CN117169320A - 一组用于结直肠癌诊断的血液多金属离子组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于诊断结直肠癌的外周血多金属离子诊断组合及其应用。所述的多金属离子诊断组合由钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)组成。本发明通过电感耦合等离子体技术与质谱技术，检测结直肠癌患者和正常对照人群外周血中的金属离子水平，筛选差异金属离子；通过机器学习算法建模分析，筛选出结直肠癌的多金属离子诊断组合；通过在不同地区病例对照人群血浆中验证，评价多金属离子诊断组合对结直肠癌的诊断能力。基于筛选的外周血多金属离子诊断组合，建立了可用于结直肠癌诊断的快速的、灵敏的、特异的标准方法体系，为大规模人群筛检及临床诊断结直肠癌提供了技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种可用于人群结直肠癌诊断的多金属例子组合及其应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
结直肠癌是全球高发的恶性肿瘤之一。
结直肠癌发病率在地域上存在显著的差异，西方发达国家中结直肠癌的发病率相对较高，相对落后的发展中国家发病率则较低。然而，近年来包括美国在内的几个高收入国家，结直肠癌发病率已经趋于稳定并呈下降趋势，可能与结直肠癌的早期筛查增加及生活习惯的改变有关。
在过去的几十年中，已经提出了几种用于诊断结直肠癌的方法，主要有：内镜检查、粪便检测、影像学检查和血液检查。患者早期诊断可有效提高其生存率，诊断为早期局部疾病(I期和II期)患者的5年生存率接近90％，随着肿瘤的分期进展，诊断为晚期结直肠癌(与扩散到远处器官有关)的患者的存活率仅为13.1％。早期发现结直肠癌并提供相应的治疗措施可以提高结直肠癌患者的生存率，因此应该更注重结直肠癌的早期筛查。
尽管有多种可用与结直肠癌的筛查方法，同时也已经明确证明筛查可以降低结直肠癌相关死亡的风险，但目前结直肠癌筛查手段的灵敏度和依从性仍然较低。作为结直肠癌筛查与诊断的金标准，结肠镜检查因其侵入性引起不适，有超过一半的患者不会使用结肠镜检查。粪便潜血检测是非侵入性的方法，但因为其结果的灵敏度低不能被推广与普及。而影像学检查常在确定为肠梗阻时才会使用。因此，在诊断时，许多患者出现局部晚期或转移性疾病的情况，甚至在发达国家中也观察到这种现象。因此，仍需要寻找常规检测中可以检测得到的结直肠癌早期生物标志物，血液仍是早期检测标志物的理想样品。
作为一门新兴学科，金属组学直到21世纪在德岛举行的化学工程大会上首次被提出，其定义是综合分析细胞或者组织中所有的金属和类金属物质的含量，其所代表的是一个与生物系统金属有关的新科学领域。越来越多的研究指出，金属离子会通过诱导氧化应激的产生及与染色质(如DNA、组蛋白、转录因子、DNA修复酶)和肿瘤调节分子竞争结合的方式，直接或间接地影响肿瘤的发生、发展过程。金属离子在机体内虽然大多以微量元素的形式存在，但是却承担着包括氧的转运、自由基的清除、构成大分子物质、组成金属酶等生物进程，对细胞发挥其功能至关重要。越来越多的研究指出，金属离子稳态失衡出现在各种疾病中。金属组学的出现，促使我们以一个整体的角度系统研究金属离子和结直肠癌的关系，包括金属离子之间的相互作用都被考虑在内。因此，外周血中的金属离子水平可能具有癌症诊断的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于诊断结直肠癌的多金属离子诊断组合及其应用，所述的多金属离子诊断组合可以灵敏且特异的诊断结直肠癌。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一组用于诊断结直肠癌的多金属离子组合，是由钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)六种金属离子组成。
进一步的，本发明还提出了所述的用于诊断结直肠癌的多金属离子组合在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。以及用于检测钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)的试剂或器械在制备结直肠癌诊断试剂或装置中的应用。
其中，优选的，所述的试剂或装置是通过检测个体空腹静脉血中钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)的浓度来评价个体患有结直肠癌的风险。
其中，优选的，所述的检测包括使用电感耦合等离子体质谱仪对个体空腹静脉血钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)的浓度进行检测，若在个体中测得的上述金属离子浓度与对照组人群血浆水平存在统计学显著差异，这说明该个体罹患结直肠癌的风险较大。
更进一步的，本发明还提出了一种用于诊断结直肠癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有用于检测钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)的试剂。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明通过基于电感耦合等离子体技术与质谱技术联用，检测结直肠癌患者和正常对照人群外周血中的金属离子水平，筛选差异金属离子；通过机器学习算法建模分析，筛选出结直肠癌的多金属离子诊断组合；通过在不同地区病例对照人群血浆中验证，评价多金属离子诊断组合对结直肠癌的诊断能力。基于筛选的多金属离子诊断组合，建立了可用于结直肠癌诊断的快速的、灵敏的、特异的标准方法体系，为大规模人群筛检及临床诊断结直肠癌提供了技术手段。
附图说明
图1为随机森林模型下金属离子重要性排序；
图2为基于Lasso回归的λ选择；
图3为不同统计模型下对结直肠癌诊断有统计学意义的离子；
图4为哈尔滨血浆中金属离子水平对结直肠癌诊断的ROC曲线；
图5为贵阳血浆中金属离子水平对结直肠癌诊断的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1结直肠癌血浆金属离子浓度检测筛选多金属离子诊断组合
1、样品采集：
1)结直肠癌病例人群：为2018-2019年哈尔滨医科大学附属第二医院新确诊为结直肠癌的住院患者128例。病例均为18岁以上、到医院就诊，经临床组织病理诊断新确诊为结直肠癌的患者，未经放疗与化疗，任何患有恶性黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃肠道间质瘤和Lynch综合征、家族性腺瘤性息肉病、炎症性肠病(克罗恩病CD和溃疡性结肠炎UC)等肠道相关疾病的患者均被排除在外，。
血浆样本采集：受试者采血前均空腹、禁饮含酒精和咖啡因的饮料八小时以上，病例在手术及各项治疗前进行采血。血浆样本使用枸橼酸钠抗凝(EDTA)采血管进行收集，将外周静脉血(5ml)在3000转/分、4℃的条件下离心10分钟，去除血细胞后分装血浆，之后立刻将样本置于-80℃冰箱储存。
2)无癌对照人群：纳入2018-2019年同时期在哈尔滨医科大学附属第四医院体检的未患有癌症的对照人群128例。
血浆样本采集：受试者采血前均空腹、禁饮含酒精和咖啡因的饮料八小时以上，病例在手术及各项治疗前进行采血。血浆样本使用枸橼酸钠抗凝(EDTA)采血管进行收集，将外周静脉血(5ml)在3000转/分、4℃的条件下离心10分钟，去除血细胞后分装血浆，之后立刻将样本置于-80℃冰箱储存。
2、血浆中金属离子水平测定：
通过电感耦合等离子体技术与质谱技术联用，分析采集集结直肠癌患者和无癌对照人群外周血中金属离子水平；分析金属离子的差异性。
具体步骤：
(1)检测试剂的准备：2％的硝酸混合溶液，溶液由5ml 10％的硝酸，5ml的1％Tritionx和490ml的纯净水组成；标准溶液购于安捷伦科技有限公司，标准溶液的制备：分别量取浓度为10mg/L混合标准储备液，使用5％硝酸稀释成各元素系列质量浓度的混合标准溶液，钙、钠、镁、铁、钾(0.5、1、2、5、10μg/L)铝、铬、锰、铜、锌、砷、硒、银、锡、钡、铅(5、10、20、50、100μg/L)。
(2)血浆样本解冻：取冻存于-80℃冰箱的血液样本放置4℃条件下解冻融化。
(3)待检测样本的制备：解冻后使用涡旋器将血液涡旋3分钟，使样本充分混匀；取0.3ml待测血液样本加入到15ml离心管中；在离心管中加入配制好的内标75μl和2％硝酸2625μl，组成混合溶液；将上述混合溶液震荡调匀后离心5分钟，转速3000r/min，将杂质以及浑浊物沉淀，将配置完成的待测样本放置一旁准备检测。
(4)利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测血浆金属离子浓度：将配制完成的待测样本放入电感耦合等离子体质谱仪内进行检测。ICP-MS是将电感耦合等离子体技术与质谱技术结合在一起的高精度检测仪器，可同时检测多种金属元素的含量，将电感耦合等离子体作为离子源，被检测分析的样本送至雾化器后形成气溶胶，通过蒸发、分解、激发和电离等过程，被检测物质中的元素大多变成正一价离子，然后正离子进入质谱仪通过不同的质核比从而分析出各元素的浓度水平。
(5)采用Mann-Whitney检验比较病例组与对照组血液样本中各金属离子水平是否存在统计学差异；筛选出差异金属离子。
结果：通过电感耦合等离子体技术与质谱技术联用发现，在血浆中总共检测22种金属离子的浓度，其中15种金属离子在病例和对照中具有显著性差异(P<0.05)(表1)。
表1哈尔滨病例对照人群血浆金属离子水平比对结果
a数据是以中位数(四分位数间距)来表示
由以上结果可知，铝、锰、镉、锑、汞、钛、铅、钙、钒、铬、砷、硒、锶、铁以及锌在病例组和对照组人群间血浆水平存在统计学显著差异(P<0.05)，有作为结直肠癌诊断的潜力。
3、基于机器学习算法建模分析，筛选结直肠癌多金属离子诊断组合
运用随机森林，Logistic回归以及Lasso回归三种函数模型筛选对结直肠癌和无癌对照人群分类有显著贡献的金属离子。
将15种金属离子引入Logistic回归模型，在Logistic回归模型中，采用向前逐步回归法，筛选出锰、钛、铅、钒、铬、锌以及砷七种金属离子，该模型正确率达到97.1％(95％CI＝0.942-0.988，灵敏度＝0.976，特异度＝0.966，Kappa＝0.943)。在随机森林模型中，筛选出铅、铬、锰、铁、锌、砷、钛以及钒八个离子(取重要性前八的离子)，该模型同样具有较高的正确率，达到91.9％(95％CI＝0.832-0.970，灵敏度＝0.895，特异度＝0.944，Kappa＝0.838)(图1)。在Lasso回归模型中，筛选出锌、砷、铬、铅、钛、钒、锶以及铁八个离子，模型的正确率达到95.3％(95％CI＝0.920-0.976，灵敏度＝0.977，特异度＝0.930，Kappa＝0.906)(图2)。三种模型都筛选出钛、铅、钒、铬、锌以及砷六个离子(图3)。
最终，确定了6个在血浆样本中，具有差异的金属离子——钛、铅、钒、铬、锌、砷，共同组成多金属离子诊断组合。
实施例2结直肠癌的多金属离子诊断组合的人群验证
对具有结直肠癌特异性的多金属离子诊断组合在结直肠癌患者和健康人群中进行了含量测定，检测其在病例对照的血浆中的含量情况，评价其对结直肠癌的诊断学价值。分别利用受试者工作曲线(ROC)评价钛，铅，钒，铬，锌，砷(三个统计模型共同筛选)六个离子，以及不同统计模型筛选出的多金属组合。
1、样本收集
本研究纳入128例2018-2019年哈尔滨医科大学附属第二医院新确诊为结直肠癌的住院患者以及128例来自同时期哈医大附属四院体检的无癌对照；45例2018年贵州医科大学附属医院结直肠外科就诊的结直肠癌病人45例以及同医院的无癌对照46例。人口统计学信息表2。
经医生许可且患者同意并签订知情同意书后，病例组于患者手术之前空腹采集外周静脉血5-10ml，对照组于体检时空腹采集外周静脉血5-10ml。3000转/分离心10分钟，取血浆并置于-80℃进行保存。
表2血浆样本病例对照人口学特征
a缺失数据：性别31；年龄33
2、血浆中金属离子水平测定：
方法同实施例1。
3、哈尔滨血浆样本金属离子水平结直肠癌诊断学价值分析
基于哈尔滨血浆人群分析，通过图4可以发现，六个金属离子的AUC分别是：砷(AUC＝0.777，P<0.001)、铬(AUC＝0.865，P<0.001)、铅(AUC＝0.915，P<0.001)、钛(AUC＝0.791，P<0.001)、钒(AUC＝0.619，P＝0.001)、锌(AUC＝0.887，P<0.001)。
同时我们评价了金属离子对于结直肠癌诊断的能力，Logistic回归模型筛选出的金属离子组合(砷、铬、铅、钛、钒、锰、锌)AUC为0.998，P<0.001。随机森林模型筛选出的金属离子组合(砷、铬、铅、钛、铁、锰、钒、锌)AUC为0.998，P<0.001。Lasoo回归模型筛选出的金属离子组合(砷、铬、铅、钛、铁、锶、钒、锌)AUC为0.998，P<0.001。三个统计模型共同筛选出的离子组合(砷、铬、铅、钛、钒、锌)AUC为0.998，P<0.001。四个金属组合都能有效地识别出结直肠癌患者(AUC>0.9)(表3)。
表3哈尔滨血浆中金属离子水平对结直肠癌的诊断效能评价
组合1：回归模型(砷、铬、铅、钛、钒、锰和锌)；组合2：随机森林模型(砷、铬、铅、钛、铁、锰、钒和锌)；组合3：Lasoo回归模型(砷、铬、铅、钛、铁、锶、钒和锌)；组合4：砷、铬、铅、钛、钒和锌。
4、贵阳血浆样本金属离子水平结直肠癌诊断学价值分析
通过图5可以发现六种金属离子在贵阳血浆样本中保持了良好的诊断效能(AUC＝0.654-0.938)，六个金属离子的AUC分别是：砷(AUC＝0.665，P＝0.007)、铬(AUC＝0.654，P＝0.011)、铅(AUC＝0.725，P<0.001)、钛(AUC＝0.747，P<0.001)、钒(AUC＝0.938，P<0.001)、锌(AUC＝0.883，P<0.001)。金属锌对结直肠癌的诊断在哈尔滨、以及贵阳两地区的血浆样本中均具有良好的效能。
同时评价金属离子组合对于结直肠癌诊断的能力(表4)，Logistic回归模型筛选出的金属离子组合(砷、铬、铅、钛、钒、锰、锌)AUC为0.967，P<0.001。随机森林模型筛选出的金属离子组合(砷、铬、铅、钛、铁、锰、钒、锌)AUC为0.971，P<0.001。Lasoo回归模型筛选出的金属离子组合(砷、铬、铅、钛、铁、锶、钒、锌)AUC为0.971，P<0.001。三个统计模型共同筛选出的离子组合(砷、铬、铅、钛、钒、锌)AUC为0.970，P<0.001。通过比较发现，统计模型筛选出的金属离子组合在贵阳血浆样本中同样具有良好的诊断效能。
表4贵阳血浆中金属离子水平对结直肠癌的诊断价值评价
组合1：回归模型(砷、铬、铅、钛、钒、锰和锌)；组合2：随机森林模型(砷、铬、铅、钛、铁、锰、钒和锌)；组合3：Lasoo回归模型(砷、铬、铅、钛、铁、锶、钒和锌)；组合4：砷、铬、铅、钛、钒和锌。
综上，多金属离子诊断组合(砷、铬、铅、钛、钒和锌)可用于人群结直肠癌的诊断，且具有良好的诊断效能，价格适中，检测速度快。
Claims (6)
1.一组用于诊断结直肠癌的多金属离子组合，其特征在于，所述的多金属离子组合由钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)六种金属离子组成。
2.权利要求1所述的用于诊断结直肠癌的多金属离子组合在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。
3.用于检测钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)的试剂或器械在制备结直肠癌诊断试剂或装置中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂或装置通过检测个体空腹静脉血中钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)的浓度来评价个体患有结直肠癌的风险。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的检测包括使用电感耦合等离子体质谱仪对个体空腹静脉血钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)的浓度进行检测，若在个体中测得的上述金属离子浓度与对照组人群血浆水平存在统计学显著差异，这说明该个体罹患结直肠癌的风险较大。
6.一种用于诊断结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有用于检测钛(Titanium，Ti)、铅(Lead，Pb)、钒(Vanadium，V)、铬(Chromium，Cr)和砷(Arsenic，AS)的试剂。
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