RS64217B1 - Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv raka jajnika i drugih malignih tumora - Google Patents

Description

Uopšteno, predmetni pronalazak odnosi se na polje peptida, proteina, nukleinskih kiselina i ćelija za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Stoga, predmetni pronalazak odnosi se na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak uopšteno se odnosi na peptidne epitope tumor-asocirane T ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumorasociranim peptidima koji mogu na primer služiti kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore, ili za stimulaciju T ćelija ex vivo i prenos u pacijente. Peptidi vezani za molekule glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC), ili peptidi kao takvi, mogu takođe biti ciljevi antitela, solubilnih T-ćelijskih receptora i drugih molekula koji imaju sposobnost vezivanja.

U ovom dokumentu opisano je nekoliko novih peptidnih sekvenci i njihove varijante dobijene iz HLA molekula klase I i HLA molekula klase II humanih tumorskih ćelija koje mogu da se koriste u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora, ili kao ciljevi za razvoj farmaceutski/imunološki aktivnih jedinjenja i ćelija.

OSNOVNE INFORMACIJE O PRONALASKU

Rak jajnika

Sa procenjenih 239.000 novih slučajeva u 2012. godini, rak jajnika je sedma najčešća vrsta raka kod žena, koji predstavlja 4% svih vrsta raka kod žena. Stopa smrtnosti od raka jajnika često je prilično visoka u odnosu na druge vrste raka ženskih reproduktivnih organa a letalitet je viši u siromašnijim sredinama. Stoga, rak jajnika je osmi najčešći uzrok smrti usled raka kod žena, sa 152.000 smrtnih ishoda. 2012. godine skoro 55% svih novih slučajeva otkriveno je u zemljama sa visokim ili veoma visokim nivoom ljudskog razvoja; 37% novih slučajeva i 39% smrti su se dogodile u Evropi i Severnoj Americi. Stope incidencije su najviše u Severnoj i Istočnoj Evropi, Severnoj Americi i Okeaniji a relativno su niske u Africi i većem delu Azije. Stope incidencije opadaju u određenim zemljama sa veoma visokim nivoom ljudskog razvoja, pre svega u Evropi i Severnoj Americi.

Najčešća vrsta raka jajnika su karcinomi jajnika, koji su takođe i među najsmrtonosnijim ginekološkim malignitetima. Prema histopatologiji i molekularnoj genetici, karcinomi jajnika se dele na pet glavnih tipova: serozni visokog gradusa (70%), endometroidni (10%), svetloćelijski (10%), mucinozni (3%) i serozni karcinomi niskog gradusa (< 5%), koji zajedno čine više od 95% slučajeva. Mnogo manje česti su maligni tumori germinativnih ćelija (disgerminomi, tumori žumančane kese i nezreli teratomi) (3% slučajeva raka jajnika) i potencijalni maligni stromalni tumori polne peteljke (1–2%), među kojima su najčešći tumori granuloznih ćelija.

Karcinomi jajnika najčešće se javljaju kod žena koje nisu rađale, a sa najmanjom učestalošću se javljaju kod žena sa suprimiranom ovulacijom, tipično zbog trudnoće ili primene oralnih kontraceptiva. Za ove tumore se generalno smatra da vode poreklo od ćelija koje prekrivaju površinu jajnika ili peritoneum karlice. Maligna transformacija ovog mezotela objašnjena je teorijom „neprestane ovulacije“ (La, 2001).

Porodična istorija raka jajnika prisutna je u 10% slučajeva; rizik je povećan 3 puta kada su obolela dva ili više rođaka prvog reda. Žene sa mutacijama germinativne linije na BRCA1 ili BRCA2 imaju 30–70% rizik od razvoja raka jajnika, pre svega seroznih karcinoma visokog gradusa, do 70. godine starosti (Risch et al., 2006).

Hirurška resekcija je primarna terapija u ranom kao i u uznapredovalom stadijumu karcinoma jajnika. Krajnji cilj je kompletno uklanjanje tumorske mase u zdravom okolnom tkivu. Nakon hirurškog odstranjivanja sledi sistemska hemioterapija sa analozima platine, osim za rak jajnika veoma niskog gradusa (stadijum IA, gradus 1), gde postoperativna hemioterapija nije indikovana. Kod raka jajnika u uznapredovalom stadijumu, hemioterapija prve linije se sastoji od kombinacije karboplatine sa paklitakselom, kojima može biti dodat bevacizumab. Standardno lečenje za vrste raka jajnika rezistentne na platinu sastoji se od monoterapije jednim od sledećih hemioterapeutika: pegilovani lipozomalni doksorubicin, topotekan, gemcitabin ili paklitaksel (S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 2013).

Čini se da je imunoterapija obećavajuća strategija da se poboljša tretman pacijenata sa rakom jajnika, budući da prisustvo proinflamatornih tumor-infiltrišućih limfocita, posebno CD8-pozitivnih T ćelija, korelira sa dobrom prognozom a T ćelije specifične za tumorasocirane antigene mogu biti izolovane iz tkiva raka.

Stoga, ulaže se dosta naučnog truda u istraživanje različitih imunoterapija kod raka jajnika. Značajan broj pretkliničkih i kliničkih studija je već sproveden i trenutno su u toku dalje studije. Klinički podaci su dostupni za citokinsku terapiju, vakcinaciju, tretman monoklonskim antitelima, adoptivni ćelijski transfer i imunomodulaciju.

Citokinska terapija sa interleukinom-2, interferonom-alfa, interferonom-gama ili faktorom stimulacije kolonije granulocita-makrofaga ima za cilj da podstakne antitumorski imunski odgovor samog pacijenta i ovi tretmani su već pokazali obećavajuće rezultate u malim studijskim kohortama.

Studije vakcinacije faze I i II, koristeći pojedinačne ili multiple peptide, izvedene iz nekoliko tumor-asociranih proteina (Her2/neu, NY-ESO-1, p53, Wilms tumor-1) ili celokupne tumorske antigene, izvedene iz autolognih tumorskih ćelija pokazale su dobre profile bezbednosti i podnošljivosti, ali samo niske do umerene kliničke efekte.

Smatra se da monoklonska antitela koja specifično prepoznaju tumor-asocirane proteine povećavaju ubijanje tumorskih ćelija posredovano imunskim ćelijama. Anti-CA-125 antitela oregovomab i abagovomab kao i anti-EpCAM antitelo katumaksomab postigla su obećavajuće rezultate u studijama faze II i III. Nasuprot tome, anti-MUC1 antitelo HMFG1 nije uspelo da jasno poveća preživljavanje u studiji faze III.

Alternativni pristup koristi monoklonska antitela da cilja i blokira faktor rasta i receptore preživljavanja na tumorskim ćelijama. Dok su davanje trastuzumaba (anti-HER2/neu antitelo) i MOv18 i MORAb-003 (anti-folatni receptor alfa antitela) dali samo ograničenu kliničku korist za pacijente sa rakom jajnika, čini se da dodatak bevacizumaba (anti-VEGF antitelo) standardnoj hemioterapiji u uznapredovalom raku jajnika ima prednosti.

Adoptivni transfer imunskih ćelija postigao je heterogene rezultate u kliničkim ispitivanjima. U pilot ispitivanju je pokazano da je adoptivni transfer autolognih, in vitro ekspandiranih tumor infiltrišućih T ćelija obećavajući pristup. Nasuprot tome, transfer T ćelija koje nose himerni antigenski receptor specifičan za folatni receptor alfa nije izazvao značajan klinički odgovor u ispitivanju faze I. Pokazano je da dendritične ćelije pulsirane sa lizatom tumorskih ćelija ili tumor-asociranim proteinima in vitro povećavaju antitumorski T ćelijski odgovor nakon transfera, ali opseg aktivacije T ćelija nije korelisao sa kliničkim efektima. Transfer ćelija prirodnih ubica izazvao je značajne toksičnosti u studiji faze II.

Unutrašnja antitumorska imunost kao i imunoterapija su ograničene imunosupresivnom tumorskom mikrosredinom. Da se prevaziđe ova prepreka, imunomodulatorni lekovi, kao ciklofosfamid, anti-CD25 antitela i pegilovani lipozomalni doksorubicin su testirani u kombinaciji sa imunoterapijom. Najpouzdaniji podaci su trenutno dostupni za ipilimumab, anti-CTLA4 antitelo, koje povećava aktivnost T ćelija. Pokazano je da ipilimumab izaziva značajne antitumorske efekte kod pacijenata sa rakom jajnika (Mantia-Smaldone et al., 2012).

Imajući u vidu teška neželjena dejstva i trošak lečenja raka, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu da se koriste u lečenju raka uopšte i konkretno raka jajnika. Takođe postoji potreba da se identifikuju faktori koji predstavljaju biomarkere za rak uopšte i konkretno za rak jajnika, koji bi doveli do boljeg dijagnostikovanja raka, bolje procene prognoze i predviđanja uspeha lečenja.

Imunoterapija raka predstavlja mogućnost specifičnog ciljanja ćelija raka uz svođenje neželjenih dejstava na minimum. Imunoterapija raka iskorišćava postojanje tumorasociranih antigena.

Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena (TAA) sadrži sledeće velike grupe:

a) Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumorspecifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije i NY-ESO-1.

b) Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao. Većina poznatih antigena diferencijacije nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumor-specifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za rak prostate.

c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.

d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je β-katenin, CDK4, itd.). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora. Tumorska specifičnost (ili asociranost) peptida može takođe biti posledica toga što peptid potiče iz tumor- (-asociranog) egzona u slučaju proteina sa tumor-specifičnim (-asociranim) izoformama.

e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumor-specifični.

f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.

Imunoterapija bazirana na T ćelijama cilja peptidne epitope dobijene iz tumor-asociranih ili tumor-specifičnih proteina, koje prezentuju molekuli glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC). Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, obično ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.

Postoje dve klase MHC molekula, MHC klasa I i MHC klasa II. MHC molekuli klase I su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina, MHC molekuli klase II od alfa i beta lanca. Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima.

MHC molekuli klase I se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. Oni prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ova) i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju npr. u toku endocitoze, i nakon toga obrađuju.

Komplekse peptida i MHC klase I prepoznaju CD8-pozitivne T ćelije koje nose odgovarajući T-ćelijski receptor (TCR), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.

CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora (Gnjatic et al., 2003). Na mestu tumora, T pomoćničke ćelije podržavaju citokinski milje koji je povoljan za citotoksične T ćelije (CTL) (Mortara et al., 2006) i privlače efektorske ćelije, npr. CTL, ćelije prirodne ubice (NK), makrofage i granulocite (Hwang et al., 2007).

U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, otkriveno je da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel et al., 2006).

Elongirani (duži) peptidi mogu da deluju kao MHC klasa II aktivni epitopi.

T-pomoćničke ćelije, aktivirane od strane MHC klasa II epitopa, imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1 tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T-pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.

Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CD8-pozitivnih T limfocita, CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferona-gama (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Postoje dokazi da su CD4 T ćelije direktni antitumorski efektori (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na imunske ćelije, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora ranije se nije smatrala mogućom. Međutim, Dengjel i saradnici su uspešno identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1760 088 B1).

Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8+ T ćelija (ligand: MHC molekul klase I peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekul klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.

Da bi peptid MHC klase I pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on takođe mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji vezuju MHC klasa I su obično dužine 8-12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje.

U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da naknadno prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).

Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane T limfocita kao tumor-specifični ili tumorasocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne, ili u uporedivo malim količinama, od strane normalnih zdravih tkiva. U poželjnom otelotvorenju, peptid bi trebalo da bude prekomerno prezentovan od strane ćelija tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumor-specifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog njihove funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektni tumorasocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et al., 2004). Esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, kako bi se osiguralo da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije koja ima odgovarajući TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.

Stoga su TAA početna tačka za razvoj terapije zasnovane na T ćelijama uključujući, bez ograničavanja, tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA obično su zasnovani na upotrebi T ćelija koje mogu biti izolovane iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva. Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna potpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. Zato je važno da se odaberu samo oni prekomerno ili selektivno prezentovani peptidi protiv kojih se može naći funkcionalna i/ili proliferišuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).

U slučaju ciljanja kompleksa peptid-MHC pomoću specifičnih TCR-ova (npr. solubilni TCR) i antitela ili drugih vezujućih molekula (skele) u skladu sa pronalaskom, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. U tim slučajevima presudni faktor je prezentacija.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

Predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži ID BR. SEKV 53: (MEHPGKLLF) ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.

U jednom otelotvorenju pronalaska, navedeni peptid ima sposobnost da se veže za MHC molekul klase I ili II, te naznačeno time što navedeni peptid, kada je vezan za navedeni MHC, ima sposobnost da ga prepoznaju CD4 i/ili CD8 T ćelije.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitelo, poželjno monoklonsko antitelo ili njegov fragment, koje specifično prepoznaje peptid u skladu sa pronalaskom, poželjno peptid u skladu sa pronalaskom kada je vezan za MHC molekul.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijski receptor ili njegov fragment, koji specifično prepoznaje određeni HLA ligand, naznačeno time što je navedeni ligand peptid u skladu sa pronalaskom kada je vezan za MHC molekul.

U jednom otelotvorenju pronalaska, navedeni T-ćelijski receptor je obezbeđen kao rastvorljiv molekul i opciono nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na rekombinantnu ćeliju domaćina koja sadrži peptid u skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov fragment u skladu sa pronalaskom, T-ćelijski receptor ili njegov fragment u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno izabrana od antigen-prezentujuće ćelije, kao što je dendritična ćelija, T ćelija ili NK ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T limfocita, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I ili II sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačkog konstrukta koji imitira antigen-prezentujuću ćeliju u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigenspecifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktiviran T limfocit, proizveden pomoću metoda u skladu sa pronalaskom, koji selektivno prepoznaje ćeliju koja prezentuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u pronalasku.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku smešu koja sadrži najmanje jedan aktivan sastojak izabran iz grupe koju čine peptid u skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov fragment u skladu sa pronalaskom, T-ćelijski receptor ili njegov fragment u skladu sa pronalaskom, ćelija domaćin u skladu sa pronalaskom, ili aktivirani T limfocit u skladu sa pronalaskom, ili konjugovan ili obeležen aktivan sastojak, i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono, farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod za proizvodnju peptida u skladu sa pronalaskom, antitela ili njegovog fragmenta u skladu sa pronalaskom, ili T-ćelijskog receptora ili njegovog fragmenta u skladu sa pronalaskom, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa pronalaskom, i izolovanja peptida, antitela ili njegovog fragmenta ili T-ćelijskog receptora ili njegovog fragmenta iz navedene ćelije domaćina i/ili medijuma za njenu kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov fragment u skladu sa pronalaskom, T-ćelijski receptor ili njegov fragment u skladu sa pronalaskom, ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom, ili aktivirani T limfocit u skladu sa pronalaskom za upotrebu u medicini.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov fragment u skladu sa pronalaskom, T-ćelijski receptor ili njegov fragment u skladu sa pronalaskom, ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom, ili aktivirani T limfocit u skladu sa pronalaskom za upotrebu u dijagnostikovanju i/ili lečenju raka.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na komplet koji se sastoji od: (a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu koja sadrži peptid u skladu sa pronalaskom, antitelo ili njegov fragment u skladu sa pronalaskom, T-ćelijski receptor ili njegov fragment u skladu sa pronalaskom, ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom, ili aktivirani T limfocit u skladu sa pronalaskom u rastvoru ili u liofiliziranom obliku;

(b) opciono, druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju;

(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.

U jednom otelotvorenju pronalaska, navedeni komplet dalje se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) igla ili (vii) brizgalica.

U ovom dokumentu je predstavljen peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 52, odnosno ID BR. SEKV: 54 do ID BR. SEKV: 772 ili njihovu varijantnu sekvencu koja je najmanje 77%, a poželjno najmanje 88%, homologna (poželjno najmanje 77% ili najmanje 88% identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 52, odnosno ID BR. SEKV: 54 do ID BR. SEKV: 772, naznačeno time što se navedena varijanta vezuje za MHC i/ili indukuje T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što navedeni peptid nije osnovni polipeptid kompletne dužine.

U ovom dokumentu takođe je predstavljen peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 52, odnosno ID BR. SEKV: 54 do ID BR. SEKV: 772 ili njihova varijanta, koja je najmanje 77%, a poželjno najmanje 88%, homologna (poželjno najmanje 77% ili najmanje 88% identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 52, odnosno ID BR. SEKV: 54 do ID BR. SEKV: 772, naznačeno time što navedeni peptid ili njegova varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14 aminokiselina.

U sledećim tabelama prikazan je peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom i dalji peptidi koji su predstavljeni u ovom dokumentu, njihovi odgovarajući ID BR. SEKV, i prospektivni izvorni (osnovni) geni za ove peptide. U tabeli 1, peptidi sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 9 vezuju se za HLA-A*02, peptidi sa ID BR. SEKV: 10 do ID BR. SEKV: 19 vezuju se za HLA-A*24, peptidi sa ID BR. SEKV: 20 do ID BR. SEKV: 30 vezuju se za HLA-A*03, peptid sa ID BR. SEKV: 31 vezuje se za HLA-A*01, peptidi sa ID BR. SEKV: 32 do ID BR. SEKV: 41 vezuju se za HLA-B*07, peptidi sa ID BR. SEKV: 42 do ID BR. SEKV: 51 vezuju se za HLA-B*08, peptidi sa ID BR. SEKV: 52 do ID BR. SEKV: 59 vezuju se za HLA-B*44. U tabeli 2, peptidi sa ID BR. SEKV: 60 do ID BR. SEKV: 75 vezuju se za HLA-A*02, peptidi sa ID BR. SEKV: 76 do ID BR. SEKV: 82 vezuju se za HLA-A*24, peptidi sa ID BR. SEKV: 83 do ID BR. SEKV: 111 vezuju se za HLA-A*03, peptidi sa ID BR. SEKV: 112 do ID BR. SEKV: 116 vezuju se za HLA-A*01, peptidi sa ID BR. SEKV: 117 do ID BR. SEKV: 149 vezuju se za HLA-B*07, peptidi sa ID BR. SEKV: 150 do ID BR. SEKV: 172 vezuju se za HLA-B*08, peptidi sa ID BR. SEKV: 173 do ID BR. SEKV: 215 vezuju se za HLA-B*44. U tabeli 3, peptidi sa ID BR. SEKV: 216 do ID BR. SEKV: 245 vezuju se za HLA-A*02, peptidi sa ID BR. SEKV: 246 do ID BR. SEKV: 255 vezuju se za HLA-A*24, peptidi sa ID BR. SEKV: 256 do ID BR. SEKV: 287 vezuju se za HLA-A*03, peptidi sa ID BR. SEKV: 288 do ID BR. SEKV: 292 vezuju se za HLA-A*01, peptidi sa ID BR. SEKV: 293 do ID BR. SEKV: 392 vezuju se za HLA-B*07, peptidi sa ID BR. SEKV: 393 do ID BR. SEKV: 395 vezuju se za HLA-B*08, peptidi sa ID BR. SEKV: 396 do ID BR. SEKV: 438 vezuju se za HLA-B*44. U tabeli 4, peptidi sa ID BR. SEKV: 439 do ID BR. SEKV: 551 vezuju se za nekoliko alela HLA klase I, peptid sa ID BR. SEKV: 773 vezuje se za HLA-A*02, peptid sa ID BR. SEKV: 774 vezuje se za HLA-A*24. U tabeli 5, peptidi sa ID BR. SEKV: 552 do ID BR. SEKV: 772 vezuju se za nekoliko alela HLA klase II.

Tabela 1: peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom i dalji peptidi predstavljeni u ovom dokumentu.

Tabela 2: dodatni peptidi predstavljeni u ovom dokumentu.

Tabela 3: dodatni peptidi predstavljeni u ovom dokumentu.

Tabela 4: HLA klasa I peptidi predstavljeni u ovom dokumentu.

Tabela 5: HLA klasa II peptidi predstavljeni u ovom dokumentu.

Predmetni pronalazak se pored toga uopšteno odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u medicini, kao na primer u lečenju proliferativnih bolesti, kao što su, na primer, hepatocelularni karcinom, kolorektalni karcinom, glioblastom, rak želuca, rak jednjaka, nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, rak pankreasa, karcinom bubrežnih ćelija, rak prostate, melanom, rak dojke, hronična limfocitna leukemija, non-Hodžkinov limfom, akutna mijeloidna leukemija, rak žučne kese i holangiokarcinom, rak mokraćne bešike, rak materice, skvamocelularni karcinom glave i vrata, mezoteliom.

Predmetni pronalazak se odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom (videti tabelu 1), i njegove primene u imunoterapiji raka jajnika, hepatocelularnog karcinoma, kolorektalnog karcinoma, glioblastoma, raka želuca, raka jednjaka, nesitnoćelijskog karcinoma pluća, sitnoćelijskog karcinoma pluća, raka pankreasa, karcinoma bubrežnih ćelija, raka prostate, melanoma, raka dojke, hronične limfocitne leukemije, non-Hodžkinovog limfoma, akutne mijeloidne leukemije, raka žučne kese i holangiokarcinoma, raka mokraćne bešike, raka materice, skvamocelularnog karcinoma glave i vrata, mezotelioma, i poželjno raka jajnika.

Tako, drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u medicini. U poželjnim otelotvorenjima, navedena medicinska upotreba odnosi se na lečenje proliferativne bolesti izabrane iz grupe koju čine rak jajnika, hepatocelularni karcinom, kolorektalni karcinom, glioblastom, rak želuca, rak jednjaka, nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, rak pankreasa, karcinom bubrežnih ćelija, rak prostate, melanom, rak dojke, hronična limfocitna leukemija, non-Hodžkinov limfom, akutna mijeloidna leukemija, rak žučne kese i holangiokarcinom, rak mokraćne bešike, rak materice, skvamocelularni karcinom glave i vrata, mezoteliom.

Predmetni pronalazak se zatim odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom koji ima sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili – u produženom obliku, kao što je varijanta dužine – MHC klase II.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom naznačen time što navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu prema ID BR. SEKV: 53.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačen time što je navedeni peptid modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačen time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina, konkretno fuziranog na N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziranog na (ili u sekvencu) antitela, kao, na primer, antitela koje je specifično za dendritične ćelije.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira i/ili eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju bolesti i medicini, konkretno u lečenju raka.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitela koja su specifična protiv peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom ili kompleksa navedenih peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom sa MHC i metode za pravljenje istih.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove), konkretno solubilne TCR (sTCR) i klonirane TCR-ove ubačene u autologne ili alogene T ćelije, i njihove funkcionalne fragmente, i metode za pravljenje istih, kao i NK ćelije ili druge ćelije koje nose navedeni TCR ili koje unakrsno reaguju sa navedenim TCR-ovima.

Antitela i TCR-ovi su dodatna otelotvorenja imunoterapijske upotrebe peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije kako je ranije opisan. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod za proizvodnju peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na navedeni metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigenprezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigenprezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira ili eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV 53 u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedena T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

U ovom dokumentu predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnom objavom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efektivnog broja T ćelija proizvedenih u skladu sa predmetnom objavom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu peptida pronalaska, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, aktiviranog T limfocita, T-ćelijskog receptora ili antitela ili drugog peptida – i/ili molekula koji vezuju peptid-MHC u skladu sa predmetnim pronalaskom u vidu leka ili u proizvodnji leka. Poželjno, navedeni lek je aktivan protiv raka.

Poželjno, navedeni lek je ćelijska terapija, vakcina ili protein zasnovan na solubilnom TCR ili antitelu.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije raka ćelije raka jajnika, hepatocelularnog karcinoma, kolorektalnog karcinoma, glioblastoma, raka želuca, raka jednjaka, nesitnoćelijskog karcinoma pluća, sitnoćelijskog karcinoma pluća, raka pankreasa, karcinoma bubrežnih ćelija, raka prostate, melanoma, raka dojke, hronične limfocitne leukemije, non-Hodžkinovog limfoma, akutne mijeloidne leukemije, raka žučne kese i holangiokarcinoma, raka mokraćne bešike, raka materice, skvamocelularnog karcinoma glave i vrata, mezotelioma, i poželjno ćelije raka jajnika.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na biomarkere zasnovane na peptidu u skladu sa predmetnim pronalaskom, u ovom tekstu nazvane „ciljevima“, a koji se mogu koristiti kod određivanja dijagnoze raka, poželjno raka jajnika. Marker može da bude prekomerna prezentacija samog(ih) peptida odnosno prekomerna ekspresija odgovarajućeg(ih) gena. Markeri se takođe mogu koristiti za predviđanje verovatnoće uspeha terapije, poželjno imunoterapije, te najpoželjnije imunoterapije čiji je cilj isti kao onaj koji se identifikuje biomarkerom. Na primer, antitelo ili rastvorljivi TCR može da se koristi za bojenje isečaka tumora radi detekcije prisustva peptida od interesovanja u kompleksu sa MHC.

Opciono, antitelo nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na upotrebu navedenih novih ciljeva u kontekstu lečenja raka.

I terapijske i dijagnostičke primene protiv dodatnih malignih bolesti predstavljene su u sledećem detaljnijem opisu osnovnih proizvoda ekspresije (polipeptida) peptida u skladu sa pronalaskom.

ESR1 kodira estrogenski receptor, faktor transkripcije koji se aktivira ligandom, koji je važan za vezivanje hormona, vezivanje DNK i aktivaciju transkripcije, što je esencijalno za seksualni razvoj i reproduktivnu funkciju (RefSeq, 2002). Mutacije i polimorfizmi pojedinačnog nukleotida ESR1 povezani su sa rizikom za nastanak različitih vrsta malignih tumora, uključujući rak jetre, prostate, žučne kese i dojke. Ushodna regulacija ekspresije ESR1 povezana je sa ćelijskom proliferacijom i rastom tumora ali je celokupno preživljavanje pacijenata sa ESR1-pozitivnim tumorima bolje zbog uspešnosti terapije sa selektivnim modulatorima estrogenskog receptora (Sun et al., 2015; Hayashi et al., 2003; Bogush et al., 2009; Miyoshi et al., 2010; Xu et al., 2011; Yakimchuk et al., 2013; Fuqua et al., 2014). ESR1 signalizacija ometa različite puteve koji su odgovorni za ćelijsku transformaciju, rast i preživljavanje kao što su EGFR/IGFR, PI3K/Akt/mTOR, p53, HER2, NFkapaB i TGF-beta putevi (Frasor et al., 2015; Band and Laiho, 2011; Berger et al., 2013; Skandalis et al., 2014; Mehta and Tripathy, 2014; Ciruelos Gil, 2014).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T ćelija iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnoj imunskoj odbrani protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane citotoksične T ćelije, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferona-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.

Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, i duži sa dužinom od 10, 11 ili 12 aminokiselina ili duži, a u slučaju peptida MHC klase II (elongirane varijante peptida pronalaska) oni mogu biti dužine od 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 ili više aminokiselina.

Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli. Napomenuto je da se soli peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi in vivo nisu soli.

Termin „peptid“ će takođe obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.

Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetnog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR-ova protiv njega.

T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.

Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.

Tabela 6: učestalosti ekspresije F serotipova HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 i HLA-B*44. Učestalosti haplotipa Gf izvedene su iz studije u kojoj su korišćeni podaci HLA tipizacije iz registra više od 6,5 miliona dobrovoljnih davalaca u SAD (Gragert et al., 2013). Učestalost haplotipa je učestalost posebnog alela na pojedinačnom hromozomu. Zbog diploidnog seta hromozoma u okviru ćelija sisara, učestalost genotipskog javljanja ovog alela je veća i može da se izračuna primenom Hardi-Vajnbergovog principa (F = 1 – (1-Gf)<2>).

Peptid pronalaska, poželjno kada je uključen u vakcinu pronalaska kako je ovde opisana, vezuje se za A*02, A*01, A*03, A*24, B*07, B*08 ili B*44. Vakcina može takođe da uključuje sve-vezujuće MHC klasa II peptide. Stoga, vakcina pronalaska može da se koristi za lečenje raka kod pacijenata koji su A*02-, A*01-, A*03-, A*24-, B*07-, B*08- ili B*44-pozitivni, pri čemu nije neophodan nikakav izbor za MHC klasa II alotipove zbog sve-vezujuće prirode ovih peptida.

Ako se A*02 peptidi pronalaska kombinuju sa peptidima koji se vezuju za drugi alel, na primer A*24, veći procenat bilo koje populacije pacijenata može da se leči u poređenju sa tim kada se cilja bilo koji od ova dva MHC klasa I alela sam. Dok u većini populacija pomoću bilo kog od ova dva alela samog može da se targetira manje od 50% pacijenata, vakcina koja sadrži HLA-A*24 i HLA-A*02 epitope može da leči najmanje 60% pacijenata u bilo kojoj relevantnoj populaciji. Konkretno, sledeći procenti pacijenata će biti pozitivni na najmanje jedan od ovih alela u različitim regionima: SAD 61%, Zapadna Evropa 62%, Kina 75%, Južna Koreja 77%, Japan 86% (izračunato sa www.allelefrequencies.net).

Tabela 7: pokrivenost HLA alela u populaciji Evropljana bele rase (izračunato iz (Gragert et al., 2013)).

U poželjnom otelotvorenju, termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer dezoksiribonukleotida.

Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za (ili koji kodira) peptid“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu, na primer, dendritičnu ćeliju ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR-ova.

Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na sekvencu nukleinske kiseline obuhvata i jednolančanu i dvolančanu nukleinsku kiselinu. Tako, na primer za DNK, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence.

Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.

Kodirajući region može biti izveden iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak izveden iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.

Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).

Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.

Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.

Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.

Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se on prirodno javlja). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.

Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, shodno razumevanju tih termina od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito je obuhvaćen.

Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetni pronalazak mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku. Termin „aktivni fragment“ označava fragment, obično peptida, polipeptida ili sekvence nukleinske kiseline, koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom ili u vektoru, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.

Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.

U skladu sa predmetnim pronalaskom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa traženom ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili traženom sekvencom („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli:

procenat identičnosti = 100 [1 -(C/R)]

gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što (i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku, i

(iiii) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;

a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.

Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.

Kao što je ranije pomenuto, predmetna objava tako obezbeđuje peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 52, odnosno ID BR. SEKV: 54 do ID BR. SEKV: 772 ili njihovu varijantu koja je 88% homologna sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 52, odnosno ID BR. SEKV: 54 do ID BR. SEKV: 772 ili njihovom varijantom koji će indukovati T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom. Peptidi predmetne objave imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I, a elongirane verzije navedenih peptida za klasu II.

U predmetnom pronalasku, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke dostupne su u javnim bazama podataka.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

Pod „varijantom“ date aminokiselinske sekvence pronalazači podrazumevaju da bočni lanci, na primer, jednog ili dva aminokiselinska ostatka budu izmenjeni (na primer tako što će biti zamenjeni bočnim lancem drugog aminokiselinskog ostatka koji se prirodno pojavljuje ili nekim drugim bočnim lancem) tako da peptid i dalje bude sposoban da se vezuje za HLA molekul na značajno isti način kao i peptid koji sadrži datu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 772. Na primer, peptid može biti modifikovan tako da najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost interakcije sa i vezivanja za udubljenje za vezivanje prikladnog MHC molekula, kao što su HLA-A*02 ili -DR, i na taj način najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T ćelija.

Ove T ćelije mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima pronalaska. Kako se može izvesti iz naučne literature i baza podataka (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje. Tako će osoba stručna u predmetnoj oblasti moći da modifikuje aminokiselinske sekvence navedene u ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 772, zadržavanjem poznatih sidrenih ostataka, i biće u stanju da utvrdi da li takve varijante zadržavaju sposobnost vezivanja za MHC molekule klase I ili II. Varijante peptida predstavljene u ovom dokumentu zadržavaju sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T ćelija, koje naknadno mogu unakrsno reagovati sa i ubiti ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u peptidima predstavljenim u ovom dokumentu.

Originalni (nemodifikovani) peptidi kako su ovde predstavljeni mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, poželjno selektivnim, položajima unutar peptidnog lanca, ako nije navedeno drugačije. Poželjno, te supstitucije nalaze se na kraju aminokiselinskog lanca. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, kada se jedna aminokiselina zamenjuje aminokiselinom slične strukture i sličnih karakteristika, kao kada se hidrofobna aminokiselina zamenjuje drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili slične veličine i hemijske prirode, kao kada se leucin zamenjuje izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u familijama prirodno javljajućih homolognih proteina, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, i one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i kao takve predstavljaju osnovu za definisanje „konzervativnih supstitucija“.

Konzervativne supstitucije su ovde definisane kao zamena u okviru jedne od sledećih pet grupa: Grupa 1 – mali alifatični, nepolarni ili malo polarni ostaci (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupa 2 – polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupa 3 – polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); Grupa 4 – veliki, alifatični, nepolarni ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i Grupa 5 – veliki aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).

Manje konzervativne supstitucije bi mogle da uključuju zamenu jedne aminokiseline drugom koja ima slične karakteristike ali je malo drugačije veličine, kao što je zamena alaninskog ostatka izoleucinskim ostatkom. Veoma nekonzervativne zamene bi mogle da uključuju supstituisanje kisele aminokiseline polarnom, ili čak i aminokiselinom baznog karaktera. Takve „radikalne“ supstitucije ne mogu, ipak, da se odbace kao potencijalno neefikasne jer hemijski efekti nisu potpuno predvidivi a radikalne supstitucije bi mogle da dovedu do srećnih slučajnih otkrića koja inače ne bi mogla da se predvide iz jednostavnih hemijskih principa.

Naravno, takve supstitucije mogu uključivati strukture koje nisu uobičajene L-aminokiseline. Tako, D-aminokiseline bi mogle da supstituišu L-aminokiseline koje se uobičajeno nalaze u antigenim peptidima pronalaska a da i dalje budu obuhvaćene onim što je ovde objavljeno. Pored toga, nestandardne aminokiseline (tj. koje nisu uobičajene proteinogene aminokiseline koje se javljaju u prirodi) mogu se takođe koristiti u svrhe supstituisanja da bi se proizveli imunogeni i imunogeni polipeptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Ako se utvrdi da supstitucije na više od jednog položaja rezultuju peptidom sa značajnom jednakom ili većom antigenom aktivnošću kako je definisano u nastavku, onda će kombinacije tih supstitucija biti testirane kako bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije rezultuju aditivnim ili sinergističkim efektima na antigenost peptida. Najviše, u okviru peptida neće biti istovremeno supstituisano više od četiri položaja.

Peptid koji se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence kako je navedena u ovom dokumentu može imati zamenjenu jednu ili dve nesidrene aminokiseline (vidite u nastavku u pogledu sidrenog motiva) bez značajnog menjanja ili negativnog uticaja na sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II, kada se uporedi sa nemodifikovanim peptidom. U drugom otelotvorenju, u peptidu koji se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence kako je navedena u ovom dokumentu, jedna ili dve aminokiseline mogu biti zamenjene njihovim partnerima za konzervativnu zamenu (vidite u nastavku dokumenta) bez značajnog menjanja ili negativnog uticaja na sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II, kada se uporedi sa nemodifikovanim peptidom.

Aminokiselinski ostaci koji ne doprinose značajno interakcijama sa T-ćelijskim receptorom mogu da se modifikuju zamenom sa drugom aminokiselinom čija inkorporacija ne utiče značajno na T-ćelijsku reaktivnost i ne eliminiše vezivanje za relevantni MHC. Stoga, nezavisno od navedenog uslova, peptid iz ove objave može biti bilo koji peptid (a pod ovim terminom pronalazači podrazumevaju i oligopeptid ili polipeptid), koji obuhvata aminokiselinske sekvence ili njihov deo ili njihovu varijantu kako je naznačeno.

Tabela 8: varijante i motiv peptida u skladu sa ID BR. SEKV: 3, 225, 13, 17, 84, 108,

113, 114, 147, 36, 51, 172, 54 i 57

Takođe, mogu biti prikladni i duži (elongirani) peptidi. Moguće je da se obradom peptida iz dužih peptida ili proteina koji sadrže sam epitop, stvore epitopi MHC klase I, mada su oni obično dužine između 8 i 11 aminokiselina. Poželjno je da ostaci koji su bočni na aktuelni epitop budu ostaci koji ne ometaju u značajnoj meri proteolitičko cepanje koje je neophodno da bi se aktuelni epitop eksponirao tokom obrade.

Peptid pronalaska i dalji peptidi predstavljeni u ovom dokumentu mogu biti produženi za najviše četiri aminokiseline, to jest mogu da se dodaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline na bilo koji kraj u bilo kojoj kombinaciji između 4:0 i 0:4. Kombinacije ovde opisanih elongacija mogu se videti u tabeli 9.

Tabela 9: kombinacie elon acia e tida

Aminokiseline za elongaciju/produžavanje mogu biti peptidi originalne sekvence proteina ili bilo koja druga aminokiselina(e). Elongacija može da se koristi za poboljšavanje stabilnosti ili rastvorljivosti peptida.

Tako, epitopi predmetnog pronalaska mogu biti identični prirodno javljajućim tumorasociranim ili tumor-specifičnim epitopima ili mogu obuhvatati epitope koji se razlikuju za ne više od četiri ostataka od referentnog peptida, dokle god imaju značajno identičnu antigenu aktivnost.

U alternativnom otelotvorenju, peptid je produžen na jednom ili oba kraja za više od 4 aminokiseline, poželjno do ukupne dužine od najviše 30 aminokiselina. Ovako mogu nastati peptidi koji se vezuju za MHC klase II. Vezivanje za MHC klase II može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.

Saglasno tome, predmetna objava obezbeđuje peptide i varijante epitopa MHC klase I, naznačene time što peptid ili varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14, naime 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminokiselina, a u slučaju elongiranih peptida koji se vezuju za klasu II, dužina može da iznosi i 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 aminokiselina.

Naravno, peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II. Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.

Poželjno, kada se T ćelije specifične za peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/l, poželjno nije veća od oko 1 µmol/l, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/l, a još poželjnije nije veća od oko 100 pmol/l, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pmol/l. Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane T ćelija dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.

U naročito preferiranom otelotvorenju pronalaska peptid se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 53.

„Esencijalno se sastoji od“ će značiti da peptid, pored sekvence u skladu sa bilo kojom od ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 772 ili njene varijante, sadrži dodatne N- i/ili C-terminalno locirane produžetke od aminokiselina koji nužno ne obrazuju deo peptida koji funkcioniše kao epitop za epitop MHC molekula.

Ipak, ovi produžeci mogu biti važni za obezbeđivanje efikasnog uvođenja peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom u ćelije. U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, peptid je deo fuzionog proteina koji sadrži, na primer, 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497. U drugim fuzijama, peptid predmetnog pronalaska može biti fuziran na antitelo kako je opisano u ovom dokumentu, ili na njegov funkcionalni deo, naročito u sekvencu antitela, tako da bude specifično ciljan od strane navedenog antitela, ili, na primer, na ili u antitelo koje je specifično za dendritične ćelije kako su opisane u ovom dokumentu.

Pored toga, peptid ili varijanta mogu biti dalje modifikovani da bi se poboljšala stabilnost i/ili vezivanje za MHC molekule kako bi se izazvao jači imunski odgovor. Metodi za takvu optimizaciju peptidne sekvence su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju, na primer, uvođenje reverznih peptidnih veza ili nepeptidnih veza.

U reverznoj peptidnoj vezi, aminokiselinski ostaci nisu povezani peptidnim (-CO-NH-) vezama već je peptidna veza obrnuta. Takvi retro-inverzni peptidomimetici mogu biti napravljeni pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, na primer poput onih opisanih u radu Meziere i sar. (1997) (Meziere et al., 1997). Ovaj pristup obuhvata pravljenje pseudopeptida koji sadrže izmene koje uključuju kostur, a ne orijentaciju bočnih lanaca. Meziere i saradnici (Meziere et al., 1997) pokazuju da su ovi pseudopeptidi korisni za vezivanje MHC i T-pomoćničke ćelijske odgovore. Retro-inverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, mnogo su otporniji na proteolizu.

Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent US 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.

Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, kako bi se pojačala stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili t-butiloksikarbonil grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9fluorenilmetoksi-karbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, t-butiloksikarbonil, ili amido grupa.

Nadalje, peptid pronalaska može biti sintetisan tako da se izmeni njegova prostorna konfiguracija. Na primer, može da se koristi D-izomer jednog ili više aminokiselinskih ostataka peptida, umesto uobičajenog L-izomera. Dodatno, najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka peptida predstavljenih u ovom dokumentu može da se supstituiše jednim od dobro poznatih aminokiselinskih ostataka koji se normalno ne javljaju u prirodi. Izmene poput ovih mogu služiti da se poveća stabilnost, bioraspoloživost i/ili vezivanje peptida pronalaska.

Slično tome, peptid pronalaska može da se modifikuje hemijski, reakcijom sa specifičnim aminokiselinama bilo pre ili nakon sinteze peptida. Primeri za takve modifikacije dobro su poznati u predmetnoj oblasti i sažeto predstavljeni, na primer, u radu R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3. izdanje, CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004). Hemijska modifikacija aminokiselina uključuje, ali nije i ograničeno na, modifikaciju pomoću acilacije, amidinacije, piridoksilacije lizina, redukcione alkilacije, trinitrobenzilacije amino grupa sa 2,4,6-trinitrobenzen sulfonskom kiselinom (TNBS), amidne modifikacije karboksilnih grupa i sulfhidrilne modifikacije pomoću oksidacije cisteina performinskom kiselinom do cisteinske kiseline, obrazovanja živinih derivata, obrazovanja mešovitih disulfida sa drugim tiolnim jedinjenjima, reakcije sa maleimidom, karboksimetilacije sa jodosirćetnom kiselinom ili jodoacetamidom i karbamilacije sa cijanatom u alkalnoj pH sredini, iako bez ograničenja na ovde navedeno. U ovom pogledu, osoba stručna u predmetnoj oblasti se upućuje na poglavlje 15 Trenutno važećih protokola u nauci o proteinima, urednici Coligan i sar. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995) za opsežniju metodologiju u vezi sa hemijskim modifikacijama proteina.

Ukratko, modifikacija, na primer, arginilskih ostataka u proteinima često se bazira na reakciji vicinalnih dikarbonilnih jedinjenja kao što su fenilglioksal, 2,3-butandion i 1,2-cikloheksandion kako bi se obrazovao adukt. Drugi primer je reakcija metilglioksala sa argininskim ostacima. Cistein može da se modifikuje bez istovremene modifikacije drugih nukleofilnih mesta kao što su lizin i histidin. Kao rezultat, dostupan je veliki broj reagenasa za modifikaciju cisteina. Veb stranice kompanija kao što je Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) pružaju informacije o specifičnim reagensima.

Selektivna redukcija disulfidnih veza u proteinima je takođe uobičajena. Disulfidne veze mogu da se formiraju i oksidiraju u toku tretiranja biofarmaceutika toplotom. Woodwardov reagens K može da se koristi za modifikaciju specifičnih ostataka glutaminske kiseline. N-(3-(dimetilamino)propil)-N’-etilkarbodiimid može da se koristi za obrazovanje intramolekularnih unakrsnih veza između lizinskog ostatka i ostatka glutaminske kiseline. Na primer, dietilpirokarbonat je reagens za modifikaciju histidilskih ostataka u proteinima. Histidin može takođe da se modifikuje pomoću 4-hidroksi-2-nonenala. Reakcija lizinskih ostataka i drugih α-amino grupa je, na primer, korisna u vezivanju peptida za površine ili unakrsno povezivanje proteina/peptida. Lizin je mesto vezivanja poli(etilen)glikola i glavno mesto modifikacije u glikozilaciji proteina. Metioninski ostaci u proteinima mogu da se modifikuju pomoću npr. jodoacetamida, bromoetilamina i hloramina T.

Tetranitrometan i N-acetilimidazol mogu da se koriste za modifikaciju tirozilskih ostataka. Unakrsno povezivanje pomoću obrazovanja ditirozina može da se postigne vodonik peroksidom/jonima bakra.

U nedavnim studijama o modifikaciji triptofana korišćeni su N-bromosukcinimid, 2-hidroksi-5-nitrobenzil bromid ili 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmerkapto)-3H-indol (BPNS-skatol).

Uspešna modifikacija terapeutskih proteina i peptida sa PEG je često udružena sa produžavanjem poluživota u cirkulaciji dok se unakrsno povezivanje proteina sa glutaraldehidom, polietilen glikol diakrilatom i formaldehidom koristi za pripremanje hidrogelova. Hemijska modifikacija alergena za imunoterapiju se često postiže karbamilacijom sa kalijum cijanatom.

Peptid, naznačen time što je peptid modifikovan ili sadrži nepeptidne veze je poželjno otelotvorenje pronalaska.

Drugo otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na peptid koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV: 53 i koji je sintetički proizveden (npr. sintetisan) u vidu farmaceutski prihvatljive soli. Metodi sintetičke proizvodnje peptida dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Soli peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno se razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi stvoreni in vivo nisu soli. Peptid u obliku neprirodne soli posreduje u rastvorljivosti peptida, konkretno u kontekstu farmaceutskih smeša koje sadrže peptide, npr. peptidne vakcine predstavljene u ovom dokumentu. Neophodna je dovoljna i barem značajna rastvorljivost peptida da bi se ispitaniku koji se leči efikasno obezbedili peptidi. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida. Ove soli u skladu sa pronalaskom obuhvataju alkalne i zemnoalkalne soli kao što su soli Hofmeister serije koja sadrži kao anjone PO4<3->, SO4<2->, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN<->i kao katjone NH4<+>, Rb<+>, K<+>, Na<+>, Cs<+>, Li<+>, Zn<2+>, Mg<2+>, Ca<2+>, Mn<2+>, Cu<2+>i Ba<2+>. Soli su naročito izabrane od (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4),, Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2i Ba(SCN)2. Naročito poželjne su NH acetat, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl i CaCl2, kao, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli.

Uopšteno, peptidi i varijante (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas i sar. (Lukas et al., 1981) i u tamo citiranim referencama. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetilakrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih preformiranih simetričnih anhidridnih derivata sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog spajanja posredovane N, N-dicikloheksil-karbodiimid/1hidroksibenzotriazolom. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, (Bruckdorfer et al., 2004) i reference koje su tamo citirane).

Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, UK).

Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija prema veličini, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.

Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.

Radi identifikacije HLA liganada pomoću masene spektrometrije, HLA molekuli iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni a sekvence su identifikovane pomoću onlajn eksperimenata nano-elektrosprej-jonizacije (nanoESI) tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Tako dobijene peptidne sekvence su potvrđene poređenjem obrasca fragmentacije prirodnih tumor-asociranih peptida (TUMAP-ova) zabeleženog iz uzoraka raka jajnika (N ≥ 80 uzorka) sa obrascima fragmentacije odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Budući da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati daju direktan dokaz za prirodnu obradu i prezentaciju identifikovanih peptida na tkivu primarnog malignog tumora dobijenog od ≥ 80 pacijenata sa rakom jajnika (uporedite primer 1).

Linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.1 (vidite na primer US 2013-0096016) omogućava identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prezentovanih peptida kandidata za vakcinu na osnovu direktne relativne kvantifikacije nivoa HLA-restrikovanog peptida na malignim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nemalignih tkiva i organa. Ovo je postignuto razvojem diferencijalne kvantifikacije bez obeležavanja primenom podataka dobijenih pomoću LC-MS koji su obrađeni vlasničkom linijom za analizu podataka, kombinovanjem algoritama za identifikaciju sekvence, grupisanje spektra, brojanje jona, poravnanje vremena zadržavanja, slabljenje naelektrisanog stanja i normalizaciju.

Kompleksi HLA-peptid iz uzoraka tkiva raka jajnika su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani i analizirani pomoću LC-MS (vidite primer 1). Svi TUMAP-ovi koji su sadržani u predmetnoj aplikaciji ovim pristupom su identifikovani na uzorcima primarnog raka jajnika čime je potvrđena njihova prezentacija na primarnom raku jajnika.

Pored prezentacije peptida, testirana je i ekspresija iRNK osnovnog gena. Podaci iRNK dobijeni su putem RNKSeq analiza normalnih tkiva i tkiva raka (uporedite primer 2, sliku 1). Peptidi koji su dobijeni iz proteina čija je kodirajuća iRNK visoko eksprimirana u tkivu raka, ali vrlo nisko ili je odsutna u vitalnim normalnim tkivima, su poželjno uključeni u predmetni pronalazak.

Predmetni pronalazak obezbeđuje peptid koji je koristan u lečenju raka / tumora, poželjno raka jajnika koji prekomerno ili isključivo prezentuje peptid pronalaska. Za ovaj peptid je pokazano masenom spektrometrijom da ga prirodno prezentuju HLA molekuli na uzorcima primarnog humanog raka jajnika.

Dokazano je da su mnogi izvorni geni/proteini (koji se takođe nazivaju „proteini kompletne dužine“ ili „osnovni proteini“) iz kojih su dobijeni peptidi visoko prekomerno eksprimirani u raku u poređenju sa normalnim tkivima – „normalna tkiva“ u pogledu ovog pronalaska označavaju ili zdrave ćelije jajnika ili normalne ćelije drugih tkiva, što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena (vidite primer 2). Štaviše, sami peptidi su prezentovani na tumorskom tkivu – „tumorsko tkivo“ u pogledu ovog pronalaska označava uzorak od pacijenta koji boluje od raka jajnika.

HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije raka jajnika koje prezentuju dobijene peptide.

Za peptid predmetnog pronalaska je dokazano da je sposoban da stimuliše T-ćelijske odgovore i/ili da je prekomerno prezentovan i da samim tim može da se koristi za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, kao što su solubilni TCR-ovi, u skladu sa predmetnim pronalaskom (vidite primer 3 i primer 4). Pored toga, peptidi, kada su u kompleksu sa odgovarajućim MHC, mogu takođe da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, konkretno sTCR-ova, u skladu sa predmetnim pronalaskom. Odgovarajući metodi dobro su poznati osobi stručnoj u ovoj oblasti i mogu se naći i u odgovarajućoj literaturi (vidite takođe i u nastavku). Tako je peptid predmetnog pronalaska koristan za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptid predmetnog pronalaska nije prezentovan na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.

Predmetni opis se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove) koji sadrže alfa lanac i beta lanac („alfa/beta TCR-ovi“). Takođe je obezbeđen peptid u skladu sa pronalaskom koji je sposoban da se vezuje za TCR-ove i antitela kada ih prezentuje MHC molekul.

Predmetni opis se takođe odnosi na fragmente TCR-ova u skladu sa pronalaskom koji su sposobni da se vežu za peptidni antigen u skladu sa predmetnim pronalaskom kada ga prezentuje HLA molekul. Termin se naročito odnosi na rastvorljive fragmente TCR-ova, na primer TCR-ovi kojima nedostaju transmembranski delovi i/ili konstantni regioni, jednolančani TCR-ovi i njihove fuzije sa, na primer, Ig.

Predmetni opis se takođe odnosi na nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine za eksprimiranje TCR-ova i peptida predmetnog opisa; i metode za primenu istih.

Termin „T-ćelijski receptor“ (skraćeno TCR) odnosi se na heterodimerni molekul koji sadrži alfa polipeptidni lanac (alfa lanac) i beta polipeptidni lanac (beta lanac), naznačeno time što je heterodimerni receptor sposoban da se vezuje za peptidni antigen koji prezentuje HLA molekul. Termin takođe obuhvata takozvane gama/delta TCR-ove.

U jednom otelotvorenju opis obezbeđuje metod proizvodnje TCR-a kakav je opisan u ovom dokumentu, a metod se sastoji od uzgajanja ćelije domaćina koja je sposobna da eksprimira TCR u uslovima pogodnim za promociju ekspresije TCR-a.

U drugom aspektu opis se odnosi na metode u skladu sa opisom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom ili se antigen postavlja na MHC tetramere klase I ili II tetramerizacijom monomera kompleksa antigen/MHC klase I ili II.

Alfa i beta lanci alfa/beta TCR-ova i gama i delta lanci gama/delta TCR-ova se uopšteno smatraju kao da svaki ima dva „domena“, naime varijabilni i konstantni domen. Varijabilni domen sastoji se od spoja varijabilnog regiona (V) i spojnog regiona (J). Varijabilni domen može da sadrži i vodeći region (L). Beta i delta lanci mogu takođe da uključuju region diverziteta (D). Alfa i beta konstantni domeni mogu takođe da sadrže C-terminalne transmembranske (TM) domene koji usidravaju alfa i beta lance za ćelijsku membranu.

U pogledu gama/delta TCR-ova, termin „TCR gama varijabilni domen“ na način kako je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na spoj TCR gama V (TRGV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR gama J (TRGJ) regiona, a termin „TCR gama konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRGC region, ili na C-terminalno skraćenu TRGC sekvencu. Isto tako, termin „TCR delta varijabilni domen“ odnosi se na spoj TCR delta V (TRDV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR delta D/J (TRDD/TRDJ) regiona, a termin „TCR delta konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRDC region, ili na C-terminalno skraćenu TRDC sekvencu.

TCR-ovi predmetnog opisa se poželjno vezuju za kompleks peptid-HLA molekul sa afinitetom vezivanja (KD) od oko 100 µmol/l ili manje, oko 50 µmol/l ili manje, oko 25 µmol/l ili manje, ili oko 10 µmol/l ili manje. Još poželjniji su TCR-ovi visokog afiniteta koji imaju afinitete vezivanja od oko 1 µmol/l ili manje, oko 100 nmol/l ili manje, oko 50 nmol/l ili manje, oko 25 nmol/l ili manje. Neograničavajući primeri poželjnih opsega afiniteta vezivanja za TCR-ove predmetnog pronalaska obuhvataju oko 1 nmol/l do oko 10 nmol/l; oko 10 nmol/l do oko 20 nmol/l; oko 20 nmol/l do oko 30 nmol/l; oko 30 nmol/l do oko 40 nmol/l; oko 40 nmol/l do oko 50 nmol/l; oko 50 nmol/l do oko 60 nmol/l; oko 60 nmol/l do oko 70 nmol/l; oko 70 nmol/l do oko 80 nmol/l; oko 80 nmol/l do oko 90 nmol/l; i oko 90 nmol/l do oko 100 nmol/l.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu u vezi sa TCR-ovima predmetnog opisa, termin „specifično vezivanje“ i njegove gramatičke varijante koriste se da označe TCR koji ima afinitet vezivanja (KD) za kompleks peptid-HLA molekul od 100 µmol/l ili manje.

Alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu da imaju uvedenu disulfidnu vezu između njihovih konstantnih domena. Poželjni TCR-ovi ovog tipa obuhvataju one koji imaju TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena osim što su Thr 48 TRAC-a i Ser 57 TRBC1-a ili TRBC2-a zamenjeni cisteinskim ostacima, navedeni cisteini obrazuju disulfidnu vezu između TRAC sekvence konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvence konstantnog domena TCR-a.

Sa ili bez uvedene veze između lanaca navedene iznad, alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu imati TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena, a TRAC sekvenca konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvenca konstantnog domena TCR-a mogu biti povezane prirodnom disulfidnom vezom između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2.

TRC-ovi predmetnog opisa mogu sadržati detektabilnu oznaku izabranu iz grupe koju čine radionuklid, fluorofor i biotin. TRC-ovi predmetnog opisa mogu biti konjugovani za terapeutski aktivan agens, kao što je radionuklid, hemioterapijski agens ili toksin.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa koji ima najmanje jednu mutaciju u alfa lancu i/ili ima najmanje jednu mutaciju u beta lancu ima modifikovanu glikozilaciju u poređenju sa nemutiranim TCR.

U jednom otelotvorenju, TCR koji sadrži najmanje jednu mutaciju u alfa lancu TCR i/ili beta lancu TCR ima afinitet vezivanja za, i/ili poluživot vezivanja za, kompleks peptid-HLA molekul, koji je najmanje dvostruk od afiniteta vezivanja/poluživota vezivanja TCR-a koji sadrži nemutirani alfa lanac TCR i/ili nemutirani beta lanac TCR. Pojačanje afiniteta tumor-specifičnih TCR-ova, i njegovo iskorišćavanje, oslanja se na postojanju prozora za optimalne TCR afinitete. Postojanje takvog prozora zasnovano je na opažanjima da TCR-ovi specifični za HLA-A2-restrikovane patogene imaju KD vrednosti koje su uopšteno oko 10 puta manje u poređenju sa TCR-ovima specifičnim za HLA-A2-restrikovane tumorasocirane autoantigene. Sada je poznato da će imunski sistem, iako tumorski antigeni imaju potencijal da budu imunogeni, zato što tumori nastaju iz sopstvenih ćelija pojedinca, videti samo mutirane proteine ili proteine sa izmenjenom translacionom obradom kao strane. Antigeni koji su ushodno regulisani ili prekomerno eksprimirani (takozvani autoantigeni) neće nužno indukovati funkcionalni imunski odgovor protiv tumora: T ćelije koje eksprimiraju TCR-ove koji su visoko reaktivni na ove antigene bile su negativno selektovane u timusu tokom procesa koji se zove centralna tolerancija, što znači da ostaju samo T ćelije sa TCR-ovima niskog afiniteta za autoantigene. Stoga, afinitet TCR-ova ili varijanti predmetnog opisa za peptide može da se pojača pomoću metoda koje su dobro poznate u predmetnoj oblasti.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od inkubacije mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa, na primer, monomerima A2/peptid, inkubacije PBMC sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od dobijanja transgenskog miša sa čitavim humanim TCRα β genskim lokusima (1,1 i 0,7 Mb), čije T ćelije eksprimiraju raznolik repertoar humanih TCR koji kompenzuje za TCR deficijenciju miša, imunizacije miša sa peptidom, inkubacije PBMC dobijenih od transgenskih miševa sa tetramerfikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)–Calibur.

U jednom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR alfa i/ili TCR beta lance predmetnog opisa se kloniraju u vektore ekspresije, kao što su gama retrovirus ili lentivirus. Rekombinantni virusi se stvaraju a zatim testiraju za funkcionalnost, kao što je antigenska specifičnost i funkcionalni aviditet. Zatim se alikvot konačnog proizvoda koristi za transdukciju ciljne T-ćelijske populacije (generalno prečišćene iz pacijentovih mononuklearnih ćelija periferne krvi, PBMC), koja se ekspandira pre infuzije pacijentu.

U drugom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti sintetišu se TCR RNK, npr. u in vitro transkripcionim sistemima. In vitro sintetisane TCR RNK se zatim uvode u primarne CD8+ T ćelije dobijene od zdravih donora elektroporacijom u cilju ponovnog eksprimiranja tumor-specifičnih TCR alfa i/ili TCR beta lanaca.

Radi povećanja ekspresije, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti operabilno povezane sa snažnim promoterima, kao što su retrovirusni dugi terminalni ponovci (LTR-ovi), citomegalovirus (CMV), mišji virus matičnih ćelija (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK), β-aktin, ubikvitin, i simijan virus 40 (SV40)/CD43 kompozitni promoter, faktor elongacije (EF)-1a i promoter virusa formiranja fokusa u slezini (SFFV). U jednom poželjnom otelotvorenju, promoter je heterologan za nukleinsku kiselinu koja se eksprimira.

Pored snažnih promotera, kasete TCR ekspresije predmetnog opisa mogu da sadrže dodatne elemente koji mogu da pojačaju transgensku ekspresiju, uključujući centralni polipurinski trakt (cPPT), koji promoviše nukleusnu translokaciju lentivirusnih konstrukata (Follenzi et al., 2000), i posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota (wPRE), koji povećava nivo transgenske ekspresije povećanjem stabilnosti RNK (Zufferey et al., 1999).

Alfa i beta lanci TCR-a predmetnog pronalaska mogu da budu kodirani nukleinskim kiselinama koje se nalaze u zasebnim vektorima, ili mogu da budu kodirani polinukleotidima koji se nalaze u istom vektoru.

Postizanje površinske ekspresije TCR-a visokog stepena iziskuje da i TCR alfa i TCR beta lanci uvedenog TCR-a budu transkribovani u visokim nivoima. Da bi se to izvelo, TCR alfa i TCR beta lanci predmetnog opisa mogu da budu klonirani u bicistronske konstrukte u jednom vektoru, za koji je dokazano da je u stanju da prevaziđe ovu prepreku. Upotreba virusnog mesta vezivanja ribozoma (IRES) između TCR alfa i TCR beta lanaca rezultuje koordinisanom ekspresijom oba lanca, zato što se TCR alfa i TCR beta lanci stvaraju iz jednog transkripta koji se cepa na dva proteina tokom translacije, čime se osigurava da se proizvodi podjednak molarni odnos TCR alfa i TCR beta lanaca (Schmitt et al., 2009).

Nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti kodonski optimizovane da bi se povećala ekspresija iz ćelije domaćina. Obilnost genetskog koda omogućava da neke aminokiseline budu kodirane pomoću više od jednog kodona, ali određeni kodoni su manje „optimalni‘‘ od drugih zbog relativne raspoloživosti podudarnih tRNK kao i drugih faktora (Gustafsson et al., 2004). Pokazano je da modifikacija TCR alfa i TCR beta genskih sekvenci tako da svaka aminokiselina bude kodirana optimalnim kodonom za ekspresiju sisarskih gena, kao i eliminacija motiva nestabilnosti iRNK ili mesta kriptičkog cepanja, značajno pojačava ekspresiju TCR alfa i TCR beta gena (Scholten et al., 2006).

Pored toga, pogrešno uparivanje uvedenih i endogenih TCR lanaca može rezultovati dobijanjem specifičnosti koje predstavljaju značajan rizik za autoimunost. Na primer, obrazovanje mešovitih TCR dimera može smanjiti broj CD3 molekula dostupnih za obrazovanje pravilno uparenih TCR kompleksa, te stoga može značajno smanjiti funkcionalni aviditet ćelija koje eksprimiraju uvedeni TCR (Kuball et al., 2007).

Da bi se smanjilo pogrešno uparivanje, C-terminalni domen uvedenih TCR lanaca predmetnog opisa može da se modifikuje da bi se promovisao međulančani afinitet, uz smanjenje sposobnosti uvedenih lanaca da se sparuju sa endogenim TCR. Ove strategije mogu da uključuju zamenu humanih TCR alfa i TCR beta C-terminalnih domena sa njihovim mišjim antipodima (murinizovani C-terminalni domen); stvaranje druge međulančane disulfidne veze u C-terminalnom domenu uvođenjem drugog ostatka cisteina i u TCR alfa i u TCR beta lanac uvedenog TCR-a (cisteinska modifikacija); zamenjivanje interagujućih ostataka u C-terminalnim domenima TCR alfa i TCR beta lanca („knob-in-hole“); i fuziju varijabilnih domena TCR alfa i TCR beta lanaca direktno na CD3ζ (CD3ζ fuzija) (Schmitt et al., 2009).

U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin se projektuje da eksprimira TCR predmetnog opisa. U poželjnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je humana T ćelija ili progenitorska T ćelija. U nekim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od pacijenta obolelog od raka. U drugim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od zdravog donora. Ćelije domaćini predmetnog opisa mogu da budu alogene ili autologne u odnosu na pacijenta koji će se lečiti. U jednom otelotvorenju, domaćin je gama/delta T ćelija transformisana da eksprimira alfa/beta TCR.

„Farmaceutska smeša“ je smeša koja je pogodna za davanje ljudskom biću u medicinskim okolnostima. Poželjno, farmaceutska smeša je sterilna i proizvedena u skladu sa smernicama Dobre proizvođačke prakse (DPP).

Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (pogledajte ranije u tekstu). Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu –NH2 grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične.

U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoro acetata ili hlorovodonične kiseline (hloridi).

Poželjno, lek predmetnog pronalaska je imunoterapeutik, kao što je vakcina. Ona se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transfektovane tako da koeksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (vidite u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (pogledajte WO 95/18145 i (Longenecker et al., 1993)). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnom pronalasku se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 T ćelija je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 T ćelije, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju one identifikovane u predmetnom pronalasku.

U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iznetu u ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV 772 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid pronalaska. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira polipeptid u skladu sa pronalaskom.

Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarno kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.

Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.

Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid pronalaska koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK i sar. (Saiki et al., 1988). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid pronalaska. Tako, DNK koja kodira peptid pronalaska može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, da se konstruiše vektor ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida pronalaska. Takve tehnike uključuju one izložene u, na primer, patentima US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji sačinjava jedinjenje pronalaska može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.

Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.

Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK pronalaska se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

Tipični plazmidni vektor ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži CMV ili SV40 promoter sa prikladnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL koji je dostupan kod kompanije Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog sisarskog vektora ekspresije je pMSG, koji je takođe dostupan kod kompanije Pharmacia. Korisni kvasnički plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 koji su generalno dostupni kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su integrišući plazmidi kvasnice (YIps) i inkorporiraju selektivne markere kvasnica HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su centromerni plazmidi kvasnice (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promoteru (na primer, kompanije Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno označavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije obezbeđuju fleksibilnost prilikom detekcije.

Snažni regulatorni region, humani citomegalovirus (CMV) promoter dovodi nivoe ekspresije konstitutivnog proteina čak i do 1 mg/l u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično ~0,1 mg/l. Prisustvo izvora SV40 replikacije će rezultovati visokim nivoima DNK replikacije u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu sadržati izvor pMB1 (derivat pBR322) za replikaciju u bakterijskim ćelijama, gen za b-laktamazu za izbor rezistencije na ampicilin u bakterijama, hGH poliA i izvor f1. Vektori koji sadrže pre-pro-tripsin (PPT) vodeću sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum za kultivaciju za prečišćavanje pomoću ANTI-FLAG antitela, smola i pločica. Drugi vektori i sistemi za ekspresiju su dobro poznati u predmetnoj oblasti za upotrebu sa raznim ćelijama domaćinima.

U drugom otelotvorenju dva ili više peptida pronalaska su kodirani i samim tim eksprimirani po sukcesivnom redosledu (slično konstruktima „brojanica“). Pritom, peptidi ili varijante peptida mogu biti povezani ili spojeni zajedno pomoću regija povezujućih aminokiselina, kao što je na primer LLLLLL, ili mogu biti povezani bez bilo kakvih dodatnih peptida između njih. Ovi konstrukti mogu takođe da se koriste za antitumorsku terapiju i mogu indukovati imunske odgovore koji uključuju i MHC I i MHC II.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju ćelije kvasnica, insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.

Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, rad Cohen i sar. (Cohen et al., 1972) i (Green and Sambrook, 2012) . Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman i sar. (Sherman et al., 1986) . Metod koji je izložio Beggs (Beggs, 1978) takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.

Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini pronalaska korisne za pripremanje peptida pronalaska, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida pronalaska tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.

U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog karcinoma prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje metod za proizvodnju peptida pronalaska, metod koji obuhvata kultiviranje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

U drugom otelotvorenju, peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska koriste se u medicini. Na primer, peptid ili njegova varijanta mogu biti pripremljeni za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al., 2012).

Polinukleotid koji se koristi za aktivnu vakcinaciju može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. Teufel i sar. (Teufel et al., 2005). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adenoasociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.

Lek pronalaska može takođe da sadrži jedan ili više adjuvanasa. Adjuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imunski odgovor (npr. imunske odgovore posredovane CD8-pozitivnim T ćelijama i pomoćničkim T (TH) ćelijama na antigen, i na taj način se smatraju korisnim u leku predmetnog pronalaska. Pogodni adjuvansi uključuju, ali nisu i ograničeni na, 1018 ISS, soli aluminijuma, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande dobijene od flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, IC30, IC31, imikvimod (ALDARA®), rezikvimod, ImuFact IMP321, interleukine poput IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa ili -beta, ili njihove pegilovane derivate, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulzije voda u ulju i ulje u vodi, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® vektorski sistem, poli(laktid ko-glikolid) [PLG]-zasnovane i mikročestice dekstrana, talaktoferin, SRL172, virozome i druge virusu slične partikule, YF-17D, VEGF klopku, R848, beta-glukan, Pam3Cys, QS21 stimulon kompanije Aquila, koji je dobijen od saponina, mikobakterijske ekstrakte i sintetičke mimetike bakterijskog ćelijskog zida i druge zaštićene adjuvanse kao što su Ribi-jev Detox, Quil, ili Superfos. Preferirani su adjuvansi kao što je Freund-ov ili GM-CSF. Nekoliko imunoloških adjuvanasa (npr. MF59) specifičnih za dendritične ćelije i njihova priprema opisani su ranije (Allison and Krummel, 1995). Takođe, mogu se koristiti citokini. Nekoliko citokina je direktno dovedeno u vezu sa uticajem na migraciju dendritičnih ćelija u limfna tkiva (npr. TNF-), ubrzavanjem sazrevanja dendritičnih ćelija u efikasne antigen-prezentujuće ćelije za T limfocite (npr. GM-CSF, IL-1 i IL-4) (patent registrovan u SAD pod brojem 5,849,589) i delovanjem kao imunoadjuvansi (npr. IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).

Takođe, objavljeno je da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi poboljšavaju efekte adjuvanasa u sastavu vakcine. Bez ograničavanja postojećom teorijom, CpG oligonukleotidi deluju aktiviranjem urođenog (neadaptivnog) imunskog sistema preko Toll-like receptora (TLR), uglavnom TLR9. Aktivacija TLR9 pokrenuta CpG-om pojačava antigen-specifične humoralne i ćelijske odgovore na širok spektar antigena, uključujući peptidne ili proteinske antigene, žive ili mrtve viruse, vakcine dendritičnim ćelijama, autologne ćelijske vakcine i polisaharidne konjugate kako u profilaktičkim tako i terapijskim vakcinama. Što je važnije, ona poboljšava sazrevanje i diferencijaciju dendritičnih ćelija, što dovodi do pojačane aktivacije TH1 ćelija i snažnog stvaranja citotoksičnih T limfocita (CTL), čak i u odsustvu pomoći CD4 T ćelija. Predominacija TH1 indukovana pomoću TLR9 stimulacije se održava čak i u prisustvu adjuvanasa u vakcini kao što je aluminijum ili nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) koji normalno promovišu predominaciju TH2. CpG oligonukleotidi pokazuju još veću adjuvansnu aktivnost kada se formulišu ili istovremeno primenjuju sa drugim adjuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice, nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije, koje su naročito neophodne za indukovanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imunski odgovor i omogućavaju da se doze antigena smanje za približno dva reda veličine, sa uporedivim odgovorima antitelima na punu dozu vakcine bez CpG u pojedinim eksperimentima (Krieg, 2006). Patent registrovan u SAD pod brojem 6,406,705 B1 opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, adjuvanasa u obliku nenukleinskih kiselina i antigena za indukovanje antigen-specifičnog imunskog odgovora.

Antagonist CpG TLR9 je dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) kompanije Mologen (Berlin, Nemačka) koji je preferirana komponenta farmaceutske smeše predmetnog pronalaska. Takođe, mogu se koristiti i drugi molekuli koji vezuju TLR kao što su RNK koja vezuje TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9.

Drugi primeri korisnih adjuvanasa uključuju, ali nisu i ograničeni na, hemijski modifikovane CpG-jeve (npr. CpR, Idera), analoge dsRNK kao što su Poly(I:C) i njegovi derivati (npr. AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ne-CpG bakterijska DNK ili RNK kao i imunoaktivne male molekule i antitela poput ciklofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab®-a, celebreksa, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafeniba, temozolomida, temsirolimusa, XL-999, CP-547632, pazopaniba, VEGF klopke, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, druga antitela koja ciljaju ključne strukture imunskog sistema (npr. anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalfa receptor) i SC58175, koji mogu delovati terapijski i/ili kao adjuvans. Količine i koncentracije adjuvanasa i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog pronalaska, stručnjak iz ove oblasti može lako da utvrdi bez izvođenja suvišnih eksperimenata.

Poželjni adjuvansi su anti-CD40, imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda i rezikvimoda. U poželjnom otelotvorenju farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom, adjuvans je ciklofosfamid, imikvimod ili rezikvimod. Još poželjniji adjuvansi su Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAT ili njihove kombinacije.

Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, razblaživača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta iz priručnika A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2112253.

Važno je da se razume da imunski odgovor izazvan vakcinom u skladu sa pronalaskom napada maligni tumor u različitim ćelijskim fazama i različitim stadijumima razvoja. Pored toga napadaju se i različiti signalni putevi povezani sa malignim tumorom. Ovo je prednost u odnosu na vakcine koje ciljaju samo jedan ili nekoliko ciljeva, što može dovesti do toga da se tumor lako adaptira na napad (izbegavanje tumora). Pored toga, ne eksprimiraju svi pojedinačni tumori isti obrazac antigena. Zbog toga, kombinacija nekoliko tumorasociranih peptida osigurava da svaki pojedinačan tumor nosi najmanje neki od ciljeva. Smeša je dizajnirana na takav način da se očekuje da svaki tumor eksprimira nekoliko antigena i pokriva nekoliko nezavisnih puteva neophodnih za rast i održavanje tumora. Tako, vakcina se lako može koristi „iz zaliha“ za veću populaciju pacijenata. Ovo znači da prethodna selekcija pacijenata koji će biti lečeni vakcinom može da se ograniči na HLA tipizaciju, ne zahteva bilo kakve dodatne procene biomarkera za ekspresiju antigena, ali se i dalje osigurava da nekoliko ciljeva bude napadnuto istovremeno od strane indukovanog imunskog odgovora, što je važno za efikasnost (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „skela“ odnosi se na molekul koji se specifično vezuje za (npr. antigenu) determinantu. U jednom otelotvorenju, skela je u stanju da usmeri jedinicu za koju je zakačena (npr. (drugo) jedinjenje koje vezuje antigen) na ciljno mesto, na primer specifičnu vrstu tumorske ćelije ili stromu tumora koja nosi antigenu determinantu (npr. kompleks peptida sa MHC-om, u skladu sa predmetnom prijavom). U drugom otelotvorenju skela je u stanju da aktivira signalizaciju kroz njen ciljni antigen, na primer T-ćelijski receptor kompleksni antigen. Skele obuhvataju ali nisu i ograničene na antitela i njihove fragmente, antigen-vezujuće domene antitela, koji sadrže varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela, vezujuće proteine koji sadrže najmanje jedan ponovljeni motiv ankirina i antigen-vezujuće molekule sa jednim domenom (SDAB), aptamere, (solubilne) TCR-ove i (modifikovane) ćelije kao što su alogene ili autologne T ćelije. Radi procene da li je molekul skela koja se vezuje za cilj, mogu se izvršiti testovi vezivanja.

„Specifično“ vezivanje znači da skela vezuje kompleks peptid-MHC od interesa bolje nego druge komplekse peptid-MHC koji se prirodno javljaju, do te mere da skela koja je naoružana aktivnim molekulom koji je u stanju da ubije ćeliju koja nosi specifičan cilj nije u stanju da ubije drugu ćeliju bez specifičnog cilja ali koja prezentuje drugi/-e kompleks/-e peptid-MHC. Vezivanje za druge komplekse peptid-MHC je nebitno ako se peptid unakrsno reaktivnog peptid-MHC ne javlja u prirodi, tj. nije dobijen uz humanog HLA-peptidoma. Testovi za procenu ubijanja ciljne ćelije dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Oni bi trebalo da se izvrše primenom ciljnih ćelija (primarnih ćelija ili ćelijskih linija) sa neizmenjenom prezentacijom peptid-MHC-a, ili ćelija u koje su ubačeni peptidi tako da se postižu prirodno javljajući nivoi peptid-MHC-a.

Svaka skela može da sadrži oznaku koja omogućava da vezana skela može da se detektuje određivanjem prisustva ili odsustva signala koji daje oznaka. Na primer, skela može da se obeleži fluorescentnom bojom ili bilo kojim drugim primenjivim ćelijskim markerskim molekulom. Takvi markerski molekuli su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Na primer fluorescentno obeležavanje, na primer koje obezbeđuje fluorescentna boja, može da obezbedi vizuelizaciju vezanog aptamera pomoću fluorescentne ili laserske skenirajuće mikroskopije ili protočne citometrije.

Svaka skela može da se konjuguje sa drugim aktivnim molekulom kao što su na primer IL-21, anti-CD3 i anti-CD28. Za dodatne informacije o polipeptidnim skelama vidite na primer uvodni odeljak patenta WO 2014/071978A1 i reference koje su citirane u dokumentu.

Predmetna objava se dalje odnosi na aptamere. Aptameri (vidite na primer patent WO 2014/191359 i tamo citiranu literaturu) su kratki jednolančani molekuli nukleinske kiseline koji mogu da se presaviju u definisane trodimenzionalne strukture i prepoznaju specifične ciljne strukture. Ispostavilo se da su oni pogodne alternative za razvoj ciljanih terapija. Pokazalo se da se aptameri selektivno vezuju za raznolike kompleksne ciljeve sa visokim afinitetom i specifičnošću.

U poslednjoj dekadi su identifikovani aptameri koji prepoznaju molekule koji se nalaze na površini ćelije i obezbeđuju načine za razvoj dijagnostičkih i terapeutskih pristupa. Budući da se pokazalo da aptameri praktično nemaju toksičnost i imunogenost oni su obećavajući kandidati za biomedicinske primene. Aptameri su zaista, na primer aptameri koji prepoznaju membranski antigen specifičan za prostatu, uspešno upotrebljeni za ciljane terapije i pokazalo se da su funkcionalni u in vivo modelima ksenografta. Pored toga, identifikovani su aptameri koji prepoznaju specifične tumorske ćelijske linije.

Mogu da se izaberu DNK aptameri kako bi se otkrila svojstva prepoznavanja širokog spektra za različite ćelije malignih tumora, a naročito one dobijene iz solidnih tumora, dok se netumorogene i primarne zdrave ćelije ne prepoznaju. Ako identifikovani aptameri prepoznaju ne samo specifični podtip tumora već interaguju sa nizom tumora, ovo čini aptamere primenjivim kao takozvana dijagnostička i terapeutska sredstva širokog spektra.

Nadalje, ispitivanje ponašanja ćelijskog vezivanja pomoću protočne citometrije pokazalo je da aptameri pokazuju veoma dobre jasne afinitete koji su u nanomolarnom opsegu.

Aptameri su korisni za dijagnostičke i terapeutske svrhe. Pored toga, moglo je da se pokaže da neke od aptamera preuzimaju tumorske ćelije i tako mogu da imaju funkciju kao prenosioci molekula za ciljano dostavljanje antitumorskih agenasa kao što je siRNK u tumorske ćelije.

Mogu da se izaberu aptameri protiv kompleksnih ciljeva kao što su ćelije i tkiva i kompleksi peptida koji sadrže, poželjno sastoje se od, sekvence u skladu sa bilo kojom od ovde izloženih ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV 772, sa MHC molekulom, koristeći cell-SELEX (sistematska evolucija liganada pomoću eksponencijalnog obogaćivanja) tehniku.

Peptid predmetnog pronalaska može da se koristi za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Ona se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.

Zato, dalji aspekt pronalaska je obezbeđivanje metoda za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom (poželjno peptidom u skladu sa predmetnim pronalaskom), pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inženjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje se specifično vezuje za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom.

Stoga je dalji aspekt pronalaska da se obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, naznačeno time što je antitelo poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bispecifično antitelo i/ili himerno antitelo.

Odgovarajući metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I, kao i ostali alati za proizvodnju ovih antitela izneti su u patentima WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, kao i publikacijama (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).

Poželjno, antitelo se vezuje za kompleks sa afinitetom vezivanja manjim od 20 nanomol/l, poželjno ispod 10 nanomol/l, što se u kontekstu predmetnog pronalaska takođe smatra „specifičnim“.

Predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 53 pronalaska koji indukuje T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom.

U ovom dokumentu dalje je predstavljen peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 52, odnosno ID BR. SEKV: 54 do ID BR. SEKV: 772 ili njihovu varijantu koja je najmanje 88% homologna (poželjno identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 52, odnosno ID BR. SEKV: 54 do ID BR. SEKV: 772, naznačeno time što navedeni peptid ili varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14 aminokiselina.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom koji ima sposobnost da se veže za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom naznačen time što peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu prema ID BR. SEKV: 53.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom, naznačen time što je peptid (hemijski) modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom, naznačen time što je peptid deo fuzionog proteina, konkretno koji sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii), ili naznačen time što je peptid fuziran na (ili u) antitelo, kao, na primer, antitelo koje je specifično za dendritične ćelije.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptid u skladu sa pronalaskom, pod uslovom da peptid nije potpun (kompletan) humani protein.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u medicini, konkretno u lečenju raka jajnika.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačen time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 53.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačene time što navedene T ćelije selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

U ovom dokumentu takođe je predstavljen metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid ID BR. SEKV: 53 predmetnog pronalaska, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćeliju u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa predmetnim pronalaskom za primenu u medicini. U nekim otelotvorenjima, peptid za upotrebu predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu u vidu leka ili upotrebu u proizvodnji leka. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid predmetnog pronalaska za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv raka.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid ID BR. SEKV: 53 za upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek vakcina. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na navedeni peptid za upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv raka.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid ID BR. SEKV: 53 za upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije raka, ćelije raka jajnika ili ćelije drugih solidnih ili hematoloških tumora kao što su hepatocelularni karcinom, kolorektalni karcinom, glioblastom, rak želuca, rak jednjaka, nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, rak pankreasa, karcinom bubrežnih ćelija, rak prostate, melanom, rak dojke, hronična limfocitna leukemija, non-Hodžkinov limfom, akutna mijeloidna leukemija, rak žučne kese i holangiokarcinom, rak mokraćne bešike, rak materice, skvamocelularni karcinom glave i vrata, mezoteliom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na konkretne markerske proteine i biomarkere zasnovane na peptidima u skladu sa predmetnim pronalaskom, u ovom tekstu nazvane „ciljevima“, a koji se mogu koristiti kod određivanja dijagnoze i/ili prognoze raka jajnika. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na cilj ID BR. SEKV: 53 u skladu sa pronalaskom za upotrebu u lečenju raka.

Termin „antitelo“ ili „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih ili „kompletnih“ molekula imunoglobulina, pod terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti (npr. CDR-ovi, Fv, Fab i Fc fragmenti) ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovanih verzija molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava (npr. specifično vezivanje markerskog (poli)peptida raka jajnika, isporučivanje toksina ćeliji raka jajnika koja eksprimira markerski gen za rak u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida raka jajnika) u skladu sa pronalaskom.

Kad god je to moguće, antitela pronalaska mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Antitela pronalaska mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osobi stručnoj u predmetnoj oblasti će biti poznato da za stvaranje antitela pronalaska mogu da se koriste ili markerski polipeptidi za rak jajnika kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela pronalaska može biti parcijalno ili kompletno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK.

Na primer, cDNK koja kodira peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao što je peptid u skladu sa ID BR. SEKV: 53 ili njegov fragment, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. ćelije kvasnica, insekata i sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za rak jajnika koji se koristi za stvaranje antitela u skladu sa pronalaskom.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će shvatiti da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd.; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela pogledajte, npr. rad Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Na primer, antitela mogu da se testiraju u ELISA testovima, ili Western blot testovima, imunohistohemijskim bojenjem uzoraka malignog tumora fiksiranih u formalinu ili zamrznutih isečaka tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.

Termin „monoklonalno antitelo“ na način na koji je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (US 4,816,567).

Monoklonalna antitela pronalaska mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.

Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu US 4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela pronalaska može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).

Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u patentima WO 94/29348 i US 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fc fragment. Tretiranje pepsinom proizvodi F(ab')2 fragment i pFc' fragment.

Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije, ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona ili specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disulfidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u predmetnoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.

Antitela pronalaska mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR-a nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR-a ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.

Metodi humanizacije nehumanih antitela dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR-ova ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. Saglasno tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (US 4,816,567), naznačena time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućom sekvencom iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.

U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira region spajanja teškog lanca antitela kod miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultira kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.

Antitela pronalaska se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u predmetnoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.

Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne kao i sistemske terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.

Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski a takva određivanja spadaju u okvir veštine predmetne oblasti. Osobe stručne u predmetnoj oblasti će razumeti da će doza antitela koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Nakon primene antitela, poželjno za tretiranje raka jajnika, efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u predmetnoj oblasti. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija malignog tumora kod ispitanika koji prima terapiju, može da se prati pomoću standardnih tehnika za imidžing tumora. Antitelo koje se primenjuje u terapijske svrhe, koje zaustavlja rast tumora, rezultuje smanjivanjem veličine tumora i/ili sprečava nastanak novih tumora u poređenju sa tokom bolesti koji bi nastao u odsustvu primene antitela, jeste efikasno antitelo za lečenje malignog tumora.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora (sTCR) koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se poveća pomoću mutageneze koja cilja komplementarne determinišuće regione. U svrhe odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T-ćelijski receptor može biti povezan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite, na primer, patent US 2013/0115191) i domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. Pored toga, on može biti eksprimiran u T ćelijama koje se koriste za adoptivni transfer. Dalje informacije se mogu naći u patentima WO 2004/033685A1 i WO 2004/074322A1. Kombinacija sTCR-ova opisana je u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju izneti su u WO 2013/057586A1.

Pored toga, peptidi i/ili TCR-ovi ili antitela ili drugi vezujući molekuli predmetnog pronalaska mogu da se koriste da se potvrdi dijagnoza raka patologa na osnovu bioptiranog uzorka.

Antitela ili TCR-ovi se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke testove. Uopšteno, antitelo se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije. U jednom otelotvorenju, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za vanćelijske domene dva ili više ciljeva proteina izabranih iz grupe koju čine gore navedeni proteini, a vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1x10 µmol/l.

Antitela za dijagnostičku primenu mogu biti obeležena probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti bi- ili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba za antitela uključuje kovalentno vezivanje probe, inkorporaciju probe u antitelo, i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije proteina in situ.

Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigenprezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.

Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.

Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Ljunggren i sar. (Ljunggren and Karre, 1985).

Poželjno, pre transfekcije ćelija domaćin značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje kostimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i kostimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.

U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivne T ćelije.

Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji je sposoban da eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 772, ili varijantu njegove aminokiselinske sekvence.

Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje T ćelija in vitro. Na primer, za generisanje CTL mogu da se koriste autologni tumor-infiltrišući limfociti. Plebanski i sar. (Plebanski et al., 1995) upotrebili su autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje T ćelija. Pored toga, moguća je proizvodnja autolognih T ćelija pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Takođe, za proizvodnju autolognih T ćelija mogu da se koriste B ćelije. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih T ćelija. S. Walter i sar. (Walter et al., 2003) opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U predmetnom pronalasku, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa kostimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina, kao što je interleukin-12.

Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija a metod je detaljno opisan u patentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice i ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga mogu da se koriste i virusi biljaka (pogledajte, na primer, rad Porta i sar. (Porta et al., 1994) u kom je opisan razvoj mozaičkog virusa crnog pasulja kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.

Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska korisne su u terapiji. Tako, dalji aspekt pronalaska obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodima pronalaska.

Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 772.

Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentan imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.

In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).

T ćelije predmetnog pronalaska mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Dalje je predstavljen metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kako je izneta u ovom dokumentu, pri čemu metod obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kao što je definisano ranije.

Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa nivoima ekspresije u normalnim tkivima, ili da je gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao, ali da je eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran“ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.

T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, npr. ranije opisanih.

Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Pregledi se mogu naći u: radu Gattioni i sar. i Morgan i sar. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Drugi aspekt predmetnog pronalaska obuhvata upotrebu peptida koji su u kompleksu sa MHC za stvaranje T-ćelijskog receptora čija nukleinska kiselina je klonirana i uvedena u ćeliju domaćina, poželjno T ćeliju. Ova stvorena T ćelija može zatim da se prenese u pacijenta radi lečenja raka.

Svaki molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, antitelo, vektor ekspresije, ćelija, aktivirana T ćelija, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).

Predmetni pronalazak je dalje usmeren na komplet koji se sastoji od:

(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;

(b) opciono druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i

(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.

Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica, brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.

Kompleti predmetnog pronalaska se poželjno sastoje od liofilizirane formulacije predmetnog pronalaska u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrži(e) uputstva na posudi ili uz nju koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za potkožnu primenu.

Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr. 2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni razblaživač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).

Nakon mešanja razblaživača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75 µg) a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500 µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, rablaživače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.

Kompleti predmetnog pronalaska mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša u skladu sa predmetnim pronalaskom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.

Poželjno, kompleti pronalaska obuhvataju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše. Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.

Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd.) koji omogućava primenu agenasa pronalaska koji su komponente predmetnog kompleta.

Predmetna formulacija je ona koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, supkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. primena može biti pomoću infuzione pumpe.

Budući da su peptidi pronalaska izolovani iz raka jajnika, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje raka jajnika.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod za proizvodnju personalizovanog farmaceutskog sredstva za pojedinačnog pacijenta, koji obuhvata proizvodnju farmaceutske smeše koja sadrži najmanje jedan peptid izabran iz skladišta prethodno skriniranih TUMAP-ova, naznačenu time što je najmanje jedan peptid upotrebljen u farmaceutskoj smeši izabran zbog prikladnosti za pojedinačnog pacijenta. U jednom otelotvorenju, farmaceutska smeša je vakcina. Metod takođe može biti prilagođen za proizvodnju T-ćelijskih klonova za nishodne primene, kao što je izolacija TCR, ili rastvorljivih antitela i druge terapijske opcije.

„Personalizovano farmaceutsko sredstvo“ će označavati specifično prilagođene terapije za jednog pojedinačnog pacijenta koje će se koristiti samo za terapiju kod tog pojedinačnog pacijenta, uključujući aktivno personalizovane antitumorske vakcine i adoptivne ćelijske terapije korišćenjem autolognog tkiva pacijenta.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „skladište“ će se odnositi na grupu ili skup peptida koji su prethodno skrinirani za imunogenost i/ili prekomernu prezentaciju kod konkretnog tipa tumora. Termin „skladište“ ne treba da implicira da su konkretni peptidi koji su obuhvaćeni vakcinom unapred proizvedeni i skladišteni u fizičkom postrojenju, mada se razmatra ta mogućnost. Izričito je razmatrano da peptidi mogu biti proizvedeni de novo za svaku proizvedenu individualizovanu vakcinu, ili mogu biti unapred proizvedeni i uskladišteni. Skladište (npr. u obliku baze podataka) sastavljeno je od tumor-asociranih peptida koji su visoko prekomerno eksprimirani u tumorskom tkivu pacijenata sa rakom jajnika sa raznim HLA-A, HLA-B i HLA-C alelima. Ono može sadržati peptide MHC klase I i MHC klase II ili elongirane peptide MHC klase I. Pored tumorasociranih peptida sakupljenih iz više tkiva raka jajnika, skladište može da sadrži HLAA*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 i HLA-B*44 peptidne markere. Ovi peptidi omogućavaju kvantitativno poređenje veličine T-ćelijskog imuniteta indukovanog putem TUMAP-ova, te stoga omogućavaju donošenje značajnih zaključaka o sposobnosti vakcine da izazove antitumorske odgovore. Drugo, oni deluju kao važni peptidi pozitivne kontrole dobijeni od „nesopstvenog“ antigena u slučaju da bilo koji vakcinom indukovani T-ćelijski odgovori na TUMAP-ove dobijene od „sopstvenih“ antigena nisu uočeni kod pacijenta. I treće, može da omogući da se donesu zaključci u pogledu statusa imunokompetencije pacijenta.

TUMAP-ovi za skladište identifikuju se korišćenjem integrisanog pristupa funkcionalne genomike koji kombinuje analizu ekspresije gena, masenu spektrometriju i T-ćelijsku imunologiju (XPresident ®). Ovaj pristup osigurava da samo TUMAP-ovi koji su istinski prisutni na velikom procentu tumora, ali koji uopšte nisu eksprimirani na normalnom tkivu ili su samo minimalno eksprimirani na njemu, budu izabrani za dalju analizu. Za inicijalnu selekciju peptida, uzorci raka jajnika od pacijenata i krv od zdravih donora su analizirani korak po korak:

1. HLA ligandi iz malignog materijala su identifikovani masenom spektrometrijom

2. Analiza ekspresije genomske informacione ribonukleinske kiseline (iRNK) korišćena je za identifikaciju gena koji su prekomerno eksprimirani u malignom tkivu (rak jajnika) u poređenju sa dijapazonom normalnih organa i tkiva

3. Identifikovani ligandi za HLA upoređeni su sa podacima o ekspresiji gena. Peptidi prezentovani na tumorskom tkivu, poželjno koje kodiraju selektivno eksprimirani ili prekomerno eksprimirani geni koji su detektovani u 2. koraku smatrani su pogodnim TUMAP kandidatima za multipeptidnu vakcinu.

4. Sprovedena je pretraga literature kako bi se pronašli dodatni dokazi koji podržavaju značaj identifikovanih peptida kao TUMAP-ova

5. Značaj prekomerne ekspresije na nivou iRNK potvrđen je ponovnom detekcijom izabranih TUMAP-ova iz 3. koraka na tumorskom tkivu i nedostatkom (ili malom učestalošću) detekcije na zdravim tkivima.

6. Da bi se procenilo da li je indukovanje in vivo T-ćelijskih odgovora izabranim peptidima izvodljivo, obavljeni su in vitro testovi imunogenosti korišćenjem humanih T ćelija zdravih donora, kao i pacijenata sa rakom jajnika.

U jednom aspektu, peptidi su prethodno ispitani na imunogenost pre uključivanja u skladište. Na primer, ali bez ograničenja, imunogenost peptida uključenih u skladište se određuje pomoću metoda koji obuhvata in vitro prajmovanje T ćelija putem ponovljenih stimulacija CD8+ T ćelija zdravih donora veštačkim antigen-prezentujućim ćelijama sa ubačenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom.

Ovaj metod je poželjan kod retkih maligniteta i pacijenata sa retkim profilom ekspresije. Nasuprot multipeptidnim koktelima sa fiksnim sastavom koji se trenutno razvijaju, skladište dozvoljava znatno veće usklađivanje stvarne ekspresije antigena na tumoru sa vakcinom. Odabrani pojedinačni peptidi ili kombinacija nekoliko peptida „iz zaliha“ koristiće se za svakog pacijenta u višeciljnom pristupu. U teoriji, pristup zasnovan na odabiru npr. 5 različitih antigenih peptida iz biblioteke od 50 bi već dao oko 17 miliona mogućih kompozicija lekovitog proizvoda (LP).

U jednom aspektu, peptidi se biraju za uključivanje u vakcinu na osnovu njihove prikladnosti za pojedinačnog pacijenta na osnovu metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom kako je opisan u ovom dokumentu, ili kako sledi.

HLA fenotip, transkriptomski i peptidomski podaci se prikupljaju iz tumorskog materijala pacijenta i uzoraka krvi kako bi se identifikovali najprikladniji peptidi za svakog pacijenta koji sadrže „uskladištene“ TUMAP-ove i one jedinstvene za pacijenta (tj. mutirane). Biće izabrani oni peptidi koji su selektivno ili prekomerno eksprimirani u tumoru pacijenta i, gde je to moguće, koji pokazuju snažnu in vitro imunogenost ako su testirani sa individualnim PBMC pacijenta.

Poželjno, peptidi uključeni u vakcinu identifikovani su pomoću metoda koji se sastoji od: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP-ovi) koje prezentuje uzorak tumora od pojedinačnog pacijenta; (b) upoređivanja peptida identifikovanih u tački (a) sa skladištem (bazom podataka) peptida kako je opisano ranije; i (c) biranja najmanje jednog peptida iz skladišta (baze podataka) koji korelira sa tumor-asociranim peptidom identifikovanim kod pacijenta. Na primer, TUMAP-ovi koje prezentuje uzorak tumora identifikuju se pomoću: (a1) upoređivanja podataka o ekspresiji iz uzorka tumora sa podacima o ekspresiji iz uzorka normalnog tkiva koje odgovara vrsti tkiva uzorka tumora kako bi se identifikovali proteini koji su prekomerno eksprimirani ili aberantno eksprimirani u uzorku tumora; i (a2) koreliranja podataka o ekspresiji sa sekvencama MHC liganada vezanih za MHC klasa I i/ili klasa II molekule u uzorku tumora kako bi se identifikovali MHC ligandi dobijeni iz proteina koje tumor prekomerno eksprimira ili aberantno eksprimira. Poželjno, sekvence MHC liganada se identifikuju eluiranjem vezanih peptida sa MHC molekula izolovanih iz uzorka tumora, i sekvenciranjem eluiranih liganada. Poželjno, uzorak tumora i normalno tkivo se dobijaju od istog pacijenta.

Dodatno, ili kao alternativa biranju peptida pomoću modela skladišta (baze podataka), TUMAP-ovi mogu da se identifikuju kod pacijenta de novo, a zatim da se uključe u vakcinu. Kao jedan primer, kandidati za TUMAP-ove mogu da se identifikuju kod pacijenta pomoću (a1) upoređivanja podataka o ekspresiji iz uzorka tumora sa podacima o ekspresiji iz uzorka normalnog tkiva koje odgovara vrsti tkiva uzorka tumora, kako bi se identifikovali proteini koji su prekomerno eksprimirani ili aberantno eksprimirani u uzorku tumora; i (a2) koreliranja podataka o ekspresiji sa sekvencama MHC liganada vezanih za MHC molekule klase I i/ili klase II u uzorku tumora kako bi se identifikovali MHC ligandi dobijeni iz proteina koje tumor prekomerno eksprimira ili aberantno eksprimira. Kao drugi primer, mogu biti identifikovani proteini koji sadrže mutacije koje su jedinstvene za uzorak tumora u odnosu na normalno istovetno tkivo od pojedinačnog pacijenta, te mogu biti identifikovani TUMAP-ovi koji specifično ciljaju mutaciju. Na primer, genom tumora i istovetnog normalnog tkiva može da se sekvencira pomoću sekvenciranja celog genoma: Za otkrivanje nesinonimnih mutacija u regionima gena koji kodiraju protein, iz tumorskih tkiva se ekstrahuju genomska DNK i RNK, a normalna nemutirana genomska DNK germinativne linije se ekstrahuje iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC). Primenjeni NGS pristup ograničen je na resekvenciranje regiona koji kodiraju protein (resekvenciranje egzoma). U ovu svrhu, egzonska DNK iz uzoraka ljudskog porekla se sakuplja pomoću kompleta za obogaćivanje cilja koje dostavlja dobavljač, nakon čega sledi sekvenciranje pomoću npr. HiSeq2000 (Illumina). Dodatno, tumorska iRNK se sekvencira radi direktne kvantifikacije genske ekspresije i potvrde da su mutirani geni eksprimirani u tumorima pacijenata. Nastali milioni očitanih sekvenci se obrađuju kroz algoritme softvera. Izlazna lista sadrži mutacije i ekspresiju gena. Tumor-specifične somatske mutacije se utvrđuju upoređivanjem sa germinativnim varijacijama dobijenim iz PBMC i daje im se prioritet. De novo identifikovani peptidi zatim mogu da se testiraju u pogledu imunogenosti kako je opisano ranije za skladište, a kandidati za TUMAP-ove koji poseduju prikladnu imunogenost se biraju za uključivanje u vakcinu.

U jednom primernom otelotvorenju, peptidi koji su uključeni u vakcinu se identifikuju pomoću: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP-ova) koje prezentuje uzorak tumora pojedinačnog pacijenta pomoću ranije opisanog metoda; (b) upoređivanja peptida identifikovanih pod tačkom a) sa skladištem peptida koji su prethodno ispitani za imunogenost i prekomernu prezentaciju u tumorima u poređenju sa odgovarajućim normalnim tkivom; (c) biranja najmanje jednog peptida iz skladišta koji korelira sa tumorasociranim peptidom identifikovanim kod pacijenta; i (d) opciono, biranja najmanje jednog peptida identifikovanog de novo pod tačkom (a) i potvrđivanja njegove imunogenosti.

U jednom primernom otelotvorenju, peptidi koji su uključeni u vakcinu se identifikuju pomoću: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP-ova) koje prezentuje uzorak tumora od pojedinačnog pacijenta; i (b) biranja najmanje jednog peptida identifikovanog de novo u tački (a) i potvrđivanja njegove imunogenosti.

Vakcina se proizvodi kada se izaberu peptidi za personalizovanu vakcinu zasnovanu na peptidima. Vakcina je poželjno tečna formulacija koja sadrži pojedinačne peptide rastvorene u između 20–40% DMSO, poželjno oko 30–35% DMSO, kao što je oko 33% DMSO.

Svaki peptid koji će biti uključen u proizvod se rastvara u DMSO. Koncentracija rastvora pojedinačnih peptida treba da se izabere u zavisnosti od broja peptida koji će biti uključeni u proizvod. Rastvori pojedinačan peptid-DMSO se mešaju u jednakim delovima kako bi se dobio rastvor koji sadrži sve peptide koji treba da budu uključeni u proizvod sa koncentracijom od ~2,5 mg/ml po peptidu. Pomešani rastvor se zatim razblažuje u odnosu 1:3 sa vodom za injekcije kako bi se dobila koncentracija od 0,826 mg/ml po peptidu u 33% DMSO. Razblaženi rastvor se filtrira kroz sterilni filter veličine 0,22 µm. Dobijen je konačan ukupni rastvor.

Konačni ukupni rastvor se puni u bočice i čuva na -20 °C do upotrebe. Jedna bočica sadrži 700 µl rastvora koji sadrži 0,578 mg svakog peptida. Od toga će 500 µl (pribl.400 μg po peptidu) biti primenjeno za intradermalnu injekciju.

Pored toga što je koristan za lečenje raka, peptid predmetnog pronalaska je takođe koristan kao sredstvo za dijagnostikovanje. Budući da su peptidi napravljeni iz ćelija raka jajnika i budući da je utvrđeno da ovi peptidi nisu prisutni ili su prisutni u manjim nivoima u normalnim tkivima, ovi peptidi mogu da se koriste za dijagnostikovanje prisustva raka.

Prisustvo peptida patentnog zahteva na biopsijama tkiva u uzorcima krvi može da pomogne patologu u postavljanju dijagnoze raka. Detekcija određenih peptida pomoću antitela, masene spektrometrije ili drugih metoda poznatih u stručnoj oblasti mogu da pokažu patologu da je uzorak tkiva maligan ili inflamiran ili uopšteno oboleo, ili može da se koristi kao biomarker za rak jajnika. Prisustvo grupa peptida može da omogući klasifikaciju ili supklasifikaciju obolelih tkiva.

Detekcija peptida na uzorku obolelog tkiva može da omogući donošenje odluke o koristima terapija koje uključuju imunski sistem, posebno ako je poznato ili se očekuje da T limfociti budu uključeni u mehanizam delovanja. Gubitak MHC ekspresije je dobro opisani mehanizam pomoću kojeg inficirane ili maligne ćelije izbegavaju imunološki nadzor. Tako, prisustvo peptida pokazuje da analizirane ćelije ne iskorišćavaju ovaj mehanizam.

Peptid predmetnog pronalaska može da se koristi za analizu limfocitnih odgovora protiv tih peptida, kao što su T-ćelijski odgovori ili odgovori antitelima protiv peptida ili peptida u kompleksu sa MHC molekulima. Ovi limfocitni odgovori mogu da se koriste kao prognostički markeri za donošenje odluke o daljim koracima lečenja. Ovi odgovori mogu takođe da se koriste kao surogat markeri odgovora u imunoterapijskim pristupima čiji je cilj indukcija limfocitnih odgovora pomoću različitih sredstava, npr. vakcinacije proteinom, nukleinskim kiselinama, autolognim materijalom, ili adoptivni transfer limfocita. U smislu genske terapije, limfocitni odgovori protiv peptida mogu se razmatrati u pogledu procene neželjenih dejstava. Praćenje limfocitnih odgovora može takođe biti dragocena alatka za kontrolne preglede terapija transplantacijom, npr. za detekciju bolesti graft protiv domaćina i domaćin protiv grafta.

Predmetni pronalazak će sada biti opisan u sledećim primerima koji opisuju njegova poželjna otelotvorenja, i uz upućivanje na pridružene slike, ali to neće biti ograničeno na ovde navedeno.

SLIKE

Na slikama 1A do 1S prikazan je primerni profil ekspresije izvornih gena predmetnog pronalaska koji su prekomerno eksprimirani u različitim uzorcima raka. Uzorci tumora (crne tačke) i normalnog tkiva (sive tačke) grupisani su prema organu iz kojeg potiču, a kutijasti dijagrami predstavljaju medijanu, 25. i 75. percentil (kutija) i minimalne i maksimalne (brkovi) RPKM vrednosti. Normalni organi su poređani prema kategorijama rizika. RPKM = očitavanja po kilobazi na milion mapiranih očitavanja. Normalni uzorci: ćelije krvi; krvni sud; mozak; srce; jetra; pluće; adipozno: masno tkivo; nadbubrežna žl.: nadbubrežna žlezda; žučni put; bešika; KS: kostna srž; hrskavica; jednj: jednjak; oko; žuč. kesa: žučna kesa; glava i vrat; bubreg; debelo_cr: debelo crevo; LČ: limfni čvor; nerv; pankreas; paratir: paraštitasta žlezda; hipof: hipofiza; skel.miš: skeletni mišić; koža; tanko_cr: tanko crevo; slezina; želudac; štitasta žl.: štitasta žlezda; dušnik; bešika; dojka; jajnik; placenta; prostata; testis; timus; materica. Uzorci tumora: AML: akutna mijeloidna leukemija; BRCA: rak dojke; CLL: hronična limfocitna leukemija; CRC: kolorektalni karcinom; GALB: rak žučne kese; GB: glioblastom; GC: rak želuca; HCC: hepatocelularni karcinom; HNSCC: rak glave i vrata; MEL: melanom; NHL: non-Hodžkinov limfom; NSCLC: nesitnoćelijski karcinom pluća; OC: rak jajnika; OSC_GC: rak jednjaka / želuca; OSCAR: rak jednjaka; PC: rak pankreasa; PCA: rak prostate; RCC: karcinom bubrežnih ćelija; SCLC: sitnoćelijski karcinom pluća; UBC: karcinom mokraćne bešike; UEC: rak materice i endometrijuma. Slika 1A) simbol gena: CT45A2, peptid: KYEKIFEML (ID BR. SEKV: 12), Slika 1B) simbol gena: NLRP2, peptid: VLYGPAGLGK (ID BR. SEKV: 27), Slika 1C) simbol gena: NLRP7, peptid: LLDEGAMLLY (ID BR. SEKV: 31), Slika 1D) simbol gena: HTR3A, peptid: GLLQELSSI (ID BR. SEKV: 66), Slika 1E) simbol gena: VTCN1, peptid: KVVSVLYNV (ID BR. SEKV: 75), Slika 1F) simbol gena: CYP2W1, peptid: RYGPVFTV (ID BR. SEKV: 98), Slika 1G) simbol gena: MMP11, peptid: LLQPPPLLAR (ID BR. SEKV: 98), Slika 1H) simbol gena: MMP12, peptid: FVDNQYWRY (ID BR. SEKV: 115), Slika 1I) simbol gena: CTAG2, peptid: APLPRPGAVL (ID BR. SEKV: 119), Slika 1J) simbol gena: FAM111B, peptid: KPSESIYSAL (ID BR. SEKV: 123), Slika 1K) simbol gena: CCNA1, peptid: HLLLKVLAF (ID BR. SEKV: 151), Slika 1L) simbol gena: FAM83H, peptid: HVKEKFLL (ID BR. SEKV: 156), Slika 1M) simbol gena: MAGEA11, peptid: KEVDPTSHSY (ID BR. SEKV: 194), Slika 1N) simbol gena: MMP11, peptid: YTFRYPLSL (ID BR. SEKV: 227), Slika 1O) simbol gena: ZNF560, peptid: VFVSFSSLF (ID BR. SEKV: 255), Slika 1P) simbol gena: IGF2BP1, peptid: ISYSGQFLVK (ID BR. SEKV: 266), Slika 1Q) simbol gena: CLDN6, peptid: LPMWKVTAF (ID BR. SEKV: 303), Slika 1R) simbol gena: IGF2BP3, peptid: IEALSGKIEL (ID BR. SEKV: 413), Slika 1S) simbol gena: PRAME, peptid: EEQYIAQF (ID BR. SEKV: 432).

Na slikama 1T do 1V prikazani su primerni profili ekspresije izvornih gena predstavljenih u ovom dokumentu koji su prekomerno eksprimirani u različitim uzorcima raka. Uzorci tumora (crne tačke) i normalnog tkiva (sive tačke) grupisani su prema organu iz kojeg potiču. Kutijasti dijagrami predstavljaju medijanu FPKM vrednosti, 25. i 75. percentil (kutija) plus linije (brkovi) koje se pružaju do tačke najnižeg podatka koji je i dalje u okviru 1,5 interkvartilnog raspona (IQR) donjeg kvartila i tačke najvišeg podatka koji je i dalje u okviru 1,5 IQR gornjeg kvartila. Normalni organi su poređani prema kategorijama rizika. FPKM: fragmenti po kilobazi na milion mapiranih očitavanja. Normalni uzorci: ćelije krvi; krvnisud (krvni sudovi); mozak; srce; jetra; pluće; adipozno (masno tkivo); nadbubrežna žl. (nadbubrežna žlezda); žučni put; bešika; kostna srž; hrskavica; jednj (jednjak); oko; žuč. kesa (žučna kesa); glava i vrat; debelo_cr (debelo crevo); tanko_cr (tanko crevo); bubreg; llimfni čvor; perif. nerv (periferni nerv); pankreas; paratir (paraštitasta žlezda); perit (peritoneum); hipof (hipofiza); pleura; skel. miš (skeletni mišić); koža; slezina; želudac; štitasta žl. (štitasta žlezda); dušnik; ureter; dojka; jajnik; placenta; prostata; testis; timus; materica. Uzorci tumora: AML (akutna mijeloidna leukemija); BRCA (rak dojke); CCC (holangiocelularni karcinom); CLL (hronična limfocitna leukemija); CRC (kolorektalni karcinom); GBC (rak žučne kese); GBM (glioblastom); GC (rak želuca); HCC (hepatocelularni karcinom); HNSCC (skvamocelularni karcinom glave i vrata); MEL (melanom); NHL (non-Hodžkinov limfom); NSCLCadeno (nesitnoćelijski adenokarcinom pluća); NSCLCother (uzorci NSCLC koji nisu nedvosmisleno mogli da se rasporede u NSCLCadeno ili NSCLCsquam); NSCLCsquam (skvamocelularni nesitnoćelijski karcinom pluća); OC (rak jajnika); OSCAR (rak jednjaka); PACA (rak pankreasa); PRCA (rak prostate); RCC (karcinom bubrežnih ćelija); SCLC (sitnoćelijski karcinom pluća); UBC (karcinom mokraćne bešike); UEC (rak materice i endometrijuma). Slika 1T) simbol gena: MAGEA4, peptid: SPDAESLFREALSNKVDEL (ID BR. SEKV: 597), Slika 1U) simbol gena: MAGEA4, peptid: LSNKVDELAHFLLRK (ID BR. SEKV: 601), Slika 1V) simbol gena: MAGEB3, peptid: KLITQDLVKLKYLEYRQ (ID BR. SEKV: 604).

Na slici 2 prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*02+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*02 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv. 773 (ALYGKLLKL, ID br. sekv: 773) (A, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*02/ID br. sekv. 773 (A). Desni panel (A) prikazuje kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*02/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

Na slici 3 prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*24+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*24 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv.774 (A, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*24/ID br. sekv. 774 (VYVDDIYVI, ID br. sekv: 774) (A). Desni panel (A) prikazuje kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*24/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

Na slici 4 prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*02+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*02 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv. 67 SLLLPSIFL (A, levi panel) odnosno peptidom ID br. sekv.75 KVVSVLYNV (B, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*02/ID br. sekv.67 (A) ili A*02/ID br. sekv.75 (B). Desni paneli (A i B) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*02/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

Na slici 5 prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*24+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*24 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv. 11 SYSDLHYGF (A, levi panel) odnosno peptidom ID br. sekv. 79 SYNEHWNYL (B, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*24/ID br. sekv. 11 (A) ili A*24/ID br. sekv. 79 (B). Desni paneli (A i B) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*24/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

Na slici 6 prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-B*07+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-B*07 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv. 33 SPTFHLTL (A, levi panel) odnosno peptidom ID br. sekv. 40 KPGTSYRVTL (B, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa B*07/ID br. sekv. 33 (A) ili B*07/ID br. sekv. 40 (B). Desni paneli (A i B) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima B*07/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

Na slici 7 prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*01+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*01 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv.113 QLDSNRLTY (A, levi panel) odnosno peptidom ID br. sekv. 115 FVDNQYWRY (B, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*01/ID br. sekv. 113 (A) ili A*01/ID br. sekv. 115 (B). Desni paneli (A i B) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*01/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

Na slici 8 prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*03+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*03 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv. 23 GMMKGGIRK (A, levi panel) odnosno peptidom ID br. sekv. 90 KVAGERYVYK (B, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*03/ID br. sekv. 23 (A) ili A*03/ID br. sekv. 90 (B). Desni paneli (A i B) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*03/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

Na slici 9 prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-B*44+ donora. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-B*44 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv.200 AESIPTVSF (A, levi panel) odnosno peptidom ID br. sekv. 211 EEKVFPSPLW (B, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa B*44/ID br. sekv. 200 (A) ili B*44/ID br. sekv. 211 (B). Desni paneli (A i B) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima B*44/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

PRIMERI

PRIMER 1

Identifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije

Uzorci tkiva

Tkiva tumora pacijenata i normalna tkiva dobijena su od Univerzitetske bolnice u Tibingenu (Tübingen, Nemačka) Pre operacije ili autopsije, od svih pacijenata je pribavljen pisani informisani pristanak. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem neposredno nakon ekscizije i uskladištena na -70 °C ili manje do izolacije TUMAP.

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

Pulovi HLA peptida iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem dobijeni su imunskom precipitacijom iz čvrstih tkiva u skladu sa blago modifikovanim protokolom (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) primenom HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2, HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, HLA-DR-specifičnog antitela L243 i pan-HLA klasa II-specifičnog antitela Tü39, CNBr-aktivirane sefaroze, tretiranja kiselinom i ultrafiltracije.

Analize masenom spektrometrijom

Dobijeni pulovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hidrofobnosti pomoću reverznofazne hromatografije (Ultimate 3000 RSLC Nano UHPLC System, Dionex) a eluirani peptidi su analizirani u LTQ-Orbitrap i Fusion Lumos hibridnim masenim spektrometrima (ThermoElectron) opremljenim ESI izvorom. Uzorci peptida napunjeni su sa 3% rastvaračem B (20% H2O, 80% acetonitril i 0,04% mravlja kiselina) na PepMap 100 C18 Nanotrap koloni od 2 cm (Dionex) pri brzini protoka od 4 µl/min tokom 10 min. Odvajanje je izvršeno na PepMap C18 kolonama od 25 cm ili 50 cm sa veličinom čestica od 2 µm (Dionex) postavljenim u pećnicu za kolone koja je radila na 50 °C. Primenjeni gradijent kretao se u rasponu od 3 do 32% rastvarača B u okviru 90 minuta pri brzini protoka od 300 nl/min (za kolone od 25 cm) ili 140 min pri brzini protoka od 175 nl/min (za kolone od 50 cm). (Rastvarač A: 99% H2O, 1% ACN i 0,1% mravlja kiselina; Rastvarač B: 20% H2O, 80% ACN i 0,1% mravlja kiselina).

Maseno spektrometrijska analiza izvršena je u režimu akvizicije zavisnom od podataka koji je primenjivao metod najvećih pet (tj. tokom svakog istražnog skena za fragmentaciju je izabrano pet najobilnijih prekursorskih jona). Alternativno je primenjen TopSpeed metod za analiziranje na instrumentima Fusion Lumos.

Istražni skenovi zabeleženi su u Orbitrap pri rezoluciji od 60.000 (za Orbitrap XL) ili 120.000 (za Orbitrap Fusion Lumos). MS/MS analiza izvršena je pomoću disocijacije indukovane kolizijom (CID, normalizovana energija kolizije 35%, vreme aktivacije 30 ms, širina izolacije 1,3 m/z) sa naknadnom analizom u kvadrupolnoj linearnoj klopci (LTQ). Maseni opseg za HLA klasa I ligande je bio ograničen na 400-650 m/z sa mogućim stanjima naelektrisanja 2+ i 3+ izabranim za fragmentaciju. Za HLA klase II maseni opseg je postavljen na 300–1500 m/z što dozvoljava fragmentaciju sa svim stanjima pozitivnog naelektrisanja ≥ 2.

Tandem maseni spektri su interpretirani pomoću MASCOT ili SEQUEST pri fiksnoj stopi lažnih otkrića (q ≤ 0,05) i uz dodatnu ručnu kontrolu. U slučajevima kada identifikovana peptidna sekvenca nije bila sigurna, ona je dodatno validirana poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog peptida sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence.

U tabeli 19 prikazana je prezentacija na raznim malignitetima za izabrane peptide, te samim tim i konkretan značaj pomenutih peptida za dijagnostikovanje i/ili lečenje naznačenih maligniteta (npr. peptid ID BR. SEKV.1 za kolorektalni karcinom, rak žučne kese, non-Hodžkinov limfom, nesitnoćelijski karcinom pluća i rak materice i endometrijuma, peptid ID BR. SEKV. 2 za rak dojke, holangiocelularni karcinom, kolorektalni karcinom, rak žučne kese, rak želuca, skvamocelularni karcinom glave i vrata, melanom, non-Hodžkinov limfom, nesitnoćelijski karcinom pluća, rak jednjaka, rak pankreasa, rak prostate, karcinom bubrežnih ćelija, sitnoćelijski karcinom pluća i rak materice i endometrijuma).

Tabela 19: pregled prezentacije izabranih tumor-asociranih peptida predmetnog pronalaska u različitim vrstama tumora.

AML: akutna mijeloidna leukemija; BRCA: rak dojke; CCC: holangiocelularni karcinom; CLL: hronična limfocitna leukemija; CRC: kolorektalni karcinom; GBC: rak žučne kese; GBM: glioblastom; GC: rak želuca; GEJC: rak gastroezofagusnog spoja; HCC: hepatocelularni karcinom; HNSCC: skvamocelularni karcinom glave i vrata; MEL: melanom; NHL: non-Hodžkinov limfom; NSCLC: nesitnoćelijski karcinom pluća; OC: rak jajnika; OSCAR: rak jednjaka; PACA: rak pankreasa; PRCA: rak prostate; RCC: karcinom bubrežnih ćelija; SCLC: sitnoćelijski karcinom pluća; UBC: karcinom mokraćne bešike; UEC: rak materice i endometrijuma.

PRIMER 2

Profiliranje ekspresije gena koji kodiraju peptid pronalaska i dalje peptide predstavljene u ovom dokumentu

Prekomerna prezentacija ili specifična prezentacija peptida na tumorskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama je dovoljna za njihovu korisnost u imunoterapiji, a neki peptidi su tumor-specifični iako se njihov izvorni protein takođe javlja u normalnim tkivima. Ipak, profiliranje ekspresije iRNK dodaje dodatni nivo bezbednosti u izboru peptidnih ciljeva za imunoterapije. Naročito za terapijske opcije sa visokim rizicima u pogledu bezbednosti, kao što su afinitetno sazreli TCR-ovi, idealni ciljni peptid će biti dobijen od proteina koji je jedinstven za tumor i ne nalazi se na normalnim tkivima.

RNK izvori i priprema

Hirurški odstranjeni uzorci tkiva obezbeđeni su kako je navedeno ranije (pogledajte primer 1) nakon što je od svakog pacijenta pribavljen pisani informisani pristanak. Uzorci tumorskog tkiva su zamrznuti brzim zamrzavanjem neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani avanom i tučkom u prisustvu tečnog azota. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka pomoću TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Nemačka) nakon čega je sledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Hilden, Nemačka); oba metoda su izvedena u skladu sa protokolom proizvođača.

Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva za eksperimente sekvenciranja RNK dobijena je od: Asterand (Detroit, MI, SAD i Royston, Herts, UK); Bio-Options Inc. (Brea, CA, SAD); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SAD); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SAD); Tissue Solutions Ltd (Glazgov, UK).

Ukupna RNK iz tumorskih tkiva za eksperimente sekvenciranja RNK dobijena je od: Asterand (Detroit, MI, SAD i Royston, Herts, UK); BioCat GmbH (Hajdelberg, Nemačka); BioServe (Beltsville, MD, SAD); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SAD); Istituto Nazionale Tumori „Pascale“ (Napulj, Italija); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SAD); Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu (Hajdelberg, Nemačka).

Kvalitet i kvantitet svih uzoraka RNK procenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Waldbronn, Nemačka) upotrebom RNA 6000 Pico LabChip kompleta (Agilent).

Eksperimenti sekvenciranja RNK

Analiza ekspresije gena uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je sekvenciranjem naredne generacije (RNAseq) pomoću CeGaT (Tibingen, Nemačka). Ukratko, biblioteke za sekvenciranje su pripremljene primenom kompleta reagensa Illumina HiSeq v4 prema protokolu dobavljača (Illumina Inc., San Diego, CA, SAD), koji obuhvata fragmentaciju RNK, konverziju cDNK i dodavanje adaptera za sekvenciranje. Biblioteke dobijene od multiplih uzoraka se mešaju ekvimolarno i sekvenciraju na Illumina HiSeq 2500 sekvenceru prema uputstvima proizvođača, stvarajući jednostrana očitavanja veličine 50 bp. Obrađena očitavanja se mapiraju na humanom genomu (GRCh38) pomoću softvera STAR. Podaci o ekspresiji se obezbeđuju na nivou transkripta u vidu RPKM (očitavanja po kilobazi na milion mapiranih očitavanja, koji generiše softver Cufflinks) i na nivou egzona (ukupna očitavanja, generiše softver Bedtools), na osnovu beleški ensembl baze podataka sekvenci (Ensembl77). Očitavanja egzona se normalizuju za dužinu egzona i veličinu poravnanja kako bi se dobile RPKM vrednosti.

Primerni profili ekspresije izvornih gena koji su visoko prekomerno eksprimirani ili isključivo eksprimirani u raku jajnika prikazani su na slici 1. Rezultati ekspresije za dalje primerne gene prikazani su u tabeli 10.

Tabela 10: rezultati ekspresije. U tabeli su navedeni peptidi iz gena koji su veoma visoko prekomerno eksprimirani u OC tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno eksprimirani u OC tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno eksprimirani u OC tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+). Polazna vrednost za ovaj rezultat izračunata je iz merenja sledećih relevantnih normalnih tkiva: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, žučni put, ćelije krvi, krvni sudovi, kostna srž, mozak, hrskavica, jednjak, oko, žučna kesa, srce, glava i vrat, bubreg, debelo crevo, jetra, pluća, limfni čvor, nerv, paraštitasta žlezda, pankreas, hipofiza, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, štitasta žlezda, dušnik, mokraćna bešika. U slučaju da su bili dostupni podaci o ekspresiji za nekoliko uzoraka tkiva iste vrste, za izračunavanje je korišćena aritmetička srednja vrednost za sve dotične uzorke.

PRIMER 3

In vitro imunogenost za MHC klasa I-prezentovane peptide

Da bi se dobile informacije u pogledu imunogenosti TUMAP-ova predmetnog pronalaska, istraživači su sproveli ispitivanja pomoću eseja za in vitro prajming T ćelija zasnovanog na ponovljenim stimulacijama CD8+ T ćelija sa veštačkim antigen-prezentujućim ćelijama (aAPĆ) napunjenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom. Na ovaj način istraživači su mogli da pokažu imunogenost za HLA-A*0201, HLA-A*24:02, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLA-B*07:02 i HLA-B*44:02-restrikovane TUMAP-ove pronalaska, dokazujući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih kod ljudi postoje CD8+ prekursorske T ćelije (tabela 11).

In vitro priprema CD8+ T ćelija

Da bi izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija napunjenih kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, pronalazači su prvo izolovali CD8+ T ćelije iz svežih proizvoda leukafereze HLA-A*02 HLA-A*24, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-B*07 ili HLA-B*44 putem pozitivne selekcije primenom CD8 mikroperli (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Nemačka) zdravih donora dobijenih od Univerzitetskih klinika u Manhajmu, Nemačka, nakon pribavljanja informisanog pristanka.

PBMC i izolovani CD8+ limfociti su inkubirani do primene u T-ćelijskom medijumu (TCM) koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Nemačka), 100 U/ml penicilina / 100 µg/ml streptomicina (Cambrex, Keln, Nemačka), 1 mmol/l natrijum piruvata (CC Pro, Oberdorla, Nemačka), 20 µg/ml gentamicina (Cambrex). U ovom koraku u TCM je takođe dodato 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Hajdelberg, Nemačka) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nirnberg, Nemačka).

Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanje su izvršeni u visoko definisanom in vitro sistemu primenom četiri različita pMHC molekula po uslovu stimulacije i 8 različitih pMHC molekula po uslovu očitavanja.

Prečišćeno kostimulatorno mišje IgG2a anti-humano CD28 At 9.3 (Jung et al., 1987) bilo je hemijski biotinilirano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bon, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom prečnika 5,6 µm (Bangs Laboratories, Illinois, SAD).

pMHC korišćeni za stimulacije pozitivne i negativne kontrole bili su A*0201/MLA-001 (peptid ELAGIGILTV (ID BR. SEKV: 775) iz modifikovanog Melan-A/MART-1) odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5, ID BR. SEKV.776).

800.000 perli/200 µl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 4 x 12,5 ng različitih biotin-pMHC, isprano i naknadno je dodato 600 ng biotin anti-CD28 u zapremini od 200 µl. Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem 1x10<6>CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 µl TCM u koji je dodato 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) u toku 3 dana na 37 °C. Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 4 dana na 37 °C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta. Za očitavanje pMHC multimera pomoću 8 različitih pMHC molekula po uslovu, korišćen je pristup dvodimenzionalnog kombinatornog kodiranja kako je ranije opisano (Andersen et al., 2012) sa manjim modifikacijama koje obuhvataju spajanje sa 5 različitih fluorohroma. Na kraju, analize multimera su izvršene bojenjem ćelija sa bojom Live/dead near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka), klonom CD8-FITC antitela SK1 (BD, Hajdelberg, Nemačka) i fluorescentnim pMHC multimerima. Za analizu je korišćen BD LSRII SORP citometar opremljen odgovarajućim laserima i filterima. Peptid-specifične ćelije izračunate su kao procenat ukupnih CD8+ ćelija. Evaluacija analize multimera izvršena je primenom FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, SAD). In vitro prajming specifičnih multimer+ CD8+ limfocita detektovan je upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovo mesto je sadržalo najmanje 1% specifičnih multimer+ među CD8+ T ćelijama a procenat specifičnih multimer+ ćelija je bio najmanje 10x veći od srednje vrednosti stimulacija negativne kontrole).

In vitro imunogenost za peptide raka jajnika

Za testirane HLA klasa I peptide, in vitro imunogenost je mogla da se pokaže stvaranjem peptid-specifičnih T-ćelijskih linija. Primerni rezultati protočne citometrije nakon TUMAP-specifičnog bojenja multimera za 14 peptida pronalaska prikazani su na slikama 2 do 9 zajedno sa odgovarajućim negativnim kontrolama. Rezultati za 118 peptida iz pronalaska sumirani su u tabeli 11a i tabeli 11b.

Tabela 11a: in vitro imunogenost HLA klasa I peptida predstavljenih u ovom dokumentu. Primerni rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti izvršenih od strane podnosioca prijave za peptide pronalaska. <20% = ; 20%–49% = +; 50%–69%= ++; >= 70% = +++

Tabela 11b: in vitro imunogenost HLA klasa I peptida pronalaska i daljih peptida predstavljenih u ovom dokumentu. Primerni rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti izvršenih od strane podnosioca prijave za peptide pronalaska i dalje peptide predstavljene u ovom dokumentu. <20% = ; 20%–49% = +; 50%–69%= ++; >= 70% = +++

PRIMER 4

Sinteza peptida

Svi peptidi su sintetisani pomoću standardne i dobro ustanovljene sinteze peptida u čvrstoj fazi primenom strategije Fmoc. Identitet i prečišćenost svakog pojedinačnog peptida utvrđeni su masenom spektrometrijom i analitičkom RP-HPLC. Peptidi su dobijeni u vidu belih do krem liofilizata (trifluoro-acetatne soli) u čistoćama >50%. Svi TUMAP-ovi se poželjno primenjuju u obliku trifluoro-acetatnih soli ili acetatnih soli, mogući su i drugi oblici soli.

PRIMER 5

Testovi vezivanja MHC

Peptidi kandidati za terapije zasnovane na T ćelijama u skladu sa predmetnim pronalaskom su dalje testirani u pogledu njihovog kapaciteta vezivanja MHC (afinitet). Pojedinačni kompleksi peptid-MHC proizvedeni su pomoću izmene liganada pod UV, gde je peptid osetljiv na UV odvojen odmah nakon UV zračenja i zamenjen peptidom od interesa prema analizi. Samo peptidi kandidati koji mogu efikasno da vežu i stabilizuju peptid-receptivne MHC molekule sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa. Da bi se utvrdio prinos reakcije zamene, sprovedena je ELISA zasnovana na detekciji lakog lanca (β2m) stabilizovanih MHC kompleksa. Esej je sproveden kako je uopšteno opisano u radu Rodenko i sar. (Rodenko et al., 2006).

MAXISorp pločice sa 96 mesta (NUNC) obložene su preko noći sa 2 ug/ml streptavidina u PBS na sobnoj temperaturi, isprane 4 puta i blokirane tokom 1 h na 37 °C u 2% BSA koji sadrži pufer za blokiranje. Ponovo presavijeni HLA-A*02:01/MLA-001 monomeri služili su kao standardi, pokrivajući opseg od 15–500 ng/ml. Monomeri peptid-MHC iz UV-izmenjivačke reakcije razblaženi su 100 puta u puferu za blokiranje. Uzorci su inkubirani tokom 1 h na 37 °C, isprani četiri puta, inkubirani sa 2 µg/ml HRP konjugovanog anti-β2m tokom 1 h na 37 °C, isprani ponovo i detektovani sa rastvorom TMB koji je zaustavljen sa NH2SO4. Apsorpcija je izmerena na 450 nm. Peptidi kandidati koji pokazuju visok prinos izmene (poželjno veći od 50%, najpoželjnije veći od 75%) se generalno preferiraju za generisanje i proizvodnju antitela ili njihovih fragmenata, i/ili T-ćelijskih receptora ili njihovih fragmenata, jer oni pokazuju dovoljan aviditet prema MHC molekulima i sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa.

Tabela 12: rezultati vezivanja MHC klase I. Raspon vezivanja HLA klasa I-restrikovanih peptida za HLA-A*02:01 utvrđen je pomoću prinosa izmene peptida: >10% = ; >20% = +; >50 = ++; > 75% = +++

Tabela 13: rezultati vezivanja MHC klase I. Raspon vezivanja HLA klasa I-restrikovanih peptida za HLA-A*24:02 utvrđen je pomoću prinosa izmene peptida: >10% = ; >20% = +; >50 = ++; > 75% = +++

Tabela 14: rezultati vezivanja MHC klase I. Raspon vezivanja HLA klasa I-restrikovanih peptida za HLA-A*01:01 utvrđen je pomoću prinosa izmene peptida: >10% = ; >20% = +; >50 = ++; > 75% = +++

Tabela 15: rezultati vezivanja MHC klase I. Raspon vezivanja HLA klasa I-restrikovanih peptida za HLA-A*03:01 utvrđen je pomoću prinosa izmene peptida: >10% = ; >20% = +; >50 = ++; > 75% = +++

Tabela 16: rezultati vezivanja MHC klase I. Raspon vezivanja HLA klasa I-restrikovanih peptida za HLA-B*07:02 utvrđen je pomoću prinosa izmene peptida: >10% = ; >20% = +; >50 = ++; > 75% = +++

Tabela 17: rezultati vezivanja MHC klase I. Vezivanje HLA klasa I-restrikovanih peptida za HLA-B*44:02 izmereno je pomoću prinosa izmene peptida: >10% = ; >20% = +; >50 = ++; > 75% = +++

PRIMER 6

Stabilnost kompleksa peptid-MHC klasa I

Sprovedeni su testovi stabilnosti peptid-MHC za peptide HLA-B*08:01. Podaci su dobijeni primenom homogenog eseja u realnom vremenu zasnovanog na blizini kako bi se izmerila disocijacija peptida od HLA molekula klase I. Prvo su humani rekombinantni HLA-B*08:01 i b2m eksprimirani u E. coli i prečišćeni serijom koraka zasnovanim na tečnoj hromatografiji (Ferre et al., 2003; Ostergaard et al., 2001). Zatim je stabilnost kompleksa peptid-MHC (pMHC) utvrđena merenjem količine b2m povezane sa teškim lancem MHC tokom vremena pri 37 °C (Harndahl et al., 2012). Stabilnost svakog pMHC, izražena kao poluživot b2m povezane sa dotičnim teškim lancem, izračunata je ubacivanjem podataka u jednačinu za jednofaznu disocijaciju.

Stabilnosti pMHC izmerene su u tri nezavisna eksperimenta sa dotičnim peptidima, a pronađeno je da se za HLA-B*08:01 kreću u rasponu od slabih vezivača (+) do veoma stabilnih vezivača (++++). Srednje vreme poluživota (T1/2) prikazano je u tabeli 18.

Tabela 18: srednje vreme poluživota (T1/2) zasnovano na tri pojedinačna merenja. T1/2

PRIMER 7

Rezultati vezivanja izabranih peptida za HLA klasa II alotipove

Molekuli glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti klase II (MHC-II) su predominantno eksprimirani na površini profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija, gde oni prikazuju peptide T-pomoćničkim ćelijama koje orkestriraju nastanak i ishod mnogih imunskih odgovora kod domaćina. Stoga je razumevanje koji peptidi će biti prezentovani od strane MHC-II molekula važno za razumevanje aktivacije T-pomoćničkih ćelija i može da se koristi za identifikaciju T-ćelijskih epitopa. Peptidi koje prezentuje MHC molekul klase II se vezuju za udubljenje za vezivanje kojeg obrazuju ostaci MHC α- i β-lanca. Afinitet vezivanja peptid-MHC prvenstveno određuje aminokiselinska sekvenca jezgra za vezivanje peptida. Algoritmi za predviđanje vezivanja HLA klase II dostupni su samo za najvažnije alele klase II i testirani su pomoću SYFPEITHI algoritma (Rammensee et al., 1999). Algoritam je već uspešno korišćen za identifikaciju epitopa klase I i klase II iz širokog dijapazona antigena, npr. iz humanih tumor-asociranih antigena TRP2 (klasa I) (Sun et al., 2000) i SSX2 (klasa II) (Neumann et al., 2004). U tabeli 20 su prikazani HLA klasa II alotipovi za koje je verovatno da će vezivati izabrane peptide. Za peptid se smatralo da se vezuje za HLA molekul ako je SYFPEITHI rezultat bio jednak ili veći od 18.

HI,z

tiv

IT o

m

PEYFćim

S uj

a zu

rit<m>vego<m>

alati

zn

nja

pođavia .d sHIpre va IT

o

u PE

tip

ovloYFsn S

Ia

oI ja a a anN iđ. klas

dvve

A rei<p>o

HL pi<c>a alot

od tr II 4aa m nje

na klas

a pA jm stu HLna

doe azl<a>zn

ju bira je a zu

zveje e koi<d>asa pt z edali p e o al II tn II asvaaskla ro

kla e venjAa je

HL

e ziv<d>ti viveps: pesu02 e nian

elde

bra

veab

T iza

Na

Lista referenci

The Molecular Taxonomy of Primary Prostate Cancer. Cell 163 (2015): 1011-1025 Abba, M. C. et al., Mol.Cancer Res 5 (2007): 881-890

Abdelmalak, C. A. et al., Clin Lab 60 (2014): 55-61

Abe, A. et al., Genes Chromosomes.Cancer 55 (2016): 242-250 Aghajanova, L. et al., Hum.Reprod.30 (2015): 232-238

Agherbi, H. et al., PLoS.One. 4 (2009): e5622

Aguilo, F. et al., Curr.Top.Microbiol.Immunol. 394 (2016): 29-39

Akagi, T. et al., J Biol Chem 290 (2015): 22460-22473

Al, Zeyadi M. et al., Biotechnol.Biotechnol.Equip. 29 (2015): 111-118 Albergaria, A. et al., Int.J Dev.Biol 55 (2011): 811-822

Alentorn, A. et al., Presse Med 42 (2013): 806-813

Alhosin, M. et al., J Exp.Clin Cancer Res 35 (2016): 174

Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

Alrawi, S. J. et al., Anticancer Res 26 (2006): 107-119

Alvarado-Ruiz, L. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.17 (2016): 1037-1047 Alzrigat, M. et al., Oncotarget. (2016)

Amsterdam, A. et al., Acta Histochem. 116 (2014): 781-787

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902

Andrade, V. C. et al., Cancer Immun.8 (2008): 2

Andrade, V. C. et al., Exp.Hematol. 37 (2009): 446-449

Angelopoulou, K. et al., Mamm.Genome 21 (2010): 516-524

Angulo, J. C. et al., J Urol.195 (2016): 619-626

Ansari, K. I. et al., J Mol.Endocrinol.48 (2012): 61-75

Appay, V. et al., Eur.J Immunol.36 (2006): 1805-1814

Aprelikova, O. et al., Cancer Res 69 (2009): 616-624

Arsenic, R. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 784

Askew, E. B. et al., J Biol Chem 284 (2009): 34793-34808

Aung, P. P. et al., Oncogene 25 (2006): 2546-2557

Avasarala, S. et al., Biol Open.2 (2013): 675-685

Avgustinova, A. et al., Nat Commun.7 (2016): 10305

Aytes, A. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 110 (2013): E3506-E3515 Bahnassy, A. A. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014): 18240-18248 Bailey, V. J. et al., Methods 52 (2010): 237-241

Balaz, P. et al., Ann.Surg. 235 (2002): 519-527

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Band, A. M. et al., J Mammary.Gland.Biol Neoplasia.16 (2011): 109-115 Bao, L. et al., Cell Biol Toxicol.32 (2016): 419-435

Baroy, T. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 93

Bartolini, A. et al., Clin Cancer Res 22 (2016): 4923-4933

Baty, F. et al., J Biomed.Inform.58 (2015): 175-185

Beard, R. E. et al., Clin Cancer Res 19 (2013): 4941-4950

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Beke, L. et al., Biosci.Rep. 35 (2015)

Bell, J. L. et al., J Clin Oncol 33 (2015): 1285-1293

Bell, J. L. et al., Cell Mol Life Sci.70 (2013): 2657-2675

Benz, C. C. et al., Oncogene 15 (1997): 1513-1525

Bergamini, A. et al., Expert.Opin.Investig.Drugs 25 (2016): 1405-1412 Berger, C. et al., Curr.Mol.Med.13 (2013): 1229-1240

Bernstein, M. B. et al., Cancer Biother.Radiopharm. 29 (2014): 153-161 Beyranvand, Nejad E. et al., Cancer Res 76 (2016): 6017-6029 Bhan, S. et al., Oncol Rep. 28 (2012): 1498-1502

Bierkens, M. et al., Genes Chromosomes.Cancer 52 (2013): 56-68 Bikkavilli, R. K. et al., Oncogene 34 (2015): 5317-5328

Bisig, B. et al., Best.Pract.Res Clin Haematol.25 (2012): 13-28 Bode, P. K. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 899-905

Boeva, V. et al., PLoS.One.8 (2013): e72182

Bogush, T. A. et al., Antibiot.Khimioter. 54 (2009): 41-49

Bonitsis, N. et al., Exp.Oncol 28 (2006): 187-193

Borgono, C. A. et al., Cancer Res 63 (2003): 9032-9041

Borgono, C. A. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 1487-1493 Borgono, C. A. et al., J Biol Chem 282 (2007): 2405-2422 Borowicz, S. et al., J Vis.Exp. (2014): e51998

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Brinkmann, U. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95 (1998): 10757-10762 Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol.5 (2004): 29-43 Bruey, J. M. et al., J Biol Chem 279 (2004): 51897-51907

Bryan, R. T., Philos.Trans.R Soc.Lond B Biol Sci.370 (2015): 20140042 Bryan, R. T. et al., J Urol.184 (2010): 423-431

Buchet-Poyau, K. et al., Nucleic Acids Res 35 (2007): 1289-1300 Bundela, S. et al., PLoS.One. 9 (2014): e102610

Burnett, R. M. et al., Oncotarget.6 (2015): 12682-12696

Cano, A. et al., Future.Oncol 8 (2012): 1095-1108

Caputi, F. F. et al., J Mol.Neurosci.51 (2013): 532-538

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother.53 (2004): 345-357 Carrera, M. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015): 3613-3623 Cerveira, N. et al., BMC.Cancer 10 (2010): 518

Chakrabarty, S. et al., J Cell Physiol 186 (2001): 47-52

Chan, M. H. et al., Pediatr.Blood Cancer 59 (2012): 1173-1179 Chandra, V. et al., Cell Death.Dis. 5 (2014): e1380

Chang, H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.464 (2015a): 45-50 Chang, Q. et al., Oncotarget. 6 (2015b): 42838-42853

Chen, H. S. et al., Zhonghua Gan Zang.Bing.Za Zhi.11 (2003): 145-148 Chen, S. T. et al., Cancer Sci.102 (2011a): 2191-2198

Chen, Y. et al., Cancer Biol Ther. 11 (2011b): 497-511

Chen, Y. et al., Onco.Targets.Ther. 7 (2014): 1465-1472

Chen, Y. C. et al., Taiwan.J Obstet.Gynecol. 54 (2015): 572-579 Chen, Y. L. et al., Int J Surg.11 (2013): 85-91

Chen, Y. T. et al., Int.J Cancer 124 (2009): 2893-2898

Chen, Y. T. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102 (2005): 7940-7945 Cheng, Y. C. et al., J Neurochem.110 (2009): 947-955

Cheung, A. et al., Oncotarget. 7 (2016): 52553-52574

Chevillard, G. et al., Blood 117 (2011): 2005-2008

Choi, M. R. et al., APMIS 123 (2015): 65-71

Choijamts, B. et al., Stem Cells 29 (2011): 1485-1495

Chung, H. et al., Biol Chem 393 (2012a): 413-420

Chung, S. et al., Oncotarget.3 (2012b): 1629-1640

Ciruelos Gil, E. M., Cancer Treat.Rev 40 (2014): 862-871

Clancy, A. A. et al., Ann.Oncol 27 (2016): 1696-1705

Clermont, P. L. et al., Clin Epigenetics. 8 (2016): 16

Clermont, P. L. et al., Clin Epigenetics. 7 (2015): 40

Clermont, P. L. et al., Br.J Cancer 111 (2014): 1663-1672

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114 Colas, E. et al., Clin Transl.Oncol 14 (2012): 715-720

Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995) Colombetti, S. et al., J Immunol.176 (2006): 2730-2738

Colovai, A. I. et al., Cytometry B Clin Cytom.72 (2007): 354-362 Cortesini, R., JOP.8 (2007): 697-703

Coulie, P. G. et al., Immunol.Rev 188 (2002): 33-42

Coutte, L. et al., Gene 240 (1999): 201-207

Cui, X. P. et al., Dig.Dis.Sci.59 (2014): 1442-1451

Curran, K. J. et al., Mol.Ther.23 (2015): 769-778

Dai, W. et al., Am.J Cancer Res 5 (2015): 2697-2707

Dalerba, P. et al., Int.J Cancer 93 (2001): 85-90

Dannenmann, S. R. et al., Cancer Immunol.Res.1 (2013): 288-295 Darda, L. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0122285

Darling, M. R. et al., Head Neck Pathol.2 (2008): 169-174

Dat, le T. et al., Int.J Oncol 40 (2012): 1455-1469

Davidson, B. et al., J Cell Mol.Med.15 (2011): 535-544

Davis, M. P., Cleve.Clin J Med 79 Electronic Suppl 1 (2012): eS51-eS55 de Goeje, P. L. et al., Oncoimmunology 4 (2015): e1014242 de Matos, Simoes R. et al., BMC.Syst.Biol 9 (2015): 21

De, Meulenaere A. et al., Pathobiology 83 (2016): 327-333

De, Plaen E. et al., Immunogenetics 40 (1994): 360-369 Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170 Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Devetzi, M. et al., Thromb.Haemost. 109 (2013): 716-725 Dewar, R. et al., Arch.Pathol.Lab Med 135 (2011): 422-429 Dias, R. P. et al., Epigenomics. 5 (2013): 331-340

Dobrowolska, H. et al., Cytometry B Clin Cytom.84 (2013): 21-29 Dong, Q. et al., Biomed.Res Int.2015 (2015): 156432

Dorn, J. et al., Crit Rev Clin Lab Sci. 51 (2014): 63-84

Du, T. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 100

Dua, P. et al., Cancer Res 73 (2013): 1934-1945

Duan, Z. et al., Clin Cancer Res 9 (2003): 2778-2785

Dufour, C. et al., Cancer 118 (2012): 3812-3821

Dyrskjot, L. et al., Br.J Cancer 107 (2012): 116-122

Ek, S. et al., Cancer Res 62 (2002): 4398-4405

Emmrich, S. et al., Genes Dev.28 (2014): 858-874

Fabbri, C. et al., Dig.Endosc. (2017)

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Fan, M. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 6768-6775

Fang, F. et al., Clin Cancer Res 20 (2014a): 6504-6516

Fang, L. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.446 (2014b): 272-279 Faure, A. et al., Nat Rev Urol. 13 (2016): 141-150

Feng, X. et al., Mol.Biosyst. 11 (2015): 2946-2954 Ferre, H. et al., Protein Sci.12 (2003): 551-559

Findeis-Hosey, J. J. et al., Biotech.Histochem.87 (2012): 24-29 Fishman, W. H., Tumour.Biol 16 (1995): 394-402

Follenzi, A. et al., Nat Genet. 25 (2000): 217-222

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814 Fontalba, A. et al., J Immunol.179 (2007): 8519-8524 Forghanifard, M. M. et al., Cancer Biol Ther. 12 (2011): 191-197 Frasor, J. et al., Mol.Cell Endocrinol. 418 Pt 3 (2015): 235-239 Fritzsche, F. et al., Br.J Cancer 94 (2006): 540-547

Fry, E. A. et al., Int.J Cancer 140 (2017): 495-503

Fujiyama, T. et al., J Dermatol.Sci. 75 (2014): 43-48 Fukumoto, I. et al., J Hum.Genet.61 (2016): 109-118 Fuqua, S. A. et al., Breast Cancer Res Treat.144 (2014): 11-19 Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103

Gan, X. et al., Dis.Markers 2016 (2016): 5259602

Ganguly, R. et al., Mol.Cancer Ther.13 (2014): 1393-1398 Garg, M. et al., J Clin Endocrinol.Metab 99 (2014): E62-E72 Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Ge, L. et al., J Biomed.Res 29 (2015a)

Ge, L. et al., Eur.Rev Med Pharmacol.Sci. 19 (2015b): 2703-2710 Geyer, C. R., Epigenetics. 5 (2010): 696-703

Ghodsi, M. et al., Int.J Surg.13 (2015): 193-197

Gibbs, P. et al., Melanoma Res 10 (2000): 259-264

Gleize, V. et al., Ann.Neurol. 78 (2015): 355-374

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867 Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911

Gomez, A. et al., Mol.Pharmacol. 78 (2010): 1004-1011

Gong, Y. et al., Adv.Anat.Pathol. 21 (2014): 191-200

Gottlieb, H. B. et al., J Neuroendocrinol. 19 (2007): 531-542

Gragert, L. et al., Hum.Immunol.74 (2013): 1313-1320

Grah, J. J. et al., Tumori 100 (2014): 60-68

Gratio, V. et al., Am.J Pathol.179 (2011): 2625-2636

Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012) Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014)

Gu, C. et al., Stem Cells 31 (2013): 870-881

Gu, Z. D. et al., Zhonghua Wei Chang Wai Ke.Za Zhi.10 (2007): 365-367 Gualco, G. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol. 18 (2010): 301-310 Guerrero, K. et al., Gynecol.Oncol 125 (2012): 720-726

Guo, J. T. et al., Zhonghua Zhong.Liu Za Zhi.31 (2009): 528-531 Gupta, A. K. et al., Med J Armed.Forces.India 72 (2016): S37-S42 Gustafsson, C. et al., Trends Biotechnol. 22 (2004): 346-353

Haass, N. K. et al., Pigment Cell Res 18 (2005): 150-159

Haeberle, H. et al., Neoplasia.14 (2012): 666-669

Hall, R. D. et al., Cancer Control 20 (2013): 22-31

Hamilton, K. E. et al., Mol.Cancer Res 13 (2015): 1478-1486

Han, J. et al., World J Surg.Oncol 10 (2012): 37

Han, Y. et al., Eur.J Cell Biol 94 (2015): 642-652

Han, Y. D. et al., Oncotarget. 8 (2017): 1871-1883

Hanafusa, H. et al., Seikagaku 83 (2011): 1127-1131

Harndahl, M. et al., Eur.J Immunol.42 (2012): 1405-1416 Hase, H. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 1807-1817 Hasegawa, H. et al., Arch.Pathol.Lab Med.122 (1998): 551-554 Hashem, N. N. et al., Int.J Biol Markers 25 (2010): 32-37 Hashimoto, Y. et al., Oncotarget. (2017)

Hayashi, S. I. et al., Endocr.Relat Cancer 10 (2003): 193-202 Hayashida, T. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 107 (2010): 1100-1105 Heeg, S. et al., Gastroenterology 151 (2016): 540-553

Heerma van Voss, M. R. et al., Histopathology 65 (2014): 814-827 Hemminger, J. A. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 1238-1245 Hennard, C. et al., J Pathol. 209 (2006): 430-435

Heubach, J. et al., Mol.Cancer 14 (2015): 108

Higgins, J. et al., Horm.Cancer 6 (2015): 67-86

Hildebrandt, M. O. et al., Bone Marrow Transplant.22 (1998): 771-775 Hiramoto, T. et al., Oncogene 18 (1999): 3422-3426

Hirata, T. et al., Oncol Rep. 33 (2015): 2052-2060

Hiroumi, H. et al., Int.J Cancer 93 (2001): 786-791

Hoff, P. M. et al., Surg.Oncol Clin N.Am.26 (2017): 57-71 Hoffmann, N. E. et al., Cancer 112 (2008): 1471-1479

Hofmann, M. C. et al., Eur.Urol.23 (1993): 38-44

Holm, C. et al., Leuk.Res 30 (2006): 254-261

Honrado, E. et al., Crit Rev Oncol Hematol.59 (2006): 27-39 Horiuchi, S. et al., J Pathol.200 (2003): 568-576

Horvath, A. et al., World J Gastroenterol. 10 (2004): 152-154 Hoshino, Y. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 102

Hou, Z. et al., Mol.Cancer Ther. (2017)

Hu, S. et al., J Cancer Res Clin Oncol 140 (2014): 883-893

Hu, X. T. et al., Cell Prolif.47 (2014): 200-210

Huang, K. et al., Chin J Cancer Res 26 (2014): 72-80

Huang, X. et al., Cell Prolif.48 (2015): 593-599

Hudolin, T. et al., J Transl.Med 11 (2013): 123

Hur, H. et al., J Cancer 7 (2016): 768-773

Hussein, Y. M. et al., Med.Oncol 29 (2012): 3055-3062

Hwang, M. L. et al., J Immunol.179 (2007): 5829-5838

Iacobuzio-Donahue, C. A. et al., Cancer Res 63 (2003): 8614-8622 Idbaih, A., Rev Neurol.(Paris) 167 (2011): 691-698

Ingaramo, P. I. et al., Mol.Cell Endocrinol.425 (2016): 37-47 Ioannidis, P. et al., Anticancer Res 23 (2003): 2179-2183

Ishida, S. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.339 (2006): 325-330 Ishikawa, K. et al., Mol.Biol Cell 23 (2012): 1294-1306

Ishikawa, S. et al., Cell Tissue Res 337 (2009): 381-391

Itesako, T. et al., PLoS.One. 9 (2014): e84311

Jacobs, J. et al., Pharmacol.Ther. 155 (2015a): 1-10

Jacobs, J. et al., Oncotarget. 6 (2015b): 13462-13475

James, S. R. et al., Epigenetics. 8 (2013): 849-863

Jang, B. G. et al., Virchows Arch.467 (2015): 393-403

Jeng, Y. M. et al., Br.J Surg.96 (2009): 66-73

Ji, P. et al., Oncogene 24 (2005): 2739-2744

Jiang, D. et al., PLoS.One.9 (2014): e96822

Jiang, Y. et al., Mol.Oncol 10 (2016): 292-302

Jiang, Y. et al., Oncotarget. 6 (2015): 39865-39876

Jiao, T. T. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 6 (2013): 3036-3041

Jin, H. et al., Tumour.Biol 27 (2006): 274-282

Jnawali, H. N. et al., J Nat Prod. 77 (2014): 258-263

John, T. et al., Clin Cancer Res 14 (2008): 3291-3298

Jung, D. B. et al., Oncotarget.6 (2015): 4992-5004

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615 Kalejs, M. et al., BMC.Cancer 6 (2006): 6

Kannan, K. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 112 (2015): E1272-E1277 Karlgren, M. et al., Expert.Opin.Ther.Targets. 11 (2007): 61-67 Karpf, A. R. et al., Mol.Cancer Res 7 (2009): 523-535 Kasashima, H. et al., Cancer Lett.354 (2014): 438-446 Kaufman, L. et al., J Am.Soc.Nephrol.15 (2004): 1721-1730 Kazi, J. A. et al., Neuropeptides 41 (2007): 227-231

Kedage, V. et al., Cell Rep.17 (2016): 1289-1301

Keld, R. et al., Br.J Cancer 105 (2011): 124-130

Keld, R. et al., Mol.Cancer 9 (2010): 313

Kelemen, L. E. et al., Nat Genet. 47 (2015): 888-897

Kelly, Z. et al., Int.J Cancer 139 (2016): 1608-1617

Kerns, S. L. et al., J Urol.190 (2013): 102-108

Kevans, D. et al., Int J Surg.Pathol. 19 (2011): 751-760

Khan, F. S. et al., Hepatol.Int.11 (2017): 45-53

Khan, M. F. et al., Transl.Oncol 5 (2012): 85-91

Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000) Kikkawa, Y. et al., Exp.Cell Res 328 (2014): 197-206

Kikkawa, Y. et al., J Biol Chem 288 (2013): 30990-31001 Kikkawa, Y. et al., Exp.Cell Res 314 (2008): 2579-2590

Kim, B. K. et al., J Dermatol.Sci.79 (2015a): 137-147

Kim, B. R. et al., Cell Signal.26 (2014): 1765-1773

Kim, T. D. et al., J Clin Invest 126 (2016): 706-720

Kim, T. H. et al., J Korean Med Sci.30 (2015b): 155-161

Kim, Y. D. et al., Int.J Mol.Med.29 (2012): 656-662

Kim, Y. H. et al., Ann.Surg.Oncol 18 (2011): 2338-2347

King, M. L. et al., Oncogene 34 (2015): 3452-3462

Kinoshita, T. et al., Int.Immunol.18 (2006): 1701-1706 Kinoshita, T. et al., J Biol Chem 280 (2005): 21720-21725 Kirkova, M. et al., Pharmacol.Rep. 61 (2009): 1163-1172

Klatka, J. et al., Eur.Arch.Otorhinolaryngol. 270 (2013): 2683-2693 Klauke, K. et al., Nat Cell Biol 15 (2013): 353-362

Kleeff, J. et al., Nat Rev Dis.Primers.2 (2016): 16022

Knudsen, K. A. et al., J Cell Biochem. 95 (2005): 488-496

Ko, A. et al., BMB.Rep. 49 (2016): 598-606

Kocak, H. et al., Cell Death.Dis.4 (2013): e586

Kohrt, D. et al., Cell Cycle 13 (2014): 62-71

Kontos, C. K. et al., Clin Chem Lab Med 54 (2016): 315-324 Koonrungsesomboon, N. et al., Cancer Epidemiol.39 (2015): 487-496 Korr, D. et al., Cell Signal. 18 (2006): 910-920

Kountourakis, P. et al., Thromb.Haemost. 101 (2009): 541-546 Krepischi, A. C. et al., Mol.Cytogenet. 9 (2016): 20

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Kruhlak, M. et al., Nature 447 (2007): 730-734

Kuball, J. et al., Blood 109 (2007): 2331-2338

Kuga, T. et al., J Cell Sci. 126 (2013): 4721-4731

Kuga, T. et al., Sci.Rep. 6 (2016): 26557

Kumar-Sinha, C. et al., Genome Med 7 (2015): 129

Kumari, A. et al., BMC.Res Notes 9 (2016): 92

Kuner, R. et al., J Mol.Med (Berl) 91 (2013): 237-248

Kuo, C. T. et al., Cancer Lett.378 (2016): 104-110

Kuppers, R. et al., J Clin Invest 111 (2003): 529-537

Kuraishi, Y., Yakugaku Zasshi 134 (2014): 1125-1142

Kurscheid, S. et al., Genome Biol 16 (2015): 16

Kwon, O. S. et al., Oncotarget. 6 (2015): 41916-41928

La, Vecchia C., Eur.J Cancer Prev. 10 (2001): 125-129

Lally, K. M. et al., Int.J Cancer 93 (2001): 841-847

Lapin, V. et al., Oncogenesis. 3 (2014): e133

Latini, F. R. et al., Blood Cells Mol.Dis.50 (2013): 161-165 Lawrenson, K. et al., Int.J Cancer 136 (2015a): 1390-1401 Lawrenson, K. et al., Nat Commun.6 (2015b): 8234

Lazaro-Ibanez, E. et al., BMC.Cancer 17 (2017): 92

Lederer, M. et al., Semin.Cancer Biol 29 (2014): 3-12

Lee, E. et al., BMB.Rep. 46 (2013): 594-599

Lee, O. H. et al., Mol.Cell Proteomics. 10 (2011): M110

Leong, S. R. et al., Mol.Pharm.12 (2015): 1717-1729

Leung, F. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.25 (2016): 1333-1340 Li, B. et al., Cell Biochem.Biophys. 70 (2014a): 1363-1368

Li, B. et al., Oncotarget. (2016a)

Li, H. et al., Gynecol.Oncol 84 (2002): 216-221

Li, L. et al., Cytokine 89 (2017): 173-178

Li, L. et al., Zhongguo Shi Yan.Xue.Ye.Xue.Za Zhi.24 (2016b): 326-331 Li, M. et al., Oncotarget.7 (2016c): 51503-51514

Li, M. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 1809-1814

Li, Q. et al., J Gastroenterol.Hepatol. 29 (2014b): 835-842

Li, W. M. et al., J Surg.Oncol (2016d)

Li, Z. et al., Cancer Res 76 (2016e): 619-629

Liang, X. et al., Oncotarget. 7 (2016): 52207-52217

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Lilja-Maula, L. et al., J Comp Pathol. 150 (2014): 399-407

Lim, J. Y. et al., World J Gastroenterol.19 (2013): 7078-7088

Lin, J. et al., Clin Cancer Res 10 (2004): 5708-5716

Lin, L. et al., Oncol Lett.6 (2013a): 740-744

Lin, Q. et al., J Cancer Res Clin Oncol 135 (2009): 1675-1684

Lin, Z. et al., Diagn.Pathol.8 (2013b): 133

Linn, D. E. et al., PLoS.One.10 (2015): e0120628

Linz, K. et al., J Pharmacol.Exp.Ther. 349 (2014): 535-548

Liu, D. B. et al., World J Gastroenterol.11 (2005): 1562-1566

Liu, M. et al., Cell Mol.Neurobiol. 34 (2014a): 913-923

Liu, Q. et al., J Biol Chem 286 (2011): 29951-29963

Liu, R. et al., Cancer Biol Ther.16 (2015a): 317-324

Liu, W. et al., Mol.Clin Oncol 2 (2014b): 219-225

Liu, X. et al., Biomed.Pharmacother. 88 (2017): 595-602

Liu, X. et al., Int.Immunopharmacol.25 (2015b): 416-424

Liu, Y. et al., Int.J Gynecol.Cancer 23 (2013): 304-311

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759

Llaurado, M. et al., Int.J Cancer 130 (2012a): 1532-1543

Llaurado, M. et al., Mol.Cancer Res 10 (2012b): 914-924

Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291

Lopez, R. et al., Int.J Gynecol.Cancer 16 (2006): 1289-1296

Lopez-Romero, R. et al., Rev Med Inst.Mex.Seguro.Soc.53 Suppl 2 (2015): S188-S193 Lorincz, A. T., Acta Cytol. 60 (2016): 501-512

Lose, F. et al., Biol Chem 393 (2012): 403-412

Low, G. M. et al., Oral Oncol 61 (2016): 27-30

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795

Lunardi, A. et al., Cancer Discov 5 (2015): 550-563

Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004)

Luo, H. et al., Int.J Clin Exp.Med 7 (2014): 1244-1254

Luo, P. et al., Oncol Rep. (2017)

Luostari, K. et al., PLoS.One.9 (2014): e102519

Lv, G. Q. et al., Biochem.Cell Biol 92 (2014): 379-389

Lv, L. et al., Cancer Lett.357 (2015a): 105-113

Lv, X. et al., J Exp.Clin Cancer Res 34 (2015b): 133

Ma, K. et al., Clin Epigenetics. 8 (2016a): 43

Ma, Y. et al., Biosens.Bioelectron. 85 (2016b): 641-648

Ma, Z. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015): 5071-5079

MacLean, J. A. et al., PLoS.One. 11 (2016): e0156109

Mahajan, A., Hum.Pathol.51 (2016): 64-74

Maine, E. A. et al., Oncotarget. 7 (2016): 14708-14726

Maines-Bandiera, S. et al., Int.J Gynecol.Cancer 20 (2010): 16-22 Mamane, Y. et al., J Interferon Cytokine Res 22 (2002): 135-143

Mantia-Smaldone, G. M. et al., Hum.Vaccin.Immunother.8 (2012): 1179-1191 Manzella, L. et al., Curr.Cancer Drug Targets.16 (2016): 594-605

Mao, L. et al., Cancer Res 71 (2011): 4314-4324

Marcinkiewicz, K. M. et al., Exp.Cell Res 320 (2014a): 128-143 Marcinkiewicz, K. M. et al., J Cell Physiol 229 (2014b): 1405-1416 Marlow, L. A. et al., J Cell Sci.125 (2012): 4253-4263

Maruta, S. et al., APMIS 117 (2009): 791-796

Marzese, D. M. et al., Hum.Mol.Genet.23 (2014): 226-238

Masamoto, I. et al., Leuk.Lymphoma 57 (2016): 685-691

Mason, J. M. et al., Nucleic Acids Res.43 (2015): 3180-3196

Mawrin, C. et al., J Neurooncol.99 (2010): 379-391

McCormack, E. et al., Cancer Immunol.Immunother.62 (2013): 773-785 Medina-Aguilar, R. et al., Data Brief.11 (2017): 169-182

Mehta, A. et al., Breast 23 (2014): 2-9

Melin, B., Curr.Opin.Oncol 23 (2011): 643-647

Menezes, J. et al., Leukemia 28 (2014): 823-829

Mercer, K. E. et al., Adv.Exp.Med Biol 815 (2015): 185-195

Mercer, K. E. et al., Cancer Prev.Res (Phila) 7 (2014): 675-685 Mesquita, D. et al., Oncotarget. 6 (2015): 5217-5236

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Michaelidou, K. et al., Breast Cancer Res Treat.152 (2015): 323-336 Millan, J. L. et al., Crit Rev Clin Lab Sci.32 (1995): 1-39

Mitsuhashi, K. et al., Int.J Hematol.100 (2014): 88-95 Miyazaki, M. et al., Immunity.28 (2008): 231-245

Miyoshi, Y. et al., Med.Mol.Morphol. 43 (2010): 193-196 Mizuno, K. et al., Int.J Oncol 48 (2016): 450-460

Moon, H. J. et al., Bioorg.Chem 57 (2014): 231-241

Moore, K. N. et al., J Clin Oncol (2016): JCO2016699538 Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Moroy, T. et al., Semin.Immunol.23 (2011): 379-387 Mortara, L. et al., Clin Cancer Res.12 (2006): 3435-3443 Moskvina, L. V. et al., Arkh.Patol. 72 (2010): 58-61

Moussa, O. et al., J Cell Biochem. 108 (2009): 1389-1398 Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638 Nabeshima, K. et al., Diagn.Cytopathol. 44 (2016): 774-780 Nalla, A. K. et al., Mol.Carcinog 55 (2016): 1761-1771 Nawaz, I. et al., Oncotarget. 6 (2015): 31493-31507

Nishida, C. R. et al., Mol.Pharmacol. 78 (2010): 497-502 Niskakoski, A. et al., Epigenetics. 9 (2014): 1577-1587

Noah, T. K. et al., Gastroenterology 144 (2013): 1012-1023 Notaridou, M. et al., Int.J Cancer 128 (2011): 2063-2074 Notaro, S. et al., BMC.Cancer 16 (2016): 589

Noubissi, F. K. et al., J Invest Dermatol. 134 (2014): 1718-1724 Obiezu, C. V. et al., Cancer Lett.224 (2005): 1-22

Oh, S. et al., Biochim.Biophys.Acta 1826 (2012): 1-12

Ohno, S. et al., Anticancer Res 28 (2008): 2493-2497

Okada, K. et al., Cancer Sci.95 (2004): 949-954

Okamoto, O. K. et al., Biochim.Biophys.Acta 1769 (2007): 437-442 Oliveira-Costa, J. P. et al., Oncotarget.6 (2015): 20902-20920 Orsini, G. et al., Pathol.Oncol Res 20 (2014): 267-276

Orwat, D. E. et al., Arch.Pathol.Lab Med 136 (2012): 333-338 Ostergaard, Pedersen L. et al., Eur.J Immunol.31 (2001): 2986-2996 Ottaviani, S. et al., Cancer Immunol.Immunother.55 (2006): 867-872 Otte, M. et al., Cancer Res 61 (2001): 6682-6687

Oue, N. et al., Cancer Sci.106 (2015): 951-958

Pacholczyk, M. et al., Med Pr 67 (2016): 255-266

Pagnotta, S. M. et al., PLoS.One. 8 (2013): e72638

Pai, V. P. et al., Breast Cancer Res 11 (2009): R81

Pal, M. et al., J Biol Chem 288 (2013): 12222-12231

Palacios, J. et al., Pathobiology 75 (2008): 85-94

Paliouras, M. et al., Breast Cancer Res Treat.102 (2007): 7-18 Paliouras, M. et al., Mol.Oncol 1 (2008a): 413-424

Paliouras, M. et al., Tumour.Biol 29 (2008b): 63-75

Palma, M. et al., BMC.Clin Pathol.12 (2012): 2 Papachristopoulou, G. et al., Tumour.Biol 34 (2013): 369-378 Papadakis, A. I. et al., Cell Res 25 (2015): 445-458 Papadopoulou-Boutis, A. et al., Cancer Detect.Prev.8 (1985): 141-150 Paredes, J. et al., Breast Cancer Res 9 (2007): 214

Paredes, J. et al., Biochim.Biophys.Acta 1826 (2012): 297-311 Parris, T. Z. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 324

Parris, T. Z. et al., Clin Cancer Res 16 (2010): 3860-3874 Pathiraja, T. N. et al., Sci.Transl.Med 6 (2014): 229ra41

Patrick, A. N. et al., Nat Struct.Mol.Biol 20 (2013): 447-453 Pattani, K. M. et al., PLoS.One.7 (2012): e45534

Peeters, M. C. et al., Cell Signal. 27 (2015): 2579-2588 Pelkonen, M. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 431

Peng, H. X. et al., Biomed.Res Int.2015 (2015): 326981 Pereira, B. et al., Nucleic Acids Res 41 (2013): 3986-3999 Perez, C. A. et al., Expert.Rev Anticancer Ther.11 (2011): 1599-1605 Petersen, G. M., Semin.Oncol 43 (2016): 548-553

Petrau, C. et al., J Cancer 5 (2014): 761-764

Pich, C. et al., Br.J Cancer 114 (2016a): 63-70

Pich, C. et al., PLoS.One.11 (2016b): e0148095

Pickard, M. R. et al., Breast Cancer Res 11 (2009): R60 Pineda, C. T. et al., Cell 160 (2015): 715-728

Piura, B. et al., Harefuah 144 (2005): 261-5, 303, 302 Planaguma, J. et al., Hum.Pathol. 42 (2011): 57-67

Planque, C. et al., Biol Chem 389 (2008a): 781-786

Planque, C. et al., Clin Chem 56 (2010): 987-997

Planque, C. et al., Clin Cancer Res 14 (2008b): 1355-1362 Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787 Pollack, S. M. et al., PLoS.One. 7 (2012): e32165

Pollard, C. et al., Expert.Rev Mol.Med 12 (2010): e10

Ponte, J. F. et al., Neoplasia. 18 (2016): 775-784

Ponzoni, M. et al., Ann.Oncol 25 (2014): 316-322

Popov, N. et al., Epigenetics.5 (2010): 685-690

Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Power, P. F. et al., J Orthop.Res 31 (2013): 493-501

Prasad, M. L. et al., Head Neck 26 (2004): 1053-1057

Pu, X. et al., Clin Pharmacol.Ther.96 (2014): 609-615

Pyle-Chenault, R. A. et al., Tumour.Biol 26 (2005): 245-257

Qin, Y. et al., Chin Med.J (Engl.) 127 (2014): 1666-1671

Rabien, A. et al., Tumour.Biol 29 (2008): 1-8

Raeisossadati, R. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 5299-5305

Rahmatpanah, F. B. et al., Leukemia 20 (2006): 1855-1862

Rajapakse, S. et al., Zoolog.Sci.24 (2007): 774-780

Rammensee, H. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219

Ramos-Solano, M. et al., Exp.Cell Res 335 (2015): 39-50

Rapoport, A. P. et al., Nat Med 21 (2015): 914-921

Rasmussen, S. L. et al., Colorectal Dis.18 (2016): 549-561

Rastelli, F. et al., Tumori 96 (2010): 875-888

Rauscher, G. H. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 816

Ravenni, N. et al., MAbs. 6 (2014): 86-94

Reck, M., Ann.Oncol 23 Suppl 8 (2012): viii28-viii34

RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/

Resende, C. et al., Helicobacter. 16 Suppl 1 (2011): 38-44

Reyes, C. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol. 21 (2013): 283-286 Reyniers, L. et al., J Neurochem. 131 (2014): 239-250

Ribeiro, A. S. et al., Front Oncol 4 (2014): 371

Ricketts, C. J. et al., PLoS.One.9 (2014): e85621

Riedel, S. S. et al., J Clin Invest 126 (2016): 1438-1450

Ries, J. et al., Int.J Oncol 26 (2005): 817-824

Rinaldi, A. et al., Pathobiology 77 (2010): 129-135

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Risch, H. A. et al., J Natl.Cancer Inst.98 (2006): 1694-1706

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Rodenko, B. et al., Nat Protoc.1 (2006): 1120-1132

Rodriguez-Rodero, S. et al., J Clin Endocrinol.Metab 98 (2013): 2811-2821 Roy, A. et al., J Cell Physiol 230 (2015): 504-509

Royce, L. S. et al., Invasion Metastasis 12 (1992): 149-155

Ruf, M. et al., Clin Cancer Res 21 (2015a): 889-898

Ruf, M. et al., Oncoimmunology 4 (2015b): e1049805

Rui, X. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015): 5435-5442

S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 032-035OL, (2013)

Sadik, H. et al., Cancer Res 76 (2016): 4443-4456

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Salazar, M. D. et al., Breast Cancer Res 13 (2011): R18

Samaan, S. et al., Biol Chem 395 (2014): 991-1001

Sanchez, W. Y. et al., Endocrinology 153 (2012): 3179-3189 Savone, D. et al., Tumori 102 (2016): 450-458

Sawasaki, T. et al., Tumour.Biol 25 (2004): 141-148

Schaefer, J. S. et al., J Biol Chem 285 (2010): 11258-11269

Schmitt, T. M. et al., Hum.Gene Ther.20 (2009): 1240-1248 Scholten, K. B. et al., Clin Immunol.119 (2006): 135-145

Schulte, I. et al., BMC.Genomics 13 (2012): 719

Scrideli, C. A. et al., J Neurooncol. 88 (2008): 281-291

Sedgwick, A. E. et al., Cancers (Basel) 8 (2016)

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Seifi-Alan, M. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.14 (2014): 6625-6629

Seki, H. et al., Ann.Surg.Oncol 19 (2012): 1831-1840

Seliger, B., Methods Mol.Biol 1102 (2014): 367-380

Sha, L. et al., Clin Exp.Med 15 (2015): 55-64

Sha, S. et al., Dig.Liver Dis. 45 (2013): 422-429

Shabestarian, H. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.16 (2015): 8461-8465 Shaffer, A. L. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 2954-2961

Shang, B. et al., Cell Death.Dis. 5 (2014): e1285

Shantha Kumara, H. M. et al., Cancer Immun.12 (2012): 16

Sharpe, D. J. et al., Oncotarget. 5 (2014): 8803-8815

Sher, Y. P. et al., Cancer Res 66 (2006): 11763-11770

Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986) Shi, H. et al., World J Surg.Oncol 12 (2014): 188

Shi, X. et al., Cancer Lett.339 (2013): 159-166

Shima, H. et al., Int.J Hematol.99 (2014): 21-31

Shrestha, B. et al., FEBS J 279 (2012): 3715-3726

Si, Y. Q. et al., Transplant.Proc. 44 (2012): 1407-1411

Simeone, A. et al., Mech.Dev. 33 (1991): 215-227

Simonova, O. A. et al., Mol.Biol (Mosk) 49 (2015): 667-677

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother.53 (2004): 187-195 Skandalis, S. S. et al., Matrix Biol 35 (2014): 182-193

Skotheim, R. I. et al., Cancer Res 65 (2005): 5588-5598

Slim, R. et al., Mol.Hum.Reprod.18 (2012): 52-56

Small, E. J. et al., J Clin Oncol.24 (2006): 3089-3094

Smith, J. B. et al., Gynecol.Oncol 134 (2014): 181-189 Snijders, A. M. et al., Mol.Oncol 11 (2017): 167-179

Sohal, D. P. et al., Crit Rev Oncol Hematol.107 (2016): 111-118 Song, D. G. et al., J Hematol.Oncol 9 (2016): 56

Sontakke, P. et al., PLoS.One. 11 (2016): e0153226 Spadaro, A. et al., World J Gastroenterol.12 (2006): 4716-4720 Sriraksa, R. et al., Cancer Prev.Res (Phila) 6 (2013): 1348-1355 Stamer, U. M. et al., Br.J Anaesth.106 (2011): 566-572 Steffan, J. J. et al., Cancer Lett.310 (2011): 109-117 Stornaiuolo, A. et al., Cell Differ.Dev.31 (1990): 119-127 Su, S. et al., J Biol Chem 287 (2012): 34809-34824

Suciu-Foca, N. et al., J Immunol.178 (2007): 7432-7441 Sun, H. et al., J BUON.20 (2015): 296-308

Sun, S. et al., Dig.Dis.Sci.61 (2016): 2535-2544

Suzuki, N. et al., J Orthop.Res 32 (2014): 915-922

Sykes, D. B. et al., Cell 167 (2016): 171-186

Szajnik, M. et al., Gynecol.Obstet.(Sunnyvale.) Suppl 4 (2013): 3 Szalay, F. et al., World J Gastroenterol. 10 (2004): 42-45 Szarvas, T. et al., Int J Cancer 135 (2014): 1596-1604 Szczepanski, M. J. et al., Oral Oncol 49 (2013): 144-151 Szczepanski, M. J. et al., Biomark.Med.7 (2013): 575-578 Ta, L. et al., Mol.Med Rep. 14 (2016): 1371-1378

Tabuse, M. et al., Mol.Cancer 10 (2011): 60

Talieri, M. et al., Br.J Cancer 100 (2009): 1659-1665

Tan, A. C. et al., Cancer Biol Ther.7 (2008): 135-144

Tan, P. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.419 (2012): 801-808 Tanaka, F. et al., Int.J Oncol 10 (1997): 1113-1117

Tatarian, T. et al., Surg.Clin North Am. 96 (2016): 1207-1221

Tchabo, N. E. et al., Cancer Immun.9 (2009): 6

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci.62 (2005): 1755-1762

Thomsen, H. et al., BMC.Cancer 16 (2016): 227

Thorne, A. et al., Cytotherapy. 17 (2015): 633-646

Tian, X. et al., J Transl.Med. 13 (2015): 337

Titz, B. et al., Oncogene 29 (2010): 5895-5910

Tjalma, W. A., Eur.J Obstet.Gynecol.Reprod.Biol 210 (2017): 275-280 Tomioka, N. et al., Cancer Genet.Cytogenet.201 (2010): 6-14

Torres, S. et al., Clin Cancer Res 21 (2015): 4892-4902

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Trojandt, S. et al., Hum.Immunol.77 (2016): 1223-1231

Tsukihara, H. et al., PLoS.One.11 (2016): e0163961

Tung, P. Y. et al., Stem Cells 31 (2013): 2330-2342

Uehiro, N. et al., Breast Cancer Res 18 (2016): 129

Ulker, V. et al., Eur.J Obstet.Gynecol.Reprod.Biol 170 (2013): 188-192 Underwood, L. J. et al., Biochim.Biophys.Acta 1502 (2000): 337-350 Ushiku, T. et al., Histopathology 61 (2012): 1043-1056

van den Hurk, K. et al., Biochim.Biophys.Acta 1826 (2012): 89-102 van der Bruggen, P. et al., Immunol.Rev 188 (2002): 51-64

van, Duin M. et al., Haematologica 96 (2011): 1662-1669 Vanderstraeten, A. et al., Cancer Immunol.Immunother.63 (2014): 545-557 Vardhini, N. V. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 10855-10860

Vater, I. et al., Leukemia 29 (2015): 677-685

Vieira, A. F. et al., Mol.Cancer 14 (2015): 178

Vincent, A. et al., Oncotarget. 5 (2014): 2575-2587

Vlad, G. et al., Exp.Mol.Pathol. 93 (2012): 294-301

Vukovic, M. et al., J Exp.Med 212 (2015): 2223-2234

Walker, F. et al., Biol Chem 395 (2014): 1075-1086

Wallrapp, C. et al., Cancer Res 60 (2000): 2602-2606

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med.18 (2012): 1254-1261

Wang, H. et al., Int.J Cancer 124 (2009): 1349-1357

Wang, J. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.24 (2015a): 1332-1340 Wang, L. et al., Diagn.Pathol.8 (2013): 190

Wang, Q. et al., Onco.Targets.Ther.8 (2015b): 1971-1977

Wang, Q. J. et al., Clin Cancer Res (2016a)

Wang, X. et al., Med Oncol 28 (2011): 1225-1254

Wang, X. et al., Hum.Immunol.75 (2014): 1203-1209

Wang, X. Z. et al., Oncogene 18 (1999): 5718-5721

Wang, Y. et al., BMC.Genomics 17 Suppl 7 (2016b): 515

Wang, Y. Y. et al., World J Surg.Oncol 13 (2015c): 259

Wanli, H. et al., Yi.Chuan 37 (2015): 1095-1104

Watabe, T., J Biochem.152 (2012): 1-3

Wegiel, B. et al., J Natl.Cancer Inst.100 (2008): 1022-1036

Wen, Y. et al., Zhongguo Fei.Ai.Za Zhi.17 (2014): 30-33

Western, P. S. et al., PLoS.One.6 (2011): e20736

Wielscher, M. et al., EBioMedicine 2 (2015): 929-936

Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423 Wilson, E. M., Ther.Adv.Urol.2 (2010): 105-117

Wilson, E. M., Methods Mol.Biol 776 (2011): 113-129 Wolff, L. et al., Blood Cells Mol.Dis.50 (2013): 227-231 Wong, C. C. et al., Hepatology 60 (2014a): 1645-1658 Wong, N. A. et al., J Clin Pathol.67 (2014b): 105-111 Woo, M. M. et al., Clin Cancer Res 10 (2004): 7958-7964 Wu, G. Q. et al., Plasmid 64 (2010): 41-50

Wu, L. et al., Int.J Mol.Med.36 (2015): 1200-1204

Wu, P. et al., Nano.Lett.13 (2013): 4632-4641

Wu, S. Y. et al., Nat Commun.7 (2016): 11169

Wu, Z. Y. et al., Scand.J Immunol.74 (2011): 561-567 Xiao, Z. D. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 4039-4044 Xu, C. et al., Biomarkers 20 (2015a): 271-274

Xu, C. Q. et al., Alcohol Clin Exp.Res 39 (2015b): 969-979 Xu, D. et al., Mol.Biosyst.12 (2016): 3067-3087

Xu, J. et al., Dig.Liver Dis.46 (2014a): 750-757

Xu, L. et al., Zhongguo Fei.Ai.Za Zhi.14 (2011): 727-732 Xu, Y. et al., Oncol Lett.7 (2014b): 1474-1478

Xuan, F. et al., Neuro.Oncol 18 (2016): 819-829

Xylinas, E. et al., Biomolecules. 6 (2016)

Yakimchuk, K. et al., Mol.Cell Endocrinol. 375 (2013): 121-129 Yamada, R. et al., Tissue Antigens 81 (2013): 428-434 Yamagata, M. et al., J Neurosci. 32 (2012): 14402-14414 Yamamoto, H. et al., Carcinogenesis 25 (2004): 325-332 Yang, B. et al., Asian Pac.J Trop.Med 9 (2016a): 1105-1110 Yang, F. et al., Onco.Targets.Ther. 9 (2016b): 7039-7045 Yang, H. et al., Oncol Rep. 34 (2015a): 1681-1691

Yang, L. et al., Oncol Lett.12 (2016c): 4068-4074

Yang, P. et al., Curr.Pharm.Des 21 (2015b): 1292-1300 Yang, W. et al., Cancer 91 (2001): 1277-1283

Yang, X. S. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.13 (2012): 1657-1662 Yao, J. et al., Cancer Immunol.Res.2 (2014): 371-379

Yi, J. M. et al., Tumour.Biol 33 (2012): 363-372

Yi, Y. J. et al., Int.J Mol.Med 37 (2016): 1405-1411

Yilmaz-Ozcan, S. et al., PLoS.One.9 (2014): e107905

Yin, B. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 2934-2941

Yin, X. Y. et al., Oncogene 20 (2001): 2908-2917

Yin, X. Y. et al., Oncogene 18 (1999): 6621-6634

Yoon, H. et al., Tohoku J Exp.Med 224 (2011): 41-46

Yu, H. et al., Blood 124 (2014): 1737-1747

Yu, Y. et al., J Pharmacol.Sci.112 (2010): 83-88

Yuan, R. et al., Cancer Res 74 (2014): 5287-5300

Yuan, R. H. et al., Ann Surg.Oncol 16 (2009): 1711-1719 Yue, W. et al., Sci.Rep.5 (2015): 13390

Zamuner, F. T. et al., Mol.Cancer Ther.14 (2015): 828-834 Zanaruddin, S. N. et al., Hum.Pathol. 44 (2013): 417-426 Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577

Zha, Y. et al., PLoS.One.7 (2012): e40728

Zhai, Y. et al., Cancer Res 67 (2007): 10163-10172

Zhan, J. et al., Br.J Cancer 111 (2014): 883-893

Zhan, J. et al., Cancer Lett.361 (2015): 75-85

Zhang, C. et al., J Surg.Res 197 (2015a): 301-306

Zhang, D. et al., Oncol Rep.35 (2016a): 81-88

Zhang, G. et al., Int.J Biochem.Cell Biol 36 (2004): 1613-1623 Zhang, H. et al., J Exp.Clin Cancer Res 26 (2007): 361-366 Zhang, H. Y. et al., Oncol Rep.34 (2015b): 1193-1202

Zhang, J. et al., Oncotarget.6 (2015c): 42040-42052

Zhang, J. et al., Sci.Rep.7 (2017): 42819

Zhang, K. et al., Tumour.Biol 35 (2014a): 7669-7673

Zhang, L. et al., Med Oncol 31 (2014b): 52

Zhang, L. et al., Cancer Res 65 (2005): 925-932

Zhang, M. et al., Onco.Targets.Ther. 9 (2016b): 2717-2723 Zhang, R. et al., Mol.Med Rep. 5 (2012a): 256-259

Zhang, W. et al., Epigenetics.10 (2015d): 736-748

Zhang, W. et al., Acta Haematol.130 (2013): 297-304

Zhang, X. et al., Int.J Oncol (2016c)

Zhang, X. et al., Med.Oncol 32 (2015e): 148

Zhang, Y. et al., Mol.Med.Rep. 5 (2012b): 910-916

Zhang, Z. et al., Tumour.Biol (2015f)

Zhao, H. et al., Zhonghua Gan Zang.Bing.Za Zhi.10 (2002): 100-102 Zhao, L. et al., Oncogene (2017)

Zhao, R. et al., EBioMedicine 8 (2016): 30-39

Zheng, J. et al., J Surg.Oncol 107 (2013): 746-751

Zhou, B. et al., Biochim.Biophys.Acta 1784 (2008): 747-752 Zhou, Y. et al., Mol.Cell Endocrinol. 386 (2014): 16-33 Zhu, J. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 14 (2013): 3011-3015 Zhu, N. et al., J Clin Invest 126 (2016): 997-1011

Zhussupova, A. et al., PLoS.One. 9 (2014): e105285

Zou, C. et al., Cancer 118 (2012): 1845-1855

Zufferey, R. et al., J Virol.73 (1999): 2886-2892

Neumann, F. et al., Cancer Immunol.Immunother.53 (2004): 589-599 Rammensee, H. et al., Immunogenetics 50 (1999): 21

Claims (9)

Patentni zahtevi

1. Peptid koji sadrži ID BR. SEKV 53: (MEHPGKLLF) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što navedeni peptid ima sposobnost da se veže za MHC molekul klase I ili II, te naznačen time što navedeni peptid, kada je vezan za navedeni MHC, ima sposobnost da ga prepoznaju CD4 i/ili CD8 T ćelije.

3. Antitelo, poželjno monoklonalno antitelo ili njegov fragment, koje specifično prepoznaje peptid patentnih zahteva 1 ili 2, poželjno peptid patentnih zahteva 1 ili 2 kada je vezan za MHC molekul.

4. T-ćelijski receptor ili njegov fragment, koji specifično prepoznaje HLA ligand, naznačeno time što je navedeni ligand peptid iz patentnih zahteva 1 ili 2 kada je vezan za MHC molekul.

5. T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačen time što je navedeni T-ćelijski receptor obezbeđen kao rastvorljiv molekul i opciono nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.

6. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži peptid iz patentnih zahteva 1 ili 2, antitelo ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 3, T-ćelijski receptor ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili 5, naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno izabrana od antigen-prezentujuće ćelije, kao što je dendritična ćelija, T ćelija ili NK ćelija.

7. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih T limfocita, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I ili II sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačkog konstrukta koji imitira antigen-prezentujuću ćeliju u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigenspecifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid iz patentnih zahteva 1 ili 2.

8. Aktivirani T limfocit, proizveden metodom u skladu sa patentnim zahtevom 7, koji selektivno prepoznaje ćeliju koja prezentuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u patentnom zahtevu 1 ili 2.

9. Farmaceutska smeša koja sadrži najmanje jedan aktivan sastojak izabran iz grupe koju čine peptid iz patentnih zahteva 1 ili 2, antitelo ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 3, T-ćelijski receptor ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili 5, ćelija domaćin u skladu sa patentnim zahtevom 6, ili aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 8, ili konjugovan ili obeležen aktivan sastojak, i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono, farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore.

Metod za proizvodnju peptida iz patentnih zahteva 1 ili 2, antitela ili njegovog fragmenta u skladu sa patentnim zahtevom 3, ili T-ćelijskog receptora ili njegovog fragmenta u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili 5, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 6, i izolovanja peptida, antitela ili njegovog fragmenta ili T-ćelijskog receptora ili njegovog fragmenta iz navedene ćelije domaćina i/ili medijuma za njenu kultivaciju.

Peptid iz patentnih zahteva 1 ili 2, antitelo ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 3, T-ćelijski receptor ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili 5, ćelija domaćin u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 8 za upotrebu u medicini.

Peptid iz patentnih zahteva 1 ili 2, antitelo ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 3, T-ćelijski receptor ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili 5, ćelija domaćin u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 8 za upotrebu u dijagnostikovanju i/ili lečenju raka.

Komplet koji se sastoji od: (a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu koja sadrži peptid iz patentnih zahteva 1 ili 2, antitelo ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 3, T-ćelijski receptor ili njegov fragment u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili 5, ćeliju domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 6, ili aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 8, u rastvoru ili u liofiliziranom obliku;

(b) opciono, druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju;

(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.

Komplet u skladu sa patentnim zahtevom 13 dalje se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) igla ili (vii) brizgalica.