WO2015182668A1 - 膠芽腫の予測方法 - Google Patents

膠芽腫の予測方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015182668A1
WO2015182668A1 PCT/JP2015/065281 JP2015065281W WO2015182668A1 WO 2015182668 A1 WO2015182668 A1 WO 2015182668A1 JP 2015065281 W JP2015065281 W JP 2015065281W WO 2015182668 A1 WO2015182668 A1 WO 2015182668A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nestin
glioblastoma
concentration
subject
glioma
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/065281
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
沙織 岡本
善浩 村垣
雅之 新田
Original Assignee
学校法人東京女子医科大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人東京女子医科大学 filed Critical 学校法人東京女子医科大学
Priority to JP2016523539A priority Critical patent/JP6613526B2/ja
Publication of WO2015182668A1 publication Critical patent/WO2015182668A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the onset of glioblastoma in a subject.
  • Glioma is one of the malignant tumors that occur in the brain and accounts for about 25% of all intracranial tumors. There are various types of glioma, but classification by the World Health Organization (WHO) is used worldwide (Non-patent Document 1). The WHO classification is based on the grade of malignancy, and each glioma is classified into grade 1 (lowest grade) to grade 4 (highest grade). And the treatment policy of each glioma is also defined based on this grade. Glioblastoma is one of gliomas classified as grade 4 by the WHO classification. Because glioblastoma progresses quickly, it is important for the patient's prognosis to accurately determine that it is a glioblastoma and to start treatment appropriate for glioblastoma.
  • WHO World Health Organization
  • a definitive diagnosis of glioblastoma is performed by a pathologist observing a brain tissue collected from a subject suspected of having glioblastoma by CT or MRI with a microscope (pathological examination).
  • a pathologist observing a brain tissue collected from a subject suspected of having glioblastoma by CT or MRI with a microscope (pathological examination).
  • cells collected in brain tissue are stained with nestin.
  • nestin staining of glioma tissue cells based on the correlation between nestin staining of glioma tissue cells and malignancy of glioma, the results of nestin staining of brain tissue cells using immunohistochemical staining were analyzed. It is used as an auxiliary in the diagnosis of tumor (Non-patent Document 2). It is not known that nestin exists outside cells such as blood.
  • the method of nestin staining brain tissue cells collected from a subject requires a complicated immunohistochemical staining operation, and thus takes time to obtain the result. Furthermore, in this method, it is often difficult to differentiate from metastatic brain tumors and malignant lymphomas, which are diseases different from glioblastoma. In addition, since the collection of brain tissue is highly invasive to the subject and is not dangerous, glioblastoma is not examined in normal health examinations.
  • the inventors of the present invention have intensively studied a means of predicting the onset of glioblastoma in a simple, quick and accurate manner with low invasiveness and risk to the subject, and the nestin concentration in the blood of the subject is the onset of glioblastoma. I found that it is related. The present invention has been made based on this finding.
  • the present invention relates to the following 1 to 11.
  • a method for predicting the onset of glioblastoma in a subject (1) a step of measuring a nestin concentration in a blood sample derived from a subject, and (2) A method comprising a step of predicting that a subject is likely to have glioblastoma when the nestin concentration is 0.63 ng / ml or more.
  • the reagent for measuring the nestin concentration contains a nestin antibody.
  • the reagent for measuring the nestin concentration further comprises a reagent used in the ELISA method.
  • the present invention can predict the onset of glioblastoma simply, quickly and accurately using blood that can be obtained by means of low invasiveness and risk to a subject, as shown in the examples described later. Therefore, by using the present invention, a glioblastoma can be diagnosed quickly and accurately for a subject suspected of having glioblastoma by other examination (for example, CT, MRI, etc.). Furthermore, by using the present invention, glioblastoma can be examined during a normal health examination.
  • FIG. 1 shows the results of Example 1.
  • FIG. 1 is derived from glioblastoma patients (Group 4), glioma patients other than Great 4 (Groups 2 and 3), malignant tumor patients other than glioma (Group 5), and healthy subjects (Group 0). It is a figure which shows the nestin density
  • FIG. 2 shows the results of Example 2.
  • FIG. 2 is derived from glioblastoma patients (Group 4), glioma patients other than Great 4 (Groups 2 and 3), malignant tumor patients other than glioma (Group 5), and healthy subjects (Group 0). It is a figure which shows the nestin density
  • FIG. 3 is an ROC curve relating to serum nestin concentration prepared using data of group 0 (normal subjects) and group 4 (glioblastoma) in Example 2.
  • the method of predicting the development of glioblastoma in a subject comprises the following steps: (1) a step of measuring a nestin concentration in a blood sample derived from a subject, and (2) When the nestin concentration is 0.63 ng / ml or more, preferably 1.00 ng / ml or more, a step of predicting that the subject is likely to have glioblastoma is included.
  • Glioblastoma is a glioma that arises from glial cells. In the WHO classification, it is a high-grade glioma classified as grade 4. Glioblastoma often occurs in the cerebral hemisphere of men aged 45 to 65 years, symptoms include headache, convulsions, personality changes, dementia and motor paralysis, and progression of symptoms due to high malignancy It is known to be fast.
  • the subject includes any animal that may develop glioblastoma, but is preferably a mammal, particularly preferably a human.
  • the subject may be a person who is suspected of having glioblastoma by a known glioblastoma examination means (for example, CT, MRI, etc.), or who is not suspected of having glioblastoma (for example, normal health A person who receives a diagnosis).
  • a known glioblastoma examination means for example, CT, MRI, etc.
  • glioblastoma examination means for example, CT, MRI, etc.
  • normal health for example, normal health
  • the subject's gender and age do not matter.
  • the preparation of a blood sample derived from a subject can be performed without particular limitation using a technique generally used in the technical field.
  • a blood sample blood collected from a subject may be used as it is, but it is preferable to use a blood sample obtained from a subject (for example, serum or plasma).
  • a serum sample is preferably used because the nestin concentration can be measured more accurately and rapidly.
  • the serum sample can be prepared using a method generally used in the technical field without any particular limitation. For example, it can be prepared by collecting blood (eg, venous blood) from a subject, allowing it to stand at room temperature (eg, 30 minutes), and then centrifuging (eg, 3500 rpm for 10 minutes).
  • the prepared serum sample may be stored frozen (eg, ⁇ 80 ° C.) until used in the method of the present invention.
  • Nestin is a known cytoskeletal protein classified as a type IV intermediate filament.
  • nestin is specifically expressed in undifferentiated neural stem cells, but it is known that its expression disappears when differentiated into neurons and astrocytes.
  • the measurement of the nestin concentration in the blood sample can be performed without particular limitation using a nestin measurement method, a detection method, and a quantification method that are generally used in the technical field.
  • a nestin measurement method e.g., a detection method
  • a quantification method that are generally used in the technical field.
  • ELISA method Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, enzyme-linked immunosorbent assay
  • step (1) can be performed using a blood nestin concentration measuring means known in the art, for example, a nestin detection kit containing a nestin antibody, preferably a nestin ELISA kit.
  • Examples of the ELISA method suitable for the step (1) include a sandwich method and a direct adsorption method.
  • the sandwich ELISA method is preferable because of its high specificity for nestin.
  • the sandwich ELISA method can be performed by the following steps. 1. A nestin antibody (capture antibody) is adsorbed to a solid phase. 2. Block the solid phase. 3. A blood sample containing nestin is added to the solid phase to form a conjugate of the capture antibody and nestin. 4). A biotin-labeled antibody against nestin (primary antibody) is added to the solid phase to form a conjugate of the capture antibody, nestin and primary antibody. 5. Avidin labeled enzyme is added to form a conjugate of capture antibody, nestin, primary antibody and enzyme. 6).
  • Enzyme substrate is added to detect enzyme reaction products.
  • the primary antibody used in the sandwich ELISA method is an antibody against nestin that recognizes an epitope different from the epitope recognized by the capture antibody.
  • Kits for measuring nestin using a sandwich ELISA method are commercially available (for example, trade name: SEA500Hu (Uscn Life Science Inc. Wuhan)), and these commercially available products can be used in step (1) without particular limitation. .
  • Step (2) the possibility that the subject suffers from glioblastoma is predicted based on the nestin concentration in the blood sample measured in step (1). Specifically, when the nestin concentration in the blood sample is 0.63 ng / ml or more, preferably 1.00 ng / ml or more, it is predicted that the subject is likely to have glioblastoma. Using a value of “1.00 ng / ml or more”, in addition to distinguishing glioblastoma from healthy individuals, it is possible to further distinguish glioblastoma from other malignant tumors.
  • the prediction results obtained according to the present invention can be used as follows.
  • the prediction results obtained by the present invention are combined with other glioblastoma diagnostic criteria (histopathological examination results, etc.)
  • other glioblastoma diagnostic criteria histopathological examination results, etc.
  • the prediction result according to the present invention can be used more effectively.
  • the prediction result obtained according to the present invention is used to obtain a second order related to glioblastoma.
  • this invention relates to the kit for performing the prediction method of the above-mentioned glioblastoma.
  • the kit for predicting the onset of glioblastoma of the present invention A reagent for measuring the concentration of nestin in a blood sample, and Characterized in that it contains instructions describing that if the nestin concentration is 0.63 ng / ml or higher, preferably 1.00 ng / ml or higher, the subject is likely to have glioblastoma. It is a kit to do.
  • the reagent for measuring the nestin concentration in the blood sample can be used without particular limitation, as it is generally used in the art for detecting and quantifying nestin in the blood. Specific examples include nestin-specific antibodies.
  • the kit of the present invention preferably uses the above-mentioned ELISA method, particularly the sandwich ELISA method.
  • the kit of the present invention can contain a reagent used in the ELISA method (for example, a solid phase blocking agent used in the sandwich ELISA method, a nestin antibody (capture antibody), a primary antibody, an enzyme, an enzyme substrate, etc.). .
  • Example 1 Nestin concentrations in blood samples derived from glioblastoma patients, glioma patients other than Great 4, malignant tumor patients other than glioma, and healthy subjects were measured and compared.
  • Subjects Subjects Subjects were classified into the following groups.
  • Group 0 Healthy volunteers 12 Group 2 Diffuse astrocytoma (grade 2 glioma by WHO classification): 2 oligodendroma (grade 2 glioma by WHO classification): 2 oligodendrocyte astrocytoma (grade 2 by WHO classification) Glioma): 2 Group 3 Anaplastic astrocytoma (grade 3 glioma by WHO classification): 1 anaplastic oligodendroglioma (grade 3 glioma by WHO classification): 2 anaplastic oligodendroglioma (Grade 3 glioma by WHO classification): 3 people Group 4 Glioblastoma (WHO classification grade 4 glioma): 6 Group 5 Metastatic brain tumor (non-glioma disease): 2 malignant lymphoma (non-glioma disease): 1 Each subject other than group 0 had undergone craniotomy tumor excision or biopsy at Tokyo Women's Medical Neurosurgery between May 2013 and December
  • the average value of serum nestin concentration in each group was as follows.
  • Serum nestin concentration between each group was statistically evaluated using Student-t test. The results are shown below. Pairwise comparison in Student-t test
  • the serum nestin concentration value “1.00 ng / ml” larger than the average value of 0.9976 ng / ml in the serum samples of group 4 (glioblastoma) was used as an index, and glioblastoma and others It is understood that the malignant tumor and the healthy person can be distinguished from each other.
  • Example 2 Nestin concentrations in blood samples derived from glioblastoma patients, glioma patients other than Great 4, malignant tumor patients other than glioma, and healthy subjects were measured and compared.
  • Subjects Subjects Subjects were classified into the following groups.
  • Group 0 Healthy volunteers 27 Group 2 Diffuse astrocytoma (grade 2 glioma by WHO classification): 1 oligodendroma (grade 2 glioma by WHO classification): 1 oligodendrocyte astrocytoma (grade 2 by WHO classification) Glioma): 3 Group 3 Anaplastic astrocytoma (grade 3 glioma by WHO classification): 1 anaplastic oligodendroglioma (grade 3 glioma by WHO classification): 1 anaplastic oligodendroglioma (Grade 3 glioma by WHO classification): 2 people Group 4 Glioblastoma (grade 4 glioma by WHO classification): 28 Group 5 Malignant lymphoma (non-glioma): 4 Each subject other than group 0 received a craniotomy tumor or biopsy at Tokyo Women's Medical Neurosurgery between May 2013 and June 2014, and diagnosed each disease by pathological examination of the collected brain tissue was confirmed.
  • the average value of serum nestin concentration in each group was as follows.
  • glioblastoma can be distinguished from other malignant tumors and healthy individuals using the serum nestin concentration value “1.00 ng / ml” as an index.
  • ROC curves were created using serum nestin concentration data of group 0 (healthy subjects) and group 4 (glioblastoma) (FIG. 3).
  • the ROC curve shows the reliability of the test.
  • “sensitivity (positive rate)” on the Y-axis indicates the percentage that shows a positive (abnormal value) when testing a population affected with glioblastoma.
  • “Specificity (false positive rate)” indicates the rate at which healthy individuals who are not glioblastoma (negative) are detected as positive. Therefore, the closer the area under the ROC curve (AUC) of an inspection method is to 1, the higher the reliability of the inspection method.
  • the AUC of the ROC curve of Example 2 was 0.85.
  • the present invention using serum nestin concentration as an index is a reliable method for predicting the onset of glioblastoma. Furthermore, when the cut-off value (a value that separates positive and negative in glioblastoma onset prediction) was calculated using statistical software JMP Pro11, the serum nestin concentration that gave the cut-off value was 0.63 ng / ml. From this result, it is understood that glioblastoma can be distinguished from a healthy person using the serum nestin concentration value “0.63 ng / ml” as an index.
  • the present invention can predict the onset of glioblastoma. Therefore, the present invention can be used for diagnosis of glioblastoma.

Abstract

　本発明は、被験者における膠芽腫の発症を予測する方法を提供する。本発明は、（１）被験者由来の血液サンプル中のネスチン濃度を測定する工程、及び、（２）ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する工程を含むことを特徴とする方法である。

Description

膠芽腫の予測方法
　本発明は、被験者における膠芽腫の発症を予測する方法に関する。
　神経膠腫（glioma）は脳に発生する悪性腫瘍の一つであり、全頭蓋内腫瘍の約２５％を占めている。
　神経膠腫には多様な種類が存在するが、世界保健機関（ＷＨＯ）による分類が世界的に用いられている（非特許文献１）。ＷＨＯ分類は悪性度に基づいており、各神経膠腫がグレード１（悪性度が最も低い）～グレード４（悪性度が最も高い）に分類されている。そして、各神経膠腫の治療方針も、このグレードに基づいて定められている。
　膠芽腫（glioblastoma）は、ＷＨＯ分類でグレード４に分類される神経膠腫の一つである。膠芽腫は進行が早いため、膠芽腫であることを正確に判定し、膠芽腫に適した治療を開始することが患者の予後にとって重要である。
　膠芽腫の確定診断は、ＣＴやＭＲＩにより膠芽腫が疑われている被験者から採取した脳組織を病理医が顕微鏡で観察（病理組織検査）することにより行われている。その際、診断の精度を高めるための補助的手段として、採取した脳組織中の細胞をネスチン（nestin）で染色することが行われている。具体的には、神経膠腫組織細胞のネスチン染色性と神経膠腫の悪性度とが相関していることに基づき、免疫組織化学染色法を用いた脳組織細胞のネスチン染色結果を、膠芽腫の診断で補助的に使用している（非特許文献２）。
　尚、ネスチンが血液等の細胞外に存在することは知られていない。
Acta Neuropathol (2007) 114:97-109 Brain Tumor Pathol (2012) 29:160-167
　しかしながら、被験者から採取した脳組織細胞をネスチン染色する方法は、複雑な免疫組織化学染色操作を必要とするため、結果を得るまでに時間がかかる。更に、この方法では、膠芽腫とは異なる疾患である転移性脳腫瘍や悪性リンパ腫との鑑別が困難であることが少なくない。
　また、脳組織の採取は、被験者に対する侵襲性が大きく、危険性も少なくないため、通常の健康診断において膠芽腫の検査は行われていない。
　本発明者等は、被験者に対する侵襲性や危険性が低く、簡便、迅速かつ正確に膠芽腫の発症を予測できる手段について鋭意検討したところ、被験者の血液中のネスチン濃度が膠芽腫の発症と関連していることを見いだした。本発明は、この知見に基づいてなされたものである。
　すなわち、本発明は、下記１～１１に関するものである。
１.被験者における膠芽腫の発症を予測する方法であって、
　（１）被験者由来の血液サンプル中のネスチン濃度を測定する工程、及び、
　（２）ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する工程
を含むことを特徴とする方法。
２.工程（２）において、ネスチン濃度が１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する、前記１に記載の方法。
３.被験者が、膠芽腫が疑われている者である、前記１又は２に記載の方法。
４.被験者が、膠芽腫が疑われていない者である、前記１～３のいずれかに記載の方法。
５.血液サンプルが血清サンプルである、前記１～４のいずれかに記載の方法。
６.ネスチン濃度をＥＬＩＳＡ法で測定する、前記１～５のいずれかに記載の方法。
７.ＥＬＩＳＡ法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、前記６に記載の方法。
８.膠芽腫の発症を予測するためのキットであって、
　血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
　ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
を含むことを特徴とするキット。
９.膠芽腫の発症を予測するためのキットであって、
　血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
　ネスチン濃度が１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
を含むことを特徴とするキット。
１０.ネスチン濃度を測定する試薬がネスチン抗体を含む、前記８又は９に記載のキット。
１１.ネスチン濃度を測定する試薬がＥＬＩＳＡ法で用いられる試薬を更に含む、前記１０に記載のキット。
　本発明は、後述する実施例で示されるように、被験者に対する侵襲性や危険性が低い手段により入手可能な血液を用いて膠芽腫の発症を簡便、迅速かつ正確に予測することができる。したがって、本発明を用いることにより、他の検査（例えば、ＣＴやＭＲＩ等）により膠芽腫が疑われている被験者に対しては迅速かつ正確な膠芽腫の診断が可能になる。
　更に、本発明を用いることにより、通常の健康診断の際に膠芽腫の検査を行うことが可能になる。
図１は実施例１の結果である。図１は、膠芽腫患者（グループ４）、グレート４以外の神経膠腫患者（グループ２及び３）、神経膠腫以外の悪性腫瘍患者（グループ５）及び健常者（グループ０）に由来する血清サンプル中のネスチン濃度を示す図である。 図２は実施例２の結果である。図２は、膠芽腫患者（グループ４）、グレート４以外の神経膠腫患者（グループ２及び３）、神経膠腫以外の悪性腫瘍患者（グループ５）及び健常者（グループ０）に由来する血清サンプル中のネスチン濃度を示す図である。 図３は、実施例２のグループ０（健常者）とグループ４（膠芽腫）のデータを用いて作成した、血清ネスチン濃度に関するROC曲線である。
　以下、本発明を更に詳細に説明する。
　本発明の、被験者における膠芽腫の発症を予測する方法は、下記の工程：
　（１）被験者由来の血液サンプル中のネスチン濃度を測定する工程、及び、
　（２）ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する工程
を含んでいる。
工程（１）
　膠芽腫（glioblastoma）は、神経膠細胞から発生する神経膠腫である。ＷＨＯ分類では、グレード４に分類されている悪性度の高い神経膠腫である。膠芽腫は、４５～６５歳の男性の大脳半球で多く発生することや、症状として頭痛、痙攣、性格変化、認知症や運動麻痺などがあることや、悪性度が高いため症状の進行が早いことが知られている。
　被験者は、膠芽腫を発症する可能性のあるあらゆる動物が含むが、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒトである。
　被験者は、公知の膠芽腫の検査手段（例えば、ＣＴやＭＲＩ等）により膠芽腫が疑われている者であってもよく、膠芽腫が疑われていない者（例えば、通常の健康診断を受ける者）であってもよい。
　また、被験者の性別や年齢は問わない。
　被験者由来の血液サンプルの調製は、当該技術分野で一般的に用いられている手法を特に制限なく用いて行うことができる。
　血液サンプルは、被験者から採取した血液をそのまま使用してもよいが、被験者から採取した血液を加工したもの（例えば、血清や血漿等）を使用することが好ましい。ネスチン濃度をより正確かつ迅速に測定できる点で、血清サンプルを用いることが好ましい。
　血清サンプルの調製は、当該技術分野で一般的に用いられている手法を特に制限なく用いて行うことができる。例えば、被験者から血液（例えば静脈血）を採取し、これを室温下で静置（例えば３０分間）した後、遠心分離（例えば３５００ｒｐｍで１０分間）することで調製することができる。調製した血清サンプルは、本発明の方法に使用するまで凍結保存（例えば－８０℃）してもよい。
　ネスチン（nestin）は、IV型中間系フィラメントに分類される公知の細胞骨格タンパク質である。また、ネスチンは、未分化の神経幹細胞では特異的に発現しているが、ニューロン（neuron）や星状膠細胞（astrocyte）へ分化すると発現が消失することが知られている。
　血液サンプル中のネスチン濃度の測定は、当該技術分野で一般的に用いられているネスチン測定方法、検出方法や定量方法を特に制限なく用いて行うことができる。具体例としては、ネスチン特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay、酵素結合免疫吸着検定法）があり、これはネスチンに対する特異性が高くかつ定量性に優れている。
　したがって、工程（１）は、当該技術分野で公知の血中ネスチン濃度測定手段、例えばネスチン抗体を含むネスチン検出キット、好ましくはネスチン用ＥＬＩＳＡキットを用いて実施することができる。
　工程（１）に好適なＥＬＩＳＡ法としては、サンドイッチ法、直接吸着法が挙げられる。ネスチンに対する特異性が高い点でサンドイッチＥＬＩＳＡ法が好ましい。
　例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法は下記の工程で行うことができる。

　１．ネスチン抗体（捕獲抗体）を固相に吸着させる。
　２．固相をブロッキングする。
　３．ネスチンを含む血液サンプルを固相へ添加して、捕獲抗体とネスチンとのコンジュゲートを形成させる。
　４．ビオチン標識されたネスチンに対する抗体（一次抗体）を固相へ添加して、捕獲抗体とネスチンと一次抗体とのコンジュゲートを形成させる。
　５．アビジン標識された酵素を添加して、捕獲抗体とネスチンと一次抗体と酵素とのコンジュゲートを形成させる。
　６．酵素基質を添加して、酵素反応生成物を検出する。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる一次抗体は、捕獲抗体が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識するネスチンに対する抗体である。

　サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いてネスチンを測定するキットは市販されており（例えば、商品名：SEA500Hu（Uscn Life Science Inc. Wuhan））、これらの市販品を特に制限なく工程（１）に用いることができる。
工程（２）
　工程（２）では、工程（１）で測定された血液サンプル中のネスチン濃度に基づいて、被験者が膠芽腫を患っている可能性を予測する。具体的には、血液サンプル中のネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する。
　「１．００ｎｇ／ｍｌ以上」の値を用いると、膠芽腫と健常者とを識別することに加えて、更に膠芽腫と他の悪性腫瘍とを識別することができる。
　本発明にしたがい得られた予測結果は、下記の様に利用することができる。
　本発明を、ＣＴやＭＲＩにより膠芽腫が疑われている被験者に対して実施した場合、本発明により得られた予測結果を他の膠芽腫の診断基準（病理組織検査結果等）と組み合わせることにより、より迅速かつ正確な確定診断を行うことができる。また、被験者の健康状態等により脳組織の採取が困難な場合には、本発明による予測結果をより有効に活用することができる。
　本発明を、膠芽腫が疑われていない者（例えば、通常の健康診断を受ける者）に対して実施した場合、本発明にしたがって得られた予測結果を用いて、膠芽腫に関する二次検査（精密検査）の要否を判定することができる。したがって、被験者に対する侵襲性及び危険性が低い血液サンプルを用い、かつ、簡便な手段で実施できる本発明を用いることで、従来は行われていなかった膠芽腫の検査を通常の健康診断における検査項目とすることができる。
　更に本発明は、上述の膠芽腫の予測方法を行うためのキットに関する。具体的には、本発明の膠芽腫の発症を予測するためのキットは、
　血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
　ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
を含むことを特徴とするキットである。
　血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬は、血液中のネスチンを検出し、定量するために当該技術分野で一般的に用いられているものを特に制限なく用いて行うことができる。具体例としては、ネスチン特異的抗体が挙げられる。
　本発明のキットは、好ましくは、前述のＥＬＩＳＡ法、特にサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いるものである。この場合、本発明のキットは、ＥＬＩＳＡ法で用いられる試薬（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いられる固相ブロッキング剤、ネスチン抗体（捕獲抗体）、一次抗体、酵素や酵素基質等）を含むことができる。
　次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１
　膠芽腫患者、グレート４以外の神経膠腫患者、神経膠腫以外の悪性腫瘍患者及び健常者に由来する血液サンプル中のネスチン濃度を測定し、比較した。
（１）被験者
　被験者を下記のグループに分類した。
グループ０
健常者ボランティア：１２名

グループ２
びまん性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：２名
乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：２名
乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：２名

グループ３
退形成性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：１名
退形成性乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：２名
退形成性乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：３名

グループ４
膠芽腫（ＷＨＯ分類でグレード４の神経膠腫）：６名

グループ５
転移性脳腫瘍（神経膠腫ではない疾患）：２名
悪性リンパ腫（神経膠腫ではない疾患）：１名

　グループ０以外の各被験者は、2013年5月～2013年12月の間に東京女子医大脳神経外科で開頭腫瘍摘出術又は生検術を受け、採取された脳組織の病理検査より各疾患に対する診断が確定した者であった。
（２）血液サンプルの調製
　各被験者から静脈血を採取し、室温下で３０分間静置した後、遠心分離（３５００ｒｐｍで１０分間）することによって血清サンプルを調製した。調製した血清サンプルは、ネスチン濃度を測定するまで凍結保存（－８０℃）した。
（３）ネスチン濃度の測定
　凍結保存した血清サンプルを４℃で解凍した。次いで、市販のネスチン測定キット（商品名：SEA500Hu（Uscn Life Science Inc. Wuhan）を用い、キット添付のプロトコルに従いサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、血清サンプル中のネスチン濃度を測定した。
　測定結果を図１に示す。
　各グループの血清ネスチン濃度の平均値は以下の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　各グループ間の血清ネスチン濃度をStudent-t testを用いて統計学的に評価した。結果を以下に示す。

Student-t testでのペアごとの比較
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　この統計学的評価結果は、グループ４（膠芽腫）の血清ネスチン濃度が、他のグループの血清ネスチン濃度に対して有意差（p<0.05）があることを示している。
　上記の結果より、グループ４（膠芽腫）の血清サンプル中のネスチン濃度の平均値０．９９７６ｎｇ／ｍｌよりも大きい血清ネスチン濃度値「１．００ｎｇ／ｍｌ」を指標として、膠芽腫と他の悪性腫瘍及び健常者とを識別することができることが理解される。
実施例２
　膠芽腫患者、グレート４以外の神経膠腫患者、神経膠腫以外の悪性腫瘍患者及び健常者に由来する血液サンプル中のネスチン濃度を測定し、比較した。
（１）被験者
　被験者を下記のグループに分類した。
グループ０
健常者ボランティア：２７名

グループ２
びまん性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：１名
乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：１名
乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：３名

グループ３
退形成性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：１名
退形成性乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：１名
退形成性乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：２名

グループ４
膠芽腫（ＷＨＯ分類でグレード４の神経膠腫）：２８名

グループ５
悪性リンパ腫（神経膠腫ではない疾患）：４名

　グループ０以外の各被験者は、2013年5月～2014年6月の間に東京女子医大脳神経外科で開頭腫瘍摘出術又は生検術を受け、採取された脳組織の病理検査より各疾患に対する診断が確定した者であった。
（２）血液サンプルの調製
　各被験者から静脈血を採取し、室温下で３０分間静置した後、遠心分離（３５００ｒｐｍで１０分間）することによって血清サンプルを調製した。調製した血清サンプルは、ネスチン濃度を測定するまで凍結保存（－８０℃）した。
（３）ネスチン濃度の測定
　凍結保存した血清サンプルを４℃で解凍した。次いで、市販のネスチン測定キット（商品名：SEA500Hu（Uscn Life Science Inc. Wuhan）を用い、キット添付のプロトコルに従いサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、血清サンプル中のネスチン濃度を測定した。
　測定結果を図２に示す。
　各グループの血清ネスチン濃度の平均値は以下の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　各グループ間の血清ネスチン濃度をStudent-t testを用いて統計学的に評価した。結果を以下に示す。

Student-t testでのペアごとの比較

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
※片側検定では、p値は上記p値の半分の値になるので、4-0比較では、図２に示すとおりp=0.0045となった。
　この統計学的評価結果は、グループ４（膠芽腫）の血清ネスチン濃度が、他のグループの血清ネスチン濃度に対して有意差（p<0.05）があることを示している。
　上記の結果より、血清ネスチン濃度値「１．００ｎｇ／ｍｌ」を指標として、膠芽腫と他の悪性腫瘍及び健常者とを識別することができることが理解される。
　次に、グループ０（健常者）とグループ４（膠芽腫）の血清ネスチン濃度のデータを用いてROC曲線を作成した（図３）。ROC曲線は検査の信頼度を示す。ROC曲線において、Y軸の「感度（陽性率）」は、膠芽腫に罹患している集団に対して検査を行ったとき陽性（異常値）を示す割合を示し、X軸の「1-特異度（偽陽性率）」は、膠芽腫でない健常者（陰性）を陽性として検出してしまう割合を示す。したがって、ある検査法のROC曲線の曲線下面積（AUC）が1に近いほど、当該検査法の信頼性は高くなる。実施例２のROC曲線のAUCは０．８５であった。この結果より、血清ネスチン濃度を指標とする本発明は、膠芽腫の発症予測に関して信頼性の高い方法であることが理解される。
　更に、統計ソフトJMP Pro11を用いてカットオフ値（膠芽腫発症予測において陽性と陰性とを分ける値）を算出したところ、カットオフ値となる血清ネスチン濃度は０．６３ｎｇ／ｍｌであった。この結果より、血清ネスチン濃度値「０．６３ｎｇ／ｍｌ」を指標として、膠芽腫と健常者とを識別することができることが理解される。
　本発明は、膠芽腫の発症を予測することができる。したがって、本発明は、膠芽腫の診断に利用することができる。

Claims (11)

  1. 　被験者における膠芽腫の発症を予測する方法であって、
    　（１）被験者由来の血液サンプル中のネスチン濃度を測定する工程、及び、
    　（２）ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する工程
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 　工程（２）において、ネスチン濃度が１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する、請求項１に記載の方法。
  3. 　被験者が、膠芽腫が疑われている者である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　被験者が、膠芽腫が疑われていない者である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　血液サンプルが血清サンプルである、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　ネスチン濃度をＥＬＩＳＡ法で測定する、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　ＥＬＩＳＡ法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、請求項６に記載の方法。
  8. 　膠芽腫の発症を予測するためのキットであって、
    　血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
    　ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
    を含むことを特徴とするキット。
  9. 　膠芽腫の発症を予測するためのキットであって、
    　血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
    　ネスチン濃度が１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
    を含むことを特徴とするキット。
  10. 　ネスチン濃度を測定する試薬がネスチン抗体を含む、請求項８又は９に記載のキット。
  11. 　ネスチン濃度を測定する試薬がＥＬＩＳＡ法で用いられる試薬を更に含む、請求項１０に記載のキット。
PCT/JP2015/065281 2014-05-28 2015-05-27 膠芽腫の予測方法 WO2015182668A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016523539A JP6613526B2 (ja) 2014-05-28 2015-05-27 膠芽腫の予測方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014110326 2014-05-28
JP2014-110326 2014-05-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015182668A1 true WO2015182668A1 (ja) 2015-12-03

Family

ID=54698991

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/065281 WO2015182668A1 (ja) 2014-05-28 2015-05-27 膠芽腫の予測方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6613526B2 (ja)
WO (1) WO2015182668A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003046182A1 (fr) * 2001-11-30 2003-06-05 Institute Of Gene And Brain Science Antigene de gliome humain d'origine testiculaire
JP2012504393A (ja) * 2008-10-01 2012-02-23 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 神経細胞性脳腫瘍など数種の腫瘍に対する新規免疫療法
US20120184560A1 (en) * 2010-09-24 2012-07-19 The Methodist Hospital Research Institute Molecular diagnostic methods for predicting brain metastasis of breast cancer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003046182A1 (fr) * 2001-11-30 2003-06-05 Institute Of Gene And Brain Science Antigene de gliome humain d'origine testiculaire
JP2012504393A (ja) * 2008-10-01 2012-02-23 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 神経細胞性脳腫瘍など数種の腫瘍に対する新規免疫療法
US20120184560A1 (en) * 2010-09-24 2012-07-19 The Methodist Hospital Research Institute Molecular diagnostic methods for predicting brain metastasis of breast cancer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAHLSTRAND J ET AL.: "Expression of the class VI intermediate filament nestin in human central nervous system tumors.", CANCER RES., vol. 52, no. 19, October 1992 (1992-10-01), pages 5334 - 5341, XP055241031 *
KIYOSHI TEZUKA ET AL.: "Shinkei Kogashu ni Okeru Nestin no Hatsugen to, sono Yakuwari no Kento", NIPPON BYORI GAKKAI KAISHI, vol. 99, no. 1, 26 March 2010 (2010-03-26), pages 351, P2 - K-7 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6613526B2 (ja) 2019-12-04
JPWO2015182668A1 (ja) 2017-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2014276637B2 (en) Method for aiding differential diagnosis of stroke
JP2020512550A5 (ja)
CA2857589C (en) Biomarker-based methods and biochips for aiding the diagnosis of stroke
US20130040849A1 (en) Method and kit for cancer diagnosis
CN105308455B (zh) 用于诊断先兆子痫的方法和组合物
Li et al. Increased level of procalcitonin is associated with total MRI burden of cerebral small vessel disease in patients with ischemic stroke
JP6613526B2 (ja) 膠芽腫の予測方法
JP6273338B1 (ja) パーキンソン病からパーキンソン病認知症を特定する方法
JP6579339B2 (ja) 神経膠腫の予測方法
EP3545310A1 (en) Gfap accumulating in stroke
CN111308082A (zh) 用于阿尔茨海默病的风险评估的方法和装置
Lee et al. A comprehensive Exdia TRF-LFIA for simultaneous quantification of GFAP and NT-proBNP in distinguishing ischemic and hemorrhagic stroke
BR102021026038A2 (pt) Uso de algoritmos de aprendizado de máquina para a detecção e triagem do câncer de mama
Puranik et al. Insight into Early Diagnosis of Multiple Sclerosis by Targeting Prognostic Biomarkers
JP5814800B2 (ja) 神経変性疾患の検出方法
CN117169320A (zh) 一组用于结直肠癌诊断的血液多金属离子组合及其应用
CN114814237A (zh) 一种用于诊断部分性性早熟女童的特异性生物标记物及其筛选方法和应用
WO2012067152A1 (ja) Endothelial Protein C Receptor蛋白質による脳梗塞の検査方法
CN116298323A (zh) 一种用于诊断狼疮性肾炎的生物标志物及应用
WO2018060003A1 (en) Melanotransferrin for use in the diagnosis of parkinson`s disease
Mahmood Computer Assisted Optical Screening of Human Ovarian Cancer using Raman Spectroscopy
Mortazavi et al. Research Article Salivary Desmoglein Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Diagnosis of Pemphigus Vulgaris: A Noninvasive Alternative Test to Serum Assessment
Song et al. Evaluation of Difference between Benign and Normal in Ovarian Cancer
BR102012023228A2 (pt) Câncer de bexiga

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15799624

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016523539

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15799624

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1