RS61406B1 - Poboljšane kompozicije t ćelija - Google Patents

Poboljšane kompozicije t ćelija

Info

Publication number
RS61406B1
RS61406B1 RS20210077A RSP20210077A RS61406B1 RS 61406 B1 RS61406 B1 RS 61406B1 RS 20210077 A RS20210077 A RS 20210077A RS P20210077 A RSP20210077 A RS P20210077A RS 61406 B1 RS61406 B1 RS 61406B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
cell
car
akt
pi3k
Prior art date
Application number
RS20210077A
Other languages
English (en)
Inventor
Kevin Friedman
Original Assignee
Bluebird Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54767459&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS61406(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bluebird Bio Inc filed Critical Bluebird Bio Inc
Publication of RS61406B1 publication Critical patent/RS61406B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/32—T-cell receptors [TCR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4214—Receptors for cytokines
    • A61K40/4215—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

Opis
OSNOVA
Oblast tehnike
[0001] Predmetni opis odnosi se na poboljšane kompozije T ćelija i postupke za proizvodnju T ćelija. Specifičnije, pronalazak se odnosi na postupke proizvodnje T ćelija koji rezultuje u adoptivnim T ćelijskim imunoterapijama sa poboljšanim preživljavanjem, ekspanzijom, i perzistencijom in vivo.
Opis srodne tehnike
[0002] Adoptivna imunoterapija je prenos T limfocita u subjekta za terapiju bolesti. Adoptivna imunoterapija ima još uvek nerealizovani potencijal za tretiranje veoma raznovrsnih bolesti uključujući kancer, infektivnu bolest, autoimunu bolest, inflamatornu bolest, i imunodeficijenciju. Međutim, većina, ako ne i sve strategije adoptivne imunoterapije zahtevaju korake aktivacije i ekspanzije T ćelija da bi stvorile klinički efikasnu, terapeutsku dozu T ćelija. Trenutne tehnologije za stvaranje terapeutskih doza T ćelija, uključujući konstruisane T ćelije, ostaju ograničene zahtevnim procesom proizvodnje T ćelija. Na primer, ekspanzija T ćelija često zahteva kloniranje koje zahteva puno rada i troškova, i/ili više rundi aktivacije/ekspanzije da bi se postigli terapeutski relevantni brojevi T ćelija. Dodatno, postojeći postupci aktivacije/ekspanzije T ćelija su normalno povezani sa značajnom diferencijacijom T ćelija i obično rezultuju u kratkotrajnim efektima, uključujući kratko preživljavanje i nedostatak perzistencije i nedostatak in vivo ekspanzije prenetih T ćelija. Stoga, postojeći postupci za proizvodnju T ćelija proizvode inferiorni T ćelijski proizvod koji je sklon iscrpljivanju i gubitku efektorne funkcije imune ćelije.
[0003] Do danas, klinička efikasnost stečenih imunoterapija sa konstruisanim T ćelijama je ograničena sa slabom ekspanzijom i perzistencijom T ćelija nakon infuzije u pacijente. Stoga, takve terapije nisu pogodne za široku kliničku upotrebu. Shodno tome, postoji stalna, neispunjena potreba za poboljšanjima u proizvodnji T ćelija i kompozicijama terapeutskih T ćelija koje preživljavaju, šire se, i opstaju in vivo.
KRATAK REZIME
[0004] U prvom apsektu pronalaska, obezbeđen je in vitro ili ex vivo postupak za proizvodnju T želija kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.
[0005] Predmetni opis generalno obezbeđuje imunoterapije adoptivnim T ćelijama koje sadrže perzistentne i potentne anti-tumorske T ćelijske kompozicije i postupke za stvaranje istih.
[0006] Predmetni opis odnosi se na poboljšanje kompozicije T ćelija i postupke za proizvodnju T ćelija. Specifičnije, pronalazak se odnosi na postupke proizvodnje T ćelija koji rezultuje u poboljšanom preživljavanju, ekspanziji, i perzistenciji in vivo.
[0007] Opisan je postupak za proizvodnju T ćelija koji sadrži: (a) izolovanje populacije T ćelija, npr., tumor infiltrirajućih citotoksičnih T limfocita (TIL), iz subjekta; (b) aktiviranje populacije T ćelija i stimulaciju populacije T ćelija da proliferišu, pri čemu koraci aktivacije i stimulacije su izvedeni u prisustvu inhibitora AKT/mTOR puta; (c) kultivisanje T ćelija da proliferišu; pri čemu koraci aktivacije i stimulacije izvedeni u prisustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta rezultuju u održavanju proliferacije T ćelija u poređenju sa proliferacijom T ćelija koje su bile aktivirane i stimulisane u odsustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta je obezbeđeno.
[0008] Opisan je postupak za proizvodnju T ćelija koji sadrži: (a) aktiviranje populacije T ćelija i stimulaciju populacije T ćelija da proliferišu, pri čemu koraci aktivacije i stimulacije su izvedeni u prisustvu inhibitora AKT/mTOR puta; (b) transdukciju T ćelija sa virusnim vektorom koji sadrži konstruisani T ćelijski receptor (TCR) ili himerni antigen receptor (CAR); (c) kultivisanje transdukovanih T ćelija da proliferišu; pri čemu koraci aktivacije i stimulacije izvedeni u prisustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta rezultuju u održavanju proliferacije transdukovanih T ćelija u poređenju sa proliferacijom transdukovanih T ćelija koje su aktivirane i stimulisane u odsustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta je obezbeđeno.
[0009] U specifičnim primerima izvođenja, postupci predviđeni ovde sadrže izolaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi kao izvora T ćelija.
[0010] U određenim primerima izvođenja, aktivacija T ćelija sadrži dovođenje u kontakt T ćelija sa anti-CD3 antitelom ili njegovim CD3-vezujući fragment.
[0011] U dodatnim primerima izvođenja, stimulacija T ćelija sadrži dovođenje u kontakt T ćelija sa anti-CD28 antitelom ili njegovim CD28-vezujućim fragmentom, njegovim B7-1 ili CD28-vezujućim fragmentom, ili njegovim B7-2 ili CD28-vezujućim fragmentom.
[0012] U nekim primerima izvođenja, ćelije su transdukovane sa virusnim vektorom pre proliferacije T ćelija.
[0013] U određenim primerima izvođenja, ćelije su transdukovane sa virusnim vektorom nakon proliferacije T ćelija.
[0014] U specifičnim primerima izvođenja, vektor je retrovirusni vektor.
[0015] U dodatnim primerima izvođenja, vektor je lentivirusni vektor.
[0016] U drugim specifičnim primerima izvođenja, ćelije sadrže himerni antigen receptor (CAR).
[0017] U specifičnim primerima izvođenja, CAR sadrži: ekstracelularni domen koji vezuje antigen izabran iz grupe koja se sastoji od: alfa folat receptor, 5T4, ανβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, CMV, EBV, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnini AchR, FRα, GD2, GD3, glipikan- 3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NYESO- 1, HLA-A3+NY-ESO-1, HPV, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D ligandi, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, i VEGFR2; transmembranski domen izveden iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8α; CD4, CD28, CD45, PD-1, i CD152; jedan ili više intracelularni kostimulirajući signalni domeni izabrani iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PDL2), CD274 (PD-L1), i CD278 (ICOS); i CD3ζ signalni domen.
[0018] U dodatnim primerima izvođenja, ekstracelularni domen sadrži antitelo ili antigen vezujući fragment koji vezuje antigen.
[0019] U određenim primerima izvođenja, transmembranski domen je izveden iz CD8α ili CD28.
[0020] U dodatnim primerima izvođenja, jedan ili više kostimulatornih signalnih domena izabran je iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD134, i CD137.
[0021] U dodatnim primerima izvođenja, CAR sadrži polipeptid zglobnog regiona.
[0022] U specifičnim primerima izvođenja, polipeptid zglobnog regiona sadrži zglobni region od IgG1 ili CD8α.
[0023] U specifičnim primerima izvođenja, CAR sadrži signalni peptid.
[0024] U nekim primerima izvođenja, signalni peptid sadrži signalni peptid IgG1 teškog lanca ili CD8α signalni polipeptid.
[0025] U nekim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je izabran iz grupe koja se sastoji od: BEZ235, LY294002, GDC-0941, BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, IPI-145, MK-2206, GSK690693, GDC-0068, A-674563, CCT128930, AZD8055, INK128, rapamicin, PF- 04691502, everolimus, BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK, AT7867, NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75, ZSTK474, i PP-121.
[0026] U specifičnim primerima izvođenja, PI3K inhibitor je pan-PI3K inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: BEZ235, LY294002, i GDC-0941.
[0027] U drugim specifičnim primerima izvođenja, PI3K inhibitor je selektivni PI3K inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji do: BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, i IPI-145.
[0028] U drugim specifičnim primerima izvođenja, PI3K inhibitor je ZSTK474.
[0029] U primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je pan-AKT inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: MK-2206, GSK690693, i GDC-0068.
[0030] U dodatnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je selektivni AKT1 inhibitor A-674563.
[0031] U određenim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je selektivni AKT2 inhibitor CCT128930.
[0032] U određenim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta inhibira DNK-PK aktivaciju AKT.
[0033] U dodatnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta inhibira PDK-1 aktivaciju AKT.
[0034] U specifičnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta inhibira mTORC2 aktivaciju AKT.
[0035] U dodatnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta inhibira HSP aktivaciju AKT.
[0036] U drugim određenim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je pan-mTOR inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: AZD8055, INK128, i rapamicin.
[0037] U određenim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je selektivni mTORC1 inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: PF-04691502 i everolimus.
[0038] U određenim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je inhibitor s6 kinaze izabran iz grupe koja se sastoji od: BI-D1870, H89, PF- 4708671, FMK, i AT7867.
[0039] U određenim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je DNK-PK inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75, i PP-121.
[0040] U nekim primerima izvođenja, populacija T ćelija aktiviranih i stimulisanih u prisustvu PI3K inhibitora imaju povećan broj T ćelija koje eksprimiraju jedan ili više markera izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127 u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i stimulisanih u odsustvu PI3K inhibitora.
[0041] U dodatnim primerima izvođenja, populacija T ćelija aktiviranih i stimulisanih u prisustvu PI3K inhibitora ne eksprimira CD57 ili KLRG1 ili eksprimira manje CD57 ili KLRG1 u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i stimulisanih u odsustvu PI3K inhibitora.
[0042] Ovde je opisan postupak za održavanje proliferacije i smanjenje diferencijacije restimulisanih T ćelija koje eksprimiraju konstruisani TCR ili CAR koji sadrži: (a) dovođenje cele ili dela populacije proliferisanih T ćelija koje sadrže konstruisani TCR ili CAR sa anti-CD3 antitelom ili njihovim CD3-vezujućim fragmentom, i anti-CD28 antitelom ili njegovim CD28-vezujućim fragmentom, što stimuliše CD28 pomoćni molekul na površini T ćelija, čime se restimulišu aktivirane T ćelije da proliferišu; pri čemu su restimulisane T ćelije održale proliferaciju i smanjenu diferencijaciju u poređenju sa proliferacijom T ćelija koje su stimulisane ili restimulisane u odsustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta je obezbeđeno.
[0043] U specifičnim primerima, ćelije sadrže konstruisani TCR.
[0044] U određenim primerima, ćelije sadrže CAR.
[0045] U drugim specifičnim primerima, ćelije sadrže virusni vektor koji kodira konstruisani TCR ili CAR.
[0046] U dodatnim primerima, vektor je retrovirusni vektor.
[0047] U dodatnim primerima, vektor je lentivirusni vektor.
[0048] U specifičnim primerima, CAR sadrži: ekstracelularni domen koji vezuje antigen izbarna iz grupe koja se sastoji od: alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, ’Glipikan-3 (GPC3), HLAA1+ MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLAA1+ NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO- 1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D Ligandi, NY-ESO- 1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, i VEGFR2; transmembranski domen izveden iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8α; CD4, CD28, CD45, PD-1, i CD152; jednog ili više intracelularnih kostimulatornih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), i CD278 (ICOS); i CD3ζ signalnog domena.
[0049] U nekim primerima, ekstracelularni domen sadrži antitelo ili antigen vezujući fragment koji vezuje antigen.
[0050] U određenim primerima, transmembranski domen je izveden iz CD8α ili CD28.
[0051] U dodatnim primerima, jedan ili više kostimulatornih signalnih domena su izabrani iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD134, i CD137.
[0052] U specifičnim primerima, CAR sadrži zglobni region polipeptida.
[0053] U dodatnim primerima, zglobni region polipeptida sadrži zglobni region IgG1 ili CD8α.
[0054] U dodatnim primerima, CAR sadrži signalni peptid.
[0055] U drugim specifičnim primerima, signalni peptid sadrži signalni polipeptid IgG1 teškog lanca ili CD8α signalni polipeptid.
[0056] U specifičnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je izabran iz grupe koja se sastoji od: BEZ235, LY294002, GDC-0941, BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, IPI-145, MK-2206, GSK690693, GDC-0068, A-674563, CCT128930, AZD8055, INK128, rapamicin, PF- 04691502, everolimus, BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK, AT7867, NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75, ZSTK474, i PP-121.
[0057] U dodatnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je pan-PI3K inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: BEZ235, LY294002, i GDC-0941.
[0058] U drugim specifičnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je selektivni PI3K inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, i IPI- 145.
[0059] U drugim specifičnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR putta je PI3K inhibitor ZSTK474.
[0060] U određenim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je pan-AKT inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: MK-2206, GSK690693, i GDC-0068.
[0061] U specifičnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je seletivni AKT1 inhibitor A-674563.
[0062] U dodatnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je selektivni AKT2 inhibitor CCT128930.
[0063] U nekim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta inhibira DNK-PK aktivaciju AKT.
[0064] U specifičnim primerima, PI3K/AKT/mTOR puta inhibira PDK-1 aktivaciju AKT.
[0065] U određenim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta inhibira mTORC2 aktivaciju AKT.
[0066] U specifičnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta inhibira HSP aktivaciju AKT.
[0067] U dodatnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je pan-mTOR inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: AZD8055, INK128, i rapamicin.
[0068] U dodatnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je selektivni mTORC1 inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: PF-04691502 i everolimus.
[0069] U nekim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je s6 kinase inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: BI-D1870, H89, PF- 4708671, FMK, i AT7867.
[0070] U drugim specifičnim primerima, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je DNK-PK inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75, i PP-121.
[0071] U specifičnim primerima, populacija aktiviranih T ćelija restimulisanih u prisustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta ima povećan broj T ćelija koje eksprimiraju jedan ili više markera izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127 u poređenju sa populacijom T ćelija kativiranih i stimulisanih u odsustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta.
[0072] U dodatnim primerima, populacija aktiviranih T ćelija restimulisanih u prisustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta ne eksprimira CD57 ili KLRG1 ili eksprimira manje CD57 ili KLRG1 u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i stimulisanih u odsustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta.
[0073] U različitim primerima, obezbeđena je populacija T ćelija koja sadrži vektor koji sadrži konstruisani TCR ili CAR, pri čemu su ćelije aktivirane i stimuklisane da proliferišu u prisustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta.
[0074] U različitim specifičnim primerima, obezbeđena je populacija T ćelija koje sadrže vektor koji sadrži konstruisani TCR ili CAR, pri čemu su ćelije aktivirane i stimulisane da proliferišu u prisustvu inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta i restimulisane su dovođenjem u kontakt ćele ili dela populacije proliferisanih imunih efektornih ćelija sa anti-CD3 antitelom ili njegovim CD3-vezujućim fragmentom, i anti-CD28 antitelom ili njegovim CD28-vezujućim fragmentom, koji stimuliše CD28 pomoćni molekul na površini imunih efektornih ćelija.
[0075] U određenim primerima, imune efektorne ćelije sadrže T ćelije.
[0076] U jednom primeru, imune efektorne ćelije su TILs.
[0077] U različitim primerima, obezbeđena je kompozicija koja sadrži populaciju imunih efektornih ćelija predviđenih ovde ifiziološki prihvatljiv ekscipijent.
[0078] U različitim određenim primerima, obezbeđen je postupak za tretiranje kancera kod subjekta kome je do potrebno, koji sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine kompozicije T ćelija predviđenih ovde.
[0079] U specifičnim primerima, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od Wilms-ovog tumora, Ewing-ovog sarkoma, neuroendokrinog tumora, glioblastoma, neuroblastoma, melanoma, kancera kože, kancera dojke, kancera debelog creva, kancera rektuma, kancera prostate, kancera jetre, kancera bubrega, kancera pankreasa, kancera pluća, kancera žuči, kancera grlića materice, kancera endometrijuma, kancera jednjaka, kancera želudca, kancera glave i vrata, medularnog tiroidnog kancera, kancera jajnika, glioma, limfoma, leukemije, mijeloma, akutne limfoblastne leukemije, akutne mijelogene leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične mijelogene leukemije, Hodgkin-ovog limfoma, ne-Hodgkin-ovog limfoma, i kancera mokraćne bešike.
[0080] U jednom primeru, kancer je povezan sa ili izazvan virusnom infekcijom, npr., infekcijom sa CMV, HPV, ili EBV.
[0081] U dodatnim primerima, kancer je kancer pankreasa i ekstracelularni vezujući domen vezuje epitop PSCA ili MUC1
[0082] U nekim primerima, kancer je kancer bešike i ekstracelulrni vezujući domen vezuje epitop PSCA ili MUC1
[0083] U dodatnim primerima, kancer je glioblastoma multiforme i ekstracelularni vezujući domen vezuje epitop EPHA2, EGFRvIII, ili CSPG4.
[0084] U specifičnim primerima, kancer je kancer pluća i ekstracelulrni vezujući domen vezuje epitop PSCA ili GD2.
[0085] U određenim primerima, kancer je kancer dojke i ekstracelularni vezujući domen vezuje epitop CSPG4 ili HER2.
[0086] U dodatnim primerima, kancer je melanom i ekstracelularni vezujući domen vezuje epitop CSPG4 ili GD2.
[0087] U specifičnim primerima, kancer je B-ćelijski malignitet i vezujući domen vezuje epitop of BCMA.
[0088] U različitim primerima, obezbeđen je postupk tretiranja hematološkog maligniteta kod subjekta kome je do potrebno, sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine T ćelijske kompozicije predviđene ovde.
[0089] U određenim primerima, hematološki malignitet je B-ćelijski malignitet izabran iz grupe koja se sastoji od: multiplog mijeloma (MM), hronične limfocitne leukemije (CLL), ili ne-Hodgkin-ovog limfoma (NHL).
[0090] U specifičnim primerima, MM je izabran iz grupe koja se sastoji od: očigledni multipli mijelom, tinjajući multipli mijelom, leukemija plazma ćelija, ne-sekretorni mijelom, IgD mijelom, osteosklerotični mijelom, solitarni plazmacitom kosti, i ekstramedularni plazmacitom.
[0091] U određenim primerima, NHL je izabran iz grupe koja se sastoji od: Burkitt-ovog limfoma, hronične limfocitne leukemije/malog limfocitnog limfoma (CLL/SLL), difuznog krupnoćelijskog B-ćelijskog limfoma, folikularnog limfoma, imunoblastnog hrupnoćelijsog limfoma, prekursora B-limfoblastnog limfoma, i limfoma mantle ćelija.
KRATAK OPIS NEKOLIKO ASPEKATA SLIKA
[0092]
Slika 1 prikazuje reprezentativni primer održavanja proliferacije T ćelija kod T ćelija tretiranih sa AKT inhibitorom. T ćelije su kultivisane sa različitim koncentracijama AKT inhibitora, MK-22067 do sedam dana. Krajnje desni paneli pokazuju procenat podeljenih T ćelija iz T ćelijskih kultura iniciranih iz šest normalnih donorskih PBMC uzoraka. Svaki simbol u krajnje desnom panelu predstavlja jedinstvenu kulturu urađenu paralelno sa titrovanom MK-2206 dozom. Krajnje levi paneli prikazuju reprezentativni primer iz ovih eksperimenata. A) Nakon tri dana kulture sa MK-2206, prolifracija T ćelija je bila samo neznatno smanjena u poređenju sa kontrolom bez tretmana. B) Nakon 7 dana kulture sa MK-2206, proliferacija T ćelija nije bila značajno različita u poređenju sa kontrolom bez tretmana.
Slika 2 prikazuje reprezentativni primer CD62L ekspresije T ćelija tretiranih sa AKT inhibitorom. T ćelije su kultivisane sa različitim koncentracijama AKT inhibitora, MK-22067 do sedam dana. Kranje desni panel prikazuje procenat CD62L eksprimirajućih T ćelija iz T ćelijskih kultura iniciranih iz šest normalnih donorskih PBMC uzoraka. Svaki simbol u krajnje desnom panelu predstavlja jedinstvenu kulturu urađenu paralelno sa titriranom MK-2206 dozom. Krajnje levi paneli prikazuju reprezentativni primer iz ovih eksperimenata. A) Nakon tri dana kulture sa MK-2206, CD62L ekspresija na MK-2206 tretiranim T ćelijama nije bila značajno različita u poređenju sa kontrolom bez tretmana. B) Nakon 7 dana kulture, MK-2206 tretirane T ćelije pokazale su značajno više nivoe CD62L ekspresije u poređenju sa kontrolom bez tretmana.
Slika 3 prikazuje ekspresiju CD62L na anti- BCMA CAR T ćelijama procenjenu sa protočnom citometrijom na kraju kulture sa MK-2206, TCN, ili ZSTK474. MK-2206 i
1
ZSTK474 imale su značajno višu CD62L ekspresiju u poređenju sa CAR T ćelijskim kulturama tretiranim sa samo IL-2 ili sa TCN.
Slika 4 prikazuje srednje vrednosti zapremine tumora multiplih mijeloma kod miševa tretiranih sa anti-BCMA CAR T ćelijama kultivisanim sa IL-2, IL-7 i IL-15, MK- 2206, ZST747, ili TCN. Anti-BCMA CAR T ćelije kultivisane sa IL-7 i IL-15, MK-2206, ili ZST747 pokazivale su slične nivoe anti-tumorske aktivnosti u poređenju sa anti-BCMA CAR T ćelijama kultivisanim sa standardnim IL-2. Anti-BCMA CAR T ćelije kultivisane sa TCN nisu prikazivale anti-tumorski odgovor.
Slika 5 prikazuje anti-tumorsku aktivnost anti-BCMA CAR T ćelija tretiranih sa IL-2, IL-7/15, MK-2206, TCN, ili ZSTK474 modelu Daudi tumora. Na napredovanje Daudi tumora nije uticao tretman sa IL-2- ili IL7/15-kultivisanim anti-BCMA CAR T ćelijama. Anti-BCMA CAR T ćelije kultivisane ili sa MK-2206 ili sa ZST474 izazavale su kompletnu regresiju tumora.
Slika 6 prikazuje perzistenciju ZSTK474-kultivisanih anti-BCMA CAR T ćelija kod životinja tretiranih sa IL- 2-, MK-2206-, ili ZSTK474-kultivisanim anti-BCMA CAR T ćelijama koje su kompletno regresirale 100mm<3>RPMI- 8226 tumora. Životinje su ponovo provocirane 13 dana kasnije sa RPMI-8226 na suprotnom boku. Životinje tretirane sa IL-2 kultivisanim CAR T ćelijam nisu bile sposobne da spreče rast tumora. Nijedna od životinja tretiranih sa ZSTK474-kultivisanim anti-BCMA CAR T ćelijma nije imala dokaze o graftu tumora.
DETALJAN OPIS
A. Pregled
[0093] Pronalazak se generalno odnosi na poboljšane postupke za proizvodnju kompozicija T ćelija. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, inventivni postupci predviđeni ovde razdvajaju T ćelijsku proliferaciju od diferencijacije da bi se proizvele T ćelije sa superiornim osobinama, npr., povećanim preživljavanjem, ekspanzijom, i perzistencijom in vivo zajedno sa istovremenim smanjenjem diferenciacije, u poređenju sa postojećim T ćelijskim kompozicijama u tehnici. Shodno tome, T ćelijske kompozicije predviđene ovde sadrže potentne T ćelije, koje imaju karakteristike mladih ili naivinh T ćelijskih populacija, koje su sposobne za više rundi ekspanzije sa malo diferencijacije. Dodatno, ćelije u ekspanziji su sposobne da se nakon toga diferenciraju i obezbede funkcije imunih efektorskih ćelija.
[0094] U različlitim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za proizvodnju T ćelija koji održava ili minimalno smanjuje proliferaciju T ćelija i redukuje, smanjuje, ili ublažava T ćelijsku diferencijaciju tokom T ćelijske ekspanzije. U određenim poželjnim primerima izvođenja, kompozicija konstruisanih T ćelija je proizvedena postupcima koji su ovde predviđeni, koji mogu dodatno povećati efiaksnost adoptivne T ćelijske imunoterapije. Proizvedene kompozicije T ćelija predviđene ovde su korisne u tretmanu ili prevenciji brojnih stanja uključujući, ali se ne ograničavajući na kancer, infektivnu bolest, autoimunu bolest, inflamatornu bolest, i imunodeficijenciju. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, pronalazači predmetnog pronalaska su iznenađujuće i neočekivano otkrili da modulacija puteva ćelijske signalizacije u T ćelijama, pri čemu su putevi normalno povezani sa proliferacijom kod ćelija kancera, rezultuje u značajnom održavanju ili nevažnom smanjenju T ćelijske proliferacije i smanjenju diferencijacije T ćelija tokom ekspanzije T ćelija u poređenju sa T ćelijama gde putevi želijske signalizacije nisu modulirani.
[0095] U jednom primeru, postupak proizvodnje konstruisanih T ćelija sadrži dovođenje u kontakt T ćelija sa sredstvom koje inhibira PI3K/AKT/mTOR put u ćelijama. Ćelije mogu biti dovedene u kontakt pre, tokom, i/ili nakon aktivacije i ekspanzije. Kompozicije konstruisanih T ćelija zadržavaju dovoljnu T ćelijsku potenciju tako da mogu podleći više rundi ekspanzije bez značajnog povećanja u diferencijaciji.
[0096] Shodno tome, postupci i kompozicije predviđene ovde predstavljaju kvantno poboljšanje u poređenju sa postojećim imunoterapijama sa usvojenim ćelijama.
[0097] U izvođenju pronalaska koristiće se, ukoliko specifično nije napomenuto drugačije, konvencionalni metodi hemije, biohemije, organske hemije, molekularne biologije, mikrobiologije, tehnika rekombinantne DNK, genetike, imunologije i ćelijske biologije, koji su u okvirima osposobljenosti stručnjaka u oblasti, a mnogi od njih su detaljno opisani u nastavku teksta, u svrhu ilustracije. Takve tehnike u potpunosti su objašnjene u literaturi. Vidi, npr., Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley i Sons, obnovljeno jula 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods od Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates i Wiley-Interscience; Glover, DNK Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription i Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide do Molecular Cloning (1984); Harlow i Lane, Antitela, (ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach i W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; kao i monografije u žurnalima kao što je Advances in Immunology.
B. Definicije
[0098] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju značenje koje uobičajeno prepoznaju prosečno obučeni stručnjaci u oblasti kojoj pronalazak pripada. Iako se postupci i materijali slični ili ekvivalentni opisanim u ovom tekstu mogu koristiti u izvođenju ili testiranju predmetnog pronalaska, poželjni primeri izvođenja kompozicija, postupaka i materijala opisani su u ovom tekstu. Za potrebe predmetnog pronalaska, u nastavku su definisani izrazi koji slede.
[0099] Izrazi upotrebljeni u ovom tekstu koriste se da označe jedan ili više od jednog (tj., najmanje jedan ili jedan do više) gramatičkih objekata teksta. Na primer, "element" znači jedan element ili više od jednog elementa.
[0100] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "oko" ili "približno" odnosi se na količinu, nivo, vrednost, broj, frekvenciju, procenat, dimenziju, veličinu, iznos, težinu ili dužinu koja varira za 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili 1% u odnosu na referentnu količinu, nivo, vrednost, broj, frekvenciju, procenat, dimenziju, veličinu, iznos, težinu ili dužinu. U posebnim primerima izvođenja, izrazi "oko" ili "približno" kada prethode numeričkoj vrednosti označavaju vrednost plus ili minus u opsegu od 15%, 10%, 5%, ili 1%.
[0101] Kao što je ovde korišćeno, terminin "značajno" odnosi se na količinu, nivo, vrednost, broj, učestalost, procenat, dimenziju, veličinu, količinu, težinu ili dužinu koja je 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veća od referentne količine, nivoa, vrednosti, broja, učestalosti, procenta, dimenzije, veličine, količine, težine ili dužine. U jednom primeru izvođenja, "suštinski isto" odnosi se na količinu, nivo, vrednost, broj, učestalost, procenat, dimenziju, veličinu, količinu, težinu ili dužinu koja proizvodi efekat, npr., fiziološki efekat, koji je približno isti kao referentna količina, nivo, vrednost, broj, učestalost, procenat, dimenzija, veličina, količina, težina ili dužina.
[0102] U ovoj specifikaciji, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reči "sadržati", "sadrži" i "koji sadrži" podrazumevaju uključivanje navedenog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata, a ne isključivanje nekog drugog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata. Pod "sastoji se od" misli se na "sadrži" i "ograničava se na", zavisno od onoga što sledi posle izraza "sastoji se od". Prema tome, izraz "sastoji se od" ukazuje na do da su navedeni elementi
1
neophodni ili obavezni i da nema prisutnih drugih elemenata. Pod "sastoji se suštinski od" misli se na uključenost svakog od elemenata navedenih posle izraza i ograničava se na druge elemente koji ne interferiraju ili ne doprinose aktivnosti ili dejstvu specifikovanim u objavi za navedene elemente. Prema tome, izraz "sastoji se suštinski od" ukazuje na do da su navedeni elementi neophodni ili obavezni, ali da nikakvi drugi elementi nisu izborni i mogu ili ne moraju biti prisutni u zavisnosti od toga fa li utiču na aktivnost ili dejstvo navedenih elemenata.
[0103] U ovoj specifikaciji, upućivanje na "jedan primer izvođenja", "primer izvođenja", "poseban primer izvođenja", "srodan primer izvođenja", "određeni primer izvođenja", "dodatni primer izvođenja" ili "još jedan primer izvođenja" ili njihove kombinacije znače da su određena osobina, struktura ili karakteristika opisane u vezi sa primerom izvođenja uključene u najmanje jedan primer izvođenja predmetnog pronalaska. Prema tome, pojavljivanje gornjih izraza na različitim mestima u ovoj specifikaciji ne mora se odnositi na isti primer izvođenja. Pored toga, određene osobine, strukture, ili karakteristike mogu biti kombinovane na bilo koji pogodan način u jednom ili više primera izvođenja. Isto tako, podrazumeva se da pozitivno navođenje osobine u jednom primeru izvođenja služi kao osnov za isključivanje osobine u određenom primeru izvođenja.
[0104] Kao što je ovde korišćeno, termini "proizvodnja T ćelija" ili "postupci za proizvodnju T ćelija ili uporedivi termini odnose se na proces proizvodnje terapeutske kompozicije T ćelija, pri čemu postupci proizvodnje mogu sadržati jedan ili više od, ili sve od sledećih koraka: sakupljanje, stimulaciju, aktivaciju, i ekspanziju.
[0105] Termini "T ćelija" ili "T limfocit" su prepoznati u tehnici i namera je da uključe timocite, naivne T limfocite, nezrele T limfocite, zrele T limfocite, mirujuće T limfocite, ili aktivirane T limfocite. T ćelija može biti T helper (Th) ćelija, na primer T helper 1 (Th1) ili T helper 2 (Th2) ćelija. T ćelija može biti helper T ćelija (HTL; CD4+ T ćelija) CD4+ T ćelija, citotoksična T ćelija (CTL; CD8+ T ćelija), tumor infiltrirajuća citotoksična T ćelija (TIL; CD8+ T ćelija), CD4+CD8+ T ćelija, CD4- CD8- T ćelija, ili bilo koji drugi subset T ćelija. Druge ilustrativne populacije T ćelija pogodne za upotrebu u specifičnim primerima izvođenja uključuju naivne T ćelije i memorijske T ćelije.
[0106] "Potentne T ćelije," i "mlade T ćelije," su korišćene naizmenično u specifičnim primerima izvođenja i odnose se na fenotipove T ćelija u kojima je T ćelija sposobna za proliferaciju i istovremeno smanjenje diferencijacije. U specifičnim primerima izvođenja, mlada T ćelija ima fenotip "naivne T ćelije." U različitim primerima izvođenja, postupci proizvodnje predviđeni ovde proizvode mlade T ćelije; ćelije u kojima je proliferacija T ćelija razdvojena od diferencijacije T ćelija tokom stimulacije, aktivacije i ekspanzije T ćelija. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, predviđene potentne T ćelije proizvedene sa kompozicijama i postupcima poseduju veću antitumorsku efikasnost nakon usvojenog transfera. U specifičnim primerima izvođenja, mlade T ćelije sadrže jedan ili više od, ili sve sledeće biološke markere: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127. U jednom primeru izvođenja, mlade T ćelije sadrže jedan ili više od, ili sve sledeće biološke markere: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127 i nemaju ekspresiju CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3, i LAG3.
[0107] Kao što je ovde korišćeno, termin "proliferacija" odnosi se na povećanje deobe ćelija, ili simetričnu ili asimetričnu deobu ćelija. U specifičnim primerima izvođenja, "proliferacija" se odnosi na simetričnu ili asimetričnu deobu T ćelija. "Povećana proliferacija" se javlja tamo gde postoji povećanje broja ćelije u tretiranom uzorku u poređenju sa ćelijama u netretiranom uzorku.
[0108] Kao što je ovde korišćeno, termin "diferencijacija" odnosi se na postupak za smanjenje potencije ili proliferacije ćelija ili pomeranje ćelija u razvojno restriktivnije stanje. U specifičnim primerima izvođenja, diferencirane T ćelije stiču funkcije imune efektorne ćelije.
[0109] "Imuna efektorna ćelija," je bilo koja ćelija imunog sistema koja ima jednu ili više efektornih funkcija (npr., aktivnost ubijanja citotoksične ćelije, sekrecija citokina, indukcija ADCC i/ili CDC). Ilustrativne imune efktorne ćelije predviđene ovde su T limfociti, naročito citotoksične T ćelije (CTLs; CD8+ T ćelije), TILs, i helper T ćelije (HTLs; CD4+ T ćelije).
[0110] "Modifikovane T ćelije" odnose se na T ćelije koje su modifikovane introdukcijom polinukleotida koji kodira konstruisani TCR ili CAR predviđen ovde. Modifikovane T ćelije uključuju i genetičke i ne-genetičke modifikacije (npr., epizomalne ili ekstrahromozomske).
[0111] Kao što je ovde korišćeno, termin "genetički konstruisan" ili "genetički modifikovan" odnosi se na dodavanje dodatnog genetičkog materijala u obliku DNK ili RNK u ukupni genetički materijal u ćeliji.
[0112] Termini, "genetički modifikovane ćelije," "modifikovane ć elije," i, "preusmerene ćelije," su korišćeni naizmenično.
[0113] Kao što je ovde korišćeno, termin "genska terapija" odnosi se na introdukciju dodatnog genetičkog materijala u obliku DNK ili RNK u ukupni genetički materijal u ćeliji koji obnavlja, ispravlja, ili modifikuje ekspresiju gena, ili u svrhu ekspresije terapeutskog polipeptida, npr., TCR ili CAR i/ili jednog ili više citokina. U specifičnim primerima izvođenja, T ćelije su modifikovane da eksprimiraju konstruisani TCR ili CAR bez modifikovanja genoma ćelija, npr., introdukcijom epizomalnog vektora koji eksprimira TCR
1
ili CAR u ćeliju.
[0114] Termin "ex vivo" generalno se odnosi na aktivnosti koje se odigravaju van organizma, kao što su eksperimenti ili merenja urađena u ili na živom tkivu u veštačkoj sredini van organizma, poželjno sa minimalnom izmenom prirodnih uslova. U specifičnim primerima izvođenja, "ex vivo" procedure uključuju žive ćelije ili tkiva uzeta iz organizma i kultivisana ili modulirana u laboratorijskom aparatu, obično pod sterilnim uslovima, i tipično nekoliko časova ili do oko 24 časa, ali uključujući do 48 ili 72 časova, u zavisnosti od okolnosti. U određenim primerima izvođenja, takva tkiva ili ćelije mogu se sakupiti i zamrznuti, i kasnije odmrznuti za ex vivo tretman. Eksperimenti ili procedure sa kulturom tkiva koje traju duže od nekoliko dana korišćenjem živih ćelija ili tikva tipično se smatraju da su "in vitro," iako u određenim primerima izvođenja, ovaj termin može biti korišćen naizmenično sa ex vivo.
[0115] Termin "in vivo" generalno se odnosi na aktivnosti koje se odigravaju u organizimu, kao što je samoobnavljanje ćelije i ekspanzija ćelije. U jednom primeru, termin "in vivo ekspanzija" odnosi se na sposobnost populacije ćelija da povećaju broj in vivo.
[0116] Termin "stimulacija" odnosi se na primarni odgovor indukovan vezivanjem stimulatornog molekula (npr., TCR/CD3 kompleksa) sa njegovim srodnim ligandom čime se posreduje događaj prenosa signala uključujući, ali se ne ograničavajući na, prenos signala preko TCR/CD3 kompleksa.
[0117] "Stimulatorni molekul," se odnosi na molekul na T ćeliji koji se specifično vezuje sa srodnim stimulatornim ligandom.
[0118] "Stimulatorni ligand," kao što je ovde korišćeno, označava ligand koji kada je prisutan na antigen prikazujućoj ćeliji (npr., aAPC, denditskoj ćeliji, B-ćeliji, i slično) može se specifično vezati sa srodnim vezujućim partnerom (ovde označenim kao "stimulatorni molekiul") na T ćeliji, čime se posreduje u primarnom odgovoru od strane T ćelije, uključujući, ali se ne ograničavajući na, aktivaciju, inicijaciju imunog odgovora, proliferaciju, i slično. Stimulatorni ligandi uključuju, ali nisu ograničeni na CD3 ligande, npr., anti- CD3 antitelo i CD2 ligandi, npr., anti-CD2 antitelo, i peptidi, npr., CMV, HPV, EBV peptidi.
[0119] Termin, "aktivacija" odnosi se na stanje T ćelije koja je dovoljno stimulisana da indukuje detektabilnu proliferaciju ćelija. U specifičnim primerima izvođenja, aktivacija može takođe biti povezana sa indukovanom proizvodnjom citokina, i detektabilnim efektornim funkcijama. Termin "aktivirane T ćelije" odnosi se, između ostalog na, T ćelije koje proliferišu. Signali generisani preko samog TCR su nedovljni za potpunu aktivaciju T ćelija i takođe su neophodni jedan ili više sekundarnih ili kostimulatornih signala. Stoga, aktivacija T ćelija sadrži primarni stimulacioni signal preko TCR/CD3 kompleksa i jedan ili više
1
sekundarnih kostimulatornih signala. Kostimulacija može biti dokazna proliferacijom i/ili proizvodnjom citokina od strane T ćelija koje su primile primarni aktivacioni signal, kao što je stimulacija preko CD3/TCR kompleksa ili preko CD2.
[0120] "Kostimulatorni signal," odnosi se na signal, koji u kombinaciji sa primarnim signalom, kao što je TCR/CD3 ligacija, dovodi do proliferacije T ćelija, proizvodnje citokina, i/ili ushodnu regulaciju ili nishodnu regulaciju određenih molekula (npr., CD28).
[0121] "Kostimulatorni ligand," odnosi se na molekul koji vezuje kostimulatorni molekul. Kostimulatorni ligand može biti rastvorljiv ili obezbeđen na površini. "Kostimulatorni molekul" se odnosi na srodni vezujući partner na T ćeliji koji se specifično vezuje sa kostimulatornim ligandom (npr., anti-CD28 antitelom).
[0122] "Autologne," kao što je ovde korišćeno, odnosi se na ćelije iz istog subjekta.
[0123] "Alogene," kao što je ovde korišćeno, odnosi se na ćelije iste vrste koje se genetički razlikuju u odnosu na ćeliju sa kojom se upoređuju.
[0124] "Singene," kao što je ovde korišćeno, odnosi se na ćelije različitog subjekta koje su genetički identične ćeliji sa kojom se upoređuju.
[0125] "Ksenogene," kao što je ovde korišćeno, odnosi se na ćelije različitih vrsta u odnosu na ćeliju sa kojom se upoređuju. U poželjnim primerima izvođenja, ćelije prema pronalasku su alogene.
[0126] Kao što je ovde korišćeno, termini "individua" i "subjekt" se često koriste naizmenično i odnose se na bilo koju životinju koja pokazuje simptom kancera koji se može tretirati sa vektorima genske terapije, terapeuticima zasnovanim na ćeliji, i postupcima opisanim ovde na drugim mestima. Pogodni subjekti (npr., pacijenti) uključuju laboratorijske životinje (kao što je miš, pacov, zec, ili zamorac), stoku, i domaće životinje ili kućne ljubimce (kao što je mačka ili pas). Ne-humani primati i, poželjno, humani pacijenti, su uključeni. Tipični subjekti uključuju humane pacijente koji imaju kancer, dijagnostifikovani su sa kancerom, ili su u riziku od dobijanja kancera.
[0127] Kao što je ovde korišćeno, termin "pacijent" odnosi se na subjekta koji je dijagnostifikovan sa određenom indikacijom koji se može tretirati sa vektorima genske terapije, terapeuticima zasnovanim na ćeliji, i postupcima opisanim ovde na drugim mestima.
[0128] Kao što je ovde korišćeno "tretman" ili "tretiranje," uključuje bilo koji korisni ili poželjni efekat na simptome ili patologiju bolesti ili patološko stanje, i sadrži čak minimalna smanjenja u jednom ili više merljivih markera bolesti ili stanja koje se tretira, npr., kancera. Tretman sadrži izborno ili smanjenje ili ublažavanje simptoma bolesti ili stanja, ili odlaganje napredovanja bolesti ili stanja. "Tretman" ne ukazuje neophodno na potpuno iskorenjivanje ili
1
izlečenje bolesti ili stanja, ili njenih povezanih simptoma.
[0129] Kao što je ovde korišćeno, "sprečiti," i slične reči kao što su "sprečeno," "prevencija" itd., označavaju pristup za sprečavanje, inhibiranje, ili smanjenje verovatnoće pojave ili ponovne pojave, bolesti ili stanja, npr., kancera. On se takođe odnosi na odlaganje početka ili ponovne pojave bolesti ili stanja ili odlaganje pojave ili ponovne pojave simptoma bolesti ili stanja. Kao što je ovde korišćeno, "prevencija" i slične reči takođe uključuju smanjenje intenziteta, efekata, simptoma i/ili opterećenja bolešću ili stanjem pre početka ili ponovne pojave bolesti ili stanja.
[0130] Kao što je ovde korišćeno, termin "količina" odnosi se na "efikasnu količinu" ili "efektivnu količinu" genetički modifikovanih terapeutskih ćelija, npr., T ćelija, da bi se postigao korisni ili željeni profilaktički ili terapeutski rezultat, uključujući kliničke rezultate.
[0131] "Profilaktički efikasna količina" odnosi se na količinu genetički modifikovanih terapeutskih ćelija efikasnih za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično ali ne nužno, kako je profilaktička doza korišćena u subjektima pre ili na ranijem stadijumu bolesti, profilaktički efikasna količina je manja od terapeutski efikasne količine.
[0132] "Terapeutski efiaksna količina" genetički modifikovanih terapeutskih ćelija može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol, i težina pojedinca, i sposobnost T ćelija da izazovu željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj su toksični ili štetni efekti virusa ili prenesenih terapeutskih ćelija ćelije are manje važni od terapeutskih korisnih efekata. Termin "terapeutski efikasna količina" uključuje količinu koja je efikasna za "tretiranje" subjekta (npr., pacijenta). Kada je terapeutska količina naznačena, tačna količina kompozicija prema predmetnom otkriću koju treba primeniti može se odrediti od strane lekara uzimajući u obzir individualne razlike u starosti, težini, veličini tumora, stepenu infekcije ili metastaze, i stanja pacijenta (subjekta).
[0133] Kao što je ovde korišćeno, termin "kancer" generalno se odnosi na klasu bolesti ili stanja u kojima se abnormalne ćelije dele bez kontrole i mogu preći u okolna tkiva.
[0134] Kao što je ovde korišćeno, termin "maligni" odnosi se na kancer u kojem grupa tumorskih ćelija prikazuje jedno ili više od nekontrolisani rast (tj., deoba iznad normalnih granica), invazija (tj., ulazak i destrukcija susednih tkiva), i metastaza (tj., širenje na druge lokacije u telu preko lilmfe ili krvi). Kao što je ovde korišćeno, termin "metastazirati" odnosi se na širenje kancera iz jednog dela tela u drugi. Tumor formiran od strane ćelija koje su se raširile nazvan je "metastazirani tumor" ili "metastaza." Metastazirani tumor sadrži ćelije koje su kao one u originalnom (primarnom) tumoru.
[0135] Kao što je ovde korišćeno, termin "benigni" ili "ne-maligni" odnosi se na tumore koji
1
mogu porasti ali se ne šire u druge delove tela. Benigni tumori su samoograničavajući i tipično ne vrše invaziju ili metastaziraju.
[0136] "Ćelija kancera " ili "tumorska ćelija" odnosi se na pojedinačnu ćeliju sa kancerskim rastvom ili tkivom. Tumor se generalno odnosi na otok ili leziju formiranu abnormalnim rastom ćelija, koji može biti benigni, pre-maligni, ili maligi. Većina kancera formira tumore, ali neki, npr., leukemija, ne moraju obavezno formirati tumore. Za one kancere koji formiraju tumore, termini kancer (ćelija) i tumor (ćelija) su korišćeni naizmenično. Količina tumora u individui je "tumorsko opterećenje" koje može biti mereno kao broj, zapremina, ili težina tumora.
[0137] "Infektivna bolest" odnosi se na bolest koja se može preneti sa osobe na osobu ili sa organizma na organizam, i izazvana je mikrobnim sredstvom (npr., prehlada). Infektivne bolesti su poznate u tehnici i uključuju, na primer, hepatitis, seksualno prenosive bolesti (npr., Chlamydia, gonoreja), tuberkuloza, HIV/AIDS, difterija, hepatitis B, hepatitis C, kolera, i influenca.
[0138] "Autoimuna bolest" odnosi se na bolest u kojoj telo proizvodi imunogeni (tj., imuni sistem) odgovor na neki sastojak sopstvenog tkiva. Drugim rečima imuni sistem gubi sposobnost da prepozna neko tkivo ili sistem unutar tela kao "sopstveni’ i targetira i napada ga kao da je stran. Autoimune bolesti se mogu klasifikovati u one u kojima je pretežno pogođen jedan organ (npr., hemolitična anemija i anti-imuni tiroiditis), i one u kojima je proces autoimune bolesti proširen na mnoga tkiva (npr., sistemski eritemski lupus). Na primer, smatra se da je multipla skleroza izazvana T ćelijama koje napadaju omotače koji okružuju nervna vlakna mozga i kičmene moždine. Ovo rezultuje u gubitku koordinacije, slabosti, i zamagljenom vidu. Autoimune bolesti su poznate u tehnici i uključuju, na primer, Hashimoto-ov tiroiditis, Grave-ovu bolest, lupus, multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, hemolitičku anemiju, anti-imuni tiroiditis, sistemski eritemski lupus, celijačnu bolest, Crohnovu bolest, kolitis, dijabetes, sklerodermu, psorijazu, i slično.
[0139] "Imunodeficijencija" označava stanje pacijenta čije je imuni sistem kompromitovan sa bolešću ili primenom hemikalija. Ovo stanje čini sistem deficijentnim u broju i tipu krvnih ćelija potrebnih za odbranu od strane supstance. Imunodeficijentna stanja ili bolesti su poznati u tehnici i uključuju, na primer, AIDS (sindrom stečene imunodeficijencije), SCID (teška kombinovana imunodeficijentna bolest), selektivna IgA deficijencija, obična varijabilna imunodeficijencija, X-vezna agamaglobulinemija, hronična granulomatozna bolest, hipr-IgM sindrom, i dijabetes.
[0140] Pod "poboljšanjem" ili "promocijom," ili "povećanjem" ili "ekspanzijom" generalno se
1
označava sposobnost kompozicije predviđene ovde da proizvede, izazove, ili uzrokuje veći fiziološki odgovor (tj., nishodne efekte) u poređenju sa odgovorom izazvanim sa vehikulumom ili kontrolnim molekulom/kompozicijom. Merljivi fiziološki odgovor sadrži povećanje ekspanzije, aktivacije, perzistencije, i/ili povećanje u sposobosti ubijanja ćelija T ćelija, među ostalim očiglednim iz saznanja tehnike i ovog opisa. "Povećana" ili "poboljšana" količina je tipično "statistički značajna" količina, i može uključiti povećanje koje je 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ili više puta (npr., 500, 1000 puta) (uključujući sve cele brojeve i decimalne tačke između i iznad 1, npr., 1.5, 1.6, 1.7. 1.8, itd.) u odnosu na odgovor proizveden sa vehikulumom ili kontrolnom kompozicijom.
[0141] Pod "smanjenjem" ili "sniženjem," ili "snižavanje," ili "smanjenje," ili "sniženje" generalno se označava sposobnost kompozicije predviđene ovde da proizvede, izazove, ili uzorkuje manji fiziološki odgovor (tj., nishodne efekte) u poređenju sa odgovorom izzavanim ili sa vehikulumom ili kontrolnim molekulom/kompozicijom. "Smanjena" ili "redukovana" količina je tipično "statistički značajna" količina, i sadrži smanjenje koje je 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ili više puta (npr., 500, 1000 puta) (uključujući sve cele brojeve i decimalne tačke između i iznad 1, npr., 1.5, 1.6, 1.7.1.8, itd.) u odnosu na odgovor (referentni odgovor) proizveden sa vehikulumom, kontrolnom kompozicijom, ili odgovorom u specifičnoj ćelijskoj liniji.
[0142] Pod "održavanjem," ili "očuvanjem," ili "zadržavanjem," ili "bez promene," ili "bez značajne promene," ili "bez značjanog smanjenja" generalno se označava sposobnost kompozicije predviđene ovde da proizvede, izazove, ili uzorkuje manji fiziološki odgovor (tj., nishodne efekte) u ćeliji, u poređenju sa odgovoorm izazvanim sa ili vehikulumom, kontrolnim molekulom/kompozicijom, ili odgovorom u specifičnoj ćelijskoj liniji. Uporedivi odgovor je onaj koji nije značajno različit ili merljivo različit u odnosu na referentni odgovor.
[0143] Izrazi "specifični vezujući afinitet" ili "specifično vezuje" ili "specifično vezan" ili "specifično vezivanje" ili "specifično cilja" kako se koriste u ovom tekstu, opisuju vezivanje jednog molekula za drugi sa većim afinitetom vezivanja od osnovnog nivoa vezivanja. Vezujući domen (ili CAR koji uključuje vezujući domen ili fuzioni protein koji sadrži vezujući domen) "specifično se vezuje" za ciljni molekul ako se vezuje ili udružuje sa ciljnim molekulom sa afinitetom ili Ka(tj., ravnotežna konstanta asocijacije određene vezujuće interakcije sa jedinicama 1/M), na primer, jednakim ili većim od oko 10<5>M<-1>. U određenim primerima izvođenja, vezujući domen (ili njegov fuzioni protein) može se vezati za target sa Ka koja je jednaka ili veća od oko 10<6>M<-1>, 10<7>M<-1>, 10<8>M<-1>, 10<9>M<-1>, 10<10>M<-1>, 10<11>M<-1>, 10<12>M<-1>, ili 10<13>M<-1>. "Visokoafinitetni" vezujući domeni (ili njihovi jednolančani fuzioni proteini)
2
odnosi se na one vezujuće domene koji imaju Kanajmanje 10<7>M<-1>, najmanje 10<8>M<-1>, najmanje 10<9>M<-1>, najmanje 10<10>M<-1>, najmanje 10<11>M<-1>, najmanje 10<12>M<-1>, najmanje 10<13>M<-1>, ili veću.
[0144] Alternativno, afinitet se može definisati kao ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) određene vezujuće interakcije sa jedinicama M (npr., 10<-5>M do 10<-13>M, ili manje). Afiniteti polipeptida vezujućeg domena i CAR proteina prema predmetnoj objavi mogu se lako odrediti korišćenjem konvencionalnih tehnika, npr., kompetitivnim ELISA (enzimski imunotest), ili udruživanjem vezivanjem ili testovima izmeštanja uz korišćenje obeleženih liganada, ili korišćenjem uređaja za određivanje rezonance površinskog plazmona kao što je Biacore T100, koji se može nabaviti od Biacore, Inc., Piscataway, NJ, ili optičke biosenzorne tehnologije kao što je EPIC sistem ili EnSpire, koji se mogu nabaviti od Corning, odnosno Perkin Elmer (vidi i, npr., Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; i U.S. patent br. 5.283.173; 5.468.614, ili ekvivalentno) .
[0145] U jednom primeru izvođenja, afinitet specifičnog vezivanja je oko 2 puta veći od pozadinskog vezivanja, oko 5 puta veći od pozadinskog vezivanja, oko 10 puta veći od pozadinskog vezivanja, oko 20 puta veći od pozadinskog vezivanja, oko 50 puta veći od pozadinskog vezivanja, oko 100 puta veći od pozadinskog vezivanja, ili oko 1000 puta veći od pozadinskog vezivanja ili više.
[0146] "Antigen (Ag)" odnosi se na jedinjenje, kompoziciju, ili supstancu koji mogu stimulisati proizvodnju antitela ili odgovora T ćelija u životinji, uključujući kompozicije (kao što je ona koja uključuje tumor-specifični protein) koje se injektiraju ili apsorbuju u životinji. Antigen reaguje sa proizvodima specifičnog humoralnog ili ćelijskog imuniteta, uključujući one koji su indukovani heterolognim antigenima, kao što su objavljeni antigeni. „Ciljni antigen“ ili „ciljni antigen od interesa“ je antigen koji vezuje domen CAR koji je ovde razmatran, određen je za vezivanje.
[0147] "Epitop" ili "antigena determininanta" odnosi se na region antigena za koji se vezuje vezujuće sredstvo.
[0148] "Izolovani peptid" ili "izolovani polipeptid" i slično, kao što je ovde korišćeno, odnosi se na in vitro izolaciju i/ili prečišćavanje peptidnog ili polipeptidnog molekula iz ćelijske sredine, i iz asocijacije sa drugim komponentama the ćelije, tj., nije značajno povezan sa in vivo supstancama. Slično, "izolovana ćelija" se odnosi na ćeliju koja je dobijena od in vivo tkiva ili organa i suštinski je bez ekstraćelijskog matriksa.
[0149] Kao što je ovde korišćeno, "izolovani polinukleotid" odnosi se na polinukleotid koji je prečišćen iz sekvenci koje ga flankiraju na prirodnom mestu, npr., DNK fragment koji je uklonjen iz sekvenci koje su normalno susedne fragmentu. "Izolovani polinukleotid" se takođe odnosi na komplementarnu DNK (cDNK), rekombinantnu DNK, ili drugi polinukleotid koji ne postoji u prirodi i koji je napravljen od strane čoveka.
C. Postupaci za proizvodnju T ćelija
[0150] T ćelije proizvedene postupcima predviđenim ovde obezbeđuju poboljšane adoptivne imunoterapijske kompozicije. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, smatra se da kompozicije T ćelija proizvedene postupcima predviđenim ovde su sa superiornim osobinama, uključujući povećano preživljavanje, ekspanziju u relativnom odsustvu diferencijacije, i perzistencijom in vivo. U jednom primeru, postupak proizvodnje T ćelija sadrži dovođenje u kontakt ćelija sa jednim ili više sredstava koja moduliraju signalni put PI3K/Akt/mTOR ćelija. U različitim primerima izvođenja, T ćelije mogu se dobiti iz bilo kog izvora i dovestiu u kontakt sa sredstvom tokom faze aktivacije i/ili ekspanzije u proizvodnom procesu. Rezultujuće kompozcije T ćelija su obogaćene razvojno potentnim T ćelijama koje imaju sposobnost da proliferišu i eksprimiraju jedan ili više odsledećih biomarkera: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD 122, i CD 127.
[0151] U jednom primeru izvođenja, proizvedene su modifikovane T ćelije koje sadrže održavane nivoe proliferacije i smanjenu diferencijaciju. U specifičnom primeru, T ćelije su proizvedene stimulacijom T ćelija da postanu aktivirane i da proliferišu u prisustvu jednog ili više stimulatornih signala i sredstva koje je inhibitor signalnog puta PI3K/Akt/mTOR ćelija.
[0152] T ćelije se zatim mogu modfikovati da eksprimiraju jedan ili više konstruisanih TCRs ili CARs. U jednom primeru izvođenja, T ćelije su modifikovane transdukcijom T ćelija sa virusnim vektorom koji sasdrži konstruisani TCR ili CAR. U određenom primeru, T ćelije su modifikovane pre stimulacije i aktivacije u prisustvu inhibitora signalnog puta PI3K/Akt/mTOR ćelija. U sledećem primeru, T ćelije su modifikovane nakon stimulacije i aktivacije u prisutvu inhibitora signalnog puta PI3K/Akt/mTOR ćelija. U specifičnom primeru, T ćelije su modifikovane unutar 12 časova, 24 časa, 36 časova, ili 48 časa od stimulacije i aktivacije u prisustvu inhibitora signalnog puta PI3K/Akt/mTOR ćelija.
[0153] Nakon što su T ćelije aktivirane, ćelije su kultivisane da proliferišu. T ćelije mogu biti kultivisane najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 dana, najmanje 2 nedelje, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 meseci ili više sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više rundi ekspanzije.
[0154] U različitim primerima, kompozicije T ćelija su proizvedene u prisustvu jednog ili više inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta. Inhibitori mogu targetirati jednu ili više aktivnosti u putu ili pojedinačnu aktivnost. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, predviđeno je da tretman ili dovođenje u kontakt T ćelije sa jednim ili više inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta tokom faza stimulacije, aktivacije, i/ili ekspanzije u proizvodnom procesu poželjno povećava mlade T ćelije, čime se proivzode superiorne terapeutske kompozicije T ćelija.
[0155] U specifičnom primeru izvođenja, obezbeđen je postupak za povećanje proliferacije T ćelija koje eksprimiraju konstruisani T ćelijski receptor. Takvi postupci mogu sadržati, na primer, sakupljanje izvora T ćelija iz subjekta, stimulaciju i aktivaciju T ćelija u prisustvu jednog ili više inhibitora PI3K/AKT/mTOR puta, modifikaciju T ćelija da bi eksprimirale konstruisani TCR ili CAR, i ekspanziju T ćelija u kulturi.
[0156] U određenom primeru izvođenja, obezbeđen je postupak za proizvodnju populacija T ćelija obogaćenih ekspresijom jednog ili više sledećih biomarkera: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127. U povezanom primeru izvođenja, obezbeđen je postupak za povećanje T ćelija koje eksprimiraju CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127 i ne eksprimiraju ili eksprimiraju niske nivoe CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3, i LAG3. Kao što je razmatrano ovde na drugim mestima, ekspresioni nivoi biomarkera mladih T ćelija je u odnosu na ekspresione nivoe takvih markera u populacijama diferenciranijih T ćelijama ili imunih efektornih ćelija.
[0157] U jednom primeru izvođenja, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) korišćene su kao izvor T ćelija u postupcima proizvodnje T ćelija predviđenim ovde. PBMCs formiraju heterogenu populaciju T limfocita koje mogu biti CD4+, CD8+, ili CD4+ i CD8+ 19 i sadrže druge mononuklearne ćelija kao što su monociti, B ćelije, NK ćelije i NKT ćelije. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid kojhi kodira konstruisani TCR ili CAR predviđen ovde može se introdukovati u populaciju humanih donorskih T ćelija, NK ćelija ili NKT ćelija. Uspešno transdukovane T ćelije koje nose ekspresioni vektor mogu se sortirati korišćenjem protočne citometrije da se izoluju CD3 pozitivne T ćelije i zatim dodatno propagiraju da bi se povećao broj modifikovanih T ćelija dodatno aktivaciji ćelija korišćenjem anti-CD3 antitela i ili anti-CD28 antitela i IL-2, IL-7, i/ili IL-15 ili bilo kojih drugih postupaka pozantih u tehnici kao što je ovde opisano na drugim mestima.
[0158] Postupci proizvodnje predviđeni ovde mogu dodatno sadržati krioprezervaciju modifikovanih T ćelija za skladištenje i/ili pripremu za upotrebu u humanom subjektu. T ćelije su krioprezervirane tako da ćelije ostaju vijabilne nakon odmrzavanja. Po potrebi, krioprezervirane transformisane imune efektorne ćelije mogu se odmrznuti, uzgajati i izvršiti njihova ekpanzija za još takvih ćelija. Kao što je ovde korišćeno, "krioprezerviranje," odnosi se na prezervaciju ćelija hlađenjem do temperatura ispod nule, kao što je (tipično) 77 K ili -
2
196° C. (tačka ključanja tečnog azota). Krioprotektivna sredstva se često koriste na temperaturama ispod nule da bi se sprečilo šteta po ćelije koje se čuvaju usled zamrzavanja na niskim temperaturama ili zagrevanjem do sobne temperature. Krioprezervativna sredstva i optimalne stope hlađenja mogu zaštititi od povrede ćelija. Krioprotektivna sredstva koja se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničena na dimetil sulfoksid (DMSO) (Lovelock i Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirolidin (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), i polietilen glikol (Sloviter i Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). Poželjna stopa hlađenja je 1° do 3° C/minut. Nakon najmanje dva časa, T ćelije su dostigle temperaturu od -80° C. i mogu se staviti direktno u tečni azot (-196° C.) za stalno skladištenje kao što je u kriogenim bocama za dugoročno skladištenje.
1. T ćelije
[0159] Predmetni pronalazak predviđa proizvodnju poboljšanih kompozicija T ćelija. T ćelije mogu biti autologe/autogene ("sopstvene’) ili ne-autologe ("nesopstvene," npr., alogene, singene ili ksenogene). U poželjnim primerima izvođenja, T ćelije su dobijene od sisarskog subjekta. U poželjnijem primeru izvođenja, T ćelije su dobijene od subjekta primata. U najpoželjnijem primeru izvođenja, T ćelije su dobijene od humanog subjekta.
[0160] T ćelije se mogu dobiti iz brojnih izvora uključujući, ali se ne ograničavajući na, mononuklearne ćelije periferne krvi, kostnu srž, tkivo limfnih ćvorova, krv pupčane vrpce, tkivo timusa, tkivo sa mesta infekcije, ascitesa, pleuralne efuzije, tkiva slezine, i tumora. U određenim primerima izvođenja, T ćelije se mogu dobiti iz krvnih jedinica sakupljenih od subjekta upotrebnom bilo koje od brojnih tehnika poznatih stručnjaku, kao što je sedimetacija, npr., FICOLL™ separacija. U jednom primeru izvođenja, ćelije iz cirkulišuće krvi pojedinca su dobijene aferezom. Proizvod afereze tipično sadrži limfocite, uključujući T ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druge bele krvene ćelije sa nukleusom, crvene krvne ćelije, i trombocite. U jednom primeru izvođenja, ćelije sakupljene aferezom mogu se isprati da bi se uklonila plazma frakcija i da bi se stavile ćelije u odgovarajući pufer ili medijum za naknadnu obradu. Ćelije se mogu isprati sa PBS ili sa drugim pogodnim rastvorom kome nedostaje kalcijum, magnezijum, i najviše, ukooliko ne sve ostalo, dvovalentni katjoni. Kao što će shvatiti stručnjaci, korak ispiranja može se postići postupcima poznatim u tehnici, kao što je korišćenjem poluautomatske protočne centrifuge. Na primer, Cobe 2991 cell processor, Baxter CytoMate, ili slično. Nakon ispiranja, ćelije se mogu resuspendovati u raznim biokompatibilnim puferima ili drugim fiziološkim rastvorima sa ili bez pufera. U određenim primerima izvođenja, neželjene komponente u uzorku iz afereze mogu se ukoniti iz ćelija direktno resuspendovanih u medijumu kulture.
[0161] U specifičnim primerima izvođenja, poopulacija ćelija koja sadrži T ćelije, npr., PBMCs, je korišćena u postupcima proizvodnje predviđenim ovde. U drugim primerima izvođenja, izolovana ili prečišćena populacija T ćelija je korišćena u postupcima proizvodnje predviđenim ovde. Ćelije mogu biti izolovane iz mononuklearnihćelija periferne krvi (PBMCs) liziranjem crvenih krvnih ćelija i depletiranjem monocita, na primer, centrifugiranjem u PERCOLL™ gradijentu. U nekim primerima izvođenja, nakon izolacije PBMC, i citotoksični i helper T limfociti mogu se sortirati u naivne, memorijske, i efektorkse T ćelijske subpopulacije ili pre ili nakon aktivacije, ekspanzije, i/ili genetičke modifikacije.
[0162] Specifična subpopulacija T ćelija, koja eksprimira jedan ili više od sledećih markera: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127, i HLA-DR može se dodatno izolovati tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. U jednom primeru izvođenja, specifična subpopulacija T ćelija, koja eksprimira jedan ili više markera izabranih iz grupe koja se sastoji od CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127 je dodatno izolovana tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. U različitim primerima izvođenja, proizvedena kompoziicja T ćelija ne eksprimira ili suštinski ne eksprimira jedan ili više od sledećih markera: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3, i LAG3.
[0163] U jednom primeru izvođenja, ekspresija jednog ili više markera izabranih iz grupe koja se sastoji od CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127 je povećana najmanje 1.5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 25 puta, ili više u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i raširenih bez PI3K/AKT/mTOR inhibitora.
[0164] U jednom primeru izvođenja, ekspresija jednog ili više markera izabranih iz grupe koja se sastoji od CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3, i LAG3 je smanjena najmanje 1.5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 25 puta, ili više u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i raširenih sa PI3K/AKT/mTOR inhibitorom.
[0165] U jednom primeru izvođenja, postupci proizvodnje predviđeni ovde povećavaju broj T ćelija koje sadrže jedan ili više markera naivnih ili razvojno potentnih T ćelija. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, pronalazači predmetnog pronalaska smatraju da tretiranje
2
populacije ćelija koja sadrži T ćelije sa jednim ili više PI3K/AKT/mTOR inhibitora dekupluje signale T ćelijske proliferacije i diferencijacije, i time rezultuje u povećanju ekspanzije razvojno potentnih T ćelija i obezbeđuje robusniju i efikasniju adoptivnu imunoterapiju od postojećih T ćelijskih terapija.
[0166] Ilustrativni primeri markera naivnih ili razvojno potentnih T ćelija povećanih u T ćelijama proizvedenim korišćenjem postupaka predviđenih ovde uključuju, ali nisu ograničeni na CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD95, CD122, i CD127.. U specifičnim primerima izvođenja, naivne T ćelije ne eksprimiraju ili suštinski ne eksprimiraju jedan ili više od sledećeih markera: CD57, CD244, CD160, PD-1, BTLA, CD45RA, CTLA4, TIM3, i LAG3.
[0167] U odnosu na T ćelije, populacije T ćelija koje rezultuju iz raznih metodologija ekspanzije predviđene ovde mogu imati razne speciifčne osobine, u zavisnosti od upotrebljenih uslova. U različitim primerima izvođenja, populacije T ćelija u ekspanziji sadrže jedan ili više od sledećeih fenotipskih markera: CCR7, CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD62L, CD95, CD122, CD127, i HLA-DR.
[0168] U jednom primeru izvođenja, takvi fenotipski markeri uključuju poboljšanu ekspresiju jednog ili više od, ili sve od CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127. U specifičnim primerima izvođenja, CD8+ T limfociti karakterisani sa ekspresijom fenotipskih markera naivnih T ćelija uključujući CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127 su podvrgnuti ekspanziji.
[0169] U specifičnim primerima izvođenja, T ćelije karakterisane ekspresijom fenotipskih markera centralnih memorijskih T ćelija uključujući CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127 i negativne za granzim B su podvrgnute ekspanziji. U nekim primerima izvođenja, centralne memorijske T ćelije su CD45RO+, CD62L+, CD8+ T ćelije.
[0170] U određenim primerima izvođenja, CD4+ T limfociti karakterisani ekspresijom fenotipskih markera naivnih CD4+ ćelija uključujući CD62L i negativne u odnosu na ekspresiju CD45RA i/ili CD45RO su podvrgnute ekspanziji. U nekim primerima izvođenja, CD4+ ćelije karakterisane sa ekspresijom fenotipskih markera centralnih memorijskih CD4+ ćelija uključujući CD62L i CD45RO pozitivne. U nekim primerima izvođenja, efektorne CD4+ ćelije su CD62L pozitivne i CD45RO negativne.
[0171] U određenim primerima, T ćelije su izolovane iz individue i modifikovane bez dodatne manipulacije ex vivo ili in vitro. Takve ćelije se zatim mogu direktno ponovo primeniti u individuu. U dodatnim primerima izvođenja, T ćelije su prvo aktivirane i stimulisane da proliferišu in vitro pre nego što su genetički modifikovane da eksprimiraju konstruisani TCR ili CAR. U ovom pogledu, T ćelije se mogu kultivisati pre i/ili posle genetičke modifikacije
2
(tj., transdukcije ili transfekcije da bi eksprimirale konstruisani TCR ili CAR predviđen ovde).
2. Aktivacija i ekspanzija
[0172] Da bi se postigle dovoljne terapeutske doze kompozicija T ćelija, T ćelije se često podvrgavaju jednoj ili više rundi stimulacije, aktivacije i/ili ekspanzije. T ćelije mogu biti aktivirane i podvrgnute ekspanziji generalno korišćenjem postupaka kao što su opisani, na primer, u SAD patentima 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; i 6,867,041. T ćelije modifikovane da eksprimiraju konstruisani TCR ili CAR mogu se aktivirati i ekpandirati pre i/ili posle modifikacije T ćelija. Dodatno, T ćelije se mogu dovesti u kontakt sa jednim ili više sredstava koja moduliraju signalni put PI3K/AKT/mTOR ćelija pre, tokom, i/ili nakon aktivacije i/ili ekspanzije. U jednom primeru, T ćelije proizvedene postupcima predviđenim ovde podvrgnute su jednoj, dve, tri, četiri, ili pet ili više rundi aktivacije i ekspanzije, od kojih svaka sadrži jedno ili više sredstava koja moduliraju signalni put PI3K/AKT/mTOR ćelija.
[0173] U jednom primeru izvođenja, kostimulatorni ligand je prikazan na antigen prikazujućoj ćeliji (npr., aAPC, denditska ćelija, B ćelija, i slično) koja specifično vezujje srodni kostimulatorni molekul na T ćeliji, čime se obezbeđuje signal koji, dodatno primarnom signalu obezbeđenom sa, na primer, vezivanjem TCR/CD3 kompleksa, posreduje željeni T ćelijski odgovor. Pogodni kostimulatorni ligandi uključuju, ali nisu ograničeni na, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L 1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, inducibilni kostimulatorni ligand (ICOS-L), intercelularni adhezioni molekul (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, limfotoksin beta receptor, ILT3, ILT4, agonist ili antitelo koje vezuje Toll ligand receptor, i ligand koji specifično vezuje B7-H3.
[0174] U specifičnom primeru izvođenja, kostimulatorni ligand sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za kostimulatorni molekul prisutan na T ćeliji, uključujući, ali se ne ograničavajući na, CD27, CD28, 4- IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, 1COS, limfocit funkcionalno-povezani antigen- 1 (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, i ligand koji specifično vezuje CD83.
[0175] Pogodni kostimulatorni ligandi dodatno uključuju target antigene, koji mogu biti obezbeđeni u rastvorljivom obliku ili eksprimirani na APCs ili aAPCs, koji vezuju konstruisane TCRs ili CARs eksprimirane na modifikovanim T ćelijama.
[0176] U različitim primerima izvođenja, postupak za proizvodnju T ćelija predviđen ovde
2
sadrži aktiviranje populacije ćelija koja sadrži T ćelije i ekspanziju populacije T ćelija. Aktivacija T ćelija može se postići obezbeđivanjem primarnog stimulacionog signala preko TCR/CD3 kompleksa T ćelija ili preko stimulacije CD2 površinskog proteina i obezbeđivanjem sekundarnog kostimulirajućeg signala preko pomoćnog molekula, npr, CD28.
[0177] TCR/CD3 kompleks može biti stimulisan dovođenjem u kontakt T ćelija sa pogodnim CD3 vezujućim sredstvom, npr., CD3 ligandom ili anti-CD3 monoklonskim antitelom. Ilustrativni primeri CD3 antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, OKT3, G19-4, BC3, i 64.1.
[0178] U sledećem primeru izvođenja, CD2 vezujuće sredstvo može se koristiti da se obezbedi primarni stimulattorni signal za T ćelije. Ilustrativni primeri CD2 vezujućih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na, CD2 ligande i anti-CD2 antitela, npr., T11.3 antitelo u kombinaciji sa T11.1 ili T11.2 antitelom (Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36:897-906) i 9.6 antitelo (koje prepoznaje isti epitop kao TI 1.1) u kombinaciji sa 9-1 antitelom (Yang, S. Y. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097-1100). Druga antitela koja se vezuju za iste epitope kao bilo koje od prethodno opisanih antitela mogu se takođe koristiti. Dodatna antitela, ili kombinacija antitela, mogu se pripremiti i identifikovati standardnim tehnikama kao što je opisano ovde na drugim mestima.
[0179] Dodatno primarnom stimulatornom signalu obezbeđenom preko TCR/CD3 kompleksa, ili preko CD2, indukcija T ćelijskih odgovora zahteva drugi, kostimulatorni signal. U specifičnim primerima izvođenja, CD28 vezujuće sredstvo može se koristiti za obezbeđivanje kostimulatornog signala. Ilustrativni primeri CD28 vezujućih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na: prirodne CD 28 ligande, npr., prirodni ligand za CD28 (npr., član B7 familije proteina, kao što je B7-1(CD80) i B7-2 (CD86); i anti-CD28 monoklonsko antitelo ili njegov fragment sposoban za unakrsno vezivanje CD28 molekula, npr., moonklonska antitela 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2, i EX5.3D10.
[0180] U jednom primeru izvođenja, molekul koji obezbeđuje primarni stimulatorni signal, na primer molekul koji obezbeđuje stimulaciju preko TCR/CD3 kompleksa ili CD2, i kostimulatorni molekul su kuplovani za istu površinu.
[0181] U određenim primerima izvođenja, vezujuća sredstva koja obezbeđuju stimulatorne i kostimulatorne signale su lokalizovana na površini ćelije. Ovo se može postići transfekcijom ili transdukcijom ćelije sa nukleinskom kiselinom koja kodira vezujuće sredstvo u obliku pogodnom za njegovu ekspresiju na površini ćelije ili alternativno kuplovanjem vezujućeg sredstva sa površinom ćelije.
[0182] U sledećem primeru izvođenja, molekul koji obezbeđuje primarni stimulatorni signal,
2
na primer molekul koji obezbeđuje stimulaciju preko TCR/CD3 kompleksa ili CD2, i kostimulatorni molekul su prikazani na antigen prikazujućoj ćeliji.
[0183] U jednom primeru izvođenja, molekul koji obezbeđuje primarni stimulatorni signal, na primer molekul koji obezbeđuje stimulaciju preko TCR/CD3 kompleksa ili CD2, i kostimulatorni molekul su obezbeđeni na zasebnim površinama.
[0184] U određenom primeru izvođenja, jedno od vezujućih sredstava koje obezbeđuje stimulatorne i kostimulatorne signale je rastvorljivo (obezbeđeno u rastvoru) i drugo sredstvo (sredstva) je obezbeđeno na jednoj ili više površina.
[0185] U specifičnom primeru izvođenja, vezujuća sredstva koja obezbeđuju stimulatorne i kostimulatorne signale su oba obezbeđena u rastvorljivom obliku (obezbeđeni u rastvoru).
[0186] U različitim primerima izvođenja, postupci za proizvodnju T ćelija predviđeni ovde sadrže aktiviranje T ćelija sa anti-CD3 i anti-CD28 antitelima.
[0187] Kompozicije T ćelija proizvedene postupcima predviđenim ovde sadrže T ćelije aktivirane i/ili podvrgnute ekspanziji u prisustvu jednog ili više sredstava koja inhibiraju signalni put PI3K/AKT/mTOR ćelija. T ćelije modifikovane da eksprimiraju konstruisani TCR ili CAR mogu biti aktivirane i podvrgnute ekspanziji pre i/ili posle modifikacije T ćelija. U specifičnim primerima izvođenja, populacija T ćelija je aktivirana, modifikovana da eksprimira konstruisani TCR ili CAR, i zatim kultivisana za ekspanziju.
[0188] U jednom primeru izvođenja, T ćelije proizvedene sa postupcima predviđenim ovde sadrže povećani broj T ćelija koje eksprimiraju markere indikativne za visoko proliferativni potencijal i sposobnost da se samoobnavljaju ali koje ne eksprimiraju ili eksprimiraju suštinski nedetektabilne markere T ćelijske diferencijacije. Ove T ćelije mogu se ponovo aktivirati i podvrgnuti ekspanziji na robustan način i time obezbediti poboljšanu terapeutsku kompoziciju T ćelija.
[0189] U jednom primeru, populacija T ćelija aktiviranih i podvrgnutih ekspanziji u prisustvu jednog ili vieš sredstava koje inhibiraju signalni put PI3K/AKT/mTOR ćelija je podvrgnuta ekspanziji najmanje 1.5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 25 puta, najmanje 50 puta, najmanje 100 puta, najmanje 250 puta, najmanje 500 puta, najmanje 1000 puta, ili više u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i podrvgnutih ekspanziji bez PI3K/AKT/mTOR inhibitora.
[0190] U jednom primeru, populacija T ćelija karakterisanih ekspresijom markera mladih T ćelija je aktivirana i podvrgnuta ekspanziji u prisustvu jednog ili više sredstava koja inhibiraju signalni put PI3K/AKT/mTOR ćelija je podvrgnuta ekspanziji najmanje 1.5 puta, najmanje 2
2
puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 25 puta, najmanje 50 puta, najmanje 100 puta, najmanje 250 puta, najmanje 500 puta, najmanje 1000 puta, ili više u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i podvrgnutih ekspanziji bez PI3K/AKT/mTOR inhibitora.
[0191] U jednom primeru izvođenja, ekspanzija T ćelija aktiviranih sa postupcima predviđenim ovde dodatno sadrži kultivisanje populacije ćelija koje sadrže T ćelije nekoliko časova (oko 3 časa) do oko 7 dana do oko 28 dana ili bilo koju celobrojnu vrednost časova između. U sledećem primeru izvođenja, kompozicija T ćelija može se kultivisati 14 dana. U specifičnom primeru izvođenja, T ćelije su kultivisane oko 21 dan. U sledećem primeru izvođenja, kompozicije T ćelija su kultivisane oko 2-3 dana. Nekoliko ciklusa stimulacije/aktivacije/ekspanzije može takođe biti poželjno tako da vreme kultivisanja T ćelija može biti 60 dana ili više.
[0192] U specifičnim primerima izvođenja, odgovarajući uslovi za T ćelijsku kulturu uključuju odgovarajući medijum (npr., Minimal Essential Media ili RPMI Media 1640 ili, X-vivo 15, (Lonza)) i jedan ili više faktora neophodnih za proliferaciju i vijabilnost uključujući, ali se ne ograničavajući na serum (npr., fetalnini goveđi ili humani serum), interleukin-2 (IL-2), insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL- 10, IL- 12, IL-15, TGFβ, i TNF-α ili bilo koje druge aditive pogodne za rast ćelija poznat stručnjaku.
[0193] Dodatni ilustrativni primeri medijuma ćelijske kulture uključuju, ali nisu ograničeni na RPMI 1640, Clicks, AIMV, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 5, i X-Vivo 20, Optimizer, sa dodatim aminokiselinama, natrijum piruvatom, i vitaminima, ili bez seruma ili sa dodatkom odgovarajuće količine seruma (ili plazme) ili definisanim setom hormona, i/ili količinom citokina (ili više njih) dovoljnim za rast i ekspanziju T ćelija.
[0194] Ilustrativni primeri drugih aditiva za ekspanziju T ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, surfaktant, piasmanat, pH pufere kao što su HEPES, i redukujuća sredstva kao što su N-acetil-cistein i 2-merkaptoetanol
[0195] Antibiotici, npr., penicilin i streptomycin, su uključeni samo u eksperimentalne kulture, ne u kulture ćelija koje treba infuzijom primeniti na subjekta. Target ćelije se održavaju pod uslovima neophodnim da podrže rast, na primer, odgovarajuća temperatura (npr., 37° C) i atmosfera (npr., vazduh plus 5% CO2).
[0196] U specifičnim primerima izvođenja, PBMCs ili izolovane T ćelije su dovedene u kontakt sa stimulatornim sredstvom i kostimulatornim sredstvom, kao što su anti-CD3 i anti-CD28 antitela, generalno vezanim za perlicu ili drugu površinu, u medijumu kulture sa odgovarajućim citokinima, kao što su IL- 2, IL-7, i/ili IL-15.
[0197] U drugim primerima izvođenja, veštački APC (aAPC) stvoreni konstruisanjem K562, U937, 721.221, T2, i C1R ćelija da upravljaju stabilnom ekspresijom i sekrecijom, raznih kostimulatornih molekula i citokina. U specifičnom primeru izvođenja K32 ili U32 aAPCs su korišćeni da upravljaju prikazivanjem jednog ili više antitelo-zasnovanih stimulatornih molekula na površini AAPC ćelija. Populacije T ćelija mogu biti podvrgnute ekspanziji sa aAPCs koje eksprimiraju razne kostimulatorne molekule uključiujući, ali se ne ograničavajući na, CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L), i/ili CD80 ili CD86. Konačno, aAPCs obezbeđuju efikasnu platformu za ekspanziju genetički modifikovanih T ćelija i za održavanje CD28 ekspresije na CD8 T ćelijama. aAPCs su obezbeđene u WO 03/057171 i US2003/0147869.
3. Sredstva
[0198] U različitim primerima, obezbeđen je postupak za proizvodnju T ćelija koji vrši ekspanziju nediferenciranih ili razvojno potentnih T ćelija koji sadrži dovođenje u kontakt T ćelije sa sredstvom koje modulira PI3K/AKT/mTOR put u ćeliji. Ćelije mogu biti dovedene u kontakt pre, tokom, i/ili nakon aktivacije i ekspanzije. Kompozicije T ćelija zadržavaju dovoljno T ćelijske potencije tao da mogu biti podvrgnute više rundi ekspanzije bez značajnog povećanja u diferencijaciji.
[0199] Kao što je ovde korišćeno, termini "modulira," "modulator," ili "modulatorno sredstvo" ili odgovarajući termin odnosi se na sposobnost sredstva da izazove promenu u ćelijskom signalnom putu. Modulator može povećati ili smanjiti količinu, aktivnost komponente puta ili povećati ili smanjiti željeni efekat ili izlaz ćelijskog signalnog puta. U jednom primeru, modulator je inhibitor. U drugom primeru, modulator je aktivator.
[0200] "Sredstvo" se odnosi na jedinjenje, mali molekul, npr., mali organski molekul, nukleinsku kiselinu, polipeptid, ili fragment, izoformu, varijantu, analog, ili njegov derivat korišćen u modulaciji PI3K/AKT/mTOR puta.
[0201] "Mali molekul" se odnosi na kompoziciju koja ima molekulsku težinu manju od oko 5 kD, manju od oko 4 kD, manju od oko 3 kD, manju od oko 2 kD, manju od oko 1 kD, ili manju od oko .5kD. Mali molekuli mogu sadržati nukleionske kiseline, peptide, polipeptide, peptidomimetike, peptoide, ugljenehidrate, lipide, njihove komponente ili druge organske ili neorganske molekule. Biblioteke hemijskih i/ili bioloških smeša, kao što su ekstrakti gljiva, bakterija ili algi poznati su u tehnici i može biti izvršen njihov skrining sa bilo kojim analizama prema opisu. Primeri postupaka za sintezu molekulskih biblioteka mogu se naći u:
1
(Carell et al., 1994a; Carell et al., 1994b; Cho et al., 1993; DeWitt et al., 1993; Gallop et al., 1994; Zuckermann et al., 1994).
[0202] "Analog" se odnosi na malo organsko jedinjenje, nukleotid, protein, ili polipetid koji poseduje sličnu ili identičnu aktivnost ili funkciju (funkcije) kao jedinjenje, nukleotid, protein ili polipeptid ili jedinjenje koje ima željenu aktivnost prema predmetnom pronalasku, ali neophodno ne sadrži sekvencu ili strukturu koja je slična ili identična sekvenci ili strukturi poželjnog primera izvođenja.
[0203] "Derivat" se odnosi ili na jedinjenje, protein ili polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu roditeljskog proteina ili polipeptida koji je izmenjen introdukcijom supstuitucija, delecija ili adicija aminokiselinskog ostatka, ili nukleinsku kiselinu ili nukleotid koji je modifikovan sa ili introdukcijom supstitucija ili delecija, adicija ili mutacija nukleotida. Derivat nukleinska kiselinan, nukleotid, protein ili polipetid poseduje sličnu ili identičnu funkciju kao roditeljski polipeptid.
[0204] U različitim primerima, sredstvo koje moduliše PI3K/AKT/mTOR put aktivira komponentu puta. "Aktivator," ili "agonist" odnosi se na sredstvo koje promoviše, povećava, ili uključuje jednu ili više aktivnosti molekula u PI3K/AKT/mTOR putu uključujući, bez ograničenja, molekul koji inhibira jednu ili više aktivnosti PI3K, Akt, ili mTOR (ili mTORC1, mTORC2 kompleksa).
[0205] U različitim primerima, sredstvo koje modulira PI3K/AKT/mTOR put inhibira komponentu puta. "Inhibitor" ili "antagonist" se odnosi na sredstvo koje inhibira, smanjuje, ili redukuje jednu ili više aktivnosti molekula u PI3K/AKT/mTOR putu uključujući, bez ograničenja, PI3K, an Akt, ili mTOR (ili mTORC1, mTORC2 kompleks). U jednom primeru izvođenja, inhibitor je dvostruki molekul inhibitor. U jednom primeru izvođenja, inhibitor sprečava formiranje proteinskih kompleksa kao što je mTORC1 ili srodni kompleksi. U specifičnom primeru izvođenja, inhibitor može inhibirati klasu molekula koji imaju iste ili suštinski slične aktivnosti (pan-inhibitor) ili mogu specifično inhibirati aktivnost molekula (selektivni ili specifični inhibitor). Inhibicija može takođ ebiti nepovratna ili povratna.
[0206] U jednom primeru izvođenja, inhibitor ima IC50od najmanje 1nM, najmanje 2nM, najmanje 5nM, najmanje 10nM, najmanje 50nM, najmanje 100nM, najmanje 200nM, najmanje 500nM, najmanje 1mM, najmanje 10mM, najmanje 50mM, ili najmanje 100mM. Određivanje IC50može se postići korišćenjem bilo kojih konvencionalnih tehnika poznatih u tehnici. Na primer, IC50se može odrediti merenjem aktivnosti datog enzima u prisustvu opsega koncentracija inhibitora koji se proučava. Eksperimentalno dobijene vrednosti aktivnosti enzima su zatim plotovane nasuprot korišćenim koncentracijama inhibitora.
2
Koncentracija inhibitora koja pokazuje 50% aktivnosti enzima (u poređenju sa aktivnošću u odsustvu bilo kog inhibitora) je uzeta kao "IC50" vrednost. Analogno, druge inhibitorne koncentracije mogu se definisati preko odgovarajućih određivanja aktivnosti.
[0207] U različitim primerima, T ćelije su dovedene u kontakt ili tretirane ili kultivisane sa jednim ili više modulatora PI3K/AKT/mTOR puta sa koncentracijom od najmanje lnM, najmanje 2nM, najmanje 5nM, najmanje 10nM, najmanje 50nM, najmanje 100nM, najmanje 200nM, najmanje 500nM, najmanje 1mM, najmanje 10mM, najmanje 50mM, najmanje 100mM, ili najmanje 1 M.
[0208] U specifičnim primerima, T ćelije se mogu dovesti u kontakt ili tretirati ili kultivisane sa jednim ili više modulatora PI3K/AKT/mTOR puta najmanje 12 časova, 18 časova, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 dana, najmanje 2 nedelja, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 meseci ili više sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više rundi ekspanzije.
a. PI3K/AKT/mTOR put
[0209] Fosfatidil-inozitol-3kinaza/Akt/sisarski target rapamicin (PI3K/Akt/mTOR) puta služi kao spona za integrisanje signala faktora rasta sa ćelijskom proliferacijom, diferencijacijom, metabolizmom, i preživljavanjem. PI3Ks su familija visoko konzervativnih intracelularnih lipidnih kinaza. Klasa IA PI3Ks su aktivirane sa receptor tirozin kinazama faktora rasta (RTKs), ili direktno ili preko interakcije sa familijom insulin receptor supstrata adapterskih molekula. Ova aktivnost rezultuje u proizvodnji fosfatidil-inozitol-3,4,5-trisfosfata (PIP3) regulatora serin/treonin kinaze Akt. mTOR deluje preko kaskadnog PI3K puta preko 2 distinktna kompleksa, pri čemu je svaki karakterisan različitim vezujućim partnerima koji daju distinktne aktivnosti. mTORC1 (mTOR u kompleksu sa PRAS40, raptor, i mLST8/GbL) deluje kao nishodni efektor PI3K/Akt signalizacije, vezujući signale faktora rasta sa translacijom proteina, ćelijskim rastom, proliferacijom, i preživljavanjem. mTORC2 (mTOR u kompleksu sa rictor, mSIN1, protor, i mLST8) deluje kao ushodni aktivator Akt.
[0210] Nakon aktivacije PI3K posredovane receptorom za faktor rasta, Akt je regrutovan u membranu preko interakcije njegovog plekstrin homologog domena sa PIP3, čime se izlaže njegova aktivaciona petlja i omogućava fosforilacija na treoninu 308 (Thr308) sa konstitutivno aktivnim fosfoinozitid-zavisnom protein kinazom 1 (PDK1). Za maksimalnu aktivaciju, Akt je je takođe fosforilovan sa mTORC2, na serinu 473 (Ser473) njegovog C termininalnog hidrofobnog motiva. Takođe je pokazano da su DNK-PK i HSP važni za regulaciju Akt aktivnosti. Akt aktivira mTORC1 preko inhibitorne fosforilacije TSC2, koja zajedno sa TSC1, negativno reguliše mTORC1 inhibicijom Rheb GTPaze, pozitivnog regulatora mTORC1. mTORC1 ima 2 dobro definisana supstrata, p70S6K (ovde označen kao S6K1) i 4E-BP1, od kojih oba kritično regulišu sintezu proteina. Stoga, mTORC1 je važan nishodni efektor PI3K, koji povezuje signalizaciju faktora rasta sa translacijom proteina i ćelijskom proliferacijom.
b. mTOR inhibitori
[0211] Termini "mTOR inhibitor" ili "sredstvo koje inhibira mTOR" odnosi se na nukleinsku kiselinu, peptid, jedinjenje, ili mali organski moelkul koji inhibira najmanje jednu aktivnost na mTOR proteinu, kao što je, na primer, aktivnost serin/treonin protein kinaze na najmanje jednom od njenih supstrata (npr., p70S6 kinaza 1, 4E-BP1, AKT/PKB i eEF2). mTOR inhibitori su sposobni da se vezuju direktno sa i inhibiraju mTORC1, mTORC2 ili oba mTORC1 i mTORC2.
[0212] Inhibicija mTORC1 i/ili mTORC2 aktivnosti može se odrediti preko smanjenja signalne transdukcije PI3K/Akt/mTOR puta. Veoma raznovrsna očitavanja se mogu koristiti da bi se ustanovil smanjenje izlaza takvog signalnog puta. Neki ne-ograničavajući primeri uključuju (1) smanjenje fosforilacije Akt na ostacima, uključujući, ali se ne ograničavajući na 5473 i T308; (2) smanjenje u aktivaciji Akt kao što je pokazano, na primer, smanjenjem fosforilacije Akt supstrata uključujući, ali se ne ograničavajući na Fox01/O3a T24/32, GSK3a/β; S21/9, i TSC2 T1462; (3) smanjenje fosforilacije signalnih molekula nishodno od mTOR, uključujući, ali se ne ograničavajući na ribozomalnin S6 S240/244, 70S6K T389, i 4EBP1 T37/46; i (4) inhibiciju proliferacije ćelija kancera.
[0213] U jednom primeru, mTOR inhibitori su inhibitori aktivnog mesta. Oni su mTOR inhibitori koji vezuju ATP vezujuće mesto (takođe označeno kao ATP vezujući džep) mTOR i inhibiraju katalitičku aktivnost i mTORC1 i mTORC2. Jedna klasa inhibitora aktivnog mesta pogodna za upotrebu u postupcima proizvodnje T ćelija predviđenim ovde su inhibitori dvojne specifičnosti koji targetiraju i direktno inhibiraju i PI3K i mTOR. Inhibitori dvojne specifičnosti vezuju se i za ATP vezujuće mesto mTOR i PI3K. Ilustrativni primeri takvih inhibitora uključuju, ali nisu ograničeni na: imidazohinazoline, vortmannin, LY294002, PI-103 (Cayman Chemical), SF1126 (Semafore), BGT226 (Novartis), XL765 (Exelixis) i NVP-BEZ235 (Novartis).
[0214] Sledeća klasa inhibitora mTOR aktivnog mesta pogodnih za upotrebu u postupcima predviđenim ovde selektivno inhibira mTORC1 i mTORC2 aktivnost u odnosu na jedan ili
4
više tip I fosfatidilinozitol 3-kinaza, npr., PI3 kinaza α, β, γ, ili δ. Ovi inhibitori aktivnog mesta vezuju se za aktivno mesto mTOR ali ne PI3K. Ilustrativni primeri takvih inhibitora uključuju, ali nisu ograničeni na: pirazolopirimidine, Torin1 (Guertin i Sabatini), PP242 (2-(4-Amino-1-izopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)-1H-indol-5-ol), PP30, Ku-0063794, WAY- 600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), i AZD8055 (Liu et al., Nature Review, 8, 627-644, 2009). I
[0215] U jednom primeru, selektivni mTOR inhibitor odnosi se na sredstvo koje pokazuje 50% inhibitorne koncentracije (IC50) u odnosu na mTORC1 i/ili mTORC2, koja je najmanje 10-puta, najmanje 20-puta, najmanje 50-puta, najmanje 100-puta, najmanje 1000-puta, ili više, niža od IC50inhibitora u odnosu na jedanu, dve, tri, ili više tip I PI3-kinaza ili na tip I PI3-kinaze.
[0216] Sledeća klasa mTOR inhibitora za upotrebu u predmetnom opisu označena je ovde kao "rapalozi". Kao što je ovde korišćeno termin "rapalozi" odnosi se na jedinjenja koja se specifično vezuju za mTOR FRB domen (FKBP rapamicin vezujući domen), strukturno su srodni rapamicinu, i zadržavaju mTOR inhibirajuće osobine. Termin rapalozi isključuje rapamicin. Rapalozi uključuju estre, etre, oksime, hidrazone, i hidroksilamine rapamicina, kao i jedinjenja u kojima su funkcionalne grupe na strukturi jezgra rapamicina modifikovane, na primer, redukcijom ili oksidacijom. Farmaceutski prihvatljive solli takvih jedinjenja se takođe smatraju derivatima rapamicina. Ilustrativni primeri rapaloga pogodnih za upotrebu u postupcima predviđenim ovde uključuju, bez ograničenja, temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca), i OSI-027 (OSI).
[0217] U jednom primeru, sredstvo je mTOR inhibitor rapamicin (sirolimus).
[0218] Primeri mTOR inhibitora za upotrebu u predmetnom opisu inhibiraju ili mTORC1, mTORC2 ili oba mTORC1 i mTORC2 sa IC50(koncentracija koja inhibira 50% aktivnosti) od oko 200 nM ili manje, poželjno oko 100 nm ili manje, još poželjnije oko 60 nM ili manje, oko 25 nM, oko 10 nM, oko 5 nM, oko 1 nM, 100 mM, 50 mM, 25 mM, 10 mM, 1 mM, ili manje. U jednom aspektu, mTOR inhibitor za upotrebu u predmetnom opisu inhibira ili mTORC1, mTORC2 ili oba mTORC1 i mTORC2 sa IC50od oko 2 nM do oko 100 nm, poželjnije od oko 2 nM do oko 50 nM, još poželjnije od oko 2 nM do oko 15 nM.
[0219] Primeri mTOR inhibitora inhibiraju ili PI3K i mTORC1 ili mTORC2 ili oba mTORC1 i mTORC2 i PI3K sa IC50(koncentracija koj ainhibira 50% aktivnosti) od oko 200 nM ili manje, poželjno oko 100 nm ili manje, još poželjnije oko 60 nM ili manje, oko 25 nM, oko 10 nM, oko 5 nM, oko 1 nM, 100 mM, 50 mM, 25 mM, 10 mM, 1 mM, ili manje. U jednom aspektu, mTOR inhibitor za upotrebu u predmetnomm opisu inhibira PI3K i mTORC1 ili mTORC2 ili oba mTORC1 i mTORC2 i PI3K sa IC50od oko 2 nM do oko 100 nm, poželjnije od oko 2 nM do oko 50 nM, još poželjnije od oko 2 nM do oko 15 nM.
[0220] Dodatni ilustrativni primeri mTOR inhibitora pogodni za upotrebu u specifičnim primerima predviđenim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na AZD8055, INK128, rapamicin, PF-04691502, i everolimus.
[0221] Pokazano je da mTOR demonstrira robusnu i specifičnu katalitičku aktivnost prema fiziološkim supstrat proteinima, p70 S6 ribozomalnoj protein kinazi I (p70S6K1) i eIF4E vezujućem proteinu 1 (4EBP1) kao što je mereno sa fosfor-specifičnim antitelima u Western blot.
[0222] U jednom primeru, inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta je s6 kinase inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: BI-D1870, H89, PF- 4708671, FMK, i AT7867.
c. PI3K inhibitori
[0223] Kao što je ovde korišćeno, Termin "PI3K inhibitor" odnosi se na nukleinsku kiselinu, peptid, jedinjenje, ili mali organski molekul koji se vezuje za i inhibira najmanje jednu aktivnost PI3K. PI3K proteini se mogu podeliti u tri klase, klasa 1 PI3Ks, klasa 2 PI3Ks, i klasa 3 PI3Ks. Klasa 1 PI3Ks postoji kao heterodimeri koje se sastoje od jedne od četiri p110 katalitičke subjedinice (p110α, p110β, p110δ, i p110γ) i jedne od dve familije regulatornih subjedinica. PI3K inhibitor prema predmetnom pornalasku poželjno targetira klasu 1 PI3K inhibitora. U jednom primeru izvođenja, PI3K inhibitor će prikazati selektivnost za jednu ili više izoformi klase 1 PI3K inhibitora (tj., selektivnost za p110α, p110β, p110δ, i p110γ ili jednu ili više od p110α, p110β, p110δ i p110γ). U sledećem aspektu, PI3K inhibitor neće prikazivati selektivnost u odnosu na izoformu i smatraće se "pan-PI3K inhibitorom." U jednom primeru izvođenja, PI3K inhibitor će se kompetitivno vezivati sa ATP sa PI3K katalitičkim domenom.
[0224] U određenim primerima izvođenja, PI3K inhibitor može, na primer, targetirati PI3K kao i dodatne proteine u PI3K-AKT-mTOR putu. U specifičnim primerima izvođenja, PI3K inhibitor koji targetira i mTOR i PI3K može se označiti kao ili mTOR inhibitor ili PI3K inhibitor. PI3K inhibitor koji targetira samo PI3K može se označiti kao selektivni PI3K inhibitor. U jednom primeru izvođenja, selektivni PI3K inhibitor može se shavtiti kao da označava sredstvo koje pokazuje 50% inhibitorne koncentracije u odnosu na PI3K koja je najmanje 10-puta, najmanje 20-puta, najmanje 30-puta, najmanje 50-puta, najmanje 100-puta, najmanje 1000-puta, ili više, niža od IC50inhibitora u odnosu na mTOR i/ili druge proteine u putu.
[0225] U specifičnom primeru izvođenja, primeri PI3K inhibitora inhibiraju PI3K sa IC50(koncentracija koja inhibira 50% aktivnosti) od oko 200 nM ili manje, poželjno oko 100 nm ili manje, još poželjnije oko 60 nM ili manje, oko 25 nM, oko 10 nM, oko 5 nM, oko 1 nM, 100 mM, 50 mM, 25 mM, 10 mM, 1 mM, ili manje. U jednom primeru izvođenja, PI3K inhibitor inhibira PI3K sa IC50od oko 2 nM do oko 100 nm, poželjnije od oko 2 nM do oko 50 nM, još poželjnije od oko 2 nM do oko 15 nM.
[0226] Ilustrativni primeri PI3K inhibitora pogodni za korišćenje u postupcima proizvodnje T ćelija predviđenim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, BKM120 (klasa 1 PI3K inhibitor, Novartis), XL147 (klasa 1 PI3K inhibitor, Exelixis), (pan-PI3K inhibitor, GlaxoSmithKline), i PX- 866 (klasa 1 PI3K inhibitor; p110α, p110β, i p110γ isoforms, Oncothyreon).
[0227] Drugi ilustrativni primeri selektivnih PI3K inhibitora uključuju, ali nisu ograničeni na BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, ZSTK474, i IPI-145.
[0228] Dodatni ilustrativni primeri pan-PI3K inhibitora uključuju, ali nisu ograničeni na BEZ235, LY294002, GSK1059615, i GDC-0941
d. AKT inhibitori
[0229] Kao što je ovde korišćeno, termin "AKT inhibitor" odnosi se na nukleinsku kiselinu, peptid, jedinjenje, ili mali organski molekul koji inhibira najmanje jednu aktivnost AKT. AKT inhibitori se mogu grupisati u nekoliko klasa, uključujući inhibitore na bazi lipida (npr., inhibitore koji targetiraju plekstrin homologi domen AKT koji sprečava AKT da se lokalizuje u plazma membranama), ATP-kompetitivne inhibitore, i alosteričke inhibitore. U jednom primeru, AKT inhibitori deluju vezivanjem sa AKT katalitičkim mestom. U specifičnom primeru, Akt inhibitori deluju inhibicijom fosforilacije nishodnih AKT targeta kao što je mTOR. U drugom primeru, AKT aktivnost je inhibirana preko inhibicije ulaznih signala koji aktiviraju Akt preko inhibicije, na primer, DNK-PK aktivacije AKT, PDK-1 aktivacije AKT, i/ili mTORC2 aktivacije Akt.
[0230] AKT inhibitori mogu targetirati sve tri AKT izoforme, AKT1, AKT2, AKT3 ili mogu biti izoforma selektivni i targetirati samo jedniu ili dve od AKT izoformi. U jednom primeru, AKT inhibitor može targetirati AKT kao i dodatne proteine u PI3K-AKT-mTOR putu. AKT inhibitor koji targetira samo AKT može se označiti kao selektivni AKT inhibitor. U jednom primeru, može se podrazumevati da selektivni AKT inhibitor označava sredstvo koje inhibira 50% inhibitorne koncentracije u odnosu na AKT koja je najmanje 10-puta, najmanje 20-puta, najmanje 30-puta, najmanje 50-puta, najmanje 100-puta, najmanje 1000-puta, ili više niža od IC50inhibitora u odnosu na druge proteine u putu.
[0231] U specifičnom primeru, primeri AKT inhibitora inhibiraju AKT sa IC50(koncentracijom koja inhibira 50% aktivnosti) od oko 200 nM ili manje, poželjno oko 100 nm ili manje, još poželjnije oko 60 nM ili manje, oko 25 nM, oko 10 nM, oko 5 nM, oko 1 nM, 100 mM, 50 mM, 25 mM, 10 mM, 1 mM, ili manje. U jednom primeru, AKT inhibira AKT sa IC50od oko 2 nM do oko 100 nm, poželjnije od oko 2 nM do oko 50 nM, još poželjnije od oko 2 nM do oko 15 nM.
[0232] Ilustrativni primeri AKT inhibitora za upotrebu u kombinaciji sa auristatin zasnovanim antitelo-lek konjugatima uključuju, na primer, perifosin (Keryx), MK2206 (Merck), VQD-002 (VioQuest), XL418 (Exelixis), GSK690693, GDC-0068, i PX316 (PROLX Pharmaceuticals).
[0233] Ilustrativni, neograničavajući primer selektivnog Akt1 inhibitora je A-674563.
[0234] Ilustrativni, neograničavajući primer selektivnog Akt2 inhibitor je CCT128930.
[0235] U specifičnom primeru, Akt inhibitor DNK-PK aktivacije Akt, PDK-1 aktivacije Akt, mTORC2 aktivacije Akt, ili HSP aktivacije Akt.
[0236] Ilustrativni primeri DNK-PK inhibitora uključuju, ali nisu ograničeni na, NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75, i PP-121.
D. Konstruisani T ćelijski receptori i himerni antigen receptori
[0237] Predviđeni postupci proizvodnje T ćelija su naročito korisni za ekspanziju T ćelija modifikovanih da eksprimiraju T ćelijske receptore visokog afiniteta (konstruisane TCRs) ili himerne antigen receptore (CARs) bez istovremenog povećanja u diferencijaciji ovih modifikovanih T ćelija. U jednom primeru izvođenja, T ćelija je genetički modifikovana da eksprimira jedan ili više konstruisanih TCRs ili CARs. Kao što je ovde korišćeno, T ćelije modifikovane da eksprimiraju konstruisani TCR ili CAR predviđen ovde mogu se označiti kao, "antigen-specifične perusmerene T ćelije."
1. Konstruisani TCRs
[0238] Prirodni T ćelijski receptori sadrže dve subjedinice, α-subjedinicu i β-subjedinicu, od kojih je svaka jedinstveni protein proizveden sa rekombinacionim događajem u svakom genomu T ćelija. Može biti izvršen skrining biblioteka TCRs u odnosu na njihovu selektivnost u odnosu na specifične target antigene. Na taj način, prirodni TCRs, koij imaju visoki aviditet i reaktivnost na antigene mogu se selektovati, klonirati, i naknadno introdukovati u populaciju T ćelija korišćenih za adoptivnu imunoterapiju.
[0239] U jednom primeru izvođenja, T ćelije su modifkovane introdukcijom polinukleotida koji kodira subjedinicu TCR koja ima sposobnost da formira TCRs koji daje specifičnost T ćelijama za tumorske ćelije koje eksprimiraju target antigen. U specifičnim primerima izvođenja, subjedinice imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, insercija, ili modifikacija u poređenju sa prirodnom subjedinicom, sve dok subjedinice zadržavaju sposobnost da formiraju TCRs koji daju nakon transfekcije T ćelijama sposobnost da pogađaju target ćelije, i učestvuju u imunološki relevantnoj citokinskoj signalizaciji. Konstruisani TCRs poželjno takođe vezuju target ćelije prikazujući relevantni tumor-povezani peptid sa visokim aviditetom, i izborno posreduju u efikasnom ubijanju target ćelija koje prikazuju relevantni peptid in vivo.
[0240] Nukleinske kiseline koje kodiraju konstruisane TCRs su poželjno izolovane iz njihovog prirodnog konteksta u (prirodnom) hromozomu T ćelija, i mogu se inkorporisati u pogodne vektore kao što je ovde opisano na drugim mestima. I nukleinske kiseline i vektori koji ih sadrže moguse korisno preneti u ćeliju, pri čemu je ćelija poželjno T ćelija. Modifikovane T ćelije su zatim sposobne da eksprimiraju jedan ili više lanaca TCR (i poželjno dva lanca) kodirana transdukovanom nukleinskom kiselinom ili nukleinskim kiselinama. U poželjnim primerima izvođenja, konstruisani TCR je egzogeni TCR jer je introdukovan u T ćelije koje normalno ne eksprimiraju specifični TCR. Esencijalni aspekt konstruisanih TCRs je da ima visok aviditet za tumorski antigen prikazan od strane glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) ili slične imunološke komponente. Za razliku od konstruisanih TCRs, CARs su konstruisani da vezuju target antigene na MHC nezavisni način.
[0241] Protein kodiran sa inventivnim nukleinskim kiselinama može se eksprimirati sa dodatnim polipeptidima vezanim za amino-termininalni ili karboksi-termininalni deo inventivnog α-lanca ili β-lanca TCR sve dok vezani dodatni polipeptid ne utiče na sposobnost α-lanca ili β-lanca da formira funkcionalni T ćelijski receptor i MHC zavisno prepoznavanje antigena.
[0242] Antigeni koji su prepoznati sa konstruisanim TCRs predviđenim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na kancer antigene, uključujući antigene i na hematološkim kancerima i solidnim tumorima. Ilustrativni antigeni uključuju, ali nisu ograničeni na alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnini AchR, FRα, GD2, GD3, Glipikan-3 (GPC3), HLAA1+ MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLAA1+ NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO- 1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D Ligande, NY-ESO- 1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, i VEGFR2.
2. Himerni antigen receptori (CARs)
[0243] Postupci proizvodnje T ćelija predviđeni ovde uključuju modifikovanje T ćelija da eksprimiraju jedan ili više CARs kao što je ovde predviđeno. U različitim primerima izvođenja, postupci prema predmetnom pornalasku obezbeđuju T ćelije genetički konstruisane sa vektorima dizajniranim da eksprimiraju CARs koji preusmeravaju citotksičnost na tumorske ćelije. CARs su molekuli koji kombinuju antitelo-zasnovanu specifičnost za target antigen (npr., tumorski antigen) sa T ćelijski, receptor-aktivirajućim intracelularnim domenom da bi se stvorio himerni protein koji pokazuje specifičnu antitumorsku ćelijsku imunu aktivnost. Kao što je ovde korišćeno, termin, "himerni," opisuje da je izgrađen od delova različitih proteina ili DNKs različitog porekla.
[0244] CARs predviđeni ovde sadrže ekstracelularni domen koji s evezuje za specifični target target antigen (takođe označen kao vezujući domen ili antigen-specifični vezujući domen), transmembranski domen i intracelulerni signalni domen. Glavna karakteristika CARs je njihova sposobnost da preusmere specifičnost imunih efektornih ćelija, čime se inicira proliferacija, proizvodnja citokina, fagocitoza ili proizvodnja molekula koji mogu posredovati u smrti ćelija target antigen eksprimirajućih ćelija na način koji je nezavisan od glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), koristeći ćelijski specifične targeting sposobnosti monoklonskih antitela, rastvorljive ligande ili specifične koreceptore ćelije.
[0245] U specifičnim primerima izvođenja, CAR sadrži ekstracellularni vezujući domen uključujući, ali se ne ograničavajući na antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, vezani ligand, ili ektracelularni domen koreceptora, koji specifično vezuje target antigen izabran iz grupe koja se sastoji od: alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalnini AchR, FRα,
4
GD2, GD3, Glipikan-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLAA2+ MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL- 13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D Ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, i VEGFR2; jedan ili više zglobnih domena ili spejser domena; transmembranski domen uključujući, ali se ne ograničavajući na, transmembranske domene od CD8α, CD4, CD45, PD- 1, i CD152; jedan ili više intracelularnih kostimulatornih signalnih domena uključujući ali se ne ograničavajući na intracelularne kostimulatorne signalne domene od CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), i CD278 (ICOS); i primarni signalni domen od CD3ζ ili FcRy.
a. Vezujući domen
[0246] U specifičnim primerima izvođenja, CARs predviđeni ovde sadrže ekstracelularni vezujući domen koji se specifično vezuje za target polipeptid, npr, target antigen, eksprimiran na tumorskoj ćeliji. Kao što je ovde korišćeno, termini, "vezujući domen," "ekstracelularni domen," "ekstracelularni vezujući domen," "antigen-specifični vezujući domen," i "ekstracelularni antigen specifični vezujući domen," su korišćeni naizmenično i obezbeđuju CAR sa sposobnošću da se specifično veže za target antigen od interesa. Vezujući domen može sadržati bilo koji protein, polipetid, oligopeptid, ili peptid koji poseduje sposobnost da specifično prepozna i veže se sa biološkim molekulom (npr., receptor na površini ćelije ili tumorski protein, lipid, polisaharid, ili drugi target molkeul na ćelijskoj površini, ili njegova komponenta). Vezujući domen uključuje bilo koji prirodno, sintetički, semi-sintetički, ili rekombinantno proizvedeni vezujući partner za biološki molekul od interesa.
[0247] U specifičnim primerima izvođenja, ekstracelularni vezujući domen CAR sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. "Antitelo" se odnosi na vezujuće sredstvo koje je polipeptid koji sadrži najmanje imunoglobulinski varijabilni region lakog lanca ili teškog lanca koji specifično prepoznaje i vezuje epitop target antigena, kao što je peptid, lipid, polisaharid, ili nukleinska kiselina koja sadrži antigenu determininantu, kao što su one prepoznate od strane imune ćelije. Antitela uključuju njihove antigen vezujuće fragmente. Ovaj terminin takođe uključuje genetički konstruisane forme kao što su himerna antitela (na primer, humanizovana mišja antitela), heterokonjugatska antitela (kao što su bispecifična antitela) i njihove antigen-vezujuće fragmente. Vidi i Pierce Catalog i Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997.
[0248] U specifičnim primerima izvođenja, target antigen je epitop alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, Glipikan-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLAA2+ MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL- 13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D Ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, ili VEGFR2 polipeptid.
[0249] Varijabilni regioni lakog i teškog lanca sadrže "okvirni" region isprekidan umetanjem tri hipervarijabilna regiona koji se nazivaju još i "regioni koji određuju komplementarnost" ili "CDR". CDR mogu da se definišu ili identifikuju konvencionalnim postupcima, kao što su sekvenca prema Kabat et al (Wu, TT i Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. i Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (vidi, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health i Human Services, 1991), ili struktura prema Chothia et al (Choithia, C. i Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987), Choithia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883 (1989)).
[0250] Sekvence okvirnih regiona različitih lakih ili teških lanaca relativno su konzervirane unutar vrste kao što je na primer ljudska vrsta. Okvirni region antitela, koji je kombinovani okvirni region konstituentnog lakog i teškog lanca, služi za pozicioniranje i poravnavanje CDR u trodimenzionalnom prostoru. CDR su prvenstveno odgovorni za vezivanje sa epitopom antigena. CDR svakog lanca se tipično označavaju kao CDR1, CDR2 i CDR3, numerisani redom počevši od N-termininusa i takođe se tipično identifikuju po lancu u kojem je lociran određeni CDR. Prema tome, CDR locirani u varijabilnom domenu teškog lanca antitela označeni su kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3, dok su CDR locirani u varijabilnom domenu lakog lanca antitela označeni kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3. Antitela sa različitim specifičnostima (tj., različitim kombinujućim mestima za različite antigene) imaju različite CDR. Iako su CDR ti koji variraju od jednog do drugog antitela, samo je ograničen broj aminokiselinskih pozicija unutar CDR direktno uključen u vezivanje antigena. Ove pozicije unutar CDR nazivaju se ostaci koji određuju specifičnost (SDR).
[0251] Upućivanje na "VH" ili "VH" odnosi se na varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca, uključujući onaj iz antitela, Fv, scFv, dsFv, Fab, ili drugog fragmenta antitela, kako je objavljeno u ovom tekstu. Pozivanje na "VL" ili "VL" odnosi se na varijabilni region imunoglobulinskog lakog lanca, uključujući onaj iz antitela, Fv, scFv, dsFv, Fab, ili drugog fragmenta antitela, kako je objavljeno u ovom tekstu.
[0252] "Monoklonsko antitelo" je antitelo koje je proizveo jedan klon B limfocita ili ćelija u koju su transfektovi anigeni lakog i teškog lanca jednog antitela. Monoklonska antitela proizvedena su postupcima poznatim stručnjacima u oblasti, na primer pravljenjem hibridnih ćelija koje formiraju antitelo, fuzijom ćelija mijeloma sa imunskim ćelijama slezine. Monoklonska antitela uključuju humanizovana monoklonska antitela.
[0253] "Himerno antitelo" ima ostatke okvirnog regiona iz jedne vrste, na primer iz čoveka, a CDR (koji su generalno odgovorni za vezivanje antigena) iz druge vrste, na primer iz miša. Naročito poželjni primeri izvođenja, CAR razmatran u ovom tekstu sadrži antigen-specifični vezujući domen koji je himerno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.
[0254] U određenim poželjnim primerima izvođenja, antitelo je humanizovano antitelo (kao što je humanizovano monoklonsko antitelo) koje se specifično vezuje za površinski protein na tumorskoj ćeliji. "Humanizovano" antitelo je imunoglobulin koji uključuje humani okvirni region i jedan ili više CDR iz nehumanog (na primer mišjeg, pacovskog ili sintetskog) imunoglobulina. Humanizovana antitela mogu biti konstruisana pomoću genetičkog inženjeringa (videti na primer SAD patent br.5,585,089).
[0255] U posebnim primerima izvođenja, ekstracelularni vezujući domen CAR sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, uključujući, ali bez ograničenja na kamelidni Ig (kamelidno antitelo (VHH)), Ig NAR, Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab)’2 fragmente, F(ab)’3 fragmente, Fv, jednolančano Fv antitelo ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minitelo, dijatelo, trijatelo, tetratelo, disulfidnom vezom stabilisani Fv protein ("dsFv") i jednodomenako antitelo (sdAb, nanotelo).
[0256] "Kamelidnil Ig" ili "kamelidni VHH" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na najmanju poznatu antigen-vezujuću jedinicu teškolančanog antitela (Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). "Teškolančano antitelo " ili "kamelidno antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži dva VH domena i ne sadrži lake lance (Riechmann L. et al, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999); WO94/04678; WO94/25591; U.S. patent br.6,005,079).
[0257] "IgNAR" ili "immunoglobulinski novi antigenski receptor" odnosi se na klasu antitela iz imunskog repertoara ajkule, koja se sastoje od homodimera sačinjenih od jednog varijabilnog novog antigen-receptorskog (VNAR) domena i pet konstantnih novih antiigenreceptorskih (CNAR) domena.
[0258] Digestija antitela papainom proizvodi dva identična antigen-vezujuća fragmenta, koji se nazivaju "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigen-vezujućim mestom i rezidualni "Fc"
4
fragment, čije ime reflektuje njegovu sposobnost da lako podleže kristalizaciji. Fab fragment sadrži varijabilne domene teškog i lakog lanca i sadrži još i konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH-1) teškog lanca. Fab’ fragmenti razlikuju se od Fab fragmenata po dodavanju nekoliko rezidua na karboksi termininusu teškolančanog CH1 domena uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zgloba antitela. Fab’-SH je u ovom tekstu oznaka za Fab’ u kojem jedna ili više cisteinskih ostataka konstantnih domena nose slobodnu tiolnu grupu. F(ab’)2 fragmenti antitela originalno se proizvode kao parovi Fab’ fragmenata koji između sebe imaju cisteine zgloba. Poznati su i drugi načini hemijskog povezivanja fragmenata antitela.
[0259] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno antigen-vezujuće mesto. U jednolančanim Fv (scFv) vrstama, jedan varijabilni domen teškog i jedan lakog lanca mogu se kobvalentno vezati fleksibilnim peptidnim linkerom tako da se laki i teški lanci mogu povezati u "dimernu" strukturu analognu onoj u dvolančanim Fv vrstama.
[0260] Izraz "dijatela" odnosi se na fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, fragmenti uključuju teškolančani varijabilni domen (VH) spojen sa lakolančanim varijabilnim domenom (VL) u istom polipeptidnom lancu (VHVL). Korišćenjem linkera koji je prekratak da bi dozvolio sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prinuđeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i tako kreiraju dva antigen-vezujuća mesta. Dijatela mogu biti bivalentna ili bispecifična. Dijatela su opisana potpunije u, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su opisana u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
[0261] "Jednodomenako antitelo" ili "sdAb" ili "nanotelo" odnosi se na fragment antitela koji se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca antitela (VH domen) ili varijabilnog regiona lakog lanca antitela (VL domen) (Holt, L., et al, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
[0262] "Jednolančani Fv" ili "scFv" fragmenti antitela uključuju VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu i u jednoj orijentaciji (npr., VL-VH ili VH-VL). Uopšteno, scFv polipeptid uključuje još i polipeptidni linker između VH i VL domena, koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje sa antigenom. Za pregled scFv, vidi, npr., Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antitela, vol. 113, Rosenburg i Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp.269-315.
[0263] U poželjnim primerima izvođenja, CAR predviđen ovde sadrži antigen-specifični vezujući domen koji je scFv (mišji, humani ili humanizovani scFv) koji vezuje antigen eksprimiran na ćeliji kancera. U određenom primeru izvođenja, scFv vezuje alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, ’Glipikan-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NYESO- 1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D Ligande, NYESO- 1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, i VEGFR2.
b. Linkeri
[0264] U određenim primerima izvođenja, CAR razmatrani u ovom tekstu sadrže linkerske ostatke između različitih domena, npr., između VHi VLdomena dodate za održavanje pogodnog razmaka i konformacije molekula. CAR razmatrani u ovom tekstu mogu sadržati jedan, dva, tri, četiri ili pet ili više linkera. U određenim primerima izvođenja, dužina linkera može iznositi oko 1 do oko 25 amino-kiselina, oko 5 do oko 20 amino-kiselina, ili oko 10 do oko 20 amino-kiselina, ili dužina linkera može iznositi bilo koji broj amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, linker je dug 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ili više amino-kiselina.
[0265] Ilustrativni primeri linkera uključuju glicinske polimere (G)n; glicin-serinske polimere (G1-5S1-5)n, gde je n ceo broj od najmanje jedan, dva, tri, četiri ili pet; glicin-alaninske polimere; alanin-serinske polimere; i druge fleksibilne linkere poznate u tehnici. Glicinski i glicin-serinski polimeri su relativno nestrukturirani i zato mogu služiti kao neutralni dodaci između domena fuzionih proteina kao što su CAR opisani u ovom tekstu. Glicin pristupa značajno većem fi-psi prostora nego čak i alanin, i mnogo je manje ograničen nego ostatke sa dužim bočnim lancima (vidi Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Uobičajeno obučen stručnjak prepoznaće da dizajn CAR u određenim primerima izvođenja sadrži linkere koji su u celini ili delom fleksibilni, tako da linker sadrži fleksibilni linker, kao i jedan ili više delova koji daju manje fleksibilnu strukturu, da bi se obezbedila željena struktura CAR.
[0266] Drugi primeri linkera uključuju, ali se ne ograničavaju na sledeće aminokiselinske sekvence: GGG; DGGGS (SEQ ID NO: X); TGEKP (SEQ ID NO: X) (vidi, npr., Liu et al., PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (SEQ ID NO: X) (Pomerantz et al.1995, gore); (GGGGS)ngde = 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO: X) (Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996.);
4
EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: X) (Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: X) (Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (SEQ ID NO: X); LRQRDGERP (SEQ ID NO: X); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: X); LRQKd(GGGS)2ERP (SEQ ID NO: X). Alternativno, fleksibilni linkeri mogu racionalno da se dizajniraju korišćenjem kompjuterskog programa koji može da modeluje DNK-vezujuća mesta i same peptide (Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994)) ili metodima prikazivanja fagima.
[0267] U specifičnim primerima izvođenja CAR sadrži scFV koji dodatno sadrži vezujuću sekvencu varijabilnog regiona. "Vezujuća sekvenca varijabilnog regiona," je aminokiselinska sekvenca koja povezuje varijabilni region teškog lanca sa varijabilnim regionom lakog lanca i obezbeđuje spejsersku funkciju kompatibilnu sa interakcijom dva sub-vezujuća domena tako da rezultujući polipeptid zadržava afinitet specifičnog vezivanja za isti target molekul kao antitelo koje sadrži iste varijabilen regione lakog i teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, vezujuća sekvenca varijabilnog regiona je dugačka 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ili više aminokiselina. U specifičnom primeru izvođenja, vezujuća sekvenca varijabilnog regiona sadrži glicineserin polimer (G1-5S1-5)n, gde n je ceo broj od najmanje 1, 2, 3, 4, ili 5. U sledećem primeru izvođenja, vezujuća sekvenca varijabilnog regiona sadrži (G4S)3aminokiselinski linker.
c. Spejser domen
[0268] U posebnim primerima izvođenja, vezujući domen CAR može biti praćen jednim ili većim brojem "spejserskih domena", što se odnosi na region koji pomera antigen-vezujući domen od površine efektorske ćelije da bi se omogućio dobar kontakt između dve ćelije, vezivanje antigena i aktivaciju (Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). Spejser domen se može izvesti iz prirodnog, sintetičkog, semi-sintetičkog, ili rekombinantnog izvora. U određenim primerima izvođenja, spejser domen je deo imunoglobulina, uključujući, ali se ne ograničavajući na, jedan ili više konstantnih regiona teškog lanca, npr., CH2 i CH3. Spejser domen sadrži aminokiselinsku sekvencu prirodnog imunoglobulinskog zglobnog regiona ili izmenjeni imunoglobulinski zglobni region.
[0269] U jednom primeru izvođenja, spejser domen sadrži CH2 i CH3 od IgG1.
d. Zglobni domen
4
[0270] Vezujući domen CAR je generalno praćen sa jednim ili više "zglobnih domena," koji imaju ulogu u pozicioniranju antigen vezujućeg domena dalje od površine efektorne ćelije da bi se omogućio ispravan kontakt ćelija/ćelija, vezivanje antigena i aktivacija. CAR generalno sadrži jedan ili više zglobnih domena između vezujućeg domena i transmembranskog domena (TM). Zglobni domen može biti poreklom iz prirodnog, sintetskog, semi-sintetskog ili rekombinantnog izvora. Zglobni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu prirodnog imunoglobulinskog zglobnog regiona ili izmenjenog imunoglobulinskog zglobnog regiona.
[0271] Ilustrativni zglobni domeni pogodni za upotrebu u CAR opisanim u ovom tekstu uključuju zglobni region izveden iz vanćelijskih regiona membranskih proteina tipa 1 kao što su CD8α, CD4, CD28 i CD7, koji mogu biti zglobni regioni divljeg tipa iz ovih molekula ili mogu biti izmenjeni. U sledećem primeru izvođenja, zglobni domen sadrži CD8α zglobni region.
e. Transmembranski (TM) domen
[0272] "Transmembranski domen" je deo CAR koji spaja vanćelijski vezujući deo i unutarćelijski signalni domen i ukotvljuje CAR u ćelijsku membranu imune efektorske ćelije. TM domen može biti poreklom iz prirodnog, sintetskog, polu-sintetskog ili rekombinantnog izvora.
[0273] Ilustrativni TM domeni mogu biti izvedeni iz (tj., uključivati najmanje transmembranski region/transmembranske regione) alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD3 epsilon, CD3 zeta, CD4, CD5, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152 i CD154.
[0274] U jednom primeru izvođenja, CAR razmatrani u ovom tekstu sadrže TM domen izveden iz CD8α. U sledećem primeru izvođenja, CAR razmatran ovde sadrži TM domen izveden iz CD8α i kratki oligo- ili polipeptidni linker, dug poželjno između 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 amino-kiselina, koji povezuje TM domen i unutarćelijski signalni domen CAR. Linker glicin-serin posebno je pogodan linker.
f. Uunutarćelijski signalni domen
[0275] U posebnim primerima izvođenja, CAR razmatrani ovde sadrže unutarćelijski signalni domen. "Unutarćelijski signalni domen" odnosi se na deo CAR koji učestvuje u prenošenju poruke efektivnog CAR vezivanja za ciljni antigen, u unutrašnjost imune efektorske ćelije da
4
bi se pobudila funkcija efektorske ćelije, npr., aktivacija, proizvodnja citokina, proliferacija i citotoksična aktivnost, uključujući oslobađanje citotoksičnih faktora u CAR-vezanu ciljnu ćeliju, ili drugi ćelijski odgovori podstaknuti vezivanjem antigena za vanćelijski CAR domen.
[0276] Izraz "efektorska funkcija" odnosi se na specijalizovanu funkciju ćelije. Efektorska funkcija T ćelije, na primer, može biti citolitička aktivnost ili pomoć ili aktivnost koja uključuje sekreciju citokina. Prema tome, izraz "unutarćelijski signalni domen" odnosi se na deo proteina koji sprovodi efektorski funkcijski signal i usmerava ćeliju da obavi sprecijalizovanu funkciju. Iako se obično može koristiti čitav unutarćelijski domen, u mnogim slučajevima do nije neophodno. U vezi sa merom skraćenja unutarćelijskog signalnog domena, skraćeni deo može da se koristi umesto celog domena dokle god prenosi efektorski funkcionalni signal. Izraz unutarćelijski signalni domen uključuje svaki skraćeni deo unutarćelijskog signalnog domena koji je dovoljan da sprovede efektorski funkcionalni signal.
[0277] Poznato je da signali koji se generišu samo preko TCR nisu dovoljni za punu aktivaciju T ćelija i da je potreban i sekundarni ili kostimulatorni signal. Prema tome, može se reći da aktivacija T ćelije može biti posredovana uključivanjem dveju različitih klasa unutarćelijskih signalnih domena: primarnog signalnog domena koji inicira antigen-zavisnu primarnu aktivaciju preko TCR (npr., TCR/CD3 kompleksa) i kostimulatornog signalnog domena koji deluju na antigen-nezavisan način, da bi se obezbedio sekundarni ili kostimulatorni signal. U poželjnim primerima izvođenja, CAR razmatran u ovom tekstu sadrži unutarćelijski signalni domen koji uključuje jedan ili više "kostimulatornih signalnih domena" i "primarni signalni domen".
[0278] Primarni signalni domeni regulišu primarnu aktivaciju TCR kompleksa na stimulatoran ili na inhibitoran način. Primarni signalni domeni koji deluju na stimulatoran način mogu sadržati signalne motive koji su poznati kao imunoreceptorski aktivacioni motivi bazirani na tirozinu ili ITAM.
[0279] Ilustrativni primeri ITAM-sadržavajućih primarnih signalnih domena koji su posebno korisni u pronalasku uključuju one koji su izvedeni iz TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b i CD66d. U posebnim poželjnim primerima izvođenja, CAR sadrži CD3ζ primarni signalni domen i jedan ili više kostimulatornih signalnih domena. Unutarćelijski primarni signalni i kostimulatorni signalni domen mogu biti povezani bilo kojim redom u tandemu za karboksi termininus transmembranskog domena.
[0280] CAR razmatrani u ovom tekstu uključuju jedan ili više kostimulatornih signalnih domena za pojačanje efikasnosti i ekspanzije T ćelija koje eksprimiraju CAR receptore. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "kostimulatorni signalni domen" ili "kostimulatorni domen",
4
odnosi se na unutarćelijski signalni domen kostimulatornog molekula.
[0281] Ilustrativni primeri takvih kostimulatornih molekula uključuju CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS (CD278), CTLA4, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, TRIM, LCK3, SLAM, DAP10, LAG3, HVEM, i NKD2C, i CD83. U jednom primeru izvođenja, CAR sadrži jedan ili više kostimulatornih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od CD28, CD137, i CD134, i CD3ζ primarnog signalnog domena.
[0282] U jednom primeru izvođenja, CAR sadrži scFv koji vezuje alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, Glipikan-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLAA2+ MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL- 13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D Ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, ili VEGFR2 polipeptid; transmembranski domen izveden iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8α; CD4, CD45, PD-1, i CD152; i jedan ili više intracelularnih kostimulatornih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD54, CD134, CD137, CD152, CD273, CD274, i CD278; i CD3ζ primarni signalni domen.
[0283] U sledećem primeru izvođenja, CAR sadrži scFv koji vezuje alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, Glipikan-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLAA2+ MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL- 13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D Ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, ili VEGFR2; zglobni domen izabran iz grupe koja se sastoji od: IgG1 zgloba/CH2/CH3 i CD8α, i CD8α; transmembranski domen izveden iz polipeptida izabran iz grupe koja se sastoji od: CD8α; CD4, CD45, 43 44 PD-1, i CD152; i jedan ili više intracelularnih kostimulatornih signalnih domena izabran iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD134, i CD137; i CD3ζ primarnog signalnog domena.
[0284] U sledećem primeru izvođenja, CAR sadrži scFv, dodatno sadrži linker, koji vezuje alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7- H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171,
4
CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, Glipikan-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLAA2+ MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL- 13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D Ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, ili VEGFR2 polipeptid; zglobni domen izabran iz grupe koja se sastoji od: IgG1 zgloba/CH2/CH3 i CD8α, i CD8α; transmembranski domen koji sadrži TM domen izveden iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8α; CD4, CD45, PD-1, i CD152, i kratki oligo- ili polipeptid linker, poželjno dužine između 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselina koji vezuje TM domen sa intracelullarnim signalnim domenom CAR; i jedan ili više intracelularnih kostimulatornih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD134, i CD137; i CD3ζ primarnog signalnog domena.
[0285] U specifičnom primeru izvođenja, CAR sadrži scFv koji vezuje alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, Glipikan-3 (GPC3), HLAA1+ MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLAA1+ NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO- 1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D Ligande, NY-ESO- 1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, i VEGFR2 polipeptid; zglobni domen koji sadrži CD8α polipeptid; CD8α transmembranski domen koji sadrži polipeptidni linker od oko 3 aminokiseline; jedan ili više intracelularnih kostimulatornih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD134, i CD137; i CD3ζ primarnog signalnog domena.
E. Polipeptidi
[0286] Predmetni pronalazak razmatra, delimično, konstruisane TCR i CAR polipeptide i njihove fragmente, ćelije i kompozicije koje ih sadrže, i vektore koji eksprimiraju polipeptide. "Polipeptid", "polipeptidni fragment", "peptid" i "protein" koriste se naizmenično, ukoliko nije drugačije specifikovano, i u skladu sa konvencionalnim značenjem, tj., kao sekvenca amino-kiselina. Polipeptidi nisu specifično ograničeni dužinom, npr., sadrže proteinsku sekvencu pune dužine ili fragment proteina pune dužine, i sadrže posttranslacione modifikacije polipeptida, na primer, glikozilacije, acetilacije, fosforilacije i slično, kao i druge modifikacije poznate u tehnici, koje se sreću u prirodi i koje se ne sreću u prirodi. U različitim primerima izvođenja, polipeptidi razmatrani u ovom tekstu sadrže signalnu (ili lidersku) sekvencu na N-termininalnom kraju proteina, koja vrši ko-translaciono ili post-translaciono usmeravanje transporta proteina. Ilustrativni primeri odgovarajućih signalnih sekvenci korisnih u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na signalnu sekvencu teškog lanca IgG1 i CD8α signalnu sekvencu. Polipeptidi mogu da se pripreme korišćenjem bilo koje od različitih dobro poznatih rekombinantnih tehnika i/ili tehnika veštačke sinteze. Polipeptidi razmatrani u ovom tekstu specifično obuhvataju CAR predmetne objave, ili sekvence koje imaju delecije, adicije i/ili supstitucije jedne ili više amino-kiselina polipeptida kao što je ovde razmatran.
[0287] Polipeptidi uključuju "polipeptidne varijante". Polipeptidne varijante mogu da se razlikuju od polipeptida koji se sreću u prirodi po jednoj ili više supstitucija, delecija, adicija i/ili insercija. Takve varijante mogu biti one koje se sreću u prirodi ili mogu biti sintetski stvorene, na primer, modifikovanjem jedne ili više gornjih polipeptidnih sekvenci. Na primer, u posebnim primerima izvođenja može biti poželjno poboljšati vezujući afinitet i/ili druge biološke osobine konstruisanih TCR ili CAR uvođenjem jedne ili više supstitucija, delecija, adicija i/ili insercija. Poželjno, polipeptidi prema pronalasku uključuju polipeptide sa najmanje oko 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99% aminokiselinske identičnosti sa tim.
[0288] Polipeptidi uključuju "polipeptidne fragmente". "Polipeptidni fragmenti" odnosi se na polipeptid, koji može biti monomeran ili multimeran, koji nosi aminotermininalnu deleciju, karboksitermininalnu deleciju, i/ili unutrašnju deleciju ili supstituciju prirodnog ili rekombinantno proizvedenog polipeptida. U određenim primerima izvođenja, olipeptidni fragment sadrži aminokiselinski lanac dug najmanje 5 do oko 500 amino-kiselina. Podrazumeva se da u određenim primerima izvođenja, fragmenti su dugi najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ili 450 amino-kiselina.
[0289] Polipeptid može biti fuzionisan i "u okviru čitanja" ili konjugovan sa linkerom ili drugom sekvencom za lakšu sintezu, prečišćavanje ili identifikaciju polipeptida (npr., poli-His), ili pojačavanje vezivanja polipeptida za čvrstu podlogu.
[0290] Kako je prethodno napomenuto, polipeptidi prema pronalasku mogu biti izmenjeni na različite načine uključujući aminokiselinske supstitucije, delecije, trunkacije i insercije. Metodi takvih manipulacije uopšteno su poznati u tehnici. Na primer, varijantne
1
aminokiselinske sekvence referentnog polipeptida mogu se pripremiti mutacijom u DNK. Metodi mutageneze i izmene nukleotidne sekvence dobro su poznati u tehnici. Vidi, na primer, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), U.S. pat. br.4,873,192, Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) i tamo navedene reference. Uputstva o pogodnim aminokiselinskim supstitucijama koje ne utiču na biološku aktivnost proteina od interesa mogu se naći u modelu Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence i Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
[0291] U određenim primerima izvođenja, varijanta će sadržati konzervativne supstitucije. "Konzervativna supstitucija" je ona u kojoj je amino-kiselina supstituisana drugom aminokiselinom koja ima slične osobine, tako da stručnjak u oblasti hemije peptida može očekivati da sekundarna struktura i hidropatska priroda polipeptida budu suštinski neizmenjene. Modifikacije se mogu napraviti u strukturi polinukleotida i polipeptida prema predmetnom pronalasku, a da se i dalje dobija funkcionalni molekul koji kodira varijantni ili izvedeni polipeptid sa željenim karakteristikama.
[0292] Polipeptidne varijante uključuju još i glikozilovane forme, agregativne konjugate sa drugim molekulima i kovalentne konjugate sa nesrodnim hemijskim komponentama (npr., pegilisanim molekulima). Kovalentne varijante mogu se pripremiti povezivanjem funkcionalnosti sa grupama koje se nalaze u aminokiselinskom lancu ili na N- ili C-termininalnom ostatku, kao što je poznato u tehnici. Varijante takođe uključuju alelske varijante, vrsne varijante i muteine. Trunkacije ili delecije regiona, koje ne utiču na funkcionalnu aktivnost proteina takođe su varijante.
[0293] U jednom primeru izvođenja, kada je poželjna ekspresija dva ili više polipeptida, polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju mogu biti razdvojene IRES sekvencom, o čemu se govori na drugom mestu u ovom tekstu. U sledećem primeru izvođenja, dva ili više polipeptida mogu da se eksprimiraju kao fuzioni protein koji uključuje jednu ili više samoisecajućih polipeptidnih sekvenci.
[0294] Polipeptidi prema predmetnom pronalasku uključuju fuzione polipeptide. U poželjnim primerima izvođenja, obezbeđeni su fuzioni polipeptidi i polinukleotidi koji kodiraju fuzione polipeptide. Fuzioni polipeptidi i fuzioni proteini odnose se na polipeptid sa najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, ili deset ili više polipeptidnih segmenata. Fuzioni polipeptidi su tipično spojeni C-termininusom za N-termininus, mada mogu biti spojeni i C-termininusom za C-termininus, N-termininusom za N-termininus, ili N termininusom za C-termininus. Polipeptidi fuzionog proteina mogu biti postavljeni bilo kojim redom ili
2
određenim redom. Fuzioni polipeptidi ili fuzioni proteini sadrže i konzervativno modifikovane varijante, polimorfne varijante, alele, mutante, subsekvence i međuvrsne homologe, dokle god je očuvana željena transkripciona aktivnost fuzionog polipeptida. Fuzioni polipeptidi mogu se proizvesti hemijskim metodima sinteze ili uspostavljanjem hemijkih veza između dve komponente ili mogu uopšteno da se pripreme korišćenjem drugih standardnih tehnika. Vezane DNK sekvence koje uključuju fuzioni polipeptid operabilno su povezane sa pogodnim transkripcionim ili translacionim kontrolnim elementima, o čemu se govori na drugom mestu u ovom tekstu.
[0295] U jednom primeru izvođenja fuzioni partner sadrži sekvencu koja pomaže u eksprimiranju proteina (ekspresioni enhenser) sa većim prinosom od nativnog rekombinantnog proteina. Drugi fuzioni partneri mogu se birati tako da povećaju solubilnost proteina ili da omoguće da se protein uputi ka željenim unutarćelijskim kompartmentima ili da se olakša transport fuzionog proteina kroz ćelijsku membranu.
[0296] Fuzioni polipeptidi sadrže još i polipeptid-isecajući signal između svakog od polipeptidnih domena opisanih u ovom tekstu. Pored toga, polipeptidno mesto može biti smešteno u bilo koju linkersku peptidnu sekvencu. Primeri polipeptid-isecajućih signala uključuju mesta prepoznavanja isecanja polipeptida kao što su mesta sečenja proteazom, mesta sečenja nukleazom (npr., masta prepoznavanja za retke restrikcione enzime, mesta prepoznavanja za samoisecajući ribozim) i samoisecajuće virusne oligopeptide (vidi deFelipe i Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26).
[0297] Pogodna mesta za sečenje proteazom i samoisecajući peptidi poznati su stručnjaku u oblasti (vidi, npr., u Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). Primeri mesta sečenja proteazom uključuju, ali se ne ograničavaju na mesta sečenja za potivirusne NIa proteaze (npr., proteaza virusa graviranosti duvana), potivirusne HC proteaze, potivirusne P1 (P35) proteaze, biovirusne NIa proteaze, biovirusne RNK-2-kodirane proteaze, aftovirusne L proteaze, enterovirusne 2A proteaze, rinovirusne 2A proteaze, pikorna 3C proteaze, komovirusne 24K proteaze, nepovirusne 24K proteaze, RTSV ("tungro" sferični virus pirinča) 3C-slična proteaza, PYVF (virus žute pegavosti paškanata) 3C-slična proteaza, heparin, trombin, faktor Xa i enterokinaza. Zbog visoke stringentnosti sečenja, u jednom primeru izvođenja poželjna su mesta sečenja za TEV (virus graviranosti duvana) proteazu, npr., EXXYXQ(G/S) (SEQ ID NO:), na primer, ENLYFQG (SEQ ID NO:) i ENLYFQS (SEQ ID NO:), gde X predstavlja bilo koju aminokiselinu (sečenje putem TEV dešava se između Q i G ili Q i S).
[0298] U specifičnom primeru izvođenja samoisecajući peptidi sadrže polipeptidne sekvence koje su dobijene iz peptida potivirusa i kardiovirusa 2A, FMDV (virus slinavke i šapa), virusa rinitisa A konja, Thosea asigna virusa i prasećeg teshovirusa.
[0299] U određenim primerima izvođenja samoisecajuće polipeptidno mesto sadrži 2A ili 2A-slično mesto, sekvencu ili domen (Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol.82:1027-1041).
E. POLINUKLEOTIDI
[0300] U specifičnim primerima izvođenja obezbeđeni su polinukleotidi koji kodiraju jedan ili više konstruisanih TCR ili CAR polipeptida predviđenih ovde. Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "polinukleotid" ili "nukleinska kiselina" odnose se na informacionu RNK (iRNA), RNK, genomsku RNK (gRNK), plus lanac RNK (RNK(+)), minus lanac RNK (RNK(-)), genomsku DNK (gDNK), komplementarnu DNK (cDNK) ili rekombinantnu DNK. Polinukleotidi uključuju jednolančane i dvolančane polinukleotide. Poželjno, polinukleotidi prema pronalasku uključuju polinukleotide ili varijante sa najmanje oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sekvencione identičnosti sa bilo kojom od referentnih sekvenci opisanih u ovom tekstu (videti, npr., Listu sekvenci), pri čemu tipično varijante zadržavaju najmanje jednu biološku aktivnost referentne sekvence. U različitim ilustrativnim primerima izvođenja, predmetni pronalazak predviđa polinukleotide koji uključuju ekspresione vektore, virusne vektore i transfer-plazmide, i kompozicije, i ćelije koje sadrže iste.
[0301] U specifičnim primerima izvođenja mogu se obezbediti polinukleotidi prema predmetnom pronalasku koji kodiraju najmanje oko 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750, ili 2000 ili više kontinuiranih ostataka aminokiselina u polipeptidu prema pronalasku, kao i sve interminedijarne dužine. Lako će se razumeti da "interminedijarne dužine" u ovom kontekstu označavaju svaku dužinu između navedenih vrednosti, na primer, 6, 7, 8, 9, itd., 101, 102, 103, itd; 151, 152, 153, itd; 201, 202, 203, itd.
[0302] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "polinukleotidna varijanta" i "varijanta" i slično, odnose se na polinukleotide koji pokazuju bitnu sekvencionu identičnost sa referentnom polinukleotidnom sekvencom ili polinukleotidima koji se hibridizuju sa referentnom sekvencom pod stringentnim uslovima definisanim kasnije u ovom tekstu. Ovi izrazi uključuju polinukleotide u kojima su jedan ili više nukleotida dodati ili deletovani, ili zamenjeni različitim nukleotidima u poređenju sa referentnim polinukleotidom. U tom pogledu, u tehnici se podrazumeva da se u referentnom polinukleotidu mogu izvesti određene promene koje uključuju mutacije, adicije, delecije i supstitucije, pri čemu izmenjeni
4
polinukleotid zadržava biološku funkciju ili aktivnost referentnog polinukleotida.
[0303] Izrazi "sekvenciona identičnost" ili, na primer, izrazi koji obuhvataju "sekvencu koja je 50% identična sa", kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na meru u kojoj su sekvence identične na osnovu poređenja "nukleotid po nukleotid" ili "amino-kiselina po aminokiselina" u prozoru poređenja. Prema tome, "procenat sekvencione identičnosti" može se izračunati upoređivanjem dve optimalno poravnate sekvence u prozoru poređenja, uz određivanje broja pozicija na kojima se u obe sekvence sreću identična baza nukleinske kiseline (npr., A, T, C, G, I) ili identična aminokiselinska rezidua (npr., Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys i Met) da bi se dobio broj uparenih pozicija, deljenjem broja uparenih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u prozoru poređenja (tj., veličina prozora), i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat sekvencione identičnosti. Uključeni su nukleotidi i polipeptidi koji imaju najmanje oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sekvencione identičnosti sa bilo kojom od referentnih sekvenci opisanih u ovom tekstu, tipično gde polippetidna varijanta zadržava najmanje jednu biološku aktivnost referentnog polipeptida.
[0304] Izrazi upotrebljeni za opisivanje sekvencionog odnosa između dva ili više polinukleotida ili polipeptida uključuju "referentnu sekvencu", "prozor poređenja", "sekvencionu identičnost", "procenat sekvencione identičnosti" i "suštinsku identičnost". "Referentna sekvenca" je duga najmanje 12, ali često 15 do 18 i često najmanje 25 monomernih jedinica, uključujući nukleotide i amino-kiselinske ostatke. Zbog toga što svaki od dva polinukleotida sadrži (1) sekvencu (tj., samo deo kompletne polinukleotidne sekvence) koja je slična između dva polinukleotida, i (2) sekvencu koja se razlikuje kod dva polinukleotida, poređenja sekvenci između dva (ili više) polinukleotida se tipično izvode upoređivanjem sekvenci dva polinukleotida duž "prozora poređenja", da bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sekvencione sličnosti. "Prozor poređenja" odnosi se na konceptualni segment od najmanje 6 kontinuiranih pozicija, obično oko 50 do oko 100, češće oko 100 do oko 150, u kojima se sekvenca upoređuje sa referentnom sekvencom sačinjenom od istog broja kontinuiranih pozicija, posle optimalnog poravnavanja dveju sekvenci. Za optimalno poravnavanje dveju sekvenci, prozor poređenja sadrži adicije ili delecije (tj., procepe) od oko 20% ili manje u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne uključuje adicije ili delecije). Optimalno poravnavanje sekvenci za poravnavanje prozora poređenja može se izvesti kompjuterizovanom implementacijom algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) ili ispitivanjem i najboljim poravnavanjem (tj., koje za rezultat ima najviši procenat homologije u prozoru poređenja) dobijenim bilo kojim metodom odabranim između više različitih metoda. Upućivanje se takođe može izvršiti na BLAST familiju programa, kako je na primer objavljeno u Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Detaljno razmatranje analize sekvenci može se naći u Jedinici 19.3, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Poglavlje 15.
[0305] Polinukleotidi prema predmetnom pronalasku, bez obzira na dužinu same kodirajuće sekvence, mogu se kombinovati sa drugim DNK sekvencama, kao što su promotori i/ili enhenseri, netranslatujući regioni (untranslated regions, UTR), signalne sekvence, Kozakove sekvence, poliadenilacioni signali, dodatna mesta za restrikcione enzime, višestruka mesta kloniranja, mesta unutrašnjeg ulaska ribozoma (internal ribosomal entry sites, IRES), mesta prepoznavanja za rekombinazu (npr., LoxP, FRT i Att mesta), termininacioni kodoni, signali termininacije transkripcije, i polinukleotidi koji kodiraju samoisecajuće polipeptide, epitopski tagovi, kako je objavljeno na drugom mestu u ovom tekstu ili kako je poznato u tehnici, tako da njihova ukupna dužina može značajno varirati. Stoga se smatra da polinukleotidni fragment skoro svake dužine može da se upotrebi, pri čemu je ukupna dužina poželjno ograničena jednostavnošću pripreme i upotrebom u protokolu rekombinantne DNK kojem je namenjen.
[0306] Polinukleotidi mogu da se pripreme, obrade i/ili eksprimiraju korišćenjem bilo koje od većeg broja različitih tehnika poznatih i raspoloživih u tehnici. Da bi se eksprimirao željeni polipeptid, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid može da se insertuje u odgovarajući vektor. Primeri vektora su plazmidi, autonomno replicirajuće sekvence i transpozabilni elementi. Dodatni primeri vektora uključuju, bez ograničavanja, plazmide, fagemide, kozmide, veštačke hromozome kao što je veštački hromozom kvasca (YAC), bakterijski veštački hromozom (BAC), ili P1-izvedeni veštački hromozoma (PAC), bakteriofage kao lambda fag ili M13 fag i životinjske viruse. Primeri kategorija životinjskih virusa koji su korisni kao vektori uključuju, bez ograničavanja, retrovirus (uključujući lentivirus), adenovirus, adeno-udruženi virus, herpesvirus (npr., herpes simpleks virus), poksvirus, bakulovirus, papilomavirus i papovavirus (npr., SV40). Primeri ekspresionih vektora su pClneo vektori (Promega) za ekspresiju u sisarskim ćelijama; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ i pLenti6.2N5-GW/lacZ (Invitrogen) za lentivirusom-posredovani genski transfer i ekspresiju u sisarskim ćelijama. U specifičnim primerima izvođenja, kodirajuće sekvence himernih proteina objavljenih u ovom tekstu mogu biti povezane u takve ekspresione vektore za ekspresiju himernog proteina u sisarskim ćelijama.
[0307] "Kontrolni elementi" ili "regulatorne sekvence" prisutne u ekspresionom vektoru su oni netranslatujući regioni vektorskog mesta početka replikacije, selekcione kasete, promotora, enhensera, introni signala inicijacije translacije (Shine Dalgarno sekvenca ili Kozakova sekvenca), poliadenilaciona sekvenca, 5’ i 3’ netranslatujući regioni - koji interaguju sa proteinima ćelije-domaćina da bi se izvršila transkripcija i translacija. Takvi elementi mogu varirati u pogledu snage i specifičnosti. U zavisnosti od upotrebljenog vektorskog sistema i domaćina, može se koristiti bilo koji broj pogodnih transkripcionih i translacionih elemenata, uključujući sveprisutne promotore i inducibilne promotore.
[0308] U specifičnim primerima izvođenja vektor za upotrebu u izvođenju pronalaska koji uključuje, ali se ne ograničava na ekspresione vektore i virusne vektore, obuhvatiće egzogene, endogene, ili heterologne kontrolne sekvence kao što su promotori i/ili enhenseri. "Endogena" kontrolna sekvenca je ona koja je prirodno povezana sa datim genom u genomu. "Egzogena" kontrolna sekvenca je ona koja je jukstapozicionirana uz gen putem genetičke manipulacije (tj., tehnikama molekularne biologije) tako da transkripcija gena bude pod kontrolom enhensera/promotora sa kojim je spojen. "Heterologna" kontrolna sekvenca je egzogena sekvenca koja je iz vrste različite od vrste iz koje je genetički manipulisana ćelija.
[0309] Izraz "promotor", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na mesto prepoznavanja polinukleotida (DNK ili RNK) za koji se vezuje RNK polimeraza. RNK polimeraza inicira i transkribuje polinukleotide operabilno povezane sa promotorom. U specifičnim primerima izvođenja, promotori operativni u sisarskim ćelijama sadrže AT-bogati region lociran približno 25 do 30 baza ushodno od mesta gde je inicirana transkripcija i/ili drugu sekvencu koja se nalazi 70 do 80 baza ushodno od mesta početka transkripcije, CNCAAT region, pri čemu N može biti bilo koji nukleotid.
[0310] Izraz "enhenser" odnosi se na segment DNK koji sadrži sekvence sposobne da obezbede pojačanu transkripciju i u nekim slučajevima mogu da funkcionišu nezavisno od orijentacije u odnosu na drugu kontrolnu sekvencu. Enhenser može da funkcioniše kooperativno ili aditivno sa promotorskim i/ili drugim enhenserskim elementima. Izraz "promotor/enhenser" odnosi se na segment DNK koji sadrži sekvencu sposobnu da obezbedi i promotorsku i enhensersku funkciju.
[0311] Izraz "operabilno povezan", odnosi se na jukstapoziciju pri kojoj su opisane komponente u odnosu koji im dopušta da funkcionišu na predviđen način. U jednom primeru izvođenja kizraz se odnosi na funkcionalnu vezu između kontrolne sekvence nukleinske kiseline (kao promotor i/ili enhenser) i druge polinukleotidne sekvence, npr., polinukleotid od interesa, pri čemu ekspresiona kontrolna sekvenca usmerava transkripciju nukleinske kiseline koja odgovara drugoj sekvenci.
[0312] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "konstitutivna ekspresiona kontrolna sekvenca" odnosi se na promotor, enhenser, ili promotor/enhenser koji u kontinuitetu ili stalno omogućavaju transkripciju operabilno povezane sekvence. Konstitutivna ekspresiona kontrolna sekvenca može biti "sveprisutni" promotor, enhenser, ili promotor/enhenser koji omogućavaju ekspresiju u velikom broju različitih tipova ćelija i tkiva, odnosno "za ćeliju specifičan", "za tip ćelije specifičan", "za ćelijsku liniju specifičan" ili "tkivno specifičan" promotor, enhenser, ili promotor/enhenser koji omogućava ekspresiju u ograničenom broju različitih tipova ćelija i tkiva.
[0313] Ilustrativne sveprisutne ekspresione kontrolne sekvence pogodne za upotrebu u specifičnim primerima izvođenja pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na citomegalovirusni (CMV) neposredni rani promotor, simijan virusni 40 (SV40) (npr., rani ili kasni), LTR promotor Moloney virusa mišje leukemije (MoMLV), LTR Rous sarkoma virusa (RSV), promotor herpes simpleks virusa (HSV) (timidin kinaza), H5, P7.5 i P11 promotore iz vakcinija virusa, promotor elongacionog faktora 1-alfa (EF1a), "early growth response 1" (EGR1), feritina H (FerH), feritina L (FerL), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH), eukariotskog faktora inicijacije translacije 4A1 (EIF4A1), proteina 5 toplotnog šoka 70 kDa (HSPA5), proteina toplotnog šoka 90 kDa beta, član 1 (HSP90B1), proteina toplotnog šoka 70 kDa (HSP70), β-kinezin (β-KIN), humanog ROSA 26 lokusa (Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), promotor ubikvitina C (UBC), promotor fosfoglicerat-kinaze-1 (PGK), promotor citomegalovirusnog pojačivača/pileći β-aktin (CAG), promotor β-aktina i enhenser mijeloproliferativnog sarkoma virusa, negativni kontrolni region uklonjen, dl587rev prajmer-vezujuće mesto supstituisani (MND) promotor (Challita et al., J Virol. 69(2):748-55 (1995)).
[0314] U specifičnom primeru izvođenja, može biti poželjno da se eksprimira polinukleotid koji sadrži konstruisani TCR ili CAR sa promotora koji obezbeđuje stabilnu i dugotrajnu ekspresiju u T ćelijama i u dovoljnim nivoima da se preusmere T ćelije u ćelije koje eksprimiraju target antigen. U poželjnom primeru izvođenja, promotor je EF1α promoter ili MND promotor.
[0315] Kako se koristi u ovom tekstu, "uslovna ekspresija" može da se odnosi na bilo koji tip uslovne ekspresije uključujući, ali ne ograničavajući se na inducibilnu ekspresiju; represibilnu ekspresiju; ekspresiju u ćelijama ili tkivima koji imaju određeno fiziološko, biološko ili bolesno stanje, itd. Ova definicija ne isključuje ekspresiju specifičnu za tip ćelije ili tkivo. Određeni primeri izvođenja pronalaska obezbeđuju uslovnu ekspresiju polinukleotida od interesa, npr., ekspresija je kontrolisana izlaganjem ćelije, tkiva, organizma, itd. tretmanu ili uslovu koji dovode do ekspresije polinukleotida ili prouzrokuju porast ili smanjenje ekspresije polinukleotida kodiranog polinukleotidom od interesa.
[0316] Ilustrativni primeri inducibilnih promotora/sistema uključuju, ali se ne ograničavaju na steroid-inducibilne promotore kao što su promotori za gene koji kodiraju glukokortikoidne ili estrogenske receptore (inducibilne tretiranjem odogvarajućim hormonom), metalotioninski promotor (inducibilan tretmanom različitim teškim metalima), MX-1 promotor (inducibilan interferonom), "GeneSwitch" mifepriston-regulabilni sistem (Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), kumat-inducibilni genski prekidač (WO 2002/088346), tetraciklin-zavisni regulatorni sistemi, itd.
[0317] Uslovna ekspresija može da se postigne korišćenjem DNK rekombinaze specifične za mesto. Prema određenim primerima izvođenja pronalaska vektor može sadržati najmanje jedno (tipično dva) mesta za rekombinaciju posredovanu rekombinazom specifičnom za mesto. Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "rekombinaza" ili "rekombinaza specifična za mesto" uključuju ekscizivne ili integrativne proteine, enzime, kofaktore ili pridružene proteine koji su uključeni u rekombinacione reakcije koje uključuju jedno ili više tekombinacionih mesta (npr., dva, tri, četiri, pet, sedam, deset, dvanaest, petnaest, dvadest, trideset, pedeset, itd.), koji mogu biti proteini divljeg tipa (vidi Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), ili mutanti, derivati (npr., fuzioni proteini koji sadrže rekombinacione proteinske sekvence ili njihove fragmente), fragmenti i varijante istog. Ilustrativni primeri rekombinaza pogodnih za upotrebu u specifičnim primerima izvođenja predmetnog pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 resolvazu, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 i ParA.
F. VIRUSNI VEKTORI
[0318] U specifičnim primerima izvođenja, ć elija (npr., T ćelija) je transdukovana sa retrovirusnim vektorom, npr., lentivirusnim vektorom, koji konstruisani TCR ili CAR predviđen ovde. Transdukovane T ćelije izazivaju stabilan, dugotrajan i perzistentan T ćelijski odgovor.
[0319] Kako se koristi u ovom tekstu izraz "retrovirus" označava RNK virus koji reverzno transkribuje svoju genomsku RNK u linearnu dvolančanu DNK kopiju i zatim kovalentno integriše svoju genomsku DNK u genom domaćina. Ilustrativni retrovirusi pogodni za upotrebu u specifičnim primerima izvođenja uključuju, ali se ne ograničavaju na: virus Moloneyjeve mišje leukemije (M-MuLV), virus Moloneyjevog mišjeg sarkoma (MoMSV), virus Harveyjevog mišjeg sarkoma (HaMuSV), virus tumora mlečne žlezde miša (MuMTV), virus leukemije gibona (GaLV), virus mačje leukemije (FLV), spumavirus, virus Friendove mišje leukemije, virus mišjih matičnih ćelija (MSCV) i virus Rousovog sarkoma (RSV)) i lentivirus.
[0320] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "lentivirus" odnosi se na grupu (ili rod) kompleksnih retrovirusa. Ilustrativni lentivirusi uključuju, ali se ne ograničavaju na: HIV (virus humane imunodeficijencije; uključujući HIV tip 1 i HIV tip 2); visna-maedi virus (VMV); virus artritisa-encefalitisa koze (CAEV); virus infektivne anemije konja (EIAV); virus mačje imunodeficijencije (FIV); virus goveđe imunodeficijencije (BIV); i virus imunodeficijencije kod majmuna (SIV). U jednom primeru izvođenja, poželjne su HIV-bazirane vektorske kičme (tj., HIV cis-delujući sekvencioni elementi).
[0321] Izraz "vektor" koristi se u ovom tekstu da označi molekul nukleinske kiseline koji može da prenese ili transportuje drugi molekul nukleinske kiseline. Preneta nukleinska kiselina je obično povezana, npr., insertovana, u molekul vektorske nukleinske kiseline. Vektor sadrži sekvence koje usmeravaju autonomnu replikaciju u ćeliji, ili sadrže sekvence koje su dovoljne da omoguće integraciju u DNK ćelije-domaćina. Korisni vektori uključuju, na primer, plazmide (npr., DNK plazmide ili RNK plazmide), transpozone, kozmide, bakterijske veštačke hromozome i virusne vektore. Korisni virusni vektori uključuju, npr., replikaciono defektne retroviruse i lentiviruse.
[0322] Kao što će stručnjaku u oblasti biti jasno, izraz "virusni vektor" široko se koristi da označi molekul nukleinske kiseline (npr., transfer plazmid) koji uključuje elemente nukleinske kiseline izvedene iz virusa, koji tipično olakšavaju transfer molekula nukleinske kiseline ili integraciju u genom ćelije ili u virusnu česticu koja posreduje u transferu nukleinske kiseline. Virusne čestice će tipično uključivati različite virusne komponente, a ponekad i komponente ćelije-domaćina, pored jedne ili više nukleinskih kiselina.
[0323] Izraz virusni vektor može označavati virus ili virusnu česticu sposobnu da prenese nukleinsku kiselinu u ćeliju ili samu prenetu nukleinsku kiselinu. Virusni vektori i transfer plazmidi sadrže strukturne i/ili funkcionalne genetičke elemente koji su primarno izvedeni iz virusa. Izraz "retrovirusni vektor" odnosi se na virusni vektor ili plazmid koji sadrži strukturne i funkcionalne genetičke elemente ili njihove delove koji su primarno izvedeni iz retrovirusa. Izraz "lentivirusni vektor" odnosi se na virusni vektor ili plazmid koji sadrži strukturne i funkcionalne genetičke elemente, ili njihove delove, uključujući LTR koji su primarno izvedeni iz lentivirusa. Izraz "hibridni vektor" odnosi se na vektor, LTR ili drugu nukleinsku kiselinu koji sadrže retrovirusne, npr., lentivirusne sekvence i nelentivirusne virusne sekvence. U jednom primeru izvođenja, hibridni vektor može da se odnosi na vektor ili transfer-plazmid koji uključuju retrovirusne, npr., lentivirusne sekvence za reverznu transkripciju, replikaciju, integraciju i/ili pakovanje.
[0324] U specifičnim primerima izvođenja, izrazi "lentivirusni vektor", "lentivirusni ekspresioni vektor" mogu da se koriste da označe lentivirusne transfer-plazmide i/ili infektivne lentivirusne čestice. Kada se u ovom tekstu vrši pozivanje na elemente kao što su klonirajuća mesta, promotori, regulatorni elementi, heterologe nukleinske kiseline, itd., treba razumeti da su sekvence ovih elemenata u lentivirusnim česticama prema pronalasku prisutne u RNK formi i da su u DNK plazmidima prema pronalasku prisutne u DNK formi.
[0325] Na svakom kraju provirusa nalaze se strukture nazvane "dugi termininalni ponovci" ili "LTR". Izraz "dugi termininalni ponovak (LTR)" odnosi se na domene baznih parova locirane na krajevima retrovirusnih DNK koji su, u svom prirodnom sekvencionom kontekstu, direktni ponovci i sadrže U3, R i U5 regione. LTR obično obezbeđuju funkcije fundamentalne za ekspresiju retrovirusnih gena (npr., promocija, inicijacija i poliadenilacija genskih transkripata) i replikaciju virusa. LTR sadrži brojne regulatorne signale uključujući transkripcione kontrolne elemente, poliadenilacione signale i sekvence potrebne za replikaciju i integraciju virusnog genoma. Virusni LTR podeljen je u tri regiona nazvana U3, R i U5. U3 region sadrži enhenserske i promotorske elemente. U5 region je sekvenca između mesta vezivanja prajmera i R regiona i sadrži poliadenilacionu sekvencu. R (ponovak) region bočno je ograničen U3 i U5 regionom. LTR sastavljen od U3, R i U5 regiona javlja se i na 5’ i na 3’ kraju virusnog genoma. Uz 5’ LTR su sekvence potrebne za reverznu transkripciju genoma (tRNK prajmer-vezujuće mesto) i za efikasno pakovanje virusne RNK u čestice (psi mesto).
[0326] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "pakujući signal" ili "pakujuća sekvenca" odnosi se na sekvencu lociranu unutar retrovirusnog genoma, koja je potrebna za inserciju virusne RNK u virusni kapsid ili česticu, vidi, npr., Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol.69, No.4; pp. 2101-2109. Nekoliko retrovirusnih vektora koristi minimalni pakujući signal (označen i kao psi [Ψ] sekvenca) potreban za inkapsulaciju virusnog genoma. Prema tome, kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "pakujuća sekvenca", "pakujući signal", "psi" i simbol "Ψ" koriste se u vezi sa nekodirajućom sekvencom potrebnom za inkapsulisanje retrovirusnih RNK lanaca tokom formiranja virusne čestice.
[0327] U različitim primerima izvođenja, vektori sadrže modifikovani 5’ LTR i/ili 3’ LTR. Jedan ili oba LTR mogu imati jednu ili više modifikacija uključujući, ali ne ograničavajući se na jednu ili više delecija, insercija ili supstitucija. Modifikacije 3’ LTR često se prave da bi se
1
povećala bezbednost lentivirusnih ili retrovirusnih sistema, čineći viruse replikaciono defektnim. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "replikaciono defektan" odnosi se na virus koji nije sposoban za kompletnu, efikasnu replikaciju, tako da ne dolazi do proizvodnje infektivnih viriona (npr., replikaciono defektno lentivirusno potomstvo). Izraz "replikaciono kompetentan" odnosi se na divlji tip virusa ili mutantni virus koji je sposoban za replikaciju, tako da virusna replikacija može da proizvede infektivne virione (npr., replikaciono kompetentno lentivirusno potomstvo).
[0328] "Samoinaktivirajući" (SIN) vektori, odnosi se na replikaciono defektne vektore, npr., retrovirusne ili lentivirusne vektore, u kojima je desni (3’) LTR enhenser-promotor region, poznat kao U3 region, modifikovan (npr., delecijom ili supstitucijom) da bi se prevenirala virusna transkripcija dalje od prvog kruga replikacije virusa. Ovo je zbog toga što se desni (3’) LTR U3 region koristi kao templat za levi (5’) LTR U3 region tokom replikacije virusa i, prema tome, virusni transkript ne može da se napravi bez U3 enhensera-promotora. U dodatnom primeru izvođenja prema pronalasku 3’ LTR može da se modifikuje tako da se U5 region zameni, na primer, idealnom poli(A) sekvencom. Treba napomenuti da su u pronalazak takođe uključene modifikacije u LTR kao što su modifikacije 3’ LTR, 5’ LTR, ili i 3’ i 5’ LTR.
[0329] Dodatno poboljšanje bezbednosti obezbeđuje se zamenom U3 regiona 5’ LTR heterolognim promotorom za vođenje transkripcije virusnog genoma tokom proizvodnje virusnih čestica. Primeri heterolognih promotora koji se mogu koristiti uključuju, na primer, promotore simijan virusa 40 (SV40) (npr., rani ili kasni), citomegalovirusa (CMV) (npr., neposredni rani), virusa Moloneyjeve mišje leukemije (MoMLV), virusa Rousovog sarkoma (RSV) i herpes simpleks virusa (HSV) (timidin kinaza). Tipični promotori sposobni su da vode visoke nivoe transkripcije na Tat-nezavisan način. Ova zamena smanjuje mogućnost rekombinacije da stvori replikaciono kompetentni virus jer nema kompletne U3 sekvence u sistemu za proizvodnju virusa. U određenim primerima izvođenja, heterologni promotor ima dodatne prednosti u kontroli načina transkripcije virusnog genoma. Na primer, heterologni promotor može biti inducibilan, tako da će se transkripcija celog ili dela virusnog genoma desiti samo kada su prisutni indukcioni faktori. Indukcioni faktori uključuju, ali se ne ograničavaju na jedno ili više hemijskih jedinjenja, ili fiziološke uslove kao što su temperatura ili pH, pri kojima se kultivišu ćelije-domaćini.
[0330] U nekim primerima izvođenja, virusni vektori sadrže TAR element. Izraz "TAR" odnosi se na genetički element "transaktivacioni odgovor" lociran u R regionu lentivirusnih (npr., HIV) LTR. Ovaj element interaguje sa lentivirusnim transaktivatorskim (tat) genetičkim
2
elementom da bi se pojačala replikacija virusa. Međutim, ovaj element nije neophodan u primerima izvođenja u kojima je U3 region 5’ LTR zamenjen heterolognim promotorom.
[0331] "R region" odnosi se na region unutar retrovirusnih LTR, koji počinje na početku "capping" grupe (tj., početak transkripcije) i završava se neposredno pre početka poli A trakta. R region se takođe definiše kao bočno ograničen U3 i U5 regionima. R region ima ulogu tokom reverzne transkripcije u dopuštanju transfera nascentne DNK sa jednog kraja genoma na drugi.
[0332] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "FLAP element" odnosi se na nukleinsku kiselinu čija sekvenca uključuje centralni polipurinski trakt i centralne termininacione sekvence (central polypurine tract, central terminination sequences, cPPT i CTS) retrovirusa, npr., HIV-1 ili HIV-2. Pogodni FLAP elementi opisani su u U.S. pat. br. 6,682,907 i u Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173. Tokom reverzne transkripcije HIV-1, centralna inicijacija plus lanca DNK na centralnom polipurinskom traktu (cPPT) i centralna termininacija na centralnoj termininacionoj sekvenci (central terminination sequence, CTS) dovode do formiranja trolančane DNK strukture: HIV-1 centralni DNK prepust. Bez želje za ograničavanjem teorijom, DNK prepust može delovati kao cis-aktivna determininanta lentivirusnog genomskog nukleusnog importa i/ili može povisiti titar virusa. U specifičnim primerima izvođenja retrovirusne ili lentivirusne vektorske kičme sadrže jedan ili više FLAP elemenata ushodno ili nishodno u odnosu na heterologne gene od interesa u vektorima. Na primer, u specifičnim primerima izvođenja, transfer-plazmid sadrži FLAP element. U jednom primeru izvođenja, vektor prema pronalasku sadrži FLAP element izolovan iz HIV-1.
[0333] U jednom primeru izvođenja, retrovirusni ili lentivirusni transfer-vektori sadrže jedan ili više eksportnih elemenata. Izraz "eksportni element" odnosi se na cis-delujući posttranskripcioni regulatorni element koji reguliše transport RNK transkripta iz nukleusa u citoplazmu ćelije. Primeri RNK eksportnih elemenata uključuju, ali se ne ograničavaju na rev odgovorni element (rev response element, RRE) virusa humane imunodeficijencije (HIV) (vidi, npr., Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; i Cullen et al., 1991. Cell 58: 423), i posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa B (hepatitis B virus posttranscriptional regulatory element, HPRE). Uopšteno, RNK eksportni element smešten je unutar 3’ UTR gena, a može se insertovati u vidu jedne ili većeg broja kopija.
[0334] U specifičnim primerima izvođenja, ekspresija heterolognih sekvenci u virusnim vektorima je povećana inkorporisanjem posttranskripcionih regulatornih elemenata, efikasnih poliadenilacionih mesta i, opciono, transkripcijom termininacionih signala u vektorima. Različiti posttranskripcioni regulatorni elementi mogu povećati ekspresiju heterologne nukleinske kiseline na nivou proteina, npr., posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota (WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); postranskripcioni regulatorni element prisutan u virusu hepatitisa B (HPRE) (Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864); i slično (Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766). U specifičnim primerima izvođenja, vektori sadrže posttranskripcioni regulatorni element kao što je WPRE ili HPRE.
[0335] U specifičnim primerima izvođenja, vektorima nedostaju ili vektori ne sadrže posttranskripcioni regulatorni element kao što su WPRE ili HPRE jer u nekim slučajevima ovi elementi povećavaju rizik za ćelijsku transformaciju i/ili suštinski ili značajno ne povećavaju količinu iRNK transkripta ili stabilnost iRNK. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, vektori prema pronalasku nemaju ili vektori ne sadrže WPRE ili HPRE, što je dodatna mera bezbednosti.
[0336] Elementi koji usmeravaju efikasnu terminaciju i poliadenilaciju heterolognih transkripata nukleinske kiseline povećavaju ekspresiju heterolognog gena. Signali za terminaciju transkripcije se obično nalaze nishodno od poliadenilacionog signala. U specifičnim primerima izvođenja, vektori sadrže poliadenilacionu sekvencu 3’ polinukleotida kodirajućeg za polipeptid koji treba da se eksprimira. Izrazi "poliA mesto" ili "poliA sekvenca", kada se koriste u ovom tekstu, označavaju DNK sekvencu koja usmerava i terminaciju i poliadenilaciju nascentnog RNK transkripta RNK polimerazom II. Poliadenilacione sekvence mogu promovosati stabilnost iRNK dodavanjem poliA repa na 3’ kraj kodirajuće sekvence i tako doprineti povećanoj efikasnosti translacije. Efikasna poliadenilacija rekombinantnog transkripta je poželjna jer su transkripti koji nemaju poliA rep nestabilni i brzo se degradiraju. Ilustrativni primeri poliA signala koji mogu da se koriste u vektoru prema pronalasku uključuju idealnu poliA sekvencu (npr., AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), poliA sekvencu goveđeg hormona rasta (bovine growth hormone polyA sequence, BGHpA), poliA sekvencu zečjeg β-globina (rβgpA), ili drugu pogodnu heterologu ili endogenu poliA sekvencu poznatu u tehnici.
[0338] U različitim primerima izvođenja, vektori sadrže promotor operabilno povezan sa polinukleotidom koji kodira konstruisani TCR ili CAR polipeptid. Vektori mogu imati jedan ili više LTR, gde LTR uključuje jednu ili više modifikacija, na primer jednu ili više nukleotidnih supstitucija, adicija ili delecija. Vektori sadrže još i jedan ili više dodatnih elemenata za povećanje efikasnosti transdukcije (npr., cPPT/FLAP), pakovanja virusa (npr., psi (Ψ) pakujuči signal, RRE), i/ili druge elemente koji povećavaju ekspresiju terapijskog gena (npr., poli (A) sekvence) i opciono sadrže WPRE ili HPRE. Stručnjak će shvatiti da se mogu napraviti mnogi drugi primeri izvođenja na osnovu postojećih primera izvođenja
4
pronalaska.
[0339] "Ćelija-domaćin" uključuje ćelije transfektovane, inficirane ili transdukovane in vivo, ex vivo, ili in vitro, rekombinantnim vektorom ili polinukleotidom prema predmetnom opisu. Ćelije-domaćini mogu uključivati pakujuće ćelije, ćelije producente i ćelije inficirane virusnim vektorima. U specifičnim primerima izvođenja, ćelije-domaćini inficirane virusnim vektorom prema predmetnom opisu su pogodne za primenu na subjekta kojem je potrebna terapija. U određenim primerima izvođenja, izraz "ciljna ćelija" koristiti se naizmenično sa izrazom ćelija-domaćin i odnosi se na ransfektovane, inficirane ili transdukovane ćelije željenog tipa. U primerima izvođenja, ciljna ćelija je T ćelija.
[0339] Proizvodnja virusnih čestica u velikom obimu često je neophodna da bi se dostigao razuman titar virusa. Virusne čestice se proizvode transfektovanjem transfer-vektora u pakujuću ćelijsku liniju koja uključuje virusne strukturne i/ili dodatne gene, npr., gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx, ili nef gene ili druge retrovirusne gene.
[0340] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "pakujući vektor" odnosi se na ekspresioni vektor ili virusni vektor kojem nedostaje pakujući signal i uključuje polinukleotid koji kodira jedan, dva tri, četiri ili više virusnih strukturnih i/ili dodatnih gena. Tipično, pakujući vektori uključeni su u pakujuće ćelije, a introdukovani su u ćelije transfekcijom, transdukcijom ili infekcijom. Metodi transfekcije, transdukcije ili infekcije dobro su poznati stručnjacima u oblasti. Retrovirusni/lentivirusni transfer-vektor prema predmetnom pornalasku može da se introdukuje u pakujuću ćelijsku liniju, putem transfekcije, transdukcije ili infekcije, da bi se stvorila producentska ćelija ili ćelijska linija. Pakujući vektori prema predmetnom pornalasku mogu da se uvedu u humane ćelije ili ćelijske linije standardnim metodima uključujući, npr., kalcijum fosfatnu transfekciju, lipofekciju ili elektroporaciju. U nekim primerima, pakujući vektori se introdukuju u ćelije zajedno sa dominantnim selektabilnim markerima, kao što su neomicin, higromicin, puromicin, blastocidin, zeocin, timidin kinaza, DHFR, Gln sintetaza ili ADA, praćeno selekcijom u prisustvu odgovarajućeg leka i izolacijom klonova. Selektabilni marker gen može fizički da se poveže sa genima kodiranim pakujućim vektorom, npr., IRES ili samoisecajući virusni peptidi.
[0341] Proteini virusnog omotača (env) određuju opseg ćelija-domaćina koje konačno mogu biti inficirane i transformisane rekombinantnim retrovirusima stvorenim od ćelijskih linija. U slučaju lentivirusa, kao što su HIV-1, HIV-2, SIV, FIV i EIV, env proteini uključuju gp41 i gp120. Poželjno, virusni env proteini eksprimirani u pakujućim ćelijama prema opisu kodirani su na vektoru različitom od onog sa virusnim gag i pol genima, kako je ranije opisano.
[0342] Ilustrativni primeri env gena poreklom iz retrovirusa, koji mogu da se koriste u pronalasku uključuju, ali se ne ograničavaju na: MLV omotače, 10A1 omotač, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, Ebola, Sendai, FPV (virus ptičje kuge), influenca virusni omotači. Slično, mogu se koristiti geni koji kodiraju omotače RNK virusa (npr., familije RNK virusa Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) kao i DNK virusa (familije Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae i Iridoviridae). Reprezentativni primeri uključuju FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, Rabies, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 i EIAV.
[0343] U drugim primerima izvođenja, proteini omotača za pseudotipizaciju virusa prema predmetnom pronalasku uključuju, ali se ne ograničavaju na neki od sledećih virusa: influenca A kao H1N1, H1N2, H3N2 i H5N1 (ptičji grip), influenca B, influenca C virus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis D virus, hepatitis E virus, rotavirus, bilo koji virus Norwalk grupe virusa, crevni adenovirusi, parvovirus, virus Dengue groznice, majmunske boginje, Mononegavirales, Lyssavirus kao virus besnila, virus lagoskog slepog miša, Mokola virus, Duvenhage virus, virus evropskog slepog miša 1 & 2 i virus australijskog slepog miša, Ephemerovirus, Vesiculovirus, virus vezikularnog stomatitisa (vesicular stomatitis virus, VSV), herpesvirusi kao herpes simpleks virus tipovi 1 i 2, varičela zoster, citomegalovirus, Epstein-Barov virus (EBV), humani herpesvirusi (HHV), humani herpesvirus tip 6 i 8, virus humane imunodeficijencije (HIV), papiloma virus, mišji gamaherpesvirus, arenavirusi kao virus argentinske hemoragične groznice, virus bolivijske hemoragične groznice, virus Sabia-udružene hemoragične groznice, virus venecuelanske hemoragične groznice, virus Lassa groznice, Machupo virus, virus limfocitnog horiomeningitisa (LCMV), Bunyaviridiae kao virus Krim-Kongo hemoragične groznice, Hantavirus, virus koji izaziva hemoragičnu groznicu sa renalnim sindromom, virus Rift Valley groznice, Filoviridae (filovirus) uključujući ebola hemoragičnu groznicu i Marburg hemoragičnu groznicu, Flaviviridae uključujući virus Kaysanur Forest bolesti, virus omske hemoragične groznice, virus koji izaziva krpeljski encefalitis i Paramyxoviridae kao Hendra virus i Nipah virus, variola major i variola minor, alfavirusi kao virus venecuelanskog konjskog encefalitisa, virus istočnog konjskog encefalitisa, virus zapadnog konjskog encefalitisa, SARS-pridruženi koronavirus (SARS-CoV), virus Zapadnog Nila, bilo koji virus koji izaziva encefalitis.
[0344] Predmetni opis obezbeđuje pakujuće ćelije koje proizvode rekombinantni retrovirus, npr., lentivirus, pseudotipiziran VSVG glikoproteinom.
[0345] Izrazi "pseudotip" ili "pseudotipizacija", kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na virus čiji su proteini virusnog omotača supstituisani onima iz drugog virusa koji poseduju poželjne karakteristike. Na primer, HIV može biti pseudotipiziran G-proteinima omotača virusa vezikularnog stomatitisa (VSV-G), što omogućava da HIV inficira širi opseg ćelija zbog toga što proteini HIV omotača (kodirani env genom) normalno usmeravaju virus ka CD4<+>prezentujućim ćelijama. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, lentivirusni proteini omotača su pseudotipizirani sa VSV-G. Predmetni opis obezbeđuje pakujuće ćelije koje proizvode rekombinantni retrovirus, npr., lentivirus, pseudotipiziran sa VSV-G glikoproteinom omotača.
[0346] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "pakujuće ćelijske linije" odnosi se na ćelijske linije koje ne sadrže pakujući signal, ali stabilno ili prolazno eksprimiraju virusne strukturne proteine i replikacione enzime (npr., gag, pol i env) koji su neophodni za ispravno pakovanje virusnih čestica. Svaka pogodna ćelijska linija može da se koristi za pripremanje pakujućih ćelija prema predmetnom opisu. Generalno, ćelije su sisarske ćelije. U specifičnom primeru ćelije upotrebljene za proizvodnju pakujuće ćelijske linije mogu biti čovečje ćelije. Pogodne ćelijske linije koje se mogu koristiti uključuju, na primer, CHO ćelije, BHK ćelije, MDCK ćelije, C3H 10T1/2 ćelije, FLY ćelije, Psi-2 ćelije, BOSC 23 ćelije, PA317 ćelije, WEHI ćelije, COS ćelije, BSC 1 ćelije, BSC 40 ćelije, BMT 10 ćelije, VERO ćelije, W138 ćelije, MRC5 ćelije, A549 ćelije, HT1080 ćelije, 293 ćelije, 293T ćelije, B-50 ćelije, 3T3 ćelije, NIH3T3 ćelije, HepG2 ćelije, Saos-2 ćelije, Huh7 ćelije, HeLa ćelije, W163 ćelije, 211 ćelije i 211A ćelije. U poželjnim primerima, pakujuće ćelije su poželjno 293 ćelije, 293T ćelije, ili A549 ćelije.
[0347] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "proizvodna ćelijska linija" odnosi se na ćelijsku liniju koja je sposobna da proizvede rekombinantne retrovirusne čestice, uključujući pakujuću ćelijsku liniju i transfer-vektorski konstrukt koji sadrži pakujući signal. Proizvodnja infektivnih virusnih čestica i virusnih stok-rastvora može se obaviti korišćenjem konvencionalnih tehnika. Metodi pripremanja virusnih stok-rastvora poznati su u tehnici i ilustrovani su u, npr., Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633 i N. R. Landau et al. (1992) J. Virol.66:5110-5113. Infektivne virusne čestice mogu da se prikupe iz pakujućih ćelija korišćenjem konvencionalnih tehnika. Na primer, infektivne čestice mogu da se prikupe lizom ćelija ili prikupljanjem supernatanta ćelijske kulture, što je poznato u tehnici. Opciono, po želji, prikupljene virusne čestice mogu da se prečiste,. Pogodne tehnike prečišćavanja dobro su poznate stručnjacima.
[0348] Dostava jednog ili više gena ili druge polinukleotidne sekvence korisšćenjem retrovirusnog ili lentivirusnog vektora putem virusne infekcije umesto transfekcije označava se kao "transdukcija". U jednom primeru izvođenja, retrovirusni vektori su transdukani u ćeliju infekcijom i provirusnom integracijom. U određenim primerima izvođenja, T ćelija je "transdukovana" ako sadrži gensku ili drugu polinukleotidnu sekvencu dostavljenu ćeliji infekcijom uz korišćenjem virusnog ili retrovirusnog vektora. U specifičnim primerima izvođenja, transdukovana ćelija sadrži u svom ćelijskom genomu uključivati jednu ili više genskih ili drugih polinukleotidnih sekvenci dostavljenih retrovirusnim ili lentivirusnim vektorom.
[0349] U određenim primerima, ć elije-domaćini transdukovane virusnim vektorom prema opisu koji eksprimira jedan ili više polipeptida, pogodne su za primenu na subjekta za lečenje i/ili prevenciju maligniteta B ćelija. Drugi metodi vezani za upotrebu virusnih vektora u genskoj terapiji koji se mogu koristiti prema određenim primerima, mogu se naći u npr., Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. i Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. i Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol.23:746-58; Brody, S. L. i Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. i Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep.
3:43-49; i Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8.
H. Kompozicije i formulacije
[0350] Kompozicije predviđene ovde mogu sadržati jedan ili više polipeptida, polinukleotida, vektora koji sadrže iste, i kompozicija T ćelija, kao što je ovde predviđeno. Kompozicije uključuju, ali nisu ograničene na farmaceutske kompozicije. "Farmaceutska kompozicija" se odnosi na kompoziciju formulisanu u farmaceutski prihvatljivim ili fiziološki prihvatljivim rastvorima za primenu na ćeliju ili životinju, ili zasebno, ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih modaliteta terapije. Takođe se podrazumeva da, ukoliko je poželjno, kompozicije prema opisu mogu se takođe primeniti u kombinaciji sa drugim sredstvima, kao što su, npr., citokini, faktori rasta, hormoni, mali molekuli, hemoterapeutici, pro-lekovi, lekovi, antitela, ili druga različta farmaceutska aktivna sredstva. Praktično jne postoji granica za druge komponente koje se mogu takođe uključiti u kompozicije, uz uslov da dodatna sredstva ne deluju štetno na sposobnost kompozicije da isporuči nameravanu terapiju.
[0351] Izraz "farmaceutski prihvatljiv" je upotrebljen ovde da se odnosi na ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili dozne oblike, koij su unuta zdravog medicinskog rasuđivanja, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i životinja bez suvišne toksičnosti, iritacije, alrgijskog odgovora, ili drugog problema ili komplikacije, zajedno sa racionalnim odnosom korist/rizik.
[0352] Kao što je ovde korišćeno "farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent" uključuje bez ograničenja bilo koji ađuvant, nosač, ekscipijent, klizajuće sredstvo, zaslađivač, razblaživač, konzervans, boju/sredstvo za bojenje, poboljšavač ukusa, surfaktant, ovlaživač, dispergujuće sredstvo, sredstvo za suspenziju, stabilizator, izotonično sredstvo, rastvarač, surfaktant, ili emulgator koji je odobren od strane United States Food and Drug Administration kao prihvatljiv za upotrebu na ljudima ili domaćim životinjama. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju, ali nisu ograničeni na, šećere, kao što je laktoza, glukoza i saharoza; skrobovi, kao što je skrob kukuruza i skrob krompira; celuloza, i njeni derivati, kao što je natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celuloza acetat; tragacanth; slad; želatin; talk; kakao puter, voskovi, životinjska i biljna ulja, parafini, silikoni, bentoniti, silicijumova kiselina, cink oksid; ulja, kao što je ulje kikirikija, ulje iz semena pamuka, suncokretovo ulje, susamovo ulje, maslinovo ulje, ulje kukuruza i sojino ulje; glikoli, kao što je propilen glikol; polioli, kao što je glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol; estri, kao što su etil oleat i etil laurat; agar; puferujuća sredstva, kao što je magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginska kiselina; voda bez pirogena; izotonični fiziološki rastvor; Ringer-ov rastvor; etil alkohol; rastvori fosfatnog pufera; i bilo koje druge kompatibilne supstance korišćene u farmaceutskim formualcijama.
[0353] Kompozicije prema predmetnom opisu sadrže količinu modifikovanih T ćelija proizvedenih postupcima predviđenim ovde. U poželjnim primerima, farmaceutske kompozicije T ćelija sadrže potentne T ćelije koje imaju jedan ili više od, ili sve od sledećih markera: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD 122, i CD 127.
[0354] Može se reći generalno da se farmaceutske kompozicije koje sadrže T ćelije proizvedene sa postupcima predviđenim ovde mogu primeniti u dozi od 10<2>do 10<10>ćelije/kg teledsne težine, 10<5>do 10<9>ćelije/kg teledsne težine, 10<5>do 10<8>ćelije/kg teledsne težine, 10<5>do 10<7>ćelije/kg teledsne težine, 10<7>do 10<9>ćelije/kg teledsne težine, ili 10<7>do 10<8>ćelije/kg teledsne težine, uključujući sve celobrojne vrednosti unutar ovih opsega. Broj ćelija će zavisiti od krajnje upotrebe za koju je nameravana kompozicija kao i tip ćelija koji je u njima uključen. Za ovde obezbeđene upotrebe, ćelije su generalno u zapremini od litar ili manje, može biti 500 mLs ili manje, čas 250 mLs ili 100 mLs ili manje. Stoga gustina željenih ćelija je tipično veća od 10<6>ćelija/ml i generalno je veća od 10<7>ćeliae/ml, generalno 10<8>ćelije/ml ili veća. Klinički relevnatni broj imunih ćelija može se rasporediti u više infuzija koje su kumulativno jednake ili prelaze 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, 10<10>, 10<11>, ili 10<12>ćelija. U nekim apsektima prema predmetnom opisu, naročito kako će sve ćelije unesene infuzijom biti preusmerene na određeni target antigen (npr., BCMA), može se primeniti manji broj ćelija, u opsegu od 10<6>/kilogram (10<6>-10<11>po pacijentu). T ćelije modifikovane da eksprimiraju konstruisani TCR ili CAR mogu se primeniti više puta u dozama unutar ovih opsega. Ćelije mogu biti alogene, singene, ksenogene, ili autologe za pacijenta koji je podvrgnut terapiji. Ukoliko je poželjno, tretman može takođe uključiti primenu mitogena (npr., PHA) ili limfokina, citokina, i/ili hemokina (npr., IFN-γ, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, TNFalfa, IL-18, i TNF-beta, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3- L, RANTES, MIP1α, itd.) kao što je ovde opisano da se poboljša graftovanje i funkcija T ćelija unesenih infuzijom.
[0355] Generalno, kompozicije koje sadrže ćelije aktivirane i podvrgnute ekspanziji kao što je ovde opisano mogu biti upotrebljene u tretmanu i prevenciji bolesti koje se javljaju kod pojedinaca koji su imunokompormitovani. Naročito, kompozicije koje sadrže modifikovane T ćelije proizvedene postupcima predviđenim ovde korišćene su u tretmanu kancera. Modifikovane T ćelije prema predmetnom opisu mogu se primeniti ili zasebno, ili kao farmaceutska kompozicija u kombinaciji sa nosačima, razblaživačima, ekscipijentima, i/ili sa drugim komponentama kao što su IL-2, IL-7, i/ili IL-15 ili drugi citokini ili ćelijske populacije. U specifičnim primerima, farmaceutske kompozicije predviđene ovde sadrže količinu genetički modifikovanih T ćelija, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski ili fiziološki prihvatljivih nosača, razblaživača ili eskscipijenata.
[0356] Farmaceutske kompozicije koje sadrže modifikovane T ćelije predviđene ovde mogu dodatno sadržati pufere kao što su neutralni puferovani fiziološki rastvor, fosfatno puferovani fiziološki rastvor i slično; ugljene hidrate kao što je glukoza, manoza, saharoza ili dekstrani, manitol; proteini; polipeptidi ili aminokiseline kao što je glicin; antioksidanti; helatirajuća sredstva kao što je EDTA ili glutation; ađuvanti (npr., aluminijum hidroksid); i konzervanse. Kompozicije prema predmetnom pronalasku su poželjno formulisane za parenteralnu primenu, npr., primenu intravaskularno (intravenski ili intraarterijalno), intraperitonealno ili intramuskularno.
[0357] Tečne farmaceutske kompozicije, bilo da su rastvori, supsenzije ili drugi sličan oblik, mogu uključivati jedno ili više od sledećeg: sterilni razblaživači kao što je voda za injekciju, fiziološki rastvor, poželjno fiziološki slani rastvor, Ringer-ov rastvor, izotonični natrijum hlorid, neisparljiva ulja kao što su sintetički mono ili digliceridi koji mogu služiti kao rastvarač ili medijum za suspenziju, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi rastvarači; antibakterijska sredstva kao što su benzil alkohol ili metil paraben; antioksidanti kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helatirajuća sredstva kao što su etilendiamietetrasirćetna kiselina; puferi kao što su acetati, citrati ili fosfati i sredstva za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili desktroza. Parenteralne preparati mogu biti zatvoreni u ampulama, jednokratnim špricevima ili vijalicama sa više doza napravljenimod stakla ili plastike. Injektabilna farmaceutska kompozicija je poželjno sterilna.
[0358] U specifičnom primeru, kompozicije predviđene ovde sadrže efikasnu količinu kompozicije modifikovanih T ćelija koje su povrgnute ekspanziji, zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih sredstava. Stoga, kompozicije T ćelija mogu se primeniti zasebno ili u kombinaciji sa drugim poznatim tretmanima za kancer, kao što su terapija zračenjem, hemoterapija, transplantacija, imunoterapija, hormonska terapija, fotodinamička terapija, itd. KPOmpozicije se takođe mogu primeniti u kombinaciji sa antibioticima. Takva terapeutska sredstva mogu biti prihvaćena u tehnici kao standardni tretman za određeno stanje bolesti kao što je ovde opisano, kao što je naročito kancer. Primeri predviđenih terapeutskih sredstava uključuju citokine, faktore rasta, steroide, NSAIDs, DMARDs, anti-inflamatorna sredstva, hemoterapeutike, radioterapeutike, terapeutska antitela, ili druga aktivna i pomoćna sredstva.
[0359] U određenim primerima, kompozicije koje sadrže T ćelije predviđene ovde mogu se primeniti zajedno sa bilo kojim hemoterapeutskim sredstvima. Ilustrativni primeri hemoterapeutskih sredstava uključuju alkilujuća sredstva kao što su tiotepa i ciklofosfamid (CYTOXAN™); alkil sulfonati kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa, i uredopa; etilenimini i metilamelamini uključujući altretamin, trietilenemelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosfaoramid i trimetilolomelamin resume; azotni iperiti kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotici kao što su aklacinomisini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, kaliheamicin, karabicin, karminomicin, karcinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin, epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao
1
što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, didoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU; androgeni kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenalini kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljsači folne kiseline kao što su folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elformitin; eliptinium acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitracrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK®; razoksan; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2, 2’,2"-trihlorotrietilamin; uretan; vindesin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitosin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, npr. paklitaksel (TAKSOL®, Bristol-Miers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i doksetaksel (TAKSOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; teniposid; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilomitin (DMFO); derivati retinoinske kiseline kao što su Targretin™ (beksaroten), Panretin™ (alitretinoin); ONTAK™ (denileukin diftitoks); esperamicini; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo čega od prethodnog. Takođe su u ovu definiciju uključeni anti-hormonska sredstva koja deluju tako što regulišu ili inibiraju aktivnost hormona na tumore kao što su anti-estrogeni uključujući na primer tamoksifen, raloksifen, 4(5)-imidazoli koji inhibiraju aromatazu, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LI117018, onapriston, i toremifen (Fareston); i anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid, i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo čega od prethodnog.
[0360] Različita druga terapeutska sredstva mogu se koristiti zajedno sa kompozicijama opisanim ovde. U jednom primeru, kompozicija koja sadrži T ćelije je primenjena sa antiinflamatornim sredstvom. Anti-inflamatorna sredstva ili lekovi uključuju, ali nisu ograničeni na, steroide i glukokortikoide (uključujući betametazon, budesonid, deksametazon, hidrokortizon acetat, hidrokortizon, hidrokortizon, metilprednizolon, prednizolon, prednizon, triamcinolon), nesteroidni anti-inflamtaorni lekovi (NSAIDS) uključujući aspirin, ibuprofen, naproksen, metotreksat, sulfasalazin, leflunomid, anti-TNF medikamenti, ciklofosfamid i mikofenolat.
2
[0361] Drugi primeri NSAIDs su izabrani iz grupe koja se sastoji od ibuprofen, naproksen, naproksen natrijum, Cox-2 inhibitora kao što su VIOXX® (rofekoksib) i CELEBREX® (celekoksib), i sialilati. Primeri analgetika su izabrani iz grupe koja se sastoji od acetaminofena, oksikodona, tramadola propoksifen hidrohlorida. Primeri glukokortikoida su izabrani iz grupe koja se sastoji od kortizon, deksametazon, hidrokortizon, metilprednizolon, prednizolon, ili prednizon. Primeri modifikatora biološkog odgovora uključuju molekule usmerene protiv markera na ćelijskoj površini (npr., CD4, CD5, itd.), inhibitore citokina, kao što su TNF antagonisti (npr., etanercept (ENBREL®), adalimumab (HUMIRA®) i infliksimab (REMICADE®), inhibitora hemokina i inhibitora adhezionog molekula. Modifikatori biološkog odgovora uključuju monoklonska antitela kao i rekombinantne oblike molekula. Primeri DMARDs uključuju azatioprin, ciklofosfamid, ciklosporin, metotreksat, penicilamin, leflunomid, sulfasalazin, hidroksihlorokin, zlato (oralno (auranofin) i intramuskularno) i minociklin.
[0362] Ilustrativni primeri terapeutskih antitela pogodnih za kombinaciju sa CAR modifikovanim T ćelijama predviđenim ovde, uključuju, ali nisu ograničeni na, abagovomab, adekatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuksimab, anatumomab, arcitumomab, bavituksimab, bektumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuksimab, kantuzumab, katumaksomab, cetuksimab, citatuzumab, ciksutumumab, klivatuzumab, konatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromeksimab, elotuzumab, ensituksimab, ertumaksomab, etaracizumab, farietuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuksimab, ganitumab, gemtuzumab, girentuksimab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuksimab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, leksatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moksetumomab, namatumab, naptumomab, necitumumab, nimotuzumab, nofetumomab, okaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab, radretumab, rilotumumab, rituksimab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuksimab, simtuzumab, solitomab, tacatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tukotuzumab, ublituksimab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, CC49 i 3F8.
[0363] U određenim primerima, kompozicije opisane ovde su primenjene zajedno sa citokinom. Pod "citokin" kao što je ovde korišćeno podrazumeva se generički termin za protein oslobođenm iz jedne populacije ćelija koji deluju na druge ćelije kao intercelularni medijatori. Primeri takvih citokina su limfokini, monokini, hemokini, i tradicionalni polipeptidni hormoni. U citokine su uključeni hormoni rasta kao što su humani hormon rasta, N-metionil humani hormon rasta, i goveđi hormon rasta; paratiroidni hormon; tiroksin; insulin; proinsulin; relaksin; prorelaksin; glikoproteinski hormoni kao što su folikulostimulirajući hormon (FSH), tiroidni stimulirajući hormon (TSH), i luteinizirajući hormon (LH); faktor rasta jetre; faktor rasta fibroblasta; prolaktin; placentalni laktogen; fator nekroze tumora alfa i beta; milerova-inhibirajuća supstanca; mišji gonadotropin-povezani peptid; inhibin; aktivin; vaskularni endotelni faktor rasta; integrin; trombopoetin (TPO); faktori rasta nerava kao što su NGF-beta; faktor rasta trombocita; transformišući faktori rasta (TGFs) kao što su TGF-alfa i TGF-beta; insulinu-slični faktor rasta-I i -II; eritropoetin (EPO); osteoinduktivni faktori; interferoni kao što su interferon-alfa, beta, i -gama; faktori stimulacije kolonije (CSFs) kao što su makrofag-CSF (M-CSF); granulocitmakrofag-CSF (GM-CSF); i granulocit-CSF (GCSF); interleukini (ILs) kao što su IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL- 15, faktor nekroze tumora kao što su TNF-alfa ili TNFbeta; i drugi polipeptidni faktori uključujući LIF i kit ligand (KL). Kao što je ovde korišćeno, termin citokin uključuje proteine iz prirodnih izvora ili iz kulture rekombinantnih ćelija, i biološke ekvivalente nativne sekvence citokina.
I. Target ćelije i antigeni
[0364] Predmetni opis predviđa, delimično, genetički modifikovane imune efektorne ćelije preusmerene na target ćelije, npr., tumorske ili ćelije kancera, i koje sadrže konstruisane T ćelijske receptore ili CARs koji imaju vezujući domen koji se vezuje za target antigene na ćelijama. Ćelije kancera se takođe mogu proširiti na druge delove tela preko krvi i limfnog sistema. Postoji nekoliko glavnih tipova kancera. Karcinom je kancer koji počinje u koži ili u tkivima koja ograničavaju ili prekrivaju unutrašnje organe. Sarkom je kancer koji počinje u kosti, hrskavici, masti, mišiću, krvnim sudovima, ili drugom vezivnom tkivu. Leukemija je kancer koji počinje u tkivu koje formira krv kao što su kostna srž, i dovodi do toga da se veliki broj abnormalnih ćelija krvi stvara i i ulazi u krvotok. Limfom i multipli mijelom su kanceri koji počinju u ćelijama imunog sistema. Kanceri centralnog nervnog sistema su kanceri koji počinju u tkivima mozga i kičmene moždine.
[0365] U jednom primeru izvođenja, target ćelija eksprimira antigen, npr., target antigen, koji nije značajano zastupljen na površini drugih normalnih (željenih) ćelija. U jednom primeru
4
izvođenja, target ćelija je parenhimska ćelija pankreasa, ćelija kanala pankreasa, ćelija jetre, ćelija srčanog mišića, ćelija skeletnog mišića, osteoblast, skeletni mioblast, neuron, vaskularna endotelna ćelija, pigmentna ćelija, glatka mišićna ćelija, glijalna ćelija, masna ćelija, ćelija kosti, hondrocita, ćelija pankreasnog ostrvca, CNS ćelija, PNS ćelija, ćelija jetre, adipozna ćelija, bubrežna ćelija, ćelija pluća, ćelija kože, ćelija jajnika, folikularna ćelija, epitelna ćelija, imuna ćelija, ili endotelna ćelija.
[0366] U određenim primerima izvođenja, target ćelija je deo pankreasnog tkiva, nervnog tkiva, srčanog tkiva, kostne srži, mišićnog tkiva, koštanog tkiva, kožnog tkiva, tkiva jetre, folikul dlake, vaskularno tkivo, adipozno tkivo, tkivo pluća, i tkivo bubrega.
[0367] U specifičnom primeru izvođenja, target ćelija je tumorska ćelija. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, target ćelija je ćelija kancera, kao što su ćelija kod pacijenta sa kancerom. Primeri ćelija koje se mogu ubiti sa opisanim postupcima uključuju ćelije sledećih tumora: tečni tumor kao što su leukemije, uključujući akutnu leukemiju (kao što su akutna limfocitna leukemija, akutna mijelocitna leukemija, i mijeloblastna, promijelocitna, mijelomonocitna, monocitna i eritroleukemija), hroničlne leukemije (kao što su hronična mijelocitna (granulocitna) leukemija i hronična limfocitna leukemija), policitemija vera, limfom, Hodgkin-ova bolest, ne-Hodgkin-ov limfom, multipli mijelom, Waldenstrom-ova makroglobulinemija, bolest teškog lanca).
[0368] U sledećem primeru izvođenja, ćelija je ćelija solidnog tumora, kao što su sarkomi i karcinomi, fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, hondrosarkom, osteogeni sarkom, i drugi sarkomi, sinoviom, mezoteliom, Ewing-ov tumor, leiomiosarkom, rabdomiosarkom, karcinom debelog creva, kancer pankreasa, kancer dojke, kancer jajnika, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, kancer pluća, kolorektalni kancer, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinom (na primer adenokarcinom pankreasa, debelog creva, jajnika, pluća, dojke, želudca, prostate, grlića materice, ili jednjaka), karcinom znojne žlezde, karcinom sebaceozne žlezde, papilarni karcinom, papilarni adenokarcinomi, medularni karcinom, bronhogeni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija, hepatom, karcinom žučnog kanala, horiokarcinom, Wilms-ov tumor, kancer grlića materice, tumor testisa, karcinom bešike, CNS tumori (kao što su gliom, astrocitom, meduloblastom, kraniofariogiom, ependimom, pinealom, hemangioblastom, akustični neurom, oligodendrogliom, menangioma, melanom, neuroblastom i retinoblastom).
[0369] U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od: špostupka prema patentnom zahtevu 1, gde je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od Wilms-ovog tumora, Ewing-ovog sarkoma, neuroendokrinog tumora, glioblastoma, neuroblastoma, melanoma, kancer kože, kancera dojke, kancera debelog creva, rektalnog kancera, kancera prostate, kancera jetre, kancera bubrega, kancera pankreasa, kancera pluća, kancera žuči, kancera grlića materice, kancera endometrijuma, kancera jednjaka, kancera želudca, kancera glave i vrata, medularnog tiroidnog karcinoma, kancera jajnika, glioma, limfoma, leukemije, mijeloma, akutne limfoblastne leukemije, akutne mijelogene leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične mijelogene leukemije, Hodgkin-ovog limfoma, ne-Hodgkin-ovog limfoma, i kancera mokraćne bešike.
[0370] U jednom primeru izvođenja, target ćelija je maligna ćelija jetre, pankreasa, pluća, dojke, bešike, mozga, kosti, tiroidee, bubrega, kože, i hematopetskog sistema. U sledećem primeru izvođenja, target ćelija je ćelija u kanceru jetre, kanceru pankreasa, kanceru pluća, kanceru dojke, kanceru bešike, kanceru mozga, kanceru kosti, kanceru tiroidee, kanceru bubrega, kanceru kože, ili hematološkom kanceru.
[0371] U jednom primeru izvođenja, target ćelija je ćelija, npr., ćelija kancera inficirana sa virusom, uključujući, ali se ne ograničavajući na CMV, HPV, i EBV.
[0372] U jednom primeru izvođenja, target antigen je epitop na alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, CMV, EBV, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, Glipikan-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NYESO- 1, HPV, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2D Ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, ili VEGFR2.
J. Terapeutski postupci
[0373] Modifikovane T ćelije proizvedene postupcima predviđenim ovde obezbeđuju poboljšanu adoptivnu imunoterapiju za upotrebu u tretmanu različitih stanja uključujući, bez ograničenja, kancer, infektivnu bolest, autoimunu bolest, inflamatornu bolest, i imunodeficijenciju. U specifičnim primerima izvođenja, specifičnost primarne T ćelije je preusmerena na ćelije tumora ili kancera sa genetičkim modifikovanjem primarnih T ćelija sa konstruisanim TCR ili CAR predviđenim ovde. Predmetni opis uključuje tip ćelijske terapije gde su T ćelije modifikovane da eksprimiraju konstruisani TCR ili CAR koji targetiraju ćelije kancera koji eksprimiraju target antigen, i modifikovane T ćelije su unete infuzijom u primaoca kome je to potrebno. Ćelija uneta infuzijom je sposobna da ubije tumorske ćelije u recipijentu. Za razliku od terapijama antitelom, modifikovane T ćelije sa konstruisanim TCR i CAR su sposobne da se repliciraju in vivo; stoga, doprinoseći dugotrajnoj perzistenciji koja može dovesti do produžene terapije kancera.
[0374] U jednom primeru, T ćelije sa konstruisanim TCR i CAR proizvedene postupcima prema pronalasku mogu podleći robusnoj in vivo T ćelijskoj ekspanziji i mogu opstati produženo vreme. U drugom primeru, T ćelije sa konstruisanim TCR i CAR proizvedene postupcima prema pronalasku evoluiraju u specifične memorijske T ćelije koje se mogu reaktivirati da inhibiraju bilo koje dodatno formiranje ili rast tumora.
[0375] U specifičnim primerima, kompozicije koje sadrže imune efektorne ćelije genetički modifikovane sa vektorom koji sadrži promotor operativno povezan sa polinukleotidnom koji kodira CAR korišćeni su u tretmanu solidnih tumora ili kancera uključujući, bez ograničenja, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer pluća, kancer dojke, kancer bešike, kancer mozga, kancer kosti, kancer tiroidee, kancer bubrega ili kancer kože.
[0376] U specifičnim primerima, kompozicije koje sadrže imunu efektornu ćeliju genetički modifikovanu sa vektorom koji sadrži promotor operativno vezan sa polinukleotidom koji kodira konstruisani TCR ili CAR koji sadrži antigen-specifični vezujući domen koji vezuje epitop PSCA ili MUC1 korišćene su u tretmanu različitih kancera uključujući, ali se ne ograničavajući na pankreasni, bešike, i pluća.
[0377] U specifičnim primerima, kompozicije koje sadrže imunu efektornu ćeliju genetički modifikovanu sa vektorom koji sadrži promotor operativno vezan sa polinukleotidom koji kodira konstruisani TCR ili CAR korišćeni su u tretmanu tečnih tumora, uključujući, ali se ne ograničavajući na leukemiju, uključujući akutnu leukemiju (npr., ALL, AML, i nmijeloblastnu, promijelocitnu, mijelomonocitnu, monocitnu i eritroleukemiju), hronične leukemije (npr.,CLL, SLL, CML, HCL), policitemija vera, limfom, Hodgkin-ovu bolest, ne-Hodgkin-ov limfom, multipli mijelom, Waldenstrom-ovu makroglobulinemiju, i bolest teškog lanca.
[0378] U specifičnim primerima, kompozicije koje sadrže imunu efektornu ćeliju genetički modifikovanu sa vektorom koji sadrži promotor operativno vezan sa polinukleotidom koji kodira konstruisani TCR ili CAR korišćene su u tretmanu maligniteta B-ćelija, uključujući, ali se ne ograničavajući na multipli mijelom (MM), ne-Hodgkin-ov limfom (NHL), i hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL).
[0379] Multipli mijelom je malignitet B-ćelijezrele plazma ćelije morfološki karakterisan sa neoplastičnom transformacijom jednog klona ovog tipa ćelija. Ove plazma ćelije proliferišu u BM i mogu izvršiti invaziju susedne kosti i nekada krvi. Varijantni oblici multiplog mijeloma uključuju očigledni multipli mijelom, tinjajući multipli mijelom, leukemiju plazma ćelije, nesekretorni mijelom, IgD mijelom, osteosklerotični mijelom, solitarni plazmocitom kosti, i ekstramedularni plazmacitom (videti, na primer, Braunwald, et al. (eds), Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15th Edition (McGraw-Hill 2001)).
[0380] Ne-Hodgkin-ov limfom obuhvata veliku grupu kancera limfocita (bele krvne ćelije). Ne-Hodgkin-ovi limfomi mogu se javiti u bilo kom dobu i često su obeleženi sa limfnim čvorovima koji su veći od normalnih, groznicom, i gubitkom težine. Postoji mnogo različitih tipova ne-Hodgkin-ovog limfoma. Na primer, ne-Hodgkin-ov limfom se može podeliti u agresivni (brzo rastući) i indolentni (sporo rastući) tip. Iako ne-Hodgkin-ovi limfomi mogu biti izvedeni iz B-ćelija i T-ćelija, kao što je ovde korišćeno, termin "ne-Hodgkin-ov limfom" i "B-ćelijski ne-Hodgkin-ov limfom" se koriste naizmenično. B-ćelijski ne-Hodgkin-ovi limfomi (NHL) uključuju Burkitt-ov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju/mali limfocitni limfom (CLL/SLL), difuzni krupnoćelijski B-ćelijski limfom, folikularni limfom, imunoblastni krupnoćelijski limfom, prekursorski B-limfoblastni limfom, i limfom mantle ćelija. Limfomi koji nastaju iz kostne srži ili nakon transplantacije stem ćelija obično su B-ćelijski ne-Hodgkin-ovi limfomi.
[0381] Hronična limfocitna leukemija (CLL) je indolentni (sporo rastući) kancer koji izaziva sporo povećanje u nezrelim belim krvnim ćelijama nazvanim B limfociti, ili B ćelije. Ćelije kancera se šire kroz krv i kostnu srž, i mogu takođe pogoditi limfne čvorove ili druge organe kao što su jetra i slezina. CLL konačno izaziva otkazivanje kostne srži. Nekada, u kasnijim stadijumima bolesti, bolest je nazvana mali limfocitni limfom.
[0382] U specifičnim primerima, obezbeđeni su postupci koji sadrže primenu terapeutski efikasne količine modifikovanih T ćelija predviđen ovde ili kompozicija koja sadrži iste, na pacijenta kome je to potrebno, zasebno ili u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih sredstava. U određenim primerima, ćelije proizvedene postupcima prema pronalasku korišćene su u tretmanu pacijenata koji su u riziku od razvijanja kancera. Stoga, predmetni opis obezbeđuje postupke za tretiranje ili prevenciju kancera koji sadrži primenu na subjekta kome je to potrebno, terapeutski efikasne količine modifikovanih T ćelija prema opisu.
[0383] U jednom primeru, postupak za tretiranje kancera kod subjekta kome je to potrebno sadrži primenu efikasne količine, npr., terapeutski efikasne količine kompozicije koja sadrži genetički modifikovane imune efektorne ćelije predviđene ovde. Količina i učestalost primene biće određena takvim faktorima kao što su stanje pacijenta, i tip i težina bolesti pacijenta, iako odgovarajuće doze mogu biti određene kliničkim studijama.
[0384] U jednom primeru, količina T ćelija u kompoziciji primenjena na subjekta je najmanje 0.1 x 10<5>ćelija, najmanje 0.5 x 10<5>ćelija, najmanje 1 x 10<5>ćelija, najmanje 5 x 10<5>ćelija, najmanje 1 x 10<6>ćelija, najmanje 0.5 x 10<7>ćelija, najmanje 1 x 10<7>ćelija, najmanje 0.5 x 10<8>ćelija, najmanje 1 x 10<8>ćelija, najmanje 0.5 x 10<9>ćelija, najmanje 1 x 10<9>ćelija, najmanje 2 x 10<9>ćelija, najmanje 3 x 10<9>ćelija, najmanje 4 x 10<9>ćelija, najmanje 5 x 10<9>ćelija, ili najmanje 1 x 10<10>ćelija. U specifičnim primerima, oko 1 x 10<7>CAR T ćelija do oko 1 x 10<9>CAR T ćelija, oko 2 x 10<7>CAR T ćelija do oko 0.9 x 10<9>CAR T ćelija, oko 3 x 10<7>CAR T ćelija do oko 0.8 x 10<9>CAR T ćelija, oko 4 x 10<7>CAR T ćelija do oko 0.7 x 10<9>CAR T ćelija, oko 5 x 10<7>CAR T ćelija do oko 0.6 x 10<9>CAR T ćelija, ili oko 5 x 10<7>CAR T ćelija do oko 0.5 x 10<9>CAR T ćelija je primenjeno na subjekta.
[0385] U jednom primeru, količina T ćelija u kompoziciji primenjenoj na subjekta je najmanje 0.1 x 10<4>ćelija/kg telesne težine, najmanje 0.5 x 10<4>ćelija/kg telesne težine, najmanje 1 x 10<4>ćelija/kg telesne težine, najmanje 5 x 10<4>ćelija/kg telesne težine, najmanje 1 x 10<5>ćelija/kg telesne težine, najmanje 0.5 x 10<6>ćelija/kg telesne težine, najmanje 1 x 10<6>ćelija/kg telesne težine, najmanje 0.5 x 10<7>ćelija/kg telesne težine, najmanje 1 x 10<7>ćelija/kg telesne težine, najmanje 0.5 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, najmanje 1 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, najmanje 2 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, najmanje 3 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, najmanje 4 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, najmanje 5 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, ili najmanje 1 x 10<9>ćelija/kg telesne težine. U specifičnim primerima, oko 1 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 1 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine, oko 2 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 0.9 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine, oko 3 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 0.8 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine, oko 4 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 0.7 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine, oko 5 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 0.6 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine, ili oko 5 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 0.5 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine je primenjeno na subjekta.
[0386] Stručnjak će prepoznati da višestruke primene kompozicija prema opisu mogu biti neophodne da bi se izvela željena terapija. Na primer kompozicija može biti primenjena 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više puta tokom 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 1 godine, 2 godine, 5 godina, 10 godina, ili više.
[0387] U određenim primerima, može biti poželjno primeniti aktivirane T ćelije na subjekta i zatim naknadno uzeti uzorak krvi (ili izvesti aferezu), uz to aktivirati T ćelije prema predmetnom pronalasku, i ponovo dati infuziju pacijentu sa ovim aktiviranim i podvrgnutim ekspanziji T ćelijama. Ovaj postupak se može izvesti više puta svakih nekoliko nedelja. U određenim primerima, T ćelije se mogu aktivirati pri uzimanju krvi od 10cc do 400cc. U određenim primerima, T ćelije su aktivirane kod uzimanja krvi do 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 100cc, 150cc, 200cc, 250cc, 300cc, 350cc, ili 400cc ili više. Bez vezivanja za teoriju, korišćenje ovog protokola višestrukog uzimanja krvi/višestruka reinfuzija može služiti tome da se selektuju određene populacije T ćelija.
[0388] Primena kompozicija predviđenih ovde može se izvesti na bilo koji pogodan način, uključujući inhalacijom aerosola, injekcijom, ingestijom, transfuzijom, implantacijom ili transplantacijom. U poželjnom primeru, kompozicije su primenjene parenteralno. Izrazi "parenteralna primena " i "primenjene parenteralno" kao što je ovde korišćeno odnosi se na načine primene različite od enteralne i topikalne primene, obično injekcijom, i uključuju, bez ograničenja, intravaskularnu, intravensku, intramuskularnu, intraarteriajalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intratumoralnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrakalnu, potkožnu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu i intrasternalnu injekciju i infuziju. U jednom primeru, kompozicije predviđene ovde su primenjene na subjekta direktnom injekcijom u tumor, limfni čvor, ili mesto infekcije.
[0389] U jednom primeru, na subjekta kome je to potrebno primenjena je efikasna količina kompozicije da bi se povećao ćelijski imuni odgovor na kancer u subjektu. Imuni odgovor može uključivati ćelijske imune odgovore posredovane odgovorima citotoksičnih T ćelija sposobnim da ubijaju inficirane ćelije, regulatornih T ćelija, i helper T ćelija. Humoralni imuni odgovori, posredovani primarno sa helper T ćelijama sposobnim da aktiviraju B ćelije tako dovodeći do proizvodnje antitela, takođe mogu biti indukovani. Mogu se koristiti različite tehnike za analiziranje tipa imunih odgovora indukovanih kompozicijama prema predmetnom opisu, koje su dobro opisane u tehnici; npr., Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y.
[0390] U slučaju T ćelija-posredovanog ubijanja, CAR-ligand vezivanje inicira CAR signalizaciju T ćelijama, što rezultuje u aktivaciji različitih T ćelijskih signalnih puteva koji indukuju T ćelije da proizvedu ili oslobode proteine sposobne da indukuju apoptozu target ćelija različitim mehanizmima. Ovi mehanizmi posredovani T ćelijama uključuju (ali nisu ograničeni na) transfer intracelularnih citotoksičnih granula iz T ćelija u target ćelije, T ćelijsku sekreciju proinflamatornih citokina koji mogu indukovati direktno ubijanje target ćelija (ili indirektno preko regrutovanja drugih efektornih ćelija ubica), i ushodnu regulaciju liganda receptora smrti (npr. FasL) na površini T ćelije surface koji indukuje apoptozu target ćelije nakon vezivanja za njihov srodni receptor smrti (npr. Fas) na target ćeliji.
[0391] Predmetni opis obezbeđuje postupak za tretiranje subjekta kome je dijagnostifikovan kancer, koji sadrži uklanjanje imunih efektornih ćelija subjekta, genetički modifikovanih pomenutih imunih efektornih ćelija sa vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira konstruisani TCR ili CAR kao što je ovde predviđeno, čime se proizvodi populacija modifikovanih imunih efektornih ćelija, i primenu populacije modifikovanih imunih efektornih ćelija na istog subjekta. U poželjnom primeru, imune efektorne ćelije sadrže T ćelije.
[0392] Predmetni opis takođe obezbeđuje postupke za stimulaciju imunih efektornih ćelija posredovanog imunim modulatornim odgovorom na populaciju target ćelija kod subjekta koji sadrži korake primene na subjekta populacije imunih efektornih ćelija koje eksprimiraju konstrukt nukelinske kiseline koji kodira konstruisani TCR ili CAR molekul.
[0393] Postupci za primenu kompozicija ćelija opisanih ovde uključuju bilo koji postupak koji je efikasan da rezultuje u reintrodukciji ex vivo genetički modifikovanih imunih efektornih ćelija koje ili direktno eksprimiraju konstruisani TCR ili CAR u subjektu ili na reintrodukciji genetički modifikovanih progenitora imunih efektornih ćelija koje po introdukciji u subjekta diferenciraju u zrele imune efektorne ćelije koje eksprimiraju konstruisani TCR ili CAR. Jedan postupak sadrži transdukciju T ćelija periferne krvi ex vivo sa konstruktom nukelinske kiseline u skladu sa pronalaskom i vraćanje transdukovanih ćelija u subjekt.
[0394] Iako je prethodni pronalazak opisan nešto detaljnije putem ilustracije i primera u svrhu jasnoće razumevanja, stručnjaku će lako biti očigledno u svetlu podataka iz predmetnog pronalaska da se mogu načiniti njegove određene izmene i modifikacije. Sledeći primeri su obezbeđeni samo kao ilustracija i nisu ograničavajući. Stručnjaci će lako prepoznati različite nekritične parametre koji se mogu promeniti ili modifikovati da bi se dobili suštinski slični rezultati.
PRIMERI
PRIMER 1
PROLIFERACIJA T ĆELIJA KULTIVISANIH SA AKT INHIBITOROM
[0395] Svrha ovog eksperimenta bila je da se odredi efekat Akt inhibitora na proliferaciju T
1
ćelija. Uticaj MK-2206 (Selleckchem) na proliferaciju T ćelija procenjen je merenjem deobe T ćelija.
[0396] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su heterogena ćelijska populacija koja sadrži T ćelije. PBMC su sakupljene od normalnih donora i obeležene sa fluorescentnom bojom (CellTrace® Violet, Molecular Probes), čiji intenzitet je progresivno razblažen sa faktorom od dva sa svakom ćelijskom deobom. Obeležene PBMCs lkorišćene su kao izvor ćelija za ekspanziju T ćelija. T ćelije su aktivirane i podvrgnute ekspanziji kultivisanjem obeleženih PBMCs sa CD3 i CD28 antitelima (Miltenyi Biotec) u medijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix).
[0397] Uticaj MK-2206 na deobu ćelija analiziran je procenom CellTrace Violet razblaženja sa protočnom citometrijom nakon dodavanja 0.025 mM, 0.074 mM, 0.222 mM, 0.67 mM, ili 2.0 mM, MK-2206 T kulturama na dan 0. Svež XVIVO-15 – zasnovani medijum kulture koji sadrži IL-2 i MK-2206 dodat je kulturama T ćelija svaka dva do tri dana ukupno sedam dana da bi se dozvolio rast i ekspanzija T ćelija. MK-2206 tretman nije suštinski smanjio deobe T ćelija tri dana nakon iniciranja kulture (Slika 1A). Dodatno, T ćelije kultivisane u prisustvu MK-2206 seven dana nisu pokazale statistički značajne razlike u deobi T ćelija u poređenju sa vehikulumom ili ne-tretiranim kontrolama (Slika IB). T test za zavisne uzorke je izveden na svim sedmodnevnim kulturama; (svaka koncentracija MK-2206 poređena je sa 0 mM MK-2206: kulture nisu bili statistički različite na p≤0.05 nivou).
PRIMER 2
CD62L EKSPRESIJA NA T ĆELIJAMA TRETIRANIM SA MK-2206
[0398] Svrha ovog eksperimenta bila je da se odredi efekat Akt inhibitora na markere T ćelije za potenciju T ćelije. Uticaj MK-2206 (Selleckchem) na potenciju T ćelija procenjen je merenjem CD62L ekspresije u T ćelijskim kulturama proizvedenim u Primeru 1.
[0399] Mišji modeli su pokazali da CD62L ekspresija identifikuje potentne T ćelije; T ćelije sa većom antitumorskom efikasnošću nakon adoptivnog transfera. Međutim, pokazano je da T ćelije kultivisane sa IL-2 in vitro smanjuju CD62L ekspresiju i stoga su u korelaciji sa smanjenom anti-tumorskom potencijom tumor-specifičnih T ćelija. Iznenađujuće, pronalazak predmetnog pronalaska je otkrio da AKT inhibitor MK-2206 značajno povećava CD62L ekspresiju na svim koncentracijama MK-2206 testiranim nakon sedam dana kulture i u prisustvu IL-2. Slika 2. T test za zavisne uzorke je izveden na svim sedmodnevnim kulturama
2
(svaka koncentracija MK-2206 je poređena sa 0 mM MK- 2206: *p<.05, *p<.01).
PRIMER 3
CD62L EKSPRESIJA CAR T ĆELIJA TRETIRANIH SA MK-2206 ili ZSTK474
[0400] CAR T ćelije su kultivisane sa ili MK-2206 ili triciribin fosfat - TCN (AKT inhibitori) ili ZSTK474 (PI3K inhibitor). CAR T ćelije specifične za antigen sazrevanja B ćelija (BCMA) korišćene su u ovom setu eksperimenata. Kulture CAR T ćelija su izveden korišćenjem sistema direktno skalabilnog do velikih kliničkih procesa proizvodnje. Ukratko, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su kultivisane u statičkim bocama u medijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix) i antitela specifična za CD3 i CD28 (Miltenyi Biotec). 2x10<8>transdukovanih jedinica lentivirusa koji kodira anti-BCMA CARs je dodato jedan dan nakon iniciranja kulture. Anti-BCMA CAR T ćelije su održavane u log-fazi dodavanjem svežeg medijuma koji sadrži IL-2 i optimizovanu dozu inhibitora za ukupno deset dana kulture. N akraju kulture, anti-BCMA CAR T ćelije su ispitivane u odnosu na fenotip.
[0401] Ekspresija CD62L na anti-BCMA CAR T ćelijama procenjena je protočnom citometrijom na kraju kultivisanja. Anti-BCMA CAR T ćelije su specifično identifikovane korišćenjem rekombinantnog humanog BCMA-IgG Fc konjugovanog sa PE. CD62L ekspresija je određena sa ko-nojenjem korišćenjem antitela specifičnog za CD62L. Anti-BCMA CAR T ćelije od tri normalna donora kultivisane sa IL-2 i MK2206 imale su značajno veću CD62L ekspresiju u poređenju sa kulturama sa samim IL-2. Lentivirusna transdukcija za ekspresiju anti-BCMA CARs nije smanjila poboljšani fenotip izazvan MK2206. Slično poboljšanje je uočeno korišćenjem ZST474 tokom kultivisanja ali ne sa TCN. (Slika 3).
PRIMER 4
CAR T ĆELIJE TRETIRANE SA MK-2206 ili ZSTK474 POKAZUJU POBOLJŠANU TERAPEUTSKU AKTIVNOST
[0402] Anti-BCMA CAR T ćelije tretirane sa MK-2206, TCN, ili ZSTK474 kao što je opisano u Primeru 3 testirane su da se proceni da li je povećana CD62L ekspresija bila povezana sa povećanom anti-tumorskom aktivnošću. T ćelije koje eksprimiraju anti-BCMA CARs su stvorene nakon kultivisanja sa IL-2 i ili MK2206, TCN, ili ZSTK474. Alikvot CAR T ćelija je takođe kultivisan u medijumu sa dodatkom IL-7 i IL-15 na dozama prethodno pokazanim da poboljšavaju terapijsku efikasnost CAR T ćelija. Životinjama sa 100 mm<3>potkožnim multiplim mijelom tumorima (RPMI-8226) data je infuzija sa ekvivalentnim CAR T ćelijskim dozama (1x10<6>CAR-pozitivnih ćelija).
[0403] Anti-BCMA CAR T ćelije kultivisane sa IL-2 bile su dovoljne da izazovu kompletnu regresiju tumora. Anti-BCMA CAR T ćelije kultivisane sa IL-7 i IL-15, MK-2206, ili ZST747 pokazale su slične nivoe anti-tumorske aktivnosti u poređenju sa anti-BCMA CAR T ćelijama kultivisanim sa standardnim IL-2 u ovom multipli mijelom životinjskom modelu. Nasuprot tome, anti-BCMA CAR T ćelije kultivisane sa TCN kompeltno su ukinule bilo koje anti-tumorske odgovore. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na Slici 4.
PRIMER 5
CAR T ĆELIJE TRETIRANE SA MK-2206 ili ZSTK474 POKAZUJU POBOLJŠANU TERAPEUTSKU AKTIVNOST U MODELU AGRESIVNOG TUMORA
[0404] Agresivniji i teži za lečenje model tumora je korišćen za procenu anti-tumorske aktivnosti CAR T ćelija tretiranih sa IL-2, MK-2206, TCN, ZSTK474, IL7/15, ili vehikulumom. Daudi tumor ćelije eksprimiraju nizak nivo BCMA proteina i mogu se efikasno tretirati korišćenjem anti-BCMA CAR T ćelija. Na napredovanje Daudi tumora tretman sa IL-2- ili IL7/15-kultivisanim anti-BCMA CAR T ćelijama nije imao uticaj. Začuđujuće, anti-BCMA CAR T ćelije kultivisane ili sa MK-2206 ili ZST474 izazavale su kompletnu regresiju tumora. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na Slici 5.
PRIMER 6
CAR T ĆELIJE TRETIRANE SA MK-2206 ili ZSTK474 POKAZUJU POBOLJŠANU PERZISTENCIJU
[0405] Klinički podaci kod pacijenata tretiranih sa CAR T ćelijama sugerišu da je perzistencija povezana sa objektivnim odgovorima tumora. Perzistencija anti-BCMA CAR T ćelija je procenjena re-provokacijom tumora kod miševa koji su imali kompletnu regresiju. Životinje tretirane sa IL-2-, MK- 2206-, ili ZSTK474-kultivisanim anti-BCMA CAR T ćelijama koje su kompletno regresirale 100 mm<3>RPMI-8226 tumore su re-provocirane 13
4
dana kasnije sa RPMI-8226 na suprotnom boku. Životinje tretirane sa IL-2 kultivisanim CAR T ćelijama nisu bile sposobne da spreče rast tumora. Nasuprot tome, nijedna od životinja tretiranih sa ZSTK474-kultivisanim anti- BCMA CAR T ćelijama nije pokazala graftovanje tumora. Ovi podaci pokazuju da terapeutski aktivne anti- BCMA CAR T ćelije opstaju u ZSTK474-kultivisanim anti-BCMA CAR T ćelijama. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na Slici 6.

Claims (8)

Patentni zahtevi
1. In vitro ili ex vivo postupak za proizvodnju T ćelija koji sadrži:
(a) aktiviranje populacije T ćelija i stimulaciju populacije T ćelije da proliferišu, naznačen time da su koraci aktivacije i stimulacije izvedeni u prisustvu PI3K inhibitora; (b) transdukovanje T ćelija sa virusnim vektorom koji sadrži konstruisani T ćelijski receptor (TCR) ili himerni antigen receptor (CAR); i
(c) kultivisanje transdukovanih T ćelija da proliferišu;
naznačeno time da koraci aktivacije i stimulacije izvedeni u prisustvu PI3K inhibitora rezultuju u održavanju proliferacije i smanjenju diferencijacije transdukovanih T ćelija u poređenju sa proliferacijom i diferencijacijom transdukovanih T ćelija koje su aktivirane i stimulisane u odsustvu PI3K inhibitora.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da
(a) izvor T ćelija su mononuklearne ćelije periferne krvi;
(b) aktivacija T ćelija sadrži dovođenje u kontakt T ćelija sa anti-CD3 antitelom ili njegovim CD3-vezujućim fragmentom;
(c) stimulacija T ćelija sadrži dovođenje u kontakt T ćelija sa anti-CD28 antitelom ili njegovim CD28-vezujućim fragmentom, B7-1 ili njegovim CD28- vezujućim fragmentom, ili B7-2 ili njegovim CD28-vezujućim fragmentom;
(d) T ćelije su transdukovane sa virusnim vektorom pre proliferacije T ćelija; ili (e) T ćelije su transdukovane sa virusnim vektorom nakon proliferacije T ćelija.
3. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, naznačen time da:
(a) virusni vektor je retrovirusni vektor;
(b) virusni vektor je lentivirusni vektor; ili
(c) T ćelije sadrže CAR.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time da CAR sadrži
a) ekstracelularni domen koji ivezuje antigen izabran iz grupe koja se sastoji od: BCMA, alfa folat receptor, 5T4, αvβ6 integrin, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, EGFR familija uključujući ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, fetalni AchR, FRα, GD2, GD3, Glipikan-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLAA1+ NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLAA3+ NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lambda, Lewis-Y, Kapa, Mezotelin, Mucl, Muc16, NCAM, NKG2D Ligande, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivin, TAG72, TEMs, i VEGFR2;
b) transmembranski domen izveden iz polipeptida izabranog iz grupe koja se sastoji od: CD8α; CD4, CD28, CD45, PD-1, i CD152;
c) jedan ili više intracelularnih kostimulatornih signalnih domena izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PDL2), CD274 (PD-L1), i CD278 (ICOS); i
d) CD3ζ signalni domen.
5. Postupak prema ptentnom zahtevu 4, naznačen time da:
(a) ekstracelularni domen sadrži an antitelo ili antigen vezujući fragment koji vezuje antigen; (b) transmembranski domen je izveden iz CD8α ili CD28;
(c) jedan ili više kostimulatornih signalnih domena je izabran iz grupe koja se sastoji od: CD28, CD134, i CD137;
(d) CAR dodatno sadrži polipeptid zglobnog regiona;
(e) CAR dodatno sadrži polipeptid zglobnog regiona koji sadrži zglobni region IgG1 ili CD8α;
(f) CAR dodatno sadrži signalni peptid;
(g) CAR dodatno sadrži signalni peptid koji sadrži signalni polipeptid IgG1 teškog lanca ili CD8α signalni polipeptid.
6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačen time da PI3K inhibitor je:
(a) pan-PI3K inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: BEZ235, LY294002, i GDC-0941;
(b) selektivni PI3K inhibitor izabran iz grupe koja se sastoji od: BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, i IPI-145; ili
(c) ZSTK474.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačen time da populacija T ćelija aktivirana i stimulisana u prisustvu PI3K inhibitora ima povećani broj T ćelija koje eksprimiraju jedan ili više markera izabranih iz grupe koja se sastoji od: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, i CD127 u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i stimulisanih u odsustvu PI3K inhibitora.
8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 7, naznačeno time da populacija T ćelija aktiviranih i stimulisanih u prisustvu PI3K inhibitora ne eksprimira CD57 ili KLRG1 ili eksprimira manje CD57 ili KLRG1 u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i stimulisanih u odsustvu PI3K inhibitora.
RS20210077A 2014-06-06 2015-06-05 Poboljšane kompozicije t ćelija RS61406B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462008957P 2014-06-06 2014-06-06
EP15802488.5A EP3151672B1 (en) 2014-06-06 2015-06-05 Improved t cell compositions
PCT/US2015/034515 WO2015188119A1 (en) 2014-06-06 2015-06-05 Improved t cell compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61406B1 true RS61406B1 (sr) 2021-03-31

Family

ID=54767459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210077A RS61406B1 (sr) 2014-06-06 2015-06-05 Poboljšane kompozicije t ćelija

Country Status (26)

Country Link
US (3) US10479975B2 (sr)
EP (2) EP3151672B1 (sr)
JP (2) JP6663359B2 (sr)
KR (2) KR102845957B1 (sr)
CN (2) CN106793780B (sr)
AU (3) AU2015269197B2 (sr)
BR (1) BR112016028644B1 (sr)
CA (1) CA2951044C (sr)
CY (1) CY1123823T1 (sr)
DK (1) DK3151672T3 (sr)
ES (1) ES2846811T3 (sr)
HR (1) HRP20210116T1 (sr)
HU (1) HUE053101T2 (sr)
IL (1) IL249313A0 (sr)
LT (1) LT3151672T (sr)
MX (2) MX380612B (sr)
NZ (1) NZ726989A (sr)
PL (1) PL3151672T3 (sr)
PT (1) PT3151672T (sr)
RS (1) RS61406B1 (sr)
RU (1) RU2719030C2 (sr)
SG (3) SG10201810723VA (sr)
SI (1) SI3151672T1 (sr)
SM (1) SMT202100049T1 (sr)
WO (1) WO2015188119A1 (sr)
ZA (2) ZA201608378B (sr)

Families Citing this family (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009204483B2 (en) 2008-01-04 2014-03-13 Intellikine, Llc Certain chemical entities, compositions and methods
US8193182B2 (en) 2008-01-04 2012-06-05 Intellikine, Inc. Substituted isoquinolin-1(2H)-ones, and methods of use thereof
JP6294666B2 (ja) * 2010-04-13 2018-03-14 イミュノバティブ セラピーズ，リミテッド 制御性ｔ細胞の阻害のための方法および組成物
KR20180080358A (ko) 2011-01-10 2018-07-11 인피니티 파마슈티칼스, 인코포레이티드 이소퀴놀린온 및 이의 고체 형태의 제조 방법
US8828998B2 (en) 2012-06-25 2014-09-09 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Treatment of lupus, fibrotic conditions, and inflammatory myopathies and other disorders using PI3 kinase inhibitors
IL291945B2 (en) 2012-11-01 2025-11-01 Infinity Pharmaceuticals Inc Treatment of cancers using pi3 kinase isoform modulators
US20150320755A1 (en) 2014-04-16 2015-11-12 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies
CA2946552A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Bluebird Bio, Inc. Improved methods for manufacturing adoptive cell therapies
PL3689899T3 (pl) 2014-04-25 2022-01-31 2Seventy Bio, Inc. Chimeryczne receptory antygenowe promotora mnd
KR20210014210A (ko) 2014-05-15 2021-02-08 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르 변형된 천연 살해 세포 및 그의 용도
DK3151672T3 (da) * 2014-06-06 2021-02-01 Bluebird Bio Inc Forbedrede t-celle-sammensætninger
EP3193915A1 (en) * 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
MX2017001079A (es) 2014-07-24 2017-09-12 Bluebird Bio Inc Receptores de antígeno quiméricos de antígeno de maduración de células b (bcma).
US20160051669A1 (en) * 2014-08-21 2016-02-25 Georgia Regents University Research Institute, Inc. Compositions and methods for selectively modulating tregs
SMT201900596T1 (it) 2014-12-12 2019-11-13 Bluebird Bio Inc Recettori chimerici di antigene per bcma
WO2016185443A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Novartis Ag Pharmaceutical combination of everolimus with dactolisib
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
EP3364969A4 (en) 2015-10-20 2019-07-10 Kite Pharma, Inc. METHOD FOR THE PRODUCTION OF T CELLS FOR T CELL THERAPY
WO2017070042A1 (en) * 2015-10-20 2017-04-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing t cell populations using akt inhibitors
CA3004299A1 (en) * 2015-11-05 2017-05-11 City Of Hope Methods for preparing cells for adoptive t cell therapy
WO2017099712A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Bluebird Bio, Inc. Improved t cell compositions
US11096964B2 (en) * 2016-01-20 2021-08-24 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
WO2017127755A1 (en) * 2016-01-20 2017-07-27 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
WO2017130223A2 (en) * 2016-01-29 2017-08-03 Virocan Therapeutics Pvt. Ltd. A chimeric antigen receptor specific to b-cell maturation antigen, a recombinant expression vector and a method thereof
US20170216355A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-03 Augusta University Research Institute, Inc. Methods and Compositions for Enhancing T Cell Function and Survival
WO2017133175A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered mammalian cells for cancer therapy
US20200063157A9 (en) * 2016-02-26 2020-02-27 Poseida Therapeutics, Inc. Transposon system and methods of use
WO2017149515A1 (en) * 2016-03-04 2017-09-08 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
JP6980683B2 (ja) * 2016-03-17 2021-12-15 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 細胞分泌物の分析のための装置及び方法
WO2017176932A1 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Emory University Methods of treating cancer and infectious diseases using cell based therapies
CN109715808A (zh) * 2016-04-15 2019-05-03 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质表达的组合物和方法
CN105907790A (zh) * 2016-06-21 2016-08-31 林志国 特异性识别EGFRvⅢ的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法
CA3028718A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies
CA3032498A1 (en) * 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
EP3500696A4 (en) 2016-08-16 2020-04-08 Bluebird Bio, Inc. VARIANTS OF IL-10 ALPHA RECEPTOR HOMING ENDONUCLEASE, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
CN106222201B (zh) * 2016-08-27 2017-11-28 北京艺妙神州医疗科技有限公司 一种制备car‑t细胞的方法以及制得的car‑t细胞及其应用
BR112019009099A2 (pt) 2016-11-04 2019-07-16 Bluebird Bio Inc composições de células t car anti-bcma
WO2018096402A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Novartis Ag Methods of enhancing immune response with everolimus, dactolisib or both
WO2018102397A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
EP3548049A4 (en) 2016-12-05 2020-07-22 Fate Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATION OF IMMUNE CELLS IN ADOPTIVE IMMUNOTHERAPIES
US12324836B2 (en) * 2016-12-07 2025-06-10 Transtarget, Inc. Methods and compositions for vaccinating and boosting cancer patients
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
WO2018143454A1 (ja) * 2017-02-06 2018-08-09 国立研究開発法人国立がん研究センター 新規ｔ細胞受容体
CA3056439A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Truncated nkg2d chimeric receptors and uses thereof in natural killer cell immunotherapy
AU2018245749A1 (en) 2017-03-27 2019-10-03 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
CA3054104A1 (en) * 2017-03-27 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved antigen binding receptor formats
WO2018201088A1 (en) * 2017-04-27 2018-11-01 Washington University Activation of natural cytotoxicity receptor 2 (ncr2)
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201056A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN107236762A (zh) * 2017-06-19 2017-10-10 河北浓孚雨生物科技有限公司 一种微环dna转染t细胞制备临床级car‑t细胞制剂的方法
WO2019006468A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Memorial Sloan Kettering Cancer Center COMPOSITIONS AND METHODS FOR ADOPTIVE CELL THERAPY
US12178830B2 (en) 2017-06-30 2024-12-31 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for adoptive cell therapy for cancer
CA3068636A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for adoptive cell therapy for cancer
WO2019018603A2 (en) * 2017-07-19 2019-01-24 Fate Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATION OF IMMUNE CELLS IN ADOPTIVE IMMUNOTHERAPIES
CN109306013B (zh) * 2017-07-26 2020-09-25 重庆精准生物技术有限公司 抗cd20抗原的嵌合抗原受体及其应用
EP4653429A1 (en) 2017-09-07 2025-11-26 Augusta University Research Institute, Inc. Specific akt3 activator and uses thereof
CN111433354A (zh) * 2017-09-26 2020-07-17 朗沃德大学 作为免疫疗法的pd1特异性嵌合抗原受体
US11999802B2 (en) 2017-10-18 2024-06-04 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
WO2019084234A1 (en) * 2017-10-26 2019-05-02 St. Jude Childen's Research Hospital, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CD33 + CANCERS AND IMPROVING IN VIVO PERSISTENCE OF CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T CELLS
SG11202003657VA (en) * 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Process for producing a t cell composition
CN107893055B (zh) * 2017-11-03 2020-07-17 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途
SG11202004512XA (en) 2017-11-15 2020-06-29 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
JP2021503885A (ja) * 2017-11-22 2021-02-15 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 末梢血からの末梢血リンパ球（ｐｂｌ）の拡大培養
CA3083949A1 (en) 2017-11-30 2020-06-06 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
WO2019110667A1 (en) * 2017-12-05 2019-06-13 Celyad S.A. Reducing fratricide of immune cells expressing nkg2d-based receptors
CN112218651A (zh) 2018-01-08 2021-01-12 诺华公司 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
US10561686B2 (en) * 2018-01-12 2020-02-18 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
US20210038659A1 (en) 2018-01-31 2021-02-11 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
SG11202007156QA (en) 2018-02-09 2020-08-28 Nat Univ Singapore Activating chimeric receptors and uses thereof in natural killer cell immunotherapy
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
CN112119157B (zh) 2018-03-06 2025-01-14 宾夕法尼亚大学董事会 前列腺特异性膜抗原car及其使用方法
CN110272481A (zh) * 2018-03-14 2019-09-24 中国科学院广州生物医药与健康研究院 识别mage1抗原短肽的t细胞受体
SG11202008976YA (en) 2018-04-02 2020-10-29 Nat Univ Singapore Neutralization of human cytokines with membrane-bound anti-cytokine non-signaling binders expressed in immune cells
WO2019195142A1 (en) * 2018-04-03 2019-10-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Mesenchymal stem cells comprising a chimeric antigen receptor (car) for treating inflammatory and autoimmune diseases
US10869888B2 (en) 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
US20210371852A1 (en) * 2018-05-18 2021-12-02 Children's National Medical Center System of cell expansion and methods of using the same
US12060419B2 (en) 2018-06-14 2024-08-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CD79A chimeric antigen receptors
US20220226374A1 (en) * 2018-06-14 2022-07-21 2seventy bio, Inc Cd79b chimeric antigen receptors
CN119529091A (zh) * 2018-06-19 2025-02-28 南京传奇生物科技有限公司 工程化的细胞及其用途
US12486514B2 (en) 2018-08-29 2025-12-02 National University Of Singapore Method to specifically stimulate survival and expansion of genetically-modified immune cells
US12240915B2 (en) 2018-08-30 2025-03-04 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
EP3844267B1 (en) 2018-08-31 2025-06-25 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3844265A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
AU2019336229A1 (en) * 2018-09-07 2021-03-18 Sotio, LLC Chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules modulating intracellular lactate concentrations and therapeutic uses thereof
CA3118493A1 (en) * 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
US20210393753A1 (en) * 2018-11-06 2021-12-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Fgl2 neutraling cell therapy and methods of use thereof
WO2020102701A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Rapa Therapeutics, Llc Methods for the manufacture of th1/tc1 phenotype t cells
US10918667B2 (en) 2018-11-20 2021-02-16 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expressing therapeutic agent and uses thereof
WO2020112975A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 The Medical College Of Wisconsin, Inc. T-rapa cells as novel effector cell type for chimeric antigen receptor therapy
CN109694884B (zh) * 2019-01-09 2025-03-28 上海美丽人生医疗科技有限公司 用于在结肠癌治疗中应用的car-t载体的制备及其构建方法
EP3930763A1 (en) 2019-02-25 2022-01-05 Novartis AG Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
KR20210137085A (ko) 2019-03-05 2021-11-17 엔카르타, 인크. Cd19 유도된 키메라 항원 수용체 및 면역 요법에서 이의 용도
US20230074800A1 (en) 2019-03-21 2023-03-09 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
WO2020206061A1 (en) * 2019-04-05 2020-10-08 Bluebird Bio, Inc. Manufacturing anti-bcma car t cells
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
EP3966251A4 (en) * 2019-05-08 2023-05-10 Inhibrx, Inc. IMMUNOTHERAPIES TARGETED AGAINST CD33
EP3980037A4 (en) * 2019-06-06 2023-06-21 President and Fellows of Harvard College Cardiomyocytes and compositions and methods for producing the same
CN110229236B (zh) * 2019-06-13 2023-06-09 郑州大学第一附属医院 诱导肿瘤细胞上调抗原muc1表达用car及其应用
CN114761037A (zh) 2019-11-26 2022-07-15 诺华股份有限公司 结合bcma和cd19的嵌合抗原受体及其用途
KR102539610B1 (ko) * 2020-01-22 2023-06-02 한국생명공학연구원 메모리 b 세포 특이적 분화 유도 방법 및 이의 활용
US12076343B2 (en) 2020-02-19 2024-09-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Engineered safety in cell therapy
BR112022016633A2 (pt) 2020-02-27 2022-12-13 Novartis Ag Métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
KR20220146530A (ko) 2020-02-27 2022-11-01 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체-발현 세포의 제조 방법
KR102387595B1 (ko) * 2020-03-23 2022-04-15 연세대학교 산학협력단 면역 세포의 면역 기능 향상을 위한 방법 및 이에 따른 면역 세포주
GB202005617D0 (en) * 2020-04-17 2020-06-03 Adaptimmune Ltd Improved t cell manufacturing process
US12043654B2 (en) 2020-06-02 2024-07-23 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Anti-GCC antibody and CAR thereof for treating digestive system cancer
KR20230024967A (ko) 2020-06-11 2023-02-21 노파르티스 아게 Zbtb32 억제제 및 이의 용도
JP2023529853A (ja) * 2020-06-17 2023-07-12 ティジアーナ ライフ サイエンシズ パブリック リミティド カンパニー キメラ抗原受容体（ｃａｒ）ｔ細胞療法を増強するための組成物および方法
JP7795521B2 (ja) 2020-07-20 2026-01-07 エナンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 抗ウイルス剤としての官能化ペプチド
WO2022040586A2 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Novartis Ag Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
CN114426952A (zh) * 2020-10-29 2022-05-03 中国科学技术大学 用于白血病的car t细胞疗法的t细胞增效剂及获得增效t细胞的方法
US12540141B2 (en) 2020-11-23 2026-02-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11352363B1 (en) 2020-11-23 2022-06-07 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
CA3202764A1 (en) 2020-11-23 2022-05-27 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Novel spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11384090B2 (en) 2020-11-23 2022-07-12 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
CA3172530A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Spencer PARK Ror1 targeting chimeric antigen receptor
AU2022267891A1 (en) 2021-04-27 2023-11-09 Novartis Ag Viral vector production system
AU2022270361A1 (en) 2021-05-05 2023-11-16 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding prame
US11319325B1 (en) 2021-05-11 2022-05-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11325916B1 (en) 2021-07-29 2022-05-10 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11339170B1 (en) 2021-07-23 2022-05-24 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
WO2023021477A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations
WO2024097793A1 (en) * 2022-11-04 2024-05-10 The Regents Of The University Of California Method for manufacturing therapeutic immune cells
EP4584283A1 (en) * 2022-11-14 2025-07-16 Caribou Biosciences, Inc. Anti-cll-1 chimeric antigen receptors, engineered cells and related methods
EP4622631A1 (en) 2022-11-23 2025-10-01 University of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of use thereof for increasing immune responses

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
DE8817132U1 (de) 1988-01-09 1993-04-22 Asta Medica AG, 6000 Frankfurt 1,2-Bis(aminomethyl)cyclobutan-Platin-Komplexe
US7479269B2 (en) 1988-11-23 2009-01-20 Genetics Institute, Llc Methods for selectively enriching TH1 and TH2 cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP1498427B1 (en) 1992-08-21 2009-12-16 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
DE4415263C1 (de) 1994-04-15 1995-11-30 Asta Medica Ag Cis-[trans-1,2-Cyclobutanbis(methylamin)-N,N']-[(2S)-lactato-O·1·, O·2·]-platin(II)-trihydrat (Lobaplatin-Trihydrat), seine Herstellung und arzneiliche Verwendung
US6632789B1 (en) * 1994-04-29 2003-10-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for modulating T cell responses by manipulating intracellular signal transduction
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
IL125884A0 (en) 1996-03-04 1999-04-11 Targeted Genetics Corp Modified rapid expansion methods ("modified-rem") for in vitro propagation of t lymphocytes
US20020177125A1 (en) 1997-03-04 2002-11-28 Kamb Carl Alexander Human rhinovirus assays, and compositions therefrom
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
FR2777909B1 (fr) 1998-04-24 2002-08-02 Pasteur Institut Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le tranfert de sequences de nucleotides dans des cellules, vecteurs recombinants contenant ces sequences triplex
AU4328801A (en) 2000-02-24 2001-09-03 Xcyte Therapies Inc Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
WO2002066516A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
AU2002257420A1 (en) 2001-05-01 2002-11-11 National Research Council Of Canada A system for inducible expression in eukaryotic cells
DE10132502A1 (de) 2001-07-05 2003-01-23 Gsf Forschungszentrum Umwelt Angriff auf Tumorzellen mit fehlender, niedriger oder anormaler MHC-Expression durch kombinieren von nicht MHC-Restringierten T-Zellen/NK-Zellen und MHC-Restringierten Zellen
US7638325B2 (en) 2002-01-03 2009-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform
JP2006503110A (ja) * 2002-10-09 2006-01-26 トーラーレックス， インク． エフェクタｔ細胞または制御性ｔ細胞に選択的に結合する分子およびその使用方法
GB0224442D0 (en) 2002-10-21 2002-11-27 Molmed Spa A delivery system
DK1623017T3 (da) 2003-05-08 2011-01-10 Life Technologies Corp Frembringelse og isolering af antigenspecifikke T-celler
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
FR2872170B1 (fr) 2004-06-25 2006-11-10 Centre Nat Rech Scient Cnrse Lentivirus non interactif et non replicatif, preparation et utilisations
WO2006039500A2 (en) 2004-09-29 2006-04-13 California Institute Of Technology Multi-element phased array transmitter with lo phase shifting and integrated power amplifier
GB0503936D0 (en) * 2005-02-25 2005-04-06 San Raffaele Centro Fond Method
WO2006127585A2 (en) 2005-05-20 2006-11-30 Virxsys Corporation Transduction of primary cells
WO2007018318A1 (ja) 2005-08-10 2007-02-15 National University Corporation Kanazawa University 小脳星状細胞及び／又は籠細胞特異的な遺伝子発現方法
JP2010512738A (ja) * 2006-12-14 2010-04-30 メディカル リサーチ カウンシル 方法及び使用
JP5666903B2 (ja) 2007-05-23 2015-02-12 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 導入遺伝子の発現を増強するための方法および組成物
WO2009091826A2 (en) 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
EP4032552B1 (en) 2008-08-26 2023-10-04 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
PL2172211T3 (pl) 2008-10-01 2015-05-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Kompozycja związanych z guzem peptydów i związana z tym szczepionka przeciwrakowa do leczenia glejaka (GBM) i innych rodzajów raka
AU2010224160A1 (en) 2009-03-10 2011-09-22 Biogen Idec Ma Inc. Anti-BCMA antibodies
JP5934099B2 (ja) 2009-10-01 2016-06-15 アメリカ合衆国 抗血管内皮増殖因子受容体−２キメラ抗原受容体及び癌の治療のためのその使用
ES2717629T3 (es) 2009-11-03 2019-06-24 Hope City Receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt) para selección de células T transducidas
WO2011057124A1 (en) 2009-11-06 2011-05-12 Transtarget, Inc. Polyclonal bispecific antibody compositions and method of use
GB201004200D0 (en) 2010-03-15 2010-04-28 Univ Basel Spirocyclic compounds and their use as therapeutic agents and diagnostic probes
EP3467101A3 (en) 2010-09-08 2019-06-19 Baylor College of Medicine Immunotherapy of brain tumor using geneticially engineered gd2-specific t cells
PH12013501201A1 (en) * 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
BR112013018311A2 (pt) 2011-01-18 2017-03-21 Univ Pennsylvania sequência de ácido nucleico isolada, receptor de antígeno quimérico isolado, célula t geneticamente modificada, vetor, e, uso de uma célula t geneticamente modificada.
US20160002601A1 (en) 2011-03-03 2016-01-07 Stempeutics Research Pvt. Ltd. Methods of upscaling mesenchymal stromal cell production, compositions and kit thereof
RU2688185C2 (ru) 2011-03-23 2019-05-21 Фред Хатчинсон Кэнсер Рисерч Сентер Способ и композиции для клеточной иммунотерапии
JP2014514927A (ja) 2011-04-13 2014-06-26 イミュニカム・エイビイ 抗原特異的ｔ細胞の増殖のための方法
SG194176A1 (en) 2011-05-27 2013-12-30 Glaxo Group Ltd Bcma (cd269/tnfrsf17) -binding proteins
TR201819015T4 (tr) 2011-06-10 2019-01-21 Bluebird Bio Inc Adrenolökodi̇strofi̇ ve adrenomi̇yelonöropati̇ i̇çi̇n gen terapi̇ vektörleri̇
JP5802510B2 (ja) * 2011-09-30 2015-10-28 富士フイルム株式会社 パターン形成方法、感電子線性又は感極紫外線性樹脂組成物、及び、レジスト膜、並びに、これらを用いた電子デバイスの製造方法
US20140322216A1 (en) 2011-11-08 2014-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
MX2014010183A (es) * 2012-02-22 2015-03-20 Univ Pennsylvania Composiciones y metodos para generar una poblacion persistente de celulas t utiles para el tratamiento de cancer.
EA201990959A1 (ru) * 2012-04-11 2020-02-10 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания b-клеток
US20130280220A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
AU2013204923A1 (en) 2012-06-21 2014-01-16 Anthrogenesis Corporation Modified t lymphocytes having improved specificity
CN112375846A (zh) 2012-07-13 2021-02-19 宾夕法尼亚大学董事会 评估用于施用的转导t细胞的适用性的方法
KR102264290B1 (ko) 2012-08-20 2021-06-10 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물
AU2013312838B2 (en) 2012-09-04 2018-11-29 Cellectis Multi-chain chimeric antigen receptor and uses thereof
EP2711418B1 (en) 2012-09-25 2017-08-23 Miltenyi Biotec GmbH Method for polyclonal stimulation of T cells by flexible nanomatrices
AR092745A1 (es) 2012-10-01 2015-04-29 Univ Pennsylvania Composiciones que comprenden un dominio de union anti-fap y metodos para hacer blanco en celulas estromales para el tratamiento del cancer
CN112458057A (zh) * 2012-10-02 2021-03-09 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法
WO2014055771A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
AU2013329186B2 (en) 2012-10-10 2019-02-14 Sangamo Therapeutics, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
WO2014099671A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
ES2814962T3 (es) 2013-02-20 2021-03-29 Novartis Ag Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123
ES3058841T3 (en) 2013-03-15 2026-03-13 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
KR20200032763A (ko) * 2014-02-04 2020-03-26 카이트 파마 인코포레이티드 B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법
JP6772063B2 (ja) 2014-02-14 2020-10-21 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 誘導可能なキメラポリペプチドを使用して細胞を活性化するための方法
AU2015248956B2 (en) 2014-04-14 2020-06-25 Cellectis BCMA (CD269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
PL3689899T3 (pl) 2014-04-25 2022-01-31 2Seventy Bio, Inc. Chimeryczne receptory antygenowe promotora mnd
US20170049819A1 (en) 2014-04-25 2017-02-23 Bluebird Bio, Inc. Kappa/lambda chimeric antigen receptors
CA2946552A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Bluebird Bio, Inc. Improved methods for manufacturing adoptive cell therapies
DK3151672T3 (da) 2014-06-06 2021-02-01 Bluebird Bio Inc Forbedrede t-celle-sammensætninger
US10174095B2 (en) 2014-07-21 2019-01-08 Novartis Ag Nucleic acid encoding a humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor
MX2017001079A (es) 2014-07-24 2017-09-12 Bluebird Bio Inc Receptores de antígeno quiméricos de antígeno de maduración de células b (bcma).
SMT201900596T1 (it) 2014-12-12 2019-11-13 Bluebird Bio Inc Recettori chimerici di antigene per bcma
WO2016164429A1 (en) * 2015-04-06 2016-10-13 The General Hospital Corporation Anti-cspg4 chimeric antigen receptors
WO2017099712A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Bluebird Bio, Inc. Improved t cell compositions

Also Published As

Publication number Publication date
US20230193202A1 (en) 2023-06-22
AU2015269197B2 (en) 2018-10-04
EP3828265A1 (en) 2021-06-02
CN111394317B (zh) 2024-07-12
JP2017518052A (ja) 2017-07-06
EP3151672A1 (en) 2017-04-12
RU2020111566A (ru) 2020-05-19
CA2951044A1 (en) 2015-12-10
RU2017100003A3 (sr) 2018-11-14
AU2020201489B2 (en) 2021-10-21
JP6869390B2 (ja) 2021-05-12
CN111394317A (zh) 2020-07-10
MX380612B (es) 2025-03-12
AU2015269197A1 (en) 2016-12-22
SMT202100049T1 (it) 2021-03-15
RU2719030C2 (ru) 2020-04-16
PL3151672T3 (pl) 2021-05-31
KR102485855B1 (ko) 2023-01-09
HRP20210116T1 (hr) 2021-03-05
WO2015188119A1 (en) 2015-12-10
MX2021002877A (es) 2021-06-04
US11560547B2 (en) 2023-01-24
JP2020072756A (ja) 2020-05-14
IL249313A0 (en) 2017-02-28
HUE053101T2 (hu) 2021-06-28
SG11201610170SA (en) 2017-01-27
ZA201901336B (en) 2022-01-26
SG10201810723VA (en) 2018-12-28
BR112016028644B1 (pt) 2019-12-03
AU2020201489A1 (en) 2020-03-19
AU2018274888C1 (en) 2021-11-25
BR112016028644A2 (pt) 2017-08-22
LT3151672T (lt) 2021-02-10
KR20170007527A (ko) 2017-01-18
EP3151672B1 (en) 2020-11-04
CY1123823T1 (el) 2022-05-27
EP3151672A4 (en) 2018-01-17
EP3828265B1 (en) 2025-05-07
CN106793780B (zh) 2020-05-26
PT3151672T (pt) 2021-02-02
RU2017100003A (ru) 2018-07-16
US20200109365A1 (en) 2020-04-09
MX2016016076A (es) 2017-08-02
CA2951044C (en) 2023-10-03
US10479975B2 (en) 2019-11-19
JP6663359B2 (ja) 2020-03-11
DK3151672T3 (da) 2021-02-01
KR20230008915A (ko) 2023-01-16
AU2018274888B2 (en) 2019-12-05
SG10202108458XA (en) 2021-09-29
NZ726989A (en) 2020-08-28
ZA201608378B (en) 2019-06-26
CN106793780A (zh) 2017-05-31
SI3151672T1 (sl) 2021-03-31
AU2018274888A1 (en) 2018-12-20
US20170218337A1 (en) 2017-08-03
KR102845957B1 (ko) 2025-08-14
ES2846811T3 (es) 2021-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230193202A1 (en) Methods for making t cell compositions
US11479755B2 (en) T cell compositions
AU2015249376C1 (en) Improved methods for manufacturing adoptive cell therapies
JP6706244B2 (ja) Ｂｃｍａキメラ抗原受容体
RS59537B1 (sr) Bcma himerni antigenski receptori
RS60106B1 (sr) Mnd promoterni himerni antigenski receptori
KR20240159826A (ko) Muc16 키메라 항원 수용체
RU2813668C2 (ru) Способ производства t-клеток
HK40053928A (en) Improved t cell compositions
HK1233855A1 (en) Improved t cell compositions
HK1233855B (en) Improved t cell compositions