |
| US128409P | 1999-04-08 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| ES00920193T Expired - Lifetime ES2300261T3 (es) | 1999-04-08 | 2000-04-07 | Potenciacion de la respuesta inmune para aplicaciones de vacunas y terapia genetica. |
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