KR102539610B1 - 메모리 b 세포 특이적 분화 유도 방법 및 이의 활용 - Google Patents
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Abstract
메모리 B 세포 특이적 분화 유도 방법 및 이의 활용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하는 단계를 포함하는 메모리 B 세포 특이적 분화 유도 방법 및 이를 이용한 특정 항원에 특이적인 메모리 B 세포 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따르면 생물학적 시료에 존재하는 메모리 B 세포만을 특이적으로 분화할 수 있어, 상기 생물학적 시료를 제공한 개체가 특정 항원을 포함하는 병원성 물질에 감염이 된 이력이 있는지 여부를 매우 정확하고 신속하게 분석할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면 생물학적 시료에 존재하는 메모리 B 세포만을 특이적으로 분화할 수 있어, 상기 생물학적 시료를 제공한 개체가 특정 항원을 포함하는 병원성 물질에 감염이 된 이력이 있는지 여부를 매우 정확하고 신속하게 분석할 수 있다.
Description
메모리 B 세포 특이적 분화 유도 방법 및 이의 활용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하는 단계를 포함하는 메모리 B 세포 특이적 분화 유도 방법 및 이를 이용한 특정 항원에 특이적인 메모리 B 세포 검출 방법에 관한 것이다.
바이러스나 박테리아와 같은 병원체의 공격을 받았거나 혹은 백신과 같은 내 몸에 없는 성분의 항원을 경험하게 되면 우리 몸에서는 이들에 대한 면역적 기억의 과정을 가지게 된다. 이를 메모리 반응이라 하는데 우리 몸에서는 형성된 메모리로 인해 병원체나 백신 항원에 다시 노출되게 되면 관련 면역 반응이 더 크고 빠르게 일어난다. 이러한 면역적 메모리 반응을 주도하는 결정적인 면역세포들은 후천면역에서 중요한 역할을 하는 B와 T세포이다. 따라서 이들 면역 세포를 잘 분리해서 분석하게 되면 각각의 인간이 가지고 있는 면역 메모리의 양과 질의 측정이 가능하게 되어 과거에 우리 몸에 어떠한 면역적 상황이 있었는지 판단 기준이 됨은 물론 향후 병원체의 침입 시에 어떠한 면역적 방어 기작이 작동할지 예측 가능하게 된다.
하지만 임상에서는 세포 진단 기술의 복잡하고 어려운 제약들 때문에 각각의 환자에 대한 고급 면역 정보를 대다수의 의료진들이 쉽게 누리지 못하고 있다. 현재로는 면역 메모리 세포 활동의 산물로 여겨지는 항체를 혈액에서 측정하여 판단하는 간접적인 방법이 가장 보편적으로 사용되기는 하나, 이와 같은 기존의 방법은 병원체의 종류 및 숙주에 따라 항체 반응의 유지 정도가 다르고 항체가 형성되지 않는 질병의 특정 기간에서는 사용하기 어려운 단점이 있다.
면역메모리 세포를 직접 측정하는 방법에도 큰 제약이 존재하는데 가장 큰 이유는 면역 메모리를 관장하는 세포들이 체내에 매우 적은 수로 존재한다는 것이다. 또한 이 마저도 진단에 유용한 혈액보다는 면역 장기들 (비장, 림프 노드, 장)에 대부분의 세포들이 거주하기 때문에 침습적인 샘플 획득기술이나 준비과정이 복잡하면서 간접적인 이미징 의료기술의 사용을 요구하게 된다.
한편, Clinical and experimental immunology 177:333-340에 따르면, 항원-특이적 메모리 B 세포의 분석을 위해 다양한 분화 인자 칵테일(cocktail)을 처리하는 방법이 공지되어 있으나, 이와 같은 방법은 항원에 노출이 된 경험이 없는 naive B 세포까지 분화를 유도하여 비특이적인 항원-항체 반응을 나타낼 수 있다는 점에서 한계가 있다.
따라서, 면역 장기 등의 접근을 요구하는 침습적인 방법을 피하고 가장 쉽게 획득이 가능한 혈액을 사용하여 매우 정확하게 메모리 B 세포만을 특이적으로 분화시키고, 이를 통해 특정 항원에 특이적인 메모리 B 세포의 존재 여부를 확인할 수 있는 방법이 요구된다.
이에, 본 발명자는 비침습적인 방법으로 수득할 수 있는 혈액을 이용하여 메모리 B 세포만을 특이적으로 분화 유도할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하면 메모리 B 세포만을 특이적으로 분화 유도할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하는 단계를 포함하는, 메모리 B 세포(memory B cell) 특이적 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에 항원을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 항원에 특이적으로 결합한 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 항원 특이적 메모리 B 세포 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 포함하는 메모리 B 세포 특이적 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하는 단계를 포함하는, 메모리 B 세포(memory B cell) 특이적 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에 항원을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 항원에 특이적으로 결합한 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 항원 특이적 메모리 B 세포 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 포함하는 메모리 B 세포 특이적 분화 유도용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 개체로부터 수득한 혈액 유래의 PBMC에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하면, naive B 세포의 분화는 유도되지 않으면서, 메모리 B 세포 특이적인 분화가 유도되는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명은 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하는 단계를 포함하는, 메모리 B 세포(memory B cell) 특이적 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 “개체”는 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 사람, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지 또는 염소일 수 있으며, 바람직하게는 사람일 수 있다.
특히, 상기 개체는 과거에 박테리아 또는 바이러스에 감염이 된 이력이 있는지 여부를 분석하고자 하는 대상일 수 있다.
본 발명에서 상기 “생물학적 시료”는 상기 개체로부터 수득된 시료라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 전혈, 혈장, 혈청, 말초혈액단핵구세포(PBMC), 뇨, 분변, 타액, 객담, 땀, 눈물, 조직 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 전혈, 혈장, 혈청, PBMC 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 PBMC일 수 있다.
본 발명에서 상기 “항-CD3 항체” 또는 “항-CD28 항체”는 CD4+ T 세포의 표면에 발현되는 CD3 또는 CD28의 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 CD3 또는 CD28에 특이적으로 결합하여 CD4+ T 세포를 활성화하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체, 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
본 발명의 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 “리간드(ligand)”는 CD3 또는 CD28과 결합할 수 있는 모든 종류의 분자를 의미한다. 바람직하게는 상기 리간드는 CD3 또는 CD28와 결합하여 CD4+ T 세포를 활성화하는 모든 종류의 분자를 의미한다.
본 발명에서 상기 “T 세포”는 당업계에 한정된 바와 같은 T 림프구를 언급하고 흉선 세포, 미성숙한 T 림프구, 성숙한 T 림프구, 휴지기 T 림프구, 또는 활성화된 T 림프구를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 “CD4+ T 세포”는 이들의 표면 상에 CD4를 발현하고 세포-매개된 면역 반응과 연관된 T 세포 서브세트를 언급한다. 이들은 자극 후 분비 프로파일을 특징으로 하고 이는 IFN-감마, TNF-알파, IL-2, IL-4 및 IL-10와 같은 사이토킨의 분비를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 “특이적”이란 생물학적 시료에 존재하는 다양한 면역세포들, 특히 naive B 세포 및 메모리 B 세포 중에서 오로지 메모리 B 세포만의 분화를 유도하는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 “메모리 B 세포”란 기억 B 세포와 상호 교환 가능하게 사용되며, 1차 감염 후 배아 센터(germinal centers) 내에 형성되는 B 세포 서브 서브타입 중 하나이다. 상기 메모리 B 세포는 동일한 병원체에 2차 감염되었을 때 면역반응을 가속화하고 강력한 항체-매개 면역 반응을 생성한다.
본 발명에서 상기 “naive B 세포”란 항원에 노출된 경험이 없는 B 세포를 의미한다. 상기 naive B 세포가 항원에 노출이 되면 메모리 B 세포와 항체를 분비하는 형질 세포(plasma cell)로 분화가 된다.
본 발명에서 상기 “메모리 B 세포 특이적 분화 유도”란 항체를 분비하지 않는 메모리 B 세포를 특정 항원에 대한 항체를 분비하는 형질 세포(plasma cell)로 전환시키는 것을 의미한다. 메모리 B 세포가 형질 세포로 분화되면 각각의 기억으로 프로그래밍된 특이적 항원에 반응하는 IgG 및 IgM을 발현한다.
한편, 본 발명의 일실시예에 따르면, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하기 전 상기 생물학적 시료에서 CD8+ T 세포를 제거하는 단계를 추가로 수행하면 메모리 B 세포의 분화가 현저히 향상되는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명이 제공하는 상기 방법은 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하기 전 상기 생물학적 시료에서 CD8+ T 세포를 제거하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 "CD8+ T 세포"는 이들의 표면상에 CD8을 발현하는 T 세포의 아집단을 나타내며, MHC 부류 I-제한적이고, 세포독성 T 세포로 작용한다. "CD8" 분자는 흉선세포상에서 및 세포독성 및 억제 T-림프구상에서 발견된 분화 항원이다. CD8 항원은 면역글로불린 초유전자 계통의 일원이며 주 조직적합성 복합체 부류 I-제한된 상호작용에서 연상 인식 요소이다.
본 발명에서 상기 CD8+ T 세포를 제거하는 방법은 특별히 제한되지 않으나 예를 들어, 유동세포계수법, FACS(fluorescence activated cell sorting), 자성 비드, 컬럼 등을 이용한 방법에 의해 제거될 수 있다. 분리한 PBMC에 세포 표면의 CD8 분자에 반응하는 항체나 비드를 처리하여 FACS나 컬럼을 이용해 해당 세포를 선별적으로 제거할 수도 있다.
본 발명은 또한 (a) 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에 항원을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 항원에 특이적으로 결합한 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 항원 특이적 메모리 B 세포 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 방법은 전술한 메모리 B 세포 특이적 분화 유도 방법을 이용하여, 분화된 메모리 B 세포가 분비하는 항체 중에서 특정 항원을 특이적으로 인식하는 항체가 존재하는지 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다.
개체로부터 수득한 생물학적 시료에 존재하는 메모리 B 세포는 과거 특정 항원에 상기 개체가 노출이 된 이후에 형성된 것이기 때문에, 상기 (a) 단계에서 상기 생물학적 시료에 존재하는 메모리 B 세포를 항체를 분비하는 형질 세포로 분화시키고 이를 특정 항원과 반응시킴으로써, 상기 특정 항원에 대한 메모리 B 세포가 상기 생물학적 시료에 존재하는지 확인할 수 있다. 즉, 상기 개체가 과거 상기 항원을 포함하는 박테리아 또는 바이러스에 감염이 된 경험이 있는지 여부를 확인함으로써 신속한 치료 전략 수립이 가능할 수 있다.
상기 (a) 단계는 전술한 설명을 참고하여 동일하게 이해될 수 있다.
본 발명에서 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 항체를 분비하는 형질 세포로 분화된 메모리 B 세포가 분비하는 항체와 관심 있는 항원의 항원-항체 반응을 유도하는 단계이다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 “항원”은 병원성 물질, 보다 구체적으로는 박테리아 또는 바이러스에 의해서 발현되는 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.
상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스 유사 입자(VLP), 세포 또는 세포 조각을 포함할 수 있다.
상기 “항원”의 비제한적인 예시로는, 결핵균 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, Hib(Haemophilus influenzae type b)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 바리셀라 바이러스(Varicella virus), 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기 바이러스의 항원, 메르스 바이러스의 항원, 지카 바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, 사스코로나 바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 사스코로나 바이러스-2(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV-2)의 항원, 에볼라 바이러스의 항원, C형 간염 바이러스 항원, B형 간염 바이러스 항원, 급성 호흡기 증후군 바이러스 항원, 웨스트 나일 바이러스 항원, 소낭성 구내염 바이러스 항원, 뉴캐슬병 바이러스 항원 또는 폐렴구균 항원이 포함될 수 있다.
상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 처리된 항원과 상기 생물학적 시료로부터 분화가 유도된 메모리 B 세포가 분비하는 항체가 항원-항체 반응을 일으켰는지 여부를 확인하는 단계이다.
상기 (c) 단계에서 항원-항체 반응 여부를 검출하는 방법은 당업계에 공지된 방법이라면 제한없이 이용될 수 있으며, 이의 비제한적인 예시는 ELISPOT, ELISA, 경쟁적 ELISA, 자성 비드 또는 면역크로마토크래피 분석법이 포함될 수 있고, 바람직하게는 상기 항원-항체 반응 여부를 검출하는 방법은 ELISPOT일 수 있다.
상기 (c) 단계에서 상기 항원에 특이적으로 결합한 항체가 검출이 되는 경우, 상기 개체가 상기 항원을 발현하는 병원성 물질, 보다 구체적으로는 박테리아 또는 바이러스에 감염된 이력이 있는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명은 또한 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 포함하는 메모리 B 세포 특이적 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 조성물에는 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드 외에 메모리 B 세포의 생존을 위하여 필요한 인자들이 추가로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 혈청 (즉, 소 태아 또는 인간 혈청), 사이토카인, 또는 당업자에게 알려진 세포들의 성장을 위한 다른 임의의 첨가제들을 포함할 수 있는, 적합한 배지 (즉, 최소(Minimal) 필수(Essential) 배지(Media) 또는 RPMI 배지(Media) 1640 또는, X-vivo 5, (Lonza))를 포함한다. 세포들 성장을 위한 다른 첨가제들은, 계면활성제, 플라스마네이트(plasmanate) 및 N-아세틸-시스테인(cysteine) 및 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)과 같은 환원제들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배지는 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 첨가된 아미노산들과 함께, Optimizer, X-Vivo 20, 나트륨(sodium) 피루베이트(pyruvate) 및 비타민들, 혈청-없이, 또는 적합한 양의 혈청(또는 혈장)이 보충되어, 또는 호르몬들의 정의된 세트, 및/또는 T-세포들의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 따르면 생물학적 시료에 존재하는 메모리 B 세포만을 특이적으로 분화할 수 있어, 상기 생물학적 시료를 제공한 개체가 특정 항원을 포함하는 병원성 물질에 감염이 된 이력이 있는지 여부를 매우 정확하고 신속하게 분석할 수 있다.
도 1은 분리된 PBMC에 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체를 처리한 후, ELISPOT을 이용하여 분비된 IgM 및 IgG를 검출한 결과이다(면역수용체 활성 처리군: 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체 처리군).
도 2는 분리된 PBMC에서 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 제거한 후 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체를 처리하고 ELISPOT을 이용하여 분비된 IgM 및 IgG를 검출한 결과이다.
도 3은 CD8+ T 세포를 제거한 PBMC에서 IgD 또는 IgG를 제거한 후 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체를 처리하고 ELISPOT을 이용하여 분비된 IgM 및 IgG를 검출한 결과이다.
도 4는 PBMC에서 naive B 세포를 분리하고 polyclonal activator인 TLR7/8 agonist(R848)와 TLR9 agonist(CPG)를 1ug/ml으로 처리한 후 ELISPOT 실험을 통해 항체 양을 측정한 결과이다.
도 5는 메르스 항원에 노출된 경험이 있거나 없는 원숭이 혈액에서 PBMC를 분리하고, CD8+ T 세포를 제거한 후 (i) 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체 (면역수용체 활성처리군) (ii) TLR7/8 agonist(R848) 또는 (iii) TLR9 agonist(CPG)를 처리하고 ELISPOT을 이용하여 IgM 및 IgG 분비 여부를 확인한 결과이다(면역수용체 활성 처리군: 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체 처리군, TLR agonist 1: TLR7/8 agonist(R848), TLR agonist 2: TLR9 agonist(CPG)).
도 6은 뎅기 바이러스 항원(a) 또는 코로나19 바이러스 항원(b)에 노출된 경험이 있거나 없는 원숭이 혈액에서 PBMC를 분리하고, CD8+ T 세포를 제거한 후 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체 (면역수용체 활성처리군)를 처리하고 ELISPOT을 이용하여 IgM 및 IgG 분비 여부를 확인한 결과이다(면역수용체 활성 처리군: 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체 처리군).
도 2는 분리된 PBMC에서 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 제거한 후 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체를 처리하고 ELISPOT을 이용하여 분비된 IgM 및 IgG를 검출한 결과이다.
도 3은 CD8+ T 세포를 제거한 PBMC에서 IgD 또는 IgG를 제거한 후 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체를 처리하고 ELISPOT을 이용하여 분비된 IgM 및 IgG를 검출한 결과이다.
도 4는 PBMC에서 naive B 세포를 분리하고 polyclonal activator인 TLR7/8 agonist(R848)와 TLR9 agonist(CPG)를 1ug/ml으로 처리한 후 ELISPOT 실험을 통해 항체 양을 측정한 결과이다.
도 5는 메르스 항원에 노출된 경험이 있거나 없는 원숭이 혈액에서 PBMC를 분리하고, CD8+ T 세포를 제거한 후 (i) 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체 (면역수용체 활성처리군) (ii) TLR7/8 agonist(R848) 또는 (iii) TLR9 agonist(CPG)를 처리하고 ELISPOT을 이용하여 IgM 및 IgG 분비 여부를 확인한 결과이다(면역수용체 활성 처리군: 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체 처리군, TLR agonist 1: TLR7/8 agonist(R848), TLR agonist 2: TLR9 agonist(CPG)).
도 6은 뎅기 바이러스 항원(a) 또는 코로나19 바이러스 항원(b)에 노출된 경험이 있거나 없는 원숭이 혈액에서 PBMC를 분리하고, CD8+ T 세포를 제거한 후 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체 (면역수용체 활성처리군)를 처리하고 ELISPOT을 이용하여 IgM 및 IgG 분비 여부를 확인한 결과이다(면역수용체 활성 처리군: 항-CD3 항체 및 항-CD8 항체 처리군).
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: PBMC(peripheral blood mononuclear cell)의 분리
정상 인간과 비인간 영장류로부터 혈액을 분리하였다. EDTA tube 안의 혈액에 1X PBS를 섞어준 후 4ml의 Ficoll-Hypaque (Lymphoprep; Axis-Shield, 1114545)에 천천히 층이 분리시킨다. 4000rpm으로 20분동안 천천히 원심분리를 돌려준 후 층이 나눠졌을 때, PBMC인 하얀 띠 부분을 파이펫을 이용해서 모아준다. 다시 1X PBS를 넣고 1500rpm으로 5분동안 원심 분리로 돌린 다음 상층액을 없애준다. 이 후 배지 1ml을 넣어 세포를 풀어준다. Olympus R1 자동세포카운터를 사용하여 세포 수를 계산한다.
실시예 2: 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드 처리를 통한 메모리 B 세포의 분화 유도
(1) PBMC에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드 처리에 따른 항체 분비량 측정
상기 실시예 1에서 분리한 PBMC에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하였다.
항-CD3 항체 (Clone OKT3, Biolegend Cat. No. 317302)를 1ug/ml으로 코팅한 96well 플레이트에 상기 실시예 1에서 분리한 PBMC (1X105 cells/well)를 넣고 항-CD28 항체 (Clone CD28.2, BD Cat. No. 555725) 1ug/ml 으로 처리해준 다음 3~4일동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 반응시켰다.
메모리 B 세포에서 분비된 항체는 IgG 및 IgM 형으로 이루어져 있기 때문에, 이후 ELISPOT 방법을 통해 상기 PBMC 샘플에서 분비된 IgM 및 IgG의 양을 측정하였다.
구체적으로, 항 IgG와 IgM 항체를 10ug/ml을 50ul씩 플레이트에 넣어준 다음 4℃로 24시간동안 코팅했다. 항-CD3 항체와 항-CD28 항체로 자극을 준 PBMC를 코팅된 플레이트에 넣은 다음 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간동안 반응시켰다. 이 후, 항 IgG-FITC 항체와 IgM-Biotin 항체 (Southern Biotech)를 2시간 동안 상온에서 반응시키고 FITC-HRP과 Strep-AP (CTL)을 1시간동안 상온에서 반응시켰다. 마지막으로 파란색 환원제를 첨가한 다음 15분 상온에서 반응시킨 후 IgM, IgG를 측정하였다.
이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, PBMC에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하면, 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하지 않은 PBMC와 비교하여 IgG 및 IgM 형 항체의 분비량이 현저히 증가하는 것으로 확인되었다. 즉, 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드 처리에 의해 메모리 B 세포의 분화가 유도되어, 분화된 B 세포에서 IgG 및 IgM의 분비가 증가하였음을 예상해 볼 수 있었다.
(2) CD4+ T cell 또는 CD8+ T cell을 제거한 PBMC에서 메모리 B 세포의 분화 유도
상기 실험 (1)에서 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리했을 때 메모리 B 세포의 분화가 유도되는 조건을 최적화하고자 PBMC에서 CD4+ T cell 또는 CD8+ T cell을 제거한 후 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 상기 실험과 동일한 방법으로 처리했다.
CD4+ T cell 또는 CD8+ T cell은 각각 다음과 같은 방법으로 PBMC에서 제거하였다.
구체적으로, 항-CD4 마이크로 비드 키트와 항-CD8 마이크로 비드 키트 (Miltenyi Biotech, Auburn, Calif.)를 사용하여 PBMC-CD4 T 세포(CD4+ T세포가 제거된 PBMC)과 PBMC-CD8 T 세포(CD8+ T세포가 제거된 PBMC)를 분리했다. PBMC (1x107cells)에 80 μl의 버퍼 (0.5% BSA and 2mM EDTA in PBS)를 넣고 20 μl의 CD4 마이크로 비드 또는 CD8 마이크로 비드를 넣어 잘 섞어준 다음 4℃에서 15분동안 반응시켰다. 반응을 멈추고 1500 rpm로 5분동안 원심분리 해준 후 10ml의 버퍼 및 LS MACS 컬럼 (Miltenyi Biotech, Auburn, Calif)을 사용하여 자석에 붙지 않은 PBMC-CD4 T cells 또는 PBMC-CD8 T cells을 각각 얻었다.
이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, CD4+ T 세포가 제거된 PBMC에는 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하더라도 항체가 전혀 분비가 되지 않는 것으로 확인되었으나, CD8+ T 세포가 제거된 PBMC는 PBMC와 비교해 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드 처리에 의해 항체 분비량이 현저히 증가하는 것으로 확인이 되었다.
따라서, 이하 실험에서는 CD8+ T 세포가 제거된 PBMC를 이용하여 진행하였다.
(3) 메모리 B 세포 특이적 분화 유도인지 여부의 확인
종래기술에서 메모리 B 세포의 분화를 유도하기 위해 처리하는 물질들은 polycolonal activator이기 때문에, 메모리 B 세포뿐 아니라 naive B 세포까지 분화되어 실제 특정 항원에 대한 면역 메모리를 갖고 있는 B 세포만 특이적으로 분화시키는 것이 불가능하다.
따라서, 본 발명자는 PBMC에 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하는 방법이 naive B 세포가 아닌 메모리 B 세포만을 특이적으로 분화시키는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, PBMC에 해당되는 세포 표면에서 IgD와 IgG를 나타내는 세포를 제거한 나머지 세포를 BD FACS Aria II를 사용하여 분리했다. 이 후, 항-CD3 항체 (Clone OKT3, Biolegend Cat. No. 317302) 1ug/ml으로 전날 코팅된 96well 플레이트에 상기 분리한 세포(1X105 cells/well)를 넣고 항-CD28 항체 (Clone CD28.2, BD Cat. No. 555725) 1ug/ml 으로 처리한 후 3~4일동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 반응시킨 후 ELISPOT 실험을 통해 항체 양을 측정했다.
이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3a에서 확인할 수 있는 바와 같이, IgD를 표면에 발현하는 세포가 제거된 PBMC에서는 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드 처리에 의해 여전히 IgM 및 IgG형 항체의 분비량이 증가하는 것으로 확인이 되었다. 이에 반해, 도 3b에서 확인할 수 있는 바와 같이 IgG를 표면에 발현하는 세포가 제거된 PBMC에서는 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하더라도 IgM 및 IgG형 항체의 분비가 전혀 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
즉, IgD를 표면에 발현하는 naive B 세포는 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드를 처리하더라도 항체를 분비하는 세포로 분화되지 않고, IgG를 표면에 발현하는 메모리 B 세포만이 항-CD3 항체 또는 리간드; 및 항-CD28 항체 또는 리간드 처리에 의해 분화가 유도되었음을 알 수 있다.
선행 연구들에서 사용한 물질인 Polyclonal activator들은 항원을 경험하지 못한 naive B 세포를 분화시켜 특이적 항원의 메모리와 관련 없는 표면에 있는 IgM 항체를 생산하게 된다.
따라서, 본 발명자는 PBMC에 Polyclonal activator로써 대표적으로 알려진 TLR agonist들을 처리하는 방법으로 이와 같은 비특이적 반응 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, PBMC에 해당되는 세포 표면에서 naive B 세포를 나타내는 IgD+CD27-세포를 BD FACS Aria II를 사용하여 분리했다. 이 후, 96well 플레이트에 상기 분리한 세포(1X104 cells/well)를 넣고 TLR7/8 agonist(R848)와 TLR9 agonist(CPG)를 1ug/ml으로 처리한 후 3~4일동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 반응시킨 후 ELISPOT 실험을 통해 항체 양을 측정했다.
이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, TLR7/8 agonist(R848)와 TLR9 agonist(CPG)를 처리한 naive B 세포에서 IgM의 분비량이 현저히 증가한 것으로 확인되었다. 즉, Polyclonal activator는 항원 특이적 메모리와 관련이 없는 naive B 세포까지 분화를 유도한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 특정 항원에 특이적인 메모리 B 세포의 검출
상기 실시예 1 및 2를 통해 PBMC에서 메모리 B 세포만을 특이적으로 분화시키는 방법을 확립한 후, 상기 방법을 이용하여 실제 대상체로부터 분리한 생물학적 시료에서 특정 항원에 노출이 되었던 적이 있는지 여부를 확인할 수 있는지를 이하 평가해 보았다.
구체적으로, 메르스 바이러스 항원 단백질과 어주번트를 허벅지 근육 내에 3차 접종을 마친 원숭이의 PBMC를 분리했다. 본 발명의 방법에 따라 항-CD3 항체 (Clone SP34, BD Cat. No. 557052) 1ug/ml으로 전날 코팅된 96well 플레이트에 분리한 원숭이 PBMC (5X105 cells/well)를 넣고 항-CD28 항체 (Clone CD28.2, BD Cat. No. 555725) 1ug/ml 으로 처리해준 다음 3~4일 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 반응시켰다. 또는, 분리된 원숭이 PBMC에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 대신에 Polyclonal activator인 TLR7/8 agonist(R848, TLR agonist1) 또는 TLR9 agonist(CPG, TLR agonist 2) 처리해준 다음 3~4일 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 반응시켰다.
이후 메르스 특이적인 단백질을 코팅하여 ELISPOT을 진행했다.
이에 대한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라(면역수용체 활성처리군) 메모리 B 세포의 분화가 유도된 원숭이 PBMC 중에서, 메르스 바이러스에 노출이 된 경험이 있는 2 마리의 원숭이 PBMC에서는 메르스 항원을 특이적으로 인식하는 IgG(빨간색 숫자)과 IgM(파란색 숫자)이 정확하게 검출이 되었으며, 메르스 바이러스에 노출이 된 경험이 없는 2 마리의 원숭이 PBMC에서는 검출이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 본 발명의 방법에 따라 메모리 B 세포의 분화가 유도된 원숭이 PBMC에서는 메르스 항원을 특이적으로 인식하는 IgG형 항체의 분비가 Polyclonal activator인 TLR7/8 agonist(R848, TLR agonist1 ) 또는 TLR9 agonist(CPG, TLR agonist 2) 처리군보다 현저히 높게 검출이 되는 것을 확인 할 수 있었다.
또한, 상기 방법과 동일한 방법으로 뎅기 바이러스 항원 단백질과 어주번트를 허벅지 근육 내에 3차 접종을 마친 원숭이와 또는 코로나 19 바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV-2)에 감염된 원숭이의 PBMC를 이용하여 실험을 진행한 결과, 각각의 바이러스 항원에 노출이 된 경험이 있는 원숭이 PBMC에서는 뎅기 바이러스 항원(a) 또는 코로나 19 바이러스 항원(b)을 특이적으로 인식하는 IgG(빨간색 숫자)과 IgM(파란색 숫자)이 정확하게 검출이 되었으며, 각각의 바이러스 항원에 노출이 된 경험이 없는 원숭이 PBMC에서는 항체가 검출이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 방법에 따르면 생물학적 시료에 존재하는 메모리 B 세포만을 특이적으로 분화할 수 있어, 상기 생물학적 시료를 제공한 개체가 특정 항원을 포함하는 병원성 물질에 감염이 된 이력이 있는지 여부를 매우 정확하고 신속하게 분석할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
Claims (10)
- 개체로부터 수득한 전혈 또는 말초혈액단핵구세포(PBMC)에 항-CD3 항체; 및 항-CD28 항체를 처리하는 단계를 포함하는, 메모리 B 세포(memory B cell) 특이적 분화 유도 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 개체로부터 수득한 생물학적 시료에 항-CD3 항체; 및 항-CD28 항체를 처리하기 전 상기 생물학적 시료에서 CD8+ T 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 메모리 B 세포는 분화 유도되어 IgG 및 IgM를 분비하는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 개체로부터 수득한 전혈 또는 말초혈액단핵구세포(PBMC)에 항-CD3 항체; 및 항-CD28 항체를 처리하는 단계;
(b) 상기 전혈 또는 말초혈액단핵구세포(PBMC)에 항원을 처리하는 단계;
(c) 상기 항원에 특이적으로 결합한 항체를 검출하는 단계; 및
(d) 상기 항원에 특이적으로 결합한 항체가 검출이 되는 경우, 상기 개체가 상기 항원을 발현하는 박테리아 또는 바이러스에 감염된 이력이 있는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 항원 특이적 메모리 B 세포 검출 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 개체로부터 수득한 전혈 또는 말초혈액단핵구세포(PBMC)에 항-CD3 항체; 및 항-CD28 항체를 처리하기 전 상기 생물학적 시료에서 CD8+ T 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 항원은 결핵균 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, Hib(Haemophilus influenzae type b)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원, 바리셀라 바이러스(Varicella virus), 엔테로코키(Enterococci)의 항원, 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항원, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)의 항원, 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)의 항원, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 항원, 엔테로박터(Enterobacter)의 항원, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 항원, 말라리아의 항원, 뎅기 바이러스의 항원, 메르스 바이러스의 항원, 지카 바이러스의 항원, 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 항원, 중증열성혈소판감소증후군(severe fever with thrombocytopenia syndrome Bunyavirus; SFTS Bunyavirus)의 항원, 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus)의 항원, 사스코로나 바이러스(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV)의 항원, 사스코로나 바이러스-2(severe acute respitaroty syndrome-corona virus; SARS-CoV-2)의 항원, 에볼라 바이러스의 항원, C형 간염 바이러스 항원, B형 간염 바이러스 항원, 급성 호흡기 증후군 바이러스 항원, 웨스트 나일 바이러스 항원, 소낭성 구내염 바이러스 항원, 뉴캐슬병 바이러스 항원 및 폐렴구균 항원으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, (c) 단계에서 항원 특이적으로 결합한 항체의 검출은 ELISPOT, ELISA, 경쟁적 ELISA, 자성 비드 및 면역크로마토크래피 분석법으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 항-CD3 항체; 및 항-CD28 항체를 포함하는, 전혈 또는 말초혈액단핵구세포(PBMC)에서의 메모리 B 세포 특이적 분화 유도용 조성물.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
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| GRNT | Written decision to grant |