CN113347991A - 用于消除和增强受试者骨髓中造血干细胞植入的组合物的组合 - Google Patents
用于消除和增强受试者骨髓中造血干细胞植入的组合物的组合 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种组合物的组合,其包含i)组合物,其包含I)包含特异性针对干细胞抗原的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群,和/或II)α)包含特异性针对标记多肽的标签的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群,其中所述标记多肽特异性结合至干细胞抗原,和β)所述标记多肽,和ii)组合物,其包含a)CD34+造血干细胞群,和b)一种或多种选自以下的辅助或辅佐细胞群:表达CD14、CD11b、CD11c、CD123、CD33;CD36;CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326的髓系细胞谱系。还提供了一种向有需要的受试者应用这些组合物的方法。
Description
背景技术
造血干细胞(HSC)移植已用于治疗恶性血液病超过50年。同种异体造血干细胞移植的受体必须在移植前接受所谓的“调理”,以减弱其自身的造血功能,以便供体造血细胞能够植入,即迁移到受体的骨髓(BM)并增殖。用于同种异体移植的调理方案通常包括清髓和清淋巴方案,旨在通过根除恶性细胞来降低疾病负荷,同时免疫抑制受体的淋巴样细胞,以允许稳健和持续的供体造血干细胞植入。临床标准治疗是烷化剂和淋巴细胞清除剂,该过程通常包括高剂量化疗,联合全身照射,诱导非常高的干细胞和免疫细胞毒性。此类方案与患者的发病率和死亡率的显著风险以及对非造血组织的毒性增加有关。白消安(BU)是一种磺酸酯(烷化剂),用于治疗慢性粒细胞白血病并作为小儿骨髓移植的调理药物,其也会对骨髓基质细胞造成永久性损伤(Guest和Uetrecht:Drugs toxic to the bone marrowthat target the stromal cells,Immunopharmacology 46;2000103-112)。其他人也观察到了这种基质细胞功能的抑制(Anderson等,1982;Hays等,1982;Wathen等,1982),并且表现出小鼠基质支持造血以及产生CFU-F和CFU-GM的能力显著减弱。基质细胞的这种不完全恢复在BU诱导的骨髓发育不良中的作用和病变的性质仍是未知的,但很明显BU对基质层有深远的影响,导致基质细胞繁殖和支持正常造血的能力长期受损。在随后的实验中,向小鼠施用BU会导致白内障形成和毛发变灰白,这表明其他细胞更新系统也收到了影响(Down等,Late tissue-specific toxicity of total body irradiation and busulfan in amurine bone marrow transplant model,Int JRadiat Oncol Biol Phys.1989Jul;17(l):109-16)。随后的研究证实,BU还抑制SDF-1(基质衍生因子或CXCL12)和SCF(干细胞因子)。SDF-1和SCF由骨髓基质细胞产生,它们的功能是促进受体骨髓内HSC的归巢和植入(Xaymardan,Cimini,Weisel,Li:Bone Marrow Stem Cells:Propertiesand Pluripotency编著:Atala,Lanza,Thomson,Nerem,Principles of Regenerative Medicine,AcademicPress,2008,p268-283,ISBN 9780123694102和Choi等,murine male germ cellapoptosis induced by busulfan treatment correlates with loss of c-kit-expression in a Fas/FasL-and p53-independent manner.FEBS Lett.2004Sep 24;575(1-3):41-51)。
因此,白消安也会对非造血组织(即骨髓的基质细胞)产生毒性,因而其会显著损害异体或自体HSC移植后新的造血作用的建立。
随着基因治疗策略的出现,由于基因治疗主要针对患有单基因疾病而非恶性疾病的患者,因而必需采用降低毒性的调理方案。在这种情况下,当潜在疾病是恶性时施用化疗是可以接受的,但是在非恶性单基因疾病背景下,如再生障碍性贫血、原发性免疫缺陷和血红蛋白病,这是非常不可取的。此外,对于容易患造血系统恶性肿瘤(如共济失调性毛细血管扩张症、Bloom综合征和Fanconi贫血症)的DNA修复缺陷患者来说,这种调理是完全无法耐受的。因此,迫切需要开发新的方法来增加患者的存活并在调理过程中规避对其他细胞或组织的毒性。因此,目前正在评价最终将替代烷化剂并使非造血组织免于急性毒性的新型靶向空间制造剂(space-making agent)。为此,使用包括抗-c-kit(CD 117)的基于抗体的方法(Czechowicz等,2007Efficient transplantation via antibody-basedclearance of hematopoietic stem cell niches.Science 318:1296-1299和Xue等,2010.Antibody targeting KIT as pre transplantation conditioning inimmunocompetent mice.Blood 116:5419-5422)或直接靶向HSC的抗CD45抗体(Wulf等,2003,Anti-CD45-mediated cytoreduction to facilitate allogeneic stem celltransplantation.Blood101:2434-2439)在人体内观察到了有希望的结果。通过与抗CD47抗体联用增强了使用抗-c-kit抗体的结果(Chhabra等,2016,Hematopoietic stem celltransplantation in immunocompetent hosts without radiation orchemotherapy.Sci Transl Med 8:351ral05),通过缀合至皂草素极大地增强了使用抗CD45抗体的结果(Palchaudhuri等,Non-genotoxic conditioning for hematopoieticstem cell transplantation using a hematopoietic-cell-specific internalizingimmunotoxin.Nat Biotechnol.2016Jul;34:738-45)。
本领域存在对用于消除和增强受试者骨髓中的造血干细胞植入的改进或替代方法和/或组合物的需求。
发明内容
本发明公开了与受体的优良骨髓调理策略组合产生具有免疫能力和更高供体移植物存活率的方法,该策略保留受体骨髓基质细胞的功能并支持/增强供体造血细胞的附着和存活。
本发明提供了两种组分(组合物):第一种组分与受体的骨髓状态相关,第二种组分与由供体提供的移植物的状态相关。在基因疗法中(基因纠正细胞的自体移植),供体和受体是相同的。
·第一种组分是一种包括用于免疫疗法和/或造血干细胞移植的药剂的系统,其用于减少化疗的副作用并规避抗原识别受体对个体中表达抗原的非靶细胞和靶细胞的毒性。该系统包括特异性识别与多肽结合的部分(标签)的抗原识别受体;然后,所述多肽识别特定类型的靶细胞(在靶细胞上的抗原/标志物),如个体的造血细胞。抗原识别受体的实例是在免疫效应细胞的表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)。在本发明的一些实施方式中,为了介导CAR-T细胞与靶细胞之间的识别和结合,需要一个适体分子。通用CAR T细胞适体分子由例如特异性识别靶细胞上的抗原/标志物的抗体或其抗原结合片段(例如,Fab)加上仅被CAR-T细胞识别的第二个部分(标签)组成。这样,适体分子就充当了靶细胞与CAR-T细胞之间的识别桥梁。通过使用抗体和Fab,可以靶向不同的细胞群,并且CAR-T细胞仅在存在适体分子的情况下才起作用。该系统还包括骨髓的造血细胞和非造血基质细胞,其对抗原识别受体对相同抗原的识别具有抗性。在这里,我们探索了一种相关但独特的方法,使用嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞去除骨髓(BM)中的HSC,旨在提供当与选择的某些生物素化抗体结合时,携带识别例如生物素的嵌合受体的CAR-T细胞可靶向特定细胞群的概念验证。通过这种方式,可以在不影响基质细胞的情况下去除该细胞群并达到有效的BM调理。例如,人们可以利用一种嵌合抗原受体,其本质上例如具有生物素特异性抗体作为CAR的胞外组分,其与识别特定细胞群(即,表达c-Kit的细胞,和/或CD34+、和/或CD33+、和/或CD38+、和/或CD45RA+、和/或CD71+、和/或CD90+、和/或CD131+、和/或CD133+、和/或CD135+细胞)的生物素化的CDx(CDx可以是例如c-Kit、CD33、CD34、CD38、CD45RA、CD71、CD90、CD131、CD133或CD 135)抗体或其抗原结合片段组合。该策略还提供了瞬时CAR-T活性,因为CAR-T细胞仅在适体分子存在时才具有活性,从而有可能及时调控CAR-T的活性。在系统的这部分旨在专门消除骨髓中的造血干细胞,并使骨髓基质细胞不受影响。
·因此,第二种组分包括用于产生具有增强的归巢和与受试者的靶组织(如骨髓生态位)附着的有效细胞移植物的方法和组合物。在某些方面中,此类方法和组合物涉及或包括鉴定促进HSC和祖干细胞在受试者的一种或多种靶组织(例如,骨髓干细胞生态位)中保留的其他辅助细胞。本文公开的方法和组合物用于促进HSC在一种或多种靶组织中的保留,以及增强移植的干细胞(例如,HSC)在受试者靶组织中的植入效率。在一些实施方式中,如本文公开的移植的干细胞可以被基因修饰。在某些实施方式中,本文公开了在受试者的靶组织中增强干细胞的植入效率的方法,所述方法包括向受体骨髓施用细胞植入物,所述细胞植入物由以下组成:表达c-Kit的细胞,和/或CD34+、和/或CD33+、和/或CD38+、和/或CD45RA+、和/或CD71+、和/或CD90+、和/或CD131+、和/或CD133+和/或CD135+造血干细胞以及增强供体的造血干细胞附着的辅助或辅佐细胞群。此类辅佐细胞可以是以下髓系谱系中的任何一种:CD14、CD11b、CD11c、CD123、CD33、CD36、CD47、CD66b、CD235a、CD146和/或CD326;即,所述抗原或其任何组合的至少一种。在本发明的一个实施方式中,移植物不包含以下任何淋巴细胞群,即所谓的抑制细胞群,即表达CD3、CD19和CD56的细胞。在本发明的另一个实施方式中,移植物还包含所谓的抑制细胞群,即表达CD3、CD19和CD56的细胞。
将如本文所公开的造血干细胞与任何辅佐细胞组合的基本原理基于以下:
1.发现称为CD34dim细胞的某个细胞群在髓系来源的抑制性细胞,如单核细胞或其他髓系细胞(例如,CD11b和CD14)中富集,其在非人灵长类中抑制移植物抗宿主病(https://doi.org/10.1182/blood-2018-99-117370)。
2.MS-5共培养系统中的巨噬细胞分泌支持干细胞生态位的因子:特别是,收集含有巨噬细胞分泌物的培养基,然后与产生SDF-1的基质细胞一起培养,以观察培养基中的任何物质(如抑瘤素M)是否刺激了SDF-1的产生。抑瘤素M是IL-6细胞因子家族的28kDa的多功能成员,其由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和活化的T淋巴细胞分泌(Tanaka等,RevPhysiol Biochem Pharmacol 2003,149:39-533)(WO 2017/079744 Al)。
3.CD34和CD46阳性细胞组合。CD47,也称为整合素相关蛋白(IAP)是一种广泛表达的跨膜糖蛋白。其通过与免疫细胞上信号调控蛋白α(SIRPα)的N末端结合并抑制吞噬作用来提供“不进食”信号。造血干细胞在动员前和动员期间瞬时上调CD47表达以逃避巨噬细胞的吞噬作用(Yuting等,Targeting CD47:the achievements and concerns of currentstudies on cancer immunotherapy,J Thorac Dis.2017Feb;9(2):E168-E174.)。
该系统必需与这两个组分一起工作,即,维持骨髓基质细胞的活力以及增强供体细胞的植入潜力。BM基质细胞的活力是强制性的,否则,将不会从受损的基质细胞中产生诱导植入分子(如SDF-1)产生的分子。
本发明涉及诸如以下疾病的治疗:
癌症、再生障碍性贫血、Fanconi贫血、Diamond-blackfan综合征、镰状细胞病、地中海贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、Chediak-Higashi综合征、慢性肉芽肿病、血小板无力症、骨硬化症、溶酶体贮积症、戈谢氏病、尼曼-匹克病、粘多糖病、糖蛋白沉积症、免疫缺陷、共济失调毛细血管扩张症、迪乔治综合征、重度联合免疫缺陷(SCID)、Wiscott-Aldrich综合征、科斯特曼综合征和Shwachman-Diamond综合征。
附图说明
图1:在CD20+Jeko-1靶细胞上与CD20(Rtx Fab)缀合的生物素-交联剂Y的滴定。将不同浓度FAb(0,01-100μg/ml)添加至在50μl中的50.000个靶细胞中,并且使用抗生物素APC(Miltenyi Biotec)进行二次染色。在对照样品中,使用抗CD20-APC缀合物(MiltenyiBiotec)进行针对抗CD20的染色。
图2:概念验证显示了表达被X-Y-Z构建体识别的抗原的靶癌细胞(Jeko-1细胞)的特异性杀伤,所述X-Y-Z构建体由以下组成:抗-生物素CAR T细胞(X)、生物素-CD19Fab(Y-Z)。以增加的量(0-2,5μg)将Y-Z复合物加入10000个Jeko细胞和50000个CAR T细胞中(实心圆圈)。阳性对照(实心三角形)或阴性对照模拟(UTD)细胞(空心圆圈)。
图3:单生物素化Fab仅在存在靶细胞时诱导适体CAR T细胞激活,而基于全长抗体并具有多个亲和性单元的适体分子也可以在没有靶细胞的情况下诱导CAR T细胞激活。在效应细胞与靶细胞的比例为1时,将适体CAR T与Raji靶细胞共培养(24h)。以不同浓度(如所示的)添加抗体(利妥昔单抗)或Fab(RituxiFAb)。显示了活化细胞(由CD69+和CD25+的表达定义)的频率。
图4:使用单生物素化Fab可以增加适体CAR T细胞释放靶细胞特异性细胞因子。在效应细胞与靶细胞的比例为1:1时,将抗生物素CAR T细胞(25.000个细胞)与A)表达CD20的Mel526肿瘤细胞和B)Raji肿瘤细胞共培养18h后的细胞因子分泌。以20x10-11mol/l将未标记的利妥昔单抗(Rtx)、利妥昔单抗-生物素(RtxBio)和单生物素化Fab(FabBio)加入共培养物。在这两种肿瘤细胞系中,与生物素化抗体相比,使用单生物素化Fab显示出CAR T细胞增加的细胞因子分泌(检测限:100000pg/ml)。
图5:低程度标记改善了适体(Ab)功能。在具有不同程度标记(生物素/利妥昔单抗的数量的范围从0(Rtx-LLE-w/o)至高达20(Rtx-LLE20))的利妥昔单抗-生物素(抗CD20Ab)存在的条件下,将CAR T效应细胞(红色)或模拟(未转染的,蓝色)T细胞与Jeko-1套细胞淋巴瘤(E:T=5:1,18h)共培养。使用具有6个生物素/分子的抗CD19抗体作为对照。显示了不同浓度的mAb:1μg/ml和10ng/ml。使用具有低程度标记的抗体(平均2个生物素部分/利妥昔分子)观察到18h后最大的肿瘤细胞裂解。
图6:在体内在存在交联剂修饰的靶细胞结合结构域(CD20Fab-生物素)的条件下,抗亲和性单元CAR T细胞的功能。A)在第-5天将CD20+肿瘤细胞(Raji,表达萤火虫荧光素酶)植入NSG小鼠,在第0天输注CAR T细胞,每天通过i.p.注射施用适体分子(50μg/小鼠)。B)通过生物发光成像(IVIS)监测肿瘤进展(n=5只小鼠的组的中位数)。仅在接受CAR T细胞和适体分子以及针对CD20的CAR阳性对照的小鼠中观察到肿瘤生长的控制。
图7:通过注射Lin-细胞(A)或总BM(B),使用白消安处理的小鼠的植入。
具体实施方式
在一个方面中,本发明提供了一种组合物的组合,其包含
i)组合物,其包含
I)包含特异性针对干细胞抗原的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性效应细胞群,和/或
II)α)包含特异性针对标记多肽的标签的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群,其中所述标记多肽特异性结合至干细胞抗原,和
β)所述标记多肽,和
ii)组合物,其包含
a)CD34+造血干细胞群,和
b)一种或多种选自以下的辅助或辅佐细胞群:表达一种或多种(至少一种)标记物(抗原)CD14、CD11b、CD11c、CD123、CD33;CD36;CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326的髓系细胞谱系。
在本发明的一个实施方式中,所述干细胞抗原可以是造血干细胞抗原。
所述组合物的组合用于治疗受试者。所述受试者可以患有如本文所公开的疾病。所述治疗可以是消除和(随后)增强所述受试者的骨髓中的造血干细胞的植入。
所述组合物的组合用于消除和(随后)增强受试者的骨髓中的造血干细胞的植入。所述受试者可以患有如本文所公开的疾病。
所述受试者可以提供T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞,可以在体外对其进行基因修饰,以使得所述T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞包含组合物i)的嵌合抗原受体,和所述受试者可以提供组合物ii)a)部分的CD34+造血干细胞和可以提供所述一种或多种辅助或辅佐细胞群(b部分)。
在本发明的一个实施方式中,所述一种或多种辅助或辅佐细胞群可以包含T细胞和/或B细胞和/或NK细胞。
或者,所述一种或多种辅助或辅佐细胞群可以包含T细胞和/或B细胞和/或NK细胞,但是与由包含辅助和辅佐细胞群以及T细胞、B细胞和NK细胞的所述受试者提供的未耗竭样品相比,由于使用例如抗CD3、抗CD19和/或抗CD56抗体或其抗原片段在体外(至少部分)耗竭了由包含辅助和辅佐细胞群以及T细胞、B细胞和NK细胞的所述受试者提供的样品中的T细胞和/或B细胞和/或NK细胞使得其浓度更低。
或者,所述一种或多种辅助或辅佐细胞群不包含T细胞和/或B细胞和/或NK细胞。
所述组合物i)可以应用于有需要的受试者以消除受试者的造血干细胞。也可以将该程序称为清髓。
随后,可以将所述组合物ii)应用于所述受试者。该程序导致在所述受试者的骨髓中植入造血干细胞。
所述组合物ii)可以包含
a)CD34+造血干细胞群,
b)CD14+造血细胞群,和任选地
c)一种或多种选自以下的辅助或辅佐细胞群:表达一种或多种标志物CD11b、CD11c、CD123、CD33;CD36;CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326的髓系细胞谱系。
组合物i)还可以包含特异性针对干细胞抗原的两种或多种抗原或者特异性针对标记多肽的标签的两种或多种标签,所述标记多肽特异性针对干细胞抗原。
所述组合物的组合,其中所述干细胞抗原是c-Kit、和/或CD34、和/或CD33、和/或CD38、和/或CD45RA、和/或CD71、和/或CD90、和/或CD131、和/或CD133和/或CD 135。
所述组合物的组合,其中所述干细胞抗原优选地是c-Kit、CD33、CD34、CD133、CD90、CD71或其任何组合。
所述组合物的组合,其中所述CD34+造血干细胞是遗传工程化的。
所述组合物的组合,其中所述CD34+造血干细胞经遗传工程化以将待治疗受试者固有的缺陷单基因或癌基因纠正为所述单基因或癌基因的健康变体。例如,在地中海贫血和镰状细胞病的情况下,有缺陷的单基因是编码血红蛋白的β链的基因。
所述遗传工程化的CD34+造血干细胞可以是待治疗受试者的自体CD34+造血干细胞或同种异体CD34+造血干细胞。
所述组合物的组合,其中所述CD34+造血干细胞不是遗传工程化的(天然的CD34+造血干细胞)。所述天然的CD34+造血干细胞可以是待治疗受试者的自体CD34+造血干细胞或同种异体CD34+造血干细胞。
所述组合物的组合,其中所述一种或多种辅助或辅佐细胞群表达选自以下的一种或多种标志物:CD14、CD11b、CD11c、CD123、CD33;CD36;CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326。所述细胞群可以表达这些标志物中的一个或者以所述标志物的任何组合的这些标志物的若干个,如CD34+和CD90+细胞(作为干细胞)与主要是CD14,以及任何其他下述标志物的组合,即,CD11b、CD11c、CD123、CD33;CD36;CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326。
所述组合物的组合,其中所述遗传工程化的CD34+造血干细胞是已针对疾病进行纠正的细胞。
所述疾病可以是可以通过移植CD34+细胞治愈的疾病。
所述疾病可以是遗传病,优选单基因病或癌症。
所述组合物的组合,其中包含嵌合抗原受体的所述T细胞、NK细胞或细胞毒性效应细胞群和所述CD34+造血干细胞群和所述一种或多种辅助或辅佐细胞群针对在所述疾病的治疗中接受所述细胞的受试者是自体细胞。
所述组合物的组合用于在患有所述疾病的受试者中治疗疾病。
所述疾病可以选自以下:癌症、再生障碍性贫血、Fanconi贫血、Diamond-blackfan综合征、镰状细胞病、地中海贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、Chediak-Higashi综合征、慢性肉芽肿病、血小板无力症、骨硬化症、溶酶体贮积症、戈谢氏病、尼曼-匹克病、粘多糖病、糖蛋白沉积症、免疫缺陷、共济失调毛细血管扩张症、迪乔治综合征、重度联合免疫缺陷(SCID)、Wiscott-Aldrich综合征、科斯特曼综合征和Shwachman-Diamond综合征。
通常(并且正常地)待消除的造血干细胞不是患病细胞。但在一些情况下,造血干细胞本身是患病细胞,例如在Fanconi贫血、共济失调性毛细血管扩张症和Bloom综合征的背景下。
所述组合物的组合还可以包含AND NOT CAR方法,即,所述T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞可以包含第二CAR(除了上文所述的第一CAR以外),其是抑制性CAR(iCAR),并且其中所述抗原结合结构域对在第一CAR所针对的靶细胞上不表达的抗原具有特异性。
如例如在W02018061012A1中所公开的,与CAR的激活结构域(如FcRy或CD3-ζ)不同,iCAR可以具有来源于抑制性受体的信号转导结构域,所述抑制性受体能够拮抗T细胞激活,如CTLA-4、PD-1或NK抑制性受体。
因此,iCAR(与第二抗原结合的第二CAR)可以包含胞质信号转导结构域,其包含抑制性结构域,其中所述抑制性结构域可以是免疫检查点蛋白的信号转导元件。
在本发明的一个实施方式中,所述免疫细胞可以包含所述第一CAR和所述第二CAR,其中所述第一CAR可以包含在抗原结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区,并且其中所述第二CAR可以包含在抗原结合结构域和跨膜结构域之间的间隔区。
第一CAR的间隔区可以不同于第二CAR的间隔区。这可以阻止第一CAR和第二CAR形成异源二聚体。
第一CAR的间隔区可以与第二CAR的间隔区具有不同的长度和/或尺寸和/或构型。
但是,第一CAR的间隔区和第二CAR的间隔区可以足够相似,以导致在分别结合第一抗原和第二抗原后第一CAR和第二CAR的共定位。
在另一个方面中,本发明还提供了一种用于消除患有疾病的受试者骨髓中的造血干细胞并提高CD34+造血干细胞群的植入效率的方法,所述方法包括向所述受试者施用
i)组合物,其包含
I)包含特异性针对干细胞抗原的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群,或
II)α)包含特异性针对标记多肽的标签的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群,其中所述标记多肽特异性结合至干细胞抗原,和
β)所述标记多肽,
从而特异性消除所述受试者的所述骨髓中的所述造血干细胞并且不影响所述骨髓的基质细胞,
和
ii)组合物,其包含
a)CD34+造血干细胞群,
b)一种或多种选自以下的辅助或辅佐细胞群:表达一种或多种标志物CD14、CD11b、CD11c、CD123、CD33;CD36;CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326的髓系细胞谱系,从而提高所述干细胞向所述受试者的所述骨髓的植入效率。
包含特异性针对所述标记多肽的所述标签的嵌合抗原受体的所述T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群可以在将所述标记多肽应用于所述受试者的同时、之前或之后应用于所述受试者。
所述组合物i)可以在将组合物ii)应用于受试者之前应用。所述组合物i)和/或组合物ii)可以向受试者应用一次或一次以上。在如本文公开的方法中可以优选使用适体CAR系统。在这种情况下,仅在标记(例如,生物素化)抗CD34抗体存在期间,适体CAR免疫细胞(例如,适体CAR-T细胞)将攻击CD34细胞。一旦抗体从生物体中清除(通过肾),适体CAR-免疫细胞将仍在血流中循环,但不能攻击新的CD34+细胞。
所述方法,其中所述34+造血干细胞群是遗传工程化细胞或健康细胞。
所述方法,其中所述CD 34+造血干细胞群是受试者的自体细胞或同种异体细胞。
所述受试者可以是人。
本发明的另一个方面是可以独立地使用如本文所公开的组合物的组合的两种组合物。
然后,在一个优选的实施方式中,组合物包含
i)包含特异性针对标记多肽的标签的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群,其中所述标记多肽特异性结合至干细胞抗原,和
ii)所述标记多肽,
可以将其用于受试者的清髓。
在本发明的另一个实施方式中,组合物包含
a)CD34+造血干细胞群,和
b)一种或多种选自以下的辅助或辅佐细胞群:表达一种或多种标志物CD14、CD11b、CD11c、CD123、CD33;CD36;CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326的髓系细胞谱系,
可以将其用于提高在受试者骨髓中的植入。
在本发明的另一个实施方式中,组合物包含
a)CD34+造血干细胞群,
b)CD14+造血干细胞群,和任选地
c)一种或多种选自以下的辅助或辅佐细胞群:表达一种或多种标志物CD11b、CD11c、CD123、CD33;CD36;CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326的髓系细胞谱系
可以将其用于提高在受试者骨髓中的植入。
此处定义的关于本发明的一个方面(例如,本发明的第一方面)的所有定义、特征和实施方式也适用于如本文所公开的本发明的其他方面的上下文中。
定义
除非另有定义,否则本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
如本文所用,术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”用于指组合物、方法及其各自的组分,其对于所述方法或组合物是必不可少的,但对于包括未指定的要素是开放的,无论其是否是必不可少的。
在通常情况下,CAR可以包含胞外域(胞外部分),其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号转导结构域(胞内信号转导结构域)。胞外域可以通过接头或间隔区连接至跨膜结构域。胞外域还可以包含信号肽。在本发明的一些实施方式中,CAR的抗原结合结构域结合与多肽偶联的标签或半抗原(“半抗原化的”或“标记的”多肽),其中所述多肽可以结合至在靶细胞上表达的抗原,如如本文所公开的(造血)干细胞,或疾病相关抗原,如可以在靶细胞(如癌细胞)的表面上表达的肿瘤相关抗原(TAA)。
可以将此CAR称为“反标签”CAR或“适体CAR”或“通用CAR”,如例如在US9233125B2中所公开的。
半抗原或标签可以直接或间接偶联至多肽(标记多肽),其中所述多肽可以结合至所述靶细胞,如(造血)干细胞,或在靶点的(细胞)表面上表达的疾病相关抗原。标签可以是例如葡聚糖或半抗原,如生物素或荧光素异硫氰酸酯(FITC)或藻红蛋白(PE)或硫胺素,但标签也可以是肽序列,例如,化学或重组偶联至标记多肽的多肽部分。标签还可以是抗生物素蛋白链菌素。标记多肽的标签部分仅受限制于是可以被特异性针对CAR的标签的抗原结合结构域识别和特异性结合的分子。例如,当标签是FITC(荧光素异硫氰酸酯)时,标签结合结构域可以构成抗FITC scFv。或者,当标签是生物素或PE(藻红蛋白)时,标签结合结构域可以分别构成抗生物素scFv或抗PE scFv。
“信号肽”指引导蛋白在细胞内转运和定位的肽序列,例如,到某个细胞器(如内质网)和/或细胞表面。
通常,“抗原结合结构域”指与抗原特异性结合的CAR区域,例如,在(造血)干细胞上表达的抗原、肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。本发明的CAR可以包含一个或多个抗原结合结构域(例如,串联CAR)。通常,在CAR上的靶向区域是胞外的。抗原结合结构域可以包含抗体或其抗原结合片段。抗原结合结构域可以包含例如全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双体抗体。
可以将与给定抗原(如来自天然存在的受体的亲和体或配体结合结构域)特异性结合的任何分子用作抗原结合结构域。通常,抗原结合结构域是scFv。正常地,在scFv中,免疫球蛋白重链和轻链的可变区通过柔性接头融合在一起形成scFv。例如,此类接头可以是例如“(G4/S)3-接头”。
在某些情况下,抗原结合结构域来源于将使用CAR的同一物种是有益的。例如,当计划将其用于人类治疗时,CAR的抗原结合结构域包含人或人源化抗体或其抗原结合片段可能是有益的。人或人源化抗体或其抗原结合片段可通过本领域熟知的多种方法制备。
如本文所用,“间隔区”或“铰链”指位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区。本发明的CAR可以包含胞外间隔结构域,但也可以省去这样的间隔区。间隔区可以包含例如抗体或其片段的Fc片段、抗体或其片段的铰链区、抗体的CH2或CH3区、辅助蛋白、人工间隔区序列或其组合。间隔区的一个突出的实例是CD8α铰链。
CAR的跨膜结构域可以来源于此类结构域的任何所需的天然或合成来源。当来源是天然的时,结构域可以来源于任何膜结合或跨膜蛋白。例如,跨膜结构域可以来源于CD8α或CD28。当关键信号转导和抗原识别模块(结构域)位于两个(或甚至更多个)多肽上时,然后CAR可以具有两个(或更多个)跨膜结构域。由于CAR的每个多肽中的小分子依赖性异二聚化结构域,分裂关键信号转导和抗原识别模块能够对CAR细胞表达进行小分子依赖性、可滴定和可逆的控制(例如,WO2014127261A1)。
如果相应的CAR是激活性CAR,则CAR的胞质信号转导结构域(胞内信号转导结构域或激活内域)负责激活表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能(通常,如本文所述的CAR是指激活性CAR,除非明确表示为抑制性CAR(iCAR))。“效应功能”指细胞的特定功能,例如,在T细胞中,效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性,包括细胞因子的分泌。胞内信号转导结构域指转导效应功能信号并引导表达CAR的细胞执行特定功能的蛋白部分。胞内信号转导结构域可以包含给定蛋白的胞内信号转导结构域的任何完整的、突变的或截短的部分,其足以转导启动或阻断免疫细胞效应功能的信号。
在CAR中使用的胞内信号转导结构域的突出实例包括T细胞受体(TCR)的胞质信号转导序列和在抗原受体接合后启动信号转导的共受体。
通常,T细胞激活可以由两类不同胞质信号转导序列介导,首先是通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号转导序列,初级胞质信号转导结构域),其次是以抗原非依赖性方式作用的那些,以提供次级或共刺激信号(次级胞质信号转导序列,共次级信号转导结构域)。因此,CAR的胞内信号转导结构域可以包含一个或多个初级胞质信号转导结构域和/或一个或多个次级胞质信号转导结构域。
以刺激方式起作用的初级胞质信号转导结构域可以包含ITAM(免疫受体酪氨酸基激活基序)。
通常在CAR中使用的包含ITAM的初级胞质信号转导结构域的实例是来源于TCRζ(CD3ζ)、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。最突出的是来源于CD3ζ的序列。
可以将CAR的胞质结构域设计为单独包含CD3ζ信号转导结构域或与任何其他所需的胞质结构域组合。CAR的胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号转导区(结构域)。共刺激信号转导区指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子的实例是CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(FFA-1)、CD2、CD7、FIGHT、NKG2C、B7-H3。
CAR的胞质信号转导部分内的胞质信号转导序列可以以随机或特定顺序在有或没有接头的情况下彼此连接。长度优选在2至10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头可以形成连接。突出的接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。
例如,胞质结构域可以包含CD3ζ的信号转导结构域和CD28的信号转导结构域。在另一个实例中,胞质结构域可以包含CD3ζ的信号转导结构域和CD137的信号转导结构域。在又一个实例中,胞质结构域可以包含CD3ζ的信号转导结构域、CD28的信号转导结构域和CD137的信号转导结构域。
如上所述,CAR的胞外部分或跨膜结构域或胞质结构域还可以包含异源二聚化结构域,其目的是分裂CAR的关键信号转导和抗原识别模块。
可以进一步修饰CAR以在编码CAR的核酸水平上包含一种或多种可操作元件,以通过自杀开关消除表达CAR的免疫细胞。自杀开关可以包括例如诱导凋亡的信号转导级联或诱导细胞死亡的药物。在一个实施方式中,可以进一步修饰表达和编码CAR的核酸以表达诸如胸苷激酶(TK)或胞嘧啶脱氨酶(CD)的酶。CAR也可以是允许CAR在免疫细胞中受控表达的基因表达系统的一部分。此类基因表达系统可以是诱导型基因表达系统,并且其中当将诱导剂施用于用所述诱导型基因表达系统转导的细胞时,基因表达系统被诱导并且所述CAR在所述转导细胞的表面上表达。
在一些实施方式中,内结构域可以包含主要胞质信号转导结构域或共刺激区域,但不能同时包含这两者。
在本发明的一些实施方式中,CAR可以是“SUPRA”(分裂、通用和可编程)CAR,其中“zipCAR”结构域可以连接胞内共刺激结构域和胞外亮氨酸拉链(WO2017/091546)。该拉链可以被融合至例如scFv区域的互补拉链靶向,以赋予SUPRA CAR T细胞肿瘤特异性。这种方法对于针对各种肿瘤产生通用型CAR T细胞是特别有用的;可以针对肿瘤特异性对适体分子进行设计,并且将针对改变特异性后的过继转移提供选项,这是选择压力和抗原逃逸情况的关键。
如果CAR是抑制性CAR(在本文中通常称为“iCAR”),则所述CAR可以具有与活化CAR相同的胞外和/或跨膜结构域,但在内域方面与活化CAR不同。
抑制性CAR的至少一个内域可以是胞质信号转导结构域,其包含抑制免疫细胞的至少一个信号转导元件或包含诱导凋亡的至少一个元件。
iCAR的抑制性内域是本领域众所周知的并且已在例如WO2015075469A1、W02015075470A1、WO2015142314A1、WO2016055551A1、WO2016097231A1、WO2016193696A1、WO2017058753A1、WO2017068361A1、W02018061012A1和WO2019162695A1中进行了描述。
抑制或可能能够抑制所述iCAR的(效应)免疫细胞的所述至少一个信号转导元件可以是免疫检查点蛋白的信号转导元件。
所述抑制性信号转导元件可以选自以下:
-免疫球蛋白超家族(IgSF)和肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF),包括免疫检查点蛋白CD22、CD31、CD33、CD47、CD85A(LIR3)、CD85C(LIR8)、CD85D(LIR2)、CD87J(LIR1)、CD85K(LIR5)、CD89(B71)、CD94(KLRD1)、CD152(CTLA4)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158D(KIR2DL4)、CD158E1(KIR3DL1)、CD158F(KIR2DL5A)、CD158K(KIR3DL2)、CD158Z(KIR3DL3)、CD159a、CD159c、CD160、CD223(LAG3)、CD244(SLAMF4)、CD272(BTLA)、CD274(PDL1)、CD279(PD1)、CD328(Siglec7)、CD329(Siglec9)、CD352(SLAMF6)、CEACAM1、CEACAM2、FcγR、G6b-B、KIR2DL5B、KLRG1、LAIR1、PD1H(Vista)、PIR-B、Siglec2、Siglec3、Siglec5、Siglec6、Siglec8、Siglec10、Siglec11、Siglec12、TIGIT、TIM2、TIM3和TLT-1
-蛋白酪氨酸磷酸酶ACP1、CDC14A、CDC14B、CDC14C、CDC25A、CDC25B、CDC25C、CDKN3、DNAJC6、DUPD1、DUSP1、DUSP10、DUSP11、DUSP12、DUSP13、DUSP14、DUSP15、DUSP16、DUSP18、DUSP19、DUSP2、DUSP21、DUSP22、DUSP23、DUSP26、DUSP27、DUSP28、DUSP3、DUSP4、DUSP5、DUSP6、DUSP7、DUSP8、DUSP9、EPM2A、FIG4、GAK、INPP5A、INPP5B、INPP5D、INPP5E、INPP5F、INPP5J、INPP5K、INPPL1、MTM1、MTMR1、MTMR10、MTMR11、MTMR12、MTMR14、MTMR2、MTMR3、MTMR4、MTMR6、MTMR7、MTMR8、MTMR9、OCRL、PALD1、PIP4P1、PIP4P2、PTEN、PTP4A1、PTP4A2、PTP4A3、PTPDC1、PTPMT1、PTPN1、PTPN11、PTPN12、PTPN13、PTPN14、PTPN18、PTPN2、PTPN20、PTPN21、PTPN22、PTPN23、PTPN3、PTPN4、PTPN5、PTPN6、PTPN7、PTPN9、PTPRA、PTPRB、PTPRC、PTPRD、PTPRE、PTPRF、PTPRG、PTPRH、PTPRJ、PTPRK、PTPRM、PTPRN、PTPRN2、PTPRO、PTPRQ、PTPRR、PTPRS、PTPRT、PTPRU、PTPRZ1、RNGTT、SACM1L、SBF1、SBF2、SSH1、SSH2、SSH3、STYX、STYXL1、SYNJ1、SYNJ2、TNS1、TNS2、TNS3、TNS4、TPTE和TPTE2。
抑制所述iCAR的免疫细胞的所述至少一个信号传导元件还可以选自干扰素基因刺激剂(STING);含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)的蛋白、含有免疫受体酪氨酸基开关基序(ITSM)的蛋白、T细胞免疫球蛋白和I’ITM结构域(TIGIT)和腺苷受体(例如,A2aR)。
抑制所述iCAR的免疫细胞的所述至少一个信号传导元件还可以是来自含有Src同源物(SH2)结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶的酪氨酸磷酸酶结构域,其被磷酸化的免疫受体酪氨酸基激活基序(ITIM)募集。
抑制所述iCAR的免疫细胞的所述至少一个信号传导元件还可以是来自含有Src同源物(SH2)结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶的酪氨酸磷酸酶结构域,其被磷酸化的免疫受体酪氨酸基激活基序(ITIM)募集。
抑制所述iCAR的免疫细胞的所述至少一个信号传导元件还可以是
(i)截短的蛋白,其包含来自结合磷酸化的免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)的蛋白的SH2结构域,但缺乏激酶结构域;或者
(ii)截短的蛋白,其包含来自结合磷酸化的免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)的蛋白的SH2结构域,但缺乏磷酸酶结构域;或者
(iii)融合蛋白,其包含(a)来自结合磷酸化的免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)的蛋白或来自结合磷酸化的免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)的蛋白的SH2结构域;和(ii)异源结构域。所述异源结构域可以是磷酸酶结构域或激酶结构域。所述诱导凋亡的至少一种元件可以是例如肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)受体或CD200受体,如例如在WO20160972331A1中详细描述的。
可以将本发明的CAR设计成以任何顺序和/或组合包含如本文所述的上述结构域的任何一部分或部分,从而产生功能性CAR,即介导免疫效应细胞的免疫效应应答的CAR,所述免疫效应细胞表达如本文所公开的CAR或具有如本文所公开的抑制性功能(iCAR)。
如本文所用,术语“标记多肽”指具有与其直接或间接结合的至少一种附加组分(即,标签)的多肽。如本文所用,标记多肽能够结合靶细胞上表达的抗原。多肽可以是抗体或其抗原结合片段,其结合至靶细胞(如(造血)干细胞)表面上表达的抗原,或癌细胞上的肿瘤相关抗原。或者,标记多肽的多肽可以是细胞因子或生长因子,或者能够结合至靶细胞的抗原的另一种可溶性多肽。
如本文所用,术语“适体”或“适体分子”或“标记多肽”可以互换使用。
标签可以是例如半抗原或葡聚糖,以及半抗原或葡聚糖可以与多肽的抗原结合结构域(例如,CAR)结合,所述多肽的抗原结合结构域包含特异性针对标签的抗原结合结构域。
半抗原(例如,FITC、生物素、PE、抗生物素蛋白链菌素或葡聚糖)是小分子,仅当与大载体(如蛋白)结合时才会激发免疫应答;载体可以是本身也不激发免疫应答的载体。一旦机体产生了针对半抗原载体加合物的抗体,小分子半抗原也可能与抗体结合,但其将通常不会引发免疫应答;通常只有半抗原-载体加合物能够做到这一点。
但是标签也可以是肽序列,例如,化学或重组偶联到标记多肽的多肽部分。肽可以选自以下:c-Myc-标签、Strep-标签、Flag-标签和多聚组氨酸-标签。标签还可以是抗生物素蛋白链菌素。标记多肽的标签部分仅受限制于是可以被CAR的标签特异性的抗原结合结构域识别和特异性结合的分子。例如,当标签是FITC(荧光素异硫氰酸酯)时,标签结合结构域可以构成抗FITC scFv。或者,当标签是生物素或PE(藻红蛋白)时,标签结合结构域可以构成抗生物素scFv或抗PE scFv。
如本文所用,术语“抗体”以最广泛的意义使用以涵盖各种形式的抗体结构,包括但不限于单克隆和多克隆抗体(包括全长抗体)、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)、抗体片段,即,抗体的抗原结合片段、免疫粘附素和抗体-免疫粘附素嵌合体,其特异性识别(即,结合)抗原。“抗原结合片段”包含全长抗体(优选其可变结构域)的一部分,或者至少是其抗原结合位点(“抗体的抗原结合片段”)。抗原结合片段的实例包括Fab(抗原结合片段)、scFv(单链可变片段)、单域抗体、双抗体、dsFv、Fab’、双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的抗原结合结构域、其片段或CAR的术语“对......具有特异性”、“特异性结合”或“对......是特异性的”指识别并结合特异性抗原的抗原结合结构域,但其基本上不识别和结合样品中的其他分子。与来自一个物种的抗原特异性结合的抗原结合结构域也可以与来自另一物种的抗原结合。这种跨物种反应性与该抗原结合结构域的特异性定义并不矛盾。与抗原特异性结合的抗原结合结构域也可以与抗原的不同等位基因形式(等位基因变体、剪接变体、亚型等)结合。这种交叉反应性与该抗原结合结构域的特异性定义并不矛盾。
T细胞或T淋巴细胞是一种淋巴细胞,其在细胞介导的免疫中起核心作用。通过在细胞表面上存在T细胞受体(TCR),可以将其与其他淋巴细胞,如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分开来。有几个T细胞子集,每个子集具有不同功能。
T辅助细胞(TH细胞)在免疫过程中协助其他白细胞,包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞,以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。这些细胞也称为CD4+T细胞,因为其在其表面上表达CD4糖蛋白。辅助T细胞在被MHC II类分子呈递肽抗原时被激活,MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)表面表达。一旦被激活,其就会迅速分裂并分泌称为细胞因子的小蛋白,其调控或协助主动免疫应答。这些细胞可以分化成几种亚型之一,包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH,其分泌不同细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号转导引导T细胞成为特定亚型。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞,并且还与移植排斥有关。这些细胞也称为CD8+T细胞,因为其在其表面表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与MHC I类分子相关的抗原来识别其靶点,MHC I类分子存在在所有有核细胞的表面上。
如本文所用,术语“细胞毒性免疫效应细胞”指在免疫应答中保护机体的寿命相对较短的活化细胞。效应B细胞称为浆细胞并分泌抗体,并且活化的T细胞包括细胞毒性T细胞和辅助T细胞,其进行细胞介导的应答。效应T细胞描述了一组细胞,其包括多种T细胞类型,这些T细胞类型对刺激(如共刺激)做出积极应答。其包括CD4+、CD8+、Treg细胞。
记忆T细胞是抗原特异性T细胞的一个子集,其在感染恢复后会长期存在。在重新接触其同源抗原后,其迅速扩增至大量效应T细胞,从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型:中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
调节性T细胞(Treg细胞),此前称为抑制性T细胞,对于维持免疫耐受性至关重要。其主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫,并且抑制逃避胸腺负选择过程的自身反应性T细胞。
已描述了两个主要的CD4+Treg细胞类别——Foxp3+Treg细胞和Foxp3-Treg细胞。
自然杀伤T细胞(NKT细胞——不要与先天免疫系统的自然杀伤细胞混淆)将适应性免疫系统与先天免疫系统联系起来。与识别主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞不同,NKT细胞识别由称为CD Id的分子呈递的糖脂抗原。一旦被激活,这些细胞可以执行归因于Th和Tc细胞的功能(即,细胞因子产生和细胞溶解/细胞杀伤分子的释放)。
将术语“自然杀伤细胞(NK细胞)”定义为大颗粒淋巴细胞(LGL),并且构成从产生共同淋巴祖细胞的B和T淋巴细胞分化而来的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟,然后进入循环系统。NK细胞根据来源和各自的效应功能在表型上与自然杀伤T细胞(NKT)不同;通常,NKT细胞活性通过分泌IFNγ促进NK细胞活性。与NKT细胞不同的是,NK细胞不表达T细胞抗原受体(TCR)或泛T标志物CD3或表面免疫球蛋白(Ig)B细胞受体,但其在人类中通常表达表面标志物CD16(FcγRIII)和CD56,在C57BL/6小鼠中表达NK1.1或NK1.2。高达80%的人NK细胞还表达CD8。可以从癌症患者建立持续生长的NK细胞系,例如,常见的NK细胞系是NK-92、NKL和YTS。
术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”可以互换使用,并且指可以是免疫系统的一部分并执行特定效应功能的细胞,如α-βT细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、先天淋巴细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、γ-δT细胞、单核细胞或巨噬细胞。优选地,这些免疫细胞是人免疫细胞。优选的免疫细胞是具有细胞毒效应功能的细胞,如α-βT细胞、NK细胞、NKT细胞、ILC、CIK细胞、LAK细胞或γ-δT细胞。最优选的免疫效应细胞是T细胞和NK细胞。“效应功能”指细胞的特定功能,例如,在T细胞中,效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性,包括细胞因子的分泌。
如本文所用,“辅助细胞”指表达CD14、CD11b、CD11c、CD123、CD33、CD36、CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326的细胞或其组合的血细胞。
如本文所用,术语“辅佐细胞”指表达CD14、CD11b、CD11c、CD123、CD33、CD36、CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326的细胞或其组合的血细胞。
术语“辅助细胞”和“辅佐细胞”可以互换使用。
CD34+造血干细胞是具有自我更新能力并同时产生所有谱系的造血细胞的细胞,如红细胞、T和B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、粒细胞、单核细胞、血小板、树突状细胞和血液中的其他细胞,并且用于在个体的一生中补充血细胞。CD34+造血干细胞还可以包含一种或多种下述抗原:CD33+、和/或CD38+、和/或CD45RA+、和/或CD71+、和/或CD90+、和/或CD131+、和/或CD133+、和/或CD135+。
在本发明的一些实施方式中,造血干细胞可以是CD34+、CD45RA-、CD38-和CD90+。
“骨髓”是由造血细胞、骨髓脂肪组织和支持性基质细胞组成的器官。在成人中,骨髓主要位于肋骨、脊椎、胸骨和骨盆的骨骼中,并且是产生所有血液细胞的主要器官。
术语“骨髓基质细胞”指位于骨髓生态位中的所有支持细胞,其用于支持(即维持)所有血细胞的内稳态。这些通常是(但不限于)贴壁细胞,并且与血液的其他细胞(包括造血干细胞)非常接近。
如本文所用,术语“遗传工程化的CD34+造血干细胞是已针对疾病进行纠正的细胞”指其已被处理以获取此前缺失或突变的基因(基因添加)或表达另一种被认为具有治疗作用的基因。在地中海贫血和镰状细胞病的情况下,这可能意味着CD34+造血干细胞以这种方式进行处理,即,通过电穿孔,以表达已知的胎儿血红蛋白抑制因子的下调因子,以防止胎儿血红蛋白的沉默。
单一基因(或单基因)病症/疾病是单一基因突变的结果。超过6000种人类疾病是由单基因缺陷引起的。单基因疾病可以通过多种方式传递给后代。
如本文所用,术语“抗原”旨在包括与一种或多种抗体结合或引起产生一种或多种抗体的物质,并且可以包括但不限于蛋白、肽、多肽、寡肽、脂质、碳水化合物(如葡聚糖)、半抗原及其组合,例如,糖基化蛋白或糖脂。如本文所用,术语“抗原”指可以在靶细胞表面表达并可以通过适应性免疫系统识别的分子实体,包括但不限于抗体或TCR,或工程化分子,包括但不限于内源性或转基因TCR、CAR、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、单链抗体或其多聚体或者能够以高亲和性执行与结构的结合的任何其他分子。
如本文所用,术语“标志物”指由某种细胞类型特异性表达的抗原。优选地,标志物是细胞表面标志物。
如本文所用,术语“标志物”和“抗原”可以互换使用。
如本文所用,术语“靶细胞”指在其细胞表面上表达抗原的细胞,所述抗原应被如本文所公开的CAR的抗原结合结构域或被如本文所公开的标记多肽的标签的抗原结合结构域识别(结合)。
免疫疗法是一个医学术语,其定义为“通过诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病”。设计为引发或放大免疫应答的免疫疗法被归类为激活免疫疗法,而减少或抑制的免疫疗法被归类为抑制免疫疗法。癌症免疫疗法作为一种激活免疫疗法,试图刺激免疫系统排斥和摧毁肿瘤。过继细胞转移使用基于细胞,优选基于T细胞或基于NK细胞的细胞毒性应答来攻击癌细胞。对患者的癌症具有天然或遗传工程反应性的T细胞在体外产生,然后转移回癌症患者体内。然后,将免疫疗法称为“CAR免疫疗法”或在仅使用T细胞的情况下将其称为“CAR T细胞疗法”或“CAR T细胞免疫疗法”。
如本文所用,术语“治疗”指降低疾病的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
术语“治疗有效量”或“治疗有效群”指在受试者中提供治疗益处的细胞群的量。
如本文所用,术语“受试者”指动物。优选地,受试者是哺乳动物,如小鼠、大鼠、奶牛、猪、山羊、鸡、犬、猴或人。更优选地,受试者是人。受试者可以是患有如本文所公开的疾病的受试者。
如本文所用,术语“自体的”指来源于其后来重新引入的同一受试者的任何物质。
如本文所用,术语“同种异体的”指来源于与物质被重新引入的受试者相同物种的不同受试者的任何物质。
如本文所用,术语“表达”定义为特定核苷酸序列在细胞中由其启动子驱动的转录和/或翻译。
如本文所用,术语“工程化的细胞”和“基因修饰的细胞”可以互换使用。该术语指包含和/或表达外来基因或核酸序列,其进而修饰细胞或其后代的基因型或表型。特别地,该术语指的是细胞(优选T细胞)可以通过本领域众所周知的重组方法操作以稳定或瞬时表达在这些细胞中以天然状态不表达的肽或蛋白的事实。例如,将T细胞(优选人T细胞)工程化以在其细胞表面上表达人工构建体(如嵌合抗原受体)。
分化簇(缩写为CD)是一种用于鉴定和研究细胞表面分子(通常是多肽)的方案,为细胞的免疫表型分析提供靶点。
如本文所用,术语“组合物的组合”指两种或更多种组合物,其可以直接或一个接一个地一起使用(组合)以发挥本文所公开的所需作用。或者,可以使用术语“系统”或“试剂盒”代替“组合物的组合”。
术语植入指来自自体或同种异体供体的造血干细胞在输注到受体体内后,可以到达受体的骨髓,可以成功植入受体的骨髓并随后产生血细胞的所有细胞谱系,如红细胞、T和B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、粒细胞、单核细胞、血小板、树突状细胞和血液中的所有其他细胞,并且可以在受体的余生中补充血细胞。
实施例
实施例#1:与结合至CD20阳性Jeko 1细胞上的CD20抗原的抗原识别部分Z(CD20 Fab)缀合的并使用荧光抗-生物素APC染色的生物素-交联剂Y的功能将CD20阳性Jeko-1细胞接种在96孔板中(50.000个细胞/孔),并使用不同浓度(0,01-100μg/ml和0μg/ml作为阴性对照)的生物素-交联剂缀合的抗CD20 Fab(Rtx Fab MS2)在4℃下在总体积50μl缓冲液A(CliniMACS PBS/EDTA缓冲液+0.5%BSA)中孵育10min。在加入50μl抗生物素APC(在缓冲液A中1:50,Miltenyi Biotec,Art.No.130-110-952)后,将样品在4℃下再孵育10min。将作为阳性对照的抗人CD20 APC缀合物用于根据生产厂商的方案(Miltenyi Biotec,Art.No.130-111-525)染色对照样品。最后,将100μl缓冲液A加入每个样品中,并在MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotec130-096-343)上采集数据。分析CD20+细胞的频率(仅在作为阴性对照的aBio APC上门控)和阳性细胞的中位荧光强度(下图1)。在低至0,1μg/ml的浓度下检测到荧光并因此与靶细胞结合的生物素化FAb,并且中位荧光强度增加到100μg/ml的浓度,表明在所使用的条件下,在10μg/ml的浓度下游离CD20结合位点仍是可用的。
实施例#2:X-Y-Z单元组合杀伤靶癌细胞的功能
通过在Ficoll上分离,从健康供体的血沉棕黄层中分离出PBMC。使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,130-096-535),通过MACS技术从PBMC选择T细胞。对于T细胞激活和扩增,以1x106个细胞/mL将T细胞接种在含有IL-7(10ng/mL)和IL-15(10ng/mL)以及1%(v/v)T细胞TransAct,人(Miltenyi Biotec,Art No:130-111-160)的TexMACS培养基中,并在37℃、5%CO2下孵育。激活后,在第1天进行转导。为此,将以为5的MOI将编码适体CAR的LV上清液加入T细胞,并通过上下吸量将细胞小心重悬。在第3天除去TransAct,并进一步扩增T细胞,保持细胞密度为2xl06个细胞/mL。在第6天,根据生产厂商的说明书,在LS柱(Miltenyi Biotec)上,使用抗LNGFR微珠通过MACS分离表达LNGFR的细胞。将选择的LNGFR+细胞进一步扩增达第12天,然后在TexMACS+20%(v/v)FCS+10%(v/v)DMSO中以1x107个细胞/ml等份冷冻并储存在液氮中。将细胞的等分试样解冻,并在实验前48h在含有IL-7(10ng/mL)和IL-15(10ng/mL)的TexMACS中洗涤和回收细胞。
在即将实验之前,将GFP转导的Jeko-1靶细胞重悬在无细胞因子的TexMACS中,并将10.000个细胞加入96孔板的每个孔中。然后,将CAR转导的和未转导的(模拟)T细胞重悬在无细胞因子的TexMACS中,并将50.000个细胞加入96孔板的各个孔中。随后,将交联的和生物素化的CD19 Fab以指定浓度添加到每个孔中,并将含有Jeko-1靶细胞、T细胞和Fab的样品(V=200μl)通过上下吸量仔细混合。作为阳性对照,将针对抗CD 19的CAR T细胞(50.000)与10.000个靶细胞在未添加Fab的情况下共同孵育。将所有样品在37℃、5%CO2下孵育16h。在MACSQuant流式细胞仪上对杀伤进行定量。在即将测定前,将碘化丙啶添加到细胞中。通过计数GFP阳性和存活(碘化丙啶阴性)靶细胞来评价杀伤,并表示为[杀伤,%]=[在未处理样品中的存活GFP+靶细胞]/[在处理样品中的存活GFP+靶细胞]x100%(图2)。在Fab分子滴定后,16h后针对CD19的CAR的杀伤率在80%范围内。在适体CAR的情况下,在200μl样品中(0,0125ng/ml),在适体剂量低至0,0025ng时已观察到最大杀伤率(75%),增加不同适体浓度超过6个数量级仅降低约5%。此外,在200μl样品中(12.5ng/ml)添加多达2,5ng适体时,未检测到与模拟T细胞相关的适体背景杀伤活性。总体而言,这表明基于Fab的适体与适体CAR T细胞组合可在涵盖超过4个数量级的适体浓度范围内实现高度特异性裂解(65%)。
实施例#3:使用生物素化Ab对比单生物素化Fab的CAR
T细胞的非特异性激活
标志物CD25和CD69的表达与T细胞的激活相关,而T细胞的激活又与其的细胞毒性效应功能相关。为了监测T细胞激活,在存在(实心符号,E:T=1:1)或不存在(空心符号)靶细胞的情况下,以增加的适体分子浓度,在37℃和5%CO2下将适体CAR T细胞孵育24h。评价了两种不同类型的适体分子:i)利妥昔单抗(抗CD20抗体),其通过NHS酯缀合并且平均具有2-3个生物素亲和性单元和ii)Fab片段,其具有1个生物素亲和性单元/分子。在MACSQuant流式细胞仪上分析T细胞的激活,并且以CD69+和CD25+细胞的分数定义激活细胞的分数。重要的是,在适体浓度范围为1x10-10-1x10-8mol/l时,在存在靶细胞的情况下,这两种适体均有效触发适体CAR T细胞的激活(50%激活,取决于E:T比例)。然而,在不存在靶细胞的情况下,仅抗体能够诱导T细胞激活(在浓度1x10-10mol/l下观察到最大激活),而在不存在靶细胞的情况下,浓度达到1x10-9mol/l时,生物素化Fab不能诱导T细胞激活(图3)。
CAR T细胞的激活通常应严格依赖于靶细胞和同源适体分子的存在,从而提高方法的安全性,因此,在不存在适体分子的情况下T细胞的激活是不希望的适体性质,使用整个抗体分子观察到这种现象,而使用单生物素化Fab观察不到这种现象。因此,使用单生物素化Fab作为适体分子可能改善适体CAR技术的总体安全性。
实施例#4:与生物素化抗体相比单生物素化Fab显示来自CAR T细胞的细胞因子分
泌增加
使用单生物化Fab分子可以诱导促炎性细胞因子(IL-2)从T细胞的有效释放。将不同靶细胞Mel526(CD20+)和Raji(CD20+)在96孔板中在200μl中与适体CAR T细胞以E:T的比例1:1共培养。以2xl0-11mol/1添加适体分子利妥昔单抗-生物素(n=2-3个生物素/分子)和单生物素化利妥昔单抗Fab,使用非生物素化利妥昔单抗作为阴性对照。在37℃和5%CO2下孵育18h后,从培养物中仔细移出100μl上清液,并根据生产厂商的方案,使用MACSPlex细胞因子12试剂盒,人(Miltenyi Biotec Art.No.130-099-169)分析。尽管在仅含抗体的样品中未观察到显著的IL-2释放,但是在Mel526和Raji细胞上存在生物素化抗体触发的特异性细胞因子分泌(图4)。
值得注意的是,在相同浓度的生物素化Fab存在的情况下,与生物素化的抗体相比,Mel526细胞上的细胞因子释放增加3.2-7.4倍和Raji细胞上的细胞因子释放增加可达2倍。总体而言,这可能归因于受体上的次优取向(多个非生产性构象),这仅适用于具有多个亲和性单元的整个抗体分子。因此,在存在靶细胞的情况下,使用单生物素化的Fab可以改善适体CAR T细胞上生产性构象的形成,从而允许改善免疫突触的形成和细胞因子的释放。
实施例#5:使用具有不同DOL的生物素化的Ab的杀伤测定
在使用不同量的生物素缀合利妥昔单抗的测定中进一步考察了具有可变数量的亲和性单元的适体分子的功能。根据本领域众所周知的方案,通过在氨基处用琥珀酰亚胺酯随机标记进行抗体修饰。对于修饰,抗体通过在PEB缓冲液中平衡的Sephadex G25柱进行再缓冲。使用Bradford测定对收集的级分进行蛋白含量测定。将含有蛋白的级分混合,并测定总体积。通过在280nm处的吸光度测量最终蛋白浓度。随后,将相应量的生物素-LC-LC-NHS(ThermoFisher Scientific,Mw 567,70g/mol,目录号21343,CAS-No.89889-52-1)溶解在DMSO中。为了获得不同程度的标记,将不同量的生物素-LC-LC-NHS添加到反应混合物中(3、6、12和25倍摩尔过量)。将抗体和DMSO/标记混合物在30℃下孵育1h,然后通过SephadexG25柱。再次收集级分,测定蛋白浓度并合并含有蛋白的级分。通过在280nm处的吸光度测量最终蛋白浓度。通过LC-MS和通过在表达CD20抗体靶点的Jeko-1细胞系上孵育抗体并用荧光染料缀合的抗生物素抗体进行二次染色,然后进行LACS分析,确认成功的生物素化。获得具有从2-3个至高达20个生物素/抗体的标记程度的利妥昔单抗缀合物,并且随后将其用作杀伤测定中使用的适体(图5)。
尽管所有的生物素化的抗体都能够介导靶细胞的杀伤,但使用具有低标记度的(每个抗体具有2-3个生物素)利妥昔单抗观察到最大的特异性靶细胞裂解。值得注意的是,在利妥昔单抗的CDR中没有发现代表NHS酯修饰的主要位点的赖氨酸。总体而言,这可能突出了在适体分子上使用较低程度标记的重要性,并突出了单官能化适体的重要性。
实施例#6:具有CD20Fab-生物素的适体CAR到达NSG小鼠的骨髓
为了进行体内实验,使用7-10周龄的雌性NOD-SCID通用γ链-/-(NSG)小鼠。这些是源自非肥胖糖尿病(NOD)背景的重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠,其另外敲除了通用γ链(γc-/-)。小鼠获自外部供应商(Jackson labs),并且每笼和组5只动物,将其置于单独通风的笼子(IVC)中,给予标准啮齿动物饮食(ssniff,Soest,Germany)。室温始终保持在22℃,空气湿度在50-60%之间。明暗节律间隔为12小时。每天监测所有动物的一般健康状况。通过i.v.注射(在100μl中3x105个细胞)转移Raji肿瘤细胞(经基因修饰以表达萤火虫荧光素酶(ffLuc)),并且其在植入小鼠中发展成全身性白血病。在IVIS(体内成像系统)中,通过生物发光成像(BLI)定期监测(总生物负荷/分布)肿瘤进展。在肿瘤植入5天后,在第0天通过i.v.注射(1x107个细胞/小鼠,体积100μl)给予适体CAR T细胞和CD20 CAR T细胞。在肿瘤注射当天开始,通过i.p.注射每日施用适体分子。适体分子的施用持续10天,并且持续监测肿瘤进展(图6)。
尽管在仅接受肿瘤细胞的未治疗组,BLI从第0天的1x106进展到第10天的高达2x109,CD20 CAR T细胞能够有效控制肿瘤生长,在第10天时BLI信号为7xl05。这些结果表明,适体CAR T细胞能够到达受累动物的骨髓和所有其他器官。在存在适体的情况下,适体CAR T细胞显示出非常相似的肿瘤控制,在第10天时中位数为8xl05。而相比之下,在不存在或存在适体情况下的模拟T细胞和在不存在适体情况下的适体CAR T细胞均不能控制肿瘤生长,表明适体和适体CAR T细胞两者都需要存在才能在体内进行有效的肿瘤控制。此外,该实验突出了在临床前背景下单生物素化的CD20 Fab缀合物的功能。
实施例#7:在相同条件下,与施用Lin-细胞相比,在使用白消安处理的C57/BL6地
中海贫血小鼠中施用总骨髓细胞促进更长的植入
我们使用了如此前所述的(Ronen等,2011)使用白消安的已建立的方案。从3-5月龄雄性或雌性供体β-地中海贫血小鼠的股骨和胫骨冲洗总骨髓(BM),所述小鼠在BMR前4天腹腔注射了150mg/kg的5-氟尿嘧啶(5FU)。对于谱系阴性(Lin-2)细胞选择,使用小鼠BM谱系细胞耗竭(Miltenyi Biotec),通过免疫磁性分离对BM细胞进行谱系耗竭。磁性分离后,将来自所有小鼠的Lin-细胞或总BM细胞混合在一起,并以1x106个细胞/ml的浓度重悬在补充了下述细胞因子的StemSpan培养基中:50ng/ml小鼠SCF、50ng/ml人IL-6、25ng/ml人TPO、l0ng/ml小鼠IL-3,在37℃下在含有5%CO2的培养箱中孵育30小时。预刺激后,收获细胞,在含有2%FBS的PBS中洗涤两次,并且重悬在PBS中,随后进行BM移植。在移植当天,将100万个转导的总BM或10.000个Lin-细胞通过尾静脉注射至受体地中海贫血小鼠或wt C57BL/6J,随后四天用20mgr/kg白消安处理,从移植前四天开始。
如图7A所示,在第一个月内Lin-细胞产生了更高的植入率,其达到平均65%。然而,在8周内小鼠迅速丧失了植入细胞,到第12周,植入细胞的平均百分比低于10%。而相反的是,使用还含有辅佐细胞(图7B)的造血干细胞注射的小鼠成功植入,尽管与仅接受Lin-细胞的小鼠相比水平较低。这种类型的植入通常持续很长时间,即5个月(20周)。植入Lin-细胞的小鼠在4个月时出现了BM衰竭,而植入总BM的小鼠在6个月后出现了BM衰竭,这表明了共同施用辅佐细胞的存活优势。
Claims (12)
1.一种组合物的组合,其包含
i)组合物,其包含
I)包含特异性针对干细胞抗原的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性效应细胞群,和/或
II)α)包含特异性针对标记多肽的标签的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群,其中所述标记多肽特异性结合干细胞抗原,和
β)所述标记多肽,和
ii)组合物,其包含
a)CD34+造血干细胞群,和
b)一种或多种选自以下的辅助或辅佐细胞群:表达标志物CD14、CD11b、CD11c、CD123、CD33;CD36;CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326中的一种或多种的髓系细胞谱系。
2.根据权利要求1所述的组合物的组合,其中所述干细胞抗原是c-Kit、和/或CD34、和/或CD33、和/或CD38、和/或CD45RA、和/或CD71、和/或CD90、和/或CD131、和/或CD133、和/或CD135或其任何组合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物的组合,其中所述CD34+造血干细胞是遗传工程化的。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物的组合,其中所述CD34+造血干细胞不是遗传工程化的(天然的CD34+造血干细胞)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物的组合,其中所述一种或多种辅助或辅佐细胞群表示至少CD14+造血细胞群。
6.根据权利要求1至3和5中任一项所述的组合物的组合,其中所述遗传工程化的CD34+造血干细胞是已针对疾病进行修正的细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物的组合,其中所述包含嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群和所述CD34+造血干细胞群和所述一种或多种辅助或辅佐细胞群对于在所述疾病的治疗中接受所述细胞的受试者是自体细胞。
8.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物的组合,用于在患有疾病的受试者中治疗所述疾病。
9.一种用于消除患有疾病的受试者的骨髓中的造血干细胞和提高34+造血干细胞群的植入效率的方法,所述方法包括向所述受试者施用
i)组合物,其包含
I)包含特异性针对干细胞抗原的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群,或
II)α)包含特异性针对标记多肽的标签的嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞或细胞毒性免疫效应细胞群,其中所述标记多肽特异性结合干细胞抗原,和
β)所述标记多肽,
从而特异性消除所述受试者的骨髓中的所述造血干细胞并且不影响所述骨髓的基质细胞,
和
ii)组合物,其包含
a)CD34+造血干细胞群,和
b)一种或多种选自以下的辅助或辅佐细胞群:表达标志物CD14、CD11b、CD11c、CD123、CD33;CD36;CD47、CD66b、CD235a、CD146和CD326中的一种或多种的髓系细胞谱系,从而提高所述干细胞向所述受试者的所述骨髓的植入效率。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述疾病是单基因病或癌症。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法,其中所述34+造血干细胞群是遗传工程化细胞或健康细胞。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法,其中所述一种或多种辅助或辅佐细胞群是至少CD14+造血细胞群。
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