MX2013010924A - Metodo y equipo para estimar incidencia de virus de inmunodeficiencia humana (vih). - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para determinar la incidencia de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en una población, que comprende comparar los niveles de anticuerpo anti-VIH de muestras de tejido simulado in vitro con aquellos de muestras de tejido no estimulado de miembros individuales de dicha población y equipos relacionados. La presente invención también proporciona un método para determinar la distribución de infecciones por virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de etapa reciente, no reciente, y tardía en una población que comprende comparar la inmunoreactividad anti-VIH estimulada in vitro y la inmunoreactividad anti-VIH no estimulada en muestras de tejido de miembros individuales de dicha población y equipos relacionados.

Description

METODO Y EQUIPO PARA DETERMINAR EL TIEMPO DE SEROCONVERSION DE UN PACIENTE INFECTADO CON UN VIRUS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención proporciona un método para determinar el tiempo de infección, y un método para determinar si una infección microbiana está en las primeras etapas, que comprende el paso de determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en muestras de sangre de dicho sujeto, y equipos relacionados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Existe la necesidad de ensayos que puedan identificar a individuos que estén en las etapas tempranas de infección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Dichos ensayos son útiles, entre otras cosas, para determinar la etapa de infección para propósitos de tratamiento.

Las pruebas para la Infección Reciente (TRIs) clasifican a las infecciones como recientemente adquiridas o no recientemente adquiridas, con base en los resultados de pruebas de laboratorio que cuantifican biomarcadores que evolucionan con el tiempo después de la infección, algunas veces suplementados por información clínica. Sin embargo, las pruebas para una infección reciente por VIH tradicionalmente se han basado en la avidez del anticuerpo, proporción o titulación, para las cuales las altas tazas recientes falsas (e) o bajas duraciones recientes (oo) han obstaculizado la estimación de incidencia. Por lo tanto, en la técnica se necesita una forma nueva y mejora para identificar infecciones recientes. También, y de manera más importante, ninguno de estos ensayos ha sido diseñado para propósitos de diagnóstico, y todos son herramientas meramente estadísticas para la estimación de incidencia.

La clasificación de infecciones a través de un TRIs usualmente se basa en los biomarcadores medidos. Un reto es que la evolución de estos marcadores dentro de individuos infectados exhibe variabilidad inter-sujeto. En algunos casos, el estado de infección reciente es demasiado pasajero para la proporción de población que será estimada con buen potencial estadístico en estudios con tamaños de muestras viables. Además, por lo regular hay muchos individuos quienes permanecen clasificados como recientemente infectados de forma indefinida o durante períodos muy largo, o quienes revierten a una clasificación reciente durante una enfermedad de etapa final o bajo la influencia de tratamiento anti-retroviral.

Las TRIs de esta manera mucho más propuestas (tales como ELISAs desintonizados, el ensayo de BED y ensayos de avidez) todas crucialmente se basan en mediciones de titulación de anticuerpo, avidez o proporción específica de VIH. Sin embargo, estas TRIs parecen estar plagadas por un comercio insatisfactorio entre el estado pasajero de una infección reciente e infecciones recientes falsas. En resumen, para que una TRI sea útil, la Duración Reciente Media (duración media en el estado definido por TRI de infección reciente) debe ser larga, mientras que la Taza de Reciente Falso (la proporción de individuos infectados hace mucho tiempo quienes permanecen en el estado definido por TRI de infección reciente) debe ser pequeña. En el caso de una herramienta diagnóstica para determinar el tiempo de infección de un individuo, la habilidad del ensayo para determinar la duración de la infección a través de poblaciones, género, y otras variables necesita ser dirigida y se deben tomar en cuenta variaciones personales/factores para el diagnóstico del individuo. Esta invención dirige la necesidad de Pruebas de Tiempo de Infección (ITT) para determinar el tiempo de la infección y/o la duración de la infección.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo de una infección microbiana inicial de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde la inmunoreactividad antimicrobiana indica que dicho sujeto está infectado; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra; (c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinado así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) determinar el tiempo de dicha infección microbiana basándose en el valor SI obtenido en el paso (c), en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y el tiempo de dicha infección microbiana.

De esta forma, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo de una infección microbiana inicial de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de una primera muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde una inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); (d) repetir los pasos (a)-(c) con una segundo muestra de sangre obtenida de dicho sujeto en un último momento; y (e) calcular la pendiente (o ?) del cambio en el SI calculado para las primera y segunda muestras de sangre, en donde existe una correlación inversa entre el valor de dicha pendiente (o ?) y el tiempo transcurrido desde dicha infección microbiana.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para distinguir entre infección microbiana temprana y establecida en un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde la inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinando asi un valor de índice de estimulación (SI); y (d) determinar si el valor SI obtenido en el paso (c) está por arriba de un valor de umbral predeterminado para cada sujeto, en donde un valor por abajo de dicho umbral indica que el sujeto no está en las etapas tempranas de la infección y un valor por arriba de dicho umbral indica que el sujeto está en las etapas tempranas de la infección, distinguiendo así entre una infección microbiana temprana y una establecida en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para distinguir entre una infección microbiana temprana contra establecida en un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde una inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpo antimicrobianos in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) por un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) repetir los pasos (a)-(c) con una segunda muestra de sangre obtenida de dicho sujeto en un último tiempo; y (e) calcular la pendiente (o ?) del cambio en SI calculado para las primera y segunda muestra de sangre, en donde un valor por abajo de un valor de umbral predeterminado indica que el sujeto no está en las etapas tempranas de la infección y un valor por arriba de dicho umbral indica que el sujeto está en la etapas tempranas de la infección, distinguiendo así entre una infección microbiana temprana y una establecida en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar el tiempo de una infección microbiana inicial de un sujeto, que comprende: dos recipientes para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo recipiente comprende un medio comprendiendo uno o más activadores de linfocitos microbianos específicos, linfocitos no específicos, o una combinación de los mismos, un ensayo para determinar la detección de uno o más productos de dichos linfocitos, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para distinguir entre una infección microbiana temprana y una establecida en un sujeto, que comprende: dos recipientes para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo recipiente comprende un medio comprendiendo uno o más activadores de linfocitos microbianos específicos, linfocitos no específicos, o una combinación de los mismos. Un ensayo para la detección de uno o más productos de dichos linfocitos, e instrucciones de uso.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1: Niveles de Anticuerpo Estimulado y No Estimulado. Medios de estimulación incubados con especímenes de sangre (estimulados) tienen niveles superiores de anticuerpo comparado con especímenes de sangre de control (no estimulados) después de la seroconversión. Los niveles de anticuerpo incrementados en la muestra estimulada se desvanecieron con el tiempo después de la seroconversión.

Figura 2: Cambio de Indice de Estimulación (SI) con el Tiempo después de la Seroconversión. El modelo simplificado para calcular el tiempo de infección y/o determinar si una infección está en las etapas tempranas utilizando el Indice de Estimulación (SI). Los datos se recolectaron en un estudio prospectivo de individuos de alto riesgo, proporcionando los cambios para SI con el tiempo desde el inicio de una nueva infección. Vl = la primera visita seropositiva después de una muestra de infección aguda, es decir, el momento de la infección es "conocido". El intervalo de tiempo entra visitas es igual (por ejemplo, 1 mes). "Series" = muestras de sangre secuenciales del mismo paciente. Se presentan los datos de una primera (A) población y una segunda (B).

Figura 3: Indice de Estimulación (SI) en Infecciones Tempranas de Datos de Seroconversión Desconocida. La primera visita (V?1) toma lugar en un tiempo desconocido después de la seroconversión. Por ejemplo, cuando V3 representa un tiempo desconocido de seroconversión, el hecho es que la visita 3 representa infección temprana puede determinarse por los niveles de SI y/o la pendiente del cambio SI con el tiempo. El cambio de SI con el tiempo en pacientes con tiempo desconocido de seroconversión es superpuesto (por el programa "mejor ajuste") en la gráfica describiendo el cambio SI con el tiempo en pacientes con tiempo conocido de seroconversión y el tiempo de infección (seroconversión aka) de esta manera es estimado. El intervalo de tiempo entre visitas es igual (por ejemplo, 1 mes). "Series" = muestras de sangre secuenciales del mismo paciente.

Figura 4: Determinación del Tiempo de Infección Utilizando ASI. El tiempo de infección se determina al "sobreponer" la pendiente del SI en las muestras desconocidas sobre las pendientes establecidas de un grupo de tiempos desconocidos de seroconversión.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo transcurrido desde una infección microbiana inicial de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde una inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir inmunoreactividad antimicrobiana in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra; (c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) a través de un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinado así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) determinar el tiempo transcurrido desde dicha infección microbiana inicial basándose en el valor SI obtenido en el paso (c), en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y el tiempo transcurrido desde dicha infección microbiana. En una modalidad, la inmunoreactividad antimicrobiana es niveles de anticuerpo antimicrobiano, niveles de citocina, niveles de linfocina, o una combinación de los mismos. En una modalidad, el paso de estimulación se realiza solo si dicho sujeto es seropositivo. En otra modalidad, las alícuotas de sangre no estimuladas y estimuladas pueden ser procesadas al mismo tiempo. En otra modalidad, las alícuotas de sangre no estimulada y estimulada pueden ser probadas para niveles de anticuerpo al mismo tiempo.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo de una infección microbiana de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de una primera muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde una inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir inmunoreactividad antimicrobiana in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) determinar el tiempo de dicha infección microbiana basándose en el valor SI obtenido en el paso (c), en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y el tiempo de dicha infección microbiana.

En una modalidad, la inmunoreactividad antimicrobiana es niveles de citocina antimicrobiana, niveles de linfocina, niveles de anticuerpo, o una combinación de los mismos.

En una modalidad, la inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto es seropositivo. En otra modalidad, la inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo transcurrido desde una infección patogénica inicial de un sujeto. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo de una infección patogénica inicial de un sujeto.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo transcurrido desde una infección viral inicial de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar el nivel de anticuerpo antiviral en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde un nivel de anticuerpo antiviral detectable indica que dicho sujeto es seropositivo; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antivirales in vitro y determinar el nivel de anticuerpo antiviral en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo antiviral estimulado obtenido en el paso (b) entre un valor que representa el nivel de anticuerpo antiviral obtenido en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) determinar el tiempo transcurrido desde dicha infección viral inicial basándose en el valor SI obtenido en el paso (c), en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y el tiempo transcurrido desde dicha infección viral.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo transcurrido desde una infección retroviral inicial de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar el nivel de anticuerpo anti-retroviral en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde el nivel de anticuerpo anti-retroviral indica que dicho sujeto es seropositivo; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos anti-retrovirales in vitro y determinar el nivel de anticuerpo anti-retroviral en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo anti-retroviral estimulado obtenido en el paso (b) entre un valor que representa el nivel de nivel de anticuerpo anti-retroviral obtenido en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) determinar el tiempo transcurrido desde dicha infección retroviral basándose en el valor SI obtenido en el paso (c), en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y el tiempo transcurrido desde dicha infección retroviral.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo transcurrido desde una infección inicial por Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar el nivel de nivel de anticuerpo anti-VIH en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde el nivel de anticuerpo anti-VIH indica que dicho sujeto es seropositivo; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos anti-VIH in vitro y determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH estimulado obtenido en el paso (b) entre un valor que representa el nivel de nivel de anticuerpo anti-VIH obtenido en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) determinar el tiempo transcurrido desde dicha infección inicial por VIH basándose en el valor SI obtenido en el paso (c), en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y el tiempo transcurrido desde dicha infección por VIH.

En otra modalidad, un método de la presente invención además comprende el paso de formular una correlación entre valores de SI y el tiempo de infección antes del paso (a) basándose en una población de sujetos para quienes tanto el valor SI como el tiempo de infección es conocido.

En una modalidad, el valor SI se analiza con relación a otro factor medido, el cual en una modalidad, es niveles de IgG total, niveles de IgM total, niveles de anticuerpo específico microbiano, niveles de IL-2 total, niveles de IL-10 total, o una combinación de los mismos en las muestras no estimuladas.

En otra modalidad, un método de la presente invención además comprende los pasos de: (a) determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una segunda muestra de sangre de dicho sujeto, en donde dicha relación es el índice de estimulación (SI), y (b) calcular la pendiente (o ?) del cambio en Si calculado para las primeras y segundas muestras, en donde la pendiente (o ?) permite/ayuda a determinar el tiempo transcurrido desde dicha infección microbiana.

De esta manera, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo de una infección microbiana inicial de un sujeto que comprende los pasos de: (a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en un a primera alícuota de una primera muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde una inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); (d) repetir los pasos (a)-(c) con una segunda muestra de sangre obtenida de dicho sujeto en un momento posterior; y (e) calcular la pendiente (o ?) del cambio en SI calculado para las primera y segunda muestras de sangre, en donde existe una correlación inversa entre el valor de dicha pendiente (o ?) y el tiempo transcurrido desde dicha infección microbiana.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para distinguir entre una infección microbiana temprana contra una establecida en un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde la inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antimicrobianos ¡n vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) repetir los pasos (a)-(c) con una segunda muestra de sangre obtenida de dicho sujeto en un tiempo posterior; y (e) calcular la pendiente (o ?) del cambio en SI calculado para las primera y segunda muestras de sangre, en donde un valor por abajo de una valor de umbral predeterminado indica que el sujeto no está en las primeras etapas de la infección y un valor por arriba de dicho umbral indica que el sujeto estuvo en las primeras etapas de infección, distinguiendo así entre una infección microbiana temprana y una establecida en un sujeto.

En otra modalidad, un método de la presente invención además comprende los pasos de: (a) determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una segunda muestra de sangre de dicho sujeto, en donde dicha relación es el índice de estimulación (SI), y (b) calcular la pendiente (o ?) del cambio en el SI calculado para las primera y segunda muestras de sangre, en donde existe una correlación inversa entre el valor de dicha pendiente (o ?) y el tiempo transcurrido desde dicha infección microbiana.

En una modalidad, la segunda muestra de sangre se toma aproximadamente un mes después de la primera muestra de sangre. En otra modalidad, la segunda muestra de sangre se toma aproximadamente una, dos o tres semanas después de la primera muestra de sangre. En otra modalidad, la segunda muestra de sangre se toma aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis meses después de la primera muestra de sangre se toma aproximadamente una, dos, o tres semanas después de la primera prueba positiva y medición de SI. En otra modalidad, la segunda muestra de sangre se toma aproximadamente uno, dos, tres, cuatro o cinco meses después de la primera prueba positiva y medición de SI. En otra modalidad, la segunda muestra de sangre se toma en un punto de tiempo después de la primera muestra de sangre que es ya sea potencialmente informativa o práctica en términos del cuidado del paciente, como es entendido en la técnica.

En una modalidad, la inmunoreactividad específica se mide en la alícuota de muestra de sangre estimulada contra no estimulada. En otra modalidad, la inmunoreactividad no específica se mide en la alícuota de muestra de sangre estimulada contra no estimulada. En otra modalidad, tanto la inmunoreactividad específica como la inmunoreactividad no específica se mide en la alícuota de muestra de sangre estimulada contra no estimulada. En una modalidad, la determinación del tiempo de infección se basa en el SI de la inmunoreactividad específica factorizada por el SI de la inmunoreactividad no específica.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para distinguir entre infección microbiana temprana contra establecida en un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde una inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de la muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) determinar si el valor SI obtenido en el paso (c) está por arriba de un valor de umbral predeterminado para cada sujeto, en donde un valor por abajo de dicho umbral indica que el sujeto no tiene una infección temprana y un valor por arriba de dicho umbral indica que el sujeto tiene una infección temprana, distinguiendo así entre una infección microbiana temprana y una establecida en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para distinguir entre una infección viral temprana contra establecida en un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar el nivel de anticuerpo antiviral en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde un nivel de anticuerpo antiviral detectable indica que dicho sujeto es seropositivo; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antivirales in vitro y determinar el nivel de anticuerpo antiviral en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo antiviral estimulado obtenido en el paso (b) entre un valor que representa el nivel de anticuerpo antiviral obtenido en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) determinar si el valor SI obtenido en el paso (c) está por arriba de un valor de umbral predeterminado para cada sujeto, en donde un valor por abajo de dicho umbral indica que el sujeto no tiene una infección temprana y un valor por arriba de dicho umbral indica que el sujeto tiene una infección temprana, distinguiendo así una infección viral temprana contra establecida en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para distinguir entre infección retroviral temprana contra establecida en un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar el nivel de anticuerpo anti-retroviral en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde un nivel de anticuerpo anti-retroviral detectable indica que dicho sujeto es seropositivo; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos anti-retrovirales in vitro y determinar el nivel de anticuerpo anti-retroviral en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo anti-retroviral estimulado obtenido en el paso (b) entre un valor que representa el nivel de anticuerpo anti-retroviral obtenido en el paso (a), determinando así un valor de Índice de estimulación (SI); y (d) determinar si el valor SI obtenido en el paso (c) está por arriba de un valor de umbral predeterminado para cada sujeto, en donde un valor por debajo de dicho umbral indica que el sujeto no estuvo en las etapas tempranas de infección y un valor por arriba de dicho umbral indica que el sujeto no estuvo en la etapas tempranas de infección, distinguiéndose así entre una infección retroviral temprana contra una establecida en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para distinguir entre infección por Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) temprana contra una establecida en un sujeto, que comprende los pasos de: (a) determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde un nivel de anticuerpo anti-VIH detectable indica que dicho sujeto es seropositivo; (b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos anti-VIH ¡n vitro y determinar el nivel de anticuerpo anti-VIH en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (c) dividir un valor que representa el nivel de anticuerpo anti-VIH estimulado obtenido en el paso (b) entre un valor que representa un nivel de anticuerpo anti-VIH en el paso (a), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); y (d) determinar si el valor SI obtenido en el paso (c) está por arriba de un valor de umbral predeterminado para cada sujeto, en donde un valor por abajo de dicho umbral indica que el sujeto no estuvo en las etapas tempranas de infección y un valor por arriba de dicho umbral indica que el sujeto no estuvo en las etapas tempranas de infección, distinguiéndose así entre la infección por VIH temprana contra la establecida en un sujeto.

En una modalidad, el paso (d) comprende determinar la duración media de infección temprana que se correlaciona con el valor SI obtenido en el paso (c) estimando/determinando así la duración de la infección y/o el tiempo de infección.

En una modalidad, la infección viral es una infección retroviral. En una modalidad, el retrovirus es VIH. En otra modalidad, es un retrovirus. En una modalidad, el retrovirus es Alpharetrovirus, el cual, en una modalidad, es un virus de la leucosis aviar o un virus del sarcoma de Rous. En otra modalidad, el retrovirus es un betaretrovirus, el cual, en una modalidad, es un virus de tumor mamario de ratón. En otra modalidad, el retrovirus es un gammaretrovirus, el cual, en una modalidad, es un virus de la leucemia murina o virus de la leucemia felina. En otra modalidad, el retrovirus es un deltaretrovirus, el cual, en una modalidad, es un virus de la leucemia bovina o el virus T-linfotrópico Humano (HTLV) causante de cáncer, el cual, en una modalidad, es HTLV-1, y en otra modalidad, es HTLV-2. En otra modalidad, el retrovirus es un epsilonretrovirus, el cual, en una modalidad, es un virus de sarcoma dérmico de Walleye. En otra modalidad, el retrovirus es un lentivirus, el cual, en una modalidad, es un virus de inmunodeficiencia humana 1, virus de inmunodeficiencia de simio, o virus de inmunodeficiencia felina. En otra modalidad, el retrovirus es un spumavirus, el cual, en una modalidad, es un virus espumoso del simio. En otra modalidad, el retrovirus es un virus de hepatitis C (HCV). En otra modalidad, el retrovirus es un virus de hepatitis E (HEV).

En una modalidad, un virus relacionado con los métodos y equipos de la presente invención es virus xenotropico de la leucemia murina (XMRV). En otra modalidad, el virus es virus de hepatitis A (HAV). En otra modalidad, el virus es virus de hepatitis B (HBV). En otra modalidad, el virus es hepatitis C (HCV). En otra modalidad, el virus es virus de hepatitis D (HDV). En otra modalidad, el virus es hepatitis E (HEV). En otra modalidad, el virus es virus-1 T-linfocítico Humano (HTLV-1). En otra modalidad, el virus es cualquier combinación de los virus descritos aquí anteriormente. En otra modalidad, el virus es virus de hepatitis B (HBV), virus de hepatitis C (HCV), o virus de hepatitis E (HEV).

En otra modalidad, el virus es virus de inmunodeficiencia humana (VIH). En una modalidad, el VIH es VIH-1. En otra modalidad, el VIH es VIH-2. En otra modalidad, el VIH es VIH-0.

En una modalidad, el método además comprende el paso de obtener o recolectar una muestra de sangre de dicho sujeto antes del paso (a).

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el tiempo transcurrido desde una infección microbiana inicial de un sujeto, el método además comprende: (a) determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una muestra de sangre de dicho sujeto, en donde dicha relación es el valor de índice de estimulación (SI), y (b) determinar el tiempo transcurrido desde dicha infección microbiana inicial basándose en el valor SI, en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y el tiempo transcurrido desde dicha infección microbiana.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para distinguir entre infección microbiana temprana contra una establecida en un sujeto, el método comprende determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una muestra de sangre de dicho sujeto, en donde si dicha relación es mayor que una relación de umbral pre-seleccionada, entonces el sujeto tiene una infección temprana con dicho microbio.

En una modalidad, un microbio de la presente invención es un microbio patogénico.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la duración de una infección microbiana en un sujeto, el método comprende: (a) determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una muestra de sangre de dicho sujeto, en donde dicha relación es el valor de índice de estimulación (SI), y (b) determinar la duración de dicha infección microbiana en dicho sujeto basándose en el valor SI, en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y la duración de la infección microbiana.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la duración de un estado seropositivo microbiano en un sujeto, el método comprende: (a) determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una muestra de sangre de dicho sujeto, en donde dicha relación es el valor de índice de estimulación (SI), y (b) determinar la duración del estado seropositivo de un sujeto basándose en el valor SI, en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y la duración del estado seropositivo microbiano.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para estimar el tiempo de seroconversión después de una prueba de anticuerpo seropositivo microbiano en un sujeto, el método comprende: (a) determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una muestra de sangre de dicho sujeto, en donde dicha relación es el valor de índice de estimulación (SI), y (b) estimar el tiempo de seroconversión basándose en el valor SI, en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y el tiempo de seroconversión.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para diagnosticar un estado temprano de seropositividad microbiana en un sujeto, el método comprende determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una muestra de sangre de dicho sujeto, en donde si dicha relación es mayor que una relación de umbral pre-seleccionada, entonces el sujeto es diagnosticado con un estado temprano de seropositividad microbiana.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar la recencia de una infección microbiana en un sujeto, el método comprende: (a) determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una muestra de sangre de dicho sujeto, en donde dicha relación es el valor de índice de estimulación (SI), y (b) determinar la recencia de una infección microbiana en un sujeto basándose en el valor SI, en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y la recencia de la infección microbiana.

En una modalidad, el microbio es un patógeno. En una modalidad, la infección microbiana es una infección viral, la cual, en una modalidad, es una infección retroviral, la cual, en una modalidad, es una infección por Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH).

En otra modalidad, las muestras de sangre se toman de un sujeto al menos en dos puntos de tiempo, los cuales, en una modalidad, tienen 2 semanas de separación, en otra modalidad, 1 mes de separación, en otra modalidad, 2 meses de separación, en otra modalidad, 3 meses de separación en otra modalidad, 4 meses de separación, en otra modalidad, 6 meses de separación, en otra modalidad, 1 año de separación. En una modalidad, el Indice de Estimulación entre dos o más puntos de tiempo es graficado y la pendiente del cambio en el Indice de Estimulación entre los dos o más puntos de tiempo se utiliza para estimar el tiempo de infección.

En otra modalidad, algunos de los métodos de la presente invención comprenden los pasos de: (a) obtener una muestra de sangre de dicho sujeto; (b) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de dicha muestra de sangre, en donde una inmunoreactividad antimicrobiana indica que dicho sujeto está infectado; (c) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (d) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (c) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (b), determinando así un valor de índice de estimulación (SI); y (e) determinar el tiempo transcurrido desde dicha infección microbiana inicial basándose en el valor SI obtenido en el paso (d), en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y el tiempo transcurrido desde una infección microbiana, la duración de la infección microbiana, la duración del estado seropositivo microbiano, el tiempo de seroconversión, estado temprano de infección de una infección microbiana, o una combinación de los mismos.

En otra modalidad, algunos de los métodos de la presente invención comprende los pasos de: (a) obtener una muestra de sangre de dicho sujeto; (b) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de dicha muestra de sangre, en donde una inmunoreactividad antimicrobiana indica que dicho sujeto está infectado; (c) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antimicrobianos u otros productos inmunes in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; (d) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (c) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (b); y (e) determinar si el cociente obtenido en el paso (d) está por arriba de un valor de umbral predeterminado para cada sujeto, en donde un valor por abajo de dicho umbral indica que el sujeto no estuvo en las etapas tempranas de la infección y un valor por arriba de dicho umbral indica que el sujeto estuvo en las etapas tempranas de la infección, distinguiéndose así entre infección microbiana temprana contra la establecida en dicho sujeto, diagnosticando un estado temprano de seropositividad microbiana, o una combinación de los mismos.

En otra modalidad, los métodos de la presente invención pueden ser utilizados para determinar el estado temprano de infección de una infección, en donde la infección es una infección crónica. En una modalidad, la infección crónica es una infección microbiana. En otra modalidad, la infección crónica es una infección viral, la cual, en una modalidad, es una infección retroviral. En otra modalidad, la infección crónica es una infección bacteriana. En una modalidad, una infección crónica se caracteriza por la presencia continua del microbio infeccioso siguiendo la infección inicial. En una modalidad, la infección viral crónica es hepatitis, herpes, mononucleosis infecciosa, o infección por Citomegalovirus (CMV).

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para determinar el estado temprano de infección de una infección microbiana en un sujeto utilizando los métodos aquí descritos. En una modalidad, el sujeto está a un alto riesgo de desarrollar una infección microbiana crónica, la cual, en una modalidad, es VIH. En una modalidad, el sujeto está en riesgo como resultado de un comportamiento particular, el cual, en una modalidad, es uso de fármacos intravenosos, actividad homosexual, actividad bisexual, actividad sexual con múltiples compañeros, recepción de transfusiones sanguíneas, o una combinación de los mismos. En otra modalidad, el sujeto está definido como en alto riesgo por estar viviendo o haber vivido o viajado a través de una ubicación geográfica particular, la cual, en una modalidad, es un continente, una región, un estado, o una ciudad. En otra modalidad, el sujeto tiene un estado médico particular, el cual, en una modalidad, es un hemofílico, un sujeto con una o más enfermedades transmitidas sexualmente, etc.

En una modalidad, el nivel de anticuerpo de virus en una muestra no actividad contra una activada es el valor de Indice de Estimulación (SI). En una modalidad, los valores SI serán medidos con sensibilidad o amplitud variable dependiendo del sistema de detección usado. De esta forma, los valores SI considerados como "elevados", de acuerdo con la presente invención, dependerán del procedimiento preciso utilizado. Los valores SI pueden ser probados contra muestras obtenidas de individuos que se sabe que están en las etapas tempranas de infección con VIH y comparados con muestras similares obtenidas de individuos quienes tienen una infección por VIH establecida, tal como, pero no limitándose a, individuos que se sabe que han sido infectados durante al menos 1 año o así sucesivamente. Después de la comparación de los resultados, un valor SI adecuado puede ser determinado, el cual fácilmente distingue una infección temprana como se define aquí a partir de una infección establecida. La variación de ensayo puede ser controlada al utilizar el valor de un grupo estándar de pares de muestra. Un experto en la técnica fácilmente puede utilizar técnicas estándares para determinar un valor de umbral SI adecuado cuando se utiliza cualquiera de una variedad de métodos para detectar la inmunoreactividad a un antígeno retroviral. En una modalidad, los métodos de la presente invención además comprenden el paso de determinar o estimar un valor de umbral SI, en donde un valor por abajo de dicho umbral indica que el sujeto no estuvo en las etapas tempranas de infección y un valor por arriba de dicho umbral indica que el sujeto estuvo en las etapas tempranas de infección.

En una modalidad, el SI es un valor relativo, el cual, en una modalidad, se mide con relación a otro parámetro medido en la misma muestra de sangre. En una modalidad, el otro parámetro con el cual se compara el valor SI se toma de la alícuota estimulada, la alícuota no estimulada, o de alícuotas tanto estimuladas como no estimuladas. En otra modalidad, el SI es un valor absoluto, el cual, en una modalidad, es el cambio en el nivel de anticuerpo o el cambio en el nivel de anticuerpo comparado con la muestra no estimulada. En otra modalidad, el SI es una combinación de valores absolutos y relativos. En una modalidad, el SI es un valor de un tiempo, significando que es obtenido de una sola muestra de sangre tomada en un punto individual de tiempo. En otra modalidad, los cambios en SI con el tiempo en una o más muestras de sangre adicionales (es decir, distinta a la primera) tomadas en dos o más puntos de tiempo separados se utilizan para determinar el tiempo de infección.

En una modalidad, la detección de "inmunoreactividad" comprende medir secreciones inducidas por antígeno por células B y células T, en donde, en una modalidad, se secretan anticuerpo, citocina, linfocina, o una combinación de los mismos.

En una modalidad, una muestra de la presente invención se obtiene de un fluido corporal, tal como sangre entera fresca, en donde una alícuota individual es activada y el resto de la muestra no es activada, como se describe aquí, o en otra modalidad, una muestra es un par de muestras de plasma, en donde una del par de plasma fue de sangre activada y el otro par de plasma fue de sangre no activada. En una modalidad, el plasma y plasma estimulado son almacenados "apropiadamente", lo cual, en una modalidad, es a una temperatura de 4°C (durante un almacenamiento de corta duración de días), o en otra modalidad, a una temperatura de -20°C o -80°C (durante un almacenamiento de larga duración de más de una semana), así como es bien conocido en la técnica. En una modalidad, el plasma puede ser almacenado durante hasta 2 días. En otra modalidad, el plasma puede ser almacenado durante hasta 7 días. En otra modalidad, el plasma puede ser almacenado durante hasta 14 días. En otra modalidad, el plasma puede ser almacenado durante hasta 1 mes. En otra modalidad, el plasma puede ser almacenado durante hasta 6 meses. En otra modalidad, el plasma puede ser almacenado durante hasta 12 meses. En otra modalidad, el plasma puede ser almacenado durante hasta 6 años.

En una modalidad, el VIH puede ser de cualquier cepa o aislado. Preferiblemente, el VIH se selecciona del grupo que consiste de VIH-1, VIH-2, o una combinación de los mismos.

En una modalidad, el sujeto es un mamífero, el cual, en una modalidad, es un primate, el cual, en una modalidad, es un ser humano.

En una modalidad, un método de la presente invención requiere de la determinación de niveles de anticuerpo antimicrobiano en una muestra de tejido. En una modalidad, la muestra de tejió es una muestra de sangre. En otra modalidad, la muestra de tejido se obtiene de las encías o mejillas del sujeto.

En una modalidad, un método de la presente invención comprende determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una alícuota de una muestra de sangre. En una modalidad, una "alícuota" es una porción de la cantidad total de una muestra de sangre. En una modalidad, las alícuotas utilizadas en los métodos de la presente invención son de volumen o dilución igual. En una modalidad, se utilizan muestras de sangre por duplicado en los métodos de la presente invención. En una modalidad, las primera y segunda alícuotas de una muestra de sangre son porciones de una sola muestra de sangre extraída de un solo sujeto en un solo punto de tiempo.

En otra modalidad, una sola alícuota de la muestra de tejido o de sangre puede ser utilizada para determinar tanto niveles de anticuerpo de "línea de base" como niveles de anticuerpo estimulado, en donde una muestra de tejido, tal como sangre, es extraída en un contenedor que comprende el activador aquí descrito y las células son sedimentadas (a través de una fuerza G regular, o a través de centrifugaciones cortas a baja velocidad). Una alícuota pequeña del sobrenadante de plasma es removida para prueba posterior de los niveles iniciales de VI H/HCV/retrovirus/virus/ patógeno/microorganismo. El resto es incubado con el activador durante varios días. Los niveles de los anticuerpos contra VIH/HCV/ retrovirus/virus/patógeno/microorganismo para la alícuota removida en el Tiempo 0 se mide en el mismo ensayo con una alícuota de sangre o tejido removido después de la incubación. Las dos mediciones son comparadas. En una modalidad, se calcula la delta, en otra modalidad, la relación de señales o niveles, se calcula, en otra modalidad, la relación de IgM a IgG de anticuerpos contra VIH/HCV/retrovirus/virus/patógeno/microorganismo se calcula, etc.

En una modalidad, los métodos de la presente invención comprenden calcular el índice de estimulación (SI) al comparar el valor que representa el nivel de anticuerpo antimicrobiano estimulada obtenido de dicha segunda alícuota y el valor que representa el nivel de anticuerpo antimicrobiano inicial obtenido de la primera alícuota para cada muestra. En una modalidad, el SI se calcula al calcular la relación de niveles de anticuerpo antimicrobiano no estimulado. En otra modalidad, el SI se calcula al calcular la diferencia entre niveles de anticuerpo antimicrobiano estimulado y no estimulado.

De acuerdo con la presente invención, una muestra de sangre se extrae en un tubo de ensayo, el cual, en una modalidad, es un cultivo de tejido tratado, un tubo de vacío, una botella, una cavidad (como parte de una placa de cavidades múltiples o como una placa de cavidad individual) o un matraz, conteniendo una concentración efectiva de una solución de activadores (tales como mitógenos, citocinas, linfocinas, y combinaciones de los mismos como se describe aquí). La muestra de sangre que será probada se cultiva in vitro en presencia de cualquier combinación de activadores de linfocitos para lograr la misma función.

En una modalidad, el paso de determinar inmunoreactividad antimicrobiana comprende realizar un ensayo de anticuerpo en dicha alícuota de dichas muestras de sangre. En una modalidad, un ensayo de anticuerpo comprende exponer cada una de dichas muestras de sangre a un antígeno viral permitiendo así que se forme un complejo inmune de antígeno-anticuerpo y detectando dicho complejo inmune de antígeno-anticuerpo. En una modalidad, la detección del complejo inmune de antígeno-anticuerpo es semi-cuantitativa.

En una modalidad, un antígeno es un compuesto, composición, o substancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de célula T en un sujeto, incluyendo composiciones que son inyectadas o absorbidas en el sujeto. Un antígeno reacciona con los productos de inmunidad humoral o celular específicos, incluyendo aquellos inducidos por inmunógenos heterólogos. El término "antígeno" incluye todos los epítopos antigénicos relacionados. El "epítopo" o "determinante antigénico" se refiera a un sitio sobre un antígeno al cual responden las células B y/o T. En una modalidad, las células T responden al epítopo, cuando el epítopo es presentado junto con una molécula MHC, o un péptido independiente, o unido. Los epítopos pueden ser formados a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegado terciario de una proteína. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más usualmente, al menos 5, alrededor de 9, o aproximadamente 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

En una modalidad, un péptido tiene una longitud de 6-200 aminoácidos. En otra modalidad, un péptido es de 2-50 aminoácidos. En otra modalidad, un péptido es de 15-50 aminoácidos. En otra modalidad, un péptido es de 1-100 aminoácidos. En otra modalidad, un péptido es de 3-30 aminoácidos. En otra modalidad, un péptido es de 5-20 aminoácidos.

En una modalidad, dicho antígeno se agrega a dicho cultivo para reducir el tiempo de incubación y/o para proporcionar diagnóstico in situ. En otra modalidad, el complejo inmune de antígeno-anticuerpo es detectado sobre un soporte de fase sólida, vehículo, o base sólida, el cual, en una modalidad, es una tira de nitrocelulosa, un grupo de perlas marcadas o de color, o cualquier otro vehículo. En una modalidad, el vehículo puede comprender perlas con diferentes densidades, tamaños, etiquetas, colores, fluorescencia, como es conocido en la técnica.

Después de la incubación, se toma una alícuota del sobrenadante y después se analiza para la presencia de anticuerpos deseados utilizando procedimientos estándares de ELISA y/o EIA y/o cualquier otro sistema de detección de anticuerpo semi-cuantitativo, el cual, en una modalidad, es una quimioluminiscencia, o sistema de circuito. En una modalidad, el ensayo es un inmunoensayo de enzima (EIA) incluyendo el ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas, ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA), ensayo de aglutinación de partícula o ensayo de inmunofluorescencia (IFA).

En una modalidad, el ensayo de anticuerpo es un ensayo con inmunoabsorbente ligado a enzimas, una tinción, un ensayo de quimioluminiscencia, un ensayo de luminiscencia, o un ensayo de inmunofluorescencia, un arreglo de péptido-circuito, o un arreglo de circuito de anticuerpo. En una modalidad, el ensayo de anticuerpo es cualquier ensayo semi-cuantitativo para anticuerpos de VIH conocidos en la técnica, total o específico.

Si la muestra va a ser analizada en una fecha posterior, el fluido de sobrenadante puede ser recolectado, congelado y almacenado.

Técnicas Generales: A menos que se indique otra cosa, las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándares, bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican a través de la literatura en fuentes tales como, Ed Harlow y David Lañe (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora), y se incorporan aquí para referencia.

Métodos Generales para Detectar una Infección por VIH: Se han desarrollado muchas técnicas para detectar una infección por VIH. Al menos algunos de estos procedimientos están comercialmente disponibles en forma de "equipo" (kit). Muchas de las técnicas generalmente se describen en HIV: A Practical Approach (Volumen 1: Virology and Immunology. Ed. Jonathan Karn, IRL Press); AIDS Testing: A comprehensive guide to technical, medical, social, legal, and management issues (Ed. Gerald Schochetman and J. Richard George. 2.sup.nd Edición. Springer-Verlag, 1994); Gallo et al. (1986) y Mylonakis et al. (2000). Una revisión de al menos algunas de estas técnicas se proporciona a continuación. Además, al menos algunas de estas técnicas, incluyendo aquellas de la invención reclamada, pueden ser fácilmente adaptadas para ser realizadas utilizando nanocristales tales como aquellos descritos en WO 00/27365, Patente de E.U.A. No. 6,207,392, Nolan y Sklar (2002), y Han et al (2001).

Metodología de Inmunoensayo con enzima (EIA) o Ensayo con Inmunoabsorbente Ligado a Enzima (ELISA): Se han utilizado sistemas de detección de ELISA por rutina en ElAs durante muchos años en la detección de infección por VIH al mostrar la presencia de anticuerpos anti-VIH. Además, existen muchos fabricantes autorizados de ElAs y ELISAs para detectar el anticuerpo para VIH. La sensibilidad de ElAs de tercera generación está cerca del 100% cuando cualquier anticuerpo anti-VIH está presente en sangre periférica. Si embargo, estos ensayos no pueden diferenciar entre las etapas tempranas de infección e infección establecida.

La metodología de EIA involucra los siguientes pasos. Los antígenos de VIH se purifican del lisado viral, preparados a través de tecnología de ADN recombinante o síntesis de péptido y se revisten sobre las cavidades de placas de micro cavidad o sobre otras matrices tales como perlas para formar la "fase sólida" del ensayo. El suero de un individuo se agrega a la cavidad. El anticuerpo, si está presente, reacciona con el antígeno, y los otros contenidos de la cavidad después son lavados. A la cavidad se agrega un reactivo indicador que consiste de un anticuerpo anti-humano unido a una enzima u otro sistema de detección. Si el suero contuvo anticuerpos específicos a VIH, estos permanecerán unidos al antígeno de fase sólida, y el anticuerpo anti-humano conjugado a enzima se unirá a estos anticuerpos y de esta manera a la fase sólida. Después sigue otro paso de lavado. Si el cuero del individuo contiene anticuerpo para VIH, la enzima permanece unida a través del anticuerpo a la fase sólida y está disponible para catalizar una reacción de producción de color cuando se agrega a la cavidad un substrato apropiado. El cambio de color se mide en un espectrofotómetro. Los valores de absorbancia por arriba de un valor de corte calculado a partir de muestras de control se consideran reactivos. Dentro de la escala lineal (o reactiva) del ensayo, los valores de absorbancia están directamente relacionados con los niveles de anticuerpos en la muestra probada.

Esta metodología básica ha sido adaptada para abarcar una amplia variedad de formatos de ensayo incluyendo, ensayos de captura tanto de antígeno como de anticuerpo, así como también ensayos de competencia de antígeno y anticuerpo.

Transferencias Inmunológicas - Tinciones Western y otra tinción de antígeno: Las tinciones son otra forma de EIA que han sido comercialmente utilizadas para establecer la presencia de anticuerpos anti-VIH verdaderos. Están disponibles varios equipos comercialmente producidos. Se pueden utilizar ciertas tinciones en una forma semi-cuantitativa.

Ensayos de Aglutinación de Partícula: Se han empleado partículas de látex marcadas con antígeno o anticuerpo, Sepharose, microcápsulas de poliuretano, oro coloidal o glóbulos rojos para producir una amplia variedad de ensayos de inmuno-aglutinación. Las partículas pueden ser obtenidas comercialmente con una gran escala de químicas de superficie permitiendo una gran flexibilidad cuando se acoplan entre sí ya sea al anticuerpo o al antígeno. Estas técnicas típicamente se utilizan en formatos de ensayo rápido que usualmente son clasificados en forma visual, pero también están adaptados a automatización y semi-cuantificación.

Ensayo de Inmunof luorescencia (IFA): El IFA para VIH-anticuerpo es más técnicamente demandante y más costoso que las tinciones Western. Ya que virtualmente todos los antígenos presentes en una célula infectada están disponibles para reacción con el espécimen de prueba, es un ensayo muy sensible. Es un procedimiento familiar para muchos laboratorios ya que se utiliza para detectar anticuerpos para una amplia variedad de antígenos virales y bacterianos.

Básicamente, la técnica involucra los siguientes pasos. Una suspensión de un cultivo de célula de linfocito infectado con VIH se coloca sobre un portaobjetos de microscopio, se seca con aire, y se fija en acetona o metanol. Se agregaron células de control no infectadas a la suspensión o se colocaron en manchas separadas sobre el portaobjetos para proporcionar un medio para detectar reacciones no específicas (portaobjetos fijos hechos en lotes grandes y almacenados congelados o desecados). Se agregaron sueros de prueba diluidos a las manchas de célula, el portaobjetos se lavó, se incubó de nuevo con globulina anti-humana conjugada con fluoresceína, se lavó de nuevo, y después se inspeccionó para fluorescencia de fluoresceína utilizando un microscopio ultravioleta.

La fluorescencia localizada típica de células infectadas ocurre después de la reacción con sueros positivos. Se reconocieron reacciones no específicas (tales como aquellas causadas por anticuerpos antinucleares) debido a la fluorescencia en células de control no infectadas.

Radioinmunoprecipitación: El ensayo de radioinmunoprecipitación se utiliza principalmente en investigación. En general es demasiado técnicamente demandante para uso de rutina en laboratorios clínica. La radioinmunoprecipitación es especialmente sensible a las glicoproteínas de envoltura mayor de peso molecular superior, gp160 y gp120, de la cuales carecen de algunas técnicas de tinción Western. El principio de RIPA involucra unión competitiva del antígeno radiomarcado y el antígeno no marcado a un anticuerpo de alta afinidad. El antígeno generalmente es marcado con un isótopo emisor de gamma tal como .sup.1251. El antígeno marcado se mezcla con el anticuerpo a una concentración que justo satura los sitios de unión de antígeno de la molécula de anticuerpo, y después se agregan cantidades en aumento de antígeno no marcado de concentración desconocida. El anticuerpo no distingue el antígeno marcado del no marcado, y de esta forma los dos tipos de antígeno compiten para sitios de unión disponibles en el anticuerpo. Con concentraciones en aumento del antígeno no marcado, más antígeno marcado será desplazado desde los sitios de unión. Al medir la cantidad de antígeno marcado libre en solución, es posible determinar la concentración del antígeno no marcado.

En una modalidad, los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan aquí intercambiablemente. Estos términos son bien entendidos por aquellos expertos en el campo, y se refieren a una proteína glicosilada (que comprenden porciones de azúcar) que consiste de uno o más polipéptidos que específicamente unen un antígeno. Una forma de anticuerpo constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Esta forma es un tetrámero y consiste de dos pares idénticos de cadenas de anticuerpo, cada par teniendo una cadena ligera y una cadena pesada. En cada par, las regiones variables de cadena ligera y pesada juntas son responsables de unión a un antígeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras de anticuerpo.

El término "anticuerpo" también incluye molécula conteniendo proteína o péptido que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como, pero no limitándose a, una región determinante de complementariedad (CDR) de una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región de estructura de trabajo, o cualquier porción de las mismas. Dependiendo de la secuencia de aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar anticuerpos intactos a diferentes "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varas de éstas además pueden ser divididas en "subclases" (isotipos), por ejemplo, I gG , lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 25 kDa o aproximadamente 214 aminoácidos) comprenden una región variable de aproximadamente 110 aminoácidos en el término NH2 y una región constante kappa o lambda en el término COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 50 kDa o aproximadamente 446 aminoácidos), similarmente comprenden una región variable (de aproximadamente 116 aminoácidos) y una de las regiones o clases constantes de cadena pesada antes mencionadas, por ejemplo, gamma (de aproximadamente 330 aminoácidos). Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes calases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

En una modalidad, un "antígeno" incluye una proteína retroviral de longitud completa, un derivado de una proteína retroviral de longitud completa, tal como, pero no limitándose a, un fragmento de proteína o un péptido que comprende una secuencia de aminoácido que corresponde a una parte o partes de una proteína retroviral de longitud completa, incluyendo cualquier fragmento modificado o péptido sintético teniendo un ligando unida al mismo.

En una modalidad, el paso de estimulación en los métodos de la presente invención comprende incubar una segunda alícuota de las muestras de sangre del sujeto en un medio que comprende uno o más activadores de células de virus específicas. En una modalidad, el paso de estimulación comprende inducir una activación policlonal de células mononucleares de sangre periférica. En una modalidad, el paso de estimulación comprende inducir una activación específica de VIH de células mononucleares de sangre periférica. En otra modalidad, el paso de estimulación comprende inducir una activación policlonal de linfocitos. En una modalidad, las células de virus específicas con linfocitos B. En otra modalidad, las células de virus específicas con linfocitos T.

En una modalidad, una muestra de sangre activada comprende tanto anticuerpos producidos in vivo como anticuerpos producidos mediante estimulación in vitro.

En una modalidad, un activador es un estimulante. En una modalidad, una alícuota es estimulada, mientras en otra modalidad, es activada.

En una modalidad, el activador de la presente invención estimula la sangre para producir anticuerpos antimicrobianos, mientras que en otra modalidad, el activador estimula la sangre para secretar anticuerpos antimicrobianos.

En una modalidad, un "activador" para usarse en las composiciones y métodos de la presente invención es una substancia que induce la activación de células B y/o células T, y estas células pueden ser cebadas in vivo, o en el estado de blastos, o como células de memoria en la muestra de sangre. En una modalidad, la substancia es una proteína, mientras en otra modalidad, es un péptido, una molécula de ácido nucleico, una glicoproteína, etc. En una modalidad, la "activación" de células comprende inducir la proliferación de células, diferenciación de células, mejora de actividad celular (en una modalidad, producción de anticuerpo), secreción de varias linfocinas y/o citocinas, o una combinación de los mismos.

En una modalidad, el activador para usarse en las composiciones y métodos de la presente invención activa células no secretoras, en una modalidad, o células no totalmente activadas, en otra modalidad, o células totalmente diferenciadas, en otra modalidad, o células de memoria, en otra modalidad.

En una modalidad, el activador es un mitógeno. En una modalidad, un "mitógeno" es una substancia química, o una mezcla de substancias. En una modalidad, el mitógeno es una substancia bioquímica, o una mezcla de substancias bioquímicas. En una modalidad, un mitógeno es una o más proteínas, glicoproteína, o una combinación de varias proteínas y glicoproteínas con o sin otras porciones bioquímicas, que fomenta a una célula a comenzar la división celular, activando la mitosis. En una modalidad, un mitógeno activa trayectorias de transduccion de señal en donde la proteína ciña activada por mitógeno está involucrada, conduciendo a la mitosis. En una modalidad, los mitógenos de la presente invención se utilizan para inducir mitosis, diferenciación, o una combinación de los mismos, en células B de memoria, o células B cebadas por virus y/o células T cebadas por virus. En una modalidad, los mitógenos de la presente invención se utilizan para inducir la formación de células blásticas o precursoras, de células B de diferenciación y/o células B de memoria cebadas. En otra modalidad, los mitógenos de la presente invención se utilizan para inducir la formación de células plasmáticas o plasmocitos de células B y/o células B de memoria, cebadas, "silenciadas" o "toleradas".

En una modalidad, el activador de las composiciones y métodos de la presente invención induce la activación de células B o T no secretoras que son específicas para el virus de interés. En otra modalidad, el activador de la presente invención induce la expresión de anticuerpos específicos virales. En otra modalidad, el activador de la presente invención induce la transferencia de células B no secretoras a células B secretoras, las cuales, en una modalidad, son células blásticas o plasmáticas.

En una modalidad, un activador usado en los métodos y equipos de la presente invención mejora la división de célula blástica, la cual, en una modalidad, mejora la producción de anticuerpos y, en otra modalidad, mejora la diferenciación de células B en células plasmáticas. En otra modalidad, un activador usado en los métodos y equipos de la presente invención mejora la división de células blásticas, mejora la producción de anticuerpos, mejora la diferenciación de células B, en células plasmáticas, o una combinación de los mismos. En una modalidad, las células B blásticas activadas secretan el anticuerpo y experimentan división de célula. En una modalidad, las células plasmáticas secretan el anticuerpo y no proliferan.

En una modalidad, se utilizan antígenos virales junto con activadores para inducir la activación de células B no secretoras. De esta manera, en una modalidad, las composiciones de la presenten invención además comprenden uno o más antígenos específicos para el virus de interés que, en una modalidad, ayuda o mejora la transferencia de células B y/o T no secretoras a células B y/o T secretoras, que, en una modalidad, son células blásticas o plasmáticas. Similarmente, los métodos de la presente invención pueden comprender incubar una muestra de sangre en un medio que contiene uno o más mitógenos y uno o más antígenos virales.

En un aspecto relacionado, el activador utilizado en la invención aquí provista puede ser ya sea dependiente de célula T o independiente de célula T. En una modalidad, el activador usado en las composiciones y métodos de la presente invención actúa como células T, células B, o tanto células T como células B. En un aspecto relacionado, el activado usado para inducir la activación de células B no secretoras y la expresión de anticuerpos específicos de virus es un mitógeno, el cual, en una modalidad, es mitógeno de hierba de carmín (fitolaca), el cual, en una modalidad, estimula tanto células B como T. Se pueden utilizar otros mitógenos en la práctica de la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, lectinas, tales como concanavalina A, la cual, en una modalidad actúa sobre células T; endotoxinas bacterianas, las cuales, en una modalidad, es lipopolisacárido (LPS), el cual, en una modalidad, actúa sobre células B. En otra modalidad, el mitógeno es fitohemaglutinina (PHA), la cual, en una modalidad, actúa en células T. En otra modalidad, el mitógeno es leucoaglutinina (PHA-L), mientras que en otra modalidad, el mitógeno es aglutinina de Pisum sativum (PSA).

En otra modalidad, el activado usado en la composición y métodos de la presente invención es una citocina, la cual, en una modalidad, es una molécula de señalización secretada por células específicas del sistema inmunológico y células gliales. En una modalidad, dicha citocina es una interleucina o interferón. En una modalidad, la citocina es una linfocina. En una modalidad, dicha linfocina es Interleucina 1, Interleucina 2, Interleucina 3, Interleucina 4, Interleucina 5, Interleucina 6, Interleucina 10, Interleucina 12, factor estimulante de colonia de granulocito-macrófago, Interferón-gamma, TNF (factor de necrosis tumoral), o una combinación de los mismos.

En otra modalidad, el activador usado en la composición y métodos de la presente invención es un lípido A bacterialmente derivado, un péptido derivado viral, un virus, un agente biológico, un reactivo anti-inmunoglobulina, un anticuerpo contra un dominio celular de linfocito B y/o T, o una combinación de los mismos. En otra modalidad, el activador usado en la composición y métodos de la presente invención es un péptido derivado viral, lectina, endotoxina bacteriana, un virus, lípido A, una citocina, o una linfocina. En otra modalidad, el activador puede ser una combinación de los activadores aquí descritos. En una modalidad, el activador es un péptido derivado microbiano, proteína, glicoproteína, lipoproteína, etc. En una modalidad, el péptido derivado microbiano, proteína, glicoproteína, o lipoproteína es un péptido derivado viral, proteína, glicoproteína o lipoproteína.

En un aspecto relacionado, la estimulación de las células se logra al utilizar anticuerpos contra dominios de membrana celular. En otra modalidad, las células son estimuladas al utilizar anticuerpos contra un dominio celular de linfocito B, el cual, en una modalidad, es un dominio celular de linfocito B de membrana. En una modalidad, el anticuerpo es anti-lgD, el cual, en una modalidad, es expresado en membrana por: células B ingenuas, células B inicialmente cebadas, y células de memoria. En una modalidad, las células plasmáticas no expresan la IgD de membrana. En una modalidad, las células B cebadas que no han sido totalmente diferenciadas a células plasmáticas pueden ser estimuladas o activadas al ponerlas en contacto con anti-IgD. En otra modalidad, el anticuerpo en anti-IgM. En otra modalidad, el anticuerpo está dirigido contra un dominio celular de célula B (CD). En otra modalidad, el anticuerpo está dirigido contra un CD de célula T.

En una modalidad, el dominio celular de linfocito B de membrana es IgG, IgA, IgE, CD19, o cualquier otra estructura de membrana/dominio conocido en la técnica. En otra modalidad, el dominio celular de linfocito B de membrana es CD21 o CD81.

En otra modalidad, el anticuerpo para usarse en los métodos y composiciones de la presente invención comprende anti-IgD, anti-IgG, anti-lgA, anti-lgE, o anti-CD19, o anti-CD10, anti-CD23, anti-CD25, y anti-CD40.

En otra modalidad, la clase de anticuerpo usada para estimular una célula no secretora incluye, pero no se limita a, un anticuerpo de la clase IgG, IgD, IgA, o IgE.

En otro aspecto, la estimulación de células B no secretoras, las cuales en una modalidad, son células de memoria, a células B secretoras, las cuales, en una modalidad, son células blásticas o plasmáticas da como resultado la transformación de la célula a una célula blástica o plasmática de secreción de anticuerpo, por lo que la célula blástica o plasmática secreta anticuerpos específicos de antígeno.

En u n aspecto relacionado, el linfocito B de los métodos aquí provistos es una célula linfocítica B no secretora. En otro aspecto relacionado, el linfocito T es una célula linfocítica T no secretora. En otro aspecto adicional relacionado, el activador aquí provisto activa una célula linfocítica B no totalmente activada. En otra modalidad, el activador activa una célula linfocítica T no totalmente activada, y en otra modalidad, el activador activa células tanto T como B.

En una modalidad, la determinación de infección temprana de la presente invención tiene una tasa de temprana falsa baja. En una reciente temprana, la tasa está por abajo del 5%. En otra modalidad, la tasa de temprana falsa está por abajo del 4%. En otra modalidad, la tasa de temprana falsa está por abajo del 3%. En otra modalidad, la tasa de temprana falsa está por abajo del 2%. En otra modalidad, la tasa de temprana falsa está por abajo del 1%.

En otra modalidad, la determinación de infección temprana de la presente invención tiene una alta duración de infección temprana media. En una modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 1 año. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 11 meses. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 10 meses. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 9 meses. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 8 meses. E n otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 7 meses. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 6 meses. E n otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 5 meses. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 4 meses. E n otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 3 meses. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 2 meses. E n otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 1 mes. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 70 días. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 60 días. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 45 días. En otra modalidad, la duración de recencia m edia es aproximadamente 30 días. En otra modalidad, la duración de infección temprana media es aproximadamente 14 días. De esta manera, en una modalidad, una infección será clasificada como temprana para propósitos de diagnóstico si ocurrió dentro de los marcos de tiempo descritos aquí anteriormente.

En una modalidad, el SI se calcula solo para sujetos quienes han experimentado seroconversión. En una modalidad, el SI se calcula solo para sujetos cuya muestra de sangre no estimulada (en una modalidad, la primera alícuota) dio resultados por arriba del corte del ensayo de anticuerpo anti-retroviral.

En una modalidad, se determina la infección temprana media de infección por virus en dicha población. De acuerdo con este aspecto y en una modalidad, el estado de infección temprana para cada muestra en días, semanas, meses, o años se calcula basándose en la relación de niveles de anticuerpo anti-retroviral estimulado a no estimulado, y la infección temprana media de la población es calculada como es conocido en la técnica.

En una modalidad, se selecciona un umbral SI que proporcione una tasa baja de determinación de infección temprana falsa (es decir, alta especificidad de diagnóstico). En una modalidad, el umbral SI es de 1.5. En otra modalidad, el umbral SI es de 1.4. En otra modalidad, el umbral SI es de 1.3. En otra modalidad, el umbral SI es de 1.2. En otra modalidad, el umbral SI es de 1.1. En otra modalidad, el umbral SI es de 1.0. En otra modalidad, el umbral SI es de 0.95.

En una modalidad, el dispositivo que utiliza una tecnología de estimulación inmunológica es un tubo de cultivo de tejido comercialmente disponible con un medio especial que mejora la producción de anticuerpo in vitro en una muestra de sangre entera. En cuanto existan, por ejemplo, células B cebadas por VIH en la sangre (es decir, dentro de los días de la infección por VIH), es posible obtener anticuerpos anti-VIH producidos por ellas in vitro, a niveles detectables mediante los equipos actualmente disponibles. La serología actual mide los niveles de anticuerpos específicos de VIH en la muestra de sangre. Estos niveles son de anticuerpos producidos in vivo. El pre-tratamiento de la muestra de sangre en el tubo de cultivo produce una muestra de plasma que la contiene, además de los anticuerpos ya en el plasma, los anticuerpos producidos in vitro, durante el paso de cultivo. Los anticuerpos contra VIH pueden ser inducidos in vitro (producidos por células B cebadas de VIH) dentro de los días posteriores a la infección y antes de su aparición/detección en la sangre. Esto permita una detección más temprana de la infección, utilizando los ensayos y equipos actualmente disponibles para la detección de anticuerpo. De esta forma, el uso del plasma estimulado como la muestra de prueba proporciona una mejor medida de prevalencia. Se han conducido estudios clínicos en varios países alrededor del mundo mostrando una sensibilidad de diagnóstico mejorada al utilizar plasma estimulado.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo (kit) para determinar el tiempo transcurrido desde una infección microbiana inicial de un sujeto, que comprende: dos contenedores de alícuota para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos específicos microbianos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos microbianos, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar el tiempo transcurrido desde una infección microbiana inicial de un sujeto, que comprende: dos contenedores de alícuota para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos no específicos, un ensayo para la detección de uno o más productos de dichos linfocitos, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar el tiempo transcurrido desde una infección microbiana inicial de un sujeto, que comprende: dos contenedores de alícuota para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos microbianos específicos o no específicos, un ensayo para la detección de uno o más productos de dichos linfocitos, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para distinguir entre una infección microbiana temprana contra una establecida en un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de microbianos específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos microbianos específicos, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para distinguir entre una infección microbiana temprana contra una establecida en un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos no específicos, un ensayo para la detección de uno o más productos de dichos linfocitos, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para distinguir entre una infección microbiana temprana contra una establecida en un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos microbianos específicos, linfocitos no específicos, o una combinación de los mismos, un ensayo para la detección de uno o más productos de dichos linfocitos, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar el tiempo transcurrido desde una infección viral inicial de un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos virales específicos o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos virales, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para distinguir entre una infección viral temprana contra una establecida en un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos virales específicos o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos virales específicos, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar el tiempo transcurrido desde una infección retroviral inicial de un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos retrovirales específicos o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos retrovirales específicos, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para distinguir entre una infección retroviral temprana contra una establecida en un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos retrovirales específicos o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos retrovirales específicos, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para determinar el tiempo transcurrido desde una infección por Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) inicial de un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos de VIH específicos o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de VIH, e instrucciones de uso.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para distinguir entre una infección por Virus de I nmunodeficiencia Humana (VIH) temprana contra establecida de un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos de VIH específicos o no específicos, un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de VIH, e instrucciones de uso.

En una modalidad, los equipos de la presente invención pueden comprender una combinación empacada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para llevar a cabo un método de la invención. En una modalidad, el equipo puede comprender reactivos adecuados para detectar un antígeno microbiano marcado. Por ejemplo, cuando la marca es una enzima, el equipo incluirá substratos y co-factores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de substrato, el cual proporcione el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizadores, reguladores de pH, y similares. Las cantidades relativas de los varios reactivos pueden ser variadas ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que substancialmente optimizan la sensibilidad del ensayo. Los reactivos pueden ser provistos como polvos secos, usualmente líof ilizados, incluyendo excipientes, los cuales en disolución, proporcionarán una solución de reactivo teniendo la concentración apropiada.

El antígeno microbiano para usarse en los equipos de la presente invención puede ser provisto/obtenido de cualquier fuente conocida en la técnica. Por ejemplo, el antígeno microbiano puede ser producido utilizando métodos recombinantes tales como aquellos conocidos en la técnica. Alternativamente, el antígeno microbiano puede ser comprado de un proveedor comercial.

En una modalidad, el contenedor del equipo de la presente invención es para retener muestras de tejido, o en otra modalidad, mantener, procesar, almacenar, contener o recolectar muestras de tejido.

También se pueden proporcionar equipos que sean útiles como un control positivo para los ensayos de diagnóstico. Para aislamiento y purificación de anticuerpos antivirales, el equipo puede contener proteínas/antígenos virales acoplados a perlas (por ejemplo, perlas de Sepharose u otras nano-estructuras). Se pueden proporcionar equipos, los cuales contienen los anticuerpos para la detección y cuantificación de anticuerpos antivirales in vitro, por ejemplo, en ELISA, micro-arreglo de péptido, circuito de laboratorio, bio-circuito, circuito basado en nano o una tinción Western. Como con el artículo de fabricación, el equipo comprende un contenedor y una etiqueta o marca o inserto de paquete en o asociado con el contenedor. El contenedor mantiene una composición que comprende al menos un antígeno reconocido por los anticuerpos antivirales. Se pueden incluir contenedores adicionales que contengan, por ejemplo, diluyentes y reguladores de pH, anticuerpos de control. La marca o inserto de paquete puede proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el uso in vitro o de diagnóstico, pretendido.

En ciertas modalidades, los equipos pueden ser suministrados con materiales de instrucción. Las instrucciones pueden estar impresas sobre papel u otro substrato, y/o pueden se suministradas como un medio legible electrónico, tal como un disco flexible, mini-CD-ROM, CD-ROM, DVD-ROM, disco Zip, videocinta, cinta de audio, y similares. Las instrucciones detalladas no pueden estar físicamente asociadas con el equipo; más bien, un usuario puede ser dirigido a un sitio web de Internet especificado por el fabricante o distribuidor del equipo.

En una modalidad, una infección vira puede ser detectada utilizando un equipo de diagnóstico. En una modalidad, el equipo de diagnóstico es una actualmente disponible. En una modalidad, un equipo de la presente invención puede ser utilizado junto con un equipo de diagnóstico para una infección viral particular. En otra modalidad, se puede utilizar un equipo de la presente invención junto con un equipo de diagnóstico actualmente disponible para una infección viral.

El método de la presente invención incluye separar opcionalmente los hematocitos de la porción de fluido de la sangre de manera que la presencia de anticuerpos, o la presencia de células de producción de anticuerpo puede ser determinada. La separación de los hematocitos de la porción de fluido de la sangre puede ser realizada a través de varios métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, incluyendo centrifugación o sedimentación dependiente de densidad. En una modalidad, los hematocitos no son físicamente separados del fluido. En otra modalidad, se pueden separar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), linfocitos B y linfocitos T de la sangre antes del cultivo y el ensayo. Los métodos de enriquecimiento de célula B y célula T son bien conocidos en la técnica y pueden ser realizados a través de métodos que incluye, pero no se limitan a, sedimentación dependiente de densidad, y/o clasif icación/FACS de célula. Después de la incubación del tejido con el mitógeno, el fluido de la parte superior de la sangre puede ser fácilmente extraído y probado para anticuerpos. Opcionalmente, los glóbulos rojos pueden ser Usados ya sea a través de choque osmótico moderado o con un detergente moderado. De esta manera, los glóbulos blancos permanecer viables. Otro método podría ser sedimentar los glóbulos blancos a través de densidad, o gradiente de densidad.

En general, los resultados de una prueba o ensayo de acuerdo con la invención pueden ser presentados en cualquiera de una variedad de formatos. Los resultados pueden ser presentados en una manera cualitativa. Por ejemplo, el reporte de prueba puede indicar solo si un anticuerpo de virus específico fue o no detectado, tal vez también con una indicación de los límites de detección. Los resultados pueden ser presentados en una forma semi-cuantitativa. Por ejemplo, se pueden definir varios rangos, y a los rangos se les pueden asignar una clasificación (por ejemplo, 1+ a 4 + ) que proporciona un cierto grado de información cuantitativa. Dicha clasificación puede reflejar varios factores, por ejemplo, el número de virus detectados, la intensidad de la señal (la cual puede indicar el nivel de expresión de célula B o células T de virus específicas), etc. Los resultados pueden ser presentados en una forma cuantitativa, por ejemplo, como un porcentaje de células en donde se han detectado los anticuerpos de virus específicos, como una concentración de anticuerpo viral específico (según determinado a través de un ensayo diferente de unión/detección de anticuerpo), etc. Como se apreciará por un experto en la técnica, el tipo de resultado provisto por una prueba variará dependiendo de las limitaciones técnicas de la prueba y la importancia biológica asociada con la detección.

En una modalidad de la presente invención, se recolecta sangre entera en un tubo de recolección de sangre conteniendo un medio de cultivo y mitógeno. Las muestras de sangre después se incuban con una dilución final de aproximadamente 1:50-1:500 de mitógeno de hierba de carmín a una concentración de 0.1-2 x 106 células viables por mi durante cuatro días a 37°C en una atmósfera humedecida con C02 al 3-10%. La sangre después es centrifugada y el fluido de sobrenadante es recolectado y analizado dentro de aproximadamente 24 horas para anticuerpos reactivos a través de ELISA, flujo lateral, y/o técnicas de tinción. En la alternativa, una alícuota de fluido puede ser tomada directamente de la muestra. Cada muestra debe ser clasificada para anticuerpo a través de flujo latera (prueba Rápida) o ELISA primero, después las muestras consideradas como positivas pueden ser sometidas a una prueba adicional, por ejemplo, análisis de tinción.

En una modalidad, los métodos de la presente invención comprenden los pasos descritos. En otra modalidad, los métodos de la presente invención consisten esencialmente de los pasos descritos. En otra modalidad, los métodos de la presente invención consisten de los pasos descritos. En una modalidad, las composiciones de la presente invención, las cuales, en una modalidad, son equipos comprenden los elementos descritos. En otra modalidad. Las composiciones de la presente invención, las cuales, en una modalidad, son equipos consisten esencialmente de los elementos descritos. En otra modalidad. Las composiciones de la presente invención, las cuales, en una modalidad, son equipos consisten de los elementos descritos.

En una modalidad, los métodos y equipos de la presente invención pueden ser utilizados junto con otros métodos para determinar la recencia de una infección microbiana conocida en la técnica.

EJEMPLO 1 Prueba para Infección Reciente por VIH Utilizando Dispositivos de Estimulación Una infección por VIH que está en su Período de Ventana Seronegativa, principalmente el período entre la adquisición de la infección y el tiempo de seroconversión al cual los niveles de anticuerpo han alcanzado niveles medibles, es indetectable a través de pruebas de diagnóstico tales como un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)/inmunoensayo de enzima (EIA). Para mitigar el efecto de este Período de Ventana Seronegativa para producir resultados negativos falsos, se desarrollaron métodos de estimulación y/o dispositivos de estimulación para mejorar la detección de anticuerpo cuando se utilizan pruebas de diagnóstico de VIH existentes. Los métodos de estimulación y/o dispositivos de estimulación de innovación estimulan células inmunes específicas cebadas in vivo para producir anticuerpos in vitro, dando como resultado niveles de anticuerpo que alcanzan niveles detectables más rápido después de la infección, y de esta forma reduciendo el Período de Ventana Seronegativa, como se ilustra en la Figura 1.

Una característica no esperada de los métodos de estimulación y/o dispositivos de estimulación es que los niveles incrementados de anticuerpo en un espécimen de sangre incubados en métodos de estimulación y/o dispositivos de estimulación se compararon con atenuaciones de especímenes de sangre de control con el tiempo después de la seroconversión (Figura 1). La comparación de los niveles de anticuerpo en plasma y plasma estimulado puede conducir a distinguir la seroconversión reciente de infecciones mas antiguas, por el aumento en niveles de anticuerpo encontrado en el plasma estimulado (el Indice de Estimulación). Los niveles incrementados de anticuerpo en las etapas tempranas de seroconversión se derivan a partir del hecho de que la producción de anticuerpo in vivo no es a toda fuerza, y de esta manera la activación adicional in vitro conduce a niveles más altos de anticuerpos en el plasma estimulado. Posteriormente, la activación inmunológica y producción de anticuerpo están a tales altos niveles en el cuerpo que los niveles de anticuerpos medidos en el plasma estimulado no difieren de aquellos en el plasma regular.

Por lo tanto, el Indice de Estimulación (SI), definido en una modalidad como la relación de niveles de anticuerpos estimulados y no estimulados, medido a través de un ensayo semi-cuantitativo puede ser utilizado como un biomarcador novedoso para probar etapas tempranas de infección.

Hasta la fecha, no ha habido ensayos desarrollados para determinar/estimar el tiempo de infección (ITT) y/o que tan temprana es la etapa de infección en el momento del primer resultado de prueba seropositiva y diagnóstico de infección. En la definición de infección temprana, existen ventajas y desventajas adversas entre las características de funcionamiento, y la Duración Media de Infección Temprana puede experimentar baja especificidad (o alta tasa de diagnóstico de temprana falsa). El análisis presentado tanto de la tasa de diagnóstico de temprana falsa como de Duración Media de Infección Temprana, consideradas juntas, sugiere que una ITT, de utilidad en el diagnostico de infección temprana y determinación del tiempo de infección, se puede lograr utilizando métodos de estimulación y/o dispositivos de estimulación como se describe aquí o aquellos conocidos en la técnica. Estos resultados prometedores sugieren un ensayo fundamentalmente nuevo, utilizando un nuevo tipo de biomarcador para construir Pruebas de Tiempo de Infección (ITT) para el diagnóstico de infección temprana y determinación de tiempo de infección, y soportan una ampliación del espectro de biomarcadores convencionalmente usados en el diagnóstico de VIH.

EJEMPLO 2 Determinación de la Correlación entre SI y Tiempo desde la Infección En un estudio de seguimiento a gran escala en una población de muy alto riesgo, se detectan nuevas infecciones, y son seguidas durante aproximadamente 15 meses y se registró su SI a intervalos fijados cada semana durante los primeros 3-6 meses, y después mensualmente hasta que el SI alcanza el umbral de "no estimulación".

El SI cayó rápidamente en las primeras pocas semanas, y continua cayendo durante varios meses más, hasta que se "asienta" aun SI fijado, el cual es característico de la infección establecida (Figura 2). Un grupo de resultados de un número estadísticamente importante de nuevas infecciones seguido con el tiempo (según determinado por un experto en la técnica) proporciona herramientas para determinar los tipos de SI (en este ejemplo, 1.1, 1.15, o 1.2) y su Duración Media de Infección Temprana correlacionada (en este ejemplo 6 o 7 meses, respectivamente) a utilizarse para esa población (y otras, como se puede determinar por un experto en la técnica) para determinar el tiempo de infección/seroconversión y/o si el paciente está en las etapas tempranas de la infección cuando el tiempo de seroconversión no es conocido (Figura 3). En los cuatro ejemplos, el SI es mayor que el SI para infección temprana en la Figura 2, y de esta manera todas son infecciones tempranas. Otro ejemplo es determinar el tiempo de infección al ""sobreponer" la pendiente del SI en las muestras desconocidas sobre las pendientes establecidas de un grupo de tiempos desconocidos de seroconversión. En este ejemplo, 2 probadas seroconvertidas aproximadamente 1 mes antes, una aproximadamente 2 meses antes, y una aproximadamente 3 meses antes.

Aunque ciertos aspectos de la invención han sido ilustrados y descritos aquí, muchas modificaciones, substituciones, cambios y equivalentes ahora se les ocurrirán a aquellos expertos en la técnica. Por lo tanto, se debe entender que las reivindicaciones anexas pretenden cubrir todas estas modificaciones y cambios para que caigan dentro del verdadero espíritu de la invención.

Claims (68)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar el tiempo transcurrido desde una infección microbiana inicial de un sujeto, que comprende los pasos de: a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde una inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado; b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra; c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinado así un valor de índice de estimulación (SI); y d) determinar el tiempo transcurrido de dicha infección microbiana basándose en el valor SI obtenido en el paso (c), en donde existe una correlación inversa entre el valor SI y el tiempo transcurrido de dicha infección microbiana.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho paso de estimulación comprende incubar dicha segunda alícuota en un medio que comprende uno o más activadores de células inmunes.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho paso de estimulación comprende incubar dicha segunda alícuota en un medio que comprende uno o más activadores de células microbianas específicas.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho activador es un mitógeno.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho mitógeno es fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (conA), lipopolisacárido (LPS), mitógeno de la hierba de carmín (PWM), o una combinación de los mismos.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho activador es un péptido derivado microbiano, lectina, endotoxina bacteriana, un virus, lípido A, una citocina, o una linfocina.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dichas células microbianas específicas son linfocitos B.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dichas células microbianas específicas son linfocitos T.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho paso de estimulación comprende inducir la activación policlonal de células mononucleares de sangre periférica.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha alícuota de muestra de sangre estimulada comprende anticuerpos producidos in vivo y anticuerpos producidos a través de estimulación in vitro.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho paso de determinación comprende realizar un ensayo de anticuerpo en cada alícuota de dicha muestra de sangre.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho ensayo de anticuerpo comprende exponer cada una de dichas muestras de sangre a un antígeno de VIH permitiendo así que se forme un complejo inmune de antígeno-anticuerpo y detectar dicho complejo inmune de antígeno-anticuerpo.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho ensayo de anticuerpo comprende un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, un ensayo ligado a enzima, una tinción, un ensayo de luminiscencia, un ensayo de fluorescencia o un ensayo de inmunofluorescencia.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha infección microbiana es una infección viral.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha infección viral es una infección retroviral.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicha infección retroviral es una infección por VIH.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende el paso de formular una correlación entre valores SI y el tiempo transcurrido desde la infección antes del paso (a) basándose en una población de sujetos para quienes tanto el valor SI como el tiempo transcurrido desde la infección son conocidos.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende los pasos de (a) determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una segunda muestra de sangre de dicho sujeto, en donde dicha relación es el índice de estimulación (SI), y (b) calcular la pendiente del cambio en el SI calculado para las primera y segunda muestras de sangre, en donde la pendiente se utiliza para determinar el tiempo de dicha infección microbiana.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicha segunda muestra de sangre es adquirida aproximadamente un mes después de la primera muestra de sangre.

20. Un método para distinguir entre una infección microbiana temprana y una establecida en un sujeto que comprende los pasos de: a) determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en una primera alícuota de una muestra de sangre obtenida de un sujeto, en donde una inmunoreactividad antimicrobiana detectable indica que dicho sujeto está infectado; b) estimular una segunda alícuota de dicha muestra de sangre para producir anticuerpos antimicrobianos in vitro y determinar la inmunoreactividad antimicrobiana en dicha segunda alícuota de dicha muestra de sangre; c) dividir un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana estimulada obtenida en el paso (b) entre un valor que representa la inmunoreactividad antimicrobiana obtenida en el paso (a), determinado así un valor de índice de estimulación (SI); y d) determinar si el valor SI obtenido en el paso (c) está por arriba de un valor de umbral predeterminado, en donde un valor por abajo de dicho umbral indica que el sujeto tiene una infección establecida y un valor por arriba de dicho umbral indica que el sujeto está en las etapas tempranas de la infección, distinguiéndose así entre una infección microbiana temprana y una establecida en dicho sujeto.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho paso de estimulación comprende incubar dicha segunda alícuota en un medio que comprende uno o más activadores de célula inmune.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho paso de estimulación comprende incubar dicha segunda alícuota en un medio que comprende uno o más activadores de células microbianas específicas.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde dicho activador es un mitógeno.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho mitógeno es fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (conA), lipopolisacárido (LPS), mitógeno de la hierba de carmín (PWM), o una combinación de los mismos.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde dicho activador es un péptido derivado viral, lectina, endotoxina bacteriana, un virus, lípido A, una citocina, una linfocina, o una combinación de los mismos.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicho dichas células microbianas específicas con linfocitos B.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicho dichas células microbianas específicas con linfocitos T.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho paso de estimulación comprende inducir la activación policlonal de células mononucleares de sangre periférica.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicha alícuota de muestra de sangre estimulada comprende anticuerpos producidos in vivo y anticuerpos producidos mediante estimulación in vitro.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho paso de determinación comprende realizar un ensayo de anticuerpo en cada alícuota de dicha muestra de sangre.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en donde dicho ensayo de anticuerpo comprende exponer cada una de dichas muestras de sangre a un antígeno de VIH permitiendo así que se forme un complejo inmune de antígeno-anticuerpo y detectar dicho complejo inmune de antígeno-anticuerpo.

32. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde dicho ensayo de anticuerpo comprende un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, un ensayo ligado a enzima, una tinción, un ensayo de luminiscencia, un ensayo de fluorescencia o un ensayo de inmunofluorescencia.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicha infección microbiana es una infección viral.

34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde dicha infección viral es una infección retroviral.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 34, en donde dicha infección retroviral es una infección por VIH.

36. El método de acuerdo con la reivindicación 20, que además comprende el paso de formular una correlación entre valores SI y el tiempo de infección antes del paso (a) basándose en una población de sujetos para quienes tanto el valor SI como el tiempo de infección son conocidos.

37. El método de acuerdo con la reivindicación 20, que además comprende los pasos de (a) determinar la relación de inmunoreactividad antimicrobiana estimulada in vitro e inmunoreactividad antimicrobiana no estimulada en una segunda muestra de sangre de dicho sujeto, en donde dicha relación es el índice de estimulación (SI), y (b) calcular la pendiente del cambio en el SI calculado para las primera y segunda muestras de sangre, en donde existe una correlación inversa entre el valor de dicha pendiente y el tiempo de dicha infección microbiana.

38. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde dicha segunda muestra de sangre es adquirida aproximadamente un mes después de la primera muestra de sangre.

39. Un equipo para determinar el tiempo de una infección microbiana inicial de un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos microbianos específicos, linfocitos no específicos, o una combinación de los mismos, un ensayo para la detección de uno o más productos de dichos linfocitos, e instrucciones de uso.

40. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dicho ensayo comprende un antígeno microbiano al cual se exponen dichas muestras de sangre, permitiendo así que se forme y se detecte un complejo inmune de antígeno-anticuerpo.

41. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dicho ensayo es sem i-cuantitativo.

42. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dicho ensayo comprende un ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas, un ensayo ligado a enzima, una tinción, un ensayo de luminiscencia, un ensayo de fluorescencia o un ensayo de inmunofluorescencia.

43. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dicho activador es un mitógeno.

44. El equipo de acuerdo con la reivindicación 43, en donde dicho mitógeno es fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (conA), lipopolisacárido (LPS), mitógeno de la hierba de carmín (PWM), o una combinación de los mismos.

45. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dicho activador es un péptido derivado viral, lectina, endotoxina bacteriana, un virus, lípido A, una citocina, una linfocina, o una combinación de los mismos.

46. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dichos linfocitos son linfocitos B.

47. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dichos linfocitos son linfocitos T.

48. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dichos linfocitos son células mononucleares de sangre periférica.

49. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dicha infección microbiana es una infección viral.

50. El equipo de acuerdo con la reivindicación 49, en donde dicha infección viral es una infección retroviral.

51. El equipo de acuerdo con la reivindicación 50, en donde dicha infección retroviral en una infección por VIH.

52. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dichas instrucciones para uso comprenden un algoritmo para determinar el tiempo de infección basándose en el valor de Indice de Estimulación (SI).

53. El equipo de acuerdo con la reivindicación 39, en donde dichas instrucciones para uso comprenden un algoritmo para determinar los valores del Indice de Estimulación (SI).

54. Un equipo para distinguir entre una infección microbiana temprana y una establecida en un sujeto, que comprende: dos contenedores para recolectar muestras de sangre entera, en donde el segundo contenedor comprende un medio que comprende uno o más activadores de linfocitos microbianos específicos, linfocitos no específicos, o una combinación de los mismos, un ensayo para la detección de uno o más productos de dichos linfocitos, e instrucciones de uso.

55. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dicho ensayo comprende un antígeno microbiano al cual se exponen dichas muestras de sangre, permitiendo así que se forme y se detecte un complejo inmune de antígeno-anticuerpo.

56. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dicho ensayo es semi-cuantitativo.

57. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dicho ensayo comprende un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, un ensayo ligado a enzima, una tinción, un ensayo de luminiscencia, un ensayo de fluorescencia o un ensayo de inmunofluorescencia.

58. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dicho activador es un mitógeno.

59. El equipo de acuerdo con la reivindicación 58, en donde dicho mitógeno es fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (conA), lipopolisacárido (LPS), mitógeno de la hierba de carmín (PWM), o una combinación de los mismos.

60. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dicho activador es un péptido derivado viral, lectina, endotoxina bacteriana, un virus, lípido A, una citocina, una linfocina, o una combinación de los mismos.

61. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dichos linfocitos son linfocitos B.

62. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dichos linfocitos son linfocitos T.

63. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dichos linfocitos son células mononucleares de sangre periférica.

64. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dicha infección microbiana es una infección viral.

65. El equipo de acuerdo con la reivindicación 64, en donde dicha infección viral es una infección retroviral.

66. El equipo de acuerdo con la reivindicación 65, en donde dicha infección retroviral es una infección por VIH.

67. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dichas instrucciones para uso comprenden un algoritmo para distinguir entre una infección microbiana temprana y una establecida basándose en el valor del Indice de Estimulación (SI).

68. El equipo de acuerdo con la reivindicación 54, en donde dichas instrucciones para uso comprenden un algoritmo para determinar los valores del Indice de Estimulación (SI).