KR20210014210A - 변형된 천연 살해 세포 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20210014210A
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다리오 캄파나
데이비드 슈크
마사루 이마무라
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내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
세인트 쥬드 칠드런즈 리써치 호스피탈, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 몇몇 태양에서 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 천연 살해(NK) 세포, 및 상기와 같은 세포의 생성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 피실험자에서 암을 치료하거나 또는 NK 세포의 증대 및/또는 생존을 증진시키기 위해 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 천연 살해(NK) 세포를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

변형된 천연 살해 세포 및 그의 용도{MODIFIED NATURAL KILLER CELLS AND USES THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2014년 5월 15일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/993,494 호의 이점을 청구한다. 상기 출원의 전체 교시는 본 발명에 참고로 인용된다.
생체내에서 NK 세포의 생존 및 증식은 사이토킨, 예를 들어 IL-2 및 IL-15에 의한 자극을 필요로 한다. 예를 들어, 면역결핍 마우스에서 주사 후, 활성화된 NK 세포는 1주일 후에 검출할 수 없게 되지만 인간 IL-2가 또한 투여된 경우에는 한 달까지 지속되었다. 따라서, NK 세포 주입을 사용하는 임상 프로토콜은 전형적으로 환자에서 NK 세포 생존을 연장시키는데 IL-2 투여에 의존한다. 그러나, IL-2는 상당한 부작용을 가질 수 있다. IL-2 투여는 발열 및 오한 외에, 보다 심하고 잠재적으로 치명적인 결과, 예를 들어 모세혈관 누출 증후군을 유발할 수 있다. IL-2의 용량 감소는 부작용의 위험을 감소시키지만, NK 세포 기능을 억제할 수 있고 어쩌면 그의 항암 효과를 무효로 할 수 있는 조절 T 세포를 자극할 수 있다.
따라서, 시험관내 및/또는 생체내에서 NK 세포 증대(expansion) 및 활성을 촉진하는 대체 방법들을 개발하는 것이 중요할 것이다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청시 및 필요경비 지불시 관청에 의해 제공될 것이다.
상기는 첨부된 도면(여기에서 같은 도면번호는 상이한 시선들 전체를 통해 동일한 부분을 지칭한다)에 예시된 바와 같이, 하기 본 발명의 예시적인 실시태양의 보다 구체적인 기재로부터 자명할 것이다. 도면은 반드시 축척으로 그려질 필요는 없으며, 대신에 본 발명의 실시태양을 예시할 때 강조된다.
도 1A 내지 1C: IL-15 구조물(construct)의 디자인 및 발현. 1A. 본 연구에 사용된 야생형 및 막-결합된 IL-15 구조물("wtIL15" 및 "mbIL15")의 도식적 표현. 1B. mbIL15로 형질도입된 NK 세포의 표면의 IL-15의 발현. 증대된 NK 세포를 wtIL15, mbIL15 또는 GFP만을 함유하는 벡터("모의(mock)")로 형질도입시켰다. 유식 세포측정 점 플롯은 항-IL15 항체(R&D 시스템스) 및 피코에리쓰린에 접합된 염소-항-마우스 2차 항체(써던 바이오테크놀로지 어쏘시에이츠(Southern Biotechnology Associates))에 의해 검출된 바와 같은 GFP 및 IL-15의 발현을 예시한다. 각 사분면의 세포 백분율(>98% CD56+ CD3- NK 세포)을 나타낸다. 1C. wtIL15로 형질도입된 NK 세포에 의한 IL-15의 분비. 3명의 상이한 공여자로부터의 NK 세포를 3회 중복하여 시험하였다. 막대는 IL-2 부재하에서 24 및 48시간 배양 후 수집된 상등액 중에서 수행된 ELISA 측정의 평균±SD를 가리킨다. 모의-형질도입된 세포의 상등액에서는 IL-15가 검출되지 않았다.
도 2A 내지 2C: 시험관내에서 IL-15를 발현하는 NK 세포의 생존 및 증대. 2A. 15명의 공여자로부터의 모의- 및 mbIL15 형질도입된 세포(좌측 패널) 및 9명의 공여자로부터의 mbIL15- 또는 wtIL15-형질도입된 세포(우측 패널)에 대한 IL-2 부재하에 7-일 평행 배양 후 투입된 세포와 비교된 NK 세포 회수(cell recovery) 백분율. 수평 막대는 중간값을 가리킨다. 대응표본 t 검정의 결과를 나타낸다. IL-2(10 및 100 IU/㎖)와의 배양 결과를 부록 도면 S1에 나타낸다. 2B. 저 용량 IL-2(10 IU/㎖) 존재하의 6명의 공여자로부터의 모의- 및 mbIL15-형질도입된 NK 세포의 생존 및 증대. 2C. IL-2가 없거나 저 용량 IL-2(100 IU/㎖ IL2에 대한 결과는 도 6에 나타낸다)와 배양된 mbIL15, wtIL15로 형질도입되거나 또는 모의-형질도입된 하나의 공여자로부터의 NK 세포의 증대 및 장기간 생존. 지시된 배양 일수에서 NK 세포 회수의 백분율을 나타낸다.
도 3A 내지 3C: 생체내에서 mb-IL15를 발현하는 NK 세포의 생존 및 증대. 3A. 주입 후 7 및 11일째 IL-2의 존재 또는 부재하에서 모의- 또는 mbIL15 형질도입된 NK 세포가 주사된 마우스(총 16마리 마우스)의 말초 혈액 중 인간 CD45+ 세포의 절대수(IL-2가 없는 경우 P = 0.004, IL-2가 있는 경우 7일째 P = 0.021; 11일째 P = 0.044 및 0.026). 3B. 유식 세포측정 점 플롯은 IL-2 처리가 없는 경우(상부) 및 있는 경우(기부) 마우스 말초 혈액 중 인간 CD45+, GFP+ NK 세포의 존재를 예시한다. GFP 발현의 존재 또는 부재하의 인간 CD45+ 세포의 백분율을 나타낸다. 3C. 주사 후 11일째에 수집된 IL-2 존재 또는 부재하의 모의- 또는 mbIL15 형질도입된 NK 세포가 주사된 마우스의 다양한 조직 중의 인간 CD45+ 세포의 백분율. 집합적으로, 인간 45+ 세포의 백분율은 mbIL15의 존재하에서 현저하게 더 높았다(IL-2가 없는 경우 P<0.001, IL-2가 있는 경우 P = 0.002).
도 4A 내지 4C: mbIL15를 발현하는 NK 세포의 성질들. mbIL15로 형질도입되거나 모의-형질도입된 NK 세포 집단 중 배양 7일 전후의 GFP+ 세포의 상대적인 비율. 13명의 공여자로부터의 NK 세포에 대한 결과를 나타낸다; mbIL15의 경우 P<0.001, 모의의 경우 유의수준이 아니다. 4B. mbIL15-형질도입된 NK 세포의 면역표현형 특징. 유식 세포측정에 의한 세포 마커 분석을 IL-2 없이 48시간 동안 배양한 NK 세포상에서 수행하였다. 모든 결과를 표에 요약한다. 4C. 모의- 및 mbIL15-형질도입된 NK 세포를 IL-2 없이 48시간 동안 배양하고 세포 용해물을 키넥스 안티바디 마이크로어레이(Kinex Antibody Microarray)(키넥서스(Kinexus))에 의해 분석하였다. 시험된 809개 항-인단백질 항체 중에서, Z-비>0.5 및 오차 범위%<100의 신호를 갖는 것들을 나타낸다. 막대는 모의-형질전환된 NK 세포에서 표준화된 강도와 비교시 mbIL15를 발현하는 NK 세포에서의 신호변화 퍼센트를 가리킨다.
도 5A 내지 5D: mbIL15를 발현하는 NK 세포의 종양-억제(anti-tumor) 능력. 5A. 1:4 및 1:1 E:T 비(각각의 비에서 15개 실험; 상기 둘 다에 대해서 P<0.001)에서 Nalm-6, U937, K562, 다우디(Daudi), SK-BR-3 및 ES8 세포주에 대한 9명의 공여자로부터의 mbIL15- 및 모의-형질도입된 NK 세포에 의한 24-시간 세포독성 분석의 결과. 4-시간 및 24-시간 세포독성 분석에서 개별적인 세포주에 대해 획득된 결과를 도 7에 나타낸다. 5B. mbIL15를 발현하는 NK 세포는 표적 세포의 존재하에서 세포용해 과립의 증가된 방출을 갖는다. 1:1 E:T에서 4-시간 세포독성 분석 후 CD107a+ NK 세포의 백분율. 2개의 세포주에 대한 3명의 공여자로부터의 NK 세포에 의한 결과를 나타낸다(P=0.007). 5C. mbIL15를 발현하는 NK 세포는 생체내에서 종양-억제 활성을 발휘한다. NOD-SCID-IL2RGnull 마우스에게 루시페라제 표지된 1x104 U937 세포를 i.p. 주사하였다. 3마리 마우스에서, 처리를 제공하지 않은 반면("NK 없음"), 4마리 마우스에게는 3 및 7일째에 모의-형질도입된 NK 세포(1x107 i.p.)를 제공하였고, 4마리의 다른 마우스에게는 동일한 용량 및 스케줄로 mbIL15-형질도입된 NK 세포를 제공하였다. 종양 성장의 생체내 영상화 결과를 나타낸다(복부 상). 5D. 상이한 처리 그룹들에서 마우스의 전체 생존 비교. 마우스를 생물발광이 1x1011 광자/초에 도달했을 때 안락사시켰다. 3개의 곡선에 대한 로그 순위 시험 및 각각의 2개의 곡선간의 비교에 대한 P 값을 나타낸다.
도 6A 내지 6C: 시험관내에서 IL-15를 발현하는 NK 세포의 생존 및 증대. 6A. IL-2의 부재하에서 mbIL15를 발현하는 NK 세포의 증대가 항-IL-15 중화 항체에 의해 억제된다. 기호는 mbIL15로 형질도입된 NK 세포에 의한 실험에서 투입된 세포와 비교시의 배양 중 평균(±SD; n=3) NK 세포 회수를 나타낸다. 6B. 6명의 공여자로부터 모의-, mbIL15- 및 wtIL15-형질도입된 세포에 대한 저-(10 IU/㎖) 및 고-용량(100 IU/㎖) IL-2 존재하에 7-일 평행 배양 후 투입된 세포와 비교시의 NK 세포 회수의 백분율. 수평 막대는 중간값을 가리킨다. 대응표본 t 검정의 결과를 나타낸다. 6C. mbIL15 또는 wtIL15로 형질도입되고 100 IU/㎖ IL2와 배양된 하나의 공여자로부터의 NK 세포의 증대 및 장기간 생존. 지시된 배양 일수에서 NK 세포 회수의 백분율을 나타낸다.
도 7A 내지 7B: mbIL15를 발현하는 NK 세포의 종양-억제 능력. 1:4, 1:2 및 1:1 E:T 비에서 Nalm-6, U937, K562, 다우디, SK-BR-3 및 ES8 세포주에 대한 mbIL15- 및 모의-형질도입된 NK 세포에 의한 4-시간(7A) 및 24-시간 세포독성 분석(7B)의 결과. 각각의 기호는 US937, K562, ES8에 대한 3명의 상이한 공여자 및 Nalm-6, 다우디 및 SK-BR-3에 대한 2명의 공여자로부터의 NK 세포에 의한 실험(모두 3회 중복하여 수행됨)에서 평균±SD 세포독성을 가리킨다(모든 실험에 대해서 P<0.001).
도 8A 내지 8C: mbIL15를 발현하는 NK 세포의 종양-억제 능력. NOD-SCID-IL2RGnull 마우스에게 루시페라제 표지된 1x105 ES8 세포를 i.p. 주사하였다. 7마리의 마우스에서, 처리를 제공하지 않은 반면("NK 없음"), 11마리 마우스에게는 3일째에 모의-형질도입된 NK 세포(1x107 i.p.)를 제공하였고, 12마리의 다른 마우스에게는 동일한 용량 및 스케줄로 mbIL15-형질도입된 NK 세포를 제공하였다. 8A. 종양 성장의 생체내 영상화의 결과. 각 그룹에서 최고 종양 신호를 갖는 4마리 마우스의 복부 상을 나타낸다. 8B. 종양 성장의 생체내 영상화의 결과. 각각의 기호는 하나의 생물발광 측정(각각의 마우스에서 3일째 측정에 대한 광자/초)에 상응한다. 8C. 상이한 처리 그룹들에서 마우스의 전체 생존 비교. 마우스를 생물발광이 1x1010 광자/초에 도달했을 때 안락사시켰다. 3개의 곡선에 대한 로그 순위 시험 및 각각의 2개의 곡선간의 비교에 대한 P 값을 나타낸다.
도 9는 막 결합된 IL-15의 뉴클레오티드 서열(서열번호 1) 및 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸다.
도 10은 인간 IL-15(NCBI 참조 서열: NM_000585.4)의 뉴클레오티드 서열(서열번호 3) 및 아미노산 서열(서열번호 4)을 나타낸다.
도 11A 내지 11C: mbIL15는 NK 세포를 시스 제공에 의해 자극한다. 11A. NK92 세포를 GFP를 함유하는 벡터에서 mbIL15(좌측) 또는 wtIL15(우측)로 형질도입시키고, 100% GFP+ 세포를 함유하도록 분류하였으며, 형질도입되지 않은 NK92 세포와 1:1 비로 공-배양하였다. 배양 초기의 세포수에 대한, GFP+ 및 GFP- 세포의 배양 후 세포 회수 백분율(±SD; n=3)을 나타낸다. 11B. mbIL15를 발현하거나 또는 형질도입되지 않은 NK92 세포를, 나타낸 조합으로 1:2 비로 mbIL15로 형질도입되거나 또는 형질도입되지 않은 K562 세포("K")와 공-배양하였다. K562 세포를 PKH26(시그마)으로 표지하고 배양 전 세포 분열을 방지하기 위해서 스트렉(Streck) 세포 보존제(스트렉, 미국 네브라스카주 오마하 소재)로 처리하였다. 배양 초기의 세포수에 대한, 배양 후 NK92 세포 회수 백분율(±SD; n=3)을 나타낸다. 11C. 증가하는 농도의 외인성 IL-15의 존재하에서 형질도입되지 않은 NK92 세포의 경우와 비교된 mbIL15를 발현하는 NK92 세포의 증식. 배양을 IL-2의 부재하에서(좌측) 또는 10 IU/㎖(중간) 또는 100 IU/㎖(우측)의 IL-2의 존재하에서 수행하였다. 배양 초기의 세포수에 대한, 배양 후 세포 회수 백분율(±SD; n=3)을 나타낸다.
도 12A 내지 12C. mb15-NK 세포에서 KIR의 발현 및 기능. 12A. 형질도입 전 및 모의- 또는 mb15-형질도입 후 KIR 발현에 의해 한정된 NK 세포 부분집합. 유식 세포측정 점 플롯은 2명의 공여자로부터의 CD56+ CD3- 세포에서 항-KIR 항체에 의한 염색의 결과를 나타낸다. KIR+ 세포의 백분율을 나타낸다. 12B. 721.221 세포 또는 CD158a-결합 Cw6 HLA를 발현하는 동일한 세포와 4시간 배양 후 CD158a-양성 및 CD158a-음성 부분집합에서 CD107a 발현의 결과. 3명의 공여자로부터의 NK 세포에 의한 4개의 독립적인 실험의 평균(±SD)을 나타낸다(**P<0.0001; *P=0.0002). 12C. 12B에 나타낸 동일한 실험에서 IFNγ 분비의 결과(**P<0.0001).
도 13A 및 13B: mbIL15를 발현하는 NK 세포의 항체-의존적인 세포 세포독성(ADCC). 각각 리툭시맙 또는 트라스투주맙의 존재하에서 (13A) 다우디 및 (13B) SK-BR-3에 대한 mbIL15- 및 모의-형질도입된 NK 세포에 의한 4시간 ADCC 분석의 결과; 동일한 농도의 면역치료 항체(1 ㎍/㎖ )하의 IgG를 대조용으로서 사용하였다. 각각의 기호는 각각의 공여자로부터의 NK 세포에 의한 3회 중복 실험에서 평균±SD 세포독성을 가리킨다. 면역치료 항체의 존재하에서, mbIL15-NK 세포는 모의-형질도입된 세포보다 현저하게 더 높은 ADCC를 발휘하였다(다우디 또는 SK-BR-3에 의한 시험에서 어느 한 공여자에 대해 P<0.001). 항체 부재하의 mbIL15-NK 세포에 의한 세포독성도 또한 현저하게 더 높았다(다우디 또는 SK-BR-3에 의한 시험에서 어느 한 공여자에 대해 P<0.001).
본 발명의 예시적인 실시태양들의 기재는 하기와 같다.
천연 살해(NK) 세포의 충분히-확립된 백혈병-억제 활성은 NK 세포 주입에 대한 치료 가능성을 암시한다. NK 세포 생존 및 따라서 세포독성은 사이토킨 지지체를 요한다. 본 명세서는 비-분비성, 막-결합된 형태의 인터류킨-15(IL-15)의 발현이 NK 세포 성장을 지속시킬 수 있는지의 여부를 조사하는 실험을 기재한다. 인간 IL15 유전자를 CD8α 막관통 도메인을 암호화하는 것에 결합시켰다("mbIL15"). 레트로바이러스 형질도입 후, 인간 NK 세포는 상기 세포 표면상에서 mbIL-15를 발현하였으나, IL-15 분비는 무시할만하였다. IL-2 부재하에서 mbIL15-NK 세포의 생존 및 증대는 모의-형질도입된 세포의 경우(7일 배양 후, P<0.0001, n=15), 및 막 결합되지 않은 IL-15를 분비하는 NK 세포의 경우(P=0.025, n=9)보다 대단히 우수하였으며; 생육성 mbIL15-NK 세포는 2개월까지 검출될 수 있었다. 면역결핍 마우스에서, mbIL15-NK 세포는 IL-2 없이 증대되었으며, 모의-형질도입된 NK 세포보다 훨씬 더 큰 수로, 검사된 모든 조직(뇌 제외)에서 검출가능하였다(P<0.001). 시험관내 및 생체내 증대는 IL-2에 의해 추가로 증가하였다. mbIL15 자극의 1차 기전은 자가분비였으며; 상기는 IL-15 신호전달 및 세포사멸-억제 신호전달을 활성화하였다. 백혈병, 림프종 및 고형 종양 세포주에 대한 세포독성은 mbIL15-NK 세포의 경우 일관되게 더 높았다. 1:4 E:T에서 중간 24-시간 세포독성은 모의-형질도입된 세포의 22%에 대해 71%였으며; 1:1 E:T에서는 99% 대 54%였다(P<0.0001). 증가된 종양-억제 능력은 또한 백혈병(U937) 또는 육종(ES8) 세포가 생착된 면역결핍 마우스에서 분명하였다. 따라서, mbIL15는 NK 세포에 독립적인 성장을 부여하였으며 그의 종양-억제 능력을 증진(enhance)시켰다. mbIL15-NK 세포의 주입은 IL-2의 부작용 없이 NK 세포 요법을 허용하였다.
상응하게, 본 명세서에서 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 (하나 이상; 다수의) 세포를 제공하며, 여기에서 상기 세포는 IL-15에 응답하는 세포이다. IL-15에 응답하는 세포는 그의 활성 중 하나 이상이 IL-15에 의해 조절되는 세포를 포함한다. 상기와 같은 세포의 예는 천연 살해(NK) 세포, T-세포, 수지상 세포 및 단핵세포를 포함한다. 상기 하나 이상(예를 들어 단리된)의 세포는 막-결합된 폴리펩티드로서, 분비 단백질로서 또는 이들의 조합으로서 IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 발현할 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 천연 살해(NK) 세포(들)에 관한 것이다. 상기 하나 이상(예를 들어 단리된)의 NK 세포는 막-결합된 폴리펩티드로서, 분비 단백질로서 또는 이들의 조합으로서 IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 발현할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "천연 살해 세포"("NK 세포")는 면역계의 세포독성 림프구의 한 유형을 지칭한다. NK 세포는 바이러스 감염된 세포에 빠른 응답을 제공하며 형질전환된 세포에 응답한다. 전형적으로 면역세포는 감염된 세포의 표면상의 주 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제공되는 병원체로부터의 펩티드를 탐지하여 사이토킨 방출을 촉발하고, 세포용해 또는 세포사멸을 일으킨다. 그러나 NK 세포는 병원체로부터의 펩티드가 MHC 분자상에 존재하는 지에 관계 없이 스트레스를 받은 세포를 인식하는 능력을 갖기 때문에 독특하다. 상기 세포는 표적을 살해하기 위해서 선행의 활성화를 필요로 하지 않는다는 처음의 개념때문에 "천연 살해자"라 명명되었다. NK 세포는 큰 과립형 림프구(LGL)이며 분화하여 골수에서 성숙하고 이어서 상기 골수로부터 순환계로 진입하는 것으로 공지되어 있다.
일부 태양에서, 상기 NK 세포는 포유동물 NK 세포이다. "포유동물의" 또는 "포유동물"의 예는 영장류(예를 들어 인간), 개과, 고양이과, 설치류, 돼지과, 반추동물 등을 포함한다. 구체적인 예는 인간, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 토끼, 기니피그, 래트 및 마우스를 포함한다. 특정한 태양에서, 상기 포유동물 NK 세포는 인간 NK 세포이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "인터류킨-15"("IL-15")는 T 및 NK 세포 활성화 및 증식을 조절하는 사이토킨을 지칭한다. 상기 사이토킨 및 인터류킨 2는 다수의 생물 활성들을 공유한다. 이들은 공통의 수용체 서브유닛에 결합하는 것으로 공지되어 있으며 동일한 수용체에 대해 경쟁할 수 있고 따라서 서로의 활성을 음으로 조절할 수 있다. CD8+ 기억 세포의 수는 IL-15와 IL-2간의 균형에 의해 조절되는 것으로 공지되어 있다. 상기 사이토킨은 JAK 키나제의 활성화뿐만 아니라 전사 활성제 STAT3, STAT5 및 STAT6의 인산화 및 활성화를 유도하며, 추정상 STAT6의 전사 활성화 활성을 통해 세포사멸 억제제 BCL2L1/BCL-x(L)의 발현을 증가시키고 따라서 세포사멸을 방지할 수 있다.
IL-15의 "기능성 부분"("생물학적 활성 부분")은 전장 또는 성숙한 IL-15의 하나 이상의 기능을 유지하는 IL-15의 일부를 지칭한다. 상기와 같은 기능은 NK 세포 생존의 촉진, NK 세포의 조절 및 T 세포 활성화 및 증식뿐만 아니라 조혈 줄기세포의 NK 세포 발생의 지지를 포함한다.
당해 분야의 숙련가들에 의해 인식되는 바와 같이, 다양한 IL-15 분자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 하나의 태양에서, 상기 IL-15는 야생형 IL-15이다. 일부 태양에서, 상기 IL-15는 포유동물 IL-15(예를 들어 호모 사피엔스 인터류킨 15(IL15), 전사 변체 3, mRNA, NCBI 참조 서열: NM_000584.4; 개(Canis lupus familiaris) 인터류킨 15(IL5), mRNA, NCBI 참조 서열: NM_001197188.1; 고양이(Felis catus) 인터류킨 15(IL5), mRNA, NCBI 참조 서열: NM_001009207.1)이다. "포유동물의" 또는 "포유동물"의 예는 영장류(예를 들어 인간), 개과, 고양이과, 설치류, 돼지과, 반추동물 등을 포함한다. 구체적인 예는 인간, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 토끼, 기니피그, 래트 및 마우스를 포함한다. 특정한 태양에서, 상기 포유동물 IL-15는 인간 IL-15이다.
IL-15의 전부 또는 기능성 부분은 다양한 방식으로 하나 이상의 NK 세포에 의해 발현될 수 있다(막-결합된 및/또는 분비된 폴리펩티드로서). 예를 들어, 상기 IL-15의 전부 또는 기능성 부분은 상기 NK 세포내에서 발현되고 상기 NK 세포로부터 분비될 수 있고/있거나 이들은 당해 분야에 공지된 임의의 다양한 링커를 사용하여 상기 NK 세포의 표면에(예를 들어 NK 세포의 표면에 또는 상기 세포의 막 내에) 직접 또는 간접적으로(예를 들어 이온, 비-이온, 공유 결합) 결합(접합; 융합)시킬 수 있다(문헌[Hermanson, G., Bioconjugate Techniques, Academic Press 1996]). 특정한 태양에서, 상기 IL-15의 전부 또는 기능성 부분은 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 결합된다. 하나의 태양에서, 상기 NK 세포는 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 융합된 IL-15의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 특정한 태양에서, 상기 막관통 단백질의 부분은 상기 막관통 단백질의 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "막관통 단백질" 또는 "막 단백질"은 생물학적 막(예를 들어 생물막, 예를 들어 세포막)의 인지질 이중층과 같은 막에 및/또는 상기 막내에 위치하는 단백질이다. 막 단백질은 상기 막이 그의 독특한 활성을 수행할 수 있게 한다. 막에 부착된 단백질의 보체는 세포 유형 및 세포내 분포에 따라 변한다. 일부 단백질은 단지 막 표면에만 결합하는 반면, 다른 것들은 상기 막내에 묻힌 하나 이상의 영역 및/또는 상기 막의 한면 또는 양면상의 도메인을 갖는다. 상기 세포외 막 표면상의 단백질 도메인은 일반적으로 세포-세포 신호전달 또는 상호작용에 관련된다. 상기 막의 시토솔면을 따라 놓이는 도메인들은, 세포골격 단백질의 상기 막에의 고정에서부터 세포내 신호전달 경로의 촉발에 이르는 광범위한 기능들을 갖는다. 상기 막내의 도메인들(본 명세서에서 "막관통 도메인"이라 칭한다), 특히 채널 및 기공을 형성하는 것들은 분자를 상기 막을 가로질러 이동시킨다. "막관통 도메인"은 막(예를 들어 세포와 같은 소낭의 막) 중에서 열역학적으로 안정한 3-차원 단백질 구조이다. 막관통 도메인의 예는 단일 알파 나선, 다수 막관통 알파 나선의 안정한 복합체, 막관통 베타 배럴, 그라미시딘 A의 베타-나선, 또는 임의의 다른 구조를 포함한다. 막관통 나선은 대개 길이가 약 20 아미노산이다.
전형적으로, 막 단백질을 상기 막-단백질 상호작용의 성질을 기준으로 2개의 넓은 범주, 즉 내재성(내적인) 및 표재성(외적인)으로 분류한다. 대부분의 생물막은 2가지 유형의 막 단백질을 모두 함유한다.
내재성 막 단백질(또한 내적인 단백질이라 칭한다)은 인지질 이중층 중에 매몰된 하나 이상의 분절을 갖는다. 내재성 막 단백질은 막관통 단백질 및 지질-고정된 단백질을 포함한다. 대부분의 내재성 단백질은 막 인지질의 지방 아실기와 상호작용하는, 따라서 상기 단백질을 상기 막에 고정시키는 소수성 측쇄를 갖는 잔기를 함유한다. 대부분의 내재성 단백질은 전체 인지질 이중층에 걸쳐 있다. 이들 막관통 단백질은 하나 이상의 막-에 걸쳐있는 도메인뿐만 아니라 4 내지 수백 잔기 길이의, 상기 이중층의 양쪽에서 수성 매질내로 연장되는 도메인을 함유한다. 전형적으로, 상기 막-에 걸쳐있는 도메인은 하나 이상(예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)의 α 나선 및/또는 β 가닥이다. 막-에 걸쳐있는 α-나선 도메인은 전형적으로는 상기 이중층의 지질 내부와의 소수성 상호작용 및 아마도 상기 인지질(예를 들어 글리코포린)의 극성 헤드기와의 이온성 상호작용에 의해 막 중에 매몰된다. β 가닥의 구조는 전형적으로 막에 걸쳐있는 배럴(예를 들어,포린)의 형태이다. 일부 내재성 단백질은 공유 결합된 지방산에 의해 상기 막 리플릿 중 하나에 고정된다. 이들 단백질에서, 상기 결합된 지방산은 상기 막 중에 매몰되지만, 상기 폴리펩티드 쇄는 인지질 이중층에 진입하지 않는다. 일부 세포-표면 단백질은 C-말단에 결합된 복잡한 글리코실화된 인지질(예를 들어 글리코실포스파티딜이노시톨, 알칼리성 포스파타제)에 의해 원형질막의 외형질면에 고정된다. 일부 시토솔 단백질은 상기 C-말단 부근의 시스테인에 공유 결합된 탄화수소 부분(예를 들어 프레닐, 파르네실 및 제라닐제라닐기)에 의해 막의 시토솔면에 고정된다. 지질-고정된 시토솔 단백질의 또 다른 그룹에서, 지방 아실기(예를 들어,미리스테이트 또는 팔미테이트)는 N-말단 글리신 잔기에 아미드 결합에 의해 결합된다.
표재성 막 단백질, 또는 외적인 단백질은 상기 인지질 이중층의 소수성 코어와 상호작용하지 않는다. 대신에 상기는 대개 내재성 막 단백질과의 상호작용에 의해 간접적으로 또는 지질 극성 헤드기와의 상호작용에 의해 직접적으로 상기 막에 결합된다. 상기 원형질막의 시토솔면에 국소화된 표재성 단백질은 적혈구 중의 세포골격 단백질 스펙트린 및 액틴 및 효소 단백질 키나제 C를 포함한다. 상기 효소는 상기 원형질막의 시토솔면과 시토솔사이를 왕복하며 신호전달에 한 역할을 한다. 세포외 기질의 몇몇 단백질을 포함한 다른 표재성 단백질은 상기 원형질막의 외부(외형질) 표면에 국소화된다.
막관통 단백질의 예는 수용체, 리간드, 면역글로불린, 글리코포린 또는 이들의 조합을 포함한다. 막관통 단백질의 구체적인 예는 CD8α, CD4, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD28, CD137, FcεRIγ, T-세포 수용체(TCR, 예를 들어 TCRα 및/또는 TCRβ), 니코틴 아세틸콜린 수용체, GABA 수용체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 면역글로불린의 구체적인 예는 IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 또는 이들의 조합을 포함한다. 글리코포린의 구체적인 예는 글리코포린 A, 글리코포린 D 또는 이들의 조합을 포함한다.
막관통 단백질의 전부 또는 일부에 결합되는 것 외에, 상기 IL-15의 전부 또는 기능성 부분은 다른 성분들, 예를 들어 신호 펩티드(예를 들어 CD8α 신호 서열), 리더 서열, 분비 신호, 표지(예를 들어 리포터 유전자) 등에 결합될 수 있다. 특정한 태양에서, 상기 IL-15의 전부 또는 기능성 부분은 CD8α의 신호 펩티드 및 CD8α의 막관통 도메인의 전부 또는 일부에 융합된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 천연 살해(NK) 세포의 생성 방법에 관한 것이다. 상기 IL-15의 전부 또는 일부는 막-결합된 폴리펩티드, 분비된 폴리펩티드로서, 또는 이들의 조합으로서 발현될 수 있다. 상기 방법은 IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 하나 이상의 NK 세포에 도입시킴을 포함한다. 하나의 태양에서, IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 결합시킨다(예를 들어 융합시킨다). 한편으로, 또는 또한, IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 NK 세포에 도입시킨다(예를 들어 야생형 IL-15). 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, IL-15의 전부 또는 기능성 부분 및 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 융합된 IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 NK 세포에 도입시키는 태양을 단일 핵산 또는 다수(예를 들어 별도의; 2개) 핵산을 사용하여 그렇게 수행할 수 있다. 상기 NK 세포를 상기 IL-15의 전부 또는 기능성 부분이 막-결합된 폴리펩티드로서 및/또는 분비된 폴리펩티드로서 발현되어 막-결합된 폴리펩티드로서 및/또는 분비된 폴리펩티드로서 IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 NK 세포를 생성시키는 조건하에서 유지시킨다. 특정한 태양에서, IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 CD8α의 신호 펩티드에 융합시키고 CD8α의 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 상기 NK 세포에 도입시킨다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 NK 세포의 증대 및/또는 생존을 증진시키는 방법(예를 들어 시험관내, 생체외 및/또는 생체내에서)에 관한 것이다. 상기 방법은 IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 도입시킴을 포함한다. 상기 IL-15(예를 들어 야생형 IL-15)의 전부 또는 일부를 암호화하고/하거나 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 융합된 IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 상기 NK 세포에 도입시킬 수 있다. 따라서, 상기 NK 세포는 IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 막-결합된 폴리펩티드, 분비된 폴리펩티드로서 또는 이들의 조합으로서 발현시킬 수 있다. 상기 NK 세포를 상기 IL-15의 전부 또는 일부가 막-결합된 폴리펩티드, 분비된 폴리펩티드로서 또는 이들의 조합으로서 발현되고 상기 NK 세포가 증식하는 조건하에서 유지시킨다. 특정한 실시태양에서, IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 CD8α의 신호 펩티드에 융합시키고 CD8α의 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 상기 NK 세포에 도입시킨다. 일부 태양에서, 상기 방법은 막-결합된 IL-15 및/또는 분비된 IL-15를 포함하는 상기 NK 세포를 IL-2와 접촉시킴을 추가로 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 상기 IL-2의 농도는 약 10 IU/㎖ 내지 약 1000 IU/㎖이다. 다른 태양에서, 상기 IL-2의 농도는 약 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680, 700, 720 740, 760, 780, 800, 820, 840, 860, 880, 900, 920, 940, 960, 980 IU/㎖이다.
당해 분야의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 막관통 폴리펩티드로서 및/또는 분비된 폴리펩티드로서 암호화하는 핵산을 NK 세포에 도입시키는 다양한 방법(예를 들어 형질감염, 형질도입 및/또는 트랜스포손 시스템)을 사용할 수 있다. 상기와 같은 방법의 예는 화학-기반 방법(예를 들어,칼슘 포스페이트; 고도로 분지된 유기 화합물(예를 들어 덴드리머); 리포솜(리포펙션); 및/또는 양이온성 중합체(예를 들어 DEAE 덱스트란; 폴리에틸렌이민)의 사용을 수반한다), 비-화학-기반 방법(예를 들어 일렉트로포레이션; 세포 압착; 초음파천공법; 광학 유전자이입; 관통주입; 유체역학적 전달), 입자-기반 방법(예를 들어,유전자 건; 자기주입법, 입자 폭발), 벡터-기반 방법(예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 등을 포함하는 벡터), 핵형질감염, 트랜스포손-기반 방법(예를 들어 슬리핑 뷰티, 피기BAC 등) 및/또는 RNA 형질감염을 포함한다.
NK 세포를 (i) 상기 IL-15의 전부 또는 기능성 부분이 막-결합된 폴리펩티드로서 및/또는 분비된 폴리펩티드로서 발현되고/되거나 (ii) 막-결합된 IL-15 및/또는 분비된 IL-15를 포함하는 NK 세포가 증식하는 조건하에서 유지시키는 다양한 방법들이 사용될 수 있음은 또한 당해 분야의 숙련가들에게 자명하다. 예를 들어, NK 세포를 적합한 온도 및 기체 혼합물에서 생육 및/또는 유지시킬 수 있다(예를 들어,세포 인큐베이터에서 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃, 약 5% CO2). 배양 조건은 광범위하게 다양할 수 있으며, 특정 세포 유형에 대한 조건 변화는 상이한 표현형을 생성시킬 수 있다. 온도 및 기체 혼합물 외에, 배양 시스템에서 통상적으로 변화되는 인자는 세포 생육 배지이다. 생육 배지에 대한 레시피는 pH, 글루코스 농도, 생육 인자, 및 다른 영양분의 존재에 있어서 다양할 수 있다. 배지 보충에 사용되는 생육 인자는 종종 동물 혈액의 혈청, 예를 들어 소 태아 혈청(FBS), 송아지 혈청, 말 혈청, 돼지 혈청 및/또는 인간 혈소판 용해물(hPL)로부터 유래된다. 세포 유지에 고려되는 다른 인자는 현탁액 또는 부착 배양물 중에서 상기 세포의 도말 밀도(배양 배지 부피당 세포 수) 및 생육을 포함한다.
상기 방법은 본 명세서에 제공된 방법에 의해 생성된 하나 이상의 NK 세포를 단리하거나 분리시킴을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 하나 이상의 NK 세포를 배양함을 추가로 포함할 수 있다. 일부 태양에서, NK 세포주가 생성된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 방법 및 본 명세서에 제공된 NK 세포를 포함하는 조성물에 의해 생성된 (하나 이상의) 천연 살해(NK) 세포 또는 세포주를 포함한다. 특정한 태양에서, 상기 조성물은 본 명세서에 제공된 NK 세포 또는 세포주 중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물이다. 상기 약학 조성물은 IL-2의 전부 또는 기능성 부분(예를 들어 (하나 이상의) IL-2 단백질의 전부 또는 기능성 부분; IL-2의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산)을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "IL-2"는 IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21을 또한 포함하는 사이토킨 과의 일원을 지칭한다. IL-2는 알파, 베타 및 감마라 칭하는 3개의 쇄로 이루어지는 수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다. 상기 감마 쇄는 상기 사이토킨 수용체 과의 모든 일원에 의해 공유된다. IL-5와 유사한 IL-2는 B 세포에 의해 제조된 면역글로불린의 생성을 촉진하며 NK 세포의 분화 및 증식을 유도한다. IL-2와 IL-15간의 주요 차이는 후천 면역 응답에서 발견된다. 예를 들어, IL-2는 면역 기억의 발달에 토대이므로 외래 병원체에 대한 후천 면역에 필요하다. 다른 한편으로, IL-15는 CD8 기억 T 세포의 생존을 지지함으로써 고도로 특이적인 T 세포 응답을 유지하는데 필요하다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 NK 세포 요법이 필요한 개체에게 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 천연 살해(NK) 세포를 투여함을 포함하는 상기 개체에서 상기 요법을 수반하는 질병 및/또는 상태의 치료 방법에 관한 것이다. 특정한 태양에서, 상기 NK 세포는 막-결합된 폴리펩티드로서 및/또는 분비된 폴리펩티드로서 IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 발현한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, NK 세포 요법을 수반하는 질병 및/또는 상태는 NK 세포 결핍, 암, 자가면역 질병, 감염성 질병 등을 포함한다.
특정한 태양에서, 본 발명은 암(예를 들어 종양) 치료가 필요한 개체에게 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 천연 살해(NK) 세포를 투여함을 포함하는 상기 개체에서 상기 암의 치료 방법에 관한 것이다. IL-15의 전부 또는 기능성 부분은 막-결합된 폴리펩티드로서 및/또는 분비된 폴리펩티드로서 발현될 수 있다.
상기 방법은 암(예를 들어 종양)에 특이적인 하나 이상의 항체, 항원 단편 및/또는 그의 융합물을 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 하나 이상의 종양 항원에 대한 하나 이상의 항체를 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에 의해 이해되는 바와 같이, 하나 이상의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 다가(예를 들어 2가, 3가) 항체, 키메릭 항체, 인간화된 항체 등 및 이들의 조합일 수 있다. 다양한 항원 단편 및/또는 융합물이 또한 당해 분야에 공지되어 있으며 Fab', F(ab')2, 단쇄 가변 단편(scFv), 다가 scFv(예를 들어,디-scFv, 트리-scFv), 단일 도메인 항체(나노바디) 등을 포함한다.
일부 태양에서, 상기 암은 백혈병(예를 들어 급성 림프모구성 백혈병; 급성 골수성 백혈병; 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병), 골수이형성 증후군, 림프종(예를 들어 B 세포 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, T-세포 림프모구성 림프종, 역형성 대세포 림프종), 고형 종양(예를 들어 유방암, 전립선암, 위암, 결장암, 간세포 암종, 비인두 암종, 신경모세포종, 고악성도 신경아교종), 육종(예를 들어,유잉 육종, 횡문근육종, 비-횡문근육종 연조직 육종, 골육종)이다.
상기 암 치료 방법은 IL-2(IL-2 단백질의 전부 또는 기능성 부분; IL-2의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산)를 개체에게 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 태양에서, 상기 IL-2는 포유동물 IL-2, 예를 들어 인간 IL-2이다. 특정한 태양에서, 저 용량의 IL-2를 상기 개체에게 투여한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, IL-12의 "저 용량"은 약 100만 IU/㎡ 이하(예를 들어 약 800,000 IU/㎡; 600,000 IU/㎡; 400,000 IU/㎡; 200,000 IU/㎡; 100,000 IU/㎡; 80,000 IU/㎡; 60,000 IU/㎡; 40,000 IU/㎡; 20,000 IU/㎡; 10,000 IU/㎡; 8,000 IU/㎡; 6,000 IU/㎡; 4,000 IU/㎡; 2,000 IU/㎡; 1,000 IU/㎡; 800 IU/㎡; 600 IU/㎡; 400 IU/㎡; 200 IU/㎡; 100 IU/㎡)의 IL-2의 용량을 지칭한다. 대조적으로, IL-2의 통상적인 용량은 약 100만 IU/㎡ 내지 약 500만 IU/㎡이다.
인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 하나 이상의 천연 살해(NK) 세포(들)(예를 들어 치료 화합물; 약학 조성물)를 치료 유효량(즉, 예를 들어,암과 관련된 증상을 개선시키거나, 암의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 또한 암의 증상의 중증도 또는 빈도를 줄이고/줄이거나 암의 전이를 예방하거나, 지연시키거나 또는 극복함으로써 상기 암을 치료하기에 충분한 양)으로 투여한다. 특정 개체의 치료에 치료학적으로 유효한 양은 상태(예를 들어 암)의 증상 및 중증도에 따라 변할 것이며 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 또는 생체내 분석을 최적 투여량 범위의 확인을 돕는데 임의로 사용할 수 있다. 제형화에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 암의 중증도에 따라 변할 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량을 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽할 수 있다.
치료학적 화합물을 상술한 바와 같이 조성물(예를 들어 약학 조성물) 중에서 또는 단독으로 전달할 수 있다. 상기 화합물을 전신적으로 투여하거나, 또는 특정한 조직에 표적화할 수 있다. 상기 치료학적 화합물을 다양한 수단, 예를 들어 화학 합성; 재조합 생산; 생체내 생산(예를 들어 트랜스제닉 동물, 예를 들어 메드(Meade) 등의 미국특허 제 4,873,316 호)에 의해 제조할 수 있으며, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표준 수단을 사용하여 단리할 수 있다. 상기 치료 방법들 중 임의의 방법의 조합을 또한 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 화합물을 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 제형화하여 약학 조성물을 제조할 수 있다. 상기 담체 및 조성물은 멸균성일 수 있다. 상기 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
적합한 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 물, 염 용액(예를 들어,NaCl), 염수, 완충된 염수, 알콜, 글리세롤, 에탄올, 아라비아검, 식물성 오일, 벤질 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물, 예를 들어 락토스, 아밀로스 또는 전분, 덱스트로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 등뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 상기 약학 제제를 경우에 따라 보조제, 예를 들어 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압 조절용 염, 완충제, 착색제, 풍미 및/또는 방향 물질 등 활성 화합물과 유해하게 반응하지 않는 보조제와 혼합할 수 있다.
상기 조성물은 경우에 따라 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 상기 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환제, 캡슐, 서방성 제형 또는 분말일 수 있다. 상기 조성물을 좌약으로서, 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들어 트리글리세라이드와 함께 제형화할 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예를 들어 약제 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다.
상기 조성물의 도입 방법은 비제한적으로 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 국소, 경구 및 비내를 포함한다. 다른 적합한 도입 방법은 유전자 요법(하기에 기재되는 바와 같은), 충전식 또는 생분해성 장치, 입자 가속화 장치("유전자 건") 및 느린 방출 중합체 장치를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 또한 다른 화합물과의 복합 요법의 부분으로서 투여할 수 있다.
상기 조성물을 인간에 투여하기에 적합한 약학 조성물로서 통상적인 과정에 따라 제형화할 수 있다. 예를 들어, 정맥내 투여용 조성물은 전형적으로 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 용해제 및 국소 마취제를 또한 포함하여 주사 부위의 통증을 편안하게 할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들을 별도로 또는 단위 투여형으로, 예를 들어 활성 화합물의 양을 나타내는 앰풀 또는 사쉐와 같은 용봉한 용기 중에 무수 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 함께 혼합하여 공급한다. 상기 조성물을 주입에 의해 투여해야 하는 경우, 상기를 멸균 약제 등급수, 염수 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주입병으로 분배할 수 있다. 상기 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 성분들을 투여 전에 혼합할 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰풀을 제공할 수 있다.
국소 적용을 위해서, 국소 적용에 적합하고 바람직하게는 물보다 큰 동적 점도를 갖는 담체를 포함하는 비분무성 형태, 점성 내지 반-고체 또는 고체 형태를 사용할 수 있다. 적합한 제형은 비제한적으로, 경우에 따라 살균되거나 또는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정제, 습윤제, 완충제 또는 삼투압 조절용 염 등과 혼합되는 용액, 현탁액, 유화액, 크림, 연고, 분말, 관장제, 로션, 졸, 바르는 약, 연고, 에어로졸 등을 포함한다.
본 명세서에 기재된 화합물을 중성 또는 염 형태로서 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 유리 아미노기와 형성되는 것들, 예를 들어 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등으로부터 유도되는 것들, 및 유리 카복실기와 형성되는 것들, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도되는 것들을 포함한다.
더욱 다른 태양에서, 본 발명은 막-결합된 폴리펩티드로서 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 하나 이상의 NK 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료법에서 약제로서 사용하기 위한 조성물(예를 들어 약학 조성물)에 관한 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 나타낸 작용제를 암의 치료에 사용할 수 있다. 또한, 본 명세서에 나타낸 작용제를 암 치료용 약제의 제조에 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "개체"은 동물, 및 특정한 태양에서, 포유동물을 지칭한다. 포유동물의 예는 영장류, 개과, 고양이과, 설치류 등을 포함한다. 구체적인 예는 인간, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 토끼, 기니피그, 래트 및 마우스를 포함한다. "필요한 개체"이란 용어는 연구자, 수의학자, 의사 또는 다른 임상의에 의해 결정되는 바와 같은 치료 또는 예방이 필요한 개체을 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 치료 또는 예방이 필요한 개체은 포유동물, 예를 들어,인간이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, (하나 이상의) "단리된", "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 순수하고 단리된" NK 세포는 자연적으로 존재하는 복잡한 세포 환경, 또는 재조합 기법에 의해 생성되는 경우 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되는(이에 관하여 실질적으로 단리되는) 것이다. 일부의 예에서, 상기 단리된 물질은 조성물(예를 들어,다른 물질을 함유하는 조 추출물), 완충제 시스템 또는 시약 혼합물의 부분을 형성할 것이다. 다른 상황에서, 상기 물질을 예를 들어 아가로스 젤 전기영동 또는 컬럼 크로마토그래피, 예를 들어 HPLC에 의해 측정되는 바와 같은 필수적인 동종성으로 정제할 수 있다. 바람직하게, NK 세포는 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%(몰 기준으로)를 차지한다.
"하나의", "상기" 등과 같은 관사는 문맥상 상반되게 나타내지 않거나 또는 달리 자명하지 않은 한 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
본 명세서 및 특허청구범위에 사용되는 바와 같은 "및/또는"이란 어구는 결합된 요소들 중 "어느 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해해야 한다. "및/또는"과 함께 나열되는 다수의 요소들을 동일한 방식으로, 즉 결합된 요소들 중 "하나 이상"으로 해석해야 한다. 상기 "및/또는"이란 절에 의해 구체적으로 나타내는 요소들 이외의 다른 요소들도 임의로 존재할 수 있다. 본 명세서 및 특허청구범위에 나타내는 바와 같이, "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 요소들의 목록에 사용될 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포함되는 것으로서, 즉 요소들의 목록 및 임의로 추가의 나열되지 않은 요소들 중 적어도 하나, 및 임의로 하나 초과의 포함인 것으로 해석되어야 한다. 명백히 반대의 표시인 단지란 용어, 예를 들어 "중 단지 하나" 또는 "중 정확히 하나"란 용어는 요소들의 수 또는 목록 중 정확하게 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 따라서, 하나의 그룹의 하나 이상의 구성원들 간에 "또는"을 포함하는 청구항들은 달리 나타내지 않는 한, 하나, 하나 초과, 또는 그룹 구성원들 전부가 주어진 생성물 또는 방법과 관련하여 존재하거나, 사용되거나, 또는 달리 관련되는 경우를 충족시키는 것으로 간주된다. 상기 그룹의 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 방법과 관련하여 존재하거나, 사용되거나, 또는 달리 관련되는 실시태양들을 제공한다. 상기 그룹 구성원의 하나 초과, 또는 전부가 주어진 생성물 또는 방법과 관련하여 존재하거나, 사용되거나, 또는 달리 관련되는 실시태양들을 제공한다. 임의의 하나 이상의 청구항을 임의의 실시태양, 태양, 특징, 요소, 또는 특성, 또는 이들의 임의의 조합을 명백히 제외하는 것으로 정정할 수도 있다. 임의의 하나 이상의 청구항을 임의의 작용제, 조성물, 양, 용량, 투여 경로, 세포 유형, 표적, 세포 마커, 항원, 표적화 부분, 또는 이들의 조합을 제외하도록 정정할 수도 있다.
실시예
물질 및 방법
종양 세포주
인간 세포주 Nalm-6(B-계통 급성 림프모구성 백혈병), 다우디(B-세포 림프종), K562 및 U937(급성 골수성 백혈병), 및 SK-BR-3(유방 암종)을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 수득하였으며, 유잉 육종 세포주 ES8을 세인트 주드 칠드런스 리써치 호스피틀 티슈 리포지터리(St. Jude Children's Research Hospital tissue repository)로부터 수득하였다. 상기 세포주를 모두 개똥벌레 루시페라제 유전자를 함유하는 MSCV-내부 리포솜 유입 부위(IRES)-GFP 레트로바이러스 벡터(세인트 주드 벡터 디벨로프먼트 앤드 프로덕션 셰어드 리소스(St. Jude Vector Development and Production Shared Resource)로부터)로 형질전환시켰다. 형질도입된 세포를 MoFlo(벡크만 쿨터(Beckman Coulter), 미국 플로리다주 마이애미 소재) 또는 FACSAria(BD 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)로 그의 GFP의 발현에 대해 선택하였다. 10% 소 태아 혈청(FBS; 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 매사추세츠주 월섬 소재) 및 항생제가 보충된 RPMI-1640(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 사용하여 모든 세포주를 유지시켰다. 세포주는 분자 및/또는 유전자 발현 특징에 대해서 공급자에 의해 특성화되었으며; 백혈병 및 림프종 세포주의 세포 마커 프로파일을 유식 세포측정에 의해 주기적으로 시험하여, 변화가 발생하지 않았음을 확실히 하고 ES8을 DSMZ(독일 브라운슈바이그 소재)에서 DNA 핑거프린팅에 의해 확인하였다.
인간 NK 세포 증대
말초 혈액 샘플을 건강한 성인 공여자로부터의 혈소판 콜렉션의 버려진 부산물로부터 수득하였다. 단핵세포를 Accu-Prep 밀도 스텝(애큐레이트(Accurate), 미국 뉴욕주 웨스트베리 소재)상에서 원심분리에 의해 정제하고 RPMI-1640에서 2회 세척하였다. CD56+ CD3-NK 세포를 증대시키기 위해서, 말초 혈액 단핵세포 및 유전자 변형된 K562-mb15-41BBL 세포주를 앞서 문헌[Fujisaki et al., Cancer Res, 69(9):4010-4017 (2009)]; 문헌[Imai et al., Blood, 106:376-383 (2005)]에 개시된 바와 같이 공-배양하였다. 간단히, 말초 혈액 단핵세포를 6-웰 조직 배양 플레이트에서 100 Gy-조사된 K562-mb15-41BBL 세포와, 10% FBS 항생제 및 10 IU/㎖의 재조합 인간 인터류킨-2(IL-2; 롯슈, 독일 만하임 소재)를 함유하는 SCGM(셀제닉스(CellGenix), 독일 프라이부르크 소재)에서 1.5:1 비로 배양하였다. 조직 배양 배지를 2일마다 부분적으로 교환하였다. 7일의 공-배양 후에, 잔여 T 세포를 다이나비즈(Dynabeads) CD3(인비트로젠)으로 제거하여, >95% CD56+ CD3- NK 세포를 함유하는 세포 집단을 생성시켰다.
플라스미드, 바이러스 생산 및 유전자 형질도입
pMSCV-IRES-GFP, pEQ-PAM3(-E) 및 pRDF를 세인트 주드 벡터 디벨로프먼트 앤드 프로덕션 셰어드 리소스로부터 수득하였다. 긴 신호 펩티드를 갖는 인터류킨-15(IL-15)를 주형으로서 사용된 인간 비장 cDNA 라이브러리(닥터 지 닐(Dr G. Neale), 세인트 주드 칠드런스 리써치 호스피틀)로부터 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 서브-클로닝하였다. CD8α의 신호 펩티드를 암호화하는 cDNA, IL-15의 성숙한 펩티드 및 CD8α의 막관통 도메인을, PCR에 의한 중복 연장에 의한 이어맞추기(SOE-PCR)에 의해 조립하여 IL-15의 막-결합된 형태("mbIL15")를 암호화하고; IL-15의 야생형(CD8α 막관통 도메인에 결합되지 않은; "wtIL15")을 또한 시험 제조하였다. 생성된 발현 카세트를 쥐(murine) 줄기-세포 바이러스-내부 리보솜 유입 부위-녹색 형광 단백질(MSCV-IRES-GFP)의 EcRI 및 XhoI 부위에 서브-클로닝하였다.
RD144-위유형(pseudotyped) 레트로바이러스를 생성시키기 위해서, 3.0x106 293T 세포를 X-tremeGENE 9 DNA(롯슈, 독일 만하임 소재)를 사용하여 형질감염시키고, 18시간 동안 3.5 ㎍의 mbIL15 구조물을 암호화하는 cDNA, 3.5 ㎍의 pEQ-PAM3(-E) 및 3 ㎍의 pRDF가 있는 10-㎝ 조직 배양 디쉬에서 유지시켰다. 상기 배지를 24시간째에 10% FBS 및 항생제가 있는 RPMI-1640으로 교체한 후에, 레트로바이러스를 함유하는 순화배지(conditioned medium)를 36 내지 96시간째에 수확하고 레트로넥틴(타카라(Takara), 일본 오쓰 소재)으로 코팅된 폴리프로필렌 튜브에 가하고, 이를 1400 g에서 10분 동안 원심분리시키고 37 ℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 추가적인 원심분리 및 상등액 제거 후에, 증대된 NK 세포(0.5-1x106)를 상기 튜브에 가하고 37 ℃에서 12시간 동안 방치하고; 이 단계를 2 내지 3일에 걸쳐 6회 이하로 반복하였다. 이어서 세포를 FBS, 항생제 및 100 IU/㎖의 IL-2가 있는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 형질도입된 세포를 형질도입 후 3 내지 29일째에 분석하였다.
mbIL-15의 표면 발현을 항-인간 IL-15 항체(R&D, 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재) 및 피코에리쓰린 접합된 염소 항-마우스 IgG1(서던 바이오테크(Southern Biotech), 미국 알라바마주 버밍햄 소재)을 사용하여 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 항체 염색을 포르테사(Fortessa) 유식 세포계(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))로 검출하였다. 배양 상등액 중의 IL-15의 수준을 콴티킨 이뮤노어세이(Quantikine Immunoassay)(R&D)로 측정하였다.
시험관내에서 NK 세포의 기능 분석
시험관내에서 NK 세포 생존 및 생육을 평가하기 위해서, 형질도입된 NK 세포(1x106 세포/㎖)를 10% FBS 및 항생제가 있는 RPMI-1640에 재현탁하고, 24- 또는 96-웰 플레이트(코스타(Costar), 미국 뉴욕주 코닝 소재)의 웰에 넣고, IL-2(10 내지 100 IU/㎖)의 존재 또는 부재하에서 배양하였다. 생육성 GFP+ 세포의 수를 프로피디움 요오다이드로 염색 후, 애큐리(Accuri) C6 유식 세포계(벡톤 디킨슨)로 측정하였다. 일부 실험에서, 세포를 배양 전에 중화 항-IL-15 항체(R&D) 또는 아이소타입-합치된 비-반응성 항체와 10분 동안 인큐베이션하였다.
NK 세포 면역표현형분석법을 표에 나열된 항체들을 사용하여 수행하고, 포르테스 유식 세포계로 시각화하고 디바(Diva)(벡톤 디킨슨) 및 플로우조(FlowJo)(트리스타(TreeStar), 미국 오리건주 애슐랜드 소재) 소프트웨어에 의해 분석하였다. 인단백질 분석을 위해서, 모의- 및 mbIL15-형질도입된 NK 세포(1x107)를 IL-2 없이 48시간 동안 배양하였다. 세포 용해물을 20 mM 3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산, 2 mM EGTA, 5 mM EDTA, 30 mM 나트륨 플루오라이드, 60 mM β-글리세로포스페이트, 20 mM 나트륨 피로포스페이트, 1 mM 나트륨 오쏘바나데이트, 1% 트리톤 X-100, 완전 미니 프로테아제 억제제 칵테일(롯슈, 독일 만하임 소재) 및 1 mM 디티오쓰레이톨을 함유하는 용해 완충제를 사용하여 제조하였다. 초음파 처리 후, 용해물을 -80 ℃에서 동결시키고 키넥스 안티바디 마이크로어레이 분석을 위해 드라이 아이스 중에서 키넥서스(Kinexus)(캐나다 밴쿠버 소재)로 발송하였다.
세포독성 분석을 위해서, 루시페라제-표지된 표적 세포 및 NK 세포(48시간 동안 IL-2 없이 배양)를 96-웰, 편평 바닥 흑색 뷰플레이트(Viewplate)(코닝)에 다양한 효과기:표적(E:T) 비로 도말하고, 4 또는 24시간 동안 배양하였다. 부착성 세포주를 37 ℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션한 후에 NK 세포를 가하여 세포 부착을 허용하였다. 항체-의존성 세포 세포독성 분석을 위해서, 리툭시맙(리툭산, 롯슈; 독일 만하임 소재), 트라스투주맙(허셉틴, 롯슈) 또는 정제된 인간 IgG(R&D 시스템스, 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재)를 NK 세포 전에 가하였다(모두 1 ㎍/㎖). 이어서 상기 배양의 끝에서, 동등한 부피의 브라이트 글로(Bright-Glo) 루시페라제 시약(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 각 시험 웰에 가하고, 5분 후에, 발광을 플레이트 판독기를 사용하여 측정하고 Gen5 2.00 소프트웨어(둘 다 바이오텍(BioTek)으로부터, 미국 애리조나주 투손 소재)로 분석하였다. 각 플레이트에서, 표적 세포 생육력을 표적 세포만을 함유하는 웰로부터의 발광 신호를 사용하여 계산하였다. 모든 실험을 3회 중복 수행하였다.
세포용해성 과립의 방출을 측정하기 위해서, NK 세포(IL-2 부재하에서 48시간 동안 배양)를 4시간 동안 K562, U937 세포, 또는 722.221 세포 및 이들의 Cw6-발현 변체와 함께 공배양하였다. 우리는 상기 배양의 초기에 PE- 또는 PE-Cy7-접합된 항-CD107a 항체(BD 바이오사이언시즈) 및 1시간 후에 골지스탑(GolgiStop)(0.15 ㎕; BD 바이오사이언시즈)을 가하였다. CD107a+ NK 세포의 백분율을 유식 세포측정에 의해 측정하였다.
면역결핍 마우스에서 NK 세포의 증대 및 세포독성
생체내에서 NK 세포 증대를 시험하기 위해, mbIL15로 형질도입되거나 또는 모의-형질도입된 인간 NK 세포(6-9x106 세포/마우스)를 NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtmlWjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull) 마우스(잭슨 레보라토리즈, 미국 메인주 바하버 소재)의 꼬리 정맥에 주사하였다. 일부 마우스에서, 우리는 20000 IU의 IL-2를 주당 3회 복강내(i.p.) 주사하였다. 7일 및 11일째에, 혈액 세포를 세포 계수기(벡크만 쿨터)로 카운트하고; 인간 및 마우스 CD45+ 세포를 적혈구 용해 용액(인비트로젠)으로 처리하고 알로피코시아닌-접합된 마우스-항-인간 CD45 및 피코에리쓰린-접합된 래트 항-마우스 CD45 항체(둘 다 BD 바이오사이언시즈로부터)로 염색한 후에 유식 세포 측정에 의해 세었다. 안락사 후에, 골수, 간, 비장, 신장, 폐 및 뇌 중의 인간 NK 세포를 상기와 같이 세었다. 모든 동물 실험은 싱가포르 국립대학 연구 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.
마우스에서 종양 세포 살해를 시험하기 위해서, 우리는 2개의 이종이식 모델을 제조하였다. 먼저, 루시페라제를 발현하는 U937 세포를 NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtmlWjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull) 마우스(1x104 세포/마우스)에 i.p. 주사하였다. 3일 후에, GFP 단독 또는 mbIL15를 함유하는 MSCV 벡터로 형질도입된 NK 세포를 i.p. 주사하고(1x107 세포/마우스); NK 세포 주사를 7일째에 반복하였다. 대조용으로서, 하나의 마우스 그룹에 NK 세포 대신에 조직 배양 배지를 제공하였다. 두 번째 모델에서, 마우스에게 ES8 세포를 생착시킨 다음(i.p.; 1x105 세포/마우스) 3일째에 1회 NK 세포 주사를 상기와 같이 주사하였다. 종양 생착 및 진행을, D-루시페린 칼륨염(3 ㎎/마우스)의 수용액을 i.p. 주사 후 5분째에 영상화를 시작하여, 제노젠(Xenogen) IVIS-200 시스템(캘리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences, 미국 매사추세츠주 홉킨톤 소재)을 사용하여 평가하였다. 루시페라제-발현 세포로부터 방출된 광자를 리빙 이미지(Living Image) 4.3.1 소프트웨어 프로그램을 사용하여 정량분석하였다.
결과
IL-15 구조물의 설계 및 NK 세포에서 발현
본 명세서에 기재된 바와 같이, 2가지 형태의 IL15 유전자, 즉 인간 IL15 유전자가 CD8α의 막관통 도메인을 암호화하는 유전자에 결합된 구조물로부터 생성되는 막-결합된 형태("mbIL15"), 및 야생형의 변형되지 않은 형태("wtIL15")를 인간 NK 세포에 발현시켰다. 상기 두 구조물을 모두, 자극 세포주 K562-mb15-41BBL.28와 함께 말초 혈액 단핵세포를 배양한 후에 수득되는 증식성 NK 세포의 형질도입에 사용되는 GFP를 함유하는 MSCV 레트로바이러스 벡터에 삽입하였다(도 1A). 상기 배양의 끝에서, 레트로바이러스 형질도입 전에, 잔류 T-세포를 항-CD3 면역자기 비드로 고갈시켜 >95% 순수한 CD56+ CD3- 세포를 생성시켰다. 중간 GFP 발현은 mbIL15를 함유하는 구조물의 경우 71%(23% - 97%, n=60)였고, wtIL15를 함유하는 경우는 69%(범위, 20% - 91%, n-25)였다. 오직 GFP만을 함유하는 벡터로 또한 형질도입된 동일한 공여자로부터의 NK 세포는 84%(53% - 98%, n=60)의 중간 GFP 발현을 가졌다(도 1B).
mbIL15로 형질도입 후, IL-15를 NK 세포막상에 발현시켰다: 40% - 63%(중간, 52; n=7)의 GFP+ NK 세포는 항-IL15 항체에 의해 검출된 바와 같이 IL-15를 가졌다(도 1B). 대조적으로, wtIL15로 형질도입된 세포(n=4) 또는 모의 형질도입된 NK 세포(n=7)에서 IL-15는 검출할 수 없었다. 상기 형질도입된 NK 세포에 의한 용해성 IL-15의 생산을 24 및 48시간 배양 후 수집된 상등액을 시험함으로써 측정하였다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, wtIL15를 발현하는 세포는 상당량의 IL-15를 분비한 반면, 이는 mbIL15-NK 세포에서 최소였으며 모의-형질도입된 NK 세포에서는 검출할 수 없었다.
IL-15를 발현하는 NK 세포는 자율 생존 및 증대 능력을 갖는다
IL-15의 발현이 NK 세포 생존의 유지에서 외인성 IL-2를 대체할 수 있는지를 측정하기 위해서, 15명의 공여자로부터의 NK 세포를 mbIL15 구조물로 형질도입시키고 IL-2의 부재하에서 배양하고; 이어서 배양 후 세포수를 모의-형질도입된 NK 세포와의 평행 배양에서의 경우와 비교하였다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, mbIL-15의 발현은 NK 세포 생존을 대단히 증가시켰다: 7일의 배양 후에, 중간 세포 회수율은 85%인 반면 생육성 모의-형질도입된 NK 세포는 실질적으로 검출할 수 없었다(<1%; 대응표본 t 검정에 의해 P<0.0001). mbIL15의 효과는 항-IL-15 중화 항체를 상기 배양물에 첨가한 경우 현저하게 감소하였다(도 6A 내지 6B). 상기 15명의 공여자 중 9명에서, mbIL15 NK 세포의 회수율을 또한 wtIL15를 발현하는 NK 세포의 경우와 비교하였다: 이는 전자보다 현저하게 더 높았다(중간값, 85% 대 56%, P=0.026; 도 2A).
평행 실험에서, 외인성 IL-2의 존재하에서 IL15 발현의 지지 효과를 측정하였다. 배양물이 10 IU/㎖의 IL-2를 함유한 경우, mbIL15 또는 wtIL15를 발현하는 NK 세포의 7-일 회수율은 모의-형질도입된 세포의 경우보다 현저하게 더 높게 남아있었으며; 이러한 조건하에서 상기 2가지 형태의 IL15간에 현저한 차이는 주목되지 않았다(도 6A 내지 6B). 오직 외인성 IL-2가 고농도(100 IU/㎖)로 존재하는 경우에만, 모의-형질도입된 NK 세포의 7-일 회수율은 IL15로 형질도입된 NK 세포의 경우와 합치하였다(도 6A).
상기 9명의 공여자 중 6명으로부터의 증대된 NK 세포에 의한 실험에서, 저 용량 IL-2(10 IU/㎖) 하에 7일 이상 NK 세포 생존을 지지하는 mbIL15의 능력을 측정하였다. 14일째에, mbIL15 NK 세포수는 상기 6개의 배양물 중 4개에서 유지되거나 증가되었으며; 이들 중 2개에서 세포가 21일까지 추가로 증대되었다. 동일한 공여자로부터의 모의-형질도입된 NK 세포를 갖는 6개의 배양물 중 단지 2개만이 14일 및 21일째에 세포수를 유지하였으며, 세포 생육은 관찰되지 않았다; 21일째의 중간 세포 회수율은 mbIL15 NK 세포의 경우 205%이고 모의-형질도입된 NK 세포의 경우 80%였다. 따라서, 저 용량 IL-2의 존재하에서조차, mbIL15 발현은 상당한 생존 및 생육 이점을 부여하였다.
하나의 공여자로부터의 NK 세포의 배양물에서, 특히 높은 세포 회수율은 IL15가 발현된 7일째에 관찰되었다(IL-2의 부재하에서 mbIL15의 경우 261% 및 wtIL15의 경우 161%; 10 IU/㎖ IL-2의 경우 266% 및 188%). 이들 배양물을 2개월 동안 모니터하였으며 mbIL15의 발현에 의해 야기된 세포 증대 및 생존의 현저한 개선이 관찰되었다(도 2C). IL-2의 부재하에서조차, mbIL-15 NK 세포는 21일까지 계속해서 생존하였으며 상기 배양의 개시 후 75째에 여전히 검출될 수 있었던 반면, 모의-형질도입된 세포는 7일째에 검출할 수 없게 되었고 wtIL15-형질도입된 NK 세포는 42일째에 검출할 수 없게 되었다. 저 용량(10 IU/㎖)의 IL-2의 존재하에서, 상기 mbIL15-발현 NK 세포의 수는 상기 배양의 개시 후 2개월째에 최초에 시딩된 경우와 동일한 반면, 생육성 모의-형질도입된 및 wtIL15-형질도입된 NK 세포는 훨씬 더 일찍 감소하였다. 부록 도면 6B에 나타낸 바와 같이, IL-2를 고 용량(100 IU/㎖)으로 상기 배양물에 가한 경우, mbIL155 또는 wtIL15로 형질도입된 NK 세포는 유사한 지속 프로파일을 가졌으며, 상기 두 세포 유형은 모두 이러한 조건하에서조차 모의-형질도입된 NK 세포보다 더 오래 생존하였다.
생체내에서 mbIL15 NK 세포의 증대 및 귀소(homing)
시험관내에서 수행된 실험은 IL15 발현이 NK 세포의 생존 및 증대를 개선시키고 mbIL15는 전체적으로 보다 양호한 자극을 생성시킴을 가리켰다. 이어서 mbIL15 발현이 NOD/scid IL2RGnull 마우스에서 인간 NK 세포의 증대를 지속시키는지를 측정하였다. 4명의 공여자로부터의 활성화된 NK 세포를 mbIL15로 형질도입시키고(52% - 74% GFP-양성) 4마리의 마우스에 주사하였으며(공여자당 한 마리의 마우스); 4마리의 대조용 마우스에게 동일한 공여자로부터 모의-형질도입된 NK 세포를 주사하였다. mbIL15를 발현하는 NK 세포는 모의-형질도입된 NK 세포보다 훨씬 더 증대되었다: 주사 후 7일째에, mbIL15 NK 세포/혈액 ㎕의 중간수는 44.5(범위, 42-60) 대 모의-형질도입된 NK 세포의 경우 6.5(0-12)였다(P=0.004)(도 3A). 동일한 세포로 평행 실험을 수행하였으며, 이번에는 또한 20,000 IU 인간 IL-2를 2일마다 i.p. 투여하였다(도 3A). 이러한 조건하에서, mbIL15 NK 세포는 훨씬 더 증대된 반면(중간 NK 세포/㎕, 101; 범위, 60-167), 모의-형질도입된 세포는 낮게 남아있었다(중간, 18; 범위, 6-20; P=0.021).
주사 후 11일째에, mbIL15 NK 세포는, IL-2의 부재하에서 168.5 세포/㎕(범위, 94 - 355)의 말초 혈액 단핵 세포 및 IL-2가 또한 투여되었을 때 382 세포/㎕(151 - 710)을 포함하였다(도 3A, B). 대조적으로, 모의-형질도입된 NK 세포가 주사된 마우스에서, 인간 CD45 세포는 IL-2 부재하에서 실질적으로 검출될 수 없었으며, IL-2가 또한 주사된 경우 낮은 수준으로 존재하였다(중간, 27; 범위 9 - 207; P=0.026). 인간 CD45+ 세포는 또한 CD56을 발현하였으며 CD3은 없었다(도시 안 됨). 중요하게, GFP+의 비율은 주사전 66.5%±9.9%에서부터 7일째 93.8%±4.4% 및 11일째 94.8%±3.4%로 증가하였다(상기 두 비교 모두에 대해서 P<0.01).
11일째에 안락사 후, 상기 4마리 마우스 중 3마리를 다양한 조직 중 인간 CD45+ 세포의 존재에 대해 검사하였다. mbIL15가 발현된 경우, 상당수의 인간 NK 세포가 골수, 간, 비장, 신장 및 폐에서 검출되었으며; 모든 조직에서 숫자가 모의-형질도입된 세포에 대해 관찰된 경우보다 현저하게 더 높았다(도 3C): mbIL15를 발현하는 CD45+ 세포의 평균(±SD) 백분율은 모의-형질도입된 세포에 대한 0.04%±0.09% 및 0.4%±0.6%에 비해, IL-2 부재하에서 1.2%±1.5% 및 IL-2 존재하에서 3.0%±4.3%였다(각각 P<0.001 및 P=0.002). 유일한 예외는 mbIL15도 모의-형질도입된 NK 세포도 검출될 수 없었던 뇌였다.
mbIL15 자극의 기전
mbIL15가 트랜스(이웃하는 세포를 자극하는 하나의 NK 세포상에 제공된 IL-15(생리학적으로 발생하는 것으로 보고된 기전)) 또는 시스(동일한 세포에서 발현된 수용체에 대한 mbIL15의 직접적인 결합에 의해)로 세포를 우세하게 자극하는지를 측정하기 위해서, 배양물 중의 GFP+ 및 GFP- NK 세포의 비율을 배양 7일 후에 평가하였다. 상기 트랜스 기전이 우세한 경우, GFP+와 GFP- NK 세포간의 비는 배양 중 변경되지 않은 채로 있을 것이며; 시스가 우세한 경우 GFP+ 세포의 비율이 증가할 것이다. 도 4A는 상기와 같은 분석의 결과를 나타낸다: IL-2 없이 7일의 배양 후 검사된 NK 세포 가운데 GFP+ 세포의 백분율은 mbIL15가 발현된 경우 일관되게 증가한 반면, 모의-형질도입된 세포와의 배양에서는 증가하지 않았다: GFP+ 세포는 0일째에 전체 세포 집단의 71.2%±19.0% 대 80.5%±17.1%에 비해, 7일째에 95.9%±3.3% 대 57.5%±18.6%(P<0.0001)를 차지하였다. 따라서, NK 세포에서 발현된 mbIL-15에 의한 우세한 자극 기전은 자가분비이다.
mbIL15를 발현하는 세포는 활성화된 NK 세포의 면역표현형을 필수적으로 유지하였다. 그러나, 모의-형질도입된 NK 세포에 비해 IL-2 철회 후 2일째에 검사시, mbIL15 NK 세포는 보통으로 더 높은 수준의 활성화 수용체 NKG2D, NKp44(CD336) 및 NKp30(CD337)뿐만 아니라 CD16 및 CD56을 발현한 반면, NKp46(CD335)의 발현은 감소하였으며, 다른 분자들, 예를 들어 DNAM-1(CD226)의 발현은 변하지 않은 채로 있었다(도 4B; 표). mbIL15의 발현에 의해 활성화된 신호 전달 경로를 또한 측정하였다. 도 4C에 나타낸 바와 같이, 모의-형질도입된 NK 세포에 비해, mbIL-15 NK 세포는 다수의 고도로 인산화된 분자를 가졌다. 이들은 IL-15 신호전달에 응답하여 인산화되는 것으로 공지된 분자들, 예를 들어 전사 인자 STAT1, STAT3 및 STAT5, 키나제 src, Erk1/2 및 Mek1을 포함하였다. 현저하게, 세포사멸-억제 효과를 집합적으로 가리키는 Bad의 현저한 인산화뿐만 아니라 카스파제 7 및 9의 인산화가 관찰되었다. IL-15 신호전달에서의 역할이 불명확한 mbIL15 NK 세포 중의 다른 고도로 인산화된 분자는 CDK6 및 RafA를 포함하였다.
시험관내 및 생체내에서 NK 세포 항-종양 세포독성에 대한 mbIL-15의 효과
mbIL15의 발현에 의해 유발된 NK 세포 생존 및 증식의 개선은 종양 세포의 NK-매개된 살해가 또한 증가할 듯함을 암시하였다. 이러한 생각을 먼저 mbIL15-NK 세포에 의해 발휘된 종양 세포 세포독성을 동일한 공여자로부터의 모의 형질도입된 NK 세포의 경우와 비교함으로써 시험하였다. 상이한 E:T 비 및 공-배양 지속기간에서, 총 90회의 실험 동안 백혈병 세포주 Nalm-6(B-계통 급성 림프모구성 백혈병), U937 및 K562(급성 골수성 백혈병)뿐만 아니라 다우디(B-세포 림프종), SKBR3(유방 암종) 및 ES8(유잉 육종)을 표적화하는 9명의 공여자로부터의 NK 세포를 사용하는 실험을 수행하였다. 도 5A는 24-시간 분석의 결과를 나타낸다: 중간 세포독성은 모의-형질도입된 NK 세포에 의해서 1:4 E:T에서 22% 및 1:1 E:T에서 54%였고; mbIL15 NK 세포에 의해서는 각각 71% 및 99%였다(P<0.0001). 개별적인 세포주들에 대한 결과를 도 7A 내지 7B에 나타낸다. 상기 증가된 세포독성은 배양물 중의 NL 세포의 생존 증가와 관련될 수도 있지만, K562 또는 U937 세포와의 배양 후 CD107a 염색에 의해 밝혀진 바와 같이, mbIL15-NK에 의한 세포용해 과립의 증가된 방출이 또한 관찰되었다(P=0.0067; 도 5B).
mbIL15의 발현과 관련된 시험관내 세포독성 증가는 인간 종양 세포가 생착된 NOD/scid IL2RGnull 마우스를 사용한 실험에서 반영되었다. 하나의 실험 세트에서, 마우스에게 인간 급성 골수성 백혈병(AML) 세포주 U937을 주사하고 이어서 mbIL15- 또는 모의-형질도입된 NK 세포로 처리하였다. 도 5C 및 5D에 나타낸 바와 같이, mbIL15-형질도입된 NK 세포를 제공받은 마우스는 처리되지 않은 마우스 및 모의-형질도입된 NK 세포로 처리된 마우스보다 더 느린 종양 성장 및 현저하게 더 긴 생존을 가졌다(P=0.014, 추세에 대한 로그 순위 시험). 상기 세포를 또한, NOD/scid IL2RGnull 마우스에게 유잉 육종 세포주 ES8을 주사한 두 번째 이종이식 모델에서 시험하였으며, 상기 세포주는 훨씬 더 느린 성장률을 가졌고, 상기 마우스는 1회의 NK 세포 주사로 처리되었다. 부록 도면 8A 내지 8C에 나타낸 바와 같이, mbIL15 NK 세포(n=12)로 처리된 마우스의 결과는 모의-형질도입된 NK 세포(n=11) 및 처리되지 않은 마우스(n=7)의 결과보다 우수하였다: 중간 생존은 각각 162, 49 및 21일이었다(P=0.005).
논의
암의 NK 세포-기반 요법의 성공을 결정하는 인자들 가운데 아마도 가장 근본적인 것은 NK 세포가 종양 세포감소를 생성시킬 것 같은 E:T 비를 성취하기에 충분한 수로 지속되는 것이다.32 인간 NK 세포에서 IL-15의 막-결합된 형태의 발현이 IL-2의 부재하에서 상기 세포의 자율적인 증대를 지지하고 생존을 연장하는 것으로 본 명세서에 입증되어 있다. mbIL15를 발현하는 NK 세포는 외인성 IL-2 없이 2개월까지 시험관내에서 유지될 수 있었다. mbIL15를 발현하는 NK 세포는 면역결핍 마우스 및 침윤된 다수의 조직에서 증대될 수 있었으며, 여기에서 모의-형질도입된 세포보다 훨씬 더 큰 수로 발견될 수 있었다. mbIL-15 NK 세포의 증대는 시험관내 및 생체내 모두에서 저농도의 IL-2에 의해 추가로 증가되었다. mbIL15의 발현은 NK 세포의 세포독성 능력을 손상시키지 않았다. 실제로, 이종이식 모델에서, mbIL15 NK 세포는 모의-형질도입된 세포의 경우보다 더 강력한 항암 활성을 발휘하였으며, 이는 상기 접근법이 IL-2 투여의 부작용을 피하면서 NK 세포 주입의 항종양 능력을 개선시킬 수도 있음을 암시한다.
본 명세서의 발견은 인간 NK 세포에서 IL-15의 엑토픽(ectopic) 발현이, IL-15가 분비된 형태보다 막-결합된 형태로 존재할 때 보다 강한 생존-촉진 효과를 유발하였음을 나타낸다. 그러나, 현저하게는 NK 세포에서 발현된 mbIL15는 IL-15가 다른 세포들에 의해 제공될 때 트랜스에서보다는 오히려 시스에서 우선적으로 자극된다. 즉, mbIL15는 동일한 세포상의 IL-15 수용체와 선택적으로 맞물려 자가분비 자극을 생성시키는 것으로 보인다. 이러한 기전은, 세포의 상당 부분이 강한 GFP 발현을 갖지만 표면상으로는 IL-15가 없는 것으로 보이는 IL-15 발현 패턴을 설명하며, 상기 패턴은 mbIL15-형질도입된 NK 세포를 항-IL-15 항체로 표지한 경우 일관되게 관찰된다(도 1B). 이들 세포에서 IL-15는 그의 수용체에 결합되고/되거나 내면화되기 때문에, 발현은 되지만 항체에 접근하기 쉽지 않은 것으로 가정된다. NK 세포 생육력을 촉진하는 mbIL15의 능력은, 특히 24-시간 시험관내 분석 및 생체내에서 상기 세포에 의해 발휘된 증가된 세포독성을 설명하기에 적당하다. 그러나, mbIL15-NK 세포의 우수성은 또한 단기간(4-시간) 분석에서도 분명하였으며 상기 세포는 또한 CD107a 시험에 따라 보다 많은 세포용해 과립을 방출하였다. 따라서, mbIL15의 발현은 다른 수단들에 의해, 아마도 그의 활성화 상태를 증진시킴으로써 NK 세포 세포독성을 증가시키는 듯하다.
NK 세포의 임상 투여는 전형적으로는 생체내에서 상기 세포의 생존 및 증대를 지지하는 IL-2에 따라 변한다. 그러나, IL-2 투여와 관련된 다수의 부작용들은 잠재적으로 심각하며 종종 상기 사이토킨의 투여를 불충분하게 허용되게 한다. IL-2 투여의 중지 또는 그의 용량의 감소는 감소된 NK 세포 증대 및 비효율적인 항-종양 효과를 생성시킬 수 있으며, 이는 조절 T 세포의 자극에 의해 더욱 억제될 수 있다. 이 때문에, IL-2를 IL-15로 대체시키는 것은 잠재적으로 매력적이지만 IL-15의 임상 제형은 여전히 시험중이다. 상기는 붉은털 원숭이(rhesus macaques)에 투여될 때 전체적으로 잘 허용되었지만, 일부 동물에서 부작용, 예를 들어 설사, 구토, 체중감소, 일시적인 호중구감소증, 트랜스아미나제의 증가 및 저나트륨혈증이 관찰되었다. T 및 NK 세포 증대 외에, 조절 T 세포의 증대가 관찰되었다. wtIL15로 형질도입된 NK 세포와 상반되게, mbIL15로 형질도입된 것들은 상등액 중에 IL-15를 과도하게 소량으로 방출하였다. 따라서, IL-15와 NK 세포 외의 세포와의 상호작용에 의해 유발될 수 있는 임의의 잠재적인 부작용은 상기 접근법에 의해 최소화될 것이다. 중요하게, 쥐의 큰 과립 림프구의 IL-15에의 연장된 노출은 그의 백혈병 성장을 유도한다. 이는 특히 IL-15를 발현하는 NK 세포가 환자에게 낮은 재발 위험성으로 투여되는 경우, 환자에서 IL-15 투여 및 상기 세포의 사용에 대한 잠재적인 안전성 우려를 제기한다. 그러나, 본 명세서에 기재된 실험에서, mbIL15를 발현하는 NK 세포는 일반적으로 용해성 IL-15를 발현하는 T 세포 클론에 대해 보고된 1년 이상보다 훨씬 더 짧은 기간 동안 생존하였다. 더욱이, 지속적인 NK 증대가 9개월이 넘는 추적조사에서, 면역결핍 마우스에서 관찰되지 않았다.
NK 세포의 항암 능력을 지지하는 상당한 임상적 증거가 존재한다. NK 세포는 또한 단클론 항체로 치료된 환자에서 항체-의존적인 세포 세포독성을 매개하는데 중요한 역할을 한다. 따라서, NK 세포의 주입은 다수의 환경에서 이로운 듯하다. 생체외에서 다수의 인간 NK 세포의 증대가 가능하며; 상기 목적을 위한 확고한 대규모 방법이 확립되었고 임상 시험에 사용되고 있다. 레트로바이러스 형질도입 또는 일렉트로포레이션(electroporation)에 의한 NK 세포의 유전자 변형이 또한 가능하다. 따라서, 본 명세서에 기재된 접근법의 임상-등급 조건으로의 이동은 현실적이며 mbIL15-NK 세포의 우수한 증대 및 세포독성에 의해 보장된다.
Figure pat00001
1세포 마커를 IL-2의 부재하에서 48시간 배양 후에 분석하였다. 항체를 BD 바이오사이언시즈(CD56 PE, CD16 PE-Cy7, CD69 PE, CD25 PE-Cy7, CD122 BV421, CD158b PE), 벡크만 쿨터(Beckman Coulter)(CD335 PE, CD336 PE, CD337 PE, CD158ah PE, CD159a PE), 밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotech)(CD226 PE, CD158e APC), R&D 시스템스(NKG2D PE), 바이오레전드(Biolegend)(CD132 APC)로부터 수득하였다.
2백분율은 상기 마커를 발현하는 GFP+ 세포를 지칭한다.
3과발현된 마커는 굵은 글자체로 강조된다.
MFI, 평균 형광 강도
본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고문헌들의 교시는 내용 전체가 참고로 인용된다.
본 발명을 그의 예시적인 실시태양들을 참조하여 특별히 나타내고 기재하였지만, 형태 및 세부사항들에 대한 다양한 변화를 첨부된 특허청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위로부터 이탈됨 없이 수행할 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에 의해 이해될 것이다.

Claims (20)

  1. 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 천연 살해(NK) 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    IL-15가 막-결합된 폴리펩티드로서 및/또는 분비된 폴리펩티드로서 발현되는 NK 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    IL-15의 전부 또는 기능성 부분이 막관통 단백질의 전부 또는 일부에 융합되는 NK 세포.
  4. 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 천연 살해(NK) 세포의 생성 방법으로서,
    a) IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 상기 NK 세포에 도입시키고;
    b) 상기 NK 세포를 상기 IL-15의 전부 또는 기능성 부분이 발현되는 조건하에서 유지시켜, IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 NK 세포를 생성시킴
    을 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    NK 세포에 도입된 핵산이 CD8α의 신호 펩티드, IL-15의 전부 또는 기능성 부분 및 CD8α의 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    NK 세포를, 막관통 도메인의 전부 또는 일부에 결합된(예를 들어, 융합된) IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 벡터로 형질도입시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    벡터가 바이러스 벡터인 방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 천연 살해(NK) 세포.
  9. 제1항 내지 제3항 또는 제8항 중 어느 한 항의 NK 세포를 포함하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 또는 제8항 중 어느 한 항의 NK 세포를 포함하는 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    IL-2의 전부 또는 기능성 부분을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  12. 암 치료가 필요한 개체에게 인터류킨-15(IL-15)의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 천연 살해(NK) 세포를 투여함을 포함하는 상기 개체에서 암을 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    암이 백혈병(예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병; 급성 골수성 백혈병; 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병), 골수이형성 증후군, 림프종(예를 들어, B 세포 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, T-세포 림프모구성 림프종, 역형성 대세포 림프종), 고형 종양(예를 들어, 유방암, 전립선암, 위암, 결장암, 간세포 암종, 비인두 암종, 신경모세포종, 고악성도 신경아교종), 육종(예를 들어, 유잉 육종, 횡문근육종, 비-횡문근육종 연조직 육종, 골육종)인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    개체에게 IL-2를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체에게 암에 대한 하나 이상의 항체를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  16. NK 세포의 증대 및/또는 생존을 증진시키는 방법으로,
    a) IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 암호화하는 핵산을 도입시키고,
    b) 상기 NK 세포를, 상기 IL-15의 전부 또는 기능성 부분이 발현되고 상기 NK 세포가 증식하는 조건하에서 유지시켜, 상기 NK 세포의 증대 및/또는 생존을 증진시킴
    을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    NK 세포에 도입된 핵산이 CD8α의 신호 펩티드, IL-15의 전부 또는 기능성 부분 및 CD8α의 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    NK 세포를, 막관통 도메인의 전부 또는 일부에 결합된(예를 들어, 융합된) IL-15의 전부 또는 기능성 부분을 발현하는 벡터로 형질도입시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    벡터가 레트로바이러스 벡터인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    NK 세포를 IL-2와 접촉시킴을 추가로 포함하는 방법.
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Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10689609B2 (en) 2012-03-15 2020-06-23 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic bioreactor processes
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9745548B2 (en) 2012-03-15 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US10322949B2 (en) 2012-03-15 2019-06-18 Flodesign Sonics, Inc. Transducer and reflector configurations for an acoustophoretic device
US9752113B2 (en) 2012-03-15 2017-09-05 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US10737953B2 (en) 2012-04-20 2020-08-11 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic method for use in bioreactors
EP3783098A1 (en) 2013-05-14 2021-02-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
US9745569B2 (en) 2013-09-13 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. System for generating high concentration factors for low cell density suspensions
CA2935960C (en) 2014-01-08 2023-01-10 Bart Lipkens Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
SG11201609118RA (en) * 2014-05-15 2016-11-29 Univ Singapore Modified natural killer cells and uses thereof
US9744483B2 (en) 2014-07-02 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. Large scale acoustic separation device
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
US10875919B2 (en) 2016-04-26 2020-12-29 Alector Llc Chimeric receptors and methods of use thereof
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
MX2018013565A (es) * 2016-05-07 2019-08-21 Celularity Inc Métodos para tratar la leucemia mieloide aguda y mieloma múltiple usando células asesinas naturales.
JP2020513248A (ja) 2016-10-19 2020-05-14 フロデザイン ソニックス， インク．Ｆｌｏｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ． 音響による親和性細胞抽出
JP7288401B2 (ja) 2017-01-10 2023-06-07 プレシゲン，インコーポレイテッド 新規の遺伝子スイッチ発現系を介したポリペプチドの発現のモジュレーション
WO2018161026A1 (en) * 2017-03-03 2018-09-07 Obsidian Therapeutics, Inc. Il15 compositions and methods for immunotherapy
US11629340B2 (en) 2017-03-03 2023-04-18 Obsidian Therapeutics, Inc. DHFR tunable protein regulation
WO2018182511A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
EP3600356A4 (en) * 2017-03-27 2020-12-23 National University of Singapore ABBREVIATED NKG2D CHIMERIC RECEPTORS AND USES THEREOF IN IMMUNOTHERAPY WITH NATURAL KILLER CELLS
EP3621635A4 (en) 2017-05-10 2021-02-24 Wellstat Immuno Therapeutics, LLC WRAPPED VIRUS RESISTANT TO INACTIVATION OF THE CANCER TREATMENT COMPLEMENT
US20200199532A1 (en) * 2017-05-19 2020-06-25 Case Western Reserve University Compositions and methods for expanding ex vivo natural killer cells and therapeutic uses thereof
BR112020009889A2 (pt) 2017-12-14 2020-11-03 Flodesign Sonics, Inc. acionador e controlador de transdutor acústico
MY197176A (en) 2018-02-01 2023-05-30 Nkmax Co Ltd Method of producing natural killer cells and composition for treating cancer
US20210046115A1 (en) * 2018-02-09 2021-02-18 National University Of Singapore Activating Chimeric Receptors and Uses Thereof In Natural Killer Cell Immunotherapy
CN108715834B (zh) * 2018-06-01 2021-09-14 天晴干细胞股份有限公司 一种富含cd41+、cd81+微囊的血小板裂解液制备方法
JP2022500419A (ja) * 2018-09-13 2022-01-04 ンカルタ・インコーポレイテッドNkarta, Inc. 腫瘍を治療するためのナチュラルキラー細胞組成物および免疫療法の方法
MX2021010670A (es) * 2019-03-05 2021-11-12 Nkarta Inc Receptores de antigeno quimerico dirigidos a cd19 y usos de los mismos en inmunoterapia.
EP3934670A4 (en) * 2019-03-08 2022-11-30 Research Institute at Nationwide Children's Hospital STAT3 TRANSCRIPTOMES FOR DEVELOPMENT OF POTENTIAL NK CELLS
KR20200110576A (ko) * 2019-03-15 2020-09-24 재단법인대구경북과학기술원 사이토카인 기반 면역세포 및 그의 면역 치료 용도
CN113811603A (zh) * 2019-03-15 2021-12-17 河谷细胞有限公司 重组erIL-15 NK细胞
CN114450015A (zh) * 2019-07-31 2022-05-06 恩卡尔塔公司 用于天然杀伤细胞的增强的扩增和细胞毒性的方法和组合物
US20220332780A1 (en) * 2019-09-10 2022-10-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2-il15 fusion proteins for tunable regulation
CN113603787B (zh) * 2020-05-04 2023-05-23 英诺康生物医药科技(广州)有限公司 一种非分泌型的人白细胞介素15及应用
US20220002424A1 (en) * 2020-06-12 2022-01-06 Nkarta, Inc. Genetically modified natural killer cells for cd70-directed cancer immunotherapy
IL302728A (en) 2020-11-13 2023-07-01 Catamaran Bio Inc Genetically modified natural killer cells and methods of using them
US20220162288A1 (en) 2020-11-25 2022-05-26 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
US11591381B2 (en) 2020-11-30 2023-02-28 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
WO2022144632A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for differentiating stem cells into nk cells
JP2024504585A (ja) * 2021-01-19 2024-02-01 オブシディアン セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｔ細胞及び腫瘍浸潤リンパ球の拡張のための組成物及び方法
WO2023278811A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and related methods
WO2023199961A1 (ja) * 2022-04-14 2023-10-19 第一三共株式会社 膜型サイトカイン及びｔｎｆ受容体スーパーファミリー分子の細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチド
WO2023217796A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Compositions comprising il-15, il-15 receptor alpha and the intracellular signaling domain of cd2 for immune cell therapy
WO2024007020A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Indapta Therapeutics, Inc. Combination of engineered natural killer (nk) cells and antibody therapy and related methods
WO2024020537A2 (en) * 2022-07-22 2024-01-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd3-expressing natural killer cells with enhanced function for adoptive immunotherapy

Family Cites Families (209)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US4844893A (en) 1986-10-07 1989-07-04 Scripps Clinic And Research Foundation EX vivo effector cell activation for target cell killing
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US6355476B1 (en) 1988-11-07 2002-03-12 Advanced Research And Technologyinc Nucleic acid encoding MIP-1α Lymphokine
US5124263A (en) 1989-01-12 1992-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
ATE145428T1 (de) 1990-12-14 1996-12-15 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
WO1992017198A1 (en) 1991-03-28 1992-10-15 The Regents Of The University Of Minnesota Dna and amino acid sequence specific for natural killer cells
US5674704A (en) 1993-05-07 1997-10-07 Immunex Corporation Cytokine designated 4-IBB ligand
CA2168202A1 (en) 1993-07-30 1995-03-16 Joseph Dougherty Efficient gene transfer into primary lymphocytes
US5653977A (en) 1993-09-09 1997-08-05 Uab Research Foundation Anti-idiotypic antibody that mimics the GD2 antigen
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6103521A (en) 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
DE19520729A1 (de) 1995-06-07 1996-12-12 Orpegen Pharma Gmbh Testsystem zur Erfassung der Aktivität von NK-Zellen
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US7070771B1 (en) 1996-12-09 2006-07-04 Regents Of The University Of California Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells
US20020018783A1 (en) 1997-03-20 2002-02-14 Michel Sadelain Fusion proteins of a single chain antibody and cd28 and uses thereof
GB9713473D0 (en) 1997-06-25 1997-09-03 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
PT1003861E (pt) 1997-08-01 2007-01-31 Schering Corp Proteínas de membrana de células de mamíferos;reagentes relacionados
GB9725764D0 (en) 1997-12-04 1998-02-04 Isis Innovation HLA-E binding
AU741602B2 (en) 1998-02-02 2001-12-06 Johns Hopkins University School Of Medicine, The A universal immunomodulatory cytokine-expressing bystander cell line and related compositions and methods of manufacture and use
DE19813759C1 (de) 1998-03-27 1999-07-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Induktion einer durch NK-Zellen vermittelten Immunantwort
GB9809658D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
WO2000014257A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Fusion receptors specific for prostate-specific membrane antigen and uses thereof
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
EP1171596A1 (en) 1999-04-16 2002-01-16 Celltech Therapeutics Limited Synthetic transmembrane components
EP1231262A4 (en) 1999-10-21 2004-09-08 Keisuke Teshigawara METHOD FOR IN VITRO CULTURE OF LYMPHOCYTES AND GENE THERAPY COMPOSITIONS
JP3619853B2 (ja) 1999-11-26 2005-02-16 独立行政法人理化学研究所 ナチュラルキラー細胞の増殖方法
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
JP2002045174A (ja) 2000-07-31 2002-02-12 Inst Of Physical & Chemical Res ナチュラルキラー細胞増殖法
GB0025307D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
WO2002077029A2 (en) 2000-11-07 2002-10-03 City Of Hope Cd19-specific redirected immune cells
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
DE60232083D1 (de) 2001-08-15 2009-06-04 Takara Bio Inc Expansionskulturverfahren für antigenspezifische zytotoxische t-lymphozyten
CA2457143A1 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Roger Williams Hospital In situ immunization
WO2003057171A2 (en) 2002-01-03 2003-07-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform
WO2003089616A2 (en) 2002-04-22 2003-10-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Soluble mic polypeptides as markers for diagnosis, prognosis and treatment of cancer and autoimmune diseases or conditions
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US7740871B2 (en) 2002-09-19 2010-06-22 Johns Hopkins University School Of Medicine Cancer immunotherapy with a viral antigen-defined, immunomodulator-secreting cell vaccine
GB0225279D0 (en) 2002-10-30 2002-12-11 Celltech R&D Ltd Biological products
US9068234B2 (en) 2003-01-21 2015-06-30 Ptc Therapeutics, Inc. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
CA2530349A1 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Dnavec Research Inc. Method for transplanting lymphohematopoietic cells into mammal
US20050113564A1 (en) * 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
US20130266551A1 (en) 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
EP1765988B1 (en) 2004-05-27 2017-09-20 The Trustees of The University of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
ATE443084T1 (de) * 2004-07-10 2009-10-15 Fox Chase Cancer Ct Genetisch modifizierte, menschliche, natürliche killerzellenlinien:
WO2006036445A2 (en) 2004-09-24 2006-04-06 Trustees Of Dartmouth College Chimeric nk receptor and methods for treating cancer
GB0426903D0 (en) 2004-12-08 2005-01-12 Alexis Biotech Ltd Complexes and methods
EP1777294A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins
US20070160578A1 (en) 2005-12-14 2007-07-12 The Gov. Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dep. Of Health And Human Services Expansion of natural killer and CD8 T-cells with IL-15R/ligand activator complexes
EP2141997B1 (en) 2007-03-30 2012-10-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes
WO2009117566A1 (en) 2008-03-21 2009-09-24 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Chemokine gene-modified cells for cancer immunotherapy
CA2735456C (en) 2008-08-26 2021-11-16 City Of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
CN101684456A (zh) 2008-09-28 2010-03-31 江门罗森生物制药有限公司 一种体外培养条件下扩增人nk细胞的方法
WO2010071836A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Inserm Il-15 mediated nk and t cell maturation
WO2010106691A1 (ja) 2009-03-20 2010-09-23 学校法人早稲田大学 医療訓練用血管モデル及びその製造方法
CN102428173B (zh) 2009-03-26 2014-07-30 细胞维护北欧制药公司 Nk细胞的扩增
EP3135294B1 (en) 2009-08-14 2020-06-03 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Use of il-15-il-15 receptor heterodimers to treat lymphopenia
US20130058921A1 (en) 2009-10-30 2013-03-07 Frits VAN RHEE Use of autologous effector cells and antibodies for treatment of multiple myeloma
EP2493485A1 (en) 2009-10-30 2012-09-05 University Of Arkansas For Medical Science Use of autologous effector cells for treatment of multiple myeloma
MX354143B (es) 2009-12-02 2018-02-14 Imaginab Inc Minicuerpos j591 y diacuerpos-cys para apuntar con especificidad de objetivo a un antígeno de membrana específico para próstata de humano (psma) y métodos para su uso.
EP3184109B1 (en) 2009-12-29 2020-11-18 Gamida-Cell Ltd. Methods for enhancing natural killer cell proliferation and activity
US9422598B2 (en) 2010-06-04 2016-08-23 Biomerieux Method and kit for the prognosis of colorectal cancer
KR20230096132A (ko) 2010-07-13 2023-06-29 셀룰래리티 인코포레이티드 천연 킬러 세포의 생성 방법
US9487800B2 (en) * 2010-09-08 2016-11-08 Chemotherapeutisches Forschunginstitut Georg-Speyer-Haus Interleukin 15 as selectable marker for gene transfer in lymphocytes
ES2754394T3 (es) 2010-09-08 2020-04-17 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Receptores de antígenos quiméricos con una región bisagra optimizada
DK3327040T3 (da) 2010-09-21 2021-09-20 Altor Bioscience Corp Multimeriske opløselige il-15-fusionsmolekyler og fremgangsmåder til at fremstille og anvende samme
CN106963947A (zh) 2010-11-22 2017-07-21 伊纳特医药股份有限公司 Nk细胞调节治疗和用于治疗血液恶性疾病的方法
EP3305798A1 (en) 2010-12-09 2018-04-11 The Trustees of The University of Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
US20120321666A1 (en) 2011-05-23 2012-12-20 Cooper Laurence J N T cell therapy for b cell lymphoma
US20140255363A1 (en) 2011-09-16 2014-09-11 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
KR20140060541A (ko) 2011-09-16 2014-05-20 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 rna 조작된 t 세포
BR112014007029A2 (pt) 2011-09-23 2017-04-11 Bluebird Bio Inc métodos aperfeiçoados de terapia gênica
ITMO20110270A1 (it) 2011-10-25 2013-04-26 Sara Caldrer Una cellula effettrice modificata per il trattamento di neoplasie esprimenti il disialonganglioside gd2
CN103294374A (zh) 2012-02-23 2013-09-11 中兴通讯股份有限公司 一种触摸屏解锁方法及装置
CN104750498B (zh) 2012-02-24 2018-12-18 青岛海信电器股份有限公司 一种控制鼠标模块的方法及电子设备
PT3578201T (pt) 2012-06-28 2023-05-10 Univ Of Central Florida Research Foundation Incorporated Métodos e composições para células assassinas naturais
US20160235787A1 (en) 2012-07-13 2016-08-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Epitope Spreading Associated with CAR T-Cells
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
CA2918608A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Biomarker associated with risk of melanoma reoccurrence
US9365641B2 (en) 2012-10-01 2016-06-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
WO2014055413A2 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Bloodcenter Research Foundation A method of providing cellular therapy using modified natural killer cells or t lymphocytes
CN112430580A (zh) 2012-10-02 2021-03-02 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
US20150329640A1 (en) 2012-12-20 2015-11-19 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
US9511092B2 (en) 2013-01-28 2016-12-06 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptor with NKG2D specificity for use in cell therapy against cancer and infectious disease
CN105142677B (zh) 2013-02-15 2019-08-30 加利福尼亚大学董事会 嵌合抗原受体及其使用方法
KR20210108497A (ko) 2013-02-26 2021-09-02 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 면역치료용 조성물 및 방법
CN103113470B (zh) 2013-02-27 2015-04-22 四川大学 靶向人egfr的基因工程化淋巴细胞及其制备方法和用途
CA2904369A1 (en) 2013-03-07 2014-09-12 Baylor College Of Medicine Targeting cd138 in cancer
US20160024175A1 (en) 2013-03-10 2016-01-28 Baylor College Of Medicine Chemotherapy-resistant immune cells
US9446105B2 (en) 2013-03-15 2016-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimeric antigen receptor specific for folate receptor β
KR20150128997A (ko) 2013-03-15 2015-11-18 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 면역치료용 조성물 및 방법
WO2014145252A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
EP2986636B1 (en) 2013-04-17 2018-11-14 Baylor College Of Medicine Immunosuppressive tgf-beta signal converter
EP3783098A1 (en) 2013-05-14 2021-02-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
CA2912389C (en) 2013-06-10 2020-01-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for reducing immunosupression by tumor cells
CA2926267C (en) 2013-10-17 2023-08-01 National University Of Singapore Chimeric receptor that triggers antibody-dependent cell cytotoxicity against multiple tumors
US10144770B2 (en) 2013-10-17 2018-12-04 National University Of Singapore Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
CN105873952A (zh) 2013-10-31 2016-08-17 弗莱德哈钦森癌症研究中心 经修饰的造血干细胞/祖细胞和非t效应细胞及其用途
PT3071222T (pt) 2013-11-21 2020-11-20 Ucl Business Plc Célula
BR112016014156A8 (pt) 2013-12-20 2023-04-11 Hutchinson Fred Cancer Res Moléculas efetoras quiméricas etiquetadas e receptores das mesmas
EP3808410A1 (en) 2013-12-20 2021-04-21 Cellectis Method of engineering multi-input signal sensitive t cell for immunotherapy
EP3094653B1 (en) 2014-01-13 2019-10-23 Stephen J. Forman Chimeric antigen receptors (cars) having mutations in the fc spacer region and methods for their use
US20170015975A1 (en) 2014-02-10 2017-01-19 Nvigen, Inc. Cell modulation nanocomposition, and methods of use
KR102375998B1 (ko) 2014-02-14 2022-03-21 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 키메라 항원 수용체 및 제조방법
WO2015142661A1 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
GB201405845D0 (en) 2014-04-01 2014-05-14 Ucl Business Plc Signalling system
WO2015154012A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Clonogenic natural killer (nk) cell populations and methods of producing and using such populations
CN110938655A (zh) 2014-04-25 2020-03-31 蓝鸟生物公司 Mnd启动子嵌合抗原受体
SG11201609118RA (en) 2014-05-15 2016-11-29 Univ Singapore Modified natural killer cells and uses thereof
US10550197B2 (en) 2014-06-18 2020-02-04 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus CAR-expressing NK-92 cells as cell therapeutic agents
CN107075483A (zh) 2014-07-15 2017-08-18 朱诺治疗学股份有限公司 用于过继细胞治疗的工程改造的细胞
EP3180359A1 (en) 2014-08-14 2017-06-21 Novartis AG Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
EP4074735A1 (en) 2014-08-28 2022-10-19 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
GB201415347D0 (en) 2014-08-29 2014-10-15 Ucl Business Plc Signalling system
CA2996848C (en) 2014-09-04 2021-01-05 Stemcell Technologies Inc. Soluble antibody complexes for t cell or nk cell activation and expansion
EP3191507A1 (en) 2014-09-09 2017-07-19 Unum Therapeutics Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
RU2745705C2 (ru) 2014-09-15 2021-03-30 МОЛМЕД СпА Химерные рецепторы антигенов
US20170246217A1 (en) 2014-09-16 2017-08-31 Funndación Pública Andaluza Progreso y Salud Use of cord blood plasma to treat nk cell-mediated diseases and ifn-&#947; mediated diseases
MA41538A (fr) 2014-10-17 2017-12-26 Baylor College Medicine Cellules immunitaires bipartites et tripartites de signalisation
WO2016069607A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for natural killer cells
JP2017535284A (ja) 2014-11-05 2017-11-30 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 免疫エフェクター細胞の拡大のための遺伝子改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子操作細胞
EP3215534B1 (en) 2014-11-05 2020-04-15 Board of Regents, The University of Texas System Chimeric antigen receptors (car) to selectively target protein complexes
NZ769595A (en) 2014-11-05 2023-06-30 Juno Therapeutics Inc Methods for transduction and cell processing
EP3018200A1 (en) 2014-11-07 2016-05-11 Fondazione Matilde Tettamanti e Menotti de Machi Onlus Improved method for the generation of genetically modified cells
CA2967222C (en) 2014-11-12 2023-10-31 Rinat Neuroscience Corp. Inhibitory chimeric antigen receptors
IL252295B2 (en) 2014-12-19 2023-10-01 Dana Farber Cancer Inst Inc Chimeric antigen receptors and methods of using them
JP6797803B2 (ja) 2014-12-31 2020-12-09 セルジーン コーポレイション ナチュラルキラー細胞を用いて血液障害、固形腫瘍、又は感染性疾患を治療する方法
WO2016109661A1 (en) 2014-12-31 2016-07-07 Anthrogenesis Corporation Natural killer cells and uses thereof
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
US10377988B2 (en) 2015-01-23 2019-08-13 Musc Foundation For Research Development Cytokine receptor genes and the use thereof to enhance therapy
MA41433A (fr) 2015-01-26 2017-12-05 Baylor College Medicine Cellules immunitaires universelles pour l'immunothérapie anticancéreuse
EP3250587B1 (en) 2015-01-29 2020-03-25 Regents of the University of Minnesota Chimeric antigen receptors, compositions, and methods
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
GB201501936D0 (en) 2015-02-05 2015-03-25 Ucl Business Plc Signalling system
US10765699B2 (en) 2015-02-06 2020-09-08 National University Of Singapore Methods for enhancing efficacy of therapeutic immune cells
AU2016214301B2 (en) 2015-02-06 2022-05-19 Cellectis Primary hematopoietic cells genetically engineered by slow release of nucleic acids using nanoparticles
GB201503742D0 (en) 2015-03-05 2015-04-22 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
EP3265481B1 (en) 2015-03-05 2024-05-01 Fred Hutchinson Cancer Center Immunomodulatory fusion proteins and uses thereof
EP3064507A1 (en) 2015-03-06 2016-09-07 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for IL15ra and therapeutic uses thereof
US9777064B2 (en) 2015-03-17 2017-10-03 Chimera Bioengineering, Inc. Smart CAR devices, DE CAR polypeptides, side CARs and uses thereof
CN107614008A (zh) 2015-03-20 2018-01-19 蓝鸟生物公司 载体制剂
GB201504840D0 (en) 2015-03-23 2015-05-06 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
WO2016154585A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Charles Sentman Anti-mica antigen binding fragments, fusion molecules, cells which express and methods of using
CN108367057B (zh) 2015-04-06 2022-11-22 赛通免疫股份有限公司 用于胶质母细胞瘤的egfr导向的car疗法
US20180092968A1 (en) 2015-04-23 2018-04-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions to disrupt protein kinase a anchoring and uses thereof
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
GB201507108D0 (en) 2015-04-27 2015-06-10 Ucl Business Plc Nucleic acid construct
GB201507115D0 (en) 2015-04-27 2015-06-10 Ucl Business Plc Nucleic Acid Construct
GB201507104D0 (en) 2015-04-27 2015-06-10 Ucl Business Plc Nucleic acid construct
GB201507111D0 (en) 2015-04-27 2015-06-10 Ucl Business Plc Nucleic acid construct
GB201507119D0 (en) 2015-04-27 2015-06-10 Ucl Business Plc Nucleic Acid Construct
WO2016174652A1 (en) 2015-04-30 2016-11-03 Technion Research & Development Foundation Limited Chimeric antigen receptors and methods of their use
GB201507368D0 (en) 2015-04-30 2015-06-17 Ucl Business Plc Cell
CA3021226A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 University Health Network Method for expansion of double negative regulatory t cells
EP3302547A1 (en) 2015-05-28 2018-04-11 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
AU2016268863B2 (en) 2015-05-28 2022-06-23 Kite Pharma, Inc. Diagnostic methods for T cell therapy
EP3303586A1 (en) 2015-05-29 2018-04-11 Juno Therapeutics, Inc. Composition and methods for regulating inhibitory interactions in genetically engineered cells
US11154572B2 (en) 2015-06-05 2021-10-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment with natural killer cells matched for killer immunoglobulin receptor type
AU2016275030B2 (en) 2015-06-10 2021-12-09 Nantkwest, Inc. Modified NK-92 cells for treating cancer
US11655452B2 (en) 2015-06-25 2023-05-23 Icell Gene Therapeutics Inc. Chimeric antigen receptors (CARs), compositions and methods of use thereof
AU2016285859A1 (en) 2015-06-29 2018-02-15 The Johns Hopkins University Immune checkpoint chimeric antigen receptors therapy
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
GB201513540D0 (en) 2015-07-31 2015-09-16 King S College London Therapeutic agents
WO2017023859A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antigen-binding proteins targeting cd56 and uses thereof
CA2993354A1 (en) 2015-08-04 2017-02-09 Avidbiotics Corp. Insertable variable fragments of antibodies and modified a1-a2 domains of nkg2d ligands, and non-natural nkg2d ligands that bind non-natural nkg2d receptors
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
GB201514874D0 (en) 2015-08-20 2015-10-07 Autolus Ltd Cell
BR112018002189A2 (pt) 2015-08-24 2018-09-18 Cellectis receptores antigênicos quiméricos com funções controláveis integradas
EP3138905A1 (en) 2015-09-04 2017-03-08 Miltenyi Biotec GmbH Method for natural killer cell expansion
WO2017058752A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Trustees Of Dartmouth College Chimeric antigen receptor anti-inflammatory cells and methods of use
US20180291080A1 (en) 2015-09-28 2018-10-11 Trustees Of Dartmouth College Chimeric antigen receptor, regulatory cells and methods of use
JP6932709B2 (ja) 2015-11-04 2021-09-08 ジェイ． プライスマン，ソール Ｈｅｒ２を標的とするキメラ抗原受容体
MA44314A (fr) 2015-11-05 2018-09-12 Juno Therapeutics Inc Récepteurs chimériques contenant des domaines induisant traf, et compositions et méthodes associées
CN107109363A (zh) 2015-11-09 2017-08-29 张明杰 增强对异常细胞杀伤力的方法和药物组合物
EP3383892B1 (en) 2015-12-03 2022-12-21 Juno Therapeutics, Inc. Modified chimeric receptors and related compositions and methods
JP6853514B2 (ja) 2015-12-27 2021-03-31 国立大学法人東海国立大学機構 炎症性サイトカインの産生が抑制されるキメラ抗原受容体遺伝子改変リンパ球
CA3010236A1 (en) 2016-01-20 2017-07-27 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
US20190112380A1 (en) 2016-03-29 2019-04-18 University Of Southern California Chimeric antigen receptors targeting cancer
CN110358736B (zh) 2016-05-20 2023-07-07 杭州朔溪生物医药有限公司 一种修饰的k562细胞、其制备方法及nk细胞培养组合物
AU2017279548A1 (en) 2016-06-08 2018-12-13 Precigen, Inc. Cd33 specific chimeric antigen receptors
CN105985931A (zh) 2016-06-21 2016-10-05 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种nk细胞体外扩增组合物及nk细胞扩增方法
EP3487991B1 (en) 2016-07-25 2022-09-07 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods of producing modified natural killer cells and methods of use
CA2937157A1 (en) 2016-07-25 2018-01-25 Ucl Business Plc Protein-based t-cell receptor knockdown
MX2019006438A (es) 2016-12-05 2019-11-28 Juno Therapeutics Inc Produccion de celulas modificadas para terapia de celulas adoptivas.
CN108148862B (zh) 2016-12-05 2019-03-08 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种封闭pdl1的用于抑制免疫逃脱的car-t转基因载体及其构建方法和应用
CA3061898A1 (en) 2016-12-28 2019-10-29 Green Cross Lab Cell Corporation Chimeric antigen receptor and natural killer cells expressing same
EP3600356A4 (en) 2017-03-27 2020-12-23 National University of Singapore ABBREVIATED NKG2D CHIMERIC RECEPTORS AND USES THEREOF IN IMMUNOTHERAPY WITH NATURAL KILLER CELLS
WO2018182511A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
EP3665270A4 (en) 2017-08-10 2021-04-21 National University of Singapore T-LYMPHOCYTES T-LYMPHOCYTE RECEPTOR-DEFICIENT CHEMERICAL ANTIGEN RECEPTOR AND METHODS OF USE
CN109554348A (zh) 2017-09-27 2019-04-02 亘喜生物科技（上海）有限公司 可诱导分泌抗cd47抗体的工程化免疫细胞
US20210128615A1 (en) 2017-10-18 2021-05-06 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Methods and compounds for improved immune cell therapy
CN107827990B (zh) 2017-10-30 2020-07-10 河北森朗生物科技有限公司 一种多肽、编码其的核酸、其修饰的t淋巴细胞及其应用
CN109971712B (zh) 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 特异性靶向cd19抗原且高水平稳定表达pd-1抗体的car-t细胞及用途
CA3089167A1 (en) 2018-02-09 2019-08-15 National University Of Singapore Adhesion receptor constructs and uses thereof in natural killer cell immunotherapy
US20210046115A1 (en) 2018-02-09 2021-02-18 National University Of Singapore Activating Chimeric Receptors and Uses Thereof In Natural Killer Cell Immunotherapy
CA3093518A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 National University Of Singapore Neutralization of human cytokines with membrane-bound anti-cytokine non-signaling binders expressed in immune cells
WO2020044239A1 (en) 2018-08-29 2020-03-05 National University Of Singapore A method to specifically stimulate survival and expansion of genetically-modified immune cells
CN111088231A (zh) 2018-10-24 2020-05-01 艾生命序公司 Pd-l1抗体分泌的抗间皮素car-t细胞肿瘤免疫治疗
CN114286683A (zh) 2019-07-17 2022-04-05 新加坡国立大学 由免疫细胞合成和分泌的功能性结合物

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