KR20190112271A - 난소암 및 다른 암에 대한 면역요법에 사용을 위한 신규 펩티드 및 펩티드의 조합 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역요법 방법에서 사용을 위한 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단독 또는 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 역할가능한 기타 종양 연관 펩티드들과 병용하여 항종양 면역 반응을 촉진하거나 혹은 세포를 생체 외 촉진하여 환자로 이전하기 위한 종양 연관 T 세포 에피톱에 관한 것이다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드 또는 그러한 펩티드는 항체, 가용성 T 세포 수용체 및 기타 결합하는 분자의 표적이 될 수도 있다.

Description

난소암 및 다른 암에 대한 면역요법에 사용을 위한 신규 펩티드 및 펩티드의 조합

본 발명은 면역요법 방법에서 사용을 위한 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단독 또는 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 역할가능한 기타 종양 연관 펩티드들과 병용하여 항종양 면역 반응을 촉진하거나 혹은 세포를 생체 외 촉진하여 환자로 이전하기 위한 종양 연관 T 세포 에피톱에 관한 것이다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드 또는 그러한 펩티드는 항체, 가용성 T 세포 수용체 및 기타 결합하는 분자의 표적이 될 수도 있다.

본 발명은 항종양 면역 반응을 이끌어내는 백신 조성물에서 또는 약학적/면역학적 활성 화합물 및 세포의 개발을 위한 표적으로 사용할 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 분자로부터 유래하는 여러 신규 펩티드 서열 및 이들의 변이체에 관한 것이다.

난소암

2012년에 239,000건이 새로 발생한 것으로 추정되는 난소암은 여성에서 7번째로 가장 흔한 암이며 여성에서 모든 암의 4%를 차지한다. 난소암의 사망률은 여성의 생식 기관의 다른 암들에 비해 더 높은 경향이 있으며, 그 사망률은 생활자원이 낮은 환경에서 더 높다. 결과적으로 난소암은 여성에서 암에 의한 사망 중 8번째로 높은 원인이며, 152,000건의 사망에 달한다. 2012년, 모든 새로운 사례의 약 55%는 인간 개발 수준이 높거나 가장 높은 국가에서 발생했으며, 이 중 새로운 사례 중 37%와 사망 중 39%가 유럽과 북미에서 발생했다. 발생률은 북부 및 동부 유럽, 북미 및 오세아니아 지역에서 가장 높으며 아프리카와 대부분의 아시아 지역에서 상대적으로 낮은 편이다. 발생률은 인간 개발 수준이 매우 높은 일부 국가에서, 특히 유럽과 북미에서 하락되어 왔다.

가장 흔한 난소암은 난소 암종으로 이것은 또한 가장 치명적인 부인과 악성암이다. 조직병리학 및 분자 유전학에 근거하면, 난소 암종은 5개의 주요 유형으로 나뉜다: 고등급 장액성(70%), 자궁내막(10%), 투명 세포(10%), 점액(3%) 및 저등급 장액성 암종(< 5%)이며 이들은 합해서 95% 이상의 사례를 차지한다. 훨씬 덜 빈번한 것으로는 악성 생식세포 종양(미분화세포종, 난황 난종 및 미성숙 기형종) (난소암의 3%) 그리고 가능한 것으로 악성 성끈 간질 종양(1 ~ 2%)이 있는데, 가장 빈번한 것은 과립막 세포 종양이다.

난소 암종은 가장 흔히 무산부 여성에게 영향을 미치며 전형적으로 임신이나 경구 피임약에 의해 배란이 억압된 여성에게서 가장 덜 빈번히 발생한다. 이 종양은 일반적으로 난소 표면이나 골반 복막을 덮는 세포로부터 유래하는 것으로 간주된다. 이 중피의 악성 형질전환은 "지속 배란" 이론에 의해 설명되어 왔다(La, 2001).

난소암의 가족력은 사례의 10%를 차지한다; 2명 이상의 일촌 가족이 암에 걸린 적이 있으면 그 위험은 3배로 증가된다. BRCA1 혹은 BRCA2의 종자계 돌연변이가 있는 여자는 70세까지 주로 고등급 장액성 암종의 난소암에 걸릴 위험이 30-70%이다(Risch et al., 2006).

외과적 절제가 조기 그리고 진행된 단계의 난소 암종에서 일차 요법이다. 궁극적인 목표는 건강한 주변 조직에서 종양 종괴의 안전한 제거이다. 수술 후 화학요법을 필요로 하지 않는 매우 낮은 등급의 난소암(IA기, 1등급)을 제외하고는, 외과적 제거 이후 백금 유사체를 사용한 전신 화학요법을 따른다. 진행된 난소암 병기의 경우, 일차 화학요법은 카보플라틴과 파클리탁셀의 병용으로 구성되며, 이는 베바시주맙으로 보완될 수 있다. 백금 내성의 난소암을 위한 표준 치료는 다음 화학요법제 하나를 사용하는 단일요법으로 구성된다: 페길화 리포좀 독소루비신(pegylated liposomal doxorubicin), 토포테칸, 젬시타빈 또는 파클리탁셀(S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 2013).

전염증성 종양 침윤 림프구, 특히 CD8 양성 T 세포의 존재는 양호한 예후와 상관관계가 있으며 종양 관련 항원에 특이적인 T 세포를 암 조직으로부터 분리할 수 있으므로, 면역요법은 난소암 환자의 치료를 개선시키는 유망한 전략으로 보인다.

그러므로, 난소암에서 여러 면역요법을 위한 조사에 많은 과학적 노력을 쏟고 있다. 상당한 수의 전임상 및 임상 연구가 이미 수행되었으며 추가 연구가 현재 진행 중이다. 사이토카인 요법, 면역접종, 단클론성 항체 치료, 입양 세포 전달 및 면역 조절에 대한 임상 데이터가 존재한다.

인터루킨-2, 인터페론-알파(α), 인터페론-감마(γ) 또는 과립구 대식세포 집락 자극 인자를 사용한 사이토카인 요법은 환자 자신의 항종양 면역 반응의 증강을 목표로 하며, 이러한 치료는 소규모 연구 코호트에서 이미 유망한 결과를 보여주었다.

여러 종양 단백질(Her2/neu, NY-ESO-1, p53, Wilms tumor-1)로부터 유래한 단일 또는 복수의 펩티드 또는 자가 종양 세포로부터 유래한 전종양 항원을 사용하는 제I상 및 제II상 면역 접종은 양호한 안전성 및 내약성 프로필을 나타냈으나 임상적 효과는 낮음 내지 중간 정도에 그쳤다.

종양 관련 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론성 항체는 종양 세포의 면역 세포 매개 사멸을 강화시키는 것으로 사료된다. 항-CA-125 항체 오레고보맙 및 아바고보맙 그리고 항-EpCAM 항체 카투막소맙은 제II상 및 제III상 연구에서 유망한 결과를 성취했다. 이와 대조적으로 항-MUC1 항체 HMFG1은 제III상 연구에서 생존 기간을 분명히 강화시키지 못했다.

대체 접근 방식에서는 종양 세포상의 성장 인자 및 생존 수용체를 표적화하여 차단시키는 단클론성 항체를 사용한다. 트라스투주맙(항-HER2/neu 항체) 그리고 MOv18 및 MORAb-003(항엽산 수용체 α 항체)의 투여 시 난소암 환자에게 제한된 임상적 혜택만이 나타난 반면, 진행성 난소암에서 표준 화학요법에 베바시주맙(항-VEGF 항체)을 추가하면 유리한 것으로 나타났다.

임상 시험에서 면역 세포의 입양 전달은 이질적인 결과를 성취했다. 시험관 내 자가 확장된 종양 침윤 T 세포의 입양 전달은 예비 시험에서 유망한 접근 방식으로 나타났다. 이와 대조적으로 제I상 시험에서 염산 수용체 α에 특이적인 카메라 항원 수용체를 은신시키는 T 세포의 이전은 유의한 임상적 반응을 유도하지 못했다. 시험관 내에서 종양 세포 용해물이나 종양 관련 단백질로 펄스된 수지상 세포는 이전 시 항종양 T 세포를 강화시키는 것으로 나타났지만 T 세포 활성화의 정도는 임상적 효과와 상관관계가 없었다. 제II상 연구에서 자연 살해 세포의 전달은 유의한 독성을 초래했다.

내인성 항종양 면역성 그리고 면역요법은 면역억제성 종양 미세환경에 의해 방해를 받는다. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 사이클로포스파미드, 항-CD25 항체 및 페길화 리포좀 독소루비신과 같은 면역조절제를 면역요법과 병행하여 시험한다. 현재 가장 신뢰할 수 있는데이터는 항CTLA4 항체인 이필리무밥에 대해 얻을 수 있으며, 이는 T 세포 활성도를 강화시킨다. 이필리무밥은 난소암 환자에서 유의한 항종양 효과를 가져오는 것으로 나타났다(Mantia-Smaldone et al., 2012).

암 치료 관련 중증의 부작용 및 비용을 고려하면, 일반적으로 암 특히 난소암의 치료에 사용 가능한 요인을 파악할 필요가 있다. 또한 암의 보다 나은 진단, 예후의 평가 및 치료 성공의 예측을 유도하는 암 전반 그리고 특히 난소암을 위한 바이오마커를 표시하는 요인의 파악도 필요하다.

암의 면역요법은 부작용을 최소화시키는 반면 암 세포에 대한 특이적 표적화의 옵션을 나타낸다. 암 면역요법은 종양 관련 항원의 존재를 이용한다.

종양 관련 항원(TAA)의 현재 분류는 다음과 같은 주요 그룹을 포함한다:

a) 암-고환 항원: 제일 처음으로 T 세포에 의해 인식 된 TAA는 이 종류에 속하며, 이는 그 멤버들의 발현이 조직학적으로 인간 종양과 다르며, 정상 조직 중, 고환의 정모 세포/정원 세포에서만 있으며, 때로는 태반에서도 있기 때문에 암-고환(CT)라고 최초에 불려졌다. 고환의 세포들이 클래스 I 또는 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이 항원들은 정상 세포에 있는 T 세포에 의해 인식될 수 없으며 면역학적으로 종양-특정이라고 간주될 수 있다. CT 항원의 잘 알려진 예로는 MAGE 계열 구성원들 및 NY_ESO_1이 있다.

b) 분화 항원들: 이 TAA는 종양과 그 종양이 발생한 정상 조직 사이에 공유된다. 대부분의 알려진 분화 항원들은 흑색종과 정상 멜라닌 세포에서 발견된다. 이러한 멜라닌 세포 혈통 관련 단백질의 다수는 멜라닌의 생합성에 관련되어 있으며 그러므로 종양 특이적이 아니지만 암 면역요법에 널리 사용된다. 예로는, 티로시나아제 및 흑색종을 위한 멜란-A/MART-1 또는 전립선암을 위한 PSA가 포함되지만 이로 국한되지 않는다.

c) 과발현된 TAA: 일반적으로 낮은 발현 수준이 있는 많은 정상 조직뿐만 아니라 조직학적으로 다른 유형의 종양에서 유전자 인코딩에서 널리 발현된 TAA가 발견된다 정상 조직에 의해 처리되고 잠재적으로 제시되는 많은 에피톱이 T 세포 인식의 임계치 수준보다 낮을 수 있고, T 세포의 종양 세포에서의 과발현은 이전에 확립된 내성을 중단시켜 항암 반응을 개시할 수 있다. 이 클래스 TAA의 두드러진 예로는 Her-2/neu, 서바이빈, 텔로머라제 또는 WT1가 있다.

d) 종양 특이적 항원: 이러한 독특한 TAA는 정상 유전자의 변이로써 발생한다(베타(β)-카테닌, CDK4 등). 이러한 분자 변경의 일부는 종양 변이 및/또는 진행과 관련되어 있다. 종양 특이적 항원은 일반적으로 강한 면역 반응을 정상 조직에 대한 자기 면역 반응에 대한 위험성 없이 유도할 수 있다. 반면에, 대부분의 경우 TAA는 발견되어 일반적으로 많은 개별 종양에서 대개 공유되지 않은 해당 종양에만 적절하다. 종양 특이적(연관된) 아형을 갖는 단백질의 경우 펩티드가 종양(관련) 엑손으로부터 비롯된다면 펩티드의 종양 특이성(또는 연관성) 또한 발생할 수 있다.

e) 비정상 번역 후 변형에서 발생하는 TAA: 이러한 TAA는 특이적이 아니고 과발현되지도 않는 단백질에서 발생할 수 있지만 종양에서 주로 활동적인 번역 후 과정에 의해 종양과 관련된다. 이 클래스의 예는 종양 특이적일 수도 있고 아닐 수도 있는 분해 과정 동안 단백질 스플라이싱과 같은 이벤트 또는 MUC1의 경우 종양의 새로운 에피톱으로 이끄는 변화된 당화 패턴에서 발생한다.

f) 종양 바이러스 단백질: 이러한 TAA는 종양발생 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 바이러스 단백질이며, 그들이 이질적이기 때문에(인간 태생이 아닌), T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이런 단백질의 예로는 인간 유두종 타입 16 바이러스 단백질, 및 경부 암종에서 발현하는 E6와 E7이 있다.

T 세포 기반의 면역요법은 종양 관련 혹은 종양 특정 단백질로부터 유래된 펩티드 에피톱을 표적으로 하며, 이는 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 의해 제시된다. 종양특이적 세포 독성 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 그들의 에피톱은, 발현되고, 같은 원조의 변형없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 대개 상향조절된 세포인 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 클래스에서 유도된 분자일 수 있다.

MHC 분자에는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II의 두 클래스가 있다. MHC 클래스 I 분자는 α 중쇄과 β-2-마이크로글로불린으로 구성되어 있고, MHC 클래스 II 분자는 α와 β 쇄로 구성되어 있다. 이들의 3차원 형태는 결합 홈을 형성하며, 이는 펩티드와의 비공유결합에 사용된다.

MHC 클래스 I 분자는 대부분의 유핵 세포에서 찾을 수 있다. 이는 대부분 내인성 단백질, 결손 리보솜 생성물(DRIP)과 보다 큰 펩티드의 단백질분해성 절단으로 인해 생성된 펩티드를 제시한다. 하지만 엔도솜 구획이나 외생 출처로부터 유래된 펩티드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 발견된다. 이러한 비고전적 방식의 클래스 I 제시를 문헌에서는 교차 제시라고 칭한다(Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC 클래스 II 분자는 대부분 전문적인 항원 제시 세포(APC)에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 주로 APC에 의해 섭취된 외인성 또는 막횡단 단백질의 펩티드를 제시하며(예: 세포내이입 동안), 이는 차후에 처리된다.

펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합체는 적절한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 CD8 양성 T 세포에 의해서 인식되는 반면, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합체는 적절한 TCR을 갖는 CD4 양성 조력 T 세포에 의해 인식된다. TCR, 펩티드 및 MHC가 이로써 1:1:1의 화학량적 반응량으로 존재한다는 사실은 잘 알려져 있다.

CD4-양성 보조 T 세포는 CD8-양성 세포 독성 T 세포에 의한 효과적인 반응을 유도하고 지속하는데 중요한 역할을 한다. 종양 연관 항원(TAA)에서 유도된 CD4 양성 T 세포 에피톱의 동정은 항종양 면역 반응을 일으키기 위한 의약품의 개발에 아주 중요하다(Gnjatic et al., 2003). 종양 부위에서, 보조 T 세포는, 세포독성 T 세포(CTL) 친화적 사이토킨 주위 환경을 지원하고(Mortara et al., 2006) 효과기 세포, 예를 들면 CTL, 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포, 과립구를 유치한다(Hwang et al., 2007).

염증이 없는 경우, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 전문적 항원-나타내는 세포(APC)로 제한된다, 예를 들면, 단핵 세포, 단핵 세포-유도된 세포, 대식 세포, 모수석 세포. 암 환자에서, 종양의 세포는 MHC 클래스 II를 발현하는 것으로 밝혀졌다(Dengjel et al., 2006).

본 설명의 연장된(더 기다란) 펩티드는 MHC 클래스 II 활성 에피톱으로 작용할 수 있다.

MHC 클래스 II에 의해 활성화된 조력 T 세포는 항종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. CD8 양성 킬러 T 세포의 TH1 유형 지원 효과기 기능의 조력 T 세포 반응을 일으키는 조력 T 세포 에피톱은, 세포 표면에 종양 관련 펩티드/MHC 복합체를 보이는 종양 세포에 대한 세포 독성 기능을 포함한다. 이런 식으로 종양 관련 조력 T 세포 펩티드 에피톱은, 따로 또는 다른 종양 관련 펩티드와 함께, 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성의 활성 약학 원료로 사용될 수 있다.

예를 들면, 생쥐 같은 포유류 동물 모델에서는 심지어 CD8 양성 T 림프구의 부재하에서도, CD4 양성 T 세포가 인터페론-γ(IFNγ)의 분비에 의한 혈관신생의 저해를 통해 종양 발현을 억제하는데 충분한 것으로 나타났다(Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). CD4 T 세포가 직접적 항종양 작용기라는 증거가 있다(Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

이전에는 HLA 클래스 II 분자의 구성적 발현이 일반적으로 면역 세포로 제한되기 때문에, 클래스 II 펩티드를 원발성 종양에서 직접 분리하는 것은 가능하지 않다고 간주되었다. 그러나, Dengjel 등은 MHC 클래스 II 에피톱을 종양에서 직접적으로 식별하는데 성공했다(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).

CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 함께 상승작용에 의해 항종양 효과에 기여하므로, CD8+ T 세포(리간드:MHC 클래스 I 분자 + 펩티드 에피톱) 또는 CD4 양성 조력 T 세포(리간드:MHC 클래스 II 분자 + 펩티드 에피톱)에 의해 인식되는 종양 관련 항원의 식별 및 특성화가 종양 백신의 개발에 중요하다.

MHC 클래스 I 펩티드가 세포 면역 반응을 촉발(유도)하려면 MHC 분자에도 결합해야 한다. 이 과정은 MHC 분자의 대립형질 그리고 그 펩티드의 아미노산 서열의 특정적 다형성에 의존한다. MHC 클래스 I 결합 펩티드는 대개 길이가 8 ~ 12개의 아미노산 잔기이며 또한 대개 그 서열 내에 MHC 분자의 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 두 개의 유지되는 잔기("고정부")를 포함하고 있다. 이렇게 함으로써 각 MHC 대립형질은 어떤 펩티드가 결합 홈에 특정적으로 결합할 수 있는지 결정하는 "결합 모티프"를 갖는다.

MHC 클래스 I 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 특정 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있어야 하며 또한 추후 특정한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있어야 한다.

종양 특이 또는 연관 항원으로서 T 림프구에 의해 단백질이 인식되고, 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 하며 비교적 소량일지라도 건강한 정상 조직에 의해서 발현되어서는 안 된다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드는 건강한 정상 조직과 비교하여 종양 세포에 의해 과다 제시되어야 한다. 더 바람직하게는, 각각의 항원이 하나의 유형의 종양에서뿐만 아니라 높은 농도로 나타나는 것이다(즉 세포 마다 펩티드의 각각의 사본 번호). 종양 특이 및 종양 관련 항원은 흔히 기능(예: 세포 주기 조절 또는 세포자멸사의 억제) 때문에 정상 세포를 종양 세포로 전환하는 것과 직접 관련된 단백질에서 유도된다. 또한, 변환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 표적은 상향조절될 수 있으며 따라서 간접적으로 종양과 연관될 수 있다. 이러한 간접적 종양 관련 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다(Singh-Jasuja et al., 2004). 종양 관련 항원에서 유도된 그러한 펩티드("면역성 펩티드")가 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응을 유도하도록 하기 위해서 에피톱이 항원의 아미노산 서열에 나타나는 것이 필수적이다.

기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 모든 펩티드는 T 세포 에피톱으로서 기능할 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응의 유도의 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T 세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 면역성 내성의 부재이다.

그러므로, TAA는 종양 백신으로 제한되지 않지만 이를 포함하는 T 세포 기반 요법의 개발에 있어서 시작점이 된다. TAA의 식별과 특성화의 방법은 대개 환자 또는 건강한 대상에서 분리될 수 있는 CTL의 사용에 기반하거나, 또는 다른 전송 프로파일 또는 종양과 정상 조직 사이의 차등 전사 프로파일이나 차등 펩티드 발현 패턴의 생성에 기반한다. 그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 요법에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정밀한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 나타나야 하고 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성이 없거나 최소화되어야 하므로 이러한 항원의 에피톱의 개개의 하위집단만이 그런 응용에 적합하기 때문이다. 따라서, 본 발명의 매우 바람직한 실시양태에서, 기능성 T 세포가 있는 MHC 분자와 관련이 있게 나타나는 과다 발현된 그런 펩티드 또는 선택적으로 발현된 단백질만 선택하는 것은 중요하다. 그런 기능성 T 세포는 특정 항원에 의해 자극되었을 때 클론적으로 확대되고 효과기 기능("효과기 T 세포")을 실행할 수 있는 T 세포로 정의된다.

본 설명에 따른 특정 TCR(예: 가용성 TCR) 및 항체 혹은 다른 결합 분자(골격)에 의해 펩티드-MHC를 표적화하는 경우, 기저 펩티드의 면역원성은 이차적인 것이다. 이러한 경우 그 제시가 결정 요인이다.

본 발명의 제 1 양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 대해 적어도 77%, 바람직하게는 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 적어도 77% 또는 적어도 88% 동일한) 이의 변이체 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로, 상기 변이체는 MHC에 결합 및/또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하며, 상기 펩티드는 기저의 전장 폴리펩티드가 아니다.

본 발명은 또한 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 대해 적어도 77%, 바람직하게는 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 적어도 77% 또는 적어도 88% 동일한) 이의 변이체 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로, 상기 펩티드나 그 변이체는 8개 ~ 100개, 바람직하게는 8개 ~ 30개 그리고 가장 바람직하게는 8개 ~ 14개의 아미노산의 전장을 갖는다.

다음 표에는 본 발명에 따른 펩티드들과 각각의 서열 식별 번호 그리고 이 펩티드들의 장래의 출처(기저) 유전자들이 나와 있다. 표 1에서 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 9의 펩티드가 HLA-A*02에 결합하고, 서열 식별 번호 10 ~ 서열 식별 번호 19의 펩티드가 HLA-A*24에 결합하고, 서열 식별 번호 20 ~ 서열 식별 번호 30의 펩티드가 HLA-A*03에 결합하고, 서열 식별 번호 31의 펩티드가 HLA-A*01에 결합하고, 서열 식별 번호 32 ~ 서열 식별 번호 41의 펩티드가 HLA-B*07에 결합하고, 서열 식별 번호 42 ~ 서열 식별 번호 51의 펩티드가 HLA-B*08에 결합하고, 서열 식별 번호 52 ~ 서열 식별 번호 59의 펩티드가 HLA-B*44에 결합한다. 표 2에서, 서열 식별 번호 60 ~ 서열 식별 번호 75의 펩티드가 HLA-A*02에 결합하고, 서열 식별 번호 76 ~ 서열 식별 번호 82의 펩티드가 HLA-A*24에 결합하고, 서열 식별 번호 83 ~ 서열 식별 번호 111의 펩티드가 HLA-A*03에 결합하고, 서열 식별 번호 112 ~ 서열 식별 번호 116의 펩티드가 HLA-A*01에 결합하고, 서열 식별 번호 117 ~ 서열 식별 번호 149의 펩티드가 HLA-B*07에 결합하고, 서열 식별 번호 150 ~ 서열 식별 번호 172의 펩티드가 HLA-B*08에 결합하고, 서열 식별 번호 173 ~ 서열 식별 번호 215의 펩티드가 HLA-B*44에 결합한다. 표 3에서, 서열 식별 번호 216 ~ 서열 식별 번호 245의 펩티드가 HLA-A*02에 결합하고, 서열 식별 번호 246 ~ 서열 식별 번호 255의 펩티드가 HLA-A*24에 결합하고, 서열 식별 번호 256 ~ 서열 식별 번호 287의 펩티드가 HLA-A*03에 결합하고, 서열 식별 번호 288 ~ 서열 식별 번호 292의 펩티드가 HLA-A*01에 결합하고, 서열 식별 번호 293 ~ 서열 식별 번호 392의 펩티드가 HLA-B*07에 결합하고, 서열 식별 번호 393 ~ 서열 식별 번호 395의 펩티드가 HLA-B*08에 결합하고, 서열 식별 번호 396 ~ 서열 식별 번호 438의 펩티드가 HLA-B*44에 결합한다. 표 4에서, 서열 식별 번호 439 ~ 서열 식별 번호 551의 펩티드가 여러 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합하고, 서열 식별 번호 773의 펩티드가 HLA-A*02에 결합하고, 서열 식별 번호 774의 펩티드가 HLA-A*24에 결합한다. 표 5에서, 서열 식별 번호 552 ~ 서열 식별 번호 772의 펩티드가 여러 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합한다.

[표 1]

본 발명에 따른 펩티드

[표 2]

본 발명에 따른 추가의 펩티드

[표 3]

본 발명에 따른 추가의 펩티드

[표 4]

본 발명에 따른 HLA 클래스 I 펩티드

[표 5]

본 발명에 따른 HLA 클래스 II 펩티드

본 발명은 또한 예를 들어, 간세포 암종, 결장직장 암종, 아교모세포종, 위암, 식도암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암, 신세포 암종, 전립선암, 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 담낭암 및 담관암종, 방광암, 자궁암, 두경부 편평세포 암종, 중피종과 같은 증식성 질병의 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 펩티드와 일반적으로 관련이 있다.

특히 바람직하기로는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772로 구성된 군으로부터 선택된 본 발명에 따른 단일 혹은 조합의 펩티드들이다. 더 바람직하기로는 서,열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 215로 구성된 군으로부터(표 1 및 2 참조) 선택된 단일 혹은 조합의 펩티드들 그리고 난소암, 간세포 암종, 결장직장 암종, 아교모세포종, 위암, 식도암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암, 신세포 암종, 전립선암, 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 담낭암 및 담관암종, 방광암, 자궁암, 두경부 편평 세포 암종, 중피종 그리고 바람직하게는 난소암의 면역요법에서의 이들의 사용이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 난소암, 간세포 암종, 결장직장암, 아교모세포종, 위암, 식도암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암, 신세포 암종, 전립선암, 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 담낭암 및 담관 암종, 방광암, 자궁암, 두경부 편평 세포 암종, 중피종의 군으로부터 선택된 증식성 질병의 바람직하게는 병용 치료를 위한 본 발명에 따른 펩티드의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 또한 인간 주조직 적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 길이 변이체와 같은 연장된 형태의 MHC 클래스 II의 분자와 결합하는 능력을 가진 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 (각각) 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 따른 아미노산으로 구성되거나 필수적으로 구성된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 변형되며/거나 비펩티드 결합을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드는 융합 단백질의 일부이며 특히 HLA-DR 항원-결합 항원-연관된 불변 쇄(Ii)에 융합되거나 또는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 그 서열 안으로) 융합된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있으며/거나 발현하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 질병의 치료 및 의학 특히 암의 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 설명에 따른 상기 펩티드와 MHC의 복합체에 대해 특이적인 항체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 T 세포 수용체(TCR), 특히 가용성 TCR(sTCR) 및 자가조직이나 동종이형 T 세포 안으로 조작된 클론된 TCR 밍 이들의 기능적 단편들 그리고 이들은 물론 NK 세포나 상기 TCR을 포함하거나 상기 TCR과 교차반응하는 다른 세포들을 만드는 방법에 관한 것이다.

항체 및 TCR은 본 발명에 따른 펩티드의 면역요법 사용에 대한 추가적 실시양태이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 이전에 기술한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항원 제시 세포이며 바람직하게는 수지상 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 제조 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 분리를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원 제시 세포 혹은 인공 항원 제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 그 항원 제시 세포가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772를 포함하는, 바람직하게는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 215를 포함하는 상기 펩티드 또는 이의 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있거나 발현하는 발현 벡터를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 활성화된 T 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 일체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 이상 발현하는 환자에서 표적 세포를 살해하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

본 설명은 또한 약제로서 또는 약제의 제조에 있어서, 설명된 일체의 펩티드, 본 설명에 따른 핵산, 본 설명에 따른 발현 벡터, 본 설명에 따른 세포, 본 설명에 따른 활성화된 T 림프구, T 세포 수용체 또는 기타 펩티드 및/또는 펩티드 MHC 결합 분자의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 약제가 암에 대해 활성이다.

바람직하게는 상기 약제가 세포 요법, 백신 또는 가용성 TCR 혹은 항체에 근거한 단백질이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로, 상기 암 세포가 난소암, 간세포 암종, 결장직장 암종, 아교모세포종, 위암, 식도암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암, 신세포 암종, 전립선암, 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 담낭암 및 담관암종, 방광암, 자궁암, 두경부 편평 세포 암종, 중피종 그리고 바람직하게는 난소암 세포이다.

본 설명은 또한 본 설명에 따른 펩티드에 근거한 바이오마커에 관한 것으로, 여기서는 암, 바람직하게는 난소암의 진단에 사용할 수 있는 "표적"이라고 부른다. 이 표지자는 펩티드(들) 자체의 과다제시 또는 상응하는 유전자(들)의 과발현일 수 있다. 이 표지자는 또한 치료, 바람직하게는 면역요법, 가장 바람직하게는 바이오마커에 의해 확인된 동일한 표적을 표적화하는 면역요법의 성공의 확률을 예측하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 혹은 가용성 TCR은 관심 대상의 MHC와 복합체인 펩티드의 존재 검출을 위해 종양의 일부를 염색하는데 사용할 수 있다.

임의적으로, 항체는 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 작용기 기능을 보유한다.

본 설명은 또한 암 치료의 환경에서 이러한 신규 표적들의 사용에 관한 것이다.

추가의 암 질환에 대한 치료 및 진단 사용 모두 본 발명에 따른 펩티드의 기저 발현 생성물(폴리펩티드)에 대한 다음의 상세한 설명에 공개된다.

ALPP는 ALP, PLAP 또는 PALP라고도 알려져 있으며, 인산 모노에스테르의 가수분해를 촉매하는 금속 함유 효소인 알칼리성 인산분해효소를 인코딩한다(RefSeq, 2002). 다양한 인간 종양과 그 세포주 특히 고환과 난소의 암에서 ALPP가 과발현하는 것으로 기술되었다(Millan and Fishman, 1995). ALPP는 골육종 환자의 생존 기간에 대한 독립적인 예후 인자로 확인되었으며 또한 폐 전이와도 상관관계가 있다. 더욱이, ALPP는 위장관 평활근 종양, 상피내암종과 같은 배아세포 종양 전구체 및 성선모세포종의 면역조직화학 표지자로서, 그리고 유망한 난소암 바이오마커로서 기술되었다(Ravenni et al., 2014; Wong et al., 2014b; Faure et al., 2016; Han et al., 2012).

GCAP라고도 알려진 ALPPL2는 고환, 흉선 및 특정 배아세포 종양에 국소화된 막결합 글리코실화 효소를 인코딩하며, 알칼리성 인산분해효소의 태반 및 내장 형태 모두와 밀접하게 관련된다(RefSeq, 2002). ALPPL2가 고환종 그리고 다수의 췌장암 세포주에서 mRNA 및 단백질 수준으로 편위적으로 발현되고 암 세포 성장 및 침입에 관여하는 것으로 나타났다. 추가적으로, ALPPL2는 췌관 선암종의 잠재적 진단 표지자로서 기술되었다(Hofmann and Millan, 1993; Dua et al., 2013; Fishman, 1995). ALPPL2의 RT-PCR이 말초 혈액에서 잔여 배아세포 종양 세포 및 전구세포 수확에서 민감한 검출에 적합한 것으로 기술되었다(Hildebrandt et al., 1998).

BCAM은 면역글로불린 상과의 구성원인 기저 세포 유착 분자(루테란식 혈액군) 및 세포외 기질 단백질의 수용체인 라미닌을 인코딩한다(RefSeq, 2002). BCAM은 다양한 조직에서 기저막의 주요 성분인 라미닌-511(LM-511)의 아단위인 라미닌 α 5(LAMA5)의 특이적 수용체이다. BCAM/LAMA5 시스템은 KRAS-돌연변이체의 결장직장암의 전이성 확산에서 그리고 간세포 암종의 이동에서 기능적 역할을 수행한다(Kikkawa et al., 2013; Kikkawa et al., 2014; Bartolini et al., 2016). BCAM의 혈청 수준이 유방암 환자에서 상당히 증가하는 것으로 나타났으며, 그 과발현이 피부암, 난소암 및 췌장암 그리고 자궁내막양 자궁내막 암종, 난소 자궁내막양 암종 및 피부 편평 세포 암종과 연관있는 것으로 나타났다(Kikkawa et al., 2008; Planaguma et al., 2011; Latini et al., 2013; Kim et al., 2015a; Li et al., 2017). BCAM은 AKT2와 융합 단백질을 형성할 수 있으며 고등급 장액성 난소암에서 AKT2 키나제 활성인자로서 식별되었다(Kannan et al., 2015).

CBX2는 폴리콤 다중단백질 복합체의 구성요소인 크로모박스 2를 인코딩하며, 이는 염색질 재형성 및 히스톤의 변형을 통한 발생을 걸쳐 다수 유전자들의 전사적으로 억압적인 상태를 유지하는데 필요하다(RefSeq, 2002). CBX2는 세포 증식 및 전이에 관여한다(Clermont et al., 2016). CBX2는 SMARCE1에 의해 조절되어 억압된 EGFR 전사를 유도한다. CBX2는 INK4A/ARF 유전자 자리에서 인코딩되는 3개의 종양 억제 유전자의 조절에 관여한다(Papadakis et al., 2015; Agherbi et al., 2009; Miyazaki et al., 2008). CBX2는 유방암, 난소암, 폐암, 전이성 거세저항성 및 신경내분비 전립선암 및 기저유사 자궁내막양 자궁내막 암종을 포함한 암에서 과발현된다(Parris et al., 2010; Clermont et al., 2016; Clermont et al., 2014; Clermont et al., 2015; Jiang et al., 2015; Xu et al., 2016). CBX2는 보다 낮은 환자 생존율 및 전이성 진행과 연관이 있다. CBX2는 종양 주위의 염증성 침윤, 자궁경부 림프절로의 전이성 확산 및 종양 크기와 연계된다(Parris et al., 2014; Clermont et al., 2014; Xu et al., 2016). CBX2 과발현은 조혈 줄기세포 분화 및 고갈을 초래한다(Klauke et al., 2013).

CCNA1은 사이클린 A1을 인코딩하며, 이는 CDK 키나제의 조절에 관여하는 고도로 보존되는 사이클린 계열에 속한다(RefSeq, 2002). 상피 난소암, 림프모구 백혈병 세포주 그리고 소아 급성 림프모구 백혈병 환자에서 상승된 수준의 CCNA1이 검출되었다. 다른 이들은 전립선암 그리고 역형성 갑상선 암종 환자의 종양 조직에서 CCNA1 단백질 및 mRNA의 과발현을 관찰했다(Holm et al., 2006; Wegiel et al., 2008; Marlow et al., 2012; Arsenic et al., 2015). 최근의 연구에 의하면, 고도로 사이클린 A1을 발현하는 ML1 백혈병 세포의 CCNA1 침묵은 S기의 진입을 늦추고 증식을 감소시키며 또한 집락 형성을 억제했다(Ji et al., 2005).

CD70은 종양 괴사 인자(TNF) 리간드 계열에 속하는 사이토카인인 CD70 분자를 인코딩한다. CD70은 공동 촉진된 T 세포의 증식을 유도하고 세포용해 T 세포의 생성을 강화하며 T 세포 활성화에 기여한다. 이 사이토카인은 또한 B세포 활성화, 자연 살해 세포의 세포독성 기능 및 면역글로불린 합성의 조절에서 역할을 수행하는 것으로 보고되었다(RefSeq, 2002). CD70에 대한 표적화가 암 세포를 특이적으로 표적화하고 살해하는데 사용될 수 있다. CD70은 구강암에서 잠재적 표적일 수 있다(Bundela et al., 2014; Jacobs et al., 2015b; Wang et al., 2016a). CD70은 두경부 편평 세포 암종에서 발현된다. CD70은 림프종, 신세포 암종 및 아교모세포종에서 전위적으로 발현된다. CD70 발현 수준은 흑색종 진행 동안 감소한다. CD70은 급성 유형의 성인 T 세포 백혈병/림프종 환자의 CD4+ CD25+ T 세포 상에 고도로 발현된다(Jacobs et al., 2015b; Curran et al., 2015; De et al., 2016; Jacobs et al., 2015a; Masamoto et al., 2016; Pich et al., 2016b; Ruf et al., 2015a). CD70은 면역 반응, 암 발생 및 암 진행에 관여한다(Petrau et al., 2014; Pich et al., 2016a). 투명세포 신세포 암종에서 CD70 상향조절은 더 불량한 생존율과 연관이 있다(Ruf et al., 2015b). 시스플라틴은 상대적으로 더 높은 수준의 CD70을 발현하는 APC를 통해 세포 독성을 매개한다(Beyranvand et al., 2016). CD70 발현은 이온화 방사선에 의해 거의 영향을 받지 않는다. 이것은 폐암에서 방사선 민감도와 연관이 있다. PC3 세포에서 단일 선량 체외 방사선조사가 CD70을 상향조절한다(Bernstein et al., 2014; Kumari and Garnett-Benson, 2016; Pu et al., 2014).

CDH3(P-카드헤린이라고 알려짐)은 카드헤린 상과의 고전적 카드헤린인 카드헤린 3을 인코딩한다. 이 칼슘 의존성 세포-세포 유착 단백질은 5개의 세포외 카드헤린 반복, 하나의 막통과 영역 및 고도로 보존된 세포질 꼬리 하나로 구성된다. 이 유전자는 유방 및 전립선 암에서 이형접합성 사례의 소실에 관여하는 16번 염색체의 긴 팔 상의 영역에 있고 유전자 클러스터에 위치한다. 그 밖에 이 단백질의 이상 발현이 자궁경부 선암종에서 관찰된다(RefSeq, 2002). CDH3은 종양유전자 신호전달에 관여하며 인테그린, 수용체 티로신 키나제, 저분자 GTPases, EMT 전사 인자 및 기타 카드헤린 계열 구성원을 활성화한다. CDH3 신호전달은 침윤과 전이를 유도한다(Albergaria et al., 2011; Paredes et al., 2012; Bryan, 2015; Vieira and Paredes, 2015). CDH3의 종양유전자 활성화는 위암 형성에 관여한다(Resende et al., 2011). CDH3 과발현은 유방암, 방광암, 난소암, 전립선암, 자궁내막암, 피부암, 위암, 췌장암 및 직장암을 촉진한다(Albergaria et al., 2011; Paredes et al., 2007; Bryan and Tselepis, 2010; Reyes et al., 2013; Vieira and Paredes, 2015). CDH3은 기저유사 유방암에서 발현되는 기저 상피 표지자이다. BRCA1 암종은 CDH3과 같은 기저 표지자의 발현의 특징을 가지며, 고등급의 고도로 증식하는, ER 음성 및 HER3 음성 표현형을 나타낸다(Honrado et al., 2006; Palacios et al., 2008; Rastelli et al., 2010; Dewar et al., 2011). CDH3은 흑색종 및 구강 편평 세포 암종에서 종양 억제인자이다(Haass et al., 2005; Vieira and Paredes, 2015). CDH3은 EMT 표지자로서 사용될 수 있다. 종양 형성 및 진행 동안 E-카드헤린에서 N-카드헤린으로의 이동과 CDH3 발현이 있다(Piura et al., 2005; Bonitsis et al., 2006; Bryan and Tselepis, 2010; Ribeiro and Paredes, 2014). CDH3과 β-카테닌 사이의 경쟁적 상호작용은 위암에서 세포간 상호작용 부전 및 전이를 유발한다(Moskvina and Mal'kov, 2010). 결장암에서 CDH3은 암 형성의 조기 표지자이다(Alrawi et al., 2006). CDH3의 이상조절은 불량한 예후와 증가된 악성종양의 표지자이다(Knudsen and Wheelock, 2005).

CDKN2A(p16 및 p16INK4a라고도 알려짐)는 제1 엑손이 다른 여러 전사체 변이체들을 생성하는 사이클린 의존성 키나제 억제제 2A를 인코딩한다. 같지 않은 단백질들을 인코딩하는 적어도 3개의 교대로 스플라이싱되는 변이체가 보고되었으며, 이 중 2개는 CDK4 키나제의 억제제로서 기능하는 것으로 알려진 구조적으로 관련 있는 아이소형을 인코딩한다. 나머지 전사체에는 해당 유전자의 나머지로부터 20 Kb 상류에 위치한 교대 제1 엑손이 포함된다; 이 전사체는 다른 변이체들의 산물과 구조적으로 관련이 없는 단백질을 명시하는 교대의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ARF)을 함유한다. 이 ARF 산물은 p53의 분해에 대한 책임이 있는 단백질인 E3 유비퀴틴-단백질 리가제 MDM2와 상호작용하며 이를 격리시킬 수 있으므로, 종양 억제 단백질 p53의 안정화제의 기능을 한다(RefSeq, 2002). CDKN2A는 췌관 선암종, 피부 악성 흑색종, 외음부 편평 세포 암종 및 담관암에서 돌연변이된다. 돌연변이는 유전될 수 있으며 췌장암 발병의 위험을 증가시킬 수 있다. CDKN2A는 악성 흉막 중피종에서 소실된다. CDKN2A는 방광암에서 하향조절된다(Clancy et al., 2016; Fabbri et al., 2017; Gan et al., 2016; Kleeff et al., 2016; Nabeshima et al., 2016; Pacholczyk et al., 2016; Petersen, 2016; Sohal et al., 2016; Tatarian and Winter, 2016). CDKN2A는 암 세포 증식, 종양 발생, 전이, Wnt 신호전달, 노화, 세포자멸사 및 DNA 복구 기전에 관여한다(Gupta et al., 2016; Ko et al., 2016; Low et al., 2016; Sedgwick and D'Souza-Schorey, 2016; Zhao et al., 2016). CDKN2A는 종양유전자 단백질 UHRF1의 과발현 시 하향조절되는 종양 억제 유전자이다. CDKN2A는 p53와 상호작용하여 유방암을 억제한다(Alhosin et al., 2016; Fry et al., 2017). CDKN2A 프로모터 과메틸화는 저등급 편평 상피내 병변, 고등급 편평 상피내 병변 및 자궁경부암에 대한 증가된 위험 그리고 흡연 습관과 연관이 있다. CDKN2A는 간세포 암종 및 식도 편평 세포 암종의 발생 시 후생유전적으로 이상조절된다(Han et al., 2017; Khan et al., 2017; Ma et al., 2016a). CDKN2A는 자궁경부암 및 구인두 편평세포 암종의 진단에 사용될 수 있다(Mahajan, 2016; Savone et al., 2016; Tjalma, 2017). CDKN2A 발현은 종양유전 가능성이 있는 것으로 알려진 바이러스인 HPV 감염에 의해 유발된다(Hoff et al., 2017; Lorincz, 2016).

CDKN2B(p15로도 알려짐)는 광범위한 종양에서 빈번히 돌연변이되고 소실되는 영역에서 종양 억제 유전자 CDKN2A에 인접한 사이클린 의존성 키나제 억제인자 2B를 인코딩한다. 이 유전자는 CDK4 또는 CDK6와 복합체를 형성하는 사이클린 의존성 키나제 억제제를 인코딩하며 CDK 키나제의 활성화를 방지하므로, 인코딩된 단백질이 세포주기 G1 진행을 제어하는 세포 성장 조절인자로 기능한다. 이 유전자의 발현은 TGF β에 의해 극적으로 유도되는 것으로 나타났으며, 이는 TGF β 유도 성장 억제에서의 역할을 시사했다(RefSeq, 2002). CDKN2B는 세포 주기 진행의 조절과 세포 증식의 억제에 관여한다(Hu and Zuckerman, 2014; Roy and Banerjee, 2015). CDKN2B 소실은 주혈흡층 관련 방광암과 연관이 있다. CDKN2B에서의 돌연변이는 아교 종양에 대한 유전된 감수성에 관여할 수 있다. CDKN2B는 수막종에서 변형되며 비근육 침윤성 요로상피 암종에서 돌연변이된다(Mawrin and Perry, 2010; Melin, 2011; Pollard et al., 2010; Alentorn et al., 2013; Idbaih, 2011; Koonrungsesomboon et al., 2015). CDKN2B는 급성 골수성 백혈병 및 뇌하수체 선종에서 과메틸화된다. CDKN2B는 피부 악성 흑색종에서 이상 조절된다(Bailey et al., 2010; Jiang et al., 2014; Popov and Gil, 2010; van den Hurk et al., 2012; Wolff and Bies, 2013; Zhou et al., 2014). CDKN2B는 종양 억제인자 RB와 상호작용하며 Miz-1 및 TGF-β에 의해 조절된다(Zhou et al., 2014; Geyer, 2010; Moroy et al., 2011). CDKN2B는 긴 비코드 RNA에 의해 영향을 받는 종양 억제 유전자이다. AS1와 연관하는 CDKN2B 자체는 긴 비코드 RNA(ANRIL)의 일부로, 이는 암 발생에 관여할 수 있다(Popov and Gil, 2010; Aguilo et al., 2016; Shi et al., 2013; Wanli and Ai, 2015).

CLDN6은 클로딘 6이라고도 알려져 있으며 치밀 이음부 가닥의 구성요소이며 통합 막 단백질인 클로딘 계열의 구성원을 인코딩한다(RefSeq, 2002). CLDN6 발현은 비소세포 폐암에서 림프절 전이 및 TNM 병기와 연관이 있는 것으로 나타났다(Wang et al., 2015b). 더욱이, CLDN6의 낮은 발현은 비소세포 폐암 환자에서 유의하게 더 낮은 생존율과 연관 있는 것으로 나타났다(Wang et al., 2015b). 따라서, 비소세포 폐암 환자에서 낮은 CLDN6 발현은 악화된 예후를 나타내는 독립적 예후 바이오마커이다(Wang et al., 2015b). CLDN6은 자궁경부 암종과 위암에서 하향조절되는 것으로 나타났다(Zhang et al., 2015e; Lin et al., 2013b). CLDN6은 BRCA1 관련 유방암과 난소 유두상 장액성 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Wang et al., 2013; Heerma van Voss et al., 2014). CLDN6은 유방암에 대한 종양 억제인자로 기술되었다(Zhang et al., 2015e). 자궁경부암종 세포주인 HeLa 및 C33A에서 CLDN6 발현의 증가는 세포 증식, 시험관내 집락 형성 및 생체내 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 CLDN6이 자궁경부 암종 세포에서 종양 억제인자로 기능할 수 있음을 시사한다(Zhang et al., 2015e). CLDN6은 난소암의 침윤 및 전이에서 긍정적 역할을 할 수 있다(Wang et al., 2013). CLDN6은 생식 세포 종양에서 일관적으로 발현하는 것으로 나타났으며 따라서 원시 생식 세포 종양의 신규 진단 표지자이다(Ushiku et al., 2012). CLDN6 발현은 중추 신경계의 비전형의 기형/간상 종양에 대해 평가된 조합 가운데 대부분의 종양에서 양성인 것으로 나타났으며, 강력한 CLDN6 양성은 이 질환의 결과에 대한 잠재적인 독립적 예후 인자였다(Dufour et al., 2012).

CT45A1은 CT45라고도 알려져 있으며, 암/고환 항원 계열 45 구성원 A1 단백질을 인코딩하고 Xq26.3 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). CT45 유전자는 상피 난소암에서 잠재적인 예후 바이오마커와 치료 표적인 것으로 나타났다(Zhang et al., 2015d). CT45A1 단백질은 대개 고환 생식 세포에서만 발현되는데 폐암, 유방암 및 난소암에서도 발현되는 것으로 나타났다(Chen et al., 2009). CT45A1은 또한 다발성 골수종에서도 불량한 예후 및 불량한 결과와 관련 있는 것으로 나타났다(Andrade et al., 2009). CT45A1은 상피중간엽이행(EMT)을 상향조절하는 유전자 그리고 EMT 및 종양 파종을 촉진시키는 전이성 유전자로 기술되었다. 더욱이, CT45A1은 종양 형성 및 악성종양의 진행을 촉진시키는 암 줄기 유사 세포의 개시 또는 유지에 연루되는 것으로 기술되었다(Yang et al., 2015b). 유방암 모델에서 CT45A1 과발현은 다양한 종양유전자 및 전이성 유전자의 상향조절을 초래하는 것으로 나타났으며, ERK 및 CREB 신호전달 경로를 구성적으로 활성화시키고 또한 종양 형성, 침윤 및 전이를 증가시켰다. CT45A1의 침묵은 암 세포의 이동 및 침윤을 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서 CT45A1은 새로운 원암유전자로서 기능할 수 있으며 또한 항암 약물 발견 및 요법의 표적일 수 있다(Shang et al., 2014).

CT45A2는 여러 유사한 유전자들의 클러스터 가운데 하나를 인코딩하며, 이는 암/고환 항체 계열의 구성원으로 Xq26.3 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). CT45A2는 신생(de novo) 이중표현형 급성 백혈병의 소아 환자에서 새로운 스플라이싱된 MLL 융합 파트너인 것으로 나타났으며 따라서 백혈병 유발에 관련될 수 있다(Cerveira et al., 2010). 암/고환 항원 계열 45는 암 세포주 및 폐암의 검체 모두에서 빈번히 발현되는 것으로 나타났다(Chen et al., 2005). CT45 유전자는 상피 난소암에서 잠재적인 예후 바이오마커와 치료 표적인 것으로 나타났다(Zhang et al., 2015d).

CT45A3은 암/고환 항원 계열 45 구성원 A3 단백질을 인코딩하며 Xq26.3 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). 암/고환 항원 계열 45는 암 세포주 및 폐암의 검체 모두에서 빈번히 발현되는 것으로 나타났다(Chen et al., 2005). CT45 유전자는 상피 난소암에서 잠재적인 예후 바이오마커와 치료 표적인 것으로 나타났다(Zhang et al., 2015d).

CT45A4는 암/고환 항원 계열 45 구성원 A4 단백질을 인코딩하며 Xq26.3 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). 암/고환 항원 계열 45는 암 세포주 및 폐암의 검체 모두에서 빈번히 발현되는 것으로 나타났다(Chen et al., 2005). CT45 유전자는 상피 난소암에서 잠재적인 예후 바이오마커와 치료 표적인 것으로 나타났다(Zhang et al., 2015d).

CT45A5는 암/고환 항원 계열 45 구성원 A5 단백질을 인코딩하며 Xq26.3 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). 암/고환 항원 계열 45는 암 세포주 및 폐암의 검체 모두에서 빈번히 발현되는 것으로 나타났다(Chen et al., 2005). CT45 유전자는 상피 난소암에서 잠재적인 예후 바이오마커와 치료 표적인 것으로 나타났다(Zhang et al., 2015d).

CT45A6은 암/고환 항원 계열 45 구성원 A6 단백질을 인코딩하며 Xq26.3 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). 암/고환 항원 계열 45는 암 세포주 및 폐암의 검체 모두에서 빈번히 발현되는 것으로 나타났다(Chen et al., 2005). CT45 유전자는 상피 난소암에서 잠재적인 예후 바이오마커와 치료 표적인 것으로 나타났다(Zhang et al., 2015d).

CTAG2는 암-고환 항원의 ESO/LAGE 계열에 속하는 자가 면역원성 종양 항원인 암/고환 항원 2를 인코딩한다. 이 단백질은 흑색종, 유방암, 방광암 및 전립선암을 포함한 광범위한 암에서 발현된다. 이 단백질은 정상 고환 조직에서도 발현된다(RefSeq, 2002). CTAG2는 암 세포 이동 및 침윤에 관여한다(Maine et al., 2016). CTAG2 발현은 LSAMP에 의해 상향조절되어 세포 증식의 감소를 초래한다(Baroy et al., 2014). CTAG2는 지방육종, 폐암, 요로상피암 및 결장직장암에서 발현된다. CTAG2는 식도 편평 세포 암종을 포함하는 여러 객체에서 과발현된다(Kim et al., 2012; Dyrskjot et al., 2012; Hemminger et al., 2014; Forghanifard et al., 2011; McCormack et al., 2013; Shantha Kumara et al., 2012). CTAG2에 대해 조작된 T 세포는 다발성 골수종 치료에 사용될 수 있다. CTAG2에 대한 자가항체는 암 진단에 사용될 수 있다. CTAG2는 면역요법에서 표적일 수 있다. CTAG2 발현은 더 짧은 무진행 생존 기간과 연관이 있다(van et al., 2011; Dyrskjot et al., 2012; Hudolin et al., 2013; Pollack et al., 2012; Rapoport et al., 2015; Wang et al., 2015a).

CYP2W1은 약물 대사 그리고 콜레스테롤, 스테로이드 및 기타 지질의 합성에 관여하는 다수의 반응을 촉매하는 모노옥시게나제인 시토크롬 P450 효소 상계열(superfamily)의 구성원을 인코딩한다(RefSeq, 2002). CYP2W1은 간세포암, 결장직장암 및 위암 등을 포함한 다양한 인간 암에서 과발현된다. CYP2W1 과발현은 종양 진행 및 불량한 생존율과 연관된다(Aung et al., 2006; Gomez et al., 2010; Zhang et al., 2014a). 종양 특이적 발현으로 인해, CYP2W1은 암 요법 시 흥미로운 약물 표적이나 전구 약물의 효소성 활성제이다(Karlgren and Ingelman-Sundberg, 2007; Nishida et al., 2010).

DPPA2는 발생 분화다능성 연관 2(developmental pluripotency associated 2)를 인코딩하며 3q13.13 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). DPPA2는 위암, 비소세포 폐암, 상피 난소암 및 결장직장암에서 과발현된다. DPPA2는 여러 객체에서 상향조절되는 종양유전자이다. DPPA2는 기형종에서 상반되게 억압된다(Tung et al., 2013; Ghodsi et al., 2015; John et al., 2008; Raeisossadati et al., 2014; Shabestarian et al., 2015; Tchabo et al., 2009; Western et al., 2011). DPPA2 발현은 종양의 침윤 깊이, 병기, 림프절 전이 및 공격성과 상관관계가 있다(Ghodsi et al., 2015; Raeisossadati et al., 2014; Shabestarian et al., 2015). DPPA2는 비소세포 폐암의 발병에 관여한다(Watabe, 2012). DPPA2는 갑상선암에서 차등적으로 메틸화된다(Rodriguez-Rodero et al., 2013).

ENTPD4(UDPase)는 아피라아제 단백질 계열의 구성원인 엑토뉴클레오시드 삼연산염 이인산가수분해효소 4를 인코딩하며 리소좀으로부터 뉴클레오티드를 구제하는 역할을 수행할 수 있다(RefSeq, 2002). UDPase 활성도는 난소암이나 고환암 환자에서 증가하고 화학요법 이후 감소한다(Papadopoulou-Boutis et al., 1985).

ESR1은 호르몬 결합, DNA 결합 및 전사의 활성화에 중요한 리간드 활성화 전사 인자인 에스트로겐 수용체를 인코딩하며, 이는 성기능 발달 및 생식 기능에 필수적이다(RefSeq, 2002). ESR1암의 돌연변이 및 단일 뉴클레오티드 다형태는 간암, 전립선, 담낭암 및 유방암을 포함한 여러 암 유형의 위험과 관련이 있다. ESR1 발현의 상향조절은 세포 증식과 종양 성장과 연결되지만, ESR1 양성 종양 환자의 전체 생존 기간은 선택적 에스트로겐 수용체 조절자를 사용한 성공적인 요법으로 인해 더 양호하다(Sun et al., 2015; Hayashi et al., 2003; Bogush et al., 2009; Miyoshi et al., 2010; Xu et al., 2011; Yakimchuk et al., 2013; Fuqua et al., 2014). ESR1 신호전달은 EGFR/IGFR, PI3K/Akt/mTOR, p53, HER2, NFkappaB 및 TGF-beta 경로 등과 같은 세포 전환, 성장 및 생존에 대한 책임이 있는 여러 경로를 방해한다(Frasor et al., 2015; Band and Laiho, 2011; Berger et al., 2013; Skandalis et al., 2014; Mehta and Tripathy, 2014; Ciruelos Gil, 2014).

ETV1은 전사 인자의 ETS(E 26) 계열의 구성원인 ETS 변이체 1을 인코딩한다. ETS 단백질은 세포 성장, 혈관 형성, 이동 증식 및 분화와 같은 생물학적 과정을 조절하는 다수의 표적 유전자를 조절한다(RefSeq, 2002). ETV1은 상피-중간엽 이행, DNA 손상 반응, AR 및 PTEN 신호전달, 암 세포 침윤 및 전이에 관여한다. ETV1은 JMJD2A와 상호작용하여 전립선 암종 형성을 촉진하고 Hippo 신호전달 경로에 영향을 주는 YAP1 발현을 증가시킨다(Mesquita et al., 2015; Baty et al., 2015; Heeg et al., 2016; Higgins et al., 2015; Kim et al., 2016; Lunardi et al., 2015). ETV1 발현은 전립선암에서 감소된다. ETV1은 췌장암, 위장관 기질 종양, 희소돌기아교 종양 및 신세포 암종에서 과발현된다. ETV1은 비소세포 폐암에서 종양유전자일 수 있다(Heeg et al., 2016; Gleize et al., 2015; Ta et al., 2016; Al et al., 2015; Hashimoto et al., 2017; Jang et al., 2015). 전립선암 세포주의 소포에서 ETV1의 증가된 mRNA 수준은 전립선암 진행과 상관관계가 있다(Lazaro-Ibanez et al., 2017). ETV1은 유잉 육종 변곡점 단백질 EWS와 상호작용하는 종양유전자이다. ETV1은 암 세포 전이 및 결합조직형성 기질 팽창을 부분적으로 매개하는 Sparc 및 Has2와 상호작용한다(Heeg et al., 2016; Kedage et al., 2016). ETV1 유전자 융합 산물 그리고 ETV1 프로모터 메틸화 상태는 진단에 있어서 유용하다(Angulo et al., 2016; 2015; Kumar-Sinha et al., 2015; Linn et al., 2015).

ETV4(E1AF 또는 PEA3이라고도 함)는 전사 인자의 Ets 종양유전자 계열의 구성원을 인코딩하며 전이 유전자 발현의 조절 그리고 배아 줄기 세포에서 분화 관련 유전자의 유도에 관여한다(Akagi et al., 2015; Coutte et al., 1999; Ishida et al., 2006). ETV4는 유방, 폐, 결장직장 및 위의 암을 포함하는 여러 암 객체에서 과발현된다(Benz et al., 1997; Horiuchi et al., 2003; Yamamoto et al., 2004; Keld et al., 2011; Hiroumi et al., 2001). ETV4는 MMP 및 IL-8을 포함한 여러 표적의 유도 이후 ERK/MAPK, HER2, PI3K 및 Ras와 같은 여러 경로에 의해 상향조절된다(Maruta et al., 2009; Keld et al., 2010; Chen et al., 2011b; Aytes et al., 2013).

ETV5는 ETS 변이체 5 단백질을 인코딩하며 3q28 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). 자궁내막암에서 ETV5를 포함하는 경로가 상피-중간엽 과정과 깊이 관련 있는 것으로 기술되었다(Colas et al., 2012). ETV5는 OV90 난소암 세포주에서 세포주기 진행 및 TGF-β 신호전달 경로와 같은 여러 신호전달 경로와 상호작용하는 것으로 나타났으며, ETV5 발현은 난소암에서 종양유전자 전사 인자 FOXM1의 발현과 연관 있는 것으로 나타났다(Llaurado et al., 2012b). 더욱이, ETV5는 난소암에서 상향조절되는 것으로 나타났다. 타원체 모델에서, ETV5의 억제 및 상향조절은 세포 증식, 세포 이동, 세포외 기질 성분으로의 세포 유착 및 세포 생존에 영향을 미쳤다. 따라서, ETV5는 난소암 진행, 세포 파종 및 전이에서 역할을 수행할 수 있다(Llaurado et al., 2012a). 종양유전자 PEA3 아과의 다른 구성원들 중에서 ETV5의 염색체 재배열이 전립선 종양에서 발생하는 것으로 기술되었으며 전립선암의 기원에서 주요 구동력의 하나로 사료된다. 더욱이, ETV5는 흑색종, 유방암 및 다른 유형의 암에 연루된 종양단백질로서도 기술되었다(Oh et al., 2012). 기질 금속단백질분해효소 2 발현 조절 및 그에 따라 인간 연골육종에서 ETV5가 재흡수에서 상당한 역할을 갖는 것으로 제안되었으며, 따라서 이 암에서 전이성 캐스케이드의 표적 가능한 상류 작용기일 수 있다(Power et al., 2013).

EYA2는 EYA 전사적 공동활성 인자 및 눈 발달에 관여하는 단백질의 eye absent(EYA) 계열의 구성원인 인산분해효소 2를 인코딩한다(RefSeq, 2002). EYA2 과발현은 상피 난소 종양, 전립선암, 유방암, 요로암, 아교모세포종, 폐 선암종, 자궁경부암, 결장 및 조혈 암 등의 여러 종양 유형에서 관찰되었다(Bierkens et al., 2013; Zhang et al., 2005; Guo et al., 2009; Patrick et al., 2013; Kohrt et al., 2014). 여러 연구에서 밝혀진 바에 따르면, EYA2는 TGF β 경로 구성원의 전사 그리고 TGFBR2의 인산화에 영향을 미치는데, 이는 췌장에서 EYA2의 역할을 시사한다(Vincent et al., 2014).

FAM111B는 돌연변이의 경우, 반상 색소침착, 모세혈관 확장성, 표피 근위축, 힘줄 경축 및 진행성 폐 섬유증을 유도하는 C-말단에서 트립신 유사 시스테인/세린 펩티다아제 도메인을 갖는 단백질인 서열 유사성 111 구성원 B의 계열을 인코딩한다(RefSeq, 2002). FAM111B는 메트포민과 아스피린에 의해 유도된 췌장암 발생의 억제 동안 하향조절되는 것으로 나타났다(Yue et al., 2015).

FAM83H는 치아 에나멜의 구조적 발달과 석회화에서 중요한 역할을 수행하는 서열 유사성 83 구성원 H의 계열을 인코딩한다. 이 유전자의 결손이 불완전 사기질형성층 유형 3(AI3)의 원인이다(RefSeq, 2002). 긴 비코드 RNA FAM83H-AS1은 세포 증식, 이동 및 침윤에 관여하며 MET/EGFR 신호전달을 조절한다(Zhang et al., 2017). 긴 비코드 RNA FAM83H-AS1은 폐암과 결장직장암에서 과발현된다. FAM83H는 유방암 및 결장직장암을 포함하는 여러 객체에서 과발현되는 종양유전자이다(Zhang et al., 2017; Kuga et al., 2013; Snijders et al., 2017; Yang et al., 2016c; Yang et al., 2016b). 긴 비코드 RNA FAM83H-AS1의 증가된 발현은 더 짧은 전체 생존 기간과 연관이 있다. FAM83H-AS1은 불량한 예후와 연관이 있다(Yang et al., 2016c; Yang et al., 2016b). FAM83H는 안드로겐 비의존성 전립선암이 관여할 수 있다(Nalla et al., 2016). FAM83H는 CK1α와 상호작용하여 케라틴 미세섬유 및 데스모솜을 형성한다(Kuga et al., 2016).

FBN2는 피브릴린 2라고 알려져 있으며, 연결 조직의 한 구성요소인 단백질을 인코딩하며 신축성 섬유 조립체에 관여할 수 있다(RefSeq, 2002). FBN2는 TGF-β 신호전달 활성도의 세포외 기질 규제 단백질로서 기술되었다(Lilja-Maula et al., 2014). FBN2의 과메틸화는 투명세포 신세포 암종 및 결장직장암의 조기 검출을 위한 후생유전적 바이오마커로서 그리고 결장직장암 암 환자에서 불량한 예후와 연관 있는 것으로 기술되었다(Ricketts et al., 2014; Rasmussen et al., 2016; Yi et al., 2012). FBN2는 수모세포종에서 유도 절제술을 위한 종양 특이적 탐침의 개발에 사용 가능한 수모세포종에서 풍부한 후보 세포 표면 표적으로 나타났다(Haeberle et al., 2012).

FOLR1은 엽산염 수용체 1을 인코딩하며, 이는 엽산과 그 환원된 유도체에 결합하고 5-메틸테트라히드로폴레이트를 세포 안으로 운반한다. FOLR1은 글리코-포스타티닐이노시톨 연계를 통해 막에 고정되거나 용해 형태로 존재하는 분비된 단백질이다(RefSeq, 2002). 엽산의 흡수를 위해 요구되는 FOLR1/cSrc/ERK1/2/NF

B/p53 경로의 주요 일부로서, FOLR1은 유방, 폐 및 결장 암과 같은 암 세포의 증식을 조절할 수 있다(Kuo and Lee, 2016; Cheung et al., 2016). FOLR1은 그 발현이 종양 병기에 따라 증가하며 잠재적 치료 표적을 나타낼 수 있는 상피 난소암에서 널리 발현되는 것으로 나타났다(Leung et al., 2016; Ponte et al., 2016; Moore et al., 2016; Hou et al., 2017; Notaro et al., 2016; Bergamini et al., 2016). 결장직장암 요법 동안 FOLR1 발현의 감소가 5-플루오로우라실 치료의 효과를 증가시키는 것으로 나타났다(Tsukihara et al., 2016). FOLR1은 삼중음성 유방암 그리고 결장직장암의 면역요법에 대한 이상적인 종양 관련 표지자를 대표한다(Liang et al., 2016; Song et al., 2016).

GPR64는 부고환 특이적 막통과 단백질로 기술된 G 단백질 연결 수용체군의 구성원인 유착 G 단백질 연결 수용체 G2를 인코딩한다(RefSeq, 2002). 유방암 세포주에서, GPR64의 녹다운은 세포 유착 그리고 세포 이동의 강한 감소를 초래했다(Peeters et al., 2015).

HOXA10은 홈박스 A10을 인코딩한다. 이 유전자는 7 염색체 상의 클러스터의 일부로서 유전자 발현, 형태발생 및 분화를 조절할 수 있는 DNA 결합 전사 인자를 인코딩한다. 보다 구체적으로, 이 유전자는 생식, 배아 변동성 및 조혈 계통 결정의 조절에서 기능을 할 수 있다. 이 유전자와 하류 홈박스 A9(HOXA9) 유전자 사이에 통독 전사(Read-through transcription)가 존재한다(RefSeq, 2002). HOXA10은 그 발현이 신경아교종에서 CD133 발현과 상관관계가 있는 줄기 세포 인자이며 암 진행에 관여할 수 있다. HOXA10은 암 세포 증식, 이동, 침윤 및 전이에 관여한다. HOXA10은 P-gp 및 MRP1 발현의 유도에 의해 다약제 내성에 관여한다. HOXA10은 상피-중간엽 이행을 촉진시킨다. HOXA10은 miR-218/PTEN/AKT/PI3K 신호전달의 하류 표적일 수 있다. HOXA10은 AML 관련 전사 인자 Prdm16의 발현을 촉진시킨다. HOXA10은 p21 의존 방식으로 G1 세포 주기 정지를 매개할 수 있다. HOXA10은 암 세포 침윤을 촉진시키는 TGF-beta2/p38 MAPK 신호전달에 MMP-3 의존 방식으로 관여할 수 있다(Carrera et al., 2015; Cui et al., 2014; Emmrich et al., 2014; Han et al., 2015; Li et al., 2014a; Li et al., 2016a; Sun et al., 2016; Xiao et al., 2014; Yang et al., 2016a; Yi et al., 2016; Yu et al., 2014; Zhang et al., 2014b; Zhang et al., 2015b). HOXA10은 위암과 급성 골수성 백혈병에서 상향조절된다. HOXA10은 구강 편평세포 암종에서 차등적으로 발현된다. HOXA10은 비장액성 난소 암종 및 아교모세포종에서 차등적으로 메틸화된다(Carrera et al., 2015; Han et al., 2015; Kurscheid et al., 2015; Niskakoski et al., 2014; Oue et al., 2015; Shima et al., 2014). HOXA10 메틸화 상태가 유방암 진단에 사용될 수 있다. HOXA10 및 CD44 공동발현은 위암에서 종양 크기와 환자 생존 기간과 상관관계가 있다. HOXA10 및 miR-196b 공동 발현은 위암에서의 불량한 예후와 상관관계가 있다(Han et al., 2015; Lim et al., 2013; Uehiro et al., 2016). SGI-110 치료가 화학요법에 대해 난소암 세포를 민감하게 하는 HOXA10을 저메틸화시킨다(Fang et al., 2014a).

HOXA9는 홈박스 단백질 A9를 인코딩한다. 이 유전자는 염색체 7 상에서 A 클러스터의 일부이며 유전자 발현, 형태발생 및 분화를 조절할 수 있는 DNA 결합 전사 인자를 인코딩한다. 이 유전자와 NUP98 유전자 사이의 융합을 초래하는 특정 전위 사례가 골수성 백혈병 유발과 연관이 있었다(RefSeq, 2002). HOXA9는 급성 골수성 백혈병에서 발현되며 높은 발현은 불리한 예후와 연관이 있다. HOXA9 및 MEIS1 공동발현은 AML을 유도한다. HOXA9는 자궁경부암에서 하향조절된다. HOXA9는 자궁내막암에서 빈번하게 메틸화된다(Alvarado-Ruiz et al., 2016; Chen et al., 2015; Li et al., 2016b; Li et al., 2016e; Sykes et al., 2016). 유전자 융합 산물인 NUP98-HOXA9는 종양유전자로서 작용한다(Abe et al., 2016; Sontakke et al., 2016). 시스플라틴 기반 화학요법에 대한 반응이 HOXA9 프로모터 메틸화 상태와 연계된다. 백혈병에서 HOXA9, MEIS1 및 MN1 공동 발현이 그 세포들을 DOT1L의 약리학적 억제에 대해 민감하게 만든다(Li et al., 2016c; Riedel et al., 2016; Xylinas et al., 2016). HOXA9는 그 발현이 암 진단에 사용될 수 있는 종양 억제인자이다(Ma et al., 2016b). HOXA9는 백혈병 줄기 세포의 자가재생을 매개하고 HIF-2alpha 소실은 이 과정을 가속화시킨다(Vukovic et al., 2015; Zhu et al., 2016).

HOXB9는 Abd-B 홈박스 계열의 구성원인 홈박스 B9를 인코딩하며 그 홈박스 DNA 결합 도메인을 갖는 단백질을 인코딩한다. 이것은 염색체 17 상에 위치한 홈박스 B 유전자의 클러스터에 포함된다. 인코딩된 핵 단백질은 세포 증식 및 분화에 관여하는 서열 특이적 전사 인자로서 기능한다. 이 유전자의 발현 증가는 일부 백혈병, 전립선암 및 폐암 사례와 연관이 있다(RefSeq, 2002). HOXB9는 miR-192에 의해 조절되는 혈관신생 경로에 관여한다. HOXB9는 전이를 초래하는 N-아세틸갈락토스아미닐전이효소에 의해 유도되는 Wnt/β-카테닌 신호전달의 하류 표적이다. HOXB9는 위 암종 및 결장 선암종에서 중간엽-상피 이행 그리고 유방암 및 간세포 암종에서 상피-중간엽 이행을 TGF-β1 의존 방식으로 조절할 수 있다. HOXB9는 세포 증식, 이동 및 침윤에 관여한다. TGF-β1이 HOXB9를 Kindlin-2/PDAC-의존 방식으로 조절한다(Chang et al., 2015b; Darda et al., 2015; Hoshino et al., 2014; Huang et al., 2014; Kwon et al., 2015; Seki et al., 2012; Sha et al., 2015; Wu et al., 2016; Zhan et al., 2014; Zhan et al., 2015; Zhussupova et al., 2014). HOXB9는 PBRM1 돌연변이된 투명세포 신세포 암종에서 차등적으로 발현된다. HOXB9는 백금 저항성 고등급 장액성 난소암, 유방암, 신경아교종, 결장 선암종, 간세포 암종 및 두경부 편평 세포 암종에서 과발현된다. HOXB9 발현은 위 암종에서 감소한다. HOXB9는 백혈병에서 돌연변이된다(Menezes et al., 2014; Chang et al., 2015b; Darda et al., 2015; Zhan et al., 2014; Zhussupova et al., 2014; Fang et al., 2014b; Hayashida et al., 2010; Kelly et al., 2016; Sha et al., 2013; Shrestha et al., 2012; Wang et al., 2016b; Yuan et al., 2014). HOXB9 발현은 E2F1 및 FAT10에 의해 조절된다(Zhussupova et al., 2014; Yuan et al., 2014). HOXB9 발현은 구강암에서 종양 크기와 상관관계가 있다. HOXB9 발현은 신경아교종에서 진행성 임상 병기와 연관이 있다. HOXB9 하향조절은 위 암종에서 환자의 생존기간 감소와 연관이 있다(Fang et al., 2014b; Sha et al., 2013; Oliveira-Costa et al., 2015; Tomioka et al., 2010). HOXB9는 방광암 진행을 조절한다(Zhang et al., 2016b). 긴 비코드 RNA nc-HOXB9-205가 방광의 요로상피 암종에서 하향조절된다(Luo et al., 2014). BCAS3-HOXB9 유전자 융합 산물이 유방암에서 발현된다(Schulte et al., 2012).

HOXC10은 유전자의 홈박스 계열에 속하는 홈박스 C10을 인코딩한다. 홈박스 유전자는 모든 다세포 생물체의 형태발생에서 중요한 역할을 수행하는 고도로 보존된 전사 인자의 계열을 인코딩한다. 이 유전자는 염색체 12상의 클러스터에 위치하는 여러 홈박스 HOXC 유전자 중 하나이다. 단백질 수준이 세포 분화 및 증식 동안 제어되며, 이는 이 단백질이 기원 활성화에서 역할을 수행함을 나타낼 수 있다(RefSeq, 2002). HOXC10은 세포자멸사를 억압하고 NF-카파B 및 DNA 손상 복구를 상향조절함으로써 항암제 내성에 관여한다. HOXC10은 세포자멸사를 유도하고 세포 성장을 억제한다. HOXC10은 자궁경부암 진행 및 침윤에 관여할 수 있다(Pathiraja et al., 2014; Sadik et al., 2016; Zhai et al., 2007). HOXC10은 갑상선암, 자궁경부 편평세포 암종 및 유방암에서 상향조절된다(Abba et al., 2007; Zhai et al., 2007; Ansari et al., 2012; Feng et al., 2015). HOXC10 발현은 ER 음성 유방암에서 더 짧은 무재발 기간 및 전체 생존 기간과 상관관계가 있다. HOXC10 발현은 갑상선암에서 진행된 병기, 불량한 병리학적 병기, 불량한 예후, 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용 및 케모카인 신호전달 경로와 연관이 있다(Sadik et al., 2016; Feng et al., 2015). HOXC10은 구강 편평 세포 암종과 소형 B세포 림프종에서 차등적으로 메틸화된다(Marcinkiewicz and Gudas, 2014a; Marcinkiewicz and Gudas, 2014b; Rahmatpanah et al., 2006).

HOXC9는 홈박스 유전자 계열에 속하는 홈박스 C9를 인코딩한다. 홈박스 유전자는 모든 다세포 생물체의 형태발생에서 중요한 역할을 수행하는 고도로 보존된 전사 인자의 계열을 인코딩한다. 이 유전자는 염색체 12상의 클러스터에 위치하는 여러 홈박스 HOXC 유전자 중 하나이다(RefSeq, 2002). HOXC9는 암 침윤 및 증식에 관여한다. HOXC9 넉다운은 세포 생존력, 이동, 침윤, 종양형성의 감소 그리고 자가포식의 증가를 초래한다. HOXC9는 방광암에서 miR-193a-3p-의존 방식으로 항암제 내성에 관여한다. HOXC9는 레티노산 신호전달에 관여하며 세포 성장 및 분화에 관여한다(Hur et al., 2016; Kocak et al., 2013; Lv et al., 2015a; Mao et al., 2011; Simeone et al., 1991; Stornaiuolo et al., 1990; Xuan et al., 2016; Zha et al., 2012). HOXC9는 유방암, 폐암 및 신경모세포종에서 차등적으로 발현된다. HOXC9는 I기의 비소세포 폐암에서 메틸화된다. HOXC9는 성상세포종에서 상향조절된다. HOXC9는 식도암과 자궁경부암에서 발현된다(Hur et al., 2016; Xuan et al., 2016; Gu et al., 2007; Lin et al., 2009; Lopez et al., 2006; Okamoto et al., 2007). HOXC9는 Smad4에 의해 전사적으로 억압된다(Zhou et al., 2008). HOXC9 발현은 유방암에서 무질병 생존기간과 원위 무전이 생존기간과 역의 관련이 있다. HOXC9 발현은 아교모세포종에서 불량한 예후와 연관이 있다(Hur et al., 2016; Xuan et al., 2016). HOXC9는 DAPK1을 억제하며, 이는 Beclin-1에 의해 유도되는 자가포식 교란을 초래한다(Xuan et al., 2016).

HOXD10은 홈박스 D10 단백질을 인코딩하며, 이는 사지 싹의 발생 시현에 발현되며 분화 및 사지 발달육에 관여하는 서열 특이적 전사 인자로 기능하는 홈박스 D10 단백질을 인코딩한다(RefSeq, 2002). HOXD10은 위암(GC)에서 상향조절되는 miR-10b의 표적 유전자로 확인되었으며, GC 발병기전 및 발생에서 주요 역할을 할 수 있다(Ma et al., 2015; Wang et al., 2015c). HOXD10은 세포 증식 및 침입을 촉진시킴으로써 경부 편평 세포 암종 및 요로상피암에서 상향조절되는 것으로 나타났으며, 침윤성 관 유방 암종의 새로운 바이오마커를 대표할 수 있다(Sharpe et al., 2014; Vardhini et al., 2014; Heubach et al., 2015). 하지만 HOXD10은 또한 담관세포 암종에서 RHOC/AKT/MAPK 경로의 비활성화 및 G1기 세포 주기 정지의 유도에 의해 종양 억제 기능을 나타냈다(Yang et al., 2015a). HOXD10은 miR-224/HOXD10/p-PAK4/MMP-9의 신호 전달 경로의 일환으로 세포 이동 및 침윤의 조절에 기여하며, 간세포 암종 치료의 새로운 생체표적을 제공한다(Li et al., 2014b).

HOXD9는 홈박스 계열의 유전자에 속하는 홈박스 D9를 인코딩한다. 홈박스 유전자는 모든 다세포 생물체의 형태발생에서 중요한 역할을 수행하는 고도로 보존된 전사 인자의 계열을 인코딩한다. 이 유전자는 2q31-2q37 염색체 영역에 위치하는 여러 홈박스 HOXD 유전자들 중 하나이다. HOXD 유전자 클러스터 전체나 이 클러스터의 5' 말단을 제거하는 소실은 여러 사지 및 생식기 이상과 연관되어 왔다. 이 유전자의 정확한 역할은 결정되지 않았다(RefSeq, 2002). HOXD9는 상피-중간엽 이행, 암 세포 이동, 침윤 및 전이에 ZEB1 의존 방식으로 관여한다. 과발현된 HOXD9는 부착 비의존성 성장을 증가시키고 접촉 억제를 감소시킨다. HOXD9는 성장 정지 및 신경세포의 분화에 관여한다. HOXD9의 고갈은 세포 증식의 감소, 세포 주기 정지 및 세포자멸사의 유도를 초래한다(Zha et al., 2012; Lawrenson et al., 2015b; Lv et al., 2015b; Tabuse et al., 2011). HOXD9는 폐 편평 암종과 침윤성 간세포 암종에서 상향조절된다. HOXD9는 식도암종, 성상세포종 및 아교모세포종에서 발현된다. HOXD9는 자궁경부암에서 차등적으로 발현된다(Bao et al., 2016; Gu et al., 2007; Lv et al., 2015b; Tabuse et al., 2011; Li et al., 2002; Liu et al., 2005). HOXD9 발현은 레티노산 및 Wnt 신호전달에 의해 유도된다(Ishikawa and Ito, 2009). HOXD9는 자궁경부 발암에 관여할 수 있다(Lopez-Romero et al., 2015). HOXD9 과메틸화가 림프절 전이에서 더 불량한 무질병 및 전체 생존기간과 연관이 있다(Marzese et al., 2014). HOXD9는 담관암종 및 흑색종 피부 전이에서 과메틸화된다(Marzese et al., 2014; Sriraksa et al., 2013). HOXD9는 점액성 난소 암종 감수성에 관여할 수 있다(Kelemen et al., 2015). HOXD9는 종양유전자일 수 있다(Wu et al., 2013).

HTR3A는 활성화 이후 뉴론에서 신속한 탈분극 반응을 유발하는 리간드 개폐 이온 통로 수용체 상과에 속하는 5-히드록시트아민(세로토닌) 수용체를 인코딩한다(RefSeq, 2002). HTR3A(또는 5-HT3)는 여러 암 유형에서 탈조절되며, 예를 들어 외투세포 림프종에서 하향조절, 다양한 B세포 종양에서 차등적 발현, 유방암 세포주에서 발현의 감소 등이다(Pai et al., 2009; Rinaldi et al., 2010; Ek et al., 2002).

IGF2BP1은 CRD-BP라고도 알려져 있으며, 일부 유전자의 mRNA에 결합하여 그 번역을 조절함으로써 기능하는 인슐린 유사 성장 인자 2 mRNA 결합 단백질 계열의 구성원을 인코딩한다(RefSeq, 2002). IGF2BP1을 포함한 IGF2 mRNA 결합 단백질 계열의 두 구성원이 다양한 인간 암에서 새로 합성되며 종양성장과 약물 내성 및 전이를 강화하는 강력한 전사후 종양유전자일 수 있는 진정한 종양태아 단백질로 기술되었다(Lederer et al., 2014). IGF2BP1의 발현이 다양한 인간 암에서 전반적으로 불량한 예후 및 전이와 상관관계가 있는 것으로 보고되었다(Lederer et al., 2014). 따라서, IGF2BP1이 암 요법을 위한 강력한 바이오마커 및 후보 표적으로 제안되었다(Lederer et al., 2014). IGF2BP 계열 구성원이 암 전이 그리고 KRAS, MYC, MDR1과 같은 종양유전자 인자의 발현과 고도로 연관된 것으로 기술되었다(Bell et al., 2013). IGF2BP1은 C-MYC와 상호작용하는 것으로 나타났으며, 결장 및 유방의 종양 및 육종의 대부분에서 그리고 유방 섬유선종 및 수막종에서 발현되는 것으로 확인되었다(Ioannidis et al., 2003). IGF2BP1은 간세포 암종 및 기저 세포 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Noubissi et al., 2014; Zhang et al., 2015c). 간세포 암종에서 IGF2BP1 및 기타 유전자들의 상향조절이 불량한 수술후 예후와 상당히 연관 있는 것으로 나타났다(Zhang et al., 2015c). IGF2BP1은 간세포 암종 및 신세포 암종에서 각각 miR-9 및 miR-372의 종양 억제인자의 표적으로 나타났다(Huang et al., 2015; Zhang et al., 2015c). 기질 IGF2BP1의 소실이 결장에서 종양형성 미세환경을 촉진하는 것으로 나타났으며, 이는 IGF2BP1이 결장 기질 세포에서 종양 억압 역할을 함을 나타낸다(Hamilton et al., 2015). IGF2BP1은 신경모세포종에서 4기 종양과 환자 생존 기간의 감소 및 MYCN 유전자 증폭과 연관 있는 것으로 나타났으며 따라서 신경모세포종에서 잠재적 종양유전자 및 독립적인 부정적 예후 인자일 수 있다(Bell et al., 2015). IGF2BP1은 기저 세포 암종의 발생에서 GLI1 발현 및 활성도를 조절하는 WNT/β-카테닌 신호전달의 직접적 표적으로 기술되었다(Noubissi et al., 2014).

IGF2BP3은 인슐린 유사 성장 인자 II의 번역을 억제하는 종양 태아 단백질인 인슐린 유사 성장 인자 II mRNA 결합 단백질 3을 인코딩한다(RefSeq, 2002). 여러 연구에 의하면 IGF2BP3은 세포 분극 이동, 형태학, 대사, 증식 및 분화 등 세포 기능의 다양한 주요 양상에서 활동하는 것으로 나타났다. 시험관 내(in vitro) 연구에서는 IGF2BP3이 종양 세포 증식, 유착 및 침입을 촉진하는 것으로 나타났다. 더욱이 IGF2BP3은 공격적이고 진행성인 암과 연관이 있는 것으로 나타났다(Bell et al., 2013; Gong et al., 2014). IGF2BP3 과발현은 예를 들어 신경모세포종, 결장직장 암종, 간내 담관암종, 간세포 암종, 전립선암 및 신세포 암종 등의 다수의 종양 유형에서 묘사되고 불량한 예후, 진행성 종양 병기 및 전이와 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Bell et al., 2013; Findeis-Hosey and Xu, 2012; Hu et al., 2014; Szarvas et al., 2014; Jeng et al., 2009; Chen et al., 2011a; Chen et al., 2013; Hoffmann et al., 2008; Lin et al., 2013a; Yuan et al., 2009).

IRF4는 림프구에서 톨 유사 수용체(Toll-like-receptor, TLR) 신호전달을 음적으로 조절하는 전사 인자인 인터페론 조절 인자 4를 인코딩하며, 이것은 선천적 및 적응적 면역계의 활성화에 중심이다(RefSeq, 2002). IRFA는 림프성, 골수성 및 수지상 세포의 분화와 성숙화에 있어서 여러 단계의 주요 조절인자로 간주되며, 조혈 체계 내에서 계열 및 병기 특이적 방식으로 변동하는 특징을 가진다(Shaffer et al., 2009; Gualco et al., 2010). IRF4는 만성 골수성 백혈구, 원발성 중추신경계 림프종, T 세포 림프종, HTLV-I 유도 성인 T 세포 백혈병 및 혈관 내 거대 B세포 림프종에서 적응적 면역, 세포 성장, 분화 및 종양 형성의 중추적 역할을 한다(Mamane et al., 2002; Orwat and Batalis, 2012; Bisig et al., 2012; Ponzoni et al., 2014; Manzella et al., 2016). IRF4는 다발성 골수종에서 EZH2(enhancer of zeste homolog 2)에 의해 조절되는 잘 알려진 종양 유전자이다(Alzrigat et al., 2016).

KLK14는 혈압 및 박리의 조절과 같은 다양한 생리적 기능을 갖는 세린 단백분해효소의 칼리크레인 아과의 구성원인 칼리크레인 관련 펩티다제 14를 인코딩한다. 이 유전자의 변형된 발현은 유방 및 전립선 종양을 포함한 여러 암의 진행에 연루된다. 인코딩된 단백질은 단백질분해로 처리되어 기능적 효소를 생성하는 전구체이다. 이 유전자는 염색체 19 상의 유전자 클러스터에 위치하는 15개 칼리크레인 아과 구성원들 중 하나이다(RefSeq, 2002). KLK14는 ERK1/2/MAP 키나제의 인산화 및 종양형성을 통해 세포 증식에 관여한다. KLK14는 PAR-2 신호전달을 유도한다. KLK14는 종양 진행, 성장, 침윤 및 혈관생성에 관여할 수 있다(Walker et al., 2014; Borgono et al., 2007; Chung et al., 2012a; Devetzi et al., 2013; Gratio et al., 2011; Sanchez et al., 2012; Zhang et al., 2012a). KLK14는 miR-378/422a 및 안드로겐 수용체 신호전달에 의해 하향조절된다. 안드로겐 수용체 신호전달은 유방암에서 KLK14 발현을 상향조절한다(Paliouras and Diamandis, 2008b; Lose et al., 2012; Paliouras and Diamandis, 2007; Paliouras and Diamandis, 2008a; Samaan et al., 2014). KLK14는 만성 림프구성 백혈병, 비소세포 폐암, 타액선 종양 및 난소암에서 과발현된다. KLK14는 유방암에서 차등적으로 발현된다(Planque et al., 2008b; Fritzsche et al., 2006; Hashem et al., 2010; Kontos et al., 2016; Papachristopoulou et al., 2013; Planque et al., 2008a). KLK14 발현은 전체 생존기간과 역으로 연관이 있다. KLK14 발현은 바이오마커로서 그리고 질병의 재발 위험을 예측하는데 사용할 수 있다. KLK14 발현은 임상적 종양 병기 및 양성 림프절 상태와 상관관계가 있다(Devetzi et al., 2013; Lose et al., 2012; Fritzsche et al., 2006; Kontos et al., 2016; Borgono et al., 2003; Obiezu and Diamandis, 2005; Rabien et al., 2008; Rajapakse and Takahashi, 2007; Talieri et al., 2009).

KLK8은 피부에서 단백질분해성 케스케이드에 관여할 수 있는 세린 단백 분해효소인 칼리크레인 관련 펩티다제 8을 인코딩하며 난소암의 바이오마커로서 역할을 할 수 있다(RefSeq, 2002). KLK8 발현이 유방암, 결장직장암(CRC), 자궁내막 암종 및 난소암의 진행과 상관관계가 있는 것으로 나타났으며 결장직장암, 유방암 및 난소암의 잠재적인 독립적 예후 지표를 대표할 수 있다(Liu et al., 2017; Jin et al., 2006; Kountourakis et al., 2009; Darling et al., 2008; Michaelidou et al., 2015; Borgono et al., 2006). KLK8은 mRNA 전사체 결손(missing) 엑손 4를 생성하는 대체 스플라이싱을 거칠 수 있다. 이 대체 변이체는 KLK8과 반대로 암 세포에서 상당히 하향조절된다(Angelopoulou and Karagiannis, 2010). 그럼에도 불구하고 KLK8-T4 대체 스플라이스 변이체는 단독으로 또는 조합으로 폐암에서 불리한 예후의 새로운 독립적 표지자일 수 있다(Planque et al., 2010). KLK8 발현은 비소세포 폐암에서 종양 세포의 침윤을 억압하여 긍정적인 임상적 결과를 부여한다(Sher et al., 2006).

LAMA1은 이종삼량체 구조를 가진 세포외 기질 당단백질인 라미닌의 α 1 아단위를 인코딩하며, 이는 기저막의 주요 성분을 구성한다(RefSeq, 2002). LAMA1은 여러 암 유형에서 탈조절되며, 아교모세포종에서 상향조절, 결장직장암에서 과메틸화, 유방암에서 비정상적 메틸화, 위암에서 틀이동 돌연변이가 이에 포함된다(Scrideli et al., 2008; Choi et al., 2015; Simonova et al., 2015; Kim et al., 2011). TGFβ는 LAMA1의 발현을 유도할 수 있다. 그에 이어 LAMA1은 콜라겐분해효소 IV 생성을 촉진하고, 이는 양성 종양 세포에서 침윤성 표현형을 초래하지만 전이 가능성을 부여하는데 충분하지는 않다(Chakrabarty et al., 2001; Royce et al., 1992).

LAMC2는 세포외 기질 당단백질 계열인 라미닌 계열에 속한다. 라미닌은 기저막의 주요 비콜라겐 성분이다. 라미닌은 세포 부착, 분화, 이동, 신호전달, 신경돌기 외성장 및 전이 등의 다양한 생물학적 과정에 연루된 바 있다. LAMC2는 여러 태아 조직에서 발현되며 구체적으로 피부, 폐 및 신장의 상피 세포에 국소화되는 단백질을 인코딩한다(RefSeq, 2002). LAMC2는 역형성 갑상선 암종에서 고도로 발현되며 EGFR의 신호전달 조절에 의한 종양의 진행, 이동 및 침입과 연관이 있다(Garg et al., 2014). LAMC2 발현은 II기 결장직장암 환자에서 더 불량한 예후를 예측했다(Kevans et al., 2011). LAMC2 발현은 3가지의 다른 바이오마커와 함께 구강 편평 세포 암종 환자에서 LN 전이의 존재와 유의하게 연관이 있는 것으로 나타났다(Zanaruddin et al., 2013).

LILRB4(ILT-3이라고도 알려짐)는 염색체 영역 19q13.4의 유전자 클러스터에서 발견되는 백혈구 면역글로불린 유사 수용체(LIR) 계열의 구성원인 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B4를 인코딩한다. 이 수용체는 항원 제시 세포 상에서 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 면역 세포에서 발현되며, 면역 반응의 촉진을 억제하는 부정적 신호를 변환시킨다. 이 수용체는 또한 항원 포획 및 제시에서 기능할 수도 있다. 이것은 면역 반응에 대한 집중과 자가 반응성의 제한을 돕는 염증성 반응 및 세포독성을 제어하는 것으로 사료된다(RefSeq, 2002). LILRB4의 과발현은 암에서 수지상 세포의 내성에 관여할 수 있다. LILRB4는 면역 억압에 관여할 수 있다. LILRB4는 암 면역 탈출에 관여한다(Zhang et al., 2012b; Trojandt et al., 2016; Cortesini, 2007; de Goeje et al., 2015; Suciu-Foca et al., 2007). LILRB4 발현은 TNF α에 의해 유도된다. LILRB4의 과발현은 NF-카파B 활성화, 염증성 사이토카인의 전사 및 공동자극 분자를 억제시킨다. LILRB4는 시클로스포린에 의해 과발현되며, 이는 자연 살해 세포에 의한 종양 세포독성의 감소를 초래한다(Si et al., 2012; Thorne et al., 2015; Vlad and Suciu-Foca, 2012). LILRB4는 암의 수지상 세포에서 과발현된다. LILRB4는 단구성 급성 골수성 백혈병에서 발현된다. LILRB4는 난소암에서 과발현된다(Dobrowolska et al., 2013; Khan et al., 2012; Orsini et al., 2014). LILRB4 발현은 비소세포 폐암에서 더 짧은 생존 기간과 연관이 있다. LILRB4 발현은 만성 림프구성 백혈병 예후에 사용될 수 있다(Colovai et al., 2007; de Goeje et al., 2015).

LOXL2는 세포외 구리 의존성 아민 산화효소(리실 산화효소 유사 2라고 알려짐)를 인코딩한다. 이 효소는 연결 조직의 생물 발생에 필수적이며 콜라겐과 엘라스틴 사이의 교차 형성의 첫 단계를 촉매한다(RefSeq, 2002). LOXL2는 세포외 및 세포내 세포 신호전달 경로의 조절에 관여하는 것으로 나타났다. 세포외적으로, LOXL2는 종양 미세환경의 세포외 기질을 재형성한다. 세포내적으로, LOXL2는 상피-중간엽 이행을 조절한다(Cano et al., 2012; Moon et al., 2014). 일반적으로, LOXL2는 종양 진행과 연관이 있었으며, 이에는 다양한 종양에서 암 세포 침윤의 촉진, 전이, 혈관형성 및 고형 종양의 악성 형질전환이 포함된다. LOXL2의 높은 발현은 불량한 예후와 연관이 있다(Wu and Zhu, 2015). LOXL2는 결장, 식도 편평 세포, 유방 세포, 투명 세포 신세포, 간세포, 담관, 폐 편평 세포 및 두경부 편평 세포의 암종에서 과발현되는 것으로 나타났다. 다양한 암 유형에서, LOXL2의 높은 발현이 더 높은 재발, 진행 또는 전이와 연관이 있었다. 다양한 암 세포주에서, LOXL2의 높은 발현이 세포 이동성과 침윤의 증가와 연관이 있었으며 그 침묵은 반대 효과를 나타냈다(Xu et al., 2014a; Kim et al., 2014; Wong et al., 2014a; Hase et al., 2014; Lv et al., 2014; Torres et al., 2015). 위암에서, 섬유모세포 유래 LOXL2는 위암 세포의 운동성을 촉진시킬 수 있는 것으로 나타났다. 기질 세포에서 LOXL2의 발현은 예후 표지자의 역할을 할 수 있다(Kasashima et al., 2014). 암 조직에서 다수의 미크로 RNA 계열이 상당히 감소된다. LOXL2는 그러한 종양 억압 미크로-RNA의 직접적인 조절 인자로 나타났다(Fukumoto et al., 2016; Mizuno et al., 2016).

EGF는 EGF 수용체 특이적 상호작용 파트너이므로 LRRK1 전위를 유도한다(Ishikawa et al., 2012; Hanafusa and Matsumoto, 2011; Reyniers et al., 2014). LRRK1은 Grb2/Gab2/Shc1 복합체의 구성요소이며 Arap1과 상호작용한다. LRRK1은 세포 스트레스에 반응하는 MAPK 신호전달의 구성요소일 수 있다(Titz et al., 2010). 삼산화 비소는 급성 전골수구성 백혈병 치료에 사용되며 유방암 세포에서 LRRK1을 상향조절한다(Wang et al., 2011). LRRK1은 가족성 췌장암에서 극한 대립유전자 특이적 발현을 나타낸다(Tan et al., 2008). LRRK1은 루신 풍부 반복 키나제 1을 인코딩하며 염색체 15q26.3 상에 위치한다. LRRK1은 Ras-like GTPases의 신규 아군인 ROCO 단백질에 속한다(RefSeq, 2002; Korr et al., 2006).

LYPD1은 LY6/PLAUR 도메인 함유 1을 인코딩하며 2q21.2 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). LYPD1은 유방암에서 유래한 뇌 전이에서 과발현된다. LYPD1은 전이에서 과발현된다. LYPD1은 난소암에서 차등적으로 발현된다. LYPD1은 종양 억제인자로서, 자궁 암육종에서 유래하는 CD133+ 암 줄기 세포 유사 세포에서 하향조절된다(Burnett et al., 2015; Choijamts et al., 2011; Dat et al., 2012; Ge et al., 2015b; Lawrenson et al., 2015a). LYPD1은 세포 증식의 음적 조절인자이다(Salazar et al., 2011).

MAGEA11은 MAGEA 유전자 계열의 구성원인 MAGE 계열 구성원 A11을 인코딩한다. 이 계열의 구성원들은 서로 50 ~ 80%의 서열 동일성을 가진 단백질을 인코딩한다. MAGEA 유전자의 프로모터 및 제1 엑손은 상당한 변동성을 보이는데, 이는 이 유전자 계열의 존재가 동일한 기능을 여러 다른 전사 조절하에서 발현 가능케함을 시사한다. MAGEA 유전자들은 염색체 위치 Xq28에 군집한다(RefSeq, 2002). MAGEA11은 종양 진행에 관여하며 가상 환경(in silico)에서 불량한 예후와 생존 기간과 상관관계가 있는 암 배자계열 항원이다. MAGEA11은 PR-B 신호전달에 관여하며 안드로겐 수용체를 위한 공동조절인자로 활동한다. MAGEA11은 TIF2와 직접적으로 상호작용한다. MAGEA11은 저산소 신호전달에 관여하며 넉다운은 HIF-1α 발현의 감소를 유도한다(Aprelikova et al., 2009; Askew et al., 2009; James et al., 2013; Liu et al., 2011; Su et al., 2012; Wilson, 2010; Wilson, 2011). MAGEA11은 구강 편평 세포 암종, 파클리탁셀 저항성 난소암에서 그리고 전립선암 진행 동안 상향조절된다(Duan et al., 2003; Wilson, 2010; Ge et al., 2015a; Karpf et al., 2009). MAGEA11 발현은 전립선 및 상피 난소 암에서 저메틸화와 연관이 있다(James et al., 2013).

MAGEA12는 MAGE 계열 구성원 A12를 인코딩하며 X 염색체 상에 응집된 여러 다른 유전자들과 밀접한 관련이 있다(RefSeq, 2002). MAGEA12는 다발성 골수종 환자의 20.5%에서 발현된다(Andrade et al., 2008). 단일 흑색종 전이의 임시 퇴행 이후 특정 백신 접종에 반응하여 MAGEA12의 잠재 에피토프를 향한 전신 면역 반응성의 부상이 보고되었다(Lally et al., 2001). MAGEA12는 악성 흑색종의 조기 병변에서 다른 MAGE 항원에 비해 가장 높은 빈도로 발현되었다(Gibbs et al., 2000).

MAGEA3은 흑색종 연관 항원 계열 구성원 A3을 인코딩한다. MAGEA3은 암-고환 항원으로 널리 알려져 있다(RefSeq, 2002; Pineda et al., 2015; De et al., 1994). MAGEA3은 전이성 흑색종 암의 치료 백신 접종 시험에서 오랫동안 사용된 것으로 알려져 있다. 진행성 악성 흑색종 환자의 MAGEA3 및 4가지 다른 항원을 사용하여 현재 수행된 피부 펩티드 면역화 불완전 반응자에 비해 완전 반응자의 더 긴 전체 생존 기간에 유의하게 기여하는 것으로 나타났다(Coulie et al., 2002; Fujiyama et al., 2014). NSCLC에서 MAGEA3이 빈번히 발현되는 것으로 나타났다. NSCLC 조직 검체에서 MAGEA3의 발현은 더 많은 수의 종양 괴사와 상관관계가 있었으며, 폐암 세포주에서 증식 및 침윤을 억제시키고 세포자멸사를 촉진하는 것으로 나타났다. 선암종 환자에서, MAGEA3의 발현은 더 나은 생존 기간과 연관이 있었다. NSCLC의 치료에 대한 유망한 제3상 임상시험에서 전세포 항 MAGEA3 백신을 현재 조사 중이다(Perez et al., 2011; Reck, 2012; Hall et al., 2013; Grah et al., 2014; Liu et al., 2015b). 4개의 다른 유전자들과 함께 MAGEA3이 HCC에서 빈번히 발현되는 것으로 나타났다. HCC 환자에서 이 유전자들의 발현은 순환 종양 세포의 수, 고등급 종양 및 진행성 병기와 상관관계가 있었다. 간 전이의 빈도는 이 유전자를 발현하지 않은 종양 검체보다 MAGE3을 발현한 검체들의 사례에서 훨씬 더 높은 것으로 나타났다(Bahnassy et al., 2014; Hasegawa et al., 1998). 방광암 세포주 그리고 폐, 결장 또는 유방암의 세포주로부터 분리된 암 줄기세포 유사 부분 집단이 다른 암-고환 항원들 가운데 MAGEA3의 발현을 보여주었다. 일반적으로, 암 줄기 세포는 현재의 암 요법에 저항이 있는 것으로 알려져 있으며 치료 후 암 재발 및 진행을 유발한다. 따라서, 특히 방광암에서 MAGEA3은 면역요법 치료의 신규 표적의 역할을 할 수 없다(Yamada et al., 2013; Yin et al., 2014). 두경부 편평 세포 암종에서, MAGEA3의 발현이 더 나은 무질병 생존 기간과 연관 있는 것으로 나타났다(Zamuner et al., 2015). 더욱이 MAGEA3은 난소암의 예후 표지자로서 사용될 수 있다(Szajnik et al., 2013).

MAGEA4는 MAGE4라고도 알려져 있으며 MAGEA 유전자 계열의 구성원을 인코딩하며 Xq28 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). MAGEA4는 암 고환 항원으로 기술되었으며, 이 항원은 작은 비율의 전형적 고환종(비-정상피종성 고환 생식세포 종양은 아님), 유방 암종, 호지킨 림프종의 엡스타인-바 바이러스 음성 사례, 식도 암종, 폐 암종, 방광 암종, 두경부 암종 및 결장직장암, 구강 편평 세포 암종 그리고 간세포 암종에서 발현되는 것으로 발견되었다(Ries et al., 2005; Bode et al., 2014; Li et al., 2005; Ottaviani et al., 2006; Hennard et al., 2006; Chen et al., 2003). MAGEA4는 두경부의 원발성 점막 흑색종에서 빈번히 발현되는 것으로 나타났으므로 암 고환 항원 기반의 면역요법을 위한 잠재적인 표적일 수 있다(Prasad et al., 2004). MAGEA4는 LHK2 폐 선암종 세포, SW480 결장 선암종 세포 및 MCF7 유방 선암종 세포로부터 유래한 암 줄기유사 세포에서 우선적으로 발현되는 것으로 나타났다(Yamada et al., 2013). 자발적으로 전환된 정상적 구강 각질세포에서 MAGEA4의 과발현은 세포 주기 정지의 방지 그리고 p53 전사 표적인 BAX 및 CDKN1A에 의해 매개된 세포자멸사에 의해 성장을 촉진시킨 것으로 나타났다(Bhan et al., 2012). MAGEA4는 조기 병기의 간세포 암종 환자에 비해 C형 간염 바이러스에 감염된 간경변 환자 그리고 말기 간세포 암종 환자에서 더 빈번히 발현되는 것으로 나타났으므로 MAGEA4 전사물의 검출은 예후 예측에 도움이 될 수 있다(Hussein et al., 2012). MAGEA4는 폐암에서 발현되며 폐암 환자에서 다가 면역요법을 위한 잠재적인 후보로 기능할 수 있는 여러 암/고환 항원 중 하나로 나타났다(Kim et al., 2012). MAGEA4는 식도 암종과 간세포 암종에서 상향조절되는 것으로 기술되었다(Zhao et al., 2002; Wu et al., 2011). p286-1Y2L9L이라고 하는 MAGEA4 유래 미변성(native) 펩티드 유사체는 식도암에 대한 펩티드 백신의 개발에 적합한 새로운 후보 에피토프로 기술되었다(Wu et al., 2011).

MAGEA6은 흑색종 연관 항원 계열 구성인 A6을 인코딩한다. MAGEA3은 암-고환 항원으로 널리 알려져 있다(RefSeq, 2002; Pineda et al., 2015; De et al., 1994). MAGEA6은 흑색종, 진행성 골수종, 소아 횡문근육종, 육종, 폐암, 방광암, 전립선암, 유방암 및 결장직장암, 두경부 편평 세포, 식도 편평 세포 및 구강 편평 세포 암종에서 빈번히 발현되는 것으로 나타났다(Ries et al., 2005; Hasegawa et al., 1998; Gibbs et al., 2000; Dalerba et al., 2001; Otte et al., 2001; van der Bruggen et al., 2002; Lin et al., 2004; Tanaka et al., 1997). MAGEA6 발현은 다발성 골수종 환자에서 더 짧은 무진행 생존 기간과 연관이 있었다. 이와 대조적으로 두경부 편평 세포 암종에서, MAGEA6의 발현은 더 나은 무질병 생존 기간과 연관이 있었다(van et al., 2011; Zamuner et al., 2015). MAGEA6은 파클리탁셀 저항성 난소암 세포주에서 과발현된 유전자 집합 가운데 하나였다. 더욱이, MAGEA6의 형질주입은 파클리탁셀에 민감한 세포에 대한 약물 내성의 증가 또한 초래했다(Duan et al., 2003). MAGEA6은 난소암의 예후 표지자로 사용할 수 있다(Szajnik et al., 2013). 폐암, 결장암 또는 유방암의 세포주로부터 분리한 암 줄기 세포유사 부분 집단은 다른 암-고환 항원들 가운데 MAGEA6의 발현을 나타냈다(Yamada et al., 2013).

MAGEB2는 고환과 태반 그리고 다양한 조직학적 유형의 종양 가운데 상당한 부분, 다른 다발성 골수종 및 두경부 편평세포 암종에서 발현되므로 암 고환 항원으로 분류된다(Pattani et al., 2012; van et al., 2011).

MELK는 모체 배아 루신 지퍼 키나제를 인코딩하며 9p13.2 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). MELK는 세린-프레오닌의 SNF1/AMPK 계열의 구성원이며 세포 주기 의존성 단백질 키나제이다. MELK는 증식, 세포 주기 진행, 유사분열 및 스플라이스오솜(spliceosome)과 같은 복수의 세포 과정에서 주요 역할을 수행하며, 복수의 암 줄기 세포에서 과발현된 종양유전자 및 바이오마커로서 최근에 출현했다(Du et al., 2014). MELK는 결장암, 위암, 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 뇌암을 포함한 다양한 암에서 과발현되며, 과발현은 불량한 예후와 상관관계가 있다(Pickard et al., 2009; Kuner et al., 2013; Gu et al., 2013; Liu et al., 2015a). MELK의 억제는 유방암, 폐암 및 전립선암을 포함한 다양한 암에 대한 치료 전략으로서 조사 중이다. MELK-T1은 촉매 활성도와 MELK 단백질 안정성을 억제하며 DNA 손상 임계값을 낮춤으로써 종양을 DNA 손상 제제나 방사선 요법에 대해 민감하게 할 수 있다. MELK 억제제 OTSSP167에 대해 제1상 임상시험이 진행 중이다(Chung et al., 2012b; Ganguly et al., 2014; Beke et al., 2015).

MEX3A는 P-body로 모집되고 전사 후 규제 기전에 관여할 수 있는, 진화적으로 보존된 RNA 결합 단백질들로 구성되는 mex-3 RNA 결합 계열의 구성원을 인코딩한다(Buchet-Poyau et al., 2007). MEX3A는 늦은 재발과 연관 있는 윌름 종양에서 과발현되며 이 유전자가 증폭된다(Krepischi et al., 2016). MEX3A는 장분화, 극성 및 줄기 세포능에 영향을 미치며 장의 항상성 및 발암에 기여하는 전사 후 기전을 통해 CDX2를 조절한다(Pereira et al., 2013).

MMP-11은 스트로멜리신-3이라고도 불리며, 암 세포, 기질 세포 및 주위 미세환경에서 검출된 MMP 상과에 속하는 스트로멜리신 아과의 구성원이다. 달리, MMP-11은 종양에 대해 이중 효과를 가한다. 한편으로 MMP-11은 세포자멸사의 억제 그리고 암 세포의 이동 및 침윤의 강화에 의해 암 발생을 촉진하며, 반면에 MMP-11은 동물 모형에서 전이의 억압을 통해 암 발생에 대해 부정적 역할을 수행한다. MMP-11의 과발현은 정상 대조군에 비해 암 환자의 혈청에서 그리고 위암, 유방암, 췌장암과 같은 복수의 종양 조직 검체에서 발견되었다(Zhang et al., 2016c). MMP-11은 짝진 정상 점막보다 CRC 조직에서 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 과발현되는 것으로 잘 나타났다. 더욱이, MMP-11 발현은 CRC 림프절 전이, 원위 전이 및 TNM 병기와 상관관계가 있었다(Tian et al., 2015). MMP-11 과발현은 상부 요로의 요로상피 암종(UTUC) 및 방광 요로상피 암종(UBUC)에서 공격적인 종양 표현형과 불리한 임상 결과와 연관 있으며, 신규 예후 및 치료 표적으로서 역할을 할 수 있음을 제시한다(Li et al., 2016d).

MMP12(또는 MME이라고도 함)는 관절염 및 전이와 같은 질병 과정은 물론 배아 발달, 생식, 조직 재형성과 같은 정상적인 생리적 과정에서 세포외 기질의 파괴에 관여하는 기질 금속함유 단백분해효소 계열의 구성원을 인코딩한다(RefSeq, 2002). MMP12의 탈조절이 여러 암 객체에서 나타난다. MMP12는 폐암, 피부암, 췌장암 및 위암에서 상향조절되며 종양 침윤과 전이에 관련이 있다. 이와 반대로, MMP12 mRNA의 과발현이 위암과 결장직장암에서 발견되었으며 더 나은 예후와 상관관계가 있다(Zhang et al., 2007; Yang et al., 2001; Balaz et al., 2002; Zheng et al., 2013; Wen and Cai, 2014; Zhang et al., 2015f). MMP12는 NF-카파B/MAPK 및 JNK/AP-1 경로를 통해 TNF α 또는 EGF에 의해 상향조절된다(Yu et al., 2010; Yang et al., 2012).

MYO3B는 아미노-말단 키나제 도메인에 의해 특성화되며 광수용체에서 존재하는 것으로 밝혀진 미오신 계열의 구성원인 미오신 IIIB를 인코딩한다(RefSeq, 2002). MYO3B가 HER2+ 세포주 가운데 트라스투주맙 치료에 대한 길항제로 확인되었다(Lapin et al., 2014). 전립선암에 대한 방사선요법 후 MYOB3 유전자의 뉴클레오티드 다형태가 AUA 증상 점수의 변화와 연관있는 것으로 나타났다(Kerns et al., 2013).

NFE2L3은 핵 인자인 적혈구 2 유사 3을 인코딩하며, 이것은 전사 인자들의 cap 'n' collar 기본 영역 루신 지퍼 계열의 구성원이다(RefSeq, 2002). 최근의 연구 결과에 의하면, 생쥐에서 NFE2L3의 소실은 림프종 발생에 대해 취약하게 한다. 다른 이들은 결장직장암 세포에서 높은 수준의 NFE2L3을 관찰한 반면, 호지킨 림프종에서는 NFE2L3의 이상 발현이 발견되었다. 더욱이, NFE2L3은 ER 양성 종양에서 과메틸화를 나타냈다(Kuppers et al., 2003; Chevillard et al., 2011; Palma et al., 2012; Rauscher et al., 2015).

NLRP2(NALP2이라고도 알려짐)는 피린 도메인 함유 2 단백질인 NLR 계열을 인코딩하여 카스파제-1의 활성화에 관여하며, 또한 전염증성 카스파제를 활성화하는 단백질 복합체를 형성할 수 있다. NLRP7은 NLRP2의 이원체(paralog)이다(RefSeq, 2002; Wu et al., 2010; Slim et al., 2012). NLRP2의 PYRIN 도메인은 아교모세포종의 세포 증식 및 종양 성장을 억제한다(Wu et al., 2010). ATM/NLRP2/MDC1 의존 경로는 염색체 절단에 반응하여 리보솜 유전자의 전사를 중단시킬 수 있다(Kruhlak et al., 2007). NLRP2의 돌연변이는 가족성 포상 기태, 베크위드-위드만 증후군 및 가족성 일과성 신생아 당뇨와 같은 인간 각인 질병을 유발할 수 있다(Aghajanova et al., 2015; Dias and Maher, 2013; Ulker et al., 2013). NLRP2는 NF-카파B 활성화를 억제한다(Kinoshita et al., 2005; Kinoshita et al., 2006; Fontalba et al., 2007; Bruey et al., 2004).

NLRP7은 NACHT의 구성원(루신 풍부 부분)인 NLR 계열 피린 도메인 함유 7 그리고 카스파제-1-의존 인터루킨 1-β 분비의 피드백 조절인자로 작용할 수 있는 PYD 함유(NLRP) 단백질 계열을 인코딩한다(RefSeq, 2002). NLRP7 발현은 자궁내막암에서 종양 침윤의 깊이 및 불량한 예후와 유의하게 상관관계가 있으며 배아 암종에서 고도로 발현되는 유전자들 중 하나로 확인되었다(Ohno et al., 2008; Skotheim et al., 2005). NLRP7은 고환 종양발생에서 세포증식에 대한 중대한 역할을 할 수 있으며 고환 생식세포 종양의 유망한 치료 표적을 대표한다(Okada et al., 2004).

OVGP1, 즉 난관 특이적 당당백질은 섬모가 없는 난관 상피 세포로부터 분비되는 커다란 탄수화물이 풍부한 상피 당단백질을 인코딩하며, 배란된 난모세포, 분할구 및 정자 첨단체 부위와 연관이 있다(RefSeq, 2002). OVGP1의 획득은 자궁내막 과형성 및 자궁내막암의 발생과 연관이 있는 것으로 나타났다(Woo et al., 2004). OVGP1은 자궁내막 종양형성에서 침윤의 분자 표지자 그리고 여러 난소암에서 분화 기반 표지자로서 기술되었다(Maines-Bandiera et al., 2010; Wang et al., 2009).

PAGE2는 고환에서 뚜렷하게 발현되는 PAGE 단백질 계열의 구성원을 인코딩한다(Brinkmann et al., 1998). 암-고환 유전자인 PAGE2는 결장직장암 세포의 자발적 분화 동안 탈메틸화에 의해 상향조절되며 이는 중간엽-상피 이행(MET)을 초래한다. 이에 따라 PAGE2의 하향조절이 EMT에서 나타났다(Yilmaz-Ozcan et al., 2014). 인간 세포에 대한 유전체 전체 스크리닝에서 PAGE2가 종말체 신호전달의 가능한 조절인자로 파악된다(Lee et al., 2011).

PNOC는 단백질분해로 처리되어 복수의 단백질 산물을 생성하는 프리프로프로틴인 프리프로노시셉틴을 인코딩한다. 이러한 산물에는 노시셉틴, 노시스타틴 및 오르파닌 FQ2(OFQ2)가 포함된다. 노시셉틴은 오르파닌 FQ라고도 알려져 있으며, 노시셉틴 수용체와 결합하여 통증의 증가를 유도하는 17-아미노산 신경펩티드이며, 체온, 학습 및 기억 및 배고픔을 조절할 수도 있다. 인코딩된 프리프로프로틴의 또 다른 산물인 노시스타틴은 통각의 효과를 억제시킬 수 있다(RefSeq, 2002). 암 통증의 억제는 종양 성장 및 폐 전이 또한 억제시킨다. PNOC는 모르핀 내성 발생에 관여한다. PNOC는 뉴론 성장에 관여한다. PNOC는 세포 손상, 생존력, 염증 및 면역 기능 부전에 관여한다(Caputi et al., 2013; Chan et al., 2012; Kirkova et al., 2009; Kuraishi, 2014; Stamer et al., 2011). PNOC는 신경절교종에서 상향조절된다. PNOC 발현은 말기 암에서 하향조절된다. PNOC는 간세포 암종 환자의 혈장에서 고도로 발현된다(Chan et al., 2012; Stamer et al., 2011; Horvath et al., 2004; Spadaro et al., 2006; Szalay et al., 2004). 세브라노파돌은 진통제 PNOC 펩티드이며 골암 치료에 사용되고 폐암 치료에서 부프레노르핀으로 사용될 수 있다(Davis, 2012; Linz et al., 2014). PNOC는 c-Fos 발현에 관여한다(Gottlieb et al., 2007; Kazi et al., 2007).

PRAME는 인간 흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원을 인코딩하고 레티노산 수용체의 억압인자로서 작용함으로써 이 기능을 통해 암 세포에 대해 성장 이점을 부여할 수 있다(RefSeq, 2002). PRAME는 다발성 골수종, 투명 세포 신세포 암종, 유방암, 급성 골수성 백혈병, 흑색종, 만성 골수성 백혈병, 두경부 편평세포 암종 및 골육종 세포주에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Dannenmann et al., 2013; Yao et al., 2014; Zou et al., 2012; Szczepanski and Whiteside, 2013; Zhang et al., 2013; Beard et al., 2013; Abdelmalak et al., 2014; Qin et al., 2014). PRAME는 점액양 및 원형세포 지방육종과 관현이 있다(Hemminger et al., 2014). PRAME는 R-CHOP로 치료한 미만성 거대 B세포 림프종에서 더 짧은 무진행 생존 기간 및 화학요법 반응, 두경부 편평 세포 암종에서 불량한 예후의 표지자, 요로상피 암종에서 화학요법에 대한 불량한 반응 그리고 골육종에서 불량한 예후 및 폐 전이와 관련이 있다(Tan et al., 2012; Dyrskjot et al., 2012; Szczepanski et al., 2013; Mitsuhashi et al., 2014). PRAME는 급성 림프모구성 백혈병에서 보다 적은 재발, 보다 낮은 사망률 및 전체 생존 기간과 관련이 있다(Abdelmalak et al., 2014). PRAME는 R-CHOP 요법으로 치료한 미만성 거대 B 세포 림프종의 예후 표지자일 수 있다(Mitsuhashi et al., 2014).

RAD54는 DEAD 유사 헬리카아제 상계열(superfamily)에 속하는 단백질을 인코딩한다. 이것은 Saccharomyces cerevisiae RAD54 및 RDH54와 유사성을 공유하며, 이 둘은 DNA의 상동성 재조합 및 복구에 관여한다. 이 단백질은 이중가닥 DNA에 결합하며 DNA의 존재 하에서 ATPase 활성도를 발휘한다. 이 유전자는 고환과 비장에서 고도로 발현되며, 이것은 감수분열 및 유사분열 재조합에서 능동적 역할을 시사한다(RefSeq, 2002). RAD54B의 동종접합 돌연변이는 원발성 림프종과 결장암에서 관찰되었다(Hiramoto et al., 1999). RAD54B는 인간 종양 세포에서 RAD51의 dsDNA에 대한 직접 결합에 따른 게놈-불안정화 영향에 대응한다(Mason et al., 2015).

RNF17은 RING 핑거 도메인 함유 고환 특이적 단백질을 인코딩하는 생쥐 유전자와 유사한 링 핑거 단백질 17을 인코딩한다. 이 유전자의 다른 아이소형을 인코딩하는 교대로 스플라이싱된 전사 변이체가 나타났다(RefSeq, 2002). RNF17은 사이토카인 생산 및 세포자멸사에 관여한다. RNF17은 c-Myc 기능을 강화시킨다(Jnawali et al., 2014; Lee et al., 2013; Yin et al., 1999; Yin et al., 2001). RNF17은 RHOXF1 넉다운 시 상향조절된다(Seifi-Alan et al., 2014). RNF17은 간암에서 발현된다(Yoon et al., 2011). RNF17은 암 연관 표지자이다(de Matos et al., 2015).

SDK2는 면역글로불린 도메인 2개 그리고 DNA, 헤파린 및 세포 표면의 결합 부위를 대표하는 피브로넥틴 III형 도메인 13개를 포함하는 면역글로불린 상과의 구성원인 사이드킥 세포 융합 분자 2를 인코딩한다(RefSeq, 2002). SDK2는 뉴론 발생에서 액손 말단을 특정 시냅스로 유도하며 내부 얼기층에서 망막의 수상돌기에 대한 라미나 특이적 표적화를 촉진하는 것으로 나타났다(Kaufman et al., 2004; Yamagata and Sanes, 2012).

SPDEF(PDEF라고도 함)가 전사 인자의 E26 형질전환 특이적(ETS) 계열의 구성원인 ETS 전사인자 함유 SAM pointed 도메인을 인코딩한다. 이것은 전립선 특이적 항원(PSA) 프로모터의 안드로겐 비의존성 트랜스액티베이터로 기능하는 전립선 상피 세포에서 고도로 발현된다(RefSeq, 2002). SPDEF 발현은 종양 진행의 후기에서 흔히 상실되거나 하향조절되며, 이는 종양 세포 침윤 및 전이에서 역할을 한다는 의미이다. SPDEF는 종양 진행의 전기에서 때때로 상향조절된다. SPDEF의 탈조절이 유방, 전립선 및 결장직장암을 포함한 여러 암 객체에서 기술되고 있다(Moussa et al., 2009; Schaefer et al., 2010; Steffan and Koul, 2011). SPDEF는 E-카드헤린의 전사를 유도하고 그로써 세포 침윤 및 이동을 억압한다(Pal et al., 2013). SPDEF는 β-카테닌과 상호작용하여 그 전사적 활성도를 차단함으로써 종양유전자 사이클린 D1과 c-Myc의 단백질 수준의 감소를 초래한다(Noah et al., 2013).

SPON1은 스포딘 1을 인코딩하며 11p15.2 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). SPON1은 암 세포의 증식, 이동, 침윤 및 전이에 관여한다. SPON1은 Fak 및 Src 신호전달에 관여한다. SPON1은 MEKK/p38 MAPK/NF-카파B 신호전달을 경유하여 IL-6 유지에 관여하며, 이는 쥐과 신경모세포종 생존을 지원할 수 있다(Chang et al., 2015a; Cheng et al., 2009; Dai et al., 2015). SPON1은 miR-506에 의해 하향조절된다(Dai et al., 2015). SPON1은 난소암에서 과발현된다(Davidson et al., 2011; Jiao et al., 2013; Pyle-Chenault et al., 2005). SPON1은 암 예후에 대한 진단 가능성이 있을 수 있다(Pagnotta et al., 2013).

STAG3은 핵에서 발현되고 세포 분열 동안 자매 염색분체의 응집을 조절하는 응집 복합체의 아단위인 기질 항원 3을 인코딩한다(RefSeq, 2002). 연구자들이 STAG3의 공통된 대립유전자가 상피난소암의 발생에 관여함을 보고했다. 다른 그룹에서는 STAG3이 폐암, 만성 폐쇄성 폐질환 및 간질성 폐 섬유증을 효과적으로 구별할 수 있는 것으로 확인했다. 다른 이들은 p53 돌연변이된 림프종 세포에서 STAG3 유전자의 발현을 검출했다(Notaridou et al., 2011; Wielscher et al., 2015; Kalejs et al., 2006).

TDRD5는 BTB 도메인 함유 5를 인코딩하며 1q25.2 염색체 상에 위치한다(RefSeq, 2002). TDRD5가 유방암에서 과발현될 수 있다(Jiang et al., 2016). 삼중음성 유방암에서 레스베라트롤 치료 시 TDRD5 메틸화가 변형된다(Medina-Aguilar et al., 2017). TDRD5는 갑상선암과 연관있는 동형적합성 계열의 일부이다(Thomsen et al., 2016).

TENM4는 신경계와 중간엽 조직에서 발현되며 연골형성의 조절인자인 테뉴린 막횡단 단백질 4를 인코딩한다(Suzuki et al., 2014). 가장 빈번하게 변이되는 4개의 유전자 하나는 원발성 CNS 림프종에서 단백질 변경 돌연변이를 보이는 TENM4였다(Vater et al., 2015). MDA-MB-175 세포주는 TENM4와 ErbB 계열의 수용체의 융합을 유도하는 염색체 전좌를 함유한다. 키메라 유전자는 신경모세포종에서 또한 발견되었다(Wang et al., 1999; Boeva et al., 2013).

TMPRSS3은 세린 단백분해효소 계열에 속하는 단백질인 막횡단 단백분해효소, 세린 3을 인코딩한다. 인코딩된 단백질은 세린 단백분해효소 도메인, 막횡단 도메인, LDL 수용체 유사 도메인 및 제거제 수용체 시스테인 풍부 도메인을 함유한다. 세린 단백분해효소는 다양한 생물학적 과정에 관여하는 것으로 알려져 있고, 그 오기능은 흔히 인간 질병 및 장애를 초래한다. 이 유전자는 선천성 및 아동기에 발생하는 보통염색체 열성 귀먹음과의 연관에 의해 확인되었다. 이 유전자는 태아 와우 및 다수의 다른 조직에서 발현되며, 내이 또는 외림프 및 내림프의 내용물의 발달과 유지에 관여하는 것으로 사료된다. 이 유전자는 또한 난소 종양에서 과발현되는 종양 연관 유전자로 파악되었다(RefSeq, 2002). TMPRSS3은 세포 증식, 침윤 및 이동에 관여한다. TMPRSS3은 ERK1/2 신호전달을 유도한다(Zhang et al., 2016a). TMPRSS3은 E-카드헤린, 비멘틴 및 트위스트 발현에 영향을 미친다. TMPRSS3은 헥사메틸렌 비스아세트아미드에 의해 하향조절된다(Zhang et al., 2016a; Zhang et al., 2004). TMPRSS3은 유방암, 췌장암 및 난소암에서 상향조절된다. TMPRSS3은 위암과 췌관 선암종에서 탈조절된다(Rui et al., 2015; Zhang et al., 2016a; Zhang et al., 2004; Amsterdam et al., 2014; Iacobuzio-Donahue et al., 2003; Luo et al., 2017; Underwood et al., 2000; Wallrapp et al., 2000). TMPRSS3은 TNM 병기, 림프절 전이, 원위 기관 전이, 더 짧은 생존 기간, 더 짧은 무질병 생존 기간 및 불량한 예후와 연관이 있다. TMPRSS3은 암에서 바이오마커로서 사용될 수 있다. TMPRSS3 돌연변이는 암 위험과 연관이 있다. TMPRSS3은 췌관 선암종의 조기 검출에 사용될 수 있다(Rui et al., 2015; Amsterdam et al., 2014; Luo et al., 2017; Dorn et al., 2014; Luostari et al., 2014; Pelkonen et al., 2015; Sawasaki et al., 2004). TMPRSS3은 암에서 저메틸화된다(Guerrero et al., 2012).

VTCN1은 B7-H4라고도 알려져 있으며, 항원제시 세포의 표면에 존재하고 T 세포의 표면에 있는 수용체에 결합하는 리간드와 상호작용하는 B7 공동촉진 단백질 계열의 구성원을 인코딩한다(RefSeq, 2002). VTCN1은 폐암, 결장직장암, 간세포 암종, 골육종, 유방암, 자궁경부암, 요로상피 세포 암종, 위암, 자궁내막암, 갑상선암 및 후두 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Klatka et al., 2013; Zhu et al., 2013; Vanderstraeten et al., 2014; Shi et al., 2014; Fan et al., 2014; Wang et al., 2014; Leong et al., 2015; Dong and Ma, 2015; Zhang et al., 2015a; Peng et al., 2015a; Xu et al., 2015a). VTCN1은 간세포 암종에서의 불량한 전체 생존 기간 및 더 높은 재발 확률 그리고 골육종, 요로상피 세포 암종, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 흑색종 및 갑상선암에서 불량한 전체 생존 기간과 관련이 있다(Zhu et al., 2013; Seliger, 2014; Liu et al., 2014b; Chen et al., 2014i; Fan et al., 2014; Dong and Ma, 2015; Zhang et al., 2015a). VTCN1은 투명 세포 신세포 암종과 관련이 있다(Xu et al., 2014b). VTCN1 발현 수준은 난소암에서 환자의 생존 기간과 역의 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Smith et al., 2014). VTCN1은 요로상피 세포 암종과 위암에 대한 잠재적인 예후 지표일 수 있다(Shi et al., 2014; Fan et al., 2014).

WNT7A는 WNT 유전자 계열의 구성원인 Wnt 계열 구성원 7A를 인코딩한다. 이 단백질들은 종양생성 그리고 배아생성 동안 세포의 운명 및 형태화의 조절 등 여러 발달 과정에 연루된 바 있다. 이 유전자는 여성의 생식관에서 전후 축의 발달에 관여하며, 또한 자궁의 평활근 패터닝 및 성인 자궁 기능의 유지에서 중대한 역할도 수행한다. 이 유전자에서 돌연변이는 Fuhrmann 및 Al-Awadi/Raas-Rothschild/Schinzel 해표상지증 증후군과 연관이 있다(RefSeq, 2002). WNT7A는 STAT4에 의해 유도되어 암 연관 섬유모세포의 활성화를 초래한다. WNT7A는 TGF-β 수용체 신호전달을 강력하게 한다. WNT7A는 세포 증식 및 이동에 관여한다. WNT7A는 노화의 상류 유도인자이다. PG545는 WNT7A와 상호작용하며 억제된 세포 증식을 초래한다. WNT7A는 종양 성장을 억압한다. WNT7A는 Wnt/β-카테닌 신호전달에 관여하며 hsa-miR29b를 조절한다(Avasarala et al., 2013; Avgustinova et al., 2016; Bikkavilli et al., 2015; Borowicz et al., 2014; Jung et al., 2015; King et al., 2015; Ramos-Solano et al., 2015; Zhao et al., 2017). WNT7A는 miR-15b메 의해 조절되며 DNMT1에 의해 하향조절된다. 엔도술판은 WNT7A를 방해한다. WNT7A는 miR-199a-5p 및 miR-195/497의 표적 유전자이다. WNT7A는 만성 에탄올 노출에 의해 하향조절되고 PPAR-델타(δ) 작용제 치료에 의해 구조된다. Dkk-1가 WNT7A에 영향을 미친다. 빌로발라이드가 WNT7A 발현을 강화시킨다(Kim et al., 2015a; Chandra et al., 2014; Ingaramo et al., 2016; Itesako et al., 2014; Liu et al., 2014a; MacLean et al., 2016; Mercer et al., 2014; Mercer et al., 2015; Xu et al., 2015b). WNT7A는 자궁경부암에서 하향조절되고 과메틸화된다. WNT7A는 폐암에서 소실된다. WNT7A는 자궁내막암에서 과발현된다(Ramos-Solano et al., 2015; Kim et al., 2015b; Liu et al., 2013). WNT7A 발현은 불량한 예후 및 불량한 환자 결과와 상관관계가 있다. WNT7A 프로모터 메틸화는 진행성 종양 병기, 원위 전이 및 E-카드헤린의 소실과 상관관계가 있다. 악성 흉막 중피종에서 WNT7A 발현의 감소는 전체 생존기간의 감소와 상관관계가 있으며 항암제 감수성 예측에 사용될 수 있다(Avgustinova et al., 2016; King et al., 2015; Kim et al., 2015b; Hirata et al., 2015). WNT7A는 비인두암에서 종양 억압인자일 수 있다(Nawaz et al., 2015).

발명의 상세한 설명

면역 반응 자극은 숙주 면역계가 외부 물질로 인식하는 항원의 존재에 의존한다. 종양 연관 항원의 발견은 숙주의 면역계를 종양 성장에 개입하는데 사용할 가능성을 제기했다. 면역계의 체액성 그리고 세포성 지류를 이용하는 다양한 기전이 현재 암 면역 치료에서 탐색되고 있다.

세포 면역 반응의 특정 요소는 종양 세포를 특정하게 인식하고 파괴하는 능력이 있다. 종양 침윤 세포 모집단 혹은 말초 혈액으로부터 T 세포의 분리는 그러한 세포가 암에 대한 자연 면역 방어에서 중요한 역할을 수행함을 시사한다. 특히 CD8-양성 T 세포는 세포질에 위치한 단백질이나 결손 리보솜 산물들(DRIPS)로부터 유래된 보통 8에서 10개의 주 조직적합 복합체(MHC)-포함 펩티드의 클래스 I 분자를 인지하며, 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC 분자는 또한 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지정된다.

"T 세포 반응"이란 용어는 특이적 증식과 시험관 내 또는 생체 내에서 유도되는 작용기 기능의 활성화를 의미한다. MHC 클래스 I 제한 세포 독성 T 세포의 경우, 효과기 기능이 펩티드 펄스, 펩티드 전조 펄스 또는 자연적 펩티드 제시 표적 세포들의 용해, 사이토킨의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 인터페론-γ, TNF-α, 또는 IL-2, 효과기 분자의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 그랜자임 또는 퍼로린 또는 탈과립일 수 있다.

"펩티드"란 용어는 여기서 이웃 아미노산의 α 아미노와 카보닐기 사이에 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 사용한다. 펩티드는 아미노산 9개의 길이가 바람직하지만 짧게는 아미노산 8개일 수도 있고 길게는 10, 11 또는 12개 이상일 수도 있으며, MHC 클래스 II 펩티드의 경우(본 설명의 펩티드의 연장된 변이) 그 길이가 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산일 수 있다.

더욱이 "펩티드"라는 용어는 α 아미노기와 이웃 아미노산의 카보닐기 사이의 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 아미노산 잔기의 서열에 의한 염을 포함한다. 바람직하게는 그 염은 예를 들어 염화물 또는 아세트산(삼불화아세트산) 염과 같은 약학적으로 허용가능한 펩티드의 염이다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 펩티드가 생체 내에서 염이 아니므로 생체 내 상태의 펩티드와는 실질적으로 다르다는 점을 유의해야 한다.

"펩티드"라는 용어는 "올리고펩티드"도 포함한다. 여기에서 "올리고펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 α 아미노기 및 카보닐기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 아미노산 잔기를 지정하는데 사용된다. 본 발명에서 올리고펩티드의 길이는 정확한 에피톱 또는 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 올리고펩티드는 일반적으로 약 30개 아미노산 잔기보다 길이가 짧고, 15개 아미노산보다 길다.

"폴리펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 α 아미노기 및 카보닐기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는데 사용된다. 본 발명에서 폴리펩티드의 길이는 정확한 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고 펩티드와 다르게, 폴리펩티드는 약 30개 아미노산 잔기 이상의 분자를 가지고 있는 것을 지칭한다.

이런 분자의 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드 코딩은 면역 반응을 유도할 수 있으면 "면역성"(따라서, 본 발명에서의 "면역원")이다. 본 발명의 경우, 면역성은 T 세포 반응을 유도하는 능력으로 특정하게 정의된다. 그러므로, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 본 발명의 경우, T 세포 반응을 유도할 수 있는 분자이다. 다른 양태에서, 면역원은 펩티드, 펩티드와 MHC의 복합체, 올리고펩티드 및/또는 특정 항체나 항체에 대한 TCR을 높이는데 사용되는 단백질일 수 있다.

클래스 I T 세포 "에피톱"은 적당한 친화력을 가진 MHC/펩티드 혼합물에 결합하는 T 세포 수용체에 일치하는 T 세포에 의해 인식되는 삼항 혼합물(MHC 클래스 I α 쇄, β-2-미세글로블린 및 펩티드)을 생성하는 클래스 I 또는 II MHC 수용체에 결합하는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 일반적으로 길이가 8 내지 14개 아미노산이며, 가장 일반적으로 길이가 9개 아미노산이다.

인간에는 MHC 클래스 I 분자를 인코딩하는 세 개의 유전자 자리가 있다(인간의 MCH-분자는 또한 지정된 인간 백혈구 항원이다(HLA)): HLA-A, HLA-B 및 HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 및 HLA-A*07은 이러한 유전자 좌에서 발현할 수 있는 다른 MHC 클래스 I 대립형질의 예이다.

표 6은 HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 및 HLA-B*44 혈청형의 발현 빈도 F를 나타낸다. 일배체형 빈도 Gf는 미국에서 650만 명이 넘는 자원 공여자의 레지스트리로부터 얻은 HLA형 결정 데이터를 사용한 연구에서 유래한다(Gragert et al., 2013). 일배체형 빈도란 개별 염색체 상의 뚜렷한 대립유전자의 빈도를 말한다. 포유동물 세포 내의 이배수 염색체 조합으로 인해, 이 대립유전자의 유전형 발생 빈도가 더 높으며 하디-와인버그 원칙(F = 1 - (1-Gf)²)을 사용하여 계산할 수 있다.

[표 6]

본 발명의 펩티드는 바람직하게 본 발명의 백신에 포함되면 여기서 설명된 바와 같이 A*02, A*01, A*03, A*24, B*07, B*08 또는 B*44에 결합한다. 백신은 또한 범결합 MHC 클래스 II 펩티드를 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 백신은 A*02-, A*01-, A*03-, A*24-, B*07-, B*08- 또는 B*44-양성인 환자에서 암의 치료에 사용할 수 있는 반면, 이러한 펩티드의 범결합 성격으로 인해 MHC 클래스 II 동종이형에 대한 선택이 필요하지 않다.

본 발명의 A*02 펩티드가 다른 대립유전자, 예를 들어 A*24에 결합하는 펩티드와 합쳐지면, MHC 클래스 I 대립자만을 해결하는 것에 비해 더 높은 비율의 환자 모집단을 치료할 수 있다. 하나의 대립 유전자로는 대부분의 모집단에서 50% 미만의 환자를 해결할 수 있는 반면, HLA-A*24 및 HLA-A*02 에피톱을 포함하는 백신은 모든 관련된 모집단에서 60% 이상의 환자를 치료할 수 있다. 구체적으로 다양한 지역에서 이러한 대립유전자의 적어도 하나에 양성인 환자의 비율은 다음과 같다: 미국 61%, 서유럽 62%, 중국 75%, 대한민국 77%, 일본 86%(www.allelefrequencies.net으로부터 계산했음).

[표 7]

유럽 백인 인구에서 HLA 대립유전자의 범위(계산 출처: (Gragert et al., 2013))

한 바람직한 실시양태에서 "뉴클레오티드 서열"이란 용어는 디옥시리보뉴클레오티드의 이종중합체를 말한다.

특정 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩은 자연적으로 발생하거나 합성 구축될 수도 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 인코딩하는 DNA 분절은 cDNA 단편들과 짧은 올리고 뉴클레오티드 링커, 또는 올리고 뉴클레오티드의 연속에서 미생물이나 바이러스 오페론에서 유도된 규제 요소를 가진 재조합 모사 단위에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공하기 위해서 조립된다.

여기서 사용되는 용어 "펩티드를 코딩(또는 인코딩)하는 뉴클레오티드"는 예를 들어, 수지상 세포 또는 TCR 제조에 유용한 다른 세포계에 의해 서열이 발현되는 생물학적 체계와 호환가능한 인공(사람이 만든) 시작 및 정지 코돈을 포함하는 펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩을 지칭한다.

여기서 사용되는 핵산 서열에 대한 지칭에는 한 가닥 및 두 가닥 핵산 모두가 포함된다. 그러므로, 예를 들어 DNA의 경우 특정 서열이란 환경에서 대안적으로 나타내지 않는 한, 이러한 서열의 한 가닥 DNA, 보완이 있는 이러한 서열의 중복(두 가닥 DNA) 및 이러한 서열의 보완을 지칭한다.

용어 "코딩 영역"은 자연적인 게놈 환경에서 유전자의 발현 생성물에 대해 자연스럽게 또는 정상적으로 코딩하는 유전자의 부분을 지칭한다(즉, 유전자 본래의 발현 생성물에 대한 생체 내 영역 코딩).

코딩 영역은 비변이("정상")이거나 변이 또는 개조된 유전자로부터 유래할 수 있거나, 또는 심지어 DNA 서열, 또는 실험실에서 DNA 합성의 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용해서 실험실에서 전적으로 합성된 유전자로부터 유래할 수 있다.

용어 "발현 생성물"은 유전자의 자연 번역 제품인 폴리펩티드 또는 단백질 또는 유전적 코딩 퇴화로 인해 결과된 어떤 핵산 서열 코딩과 상응하며 그러므로 같은 아미노산을 코딩한다.

코딩 서열을 말할 때, 용어 "단편"은 발현 제품이 완전한 코딩 영역의 발현 생성물과 같은 생물학적 기능이나 활동을 유지하는 완전한 코딩 영역보다 적은 부분의 DNA를 지칭한다.

용어 "DNA 분절"은 최소한 하나의 상당히 순수한 형태로 분리되는 DNA 에서 유도된 별도의 단편 또는 큰 DNA 구성의 구성 요소로써의 형태의 DNA 중합체를 말한다, 예를 들면, 내생 오염이 없고 분절의 식별, 조작 및 복구를 가능하게 하는 양 또는 농도이며 그 의 표준 생화학 방법에 따른 구성 요소 뉴클레오티드 서열은, 예를 들면, 복제 벡터이다. 이러한 분절은 일반적으로 진핵 생물 유전자에 존재하는 내부 비번역 서열, 또는 인트론에 의해 방해되지 않는 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공된다. 비번역 DNA 서열은 동일 서열이 코딩 영역의 조작이나 발현을 방해하지 않는 오픈 리딩 프레임의 하단에 나타날 수 있다.

용어 "프라이머"는 하나의 표준 DNA와 짝을 이룰 수 있는 짧은 핵산 서열을 의미하며 DNA 폴리머라아제가 디옥시리보 뉴클레오티드 쇄 합성을 시작하는 유리 3'-OH 말단을 제공한다.

용어 "프로모터"는 전사를 시작하기 위한 RNA 폴리머라아제의 결합에 관여하는 DNA 영역을 뜻한다.

용어 "분리"는 물질이 원래의 환경(예: 자연적으로 발생하는 경우에는 자연 환경)에서 제거되는 것을 뜻한다. 예를 들면, 자연 발생하는 살아 있는 동물에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 부분 또는 전체에서 분리되는 같은 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 제거된다. 그런 폴리뉴클레오티드는 벡터의 부분이며 또는 그런 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 구성의 한 부분일 수 있으며, 그런 벡터 또는 구성이 자연 환경의 한 부분이 아닐 때 여전히 격리될 수 있다.

본 발명에서 밝혀지는 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 또는 면역성의 폴리펩티드는 "정화" 상태 일수도 있다. 용어 "정제"는 절대적인 순도를 필요로 하지 않는다. 오히려, 그것은 상대적인 정의를 의도하며, 관련된 당업자들이 이해하는 용어로써 상당히 정제된 제조 또는 부분적으로 정제된 제조를 포함할 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리에서 분리된 각각의 클론은 전기 영동 동일성으로 통상적으로 정제된다. 시작 물질 또는 자연 물질의 최소한 하나 이상의 순서, 바람직하게는 2~3개 순서 및 더 바람직하게는 4~5개 순서의 크기로 정제가 명시적으로 심사숙고된다. 또한 바람직하게는 중량으로 99.999%, 또는 최소한 99.99% 또는 99.9%; 및 심지어는 바람직하게는 99%보다 큰 순도를 가진 특허청구범위에 기재된 폴리펩티드는 명시적으로 심사숙고된다.

본 발명에서 밝혀진 핵산과 폴리펩티드 발현 생성물은, 그런 핵산 및/또는 그런 폴리펩티드를 가진 발현 벡터뿐만 아니라, "강화된 형태"일 수 있다. 여기에서 사용되는 것처럼, 용어 "강화"는 물질의 농도가 최소한 그것의 자연적 농도(예를 들면)의 최소한 2, 5, 10, 100, 또는 1000배 정도이고, 유리하게는 0.01 중량%, 바람직하게는 최소한 약 0.1 중량% 정도임을 의미한다. 중량으로 약 0.5%, 1%, 5%, 10% 및 20% 강화된 제조 또한 계획한다. 서열, 구성, 벡터, 클론, 및 본 발명의 다른 물질들은 유리하게 강화된 또는 격리된 형태가 될 수 있다. 용어 "활성 단편"은 예를 들면 토끼 또는 쥐 및 인간을 포함한 포유류 같은 동물에게 따로 또는 선택적으로 적당한 보조제와 함께 또는 매개체로서 투여했을 때 면역 반응(즉, 면역성 활동이 있는)을 생성하고 인간과 같은 받는 동물 내에서 T 세포 반응을 자극하는 형태로 면역 반응을 나타내는 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 단편을 의미한다. 그렇지 않으면, "활성 단편"은 또한 시험관 내 T 세포 반응을 유도하기 위해서 사용될 수도 있다.

여기에서 사용되는, "부분", "분절" 및 "단편" 이라는 용어는, 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 서열이 더 큰 서열의 하위 집합을 형성하는 경우 아미노산 잔기와 같은 잔기의 지속적인 서열을 언급한다. 예를 들면, 만약에 폴리펩티드가 트립신이나 키모트립신 같은 일반적인 엔도펩티다아제 치료를 받는다면, 그런 치료로 인해 생기는 올리고펩티드는 폴리펩티드의 시작 부분, 분절 또는 단편을 나타낼 것이다. 폴리뉴클레오티드와 관련해서 사용될 때, 이러한 용어들은 일반적인 엔도뉴클레아제 중 어떤 것과 함께 상기 폴리뉴클레오티드의 치료에 의해 생성된 생성물을 지칭한다.

본 발명에 따라, 서열을 말할 때 용어 "백분율 동일성" 또는 "백분율 동등한"은 설명되거나 명시된 서열("기준 서열")에 비교될 서열의 정렬 후("비교 서열") 서열이 명시된 또는 설명된 서열에 비교되는 것을 말한다. 백분율 동일성은 하기 공식에 따라서 결정된다:

백분율 동일성 = 100 [1 -(C/R)]

상기 식에서,

C는 기준 서열과 비교 서열의 정렬의 길이에 비해 기준 서열과 비교 서열의 차이의 개수이되,

(i) 비교 서열에서 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산이 없는 기준 서열에 각 염기 또는 아미노산,

(ii) 기준 서열의 각 차이, 및

(iii) 비교 서열의 정렬된 기초 또는 아미노산과 다른 기준 서열에서 각 정렬된 염기 또는 아미노산은 차이를 구성하며,

(iv) 정렬은 정렬된 서열의 위치 1에서 시작해야 하고;

R은 비교 서열과의 정렬의 길이에 대한 기준 서열 염기 또는 아미노산의 수이고 기준 서열에 생긴 공백도 염기 또는 아미노산 개수로 계산된다.

만약에 위에서와 같이 계산된 비교 서열과 기준 서열 사이의 백분율 동일성이 특정 최소 백분율과 같거나 더 크면 위에서 계산된 백분율 동일성이 특정 백분율 동일성보다 작은 경우에 정렬이 있더라도 비교 서열은 기준 서열에 대해 특정한 최소 백분율 동일성이 있다.

위에서 언급된 바와 같이, 본 설명은 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 팹티드 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 대해 88% 상동성인 그 변이체 또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 그 변이체를 제공한다. 본 설명의 펩티드는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I의 분자에 결합하는 능력 또는 연장된 버전의 상기 펩티드가 클래스 II에 결합하는 능력을 갖는다.

본 발명에서, "상동"이라는 용어는 두 개의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 일치 정도를 일컷는다. 전술한 "상동"은 비교될 두 개의 서열을 최적 상태에서 나란히 정렬하여 비교하여 결정된다. 이러한 서열 상동 관계는 예를 들면 ClustalW 알고리즘을 이용하여 정렬을 만들어 계산할 수 있다. 일반적으로 사용이 가능한 서열 분석 소프트웨어, 더 구체적으로 벡터 NTI, GENETYX 또는 다른 도구들은 공용 데이터베이스에서 제공된다.

이 분야의 당업자는 특정 펩티드의 변이체에 의해서 유도된 T 세포가 그 펩티드 자체와 교차 반응할 수 있을지를 평가할 수 있을 것이다(Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

주어진 아미노산 서열의 "변이체"에 의해, 본 발명자들은 예를 들면, 하나 또는 두 개의 아미노 산 잔기의 측쇄가 변경되어(예를 들면 그들을 자연적으로 발생하는 다른 아미노산 잔기 또는 다른 측쇄로 교체) 그 펩티드가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772로 구성되는데 있어서 주어진 아미노산 서열로 구성되는 펩티드와 상당히 동일하게 HLA 분자에 여전히 결합할 수 있다.. 예를 들면, 펩티드 변형에 의해 HLA-A*02 또는 -DR과 같은 적합한 MHC 분자의 결합 홈과 상호 작용하여 결합하는 능력을 향상시키지는 않더라도 적어도 유지할 수 있으며 이에 따라 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력을 향상시키지 않더라도 적어도 유지한다.

이 T 세포들은 그 결과로 본 발명의 한 양태에서 정의가 된 바 있는 같은 혈족의 펩티드의 자연 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 상호 반응을 하고 그 세포들을 죽인다. 과학 문헌 및 데이터 베이스(Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997)에서 얻을 수 있듯이, HLA 결합 펩티드의 특정 위치는 전형적으로 HLA 수용기의 결합 모티프에 일치하는 핵심 고정 잔기이며 이는 결합 홈을 이루고 있는 폴리펩티드의 극성, 전기 물리성, 소수성 및 공간적 특성에 의해 정의된다. 따라서 이 분야의 당업자는 알려진 고정 잔기를 유지함으로써 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 정해진 아미노산을 변형할 수 있을 것이며 이러한 변이체들이 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 결합할 수 있는 능력을 유지할 수 있는지를 결정할 수 있어야 한다. 이 본 발명의 변이체는 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력을 유지하고, 이는 그 결과로 본 발명의 양태에서 같은 혈족의 펩티드라고 정의가 된 자연 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 상호반응을 하고 이들을 죽인다.

여기에서 밝혀진 본래 (변형되지 않은) 펩티드는 달리 언급되지 않는 이상 다른, 아마도 선택적인, 펩티드 쇄의 사이트의 하나 이상의 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있다. 바람직하게 이러한 치환은 아미노산 쇄의 끝에 위치한다. 그런 치환은, 예를 들면, 소수성의 아미노산이 다른 소수성의 아미노산으로 치환되는 것처럼, 한 아미노산이 구조 및 특성이 유사한 아미노산에 의해 치환됨으로써 그 성격이 보존적일 수 있다 심지어 더 보수적인 것은 류신이 이소류신으로 치환되는 것 같이, 같거나 비슷한 크기와 화학적 특성을 가진 아미노산으로 치환되는 것이다. 자연적으로 발생하는 동종 단백질의 종족에서의 서열 변화의 연구에서, 특정 아미노산의 치환은 다른 것들보다 더 자주 용납되고 있으며, 이들은 본래의 아미노산과 치환 사이에서 크기, 전하, 극성, 및 소수성이 비슷한 상관관계를 보이며, 이것은 "보수적 치환"를 정의하는데 기본이 된다.

여기서 보존적 치환은 아래의 다섯 개 그룹 중 하나의 교환으로 정의된다: 그룹 1- 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성의 잔기(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 그룹 2- 극성, 음전하를 가진 잔기와 그 아미드(Asp, Asn, Glu, Gln); 그룹 3- 극성, 양전하를 가진 잔기(His, Arg, Lys); 그룹 4- 큰, 지방족, 비극성 잔기(Met, Leu, Ile, Val, Cys); 및 그룹 5- 큰, 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp).

덜 보존적 치환은 알라닌을 이소류신 잔기로 치환하는 것처럼, 비슷한 성질이지만 크기가 어느 정도 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 아주 비보수적인 치환은 산성 아미노산을 극성, 또는 심지어 염기성 아미노산으로 치환하는 것을 포함할 수도 있다. 그러나 이러한 "급진적" 치환은 화학적 작용이 완전히 예측 불가능하고 급진적 치환은 단순한 화학 원리에서 예측 가능하지 않은 뜻밖의 발생이 있을 수 있기 때문에 효과가 없다고 기각할 수는 없다.

물론, 이런 치환은 일반적인 L-아미노산 외 다른 구조를 포함할 수 있다. 그러므로, D-아미노산이 본 발명의 항원 펩티드에서 흔히 발견되지만 여기에서 아직 공개가 되어야하는 L-아미노산을 치환할 수 있다. 또한, 비표준 아미노산(즉, 흔히 자연적으로 발생하는 단백질성 아미노산이 아닌) 역시 본 발명에 따라 면역원과 면역원성 폴리펩티드를 생산하기 위해서 치환 목적으로 사용될 수 있다.

아래에서 정의된 것과 상당히 동일하거나 더 큰 항원 활성이 있는 펩티드의 하나 이상의 위치에서 치환이 발견되면, 이러한 치환의 조합은 조합된 치환이 펩티드의 항원성에 추가적 효과 또는 시너지 효과의 결과를 내는지 결정하기 위해 시험된다. 최대한으로, 펩티드의 4개가 넘는 위치에서 동시에 치환될 수 없을 것이다.

여기서 명시한 바와 같이 아미노산 서열로 필수적으로 구성된 펩티드는, 인간 주조직 적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 또는 부정적으로 영향받지 않고, 하나 또는 두 개의 비앵커 아미노산(앵커 모티프에 대해서는 아래 참조)이 교환될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 여기서 명시한 바와 같이 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 펩티드에 있어서, 비변형 펩티드에 비해 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II의 분자에 결합하는 능력이 상당히 변경되거나 부정적으로 영향을 받지 않고, 하나 또는 두 개의 아미노산이 해당되는 보수적 교환 파트너들(아래 참조)과 교환될 수 있다.

T 세포 수용체와의 상호작용에 상당히 기여를 하지 않는 아미노산 잔기들은, 이와 결합됨으로써 T 세포의 반응성에 큰 영향을 주지 않고 관련된 MHC와의 결합을 제거하지 않는 다른 아미노산과의 교체에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 주어진 조건 외에도, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 그 한 부분 또는 주어진 변이체를 포함하는(발명자들이 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다고 일컷는) 어떠한 펩티드가 될 수도 있다.

[표 8]

다음 서열 식별 번호에 따른 펩티드의 변이체 및 모티프: 3, 225, 13, 17, 84, 108, 113, 114, 147, 36, 51, 172, 54, 및 57

더 긴(연장된) 펩티드도 적합할 수 있다. 또한 대개 길이가 8-11개의 아미노산이지만, MHC 클래스 I 에피톱이 더 긴 펩티드로부터 처리되는 펩티드 또는 실제 에피톱을 포함하는 단백질에 의해 생성될 가능성도 있다. 실제 에피톱이 양측에 있는 장기는 처리 동안 실제 에피톱을 노출하는데 필요한 단백질 분해에 의한 분할에 상당한 영향을 주지 못하는 잔기이다.

본 발명의 펩티드는 4개까지의 아미노산만큼 연장할 수 있는데 즉, 1, 2, 3 및 4개의 아미노산이 4:0과 0:4 사이에서 일체의 조합으로 양쪽 어디로든 추가될 수 있다. 본 발명에 따른 연장의 조합은 표 9에서 찾아볼 수 있다:

[표 9]

본 발명의 펩티드 연장의 조합

연장/확장을 위한 아미노산은 해당 단백질의 원래 서열의 펩티드나 기타 모든 아미노산일 수 있다. 연장은 펩티드의 안정성이나 가용성 강화를 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 에피톱은 자연적으로 발생하는 종양 관련 또는 종양 특정 에피톱과 동일하거나 또는 실질상 동등한 항원적 활동력을 가지고 있는 한, 참조 펩티드와 비교 시 4개 이하의 다른 잔기를 가지고 있는 에피톱을 포함한다.

다른 실시양태에 있어서 펩티드는 한쪽 혹은 양쪽에서 4개가 넘는 아미노산으로 연장되며, 바람직하게는 최대 30개의 아미노산 길이로 연장된다. 이는 MHC 클래스 II 결합 펩티드로 이어질 수 있다. MHC 클래스 II에 대한 결합은 당업계에서 알려진 방법으로 시험할 수 있다.

따라서, 본 발명은 MHC 클래스 I 에피톱의 펩티드와 변이체를 제공하며 여기서 펩티드 또는 이의 변이체는 전체 길이가 8 ~ 100이며, 바람직하게는 8 ~ 30이며, 가장 바람직하게는 8 ~ 14이며, 이는 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개의 아미노산이다. 연장된 클래스 II 결합 펩티드의 경우 그 길이는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 아미노산일 수도 있다.

물론, 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖게 된다. 펩티드 또는 이의 변이체의 MHC 복합체에 대한 결합은 당업계의 방법에 의해 시험할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드 특정 T 세포가 치환 펩티드에 대해 시험될 때, 치환 펩티드가 배경에 상대적으로 세포 용해의 최대 증가의 절반을 달성할 때의 펩티드 농도는 약 1 mM 이하, 바람직하게 약 1 μM 이하, 더 바람직하게 약 1 nM 이하, 여전히 더 바람직하게 약 100 pM 이하, 및 가장 바람직하게는 약 10 pM 이하이다. 치환 펩티드가 1명 이상, 최소 2명, 더 바람직하게는 3명의 개인으로부터의 T 세포에 의해 인식되는 것 또한 바람직하다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서 그 펩티드는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다.

"본질적으로 구성되는"이란 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 772의 어느 서열 또는 이 변이체 외에도 본 발명에 따른 추가적인 N- 및/또는 C-말단에 위치하고 있는 아미노산이 MHC 분자 에피톱에 대한 에피톱으로 기능하는 펩티드의 한 부분을 반드시 형성하지 않는 펩티드를 일컷는다.

그럼에도 불구하고, 이 길이의 아미노산은 본 발명에 따르면 세포 안으로의 효율적인 펩티드의 도입에 중요한 역할을 할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서는, 펩티드는 예를 들면 NCBI, GenBank Accession-number X00497에서 유도된 것처럼 HLA-DR 항원-결합 불변 쇄(p33, 다음의 "Ii")의 80개 N-말단 아미노산을 포함하고 있는 융합 단백질의 일부이다. 다른 융합에서는, 본 발명의 펩티드는 항체에 의해 특이적으로 표적이 될 수 있도록 여기서 설명된 상기 항체나 그 기능적 일부 특히 항체의 서열에 대해 또는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체에 대해 혹은 그 안으로 융합될 수 있다.

추가적으로, 펩티드 또는 이의 변이체는 안정성 및/또는 MHC 분자와의 결합성을 높여 더 강한 면역 반응을 일으킬 수 있도록 더욱 변형될 수 있다. 펩티드 서열의 최적화를 위한 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들면 반대 펩티드 결합 또는 비-펩티드 결합을 도입하는 것이 있다.

반대 펩티드 결합에서는 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 연결로 결합되어 있지 않으나 펩티드 결합이 반대로 되어있다. 이러한 역-인버스 펩티드 모방형 물질은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 생성될 수 있으며, 이 방법의 예는 이 문헌의 참조 문헌으로 포함된 Meziere 등(1997)(Meziere et al., 1997)이다. 이 방법은 백본의 변경을 포함하지만, 측쇄의 방향을 바꾸지 않는 유사펩티드를 만드는 것을 포함한다. Meziere 등(Meziere et al., 1997)은 MHC 결합과 T 조력 세포 반응에서 이 유사 펩티드가 유용하다는 것을 보여준다. CO-NH 대신에 NH-CO 결합을 포함하고 있는 역-인버스 펩티드는 단백질 가수 분해에 대한 저항력이 훨씬 높다.

비-펩티드 결합의 예는 -CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, 및 -CH₂SO-이다. 미국 특허 번호 4,897,445는 기본 과정을 거쳐 합성된 폴리펩티드와 아미노 알데히드와 아미노산을 NaCNBH₃ 존재 하에 반응시켜 생성된 비-펩티드 결합을 포함한 폴리펩티드 쇄의 비-펩티드 결합(-CH₂-NH) 고체상 합성의 방법을 제공한다.

위에서 기술된 서열을 가지고 있는 펩티드는 안정성, 생물가용성, 및/또는 펩티드의 결합을 증가 시키기 위해 추가적인 화학 그룹을 아미노 및 또는 카복시 말단에 결합할 수도 있다. 예를 들면, 카보벤족실, 단실, 또는 t- 부틸옥시카보닐 그룹 등의 수소성 그룹이 펩티드의 아미노 말단에 추가될 수 있다. 비슷하게, 아세틸 그룹 또는 9-플루오레닐메톡시-카보닐-그룹이 펩티드의 아미노 말단에 위치할 수도 있다. 또한, 수소성 그룹, t-부틸옥시카보닐, 또는 아미도 그룹 또한 펩티드의 카복시 말단에 추가될 수 있다.

또한, 이 발명의 펩티드는 그들의 입체 배치를 변화시키기 위해 생성될 수도 있다. 예를 들면, 펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 D-이성질체가 보통의 L-이성질체 대신에 사용될 수도 있다. 더 나아가서, 발명의 펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 비-자연적으로 일어나는 아미노산 잔기와 치환될 수도 있다. 이와 같은 변화는 안정성, 생물가용성, 및/또는 본 발명의 펩티드의 결합을 증가시킬 수 있다.

유사하게, 이 발명의 펩티드 또는 이의 변이체는 특정한 아미노산을 펩티드 생성 전 또는 후에 반응시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예는 이 분야에서 잘 알려져 있으며 예를 들어 이 문헌의 참조 문헌에 포함되어 있는 R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004(Lundblad, 2004)에 잘 묘사되어 있으며 여기에 참조문헌으로 포함된다. 아미노산의 화학 변형은 아실화, 아미딘화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화 반응, 아미노산의 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰화(TNBS)에 의한 트라이 니트로 벤질화, 카복실 그룹의 아미드 변형 및 퍼포민산에 의한 설피드릴 변형, 시스틴의 시스테릭산으로의 산화, 머큐리얼 유도체 생성, 다른 티올 합성의 다이설피드 생성, 말레이미드와의 반응, 요오드화 아세트산 또는 요오드 아세트 아미드에 의한 카복시메틸레이션 및 사이안산 염에 알칼리성 산도에서의 의한 카바밀화를 포함하지만 이에 국한 되지 않은 변형을 말한다. 이에 관해서, 당업자는 더 광대한 단백질의 화학 변형에 대한 방법론에 대해서는 Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000)(Coligan et al., 1995)의 15장을 참조하길 바란다.

간단히 말하면, 예를 들어 단백질의 아르기닌 잔기는 흔히 페닐글리옥산, 2,3-부탄디온 및 1,2-사이클로헥산디온과 같은 조처의 디카르보닐 화합물과의 반응에 근거하여 부가물을 형성한다. 다른 예는 메틸글로옥살과 아르기닌 잔기와의 반응이다. 시스테인은 리신과 히스티딘과 같은 다른 친핵성 좌의 동시 변형 없이 변형시킬 수 있다. 그 결과 다수의 시약들이 시스테인 변형에 사용 가능하다. Sigma-Aldrich(http://www.sigma-aldrich.com)와 같은 회사들의 웹사이트에서는 특정한 시약에 관한 정보를 제공하고 있다.

단백질에서 이황화 결합의 선택적 환원 또한 흔하다. 단백질에서 이황화 결합은 생물약제의 열 처리 동안 형성되어 산화될 수 있다. 우드워드의 시약 K는 특정 글루탐산 잔기의 변형에 사용될 수 있다. N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보디이미드를 사용하여 리신 잔기와 글루탐산 잔기 사이의 분자 내 가교를 형성할 수 있다. 예를 들어 디메틸카보네이트는 단백질에서 히스티딘 잔기의 변형을 위한 시약이다. 히스티딘은 4-히드록시-2-노네날을 사용하여 변형시킬 수 있다. 리신 잔기와 다른 α-아미노기의 작용은, 예를 들어, 펩티드의 표현 결합 또는 단백질/펩티드들의 가교에 유용하다. 리신은 폴리(에틸렌)글리콜의 부착의 부위이며 단백질의 당화에서 중요 변형 부위이다. 단백질에서 메티오닌 잔기는 예를 들어 이오도아세트아미드, 브로모에틸아민 및 클로르아민 T를 사용하여 변형시킬 수 있다.

테트라니트로메탄 및 N-아세틸이미다졸은 티로신 잔기의 변형에 사용할 수 있다. 디티로신의 형성을 통한 가교 형성은 과산화 수소/구리 이온으로써 성취할 수 있다.

트립토판의 변형에 대한 최근의 연구에서는 N-브로모숙신이미드, 브롬화 2-키드록시-5-니트로벤질 또는 3-브로모-3-메틸-2-(2-니트로페닐메르캅토)-3H-인돌(BPNS-스카톨)이 사용된 바 있다.

PEG를 이용한 치료용 단백질과 펩티드의 성공적인 변형은 흔히 동시 순환 반감기의 증가를 시키는 것과 연관되어 있는 반면, 단백질과 글루타르알데히드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트 및 포름알데히드와 교차 결합이 히드로겔의 준비에 사용된다. 면역 치료를 위한 알레르겐의 화학적 변형은 종종 칼륨 시안산염의 카바밀화와 관련이 있다.

펩티드 또는 이의 변이체, 여기에서 펩티드는 변환되었거나 또는 비-펩티드 결합을 포함하는 것이 본 발명 실시양태에서 바람직하다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 비자연적으로 발생하는 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되며 약학적으로 허용가능한 염으로 합성적으로 생산되었다(예: 합성되었다). 펩티드를 합성적으로 생성하는 방법들은 당업계에서 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 생체 내 상태(들)에서의 펩티드와 실질적으로 다르며, 이는 생체 내에서 생성된 펩티드는 염이 아니기 때문이다. 펩티드의 비자연적 염 형태는 특히 예를 들어 여기서 공개된 펩티드 백신과 같이 펩티드를 포함하는 약학 조성물의 맥락에서 상기 펩티드의 용해도를 매개한다. 치료할 시험대상자에게 펩티드를 효율적으로 제공하기 위해서는 충분하며 적어도 실질적인 펩티드(들)의 용해도가 요구된다. 바람직하게, 상기 염은 펩티드의 약학적으로 허용가능한 염이다. 본 발명에 따른 이러한 염에는 음이온으로 PO₄ ^3-, SO₄ ^2-, CH₃COO^-, Cl^-, Br^-, NO₃ ^-, ClO₄ ^-, I^-, SCN^-, 그리고 양이온으로 NH₄ ⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺ 및 Ba²⁺를 포함하는 계열의 염과 같은 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염이 포함된다. 특히 염은 (NH₄)₃PO₄, (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)H₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, NH₄CH₃COO, NH₄Cl, NH₄Br, NH₄NO₃, NH₄CIO₄, NH₄I, NH₄SCN, Rb₃PO₄, Rb₂HPO₄, RbH₂PO₄, Rb₂SO₄, Rb₄CH₃COO, Rb₄Cl, Rb₄Br, Rb₄NO₃, Rb₄CIO₄, Rb₄I, Rb₄SCN, K₃PO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂SO₄, KCH₃COO, KCl, KBr, KNO₃, KClO₄, KI, KSCN, Na₃PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂SO₄, NaCH₃COO, NaCl, NaBr, NaNO₃, NaCIO₄, NaI, NaSCN, ZnCI₂ Cs₃PO₄, Cs₂HPO₄, CsH₂PO₄, Cs₂SO₄, CsCH₃COO, CsCl, CsBr, CsNO₃, CsCIO₄, CsI, CsSCN, Li₃PO₄, Li₂HPO₄, LiH₂PO₄, Li₂SO₄, LiCH₃COO, LiCl, LiBr, LiNO₃, LiClO₄, LiI, LiSCN, Cu₂SO₄, Mg₃(PO₄)₂, Mg₂HPO₄, Mg(H₂PO₄)₂, Mg₂SO₄, Mg(CH₃COO)₂, MgCl₂, MgBr₂, Mg(NO₃)₂, Mg(ClO₄)₂, MgI₂, Mg(SCN)₂, MnCl₂, Ca₃(PO₄), Ca₂HPO₄, Ca(H₂PO₄)₂, CaSO₄, Ca(CH₃COO)₂, CaCl₂, CaBr₂, Ca(NO₃)₂, Ca(ClO₄)₂, CaI₂, Ca(SCN)₂, Ba₃(PO₄)₂, Ba₂HPO₄, Ba(H₂PO₄)₂, BaSO₄, Ba(CH₃COO)₂, BaCl₂, BaBr₂, Ba(NO₃)₂, Ba(ClO₄)₂, BaI₂ 및 Ba(SCN)₂으로부터 선택된다. 특히 바람직하기로는 예를 들어 염화물 또는 아세트산(트리플루오로아세트산) 염과 같은 NH 아세테이트, MgCl₂, KH₂PO₄, Na₂SO₄, KCl, NaCl 및 CaCl₂이다.

보통, 펩티드와 변이체(적어도 펩티드 링크를 아미노산 잔기 사이에 포함하는 것들)는 Lukas et al. 및 그 문헌의 참조 자료에서 기술된 바처럼 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드에서 합성될 수 있다. (Lukas et al., 1981) 그리고 여기에 인용된 참조문헌에서 공개된 Fmoc-폴리아미드 방식의 고체상 펩티드 합성에 의해 합성될 수 있다. 일시적인 N-말단 그룹 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)에 의해 제공된다. 이렇게 염기 불안정한 보호 그룹의 반복적인 절단은 N, N-디메틸포름아미드의 20% 피페리딘을 이용하여 이루어진다. 측쇄 기능은 부틸 에테르(세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 뷰틸 에스터(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카보닐 변이체(리신과 히스티딘의 경우), 트라이틸 변이체(아르기닌의 경우) 그리고 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 유도체(아르기닌의 경우)로서 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단의 잔기인 경우, 4,4'-디메톡시벤즈히드릴이 사용되어 측쇄 아미도 기능을 보호한다. 고체형 보조는 디메틸아크릴아미드(백본-단량체), 비스아크릴로일에틸렌 디아민(가교 결합) 및 아크 릴로일사르코신 메틸 에스터(기능 작용제)의 3개의 단량체로 만들어진 폴리디메틸-아크릴아미드 중합체에 기반을 둔다. 펩티드 대 레진 절단 가능 연결 작용제로 사용되는 것은 산-불안정 4-히드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 역 N,N-디사이클로헥실-카보다이이미드/1-히드록시벤조트리아졸에 의한 커플링 과정에 의해 추가되는 아스파라진과 글루타민을 제외하여 미리 생성된 대칭의 무수물 유도체로서 추가된다. 모든 커플링과 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 술폰산 또는 이소틴 실험 과정에 의해 모니터링된다. 합성 완성 시에, 펩티드는 레진 기반에서 50% 스캐빈저 믹스를 포함한 95% 트리플루오로아세트산에 의한 측쇄 보호 그룹 제거와 동시에 절단된다. 일반적으로 사용되는 스캐빈저에는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물이 포함되며, 정확한 선택은 합성되는 펩티드를 구성하는 아미노산에 따라 달라진다. 또한 펩티드의 합성에서 고체상 및 용액상의 조합 방식도 가능하다(예를 들어 (Bruckdorfer et al., 2004) 및 여기에 인용된 참조 문헌 참고).

트리플루오로아세트산은 진공하 증발에 의해 제거되며 그 이후 디에틸 에테르에 의한 분쇄로 조 펩티드를 얻는다. 존재하는 일체의 스캐빈저는 수성상의 냉동건조로써 스캐빈저가 없는 조 펩티드를 생성하는 간단한 추출 과정에 의해 제거된다. 펩티드 합성 시약들은 일반적으로 예를 들어 Calbiochem-Novabiochem(Nottingham, 영국)로부터 얻을 수 있다.

정제는 재결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 예를 들어 아세토니트릴/물 구배 분리를 사용하는 (대개) 액상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 기법의 하나 또는 그 조합에 의해 수행할 수 있다.

펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 전기 이동, 특히 모세관 전기 이동, 고체상 추출(CSPE), 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 산 가수분해 후 아미노산 분석 및 고속 원자 폭격 질량 분광분석, 및 MALDI와 ESI-QTOF 질량 분광분석 등에 의해 이루어진다.

질량 분석에 의한 HLA 리간드의 동정을 위해, 충격동결된 조직 샘플에서 얻어진 HLA 분자를 정화하고 HLA-연관 펩티드를 격리했다. 격리된 펩티드는 분리하여 그 서열을 온라인 나노-전기분무-이온화(nanoESI) 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS) 실험에 의해 식별했다. 난소암 샘플(N ≥ 80 샘플)로부터 기록된 자연적 종양 관련 펩티드(TUMAP)의 파편 패턴을 동등한 서열을 가진 상응하는 합성 참조 펩티드의 파편 패턴과 비교하여, 얻어진 펩티드 서열을 확인했다. 펩티드는 원발성 종양의 HLA 분자의 리간드로서 직접 식별되었기 때문에, 그 결과는 18명의 흑색종 환자에서 얻어진 원발 종양 조직에 대해 식별된 펩티드의 자연적 처리와 제시에 대한 직접적 증거를 제공한다(실시예 1 참고).

발견 파이프라인 XPRESIDENT® v2.1(예를 들어 전체가 여기에 포함되는 US 2013-0096016을 참고)은 몇 가지 다른 비암성 조직 및 기관에 비해 암 조직에 대한 HLA-제한 펩티드 수준의 직접적인 상대적 정량화를 기준으로 관련 있는 과도-제시된 펩티드 백신 후보의 식별과 선택을 허용한다. 이는 서열 식별, 스펙트럼 집락화, 전화 이온 계수화, 정체 시간 정렬, 상태 디컨볼루션 및 정상화에 필요한 알고리즘을 조합시킨 독점 데이터 분석 파이프라인에 의해 처리하여 획득한 LC-MS 데이터를 사용한 label-free 차등 정량화의 개발에 의해 성취되었다.

난소암 조직 샘플에서 얻은 HLA-펩티드 복합체를 정제하고 HLA-연관 펩티드를 LC-MS로 분리하여 분석했다. 원발성 난소암 샘플에 대한 이러한 접근 방식을 통해 본 출원에 포함된 모든 TUMAP를 식별했으며, 원발성 난소암에 대한 제시가 확인되었다.

펩티드의 과다제시 외에도, 기저 유전자의 mRNA 발현을 시험했다. 정상 조직 및 암 조직의 RNASeq 분석을 통해 mRNA 데이터를 획득했다(실시예 2, 도 1 참고). 코딩 mRNA가 암 조직에서 고도로 발현되지만 필수 정상 조직에서는 매우 낮거나 부재하는 단백질들로부터 유래된 펩티드는 본 발명에 바람직하게 포함되었다.

본 발명은 본 발명의 펩티드를 과다 또는 배타적으로 제시하는 암/종양, 바람직하게는 난소암의 치료에 유용한 펩티드를 제공한다. 이러한 펩티드는 질량분석에 의해 원발성 인간 난소암 샘플 상의 HLA 분자에 의해 자연적으로 제시되는 것으로 나타났다.

이 펩티드들이 유래된 다수의 출처 유전자/단백질("전장 단백질"이나 "기저 단백질"로도 지정됨)는 정상조직에 비해 암에서 고도로 과발현되는 것으로 나타났다(본 발명과 관련하여 "정상 조직"은 출처 유전자의 종양 연관 정도가 높은 것을 보여주는 건강한 난소 세포 또는 기타 정상 조직 세포를 의미한다(실시예 2 참고)). 더욱이 펩티드 자체는 종양 조직 상에서 강력히 과다제시된다(본 발명과 관련하여 "종양 조직"이란 난소암을 앓는 환자의 샘플을 의미한다).

HLA-결합된 펩티드는 면역계 특히 T 림프구에 의해서 인식될 수 있다. T 세포들은 인식되는 HLA/펩티드 복합물을 제시하는 세포들을 파괴하며, 예를 들면, 유도된 펩티드를 제시하는 난소암 세포이다.

본 발명의 펩티드는 T 세포 반응을 자극할 수 있으며/거나 과다제시되는 것으로 나타났으므로, 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR 특히 sTCR의 생산에 사용될 수 있다(실시예 3 및 4 참조). 더욱이 해당되는 MHC와 복합된 펩티드는 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR 특히 sTCR의 생산에도 사용될 수 있다. 해당 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있으며 해당 문헌에서도 찾을 수 있다(또한 하기 참고). 그러므로, 본 발명의 펩티드는 환자의 종양 세포를 파괴할 수 있는 면역 반응을 생성하는데 유용하다. 환자의 면역 반응은 설명된 펩티드의 직접적인 투여 또는 면역성을 강화할 수 있는 제제(즉, 보조제)와 섞인 적당한 전조 물질(예를 들면, 연장된 펩티드, 단백질, 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산)을 환자에게 투여하는 것으로 유도될 수 있다. 이런 치료적 백신에서 생긴 면역 반응은 본 발명의 목적 펩티드가 비교가능한 복사수로 정상 조직에서는 나타나지 않고, 환자의 정상 세포에 대한 기피되는 자기 면역 반응의 위험을 배제하기 때문에 종양 세포에 아주 특정할 수 있다.

본 설명은 α 쇄 및 β 쇄("α/β TCR")을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 또한 MHC 분자에 의해 제시되는 경우 TCR 및 항체에 결합할 수 있는 펩티드가 제공된다.

본 설명은 또한 HLA 분자에 의해 제시될 때 본 발명에 따른 펩티드 항원에 결합할 수 있는 본 발명에 따른 TCR의 단편들에 관한 것이다. 이 용어는 특히 예를 들어 막횡단 부분 및/또는 불변 부위가 누락된 TCR과 같은 가용성 TCR 단편, 단쇄 TCR 및 예를 들어 Ig와 같은 이에 대한 융합에 관한 것이다.

본 설명은 또한 본 설명의 TCR 및 펩티드를 발현하는 핵산, 벡터 및 숙주 세포; 그리고 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

용어 "T 세포 수용체"(약자로 TCR)는 α 폴리펩티드 쇄(α 쇄) 및 β 폴리펩티드 쇄(β 쇄)을 포함하는 이질이합체 분자를 지칭하며, 여기서 이질이합체 수용체는 HLA 분자에 의해 제시된 펩티드 항원에 결합하는 능력이 있다. 이 용어는 소위 γ/δ TCR 또한 포함한다.

한 실시양태에서, 본 설명은 여기서 기술된 대로 TCR의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은 TCR의 발현 촉진에 적합한 조건 하에서 TCR을 발현시킬 수 있는 숙주 세포의 배양을 포함한다.

본 설명은 다른 양태에서 본 설명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 그 항원이 적합한 항원 제시 세포 혹은 인공 항원 제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩되거나 항원/클래스 I 또는 II MHC 복합체 단량체의 사량체화에 의해 그 항원이 클래스 I 또는 II MHC 사합체 위에 로딩된다.

α/β TCR의 α 및 β 쇄 그리고 γ/δ TCR의 γ 및 δ 쇄는 일반적으로 각각 2개의 "도메인" 즉, 가변 및 불변 도메인을 갖는 것으로 간주된다. 가변 도메인은 가변 영역(V) 및 결합 영역(J)의 연쇄로 구성된다. 가변 도메인은 리더 영역(L) 또한 포함할 수 있다. β 및 δ 쇄 또한 다양성 영역(D)을 포함할 수 있다. α 및 β 불변 도메인은 또한 α 및 β 쇄를 세포막에 고정시키는 C-말단 막횡단(TM) 도메인을 포함할 수 있다.

γ/δ TCR에 대하여, 여기서 사용된 용어 "TCR γ 가변 도메인"은 리더 영역(L)이 없는 TCR γ V(TRGV) 영역과 TCR γ J (TRGJ) 영역의 연계를 지칭하며, 또한 용어 TCR γ 불변 도메인은 세포외 TRGC 영역이나 C-말단 절단된 TRGC 서열을 지칭한다. 마찬가지로 용어 "TCR δ 가변 도메인"은 리더 영역(L)이 없는 TCR δ V(TRDV) 영역과 TCR δ D/J(TRDD/TRDJ) 영역의 연계를 지칭하며, 용어 "TCR δ 불변 도메인"은 세포외 TRDC 영역이나 C-말단 절단된 TRDC 서열을 지칭한다.

본 설명의 TCR은 바람직하게는 결합 친화도(KD)가 약 100 μM 이하, 약 50 μM 이하, 약 25 μM 이하 혹은 약 10 μM 이하인 펩티드-HLA 분자 복합체에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 결합 친화도가 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 25 nM 이하를 갖는 고친화도 TCR이다. 본 발명의 TCR은 바람직한 결합 친화도 범위에 대한 제한되지 않는 예에는 약 1 nM ~ 약 10 nM, 약 10 nM ~ 약 20 nM, 약 20 nM ~ 약 30 nM, 약 30 nM ~ 약 40 nM, 약 40 nM ~ 약 50 nM, 약 50 nM ~ 약 60 nM, 약 60 nM ~ 약 70 nM, 약 70 nM ~ 약 80 nM, 약 80 nM ~ 약 90 nM 및 약 90 nM ~ 약 100 nM가 포함된다.

본 설명의 TCR와 관련하여 여기서 사용되는, "특이적 결합" 및 그 문법적 변형어는 100 μM 이하의 펩티드-HLA 분자 복합체에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는 TCR을 의미하는 것으로 사용된다.

본 설명의 α/β 이질이합체 TCR은 그 불변 도메인 사이에 도입된 이황화 결합을 가질 수 있다. 이러한 유형의 바람직한 TCR에는 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1이나 TRBC2 불변 도메인 서열을 갖는 것들이 포함되는데, 단 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1이나 TRBC2의 Ser 57이 시스테인 잔기로 교체는 경우는 예외로, 상기 시스테인은 TCR의 TRAC 불변 도메인 서열과 TRBC1이나 TRBC2 불변 도메인 사이에 이황화 결합을 형성한다.

위에서 언급한 도입된 쇄간 결합의 유무에 관계 없이, 본 설명의 α/β 이질이합체 TCR은 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1이나 TRBC2 불변 도메인 서열을 가질 수 있으며, TCR의 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1이나 TRBC2 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1이나 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이에 있는 자연 이황화 결합에 의해 연계될 수 있다.

본 설명의 TCR은 방사성핵종, 형광단 및 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다. 본 설명의 TCR은 방사성핵종, 화학요법제, 독소와 같은 활성 치료제에 접합될 수 있다.

한 실시양태에서, α 쇄에 적어도 1개의 돌연변이를 가지며/갖거나 β 쇄에 적어도 1개의 돌연변이를 갖는 본 설명의 TCR은 돌연변이되지 않은 TCR에 비해 변형된 당화를 갖는다.

한 실시양태에서, TCR α 쇄에 적어도 1개의 돌연변이를 가지며/갖거나 TCR β 쇄에 적어도 1개의 돌연변이를 갖는 TCR은 펩티드-HLA 분자 복합체에 대해 결합 친화도 및/또는 결합 반감기를 가지며, 이는 비돌연변이 TCR α 쇄 및/또는 비돌연변이 TCR β 쇄를 포함하는 TCR의 그것에 대해 적어도 2배이다. 종양 특이적 TCR의 친화도 강화 및 그 이용은 최적의 TCR 친화도에 대한 범위의 존재에 의존한다. 그러한 창의 존재는, HLA-A2 제한 병원체에 특이적인 TCR의 KD 값이 HLA-A2 제한 종양 관련 자가 항원에 특이적인 TCR에 대해 일반적으로 약 10배 낮다는 관찰에 근거한다. 현재 종양은 개인 자체의 세포로부터 발생하기 때문에 종양 항원이 면역성일 수 있음에도 불구하고, 돌연변이된 단백질이나 변형된 번역 처리를 가진 단백질만이 면역계에 의해 이물질로 보이게 된다. 상향조절되거나 과발현되는 항원(소위 자가 항원)이 반드시 종양에 대한 기능적 면역 반응을 유도하지는 않을 것이다: 이러한 항원에 고도로 반응성인 TCR을 발현하는 T 세포는 중추 관용으로 알려진 과정에서 흉선 내부로부터 음적으로 선택되었을 것이며, 자가 항원에 대해 낮은 친화도 TCR을 갖는 T 세포만 남는다는 것을 의미한다. 그러므로, 본 설명의 TCR이나 변이체에 대한 친화도는 다음에 설명된 바와 같이 당업계에서 잘 알려진 방법들로 강화되어 왔다.

본 설명은 또한 본 설명에 따른 TCR의 식별 및 분리 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 HLA-A*02 음성의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 A2/펩티드 단량체와 함께 배양, PBMC를 사합체-피코에리트린(PE)으로 배양 그리고 형광 활성화 세포 분류(FACS)-캘리버 분석에 의한 고결합성 T 세포의 분리를 포함한다.

본 설명은 또한 본 설명에 따른 TCR의 식별 및 분리 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 T 세포가 마우스 TCR 결핍을 보상하는 방대한 TCR 레퍼토리를 발현하는 전체 인간 TCRαβ 유전자 자리(1.1 및 0.7 Mb)를 이용한 유전자이전 마우스의 획득, 펩티드에 의한 마우스의 면역접종, 유전자전이 마우스로부터 얻어진 PBMC의 사합체-피코에리트린(PE)으로 배양, 그리고 형광 활성화 세포 분류(FACS)-캘리버 분석에 의한 고결합성 T 세포의 분리를 포함한다.

한 양태에서, 본 설명의 TCR을 발현하는 T 세포를 얻기 위해, 본 설명의 TCR-α 및/또는 TCR-β 쇄를 인코딩하는 핵산을 γ 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 발현 벡터로 클로닝한다. 재조합 바이러스를 생성한 다음 항원 특이성 및 기능적 결합성과 같은 기능성에 대해 시험했다. 다음에는 최종 생성물의 분취물을 사용하여 표적 T 세포 모집단(일반적으로 환자 PBMC로부터 정제된)을 형질도입하며, 모집단은 환자에 주입하기 전에 팽창시킨다.

또 다른 양태에서, 본 설명의 TCR을 발현하는 T 세포를 얻기 위해, 당업계에서 알려진 기법(예: 시험관 내 전사 시스템)으로 TCR RNA를 합성한다. 다음에는 시험관 내에서 합성된 TCR RNA를 종양 특이적 TCR-α 및/또는 TCR-β 쇄의 재발현을 위하여, 전기천공에 의해 건강한 공여자로부터 얻은 일차 CD8+ T 세포 내로 도입시킨다.

이러한 발현을 증가시키려면, 본 설명의 TCR을 인코딩하는 핵산을 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR), 거대세포바이러스(CMV), 쥐 줄기세포 바이러스(MSCV) U3, 포스포글리세레이트 키나제(PGK), β-액틴, 유비퀴틴 및 원숭이 바이러스 40(SV40)/CD43 복합 프로모터, 연장 인자(EF)-1a, 비장 포커스-형성 바이러스(SFFV) 프로모터와 같은 강력한 프로모터에 작동하도록 연계시킬 수 있다. 바람직한 한 실시양태에서, 이 프로모터는 발현되고 있는 핵산에 대해 이종이다.

강력한 프로모터 외에도, 본 설명의 TCR 발현 카세트가 도입 유전자 발현을 강화시킬 수 있는 추가의 요소를 포함할 수 있으며, 여기에는 렌티바이러스 구성(Follenzi et al., 2000)의 핵 전위를 촉진시키는 중추 폴리퓨린 관(cPPT), 그리고 RNA 안정성의 증가로 도입 유전자 발현을 증가시키는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절요소(wPRE)(Zufferey et al., 1999)가 포함된다.

본 발명의 TCR의 α 및 β 쇄는 별개의 벡터에 위치한 핵산에 의해 인코딩될 수 있거나 동일한 벡터에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다.

높은 수준의 TCR 표면 발현을 성취하려면 도입된 TCR의 TCR-α 및 TCR-β 쇄가 높은 수준으로 전사되는 것이 요구된다. 이를 위해서, 본 설명의 TCR-α 및 TCR-β 쇄를 단일 벡터에서 바이시스트로닉(bicistronic) 구성으로 클로닝할 수 있으며, 이는 이러한 장애를 극복할 수 있는 것으로 나타났다. TCR-α TCR-β 쇄 사이의 바이러스성 내재 리보솜 진입 부위(IRES)의 사용은 두 쇄의 조율된 발현을 초래하며, 이는 TCR-α 및 TCR-β 쇄가 번역 도중 단일 전사체로부터 생성되어 TCR-α 및 TCR-β 쇄의 동등한 몰비의 생산을 보장하기 때문이다(Schmitt et al., 2009).

본 설명의 TCR을 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화에 의해 숙주 세균의 발현을 증가시킬 수 있다. 유전자 코드의 반복성은 하나를 초과하는 코돈에 의해 일부의 아미노산 인코딩을 허용하지만, 일부 코돈은 다른 코돈에 비해 "최적" 미만이며 이것은 일치하는 tRNA 그리고 다른 요인들의 상대적 가용성 때문이다(Gustafsson et al., 2004). 각 아미노산이 포유류 유전자 발현을 위한 최적의 코돈에 의해 인코딩되도록 TCR-α 및 TCR-β 유전자 서열의 변경 그리고 mRNA 불안정성이나 잠재 스플라이스 부위의 제거는 TCR-α 및 TCR-β 유전자 발현을 유의하게 강화시키는 것으로 나타났다(Scholten et al., 2006).

더욱이, 도입된 TCR 및 내생 TCR 사이의 틀린 짝짓기는 자가면역성에 대해 유의한 위험을 제기하는 특이성의 획득을 초래할 수 있다. 예를 들어, 혼합된 TCR 이합체의 형성은 적절하게 짝지어진 TCR 복합체의 형성에 이용할 수 있는 CD3 분자의 수를 감소시킬 수 있으므로, 도입된 TCR을 발현하는 세포의 기능적 결합성을 유의하게 감소시킬 수 있다(Kuball et al., 2007).

틀린 짝짓기를 감소하기 위해 도입된 쇄의 내생 TCR과의 짝짓기 능력은 감소시키면서 쇄간 친화도를 촉진시키기 위해 본 설명의 도입된 TCR 쇄의 C-말단 도메인을 변형시킬 수 있다. 이러한 전략에는 인간 TCR-α 및 TCR-β C-말단 도메인을 이의 쥐 상대물(쥐 C-말단 도메인)로 교체, 제2 시스틴 잔기를 도입된 TCR의 TCR-α 및 TCR-β 쇄로 도입하여(시스틴 변형) C-말단 도메인의 제2 쇄간 이황화 결합의 생성, TCR-쇄 및 TCR-β 쇄의 C-말단 도메인(''놉-인-홀(knob-in-hole)'')에서 상호작용하는 잔기의 교환, 그리고 TCR-α 및 TCR-β 쇄의 가변 도메인을 CD3ζ에 직접 융합(CD3ζ 융합) 등이 포함될 수 있다(Schmitt et al., 2009).

한 실시양태에서, 숙주 세포는 본 설명의 TCR을 발현하도록 공학제조된다. 바람직한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 인간 T 세포나 T 세포 전구세포이다. 일부 실시양태에서, 이 T 세포나 T 세포 전구세포는 암 환자로부터 얻는다. 다른 실시양태에서, 이 T 세포나 T 세포 전구세포는 건강한 공여자로부터 얻는다. 본 설명의 숙주 세포는 치료할 환자에 대해 동종 또는 자가 세포이다. 한 실시양태에서, 숙주는 α/β TCR을 발현하도록 형질전환된 γ/δ T 세포이다.

"약학 조성물"이란 의학적 환경에서 인간에서 투여하기에 적합한 조성물이다. 바람직하게, 약학 조성물은 무균 상태이며 GMP 지침에 따라 생산된다.

약학 조성물은 유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 된 펩티드를 포함한다(위의 내용 참조). 여기서 사용되는 것처럼, "약학적으로 허용가능한 염"은 펩티드가 산 또는 제제의 염기 염을 만들며 변형되는 공개된 펩티드의 유도체를 말한다. 예를 들면, 산성 염은 적당한 산과의 반응을 가진 자유 염기(일반적으로 중성 NH2기가 있는 약물의 중성 형태)로부터 제조된다. 산 염을 준비할 때 적당한 산은 예를 들면, 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산 인산과 같은 같은 무기산 뿐만 아니라 초산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 수산, 말산, 말론산, 호박산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 계피산, 맨델릭산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산같은 유기산을 포함한다. 반대로, 펩티드에서 나타날 수 있는 산성 모이어티의 염기 염의 제조는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 트리메틸아민과 같은 약학적으로 허용가능한 염기를 사용한다.

특별히 바람직한 약학 조성물의 실시양태는 초산(아세트산염), 삼불화 초산 또는 염산(염화물)의 염으로의 펩티드를 가진다.

바람직하게는, 본 발명의 약제는 백신과 같은 면역치료제이다. 이는 환자의 영향을 받은 기관에 직접적으로 투여될 수 있거나 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.로서 전신에 투여되거나 또는 환자에게서 또는 나중에 환자에게 투여될 인간 세포주에 생체 외로 적용될 수도 있거나 또는 나중에 환자에게 다시 투여될 환자로부터 유래하는 면역 세포의 부분 집단에 시험관 내로 사용될 수도 있다. 만약 핵산이 시험관 내에서 세포에 투여 되면, 인터루킨-2와 같은 면역 유도 사이토카인과 함께 발현되는 것이 유용할 수도 있다. 펩티드는 상당히 순도가 높을 수도 있고, 또는 면역- 유도 보조제(아래 참조)와 합성되어 있거나 또는 면역-유도 사이토카인과 함께 합성체로 사용되거나, 또는 리포좀과 같은 적당한 전달 체계와 함께 투여될 수도 있다. 펩티드는 또한 keyhole limpet haemocyanin(KLH) 또는 mannan(WO 95/18145 및 (Longenecker et al(1993) 참조)과 같은 적당한 담체와 함께 복합될 수도 있다. 펩티드는 또한 꼬리표를 달거나, 융합 단백질이거나 혼성 분자일 수도 있다. 본 발명에 서열이 주어진 이 펩티드들은 CD4 또는 CD8 T 세포를 자극할 것으로 기대한다. 하지만 CD8 T 세포의 자극은 CD4 T 조력 세포에 의해 제공되는 조력의 존재에 더 효율적이다. 그러므로 CD8 CTL을 자극하는 MHC 클래스 I 에피톱의 경우, 융합 짝 또는 하이브리드 분자의 섹션은 CD4-양성 T 세포를 자극한다. CD4-와 CD8-자극유도 에피톱은 이 분야에서 잘 알려졌고 본 발명에서 식별된 것들을 포함한다.

한 양태에서, 이 백신은 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 772를 명시하는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩티드 그리고 적어도 하나의 추가적인 펩티드 바람직하게는 2개 내지 50개이고, 더 바람직하게는 2개 내지 25개이며, 보다 더 바람직하게는 2개 내지 20개이고 가장 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 펩티드를 포함한다. 펩티드(들)는 하나 또는 그 이상의 특정한 TAA에서 유도되었고 이는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 변이체를 인코딩하는 핵산(예를 들면 폴리뉴클레오 티드)에 대한 정보를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이의 조합일 수 있으며, 한 가닥 및/또는 이중 쇄로 되어 있을 수 있고, 또는 본래의 형일 수도 또는 예를 들면 포스포로티오에이트 백본을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드의 안정화된 형태로 되어 있을 수도 있으며, 펩티드를 코딩하는 한 인트론을 포함할 수도 또는 그렇지 않을 수도 있다. 물론, 자연적으로 발생하는 펩티드 결합에 의해 결합이 된 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드만이 폴리뉴클레오티드에 의해서 인코딩될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터에 대한 설명을 제공한다.

특히 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 예를 들면 보완 응집성 말단을 이용하여 연결하는 여러 가지 방법이 개발되었다. 예를 들면, 보완 동종중합체 트랙트가 벡터 DNA에 삽입될 DNA 분절에 추가될 수 있다. 벡터와 DNA 분절은 이후 보완 동종중합체 꼬리와 함께 수소 결합을 이용하여 재조합 DNA 분자를 형성할 수 있다.

하나 또는 그 이상의 제한 부위를 포함하는 합성된 링커는 DNA 분절과 벡터를 결합하는 다른 방법을 제시한다. 여러 가지의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 링커는 상업적으로 International Biotechnologies Inc.(New Haven, CN, USA)를 비롯한 곳에서 구입이 가능하다.

본 발명에서 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 변환하는 바람직한 방법은 Saiki RK 등(Saiki et al., 1988)에 의해 발표된 바 있는 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용한다. 이 방법은 예를 들면 적당한 제한 부위를 만들어 적당한 벡터로의 DNA 도입 또는 이 분야에서 알려져 있는 DNA를 다른 용도를 위해 변환하는데 사용될 수도 있다. 만약 바이러스 벡터가 사용된다면, 수두 또는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다.

DNA(또는 레트로 바이러스 벡터일 시, RNA)는 그 후 적당한 숙주에서 발현되며 이는 본 발명의 펩티드 또는 이의 변이체를 가지고 있는 폴리펩티드를 생성한다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 DNA는 알려진 기술과 여기에서 배울 수 있는 것과 함께 적당히 사용되어 적당한 숙주 세포를 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생성하는 것으로 형질전환을 시키는데 사용된다 이러한 기법은 예를 들어 다음에 공개되어 있다: 미국 특허 번호 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 및 4,810,648.

본 발명의 합성물을 만드는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우, RNA)는 많은 종류의 다른 DNA 서열과 결합되어, 적당한 숙주로의 도입을 유도할 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 특성, DNA를 숙주로 도입하는 방법, 및 에피소말 유지 또는 통합이 필요한 지에 따라 결정될 것이다.

일반적으로, DNA는 플라스미드와 같은 발현 벡터로 발현을 위한 적합한 방향 및 올바른 리딩 프레임에 맞추어 삽입된다. 필요할 경우, DNA는 바람직한 숙주에 의해 인식되는 적당한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열(하지만, 이 제어는 대부분의 경우 발현 벡터 내에 이미 존재한다)과 함께 연결될 수도 있다. 벡터는 그 후 숙주로 기본적인 기술을 통해 도입된다. 보통, 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되지 않는다. 따라서, 형질전환된 세포를 선택하는 것이 필요할 것이다. 하나의 선택 기술은 발현 벡터에 필요한 형질전환된 세포에서 선택이 가능한 예를 들면, 항생제 저항력과 같은, 제어 요소를 통합시키는 것이다.

다른 방법으로는, 이러한 선택이 가능한 특성이 다른 벡터에 있을 수도 있으며, 이는 바람직한 숙주 세포를 동시 형질전환하는데 사용된다.

본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주 세포는 충분한 시간 동안 적당한 상태에서 당업자에 의해서 배양되고 이는 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하며, 이는 후에 회복된다.

박테리아(예: 대장균(E. coli)과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모(예를 들면 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 사상균류(예를 들면 아스페르길스 스피시즈(Aspergillus spec.)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포 등의 많은 발현 체계가 알려져 있다. 바람직하게는, 그 체계는 ATCC Cell Biology Collection에서 구할 수 있는 CHO 세포와 같은 포유류 세포일 수 있다.

구조성 발현을 위한 전형적인 포유류 세포 벡터 플라스미드는 CMV 또는 SV40 촉진제와 적당한 폴리 A 꼬리 및 네오마이신과 같은 저항 표지자를 포함한다. 하나의 예는, Pharmacia(미국 뉴저지주 Piscataway)에서 구할 수 있는 pSVL이다. 유도가능 포유류 발현 벡터의 예는 pMSG이며 이 또한 Pharmacia에서 구할 수 있다. 유용한 효소 플라스미드 벡터는 pRS403-406과 pRS413-416이며 이는 대부분 Stratagene Cloning Systems(미국 캘리포니아주 La Jolla 92037)에서 구할 수 있다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효소 통합 플라스미드(YIps)이며 이는 효소 선택 표지자 HIS3, TRP1, LEU2와 URA3을 통합한다. 플라스미드 pRS413-416는 효모 동원체 플라스미드(Ycps)이다. (예를 들면 Sigma-Aldrich로부터 입수한), CMV 프로모터 기반 벡터는 일시적인 또는 안정된 발현, 세포질 발현 또는 분비, 및 FLAG, 3xFLAG, c-myc 또는 MAT 등의 다양한 조합으로 N-말단 또는 C-말단 표지 등을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 재조합 단백질의 검출, 정제와 분석을 가능하게 한다. 듀얼-태깅된 융합은 검출의 유연성을 제공한다.

강한 인간 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터 조절 영역은 구성적인 단백질 발현 수준을 높게는 COS 세포에서 1mg/L까지 구동시킨다. 좀 더 효능이 약한 세포주에서는, 단백질 수준이 전형적으로 약 0.1mg/L 정도이다. SV40 복제 원점이 있음으로서 SV40, 복제를 가능하게 하는 COS 세포 DNA 복제의 수준이 높은 결과를 낳는다. CMV 벡터는 예를 들면 세균 세포에서의 복제를 위한 pMB1(pBR322의 유도체) 기원, 즉, 세균, hGH polyA 및 f1 원천에서 암피실린 내성 선택에 필요한 b-락타마아제를 포함할 수 있다. 프리-프로-트립신 리더(PPT) 서열을 포함하는 벡터는 FLAG 융합 단백질을 ANTI-FLAG 항체, 수지 및 플레이트를 사용하여 정제하기 위한 배양 배지로 분비하도록 방향을 정할 수가 있다. 다른 벡터와 발현 체계는 여러 가지의 숙주 세포 사용에 대해 널리 알려져 있다.

다른 실시양태에서는 본 발명의 2개 이상 펩티드나 펩티드 변이체가 인코딩 됨으로써 연속적인 순서로 발현된다("줄로 엮은 유리알" 구조와 유사). 그렇게 함으로써 펩티드나 펩티드 변이체는 예를 들어 LLLLLL과 같은 링커 아미노산의 퍼짐에 의해 함께 연결 또는 융합될 수 있으며 또한 그 사이에 추가의 펩티드 없이 연결될 수 있다. 이러한 구조들은 암 요법에서도 사용할 수 있으며 MHC I 및 MHC II 모두가 연관되는 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구성에 의해 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 세균 세포가 일부의 상황에서 바람직한 원핵 숙주 세포일 수 있으며, 보통 예를 들면 Bethesda Research Laboratories Inc.(미국 메릴랜드주 Bethesda)에서 구할 수 있는 E. coli 균주 DH5, 그리고 American Type Culture Collection(ATCC)(미국 메릴랜드주 Rockville, No ATCC 31343)의 RR1과 같은 E. coli 균주이다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효모, 곤충, 포유류 세포를 포함하고, 생쥐, 쥐, 원숭이 또는 인간 섬유아세포와 대장 세포주 등의 척추 동물 세포가 바람직하다. 효모 숙주 세포는 YPH499, YPH500 및 YPH501를 포함하며, 이는 대부분 Stratagene Cloning Systems(미국 캘리포니아주 La Jolla, 92037)에서 구입이 가능하다. 바람직한 포유류 숙주 세포는 ATCC에서 구입이 가능한 CCL61로 알려져 있는 중국 햄스터 난소 세포, CRL 1658로 알려져 있는 스위스 생쥐 배아 세포 NIH/3T3, CRL 1650 세포로 알려져 있는 원숭이 신장 유도 COS-1 세포와 293 세포로 알려져 있는 인간 배아 신장 세포를 들 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf9 세포이며 이는 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 세포로 감염될 수 있다. 발현을 위한 적당한 숙주 세포의 선택에 대한 개관은 예를 들면 Paulina Balbas and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9 및 당해 분야의 숙련자에게 공지된 문헌에서 찾을 수 있다.

적당한 세포 숙주를 본 발명의 DNA 구성으로 형질전환하는 것은 보통 사용되는 벡터의 유형이 따라 결정되는 잘 알려진 방법으로 완성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 대해서는 예를 들면 Cohen 등(Cohen et al., 1972) 및 (Green and Sambrook, 2012)을 참조한다. 효모 세포의 형질 전환은 Sherman 등(Sherman et al., 1986)에 나와 있다. Beggs의 방법 또한 유용하다(Beggs, 1978). 척추 동물 세포에 대해서는, 이러한 세포의 형질주입에 유용한 시약, 예를 들면 칼슘 인산염과 DEAE-덱스트란 또는 리포좀 공식에 대한 내용은 Stratagene Cloning Systems, 또는 Life Technologies Inc.(미국 메릴랜드주 Gaithersburg 20877)에 나와 있다. 전기 천공법 역시 형질전환 또는/및 세포를 감염시 키는데 유용하며 이는 효소 세포, 박테리아 세포, 곤충세포 및 척추동물 세포 형질전환에 잘 알려져 있다.

성공적으로 형질전환이 된 세포는, 즉 본 발명의 DNA 구성을 가지고 있는 세포는, 잘 알려진 PCR과 같은 기술로 식별된다. 다른 방법으로는, 상청액에 존재하는 단백질은 항생제를 사용함으로써 검출될 수 있다.

본 발명의 특정한 숙주 세포, 예를 들면 박테리아, 효소 및 곤충 세포와 같은 세포는 본 발명의 펩티드의 준비에 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 하지만, 다른 숙주 세포 또한 특정한 치료 방법에 유용할 수도 있다. 예를 들면, 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포는 적당한 MHC 분자에 적재가 되도록 하는 본 발명의 펩티드를 발현하는데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 핵산 또는 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 항원 제시 세포이며, 특히 수지상 세포 또는 항원 제시 세포이다. 전립선산 인산효소(PAP)를 포함하는 재조합 융합 단백질로써 적재된 APC가 무증상이나 최소 증상의 전이성 HRPC(Sipuleucel-T)의 치료를 위해 2010년 4월 29일 미국 식품의약품청(FDA)에 의해 승인되었다(Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

본 발명의 다른 양태는 펩티드 또는 그의 변이체의 숙주 세포를 배양하고 펩티드를 숙주 세포 또는 배지에서 격리하는 것을 포함한 생산 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서는, 본 발명의 펩티드, 핵산 또는 발현 벡터가 의학에서 사용된다. 예를 들어, 펩티드나 그 변이체는 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복강내(i.p.) 주사, 근육내(i.m.) 주사용으로 제조될 수 있다. 펩티드 투여의 바람직한 방법은 s.c., i.d., i.p., i.m., 및 i.v. 투여를 포함한다. DNA 투여의 바람직한 방법은 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.투여를 포함한다. 펩티드 또는 DNA의 50 μg 내지 1.5 mg, 바람직하게는 125 μg 내지 500 μg의 용량이 각각의 펩티드 또는 DNA에 따라서 투여될 수 있다. 이러한 범위의 용량이 이전의 임상시험에서 성공적으로 사용된 바 있다(Walter et al., 2012).

면역 접종에 사용된 폴리뉴클레오티드는 상당히 순도가 높거나 적당한 벡터 또는 전달 체계에 포함되어 있을 수 있다. 핵산은 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 핵산을 설계하고 도입하는 방법은 이 업계에 잘 알려져 있다. 개요는 예를 들어,Teufel 등에 제공되어 있다(Teufel et al., 2005). 폴리뉴클레오티드 백신은 만들기가 쉽지만, 이들 벡터의 면역 반응을 유도하는 동작 모드는 완전히 이해가 되지 않았다. 적당한 벡터와 전달 체계는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노 연관 바이러스 또는 한 개 이상의 바이러스를 포함하는 혼성체 등의 바이러스 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 비-바이러스 전달 체계는 양이온 지질과 양이온 중합체를 포함하고 있으며 DNA 전달 분야에서 잘 알려져 있다. "유전자 총"과 같은 물리적 전달 또한 사용될 수 있다. 펩티드 또는 핵산에 의해 인코딩 된 펩티드는 융합 단백질이 될 수도 있고, 예로서는 위에서 언급한 각각의 반대 CDR을 위한 T 세포를 유도하는 에피톱을 들 수 있다.

본 발명의 약제는 하나 또는 그 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 면역 반응을 비특이적으로 향상시키거나 강력하게 하는 물질이다(예: 항원에 대한 CD8-양성 T 세포 및 조력 T(TH) 세포에 의해서 중재된 면역 반응). 따라서, 본 설명에서 보조제는 유용한 약제 구성이라고 간주할 수 있다. 적당한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스(), AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린 또는 플라젤린에서 유도된 TLR5 리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(ALDARA®), 레스퀴미드, ImuFact IMP321, IL-2, IL-13, IL-21과 같은 인터루킨, 인터페론 α 또는 β, 또는 이들의 페길화된 유도체, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, 주브이뮨(JuvImmune), LipoVac, MALP2, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 유중수형과 수중유형 에멀전, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® 벡터 시스템, PLG와 덱스트란 극미립자, 탈락토페린, SRL172, 비로솜(Virosomes) 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, β글루칸, Pam3Cys, 사포닌에서 유도된 아퀼라스 QS21 스틸물론, 마이코박테리아 추출물과 합성 세균의 세포 벽 모방제, 및 다른 리비의 데톡스(Ribi's Detox), 쿠일(Quil), 또는 수퍼포스(Superfos)와 같은 독점 보조제 등이 있다. Freund's 또는 GM-CSF와 같은 보조제가 바람직하다. 여러 면역적 보조제(예: MF59)는 수지상 세포에 특이적이고, 그 제조 방법은 이전에 설명된 바 있다(Allison and Krummel, 1995). 또한, 사이토킨도 사용될 수 있다. 여러 사이토킨은 수지상 세포의 림프 조직으로의 이동에 영향을 주는데 직접적으로 연관된 바 있으며(예: TNF-), 이는 수지상 세포의 더 효율적인 T 림프구에 대한 항원 제시 세포로의 성장을 가속시키고(예: GM-CSF, IL-1 및 IL-4) (미국 특허 번호 5,849,589, 구체적으로 여기에 그 전문이 참조 문헌으로 포함됨) 면역보조제의 역학을 한다(예: IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-α. IFN-β)(Gabrilovich et al., 1996).

CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드는 백신 환경에서 보조제의 효율성을 높이는 것으로 나타났다. 이 이론에 국한하지 않고, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체(TLR), 특히 TLR9를 통해 천성(비-적응) 면역 체계를 활성화시킨다. CpG에 의해 유도된 TLR9의 활성화는 펩티드 또는 단백질 항원, 살아 있거나 죽은 바이러스, 수지성 세포 백신, 자가 세포 백신 및 예방적 및 치료적 백신의 다당류 접합체를 포함한 넓은 종류의 항원에 대한 항원 특이적 체액성 및 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요하게 이는 수지상 세포의 성숙 및 차별화를 향상시키고 이는 TH1 세포의 활성화를 향상시키며 강한 세포독성 T 림프구(CTL) 생성을 CD4 T 세포의 도움이 없을 때에도 향상시킨다. TLR9 자극에 의해 일어난 TH1 바이러스는 보통 TH2 바이러스를 촉진시키는 alum 또는 비완성된 프로인트 보조제(Freund's adjuvant(IFA))와 같은 백신 보조제가 존재할 때도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 다른 보조제와 함께 제조되거나 함께 투여될 시 또는 특히 항원이 상대적으로 약할 때 강한 반응을 얻어 내기 위해 필요한 미세입자, 나노입자, 지질 에멀전 또는 비슷한 제약으로 되어 있을 경우 더 큰 보조제 활동을 보인다. 그들은 또한 면역 반응을 가속화시키고, 여러 연구에서 보여진 바 있듯이 CpG가 없을 때 백신 전체 용량이 일으키는 항체 반응 수준으로 항원의 용량을 약 두 배 정도 줄일 수 있도록 한다(Krieg, 2006). 미국 특허 번호 6,406,705 B1은 CpG 올리고뉴클레오티드, 비핵산 보조제 및 항원 특정 면역 반응을 일으키는 항원의 병용에 대해 설명한다. CpG TLR9 길항제는 Mologen(Berlin, Germany)에 의해 만들어진 dSLIM(double Stem Loop Immunomodulator)이며 이는 본 발명의 제약 조성의 바람직한 성분이다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9 등의 다른 TLR 결합 분자 또한 사용이 가능하다.

다른 유용한 보조제의 예는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 화학적으로 변형된 CpGs(예: CpR, Idera), Poly(I:C)와 같은 dsRNA 유사체 및 AmpliGen, 면역활성적인 작은 분자 및 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA 및 사이클로포스아미드, 수니티닙, 베바시주맙, 셀레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라페닙, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, XL-999, CP-547632, 파조파닙, VEGF 트랩, ZD2171, AZD2171, 안티-CTLA4 및 SC58175와 같은 항원을 들 수 있으며 이는 치료적으로 또는 보조제의 역할을 할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 보조제와 첨가제의 양과 농도는 특별히 다른 실험할 필요 없이 기술이 뛰어난 개인에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.

바람직한 보조제들은 항-CD40, 이미퀴모드, 레시퀴모드, GM-CSF, 사이클로포스파마이드, 수리티닙, 베바시주맙, 인터페론-α, CpG, 올리고뉴클레오티드 및 유도체, poly-(I:C) 및 유도체, RNA, 실데나필, 그리고 PLG 혹은 비로솜 미립자 제제이다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 실시양태에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니-자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 인테페론-α같은 콜로니-자극 인자로 구성된 군에서 선택된다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 실시양태에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니-자극 인자(GM-CSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 및 레시퀴모드와 같은 콜로니-자극 인자로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 실시양태에서, 보조제는 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 또는 레시퀴모드이다. 훨씬 더 바람직한 보조제는 Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC(Hiltonol®) 및 anti-CD40 mAB 또는 이들의 조합들이다.

이 조성물은 피하, 피부내, 근육내와 같은 비경구 투약 또는 경구 투약에 사용된다. 이를 위해, 펩티드 그리고 임의적으로 다른 분자들을 약학적으로 허용되는, 바람직하게는 수용성 담체에 용해 또는 현탁한다. 추가로, 이 조성물은 완충제, 결합제, 발파제, 희석제, 향미료, 윤활제 등의 부형제를 포함할 수 있다. 또한 펩티드는 사이토킨 같은 면역 자극 물질과 함께 투여될 수 있다. 이러한 성분에 사용될 수 있는 방대한 부형제 목록은 예를 들어 A. Kibbe, 약학적 부형제 핸드북(Kibbe, 2000)에서 확인할 수 있다. 이러한 조성물은 선종성 또는 암성 질병의 방지, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 예시적 제제는 예를 들어 EP2112253에서 찾아볼 수 있다.

본 발명에 따른 백신에 의해 일어나는 면역 반응이 다른 세포 단계 및 다른 개발 단계에서는 암을 공격한다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 더욱이, 암과 연관된 다른 신호전달 경로가 공격을 받는다. 이것은 단 하나 또는 여러 표적만을 다루는 백신에 비해 이점이며, 이로 인해 종양이 공격에 쉽게 적응(종양 탈출)하도록 유발할 수 있다. 더욱이, 모든 개별 종양들이 같은 패턴의 항원을 발현하는 것은 아니다. 그러므로 종양 연관된 여러 펩티드들의 조합은 모든 개별 종양이 적어도 표적의 일부를 갖도록 보장한다. 이 조성물은 각 종양이 여러 항원을 발현하도록 예상되며 또한 종양 성장 및 유지에 필요한 여러 독립적 경로를 다루도록 설계되었다. 그리하여 백신은 보다 큰 환자 모집단을 위해 "기성품으로" 쉽게 사용이 가능하다. 이는 백신으로 치료할 환자의 사전 선택을 HLA 형결정으로 제한할 수 있고, 항원 발현을 위해 어떠한 추가의 바이오마커 평가를 요구하지 않음을 의미하지만, 효능에 중요한 여러 표적들이 유도된 면역 반응에 의해 동시적으로 공격됨을 여전히 보장한다(Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

여기서 사용된 "골격"이란 용어는 (예: 항원성) 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 말한다. 한 실시양태에서, 골격은 그것이 부착되는 객체를 (예: (제2) 항원 결합 모이어티) 표적 부위, 예를 들어 특정 유형의 종양 세포 또는 항원성 결정인자를 갖는 종양 기질(예: 현재 용도에 따른 MHC와 펩티드의 복합체)로 향하도록 지시할 수 있다. 또 다른 실시양태에서 골격은 그 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 골격은 항체 및 그 단편, 항체 중쇄 변수 영역 및 항체 경쇄 변수 영역을 포함하는 항체의 도메인에 결합하는 항원, 적어도 하나의 안키린 반복 모티프 및 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자를 포함하는 결합 단백질, 압타머, (가용성) TCR 그리고 동종 또는 자가 T 세포와 같은 (변형된) 세포를 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다. 어떤 분자가 표적에 결합하는 골격인지 평가하기 위해, 결합 분석을 수행할 수 있다.

"특이적" 결합이란 그 골격이 다른 자연적으로 발생하는 펩티드-MHC 복합체보다 관심 대상의 펩티드-MHC 복합체에 더 잘 결합하며, 그 정도는 특정 표적이 포함된 세포를 줄일 수 있는 활성 분자로 무장한 골격이 특정 표적이 없는 다른 세포는 죽일 수 없으며 다른 펩티드-MHC 복합체를 제시하는 것을 의미한다. 교차반응성 펩티드-MHC의 펩티드가 자연적으로 발생하지 않는다면, 즉, 인간 HLA-펩티돔으로부터 유래되지 않는다면, 다른 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 관련이 없다. 표적 세포 살해를 평가하는 검사는 당업계에 잘 알려져 있다. 이 검사는 변경되지 않는 펩티드-MHC 제시를 가진 표적 세포(일차 세포 혹은 세포주) 또는 자연적으로 발생되는 펩티드-MHC 수준이 도달되는 정도로 펩티드가 포함된 세포를 사용하여 수행해야 한다.

각 골격은 라벨이 제공하는 신호의 존재나 부재를 판단함으로써 결합된 골격이 검출 가능하도록 제공하는 라벨링을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 골격은 형광 염료나 임의의 다른 해당되는 세포 표지자 분자를 사용하여 라벨링이 가능하다. 그러한 표지자 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 형광 라벨링은(예를 들어 형광 염료에 의해 제공되는) 형광이나 레이저 스캐닝 현미경 또는 유세포 분석에 의해 결합된 압타머의 가시화를 제공할 수 있다.

각 골격은 IL-21, 항-CD3, 항-CD28과와 같은 제2 활성 분자와 접합될 수 있다. 폴리펩티드 골격에 대한 추가 정보는 예를 들어 WO 2014/071978A1의 배경 부분과 거기에 인용된 참조문헌을 참고한다.

본 발명은 또한 압타머에 관한 것이다. 압타머란(예는 WO 2014/191359 및 여기에 인용된 문헌을 참조) 정의된 삼차원적 구조로 접힐 수 있으며 특정 표적 구조를 인식할 수 있는 짧은 단일 핵산 분자이다. 이것은 표적 요법의 개발에 필요한 적합한 대안인 것으로 보여진 바 있다. 압타머는 높은 친화도 및 특이성으로 다양한 복합체 표적에 선택적으로 결합하는 것으로 나타난 바 있다.

세포 표면에 위치한 분자를 인식하는 압타머들이 지난 십 년 동안 식별되었으며 진단 및 치료 접근 방식을 개발하기 위한 수단을 제공한다. 압타머가 독성 및 면역원성을 거의 보유하지 않는 것으로 나타났으므로, 생의학적 용도를 위한 유력한 후보이다. 실제로 압타머, 예를 들어 전립선 특이적 막-항원을 인식하는 압타머는 표적 대상의 요법을 위해 성공적으로 사용되어 왔으며 또한 생체 내 모델에서의 이종이식에 기능적인 것으로 나타난 바 있다. 더욱이, 특이적 종양 세포주를 인식하는 압타머가 식별된 바 있다.

DNA 압타머는 다양한 암 세포 그리고 특히 고형 종양으로부터 유래하는 것들을 위한 광범위 인식 성질을 밝히기 위해 선택가능한 반면에, 비종양형성의 그리고 원발성의 건강한 세포는 인식되지 않는다. 식별된 압타머가 특이적 종양 아형을 인식할 뿐만 아니라 일련의 종양과 상호작용한다면, 이로 인해 압타머는 소위 광범위 진단 및 치료에 적용될 수 있다.

더욱이, 유세포 분석을 사용한 세포 결합 거동의 조사에 의하면 압타머는 나노몰 범위에서 매우 양호하고 뚜렷한 친화성을 드러내는 것으로 나타났다.

압타머는 진단 및 치료 목적으로 유용하다. 더욱이, 일부 압타머를 종양 세포가 취하며 그리하여 종양 세포 안으로의 siRNA와 같은 항암제의 표적 인도를 위한 분자 부형제로서 기능이 가능할 수 있다.

압타머는 세포와 조직 그리고 바람직하게는 현재 본 설명에 따른 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772의 어떤 것에 따른 서열로 구성되며 이를 포함하는 펩티드나 TCR과 MHC 분자와의 복합체에 대하여, 세포 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기법을 사용하여 선택이 가능하다.

본 발명의 펩티드는 MHC/펩티드 합성물에 대한 특정 항체를 생성하고 개발하는데 사용될 수 있다. 이들은 병변 조직에 치료, 독성 물질 표적화 또는 방사능 물질로 사용될 수 있다. 이런 항체의 또 다른 사용은 PET 같은 이미지 목적을 위해 병변 조직의 방사성 핵종을 표적화 할 수도 있다. 이 사용은 작은 전이를 검출하거나 병든 조직의 크기와 정확한 위치를 결정하는데 도움이 될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합되는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합하는 재조합 항체의 생산 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 가용성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자로써 상기 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 분리; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 적어도 하나의 파지의 분리를 포함하며 상기 적어도 하나의 파지는 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 상기 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 특이적으로 결합하는 상기 항체를 나타낸다.

본 발명의 다른 양태는 HLA 제한 항원과 복합되는 인간 주 조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것으로 이 항체는 바람직하게는 다클론 항체, 단클론 항체, 양특이성 항체 및/또는 키메라 항체이다.

그러한 항체 및 단일 쇄 클래스 I 주조직 적합 복합체의 생산을 위한 해당 방법들 그리고 이러한 항체의 생산을 위한 다른 도구들은 WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 및 출판물(Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003)에 공개되어 있으며, 이들은 본 설명의 목적을 위해 그 전문이 참조 문헌에 명백히 포함되어 있다.

바람직하게는 항체는 20 나노몰 미만의 바람직하게는 10 나노몰 미만의 결합 친화력으로써 복합체와 결합하는데, 이는 본 발명의 문맥 상 "특이적"으로 간주된다.

본 발명은 또한 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772로 구성된 군으로부터 선택된 서열 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 대해 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 동등한) 이의 변이체 또는 상기 펩티드와 T 세포 교차반응을 유도하는 이의 변이체를 포함하는 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드는 전장 폴리펩티드가 아니다.

본 발명은 또한 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772로 구성된 군으로부터 선택된 서열 또는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 대해 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 동등한) 이의 변이체에 관한 것으로, 상기 펩티드나 변이체가 갖는 전체 길이는 8 ~ 100개, 바람직하게는 8 ~ 30개, 가장 바람직하게는 8 ~ 14개의 아미노산이다.

본 발명은 또한 인간 주 조직적합, 복합체(MHC) 클래스 I 또는 -II의 분자에 결합하는 능력을 갖는 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다.

본 발명은 또한 본 발명에 의한 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 (화학적으로) 변형되거나/며 비펩티드 결합을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 의한 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 특히 HLA-DR 항원-연관된 불변 쇄(Ii)의 N-말단을 포함하는 융합 단백질의 일부이거나 또는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 안으로) 융합된다.

본 발명은 또한 본 발명이 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것으로, 단 펩티드가 완전한(전체) 인간 단백질은 아니다.

본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 더욱 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 의학에서 특히 난소암의 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 항원 제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양 및 상기 숙주 세포나 그 배양 배지로부터 펩티드의 분리를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원 제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 항원 제시 세포가 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772를 포함하는 상기 펩티드 또는 상기 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이상 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 활성화된 T 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 일체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 이상 발현하는 환자에서 표적 세포를 살해하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 설명한 일체의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포 독성 T 림프구를 약제로서 또는 약제의 제조에서의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 암에 대해 활성을 갖는다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 백신이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 암에 대해 활성을 갖는다.

본 발명 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로, 상기 암 세포가 난소암 또는 간세포 암종, 결장직장 암종, 아교모세포종, 위암, 식도암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암, 신세포 암종, 전립선암, 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 담낭암 및 담관암종, 방광암, 자궁암, 두경부 편평 세포 암종, 중피종과 같은 기타 고형이나 혈액 종양세포이다.

본 발명은 또한 난소암의 진단 및/또는 예후에 사용될 수 있는 여기서 "표적"이라 부르느 본 발명에 따른 펩티드에 근거하는 특정 표지자 단백질 및 생체표지자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 치료를 위해 이러한 신규 표적의 사용에 관한 것이다.

용어 "항체" 또는 "항체들"은 여기에서 광범위한 의미로 사용되며, 다클론 및 단클론 항체를 둘 다 포함한다. 무손상 또는 "온전한" 면역 글로불린 항체 분자뿐만 아니라, 용어 "항체"에 포함되어 있는 것은 그런 면역글로불린 분자와 인간화된 버전의 면역글로불린 버전의 단편(예: CDR, Fv, Fab 및 Fc 단편) 또는 중합체이며, 이 단편은 본 설명에 따른 바람직한 특성(예를 들면, 난소암 표지자 (폴리)펩티드의 특정 결합, 높아진 수준의 난소암 표지자 유전자를 발현하는 암 세포에 독소 전달, 및/또는 난소암 표지자 폴리펩티드의 활성 억제)을 나타낸다.

가능한 한, 본 발명의 항체는 상용 소스에서 구입해야 한다. 본 발명의 항체는 잘 알려진 방법을 통해서 만들어 질 수도 있다. 이 분야의 기술자는 전장 난소암 마커 폴리펩티도 또는 그 부분이 발명의 항체를 만드는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 항체를 생성하는데 사용될 폴리펩티드는 자연적인 원천에서 부분적으로 또는 완전히 정화될 수 있거나, 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어질 수도 있다.

예를 들어, 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772에 따른 폴리펩티드 또는 이의 변이체나 단편에 따른 펩티드와 같은 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 cDNA는 원핵 세포(예: 세균) 또는 진핵 세포(예: 효모, 곤충 또는 포유동물 세포)에서 발현될 수 있으며, 그 다음 그 재조합 단백질을 정화시켜, 본 발명에 따른 항체의 생성에 사용되는 폐암 표지 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론성 또는 다클론성 항체 제제를 생성하는데 사용할 수 있다.

당업자는 두 개 이상의 다른 단클론 또는 다클론 항체의 조합의 생성을 의도하는 사용(예: ELISA, 면역조직화학, 생체 내 이미징, 면역 독소 요법)에 요구되는 특이성 및 친화성을 갖는 항체의 획득 가능성을 최대화함을 인식할 것이다. 이 항체들은 그 항체들이 사용되는 목적에 의거하여 알려진 방법에 의해 바람직한 활성도에 대해 시험된다(예: ELISA, 면역조직화학, 면역요법 등; 항체의 생성과 시험에 관한 추가 지침은 예를 들어 Greenfield, 2014를 참고한다(Greenfield, 2014)). 예를 들어, 항체는 포르말린 고정 폐암이나 동결된 조직 분절의 ELISA 분석법, 웨스턴 블롯, 면역조직화학 염색으로 시험할 수 있다. 치료 또는 생체 내 진단용을 위한 항체는 초기의 시험관 내 특성화 이후, 알려진 임상 시험 방법에 따라 시험한다.

"단클론 항체"라는 용어는 여기서 상당한 균등질 항체 개체군에서 획득이 된 것을 말한다. 즉, 이 개체군이 포함하는 각각의 항체는 자연적으로 일어날 수 있는 소수의 돌연변이체를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 여기서 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부분이 특정한 종 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체의 서열과 상응하거나 일치하고, 쇄의 나머지 부분은 다른 종 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체, 및 이러한 항체의 단편의 서열과 상응하거나 일치하고, 희망하는 상반되는 활동성을 보여주는 "키메릭(chimeric)" 항체를 포함한다(미국 특허 번호 4,816,567, 여기에 그 전문이 참조 문헌으로 포함됨).

본 발명의 단클론 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 준비될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 생쥐 또는 다른 적당한 숙주 동물이 보통 면역성을 주는 작용제에 의해 면역되어, 면역성을 주는 작용제에 특정적으로 결합하는 항체를 생산하거나 이를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있는 림프구를 유도해 낸다. 다른 방법으로는, 림프구는 시험관 내에서 면역될 수도 있다.

단클론 항체는 또한 미국 특허 번호 4,816,567에서 설명된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다. 본 발명의 단클론 항체를 인코딩하는 DNA는 손쉽게 격리되고 전통적인 방법을 사용하여 염기 서열 분석이 가능하다(예, 마우스 유래 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특정하게 결합할 수 있는 능력이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로서).

시험관 내 방법 또한 1가의(monovalent) 항체를 준비하는데 적당하다. 이 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 항체를 분절화시켜 항체의 단편을 특히 여기서는 Fab 단편을 생산할 수 있다. 예를 들면, 파파인을 사용하여 소화가 이루어질 수 있다. 파파인 소화의 예는 WO 94/29348 및 미국 특허 번호 4,342,566에 설명되어 있다. 항체의 파파인 소화는 보통 각각 하나의 항원 결합 위치 및 남은 Fe 단편을 포함한 Fab 단편이라 부르는 동등한 두 개의 항원 결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 하나의 F(ab')2 단편과 하나의 pFc' 단편을 제공한다.

항체 단편도, 이가 다른 서열과 붙어 있든 그렇지 않든 간에, 이 단편의 활동력이 변경되지 않은 항체 또는 항체 단편에 비교할 시, 현저하게 바뀌거나 또는 손상이 되지 않는 한, 삽입, 삭제, 치환, 또는 특정한 위치의 또는 특정한 아미노산 잔기의 다른 선택된 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 이황화물 결합의 능력이 있는 아미노산의 제거/추가, 생체물 수명의 증가, 분비 특징의 변화 등의 추가적인 특성을 제공할 수 있다 어떤 경우에도, 항체 단편은 결합 활성, 결합 도메인에서의 결합 조절 등의 생활성물 성질을 소유하고 있어야 한다. 항체의 기능 또는 활동 범위는 단백질의 특정한 지역의 돌연변이 생성, 발현 및 이 발현된 폴리펩티드의 실험에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법은 이 분야의 기술자가 손쉽게 알 수 있는 기술이며 이는 항체 단편을 인코딩하는 핵산의 위치 특이적 돌연변이 생성을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 더욱 포함할 수 있다. 인간화된 형태의 비-인간(예, 쥐과 동물) 항체는 최소의 비-인간 면역글로불린 항체에서 유도된 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린항체, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(Fv, Fab, Fab' 또는 다른 항체의 항원 결합의 결과)이다. 인간화된 항체는 보완 결정 영역(complementary determining region(CDR))의 잔기가 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여 항체)의 CDR의 잔유물로 바뀐 요구되는 특이성, 친화도 및 수용력을 가진 인간 면역글로불린(수납 항체)이다. 일부 예에서는, 인간 면역글로불린의 Fv 구조(FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 교체된다. 인간화된 항체는 수납 항체 또는 수입된 CDR 또는 구조 서열의 어디에서도 찾을 수 없는 서열을 포함하기도 한다. 보통, 인간 항체는 변이성 도메인을 적어도 하나 또는 거의 대부분 두 개를 포함하며, 모든 또는 실질상 모든 CDR 범위는 비-인간 면역글로불린에 상응하고 모든 또는 실질상 모든 구조 범위는 인간 면역글로불린 일치 서열이다. 인간화된 항체는 이상적으로 적어도 보통 인간 면역 글로불린의 면역글로불린 불변 범위(Fc)의 한 부분 또한 포함할 것이다.

이 분야에서 비인간 항체를 인간화하는 방법은 잘 알려져 있다. 보통, 인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 비인간 근원에서 이에 도입된다. 이 비인간 아미노산 잔류들은 종종 "수입" 잔기이라고 일컬어지며, 이는 대개 "수입" 변수 도메인에서 출처한다. 인간화는 본질적으로 설치류의 CDR 또는 상응하는 인간 항체 서열의 CDR 서열을 인간의 것으로 교체하는 것으로 실행될 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 키메릭 항체(미국 번호 4,816,567)이며, 이 때 상당히 온전하지 않은 인간 변수 도메인이 비인간 종의 해당 서열로 치환되었다. 실제적으로, 인간화된 항체는 보통 여러 CDR 잔기 및 가능하게는 여러 구조 잔기가 이 설치류의 유사한 영역의 잔기와 치환된 인간 항체이다.

면역되었을 때, 내생의 면역글로불린 생성이 없는 중에 전체 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자 변형 동물(예, 생쥐)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 키메릭 배선 돌연변이 생쥐의 항체의 중쇄 결합 영역 유전자 동형 삭제는 내생 항체 생산의 완전한 억제 결과를 가져온다. 이러한 배선 돌연변이 생쥐로의 인간 배선 면역글로불린 유전자 정렬 이입은 항원이 존재할 때 인간 항체 생산의 결과를 낳을 것이다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생산될 수 있다.

본 발명의 항체는 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체에 의해서 피험자에게 투여된다. 보통, 적당한 약학적으로 허용가능한 염이 제형을 등장 상태로 만들기 위해 제형에 사용된다. 약학적으로 허용가능한 운반의 예로는, 링거 용액(Ringer's solution) 및 포도당 용액이 있다. 이 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이며, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 더 많은 담체는 항체를 포함하는 세포간질이 막, 리포좀 또는 미세입자와 같은 형태로 되어 있는 고체 소수성 중합체 반투성의 세포간질과 같은 지속적인 방출 준비를 포함한다. 예를 들어, 투여 방법 및 투여되는 항체의 농도에 따라 어떤 담체가 더 바람직한지는 이 분야의 당업자에게는 명백할 것이다.

항체는 피험자, 환자 또는 세포에 주사(예, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내), 또는 주입과 같은 혈액으로서의 전달이 효율적으로 이루어 질 수 있는 다른 방법으로 투여될 수 있다. 항체는 국소뿐만이 아니라 전신의 치료 효과를 얻기 위해 종양 내 또는 종괴 주의의 방법으로도 투여될 수도 있다. 국소 또는 정맥내 주사가 바람직하다.

항체 투여의 효율적인 용량과 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 이 분야의 기술 중의 하나다 이 분야의 당업자는 투여되는 항체의 용량은 예를 들어 이 항체를 받는 대상, 투여 방법, 사용되는 특정한 항체의 종류 및 투여되는 다른 약들에 따라 달라진 다는 것을 이해할 것이다. 단독으로 사용될 시 전형적인 항체의 일일 용량은 1μg/kg 내지 100 mg/kg로 다를 수 있으며, 위에 언급된 요인을 고려할 때 이보다 더 높을 수도 있다. 바람직하게는 난소암의 치료를 위한 항체의 투여 후, 이 분야의 기술자들에게 알려진 다양한 방법으로 이 항체의 치료적 효능을 평가할 수 있다. 예를 들면, 치료를 받고 있는 시험대상자에서 암의 크기, 수자, 및/또는 분포 등이 종양 영상 기술을 이용하여 모니터링될 수 있다. 항체의 투여가 없을 경우 발생할 질병 경과에 비교하여, 종양의 성장을 정지하고, 종양을 오그라들게 하고, 그리고/또는 새로운 종양의 성장을 예방하는 치료의 목적으로 투여된 항체는 효과있는 폐암의 치료라고 할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 특이적 펩티드-MHC 복합체를 인지하는 가용성 T 세포 수용체의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이러한 가용성 T 세포 수용체는 특이적 T 세포 클론으로부터 생성 가능하며, 그 친화력은 보완결정 부위를 표적으로 하는 돌연변이유발성에 의해 증가시킬 수 있다. T 세포 수용체 선택의 목적 상, 파지 디스플레이를 사용할 수 있다(US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). 파지 디스플레이 동안 T 세포 수용체의 안정화 목적 상 그리고 약물로서의 실용적인 용도의 경우, α 및 β 쇄는 연계될 수 있으며, 예를 들어, 비선천적 이황화 결합, 기타 공유 결합(단일 쇄 T 세포 수용체) 또는 이합체화 도메인에 의해 연결된다(Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T 세포 수용체는 표적 세포에 대한 특정 기능의 실행을 목적으로 독소, 약물, 사이토킨(예를 들어 미국 2013/0115191 참고), 항-CD3 도메인 등과 같은 작용기 세포를 모집하는 도메인과 연결될 수 있다. 더욱이 이것은 입양 전달에 사용되는 T 세포에서 발견될 수 있다. 추가 정보는 WO 2004/033685A1 및 WO 2004/074322A1에서 찾을 수 있다. sTCR의 조합은 WO 2012/056407A1에 설명되어 있다. 이 생산에 관한 추가 방법들은 WO 2013/057586A1에 공개되어 있다.

그 밖에, 본 발명의 펩티드 및/또는 TCR 또는 항체 또는 다른 결합하는 분자는 생검 샘플에 근거한 병리학자의 암 진단을 확인하는데 사용이 가능하다.

항체 또는 TCR은 생체 내의 진단 분석에 사용될 수도 있다. 일반적으로, 항체는 방사성핵종으로 라벨링 되고(예, ¹¹¹ In, ⁹⁹ Tc, ¹⁴C, ¹³¹ I, ³H, ³²P 또는 ³⁵S) 면역섬광계수법(immunoscintiography)을 사용하여 종양의 위치가 결정될 수 있다. 한 실시양태에서는, 항체 또는 그 단편은 위에 언급된 언급된 단백질로 구성된 군으로부터 선택한 두 개 또는 그 이상의 단백질 표적의 세포외 도메인에 결합을 하고 친화도 값(Kd)은 1x10μM 미만이다.

진단의 용도로 사용되는 항체는 여러가지의 영상 방법으로 검출될 수 있는 적당한 프로브로 라벨이 될 수 있다. 프로브의 검출 방법은 형광, 광학, 공초점 및 전자 현미경, 자기 공명 단층 촬영 영상 및 분광기 형광 투시법, 전산화 단층 촬영과 양전자 방사 단층 촬영법을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 적당한 프로브는 플루오레세인, 로다민, 에오신과 다른 형광체, 방사성 동위 원소, 금, 가돌리늄과 다른 란탄계열 원소, 상자성체의 이온, 플루오르-18 및 다른 양전자 방출 방사성 핵종 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 또한, 프로브는 두개의 또는 그 이상의 기능을 가지고 있을 수 있으며, 여기에 나열된 하나 이상의 방법으로 검출할 수 있다. 이러한 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 여기에 나열된 프로브로 라벨이 될 수 있 다. 이렇게 항체와 프로브를 연결하는 것으로는 이 분야에서 잘 알려진 것들 중에 프로브의 공유원자 연결, 프로브의 항체로의 편입, 및 프로브의 결합을 위한 킬레이트 화합물의 공유원자 연결 등을 들 수 있다. 면역조직 화학을 위해서, 질병 조직 샘플은 신선하거나 냉동되었거나 또는 파라핀에 포매되어 포르말린과 같은 방부제로 고정되어 있을 수 있다. 고정되었거나 포매되어 있는 샘플을 포함하고 있는 조직 분절은 라벨링된 1차 항체 및 2차 항체와 접촉되며 여기서 항체는 제자리 단백질 발현의 검출에 사용된다.

본 발명의 다른 양태는 활성화된 T 세포와 항원 적재된 적당한 항원 제시 세포의 표면에서 시험관 내 T 세포를 항원이 본 발명의 펩티드라고 할 때 항원 특정 방식으로서 활성화시키는데 충분한 시간 동안에 발현되는 인간 클래스 I 또는 MHC 분자의 접촉을 포함하는 시험관 내의 방법으로 생성하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 충분한 양의 항원이 항원 제시 세포와 함께 사용된다.

바람직하게는, 포유류 세포는 TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있거나, 감소된 수준 또는 기능을 가지고 있다. TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있는 적당한 세포로는 T2, RMA-S 및 초파리 세포를 들 수 있다. TAP이란 항원 처리에 관련된 트랜스포터를 일컷는다.

인간 펩티드 적재 결핍 세포주 T2는 Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA의 카탈로그 번호 CRL 1992에서 구입이 가능하고, 초파리 세포주 Schneider 2는 ATCC의 카탈로그 번호 CRL 19863에서 구입이 가능하며, 생쥐 RMA-S 세포주는 Karre et al 1985에서 묘사가 된 바 있다(Ljunggren and Karre, 1985).

바람직하게는, 숙주 세포는 감염전에 대부분 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않는다. 또한 프로모터 세포가 B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA 3과 같은 T 세포에 대한 공동자극 신호를 제공하는데 중요한 분자를 발현하는 것이 바람직하다. 다수의 MHC 클래스 II 분자의 핵산 서열 및 동시자극 분자의 서열은 GenBank와 EMBL 데이터베이스에서 공개적으로 제공된다.

MHC 클래스 I 에피톱이 항원으로 사용되는 경우, T 세포는 CD8-양성 T 세포이다.

만약 항원 제시 세포가 전달감염되어 그리한 에피톱을 발현한다면, 바람직하게는 그 세포는 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772를 포함하는 펩티드 또는 이의 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.

T 세포를 시험관 내에서 생성하는 여러 다른 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, 자가 조직 종양-침윤 림프구는 CTL의 생성에 사용이 가능하다. Plebanski 등(Plebanski et al., 1995)은 자가 조직 말초의 혈액(PLB)을 T 세포의 준비 시 사용한다. 더욱이 수지성 세포를 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스시키거나, 또는 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 자가조직 T 세포의 생산도 가능하다. 또한 자가조직 T 세포의 생산에서 B 세포도 사용할 수 있다. 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스된 또는 재조합된 바이러스에 의해 감염된 대식세포가 자가조직 T 세포의 준비 시 사용될 수 있다. S. Walter 등(Walter et al., 2003)은 인공 항원 제시 세포(aAPCs)를 사용하는 시험관 내 T 세포의 프라이밍을 기술하며, 이는 역시 선택된 펩티드에 대한 펩티드에 대해 T 세포를 생성하는데도 사용될 수 있다. 본 발명에서, aAPC는 미리 생성된 MHC:펩티드 복합체를 포리스티렌 입자(마이크로 비드)의 표면과 커플링을 시키고 바이오틴-스트렙트아비딘 생화학을 이용함으로써 생성되었다. 이 체계는 aAPC의 정확한 MHC 밀도를 제어할 수 있도록 허용하며, 이는 항원-특정 T 세포 반응을 혈액 샘플에서 높은 효율성으로 고- 또는 저-결항력을 선택적으로 유도해낼 수 있게 한다. MHC:펩티드 합성체를 제외하고, aAPC는 그들의 표면에 커플된 항-CD28 항원과 같은 동시-자극 활동을 가지고 다른 단백질을 운반해야 한다. 더욱이 이러한 aAPC-기반 체계는 종종 예를 들면, 인터루킨-12와 같은 사이토카인 등 적당한 용해 요소의 추가를 요구한다.

동종이계 세포는 T 세포의 준비에 역시 사용될 수 있으며 방법은 WO 97/26328에 더 자세하게 기술되어 있으며, 여기에 참조 문헌으로 포함되어 있다. 예를 들어, 초파리 세포와 T2 세포에 추가적으로, CHO 세포, 배큘로바이 러스-감염 곤충 세포, 박테리아, 효소, 백시니아-감염된 표적 세포 등과 같은 다른 세포들도 항원을 제시하는데 사용될 수 있다. 또한 식물성 마이러스를 사용할 수 있다(예를 들어, Porta 등을 참조 (Porta et al., 1994)을 참조). 이는 외부 펩티드의 제시를 위한 카우피 모자이크 바이러스의 높은 수확 체계로서의 개발을 기술한다.

이 실험의 펩티드에 대해 활성화된 T 세포는 치료에서 유용하다. 따라서, 본 발명의 더 나아간 양태은 앞서 말한 발명의 방법으로 획득할 수 있는 활성화된 T 세포에 대한 내용을 제공한다.

위에서 말한 방법으로 생성된 활성화된 T 세포는, 서열 식별 번호 1 ~ 서열 식별 번호 772의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 이상 발현하는 세포를 선택적으로 인지한다.

바람직하게는, T 세포는 그의 TCR을 HLA/펩티드-합성체(예, 결합)와 상호작용을 함으로서 이런 세포를 인식한다. 이 T 세포는 효율적인 활성화된 T 세포의 수가 투여되었을 시 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이는데 유용하다. 환자에게 투여된 T 세포는 위에서 기술된 바와 같이 환자에게 유도되고 활성화된다(즉, 이는 자가 조직 T 세포이다). 다른 방법으로는, T 세포는 환자에게 유도가 안 되고, 다른 개인에서 유도된다. 물론, 이 개인이 건강한 개인인 것이 바람직하다. 발명자들이 말하는 "건강한 개인"이라고 함은 개인이 전체적으로 좋은 건강을 가지고 있으며, 바람직하게는 충분한 면역 체계를 가지고 있으며, 더 바람직하게는, 손쉽게 실험되고 검출될 수 있는 어떤 질병도 겪고 있지 않다는 것이다.

생체 내에서, 본 발명에 따른 CD8-양성 T 세포는 종양 세포(이들은 가끔 MHC 클래스 II를 발현하기도 한다)이거나 또는 종양을 감싸고 있는 간질성 세포(종양 세포)(이는 가끔 MHC 클래스 II를 또한 발현하기도 한다(Dengjel et al., 2006)).

본 발명의 T 세포는 활성적인 치료 구성의 성분으로 사용될 수도 있다. 따라서, 발명은 본 발명의 아미노산 서 열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이고 환자에게 위에 정의된 바처럼 효율적인 T 세포의 수를 투여하는 방법을 제공한다.

본 발명자는 "비정상적으로 발현되는"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 수준에 비교했을 때 과다 발현되거나 또는 유전자가 종양이 유도된 조직다에서는 침묵적이지만(silent) 종양에서는 발현되는 것 또한 의미한다. 본 발명자는 "과다 발현"이라는 구절에 의해, 폴리 펩티드가 정상 조직에서 존재하는 수준의 적어도 1.2배 이상으로 존재하는 것을 말하고, 바람직하게는 적어도 2배, 더 바람직하게는 적어도 5배 또는 10배로 존재하는 것을 의미한다.

T 세포는 예를 들면 위에서 기술된 바와 같은 방법으로 얻어질 수 있다.

흔히 T 세포의 입양 전송이라고 불리우는 것에 대한 프로토콜은 이 업계에서 잘 알려져 있다. 그 리뷰는 다음에서 찾을 수 있다: Gattioni et al. 및 Morgan et al.(Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

본 발명의 다른 양태에는 핵산이 클로닝되며 숙주 세포 바람직하게는 T 세포에 개입되는 T 세포 수용체를 생성하는데 있어서 MHC와 복합된 펩티드의 사용이다. 다음 이 유전자 조합된 T 세포는 암의 요법을 위해 환자로 이전시킬 수 있다.

본 발명의 모든 분자(즉, 펩티드, 핵산, 항체, 발현 벡터, 세포, 활성화된 T 세포, T 세포, T 세포 수용체 또는 이를 인코딩하는 핵산)가 병을 고치는데 있어서 면역 반응을 피할 수 있는 성질을 가진 세포에 포함되어 있는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명에 포함되어 있는 어떤 분자든지 약제로 사용되거나 약제를 만드는데 사용될 수 있다. 이 분자는 단독으로 사용될 수도 있고, 어떤 알려진 분자와 함께 결합하여 사용될 수도 있다.

본 발명은 다음을 포함한 키트(kit)를 포함한다:

(a) 위에 기술된 바와 같은 약학 조성물을 용액 또는 동결건조된 형태로 포함하고 있는 용기;

(b) 임의적으로 희석제 또는 동결건조된 제형을 위한 재구성 용액을 포함하는 제2 용기; 및

(c) 임의적으로 (i) 용액의 사용 혹은 (ii) 동결건조된 제형의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명서.

이 키트는 하나 이상의 (iii) 완충제, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘 또는 (vii) 주사기를 더욱 포함할 수 있다. 용기는 바람직하게는 병, 바이알, 주사기 또는 시험관이며 또한 반복사용 용기일 수 있다. 약학 조성물은 바람직하게는 동결건조된다.

본 발명에 사용되는 키트는 바람직하게는 동결건조되어 있는 약제를 적당한 용기와 이들의 재구성 및/또는 사용에 관한 지침서를 함께 포함한다 적당한 용기는 예를 들면, 병, 바이알(예: 듀얼 챔버 바이알), 주사기(듀얼 챔버 주사기 등) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성할 수 있다. 바람직하게는 키트 및/또는 용기에는 재구성 및/또는 사용에 필요한 지시사항을 나타내는 지침이 포함된다. 예를 들어, 라벨 상에서 동결건조된 제형을 상기 펩티드 농도로 재구성해야 한다고 지시할 수 있다. 라벨은 또한 약제가 피하투여가 가능한지 아니면 유용한지를 보여줄 수도 있다.

제형을 포함한 용기는 재구성된 약제의 반복된 투여를 가능하게 하는 다용도 바이알일 수 있다(예: 약 2 내지 6회의 투여). 키트는 또한 적당한 희석제(예: 중탄산 용액)를 포함하는 제2 용기를 포함할 수도 있다.

희석제와 동결건조된 약제를 섞을 때는, 재구성된 약제의 최종 펩티드 농도가 바람직하게는 적어도 0.15 mg/mL/펩티드(= 75 μg)이고 바람직하게는 3 mg/mL/펩티드(= 1500 μg)를 넘지 않아야 한다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 패키지 삽입 및 사용 설명서 등의 사용자의 입장에서 필요한 것을 더 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 키트는 본 발명에 따른 약학 조성물을 포함하는 하나의 용기를 다른 제품과 함께 또는 단독으로 포함하거나(예: 다른 화합물들 또는 이 다른 화합물들의 약학 조성물) 각각의 조성물을 각자 다른 용기에 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 키트는 다음과 같은 제2 화합물 또는 그들의 조성물과 함께 투여될 수 있는 약학 조성물을 포함한다. 보조제(예: GM-CSF), 화학요법제, 자연 생산품, 호르몬 또는 길항제, 항-혈관신생 제제 또는 억제제, 괴사유도제 또는 킬레이터. 키트의 조성물은 미리 혼합되어 있을 수도 있고 또는 각각의 조성물이 각각 따로 용기에 담겨 있을 수도 있다. 키트의 조성물은 하나 또는 그 이상의 액체 용액에 제공될 수도 있고, 바람직하게는 수용액, 더욱 바람직하게는 무균 수용액에 제공된다. 키트의 조성물은 적당한 용해제를 첨가함으로서 액체로 바뀔 수 있는 고체로 제공될 수도 있고, 바람직하게는 이는 다른 용기에 담겨 제공된다.

치료 키트의 용기는 바이알, 실험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 고체나 액체를 담을 수 있는 다른 어떤 용기 일 수 있다. 보통, 하나 이상의 구성물이 있을 경우, 키트는 제2 물약병 또는 다른 용기를 포함하고, 이는 각각의 복용을 가능하게 한다. 키트는 약학적으로 허용가능한 액체를 포함하고 있는 용기를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 현재 키트의 조성물인 발명의 제제를 투여할 수 있는 기구를 포함한다(예: 하나 또는 그 이상의 바늘, 주사기, 안약 투입제, 피펫 등).

본 제형은 구강(경구), 비강, 안약 형태의, 피하의, 피내, 근육내, 혈관내 또는 경피 등 어떠한 투여 형태로든 펩티드 투여에 적당한 약제이다l. 바람직하게는 투여는 피하(s.c.)이며, 가장 바람직하게는 주입 펌프에 의한 피내(i.d.)일 수 있다.

본 발명의 펩티드가 난소암로부터 분리되었기 때문에, 본 발명의 약제는 바람직하게는 난소암의치료에 사용된다.

본 발명은 또한 사전선별된 TUMAP의 창고로부터 선택된 적어도 하나의 펩티드가 포함된 약학 조성물의 제조를 포함하는 개별 환자의 개인화 약학 조성물의 생산 방법을 포함하며, 여기서 약학 조성물에 사용되는 적어도 하나의 펩티드는 개별 환자의 적합성을 위해 선택된다. 한 실시양태에서, 약학적 성분은 백신이다. 이 방법은 TCR 분리 또는 가용성 항체 그리고 다른 치료 옵션과 같은 하류 용도를 위해 T 세포 클론의 생산에도 적응시킬 수 있다.

"개인화 약학"이란, 활성적으로 개인화된 암 백신 및 자가 환자 조직을 사용하는 적응적 세포 세포 요법을 포함하는 한 명의 개별 환자의 치료를 위해서만 사용되는 그러한 개별 환자를 위해 구체적으로 맞춤화된 요법을 의미해야 한다.

여기에서 사용되는 용어 "창고"란 특정한 종양 유형에서 면역원성 및/또는 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드의 군을 지칭해야 한다. "창고"란 용어는 백신에 포함된 특정한 펩티드가 물리적 시설에서 사전제조되어 보관되는 백신에 포함된다는 것을 내포함을 의도하지 않지만 그 가능성은 심사숙고된다. 이 펩티드는 생산된 개인화 백신마다 새로 제조될 수 있거나 사전제조되어 보관될 수 있음이 명시적으로 심사숙고된다. 창고(예: 데이터베이스의 형태)는 다양한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 대립유전자를 가진 난소암 환자의 분석된 종양 조직에서 고도로 과다 발현된 종양-연관 펩티드들로써 구성된다. 창고는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 펩티드나 연장된 MHC 클래스 I 펩티드를 조합할 수 있다. 창고는 몇몇 난소암 조직들로부터 수집된 종양 연관 펩티드 외에도, HLA-A*02 및 HLA-A*24 표지자 펩티드를 포함할 수 있다. 이 펩티드들은 TUMAPS에 의해 유도된 T 세포 면역성의 크기 비교를 허용하며 그에 따라 항종양 반응을 유발하는 백신의 용량에 대해 중요한 결정을 내리도록 허용한다. 둘째로, 이들은 환자에서 "자가" 항원으로부터 유래된 TUMAP에 대한 일체의 백신 유도된 T 세포 반응이 관찰되지 않는 경우 "비자가" 항원으로부터 유래된 중요한 양성 대조 펩티드로 기능한다. 그리고 세째로, 환자의 면역적격의 상태에 대한 결론을 내리도록 허용할 수 있다.

창고용 TUMAP는 유전자 발현 분석, 질량 분석 및 T 세포 면역학(XPresident ®)이 조합된 통합 기능적 유전체 접근방식을 사용하여 동정된다. 이 접근 방식은 정상 조직에서는 발현되지 않거나 최소한으로만 발현되지만 고비율의 종양에서는 진정하게 존재하는 TUMAPs만을 추가 분석을 위해 선택하도록 보증한다. 펩티드 선택을 위하여, 환자로부터의 난소암 샘플 그리고 건강한 공여자의 혈액을 단계적 접근 방식으로 분석했다:

1. 악성 종양 물질로부터의 HLA 리간드는 질량 분석에 의해 파악되었다.

2. 마이크로어레이에 의한 유전체-전체의 전령 리보헥산(mRNA) 발현 분석을 사용하여, 정상 기관과 조직들의 범위와 비교하여 악성 조직(난소암)에서 과발현된 유전자들을 동정했다.

3. 확인된 HLA 리간드를 유전자 발현 데이터와 비교했다. 종양 조직 상에서 제시된 펩티드들, 바람직하게는 2단계에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드들은 다중-펩티드 백신용으로 적절한 TUMAP 후보로 간주했다.

4. TUMAP로서 동정된 펩티드의 관련성을 지지하는 추가의 증거를 파악하기 위해 문헌 연구를 수행했다.

5. mRNA 수준에서의 과다 발현의 타당성은 3단계에서 종양 조직으로부터 선택된 TUMAPs의 재검출 그리고 건강한 조직에 대한 검출의 부재(또는 낮은 빈도)에 의해 확인되었다.

6. 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도가 가능한지 여부를 평가하기 위해, 건강한 공여자는 물론 난소암 환자의 인간 T 세포를 사용하여 시험관 내 면역원성 검사를 수행했다.

한 양태에서, 펩티드를 창고에 포함시키기 전에 면역원성에 대해 사전 스크리닝이 수행된다. 제한이 아니라 한 예로서, 펩티드/MHC 복합체와 항-CD28 항체가 적재된 인공 항원 제시 세포를 가진 건강한 공여자의 CD8+ T 세포를 반복적으로 자극하는 시험관 내 T 세포 초기감작을 포함하는 방법을 사용하여 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을 결정한다.

이 방법은 희귀한 암과 드문 발현 프로필을 가진 환자에서 바람직하다. 현재 개발되고 있는 고정 성분을 가진 다중펩티드 칵테일과는 대조적으로, 창고는 종양의 항원이 실제 발현과 백신과 유의하게 더 높은 일치를 허용한다. 다중표적 접근 방식에서는 단일 펩티드 또는 "재고" 펩티드들의 조합을 각 환자에 대해 사용한다. 이론상으로, 예를 들어 50개 라이브러리로부터 선택된 5개의 다른 항원 펩티드에 근거한 접근방법은 이미 약 17백만 가지의 가능한 약품(DP) 성분을 초래할 것이다.

한 양태에서 여기 그리고 다음에 설명되는 본 발명에 따른 방법에 근거하여, 이 펩티드들은 개별 환자를 위한 적합성에 근거하여 백신에 포함되도록 선택된다.

HLA 표현형, 전사체학 및 펩티도믹스 데이터는 환자의 종양 물질과 혈액 샘플로부터 수집하여 창고(데이터베이스)와 환자 고유의(즉 돌연변이된) TUMAP를 포함하는 각 환자에 대해 가장 적절한 펩티드를 동정한다. 환자 종양에서 선택적으로 발현되거나 과다 발현되는 펩티드를 선택하게 되며, 이는 가능한 경우 환자의 개별 PBMC로써 시험했을 때 강한 시험관 내 면역원성을 나타냈다.

바람직하게는 백신에 포함되는 펩티드는 다음으로 구성되는 방법에 의해 확인된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드들(TUMAPs)의 동정; (b) (a)에서 동정된 펩티드를 위에 설명된 펩티드들의 창고(데이터베이스)와 비교; 및 (c) 그 환자에서 동정된 종양-연관 펩티드와 상관관계가 있는 창고(데이터베이스)로부터 적어도 하나의 펩티드 선택을 포함하는 방법에 의해 확인된다. 예를 들어, 종양 샘플에 의해 제시되는 TUMAP는 다음에 의해 확인된다: (a1) 종양 샘플에서 과다 발현되거나 이상 발현된 단백질의 파악을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 모양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 그리고 (a2) 종양에 의해 과다 발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 파악하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계 결정. 바람직하게는, MHC 리간드의 서열은 종양 샘플로부터 분리된 MHC 분자로부터 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드의 서열결정에 의해 확인된다. 바람직하게는, 종양 샘플과 정상 조직을 같은 환자로부터 얻는다.

창고(데이터베이스) 모델을 사용한 펩티드의 선택 외에도 또는 이에 대한 대안으로, TUMAP가 환자에서 새로 확인된 다음 백신에 포함될 수 있다. 한 예로서, 후보 TUMAP 환자에서, (a1) 종양 샘플에서 과다 발현되거나 이상 발현된 단백질의 파악을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 모양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 그리고 (a2) 종양에 의해 과다 발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 파악하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계의 결정에 의해 동정할 수 있다. 다른 예로서, 개별 환자로부터의 정상의 상응하는 조직과 비교해서 종양 샘플에 대해 고유한 돌연변이를 포함하는 단백질을 확인할 수 있으며 그 돌연변이를 특이적으로 표적화하는 TUMAP의 파악이 가능하다. 예를 들어, 종양 및 상응하는 정상 조직의 유전체는 전체 유전체의 서열 결정에 의해 서열을 결정할 수 있다: 유전자의 단백질 코딩 영역에서 비동의 돌연변이 발견을 위해, 종양 조직으로부터 유전체의 DNA 및 RNA를 추출하고 비돌연변이 유전체의 배자계역은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 추출한다. 응용 NGS 접근방식은 단백질 코딩 영역의 재배열결정으로 제약된다(엑손 재배열결정). 이 목적을 위해, 인간 샘플로부터 엑손 DNA를 업체가 공급한 표적 강화 키트를 사용한 다음 예를 들어 HiSeq2000(Illumina)로써 서열을 결정하여 포획한다. 추가적으로 유전자 발현의 직접적 정량화 그리고 돌연변이된 유전자가 환자의 종양에서 발현된다는 검증을 위해 종양 mRNA의 서열을 결정한다. 그에 따른 수백만의 서열 리드는 소프트웨어 알고리즘을 통해 처리된다. 출력 목록에는 돌연변이와 유전자 발현이 포함된다. 종양 특이적 체세포 돌연변이는 PBMC 유래된 종자계 변이와 비교하여 결정한 다음 우선순위화한다. 다음에는 새로 동정된 펩티드를 위에 설명한 창고의 면역원성에 대해 시험할 수 있으며, 적절한 면역원성을 소유하는 후보 TUMAP를 선택하여 백신에 포함시킨다.

한 예시적 실시양태에서, 백신에 포함된 펩티드는 다음에 의해 확인된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드들(TUMAP)을 위에 설명한 방법으로 동정한다; (b) 상응하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성과 과제시에 대해 사전선별된 펩티드들의 창고를 이용하여 (a)에서 동정된 펩티드와 비교한다; (c) 환자에서 동정된 종양-연관 펩티드와 상관관계가 있는 적어도 하나의 펩티드를 창고(데이터베이스)에서 선택한다; 그리고 (d) 임의적으로 (a)에서 새로 동정된 적어도 하나의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인한다.

한 예시적 실시양태에서, 백신에 포함된 펩티드는 다음에 의해 확인된다: (a) 개인 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드(TUMAP)를 동정한다; 그리고 (b) (a)에서 새로 동정된 적어도 하나의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인한다.

개인화 펩티드 기반 백신에 대한 펩티드를 선택하면, 백신이 생산된다. 백신은 바람직하게는 20 ~ 40% DMSO, 바람직하게는 약 30 ~ 35% DMSO(약 33% DMSO 등)에 용해된 개별 펩티드들로 구성된 액체 제형이다.

제품에 포함되어야 할 펩티드는 각각 DMSO에 용해한다. 단일 펩티드 용액의 농도는 제품에 포함시킬 펩티드의 수에 의존하여 선택해야 한다. 단일 펩티드-DMSO 용액은 동등하게 혼합하여 제품에 포함되는 모든 펩티드를 포함하는 용액이 펩티드 당 ~2.5 mg/mL의 농도를 갖도록 한다. 다음 혼합된 용액을 주사 용수와 1:3의 비율로 희석하여 33% DMSO에서 펩티드 당 0.826 mg/mL의 농도를 달성한다. 희석된 용액을 0.22 마이크론 무균 필터를 통해 여과시킨다. 최종 벌크 용액을 얻는다.

최종 벌크 용액을 바이알에 채운 다음 사용 때까지 -20℃에서 보관한다. 바이알 하나에는 700 μL의 용액을 함유하고 각 펩티드를 0.578 mg개씩 함유한다. 이 가운데 500 μL(펩티드 당 약 400 μg)는 피내 주사에 응용한다.

암 치료에 유용함에 덧붙여, 본 발명의 펩티드는 진단으로도 유용하다. 펩티드가 난소암 세포에서 생성되고 이런 펩티드가 정상 조직에서는 나타나지 않는다는 것이 결정되었기 때문에 이런 펩티드는 암의 존재의 진단에 사용될 수 있다.

혈액 세포에서 주장되는 펩티드의 조직 생체 검사에서의 존재는 암의 진단 시 병리학자를 도울 수 있다. 항체, 질량 분석, 또는 이 분야에 다른 알려진 방법을 통한 특정 펩티드의 검출은 그 조직 샘플이 악성 또는 염증이 있는지 또는 일반적으로 병들어 있는지 또는 난소암의 바이오마커로서 사용가능한지 병리학자에게 알려줄 수 있다. 펩티드의 그룹의 존재는 병든 조직의 분류 또는 하위 분류를 가능하게 한다.

병든 조직 표본의 펩티드의 검출은 특히 만약 T 림프구가 작용 기전에 참여하는 것으로 알려져 있거나 기대할 때, 면역계를 포함한 치료의 이익에 대한 결정을 내릴 수 있게 한다. MHC 발현의 손실은 감염된 악성 세포가 면역 감시를 탈출하는데서 잘 설명되는 기전이다. 펩티드의 존재는 이 기전이 분석된 세포에서 악용되지 않는 것을 보여준다.

본 발명의 펩티드는 펩티드 또는 MHC 분자에 합성된 펩티드에 대한 T 세포 반응 또는 항체 반응 같은 펩티드에 대한 림프구 반응을 분석하는데 사용될 수 있다. 이런 림프구 반응은 추가 치료 단계에서 결정을 내릴 때 전조 표지자로 사용될 수 있다. 이런 반응은 또한 림프구 반응을 여러 방법으로, 예를 들면, 단백질 백신, 핵산, 자가 조직 물질, 림프구의 양자 전송을 유도하는 것을 목표로 하는 면역치료 접근방식의 대리 반응 표지자로 사용될 수 있다. 유전자 치료 설정에서, 펩티드에 대한 림프구 반응은 부작용의 평가에서 고려할 수 있다. 림프구 반응의 모니터링은 이식 요법의 후속 시험을 위한 중요한 도구가 될 수도 있다, 예를 들면, 융합의 검출 대 숙주 및 숙주 대 융합 질병.

본 발명을 그 바람직한 실시양태를 설명하는 다음 실시예를 통해 그리고 동반되는 그림을 참조하여 하되 이로써 제한됨이 없이 설명한다. 본 발명의 목적 상, 여기서 인용된 모든 참조문헌은 전문이 포함되어 있다.

도 1a 내지 1s는 여러 암 샘플에서 고도로 발현된 본 발명의 근원 유전자에 대한 예시적 발현 프로파일을 보여준다. 종양(검은 색 점)과 정상(회색 점) 샘플은 원발 장기에 따라 그룹화되고, 상자 수염 도표는 중간값, 25번째 및 75번째 백분위수(상자) 그리고 최소치 및 최대치(수염) RPKM 값을 나타낸다. 정상 기관은 위험 범주에 따라 순서대로 나와 있다. RPKM = 킬로베이스당 및 매핑된 리드 백만 개 당 리드. 정상 샘플: 혈액 세포; 혈관; 뇌; 심장; 간; 폐; adipose: 지방 조직; adren.gl.: 부신; 담관; 방광; BM: 골수; 연골; esoph: 식도; 눈; gallb: 담낭; 두경부; 신장; large_int: 대장; LN: 림프절; 신경; 췌장; parathyr: 부갑상선; pituit: 뇌하수체; skel.mus: 골격근; 피부; small_int: 소장; 비장; 위; 갑상선; 기관; 방광; 유방; 난소; 태반; 전립선; 고환; 흉선; 자궁. 종양 샘플: AML: 급성 골수성 백혈병; BRCA: 유방암; CLL: 만성 림프구성 백혈병; CRC: 결장직장암; GALB: 담낭암; GB: 아교모세포종; GC: 위암; HCC: 간세포 암종; HNSCC: 두경부암; MEL: 흑색종; NHL: 비호지킨 림프종; NSCLC: 비소세포 폐암; OC: 난소암; OSC-GC: 식도 / 위 암; OSCAR: 식도암; PC: 췌장암; PCA: 전립선암; RCC: 신세포 암종; SCLC: 소세포 폐암; UBC: 방광 암종; UEC: 자궁 및 자궁내막암. 도 1a) 유전자 부호: CT45A2, 펩티드: KYEKIFEML(서열 식별 번호: 12); 도 1b) 유전자 부호: NLRP2, 펩티드: VLYGPAGLGK(서열 식별 번호: 27), 도 1c) 유전자 부호: NLRP7, 펩티드: LLDEGAMLLY(서열 식별 번호: 31), 도 1d) 유전자 부호: HTR3A, 펩티드: GLLQELSSI(서열 식별 번호: 66), 도 1e) 유전자 부호: VTCN1, 펩티드: KVVSVLYNV(서열 식별 번호: 75), 도 1f) 유전자 부호: CYP2W1,펩티드: RYGPVFTV(서열 식별 번호: 98), 도 1g) 유전자 부호: MMP11, 펩티드: LLQPPPLLAR(서열 식별 번호: 98), 도 1h) 유전자 부호: MMP12, 펩티드: FVDNQYWRY(서열 식별 번호: 115), 도 1i) 유전자 부호: CTAG2, 펩티드: APLPRPGAVL(서열 식별 번호: 119), 도 1j) 유전자 부호: FAM111B, 펩티드: KPSESIYSAL(서열 식별 번호: 123), 도 1k) 유전자 부호: CCNA1, 펩티드: HLLLKVLAF(서열 식별 번호: 151), 도 1l) 유전자 부호: FAM83H, 펩티드: HVKEKFLL(서열 식별 번호: 156), 도 1m) 유전자 부호: MAGEA11, 펩티드: KEVDPTSHSY(서열 식별 번호: 194), 도 1n) 유전자 부호: MMP11, 펩티드: YTFRYPLSL(서열 식별 번호: 227), 도 1o) 유전자 부호: ZNF560, 펩티드: VFVSFSSLF(서열 식별 번호: 255), 도 1p) 유전자 부호: IGF2BP1, 펩티드: ISYSGQFLVK(서열 식별 번호: 266), 도 1q) 유전자 부호: CLDN6, 펩티드: LPMWKVTAF(서열 식별 번호: 303), 도 1r) 유전자 부호: IGF2BP3, 펩티드: IEALSGKIEL(서열 식별 번호: 413), 도 1s) 유전자 부호: PRAME, 펩티드: EEQYIAQF(서열 식별 번호: 432).
도 1t 내지 도 1v는 여러 암 샘플에서 고도로 과발현되거나 배타적으로 발현된 본 발명의 근원 유전자에 대한 예시적 발현 프로파일을 보여준다. 종양(검은 색 점) 및 정상(회색 점) 샘플은 원발 장기에 따라 그룹화되어 있다. 상자 수염 도표는 FPKM 중간값, 25번째와 75번째 백분위수(상자) 그리고 여전히 더 낮은 사분위의 1.5 사분위간 범위(IQR)에 있는 가장 낮은 데이터 점 및 여전히 더 높은 사분위의 1.5 IQR 내에 있는 가장 높은 데이터 점으로 연장되는 수염들을 나타낸다. 정상 기관은 위험 범주에 따라 순서대로 나와 있다. FPKM: 킬로베이스 당 및 매핑된 리드 백만개당 단편. 정상 샘플: 혈액 세포; bloodvess(혈관); 뇌; 심장; 간; 폐; adipose(지방 조직); adrenal gl(부신); 담관; 방광; 골수; 연골; esoph(식도); 눈; gall bl(담낭); 두경부; intest. la(대장); intest. sm(소장); 신장; 림프절; nerve perith(말초 신경); 췌장; parathyr(부갑상선); perit(복막); pituit(뇌하수체); 흉막; skel. mus(골격근); 피부; 비장; 위; 갑상선; 기관; 요관; 유방; 난소; 태반; 전립선; 고환; 흉선; 자궁. 종양 샘플: AML(급성 골수성 백혈병); BRCA(유방암); CCC(담관세포 암종); CLL(만성 림프구성 백혈병); CRC(결장직장암); GBC(담낭암); GBM(아교모세포종); GC(위암); HCC(간세포 암종); HNSCC(두경부 편평세포 암종); MEL(흑색종); NHL(비호지킨 림프종); NSCLCadeno(비소세포 폐암 선암종); NSCLCother(NSCLCadeno이나 NSCLCsquam으로 분명히 지정될 수 없는 NSCLC 샘플); NSCLCsquam(평편세포 비소세포 폐암); OC(난소암); OSCAR(식도암); PACA(췌장암); PRCA(전립선암); RCC(신세포 암종); SCLC(소세포 폐암); UBC(방광 암종); UEC(자궁 및 자궁내막 암). 도 1t) 유전자 부호: MAGEA4, 펩티드: SPDAESLFREALSNKVDEL(서열 식별 번호: 597), 도 1u) 유전자 부호: MAGEA4, 펩티드: LSNKVDELAHFLLRK(서열 식별 번호: 601), 도 1v) 유전자 부호: MAGEB3, 펩티드: KLITQDLVKLKYLEYRQ(서열 식별 번호: 604).
도 2는 건강한 HLA-A*02+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관 내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 보여준다. 서열 식별 번호 773(펩티드(ALYGKLLKL, 서열 식별 번호: 773)와의 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-A*02로 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다(A, 왼쪽 패널). 3주기의 자극 후, A*02/서열 식별 번호 773(A)로 염색되는 2D 다합체를 사용하여 펩티드-반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널(A)은 관련이 없는 A*02/펩티드 복합체로 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존 가능한 단일 유리(singlet) 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사건의 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 가운데 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.
도 3은 건강한 HLA-A*24+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관 내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 보여준다. 서열 식별 번호 774(펩티드와의 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-A*24로 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다(A, 왼쪽 패널). 3주기의 자극 후, A*24/서열 식별 번호 774(VYVDDIYVI, 서열 식별 번호: 774) (A)로 염색되는 2D 다합체를 사용하여 펩티드-반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널(A)은 관련이 없는 A*24/펩티드 복합체로 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존 가능한 단일 유리(singlet) 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사건의 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 가운데 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.
도 4는 건강한 HLA-A*02+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관 내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 보여준다. 서열 식별 번호 67 펩티드 SLLLPSIFL(A, 왼쪽 패널) 그리고 서열 식별 번호 75 펩티드 KVVSVLYNV(B, 왼쪽 패널)와의 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-A*02로 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다. 3주기의 자극 후, A*02/서열 식별 번호 67(A) 또는 A*02/서열 식별 번호 75(B)로 염색되는 2D 다합체를 사용하여 펩티드-반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널들(A 및 B)은 관련이 없는 A*02/펩티드 복합체로 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존 가능한 단일 유리(singlet) 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사건의 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 가운데 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.
도 5는 건강한 HLA-A*24+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관 내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 보여준다. 서열 식별 번호 11 펩티드 SYSDLHYGF(A, 왼쪽 패널) 그리고 서열 식별 번호 79 펩티드 SYNEHWNYL(B, 왼쪽 패널)와의 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-A*24로 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다. 3주기의 자극 후, A*24/서열 식별 번호 11(A) 또는 A*24/서열 식별 번호 79(B)로 염색되는 2D 다합체를 사용하여 펩티드-반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널들(A 및 B)은 관련이 없는 A*24/펩티드 복합체로 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존 가능한 단일 유리(singlet) 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사건의 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 가운데 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.
도 6은 건강한 HLA-A*07+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관 내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 보여준다. 서열 식별 번호 33 펩티드 SPTFHLTL(A, 왼쪽 패널) 그리고 서열 식별 번호 40 펩티드 KPGTSYRVTL(B, 왼쪽 패널)과의 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-B*07로 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다. 3주기의 자극 후, B*07/서열 식별 번호 33(A) 또는 B*07/서열 식별 번호 40(B)로 염색되는 2D 다합체를 사용하여 펩티드-반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널들(A 및 B)은 관련이 없는 B*07/펩티드 복합체로 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존 가능한 단일 유리(singlet) 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사건의 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 가운데 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.
도 7은 건강한 HLA-A*01+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관 내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 보여준다. 서열 식별 번호 113 펩티드 QLDSNRLTY(A, 왼쪽 패널) 그리고 서열 식별 번호 115 펩티드 FVDNQYWRY(B, 왼쪽 패널)와의 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-A*01로 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다. 3주기의 자극 후, A*01/서열 식별 번호 113(A) 또는 A*01/서열 식별 번호 115(B)로 염색되는 2D 다합체를 사용하여 펩티드-반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널들(A 및 B)은 관련이 없는 A*01/펩티드 복합체로 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존 가능한 단일 유리(singlet) 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사건의 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 가운데 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.
도 8은 건강한 HLA-A*03+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관 내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 보여준다. 서열 식별 번호 23 펩티드 GMMKGGIRK(A, 왼쪽 패널) 및 서열 식별 번호 90 펩티드 KVAGERYVYK(B, 왼쪽 패널)와의 각 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-A*03으로 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다. 3주기의 자극 후, A*03/서열 식별 번호 23(A) 또는 A*03/서열 식별 번호 90(B)으로 염색되는 2D 다합체를 사용하여 펩티드-반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널들(A 및 B)은 관련이 없는 A*03/펩티드 복합체로 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존 가능한 단일 유리(singlet) 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사건의 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 가운데 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.
도 9는 건강한 HLA-B*44+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관 내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 보여준다. 서열 식별 번호 200 AESIPTVSF(A, 왼쪽 패널) 그리고 서열 식별 번호 211 펩티드 EEKVFPSPLW(B, 왼쪽 패널)와의 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-B*44로 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다. 3주기의 자극 후, B*44/서열 식별 번호 200(A) 또는 B*44/서열 식별 번호 211(B)로 염색되는 2D 다합체를 사용하여 펩티드-반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널들(A 및 B)은 관련이 없는 B*44/펩티드 복합체로 자극한 세포의 대조 염색을 보여준다. 생존 가능한 단일 유리(singlet) 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 부울 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사건의 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 가운데 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.

실시예

실시예 1

세포 표면에 제시된 종양 연관 펩티드의 동정

조직 샘플

환자의 종양 조직과 정상 조직은 University Hospital Tuebingen(Tuebingen, 독일)으로부터 얻었다. 수술이나 부검 전에 모든 환자의 동의서가 제출되었다. 조직은 절제 후 즉시 충격동결한 다음 TUMAP의 분리까지 -70℃ 이하에서 보관했다.

조직 샘플에서 HLA 펩티드의 분리

충격 냉동된 조직 샘플의 HLA 펩티드 풀은 약간 변형된 프로토콜(Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999)에 따라 고형 조직의 면역 침전에 의해 HLA-A*02-특이 항체 BB7.2, HLA-A, -B, -C-특정 항체 W6/32, HLA-DR 특이 항체 L243 및 pan-HLA 클래스 II 특이 항체 Tue39, CNBr 활성화 세파로오스, 산 처리 및 한외 여과를 이용해 취득되었다.

질량분광 분석

얻어진 HLA 펩티드 풀은 그들의 소수성에 의해 역상 크로마토그래피를 이용하여 분리되었고(Ultimate 3000 RSLC Nano UHPLC System, Dionex) 용출되는 펩티드는 ESI 소스를 갖춘 LTQ-Orbitrap 및 융합 하이브리드 질량 분석기(ThermoElectron)에 의해 분석되었다. 펩티드 샘플은 2 cm PepMap 100 C18 Nanotrap 컬럼(Dionex)에 3%의 용매 B(20% H₂O, 80% 아세토니트릴 및 0.04% 포름산)를 사용하여 4 μL/분의 유속 및 10분의 조건하에서 로딩했다. 50℃에서 작동하는 컬럼 오븐에 장착된 입자 크기 2 μm인 25cm 또는 50cm PepMap C18 컬럼(Dionex)에서 분리를 수행했다. 적용된 기울기 범위는 300 nil/분의 유속에서(25cm 컬럼 사용) 90분 동안 또는 175 nL/분의 유속에서(50cm 컬럼 사용) 140분 동안 용매 B 3% ~ 32%였다. (용매 A: 99% H₂O, 1% ACN 및 0.1% 포름산; 용매 B: 20% H₂O, 80% ACN 및 0.1% 포름산).

질량 분석은 top five 방법(즉, 각 조사 스캔 동안 가장 풍부한 전구체 이온 5개를 단편화에 선택)을 사용하여 데이터 의존 획득 방식으로 수행했다. 대안으로는 Fusion Lumos 기기에서의 분석을 위해 TopSpeed 방법이 채택되었다.

조사 스캔은 60,000의 분해능으로(Orbitrap XL 사용) 또는 120,000의 분해능으로(Orbitrap Fusion Lumos 사용) Orbitrap에 기록했다. MS/MS 분석은 충돌 유도 분리(CID, 정규화 충돌 에너지 35%, 활성화 시간 30ms, 분리 너비1.3 m/z)에 의해 수행했으며, 추후 분석은 선형 트랩 사중극자형(LTQ)에서 수행했다. HLA 클래스 I 리간드의 질량 범위는 400-650m/z로 제한되었으며 단편화에 가능한 전하 상태는 2+ 및 3+를 선택했다. HLA 클래스 II는 질량 범위를 300-1500m/z으로 설정하며 모든 양전하 상태 ≥2로써 단편화를 허용했다.

탠덤 질량 스펙트럼은 고정된 위발견율(q≤0.05) 및 추가의 수동 제어로 MASCOT 또는 SEQUEST에 의해 해석했다. 동정된 펩티드 서열이 불확실한 경우, 그것은 서열이 동일한 합성 표준 펩티드의 단편화 패턴과 생성된 천연 펩티드의 단편화 패턴과 비교하여 이를 추가로 검증하였다.

표 19는 선택된 펩티드에서 다양한 암 객체에 대한 제시를 보여주며 따라서 표시된 암의 진단 및/또는 치료에 대해 언급된 펩티드의 특별한 관련성을 보여준다(예: 결장직장암, 담낭암, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암 및 자궁 및 자궁내막암은 서열 식별 번호 1, 유방암, 담관세포 암종, 결장직장암, 담낭암, 위암, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암 그리고 자궁 및 자궁내막암은 서열 식별 번호 2).

표 19는 종양 유형에 걸쳐 본 발명의 선택된 종양연관 펩티드 제시의 개요를 나타낸다. AML: 급성 골수성 백혈병; BRCA: 유방암; CCC: 담관세포 암종; CLL: 만성 림프구성 백혈병; CRC: 결장직장암; GBC: 담낭암; GBM: 아교모세포종; GC: 위암; GEJC: 위 분문 식도 암; HCC: 간세포 암종; HNSCC: 두경부 편평 세포 암종; MEL: 흑색종; NHL: 비호지킨 림프종; NSCLC: 비소세포 폐암; OC: 난소암; OSCAR: 식도암; PACA: 췌장암; PRCA: 전립선암; RCC: 신세포 암종; SCLC: 소세포 폐암; UBC: 방광 암종; UEC: 자궁 및 자궁내막암.

[표 19]

실시예 2

본 발명의 펩티드를 인코딩하는 유전자의 발현 프로필

정상 세포와 비교한 종양 세포 상의 펩티드의 과다 제시 또는 특이적 제시는 면역요법에서의 그 유용성에 대해 충분하며 일부 펩티드는 정상 조직에서도 발생하는 그 근원 단백질에도 불구하고 종양 특이적이다. 여전히 mRNA 발현 양상 분석은 면역요법을 위한 펩티드 표적의 선택에서 추가적 안정성 수준을 추가한다. 특히 친화도 성숙 TCR과 같은 안정성 위험이 높은 치료적 옵션의 경우에는, 이상적 표적 펩티드는 종양에 고유하며 정상 조직에는 없는 단백질로부터 유래될 것이다.

RNA 원천 및 준비

수술로 제거된 조직 검체는 위에서 나타낸 바와 같이(실시예 1 참조) 각각의 환자로부터 동의서를 얻은 다음 제공되었다. 종양 조직 검체는 수술 직후 스냅-냉동되었고 절구와 유봉을 이용하여 액체 질소 환경 아래에서 균질화되었다. 총 RNA는 TRI 시약(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 이용하여 샘플로부터 만들었으며, 이는 RNeasy(QIAGEN, Hilden, Germany)에 의해 청소되었다; 이 두 가지 방법은 모두 제조업체의 설명서에 따라 실행되었다.

RNASeq 실험을 위한 건강한 인체 조직의 총 RNA는 다음으로부터 얻었다: Asterand(Detroit, MI, 미국 & Royston, Herts, 영국); Bio-Options Inc.(Brea, CA, 미국); Geneticist Inc.(Glendale, CA, 미국); ProteoGenex Inc.(Culver City, CA, 미국); Tissue Solutions Ltd(Glasgow, 영국).

RNASeq 실험을 위한 종양 조직의 총 RNA는 다음으로부터 얻었다: Asterand(Detroit, MI, 미국 & Royston, Herts, 영국); BioCat GmbH(Heidelberg, 독일); BioServe(Beltsville, MD, 미국); Geneticist Inc.(Glendale, CA, 미국); Istituto Nazionale Tumori "Pascale"(Naples, 이태리); ProteoGenex Inc.(Culver City, CA, 미국); University Hospital Heidelberg(Heidelberg, 독일).

RNA 샘플의 양과 질은 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, Waldbronn, Germany)에 의해 RNA 6000 Pico LabChip Kit(Agilent)를 사용하여 분석되었다.

RNAseq 실험

종양 및 정상 조직 RNA 샘플의 유전자 발현 분석은 CeGaT(Tuebingen, Germany)사의 차세대 시퀀싱(RNAseq)으로 수행하였다. 간단히 말하면, 시퀀싱 라이브러리는 제공사의 프로토콜(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)에 따라 Illumina HiSeq v4 시약 키트를 사용하여 준비하며, 여기에는 RNA 분절, cDNA 변환 및 시퀀싱 어댑터 추가가 포함된다. 복수의 샘플에서 유래한 라이브러리들은 동일한 몰로 혼합한 다음, Illumina HiSeq 2500 시퀀서에서 그 제조사의 설명에 따라 서열을 결정함으로써 50 bp의 싱글 엔드 리드(single end read)를 생성한다. 처리된 리드는 STAR 소프트웨어를 사용하여 인간 게놈(GRCh38)에 대해 매핑한다. 발현 데이터는 RPKM(백만개 매핑된 리드당 킬로베이스당 리드, Cufflinks 소프트웨어에 의해 생성)으로 전사물 수준 상 그리고 엑손 수준 상(총 리드, Bedtools 소프트웨어에 의해 생성)에서 제공되며, 앙상블 서열 데이터베이스(Ensembl77)의 주석에 기반한다. 엑손 리드는 엑손 길이 및 정렬 크기에 대해 정규화하여 RPKM 수치를 얻는다.

본 발명의 난소암에서 고도로 과다 발현 또는 배타적으로 발현되는 출처 유전자의 예시적 발현 프로필이 도 1에 나와 있다. 추가의 예시적 유전자의 발현 점수가 표 10에 나와 있다.

표 10은 발현 점수를 나타낸다. 이 표는 정상 조직의 패널에 비해 OC 종양에서 매우 고도로 과발현된 유전자로부터의 펩티드들(+++), 정상 조직의 패널에 비해 OC 종양에서 고도로 과발현된 유전자로부터의 펩티드들(++) 또는 정상 조직의 패널에 비해 OC 종양에서 과발현된 유전자로부터의 펩티드들(+)을 나열한다. 이 점수의 베이스라인은 다음의 관련성 있는 정상 조직의 측정치로부터 계산했다: 지방 조직, 부신, 담관, 혈액 세포, 혈관, 골수, 뇌, 연골, 식도, 눈, 담낭, 심장, 두경부, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 신경, 부갑상선, 췌장, 뇌하수체, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 갑상선, 기관, 방광. 동일한 조직 유형에 대해 여러 샘플의 발현 데이터가 있는 경우, 모든 해당 샘플의 산술 평균을 그 계산에 사용했다.

[표 10]

실시예 3

MHC 클래스 I 제시 펩티드의 시험관 내 면역원성

본 발명의 TUMAP의 면역원성에 대한 정보를 얻기 위해, 본 발명자는 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 적재된 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 갖는 CD8+ T 세포의 반복된 자극을 근거로 시험관 내 T 세포 초회 감작을 사용하여 조사를 수행했다. 이 방법으로 우리는 지금까지 HLA-A*0201, HLA-A*24:02, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLA-B*07:02 및 HLA-B*44:02 제한된 TUMAP의 면역원성을 보여줄 수 있었으며, 이것은 이 펩티드들이 인간에 존재하는 CD8+ 전조 T 세포에 대한 T 세포 에피톱이라는 것을 보여주었다(표 11).

CD8+ T 세포의 시험관 내 감작

펩티드-MHC 복합체(pMHC) 및 항-CD28 항체가 적재된 인공 항원 제시 세포에 의한 시험관 내 자극을 수행하기 위해, 본 발명자는 독일 소재 Transfusion Medicine Tuebingen에서 동의서를 받은 건강한 공여자로부터의 CD8 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, 독일)를 사용한 양성 선택을 통해 신선한 HLA-A*02 백혈구 성분 채집 산물로부터 CD8+ T 세포를 먼저 분리했다.

PBMC 및 분리된 CD8+ 림프구는 10% 열 비활성화된 인간 AB 혈청(PAN-Biotech, Aidenbach, 독일), 100 U/mL 페니실린 / 100 μg/mL 스트렙토마이신(Cambrex, Cologne, 독일), 1 mM 피루브산 나트륨(CC Pro, Oberdorla, 독일), 20 μg/mL 젠타마이신(Cambrex)으로 보충된 RPMI-Glutamax(Invitrogen, Karlsruhe, 독일)을 포함하는 T 세포 배지(TCM)에서 사용할 때까지 배양했다. 이 단계에서 2.5 ng/mL IL-7(PromoCell, Heidelberg, 독일) 및 10 U/mL IL-2(Novartis Pharma, Nuernberg, 독일) 또한 TCM에 추가했다.

pMHC/항-CD28 코팅된 비드의 생성, T 세포 자극 및 판독은 고도로 정의된 시험관 내 체계에서 수행했으며, 자극 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자 그리고 판독 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자를 각각 사용했다.

정제된 공동-자극 쥐 IgG2a 항인체 CD28 Ab 9.3(Jung et al., 1987)은 제조사가 권장하는 술폰-N-히드록시숙신이미도비오틴을 사용하여 화학적으로 비오틴닐화 했다(Perbio, Bonn, 독일). 사용된 비드는 스트렙티비딘으로 코팅된 직경 5.6 μm의 폴리스티렌 입자였다(Bangs Laboratories, Illinois, 미국).

양성과 음성 대조 자극으로 사용되는 pMHC는 각각 A*0201/MLA-001(변형된 Melan-A/MART-1의 펩티드 ELAGIGILTV(서열 식별 번호 157))와 A*0201/DDX5- 001(DDX5 의 YLLPAIVHI, 서열 식별 번호 158)였다.

800.000 비드/200 μL는 4 x 12.5ng 비오틴-pMHC 존재 하에 96-웰 플레이트에서 코팅하고 세척한 다음 600ng 비오틴 항-CD28를 첨가하여 200 μL의 부피로 만들었다. 자극은 1x10⁶ CD8+ T 세포를 5 ng/mL IL-12(PromoCell)로 보충된 200 μL TCM에서 37℃ 및 3일 동안 세척하고 코팅된 2x10⁵ 비드와 함께 96-웰 플레이트에서 공동배양함으로써 개시했다. 매체의 반은 80 U/mL IL-2로 추가된 새로운 TCM에 의해 교환되고 배양은 37℃에서 4일간 계속되었다. 이 자극 주기는 총 세 번 수행되었다. 조건 당 8가지 다른 pMHC(분자를 사용하는 pMHC 멀티머의 판독을 위해, 이미 설명된 바와 같이(Andersen et al., 2012) 2차원 조합대수적 코팅 접근 방식을 사용했으며, 5가지 다른 형광색소와의 결합을 허용하는 약간의 변형이 있었다. 마지막으로 다합체 분석은 Live/dead 근 IR 염료(Invitrogen, Karlsruhe, 독일), CD8-FITC 항체 클론 SK1(BD, Heidelberg, 독일) 및 형광 pMHC 다합체로써 세포를 염색하여 수행했다. 분석에는 적절한 레이저 및 필터가 장착된 BD LSRII SORP 세포측정기를 사용했다. 펩티드 특이 세포는 총 CD8+ T 세포의 백분율로 계산되었다. 다합체 분석의 평가는 FCS Express 소프트웨어를(De Novo Software) 사용하여 수행되었다. 특정 다합체 + CD8+ 림프구의 시험관 내 초기감작은 음성 대조군 자극과 비교함으로써 검출되었다. 주어진 항원의 면역성은 건강한 기증자 의 최소한 하나의 시험관 내 자극된 평가 가능한 웰이 시험관 내 자극 후 CD8+ T 세포주를 보이면 발견되었다(예를 들면, 이 웰은 CD8+ T 세포 중 최소한 1%의 특정 테트라머+를 가졌으며 특정 테트라머+ 세포의 백분율은 최소한 음성 대조군 자극의 매체보다 10배여야 한다).

난소암 펩티드의 시험관 내 면역원성

실험된 HLA 클래스 I 펩티드에서, 시험관 내 면역원성은 펩티드 특정 T 세포주의 형성에 의해 입증될 수 있었다. 제2도 ~ 제9도에는 본 발명의 2개 펩티드에 대한 TUMAP 특이적 다합체 염색 후 얻은 예시적 유세포 측정 결과 그리고 상응하는 음성 대조가 나타났다. 본 발명의 118개의 펩티드에 대한 결과는 표 11a 및 표 11b에 요약되어 있다.

표 11a는 본 발명의 HLA 클래스 I 펩티드의 시험관 내 면역원성을 나타낸다. 본 발명의 펩티드에 대해 출원인이 실행한 시험관 내 면역원성 실험의 예시적 결과이다. <20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; ≥70 % = ++++.

[표 11a]

표 11b는 본 발명의 HLA 클래스 I 펩티드의 시험관 내 면역원성을 나타낸다. 본 발명의 펩티드에 대해 출원인이 실행한 시험관 내 면역원성 실험의 예시적 결과이다. <20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; ≥70 % = ++++.

[표 11b]

실시예 4

펩티드의 합성

모든 펩티드는 Fmoc-전략을 사용하여 표준 및 확립된 고체상 펩티드 합성으로써 합성되었다. 각 개별 펩티드의 정체와 순도로 질량 분석법과 분석 RP-HPLC에 의해 결정했다. 펩티드는 순도가 >50%인 흰색에서 황백색의 동결건조물(삼불화 초산염)로 얻어졌다. 모든 TUMAP는 바람직하게는 삼불화아세트산 염 혹은 아세트산 염으로 투여되지만, 다른 염의 형태 또한 가능하다.

실시예 5

MHC 결합 검정

본 발명에 따른 T 세포 기반 요법의 후보 펩티드를 MHC 결합 능력(친화도)에 대해 더 실험했다. 개별 펩티드-MHC 복합체는 UV-리간드 교환에 의해 만들었으며, UV에 민감한 펩티드가 UV 조사 후 분할된 다음 분석된 관심 대상의 펩티드로 교환되었다. 펩티드 수용성 MHC 분자를 효과적으로 결합하고 안정화시킬 수 있는 펩티드 후보만이 MHC 복합체의 해리를 막는다. 이 교환작용의 수율을 결정하기 위해, 안정화된 MHC 복합체의 경쇄(β2m) 검출에 근거하여 ELISA를 수행했다. 이 검정은 Rodenko 등에서 일반적으로 설명된대로 수행했다(Rodenko et al., 2006).

96 웰 MAXISorp 플레이트(NUNC)를 실온 그리고 PBS에서 2 ㎍/mL 스트렙타비딘으로 밤새 코팅하고 4회 세척한 다음 블로킹 완충역을 함유하는 2% BSA와 37℃에서 1시간 동안 블로킹을 진행했다. 되접기된 HLA-A*02:01/MLA-001 단량체가 표준의 역할을 했으며, 그 범위는 15-500ng/mL였다. UV-교환 반응을 위한 펩티드-MHC 단량체는 블로킹 완충제로 100배 희석되었다. 샘플은 37℃에서 1시간 배양 후 4회 세축하고 2 ㎍/mL HRP 접합된 항-β2m으로 37℃에서 1시간 배양한 다음 NH₂SO₄로 정지시킨 TMB 용액으로 검출했다. 흡광은 450nm에서 측정했다. 높은 교환 수율(바람직하게는 50% 초과, 그리고 가장 바람직하게는 75% 초과)을 보이는 후보 펩티드가 일반적으로 항체나 그 단편 및/또는 T 세포 수용체나 그 단편의 생성 및 생산을 위해 선호되는데, 이는 MHC 분자에 대한 충분한 결합성을 보이며 MHC 복합체의 해리를 막기 때문이다.

표 12는 MHC 클래스 I 결합 점수를 나타낸다. HLA 클래스 I 제한 펩티드의 HLA-A*02:01에 대한 결합 범위는 펩티드 교환 수율에 의해 정해졌다: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++.

[표 12]

표 13은 MHC 클래스 I 결합 점수를 나타낸다. HLA 클래스 I 제한 펩티드의 HLA-A*24:02에 대한 결합 범위는 펩티드 교환 수율에 의해 정해졌다: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++.

[표 13]

표 14는 MHC 클래스 I 결합 점수를 나타낸다. HLA 클래스 I 제한 펩티드의 HLA-A*01:01에 대한 결합 범위는 펩티드 교환 수율에 의해 정해졌다: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++.

[표 14]

표 15는 MHC 클래스 I 결합 점수를 나타낸다. HLA 클래스 I 제한 펩티드의 HLA-A*03:01에 대한 결합 범위는 펩티드 교환 수율에 의해 정해졌다: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++.

[표 15]

표 16은 MHC 클래스 I 결합 점수를 나타낸다. HLA 클래스 I 제한 펩티드의 HLA-B*07:02에 대한 결합 범위는 펩티드 교환 수율에 의해 정해졌다: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++.

[표 16]

표 17은 MHC 클래스 I 결합 점수를 나타낸다. HLA 클래스 I 제한 펩티드의 HLA-B*44:02에 대한 결합 범위는 펩티드 교환 수율에 의해 정해졌다: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++.

[표 17]

실시예 6

펩티드-MHC 클래스 I 복합체의 안정성

HLA-B*08:01 펩티드에 대한 펩티드-MHC 안정성 검사를 수행했다. HLA 클래스 I 분자로부터 펩티드의 해리를 측정하기 위해 유사성 기반의 동질성 실시간 분석을 사용하여 데이터를 획득했다. 첫째, 인간 재조합 HLA-B*08:01 및 β2m이 대장균에서 발현되었으며, 일련의 액체 크로마토그래피 기반의 단계를 통해 정제되었다(Ferre et al., 2003; Ostergaard et al., 2001). 그 다음 37℃에서 MHC 중쇄와 연관되는 β2m의 수량을 시간에 따라 측정하여 펩티드-MHC 복합체(pMHC)의 안정성을 결정했다(Harndahl et al., 2012). 각 pMHC의 안정성은 각 중쇄와 연관되는 β2m의 반감기로써 표현되며, 데이터를 단상 해리 공식에 맞춤으로써 계산했다.

pMHC 안정성은 해당 펩티드를 사용하는 3번의 독립적 실험으로 측정했으며, HLA-B*08:01의 범위는 약한 결합제(+)부터 매우 안정된 결합제(++++)까지 이르는 것으로 나타났다. 평균 반감기(T1/2)가 표 18에 나와 있다.

표 18은 3개의 개별 측정치에 근거한 평균 반감기(T1/2)를 나타낸다. T1/2 > 2 h = +; T1/2 > 4 h = ++; T1/2 > 6 h = +++; T1/2 > 10 h = ++++.

[표 18]

실시예 7

HLA 클래스 II 동종이형에 대해 선택된 펩티드의 결합 점수

주조직적합 복합체 클래스 II(MHC-II) 분자는 전문적인 항원 제시 세포의 표면에서 주로 발현되며, 또한 다수의 숙주 면역 반응의 시작과 결과를 조정하는 T 조력 세포에 대한 펩티드를 나타낸다. 따라서 MHC-II 분자에 의해 어떠한 펩티드가 제시될 것인지 이해하는 것이 T 조력 세포의 활성화의 이해에 중요하며 T 세포 에피토프의 파악에 사용될 수 있다. MHC 클래스 II 분자에 의해 제시되는 펩티드는 MHC α 쇄 및 β 쇄의 잔기에 의해 형성되는 결합 홈(binding groove)에 결합한다. 펩티드-MHC 결합 친화도는 펩티드-결합 핵심의 아미노산 서열에 의해 일차적으로 결정된다. HLA 클래스 II 결합 예측 알고리듬은 가장 중요한 클래스 II 대립유전자에서만 제공되며 SYFPEITHI 알고리듬을 사용하여 시험했다(Rammensee et al., 1999). 이 알고리듬은 광범위한 항원, 예를 들어 인간 종양 연관 항원 TRP2(클래스 I) (Sun et al., 2000) 및 SSX2(클래스 II)로부터 클래스 I 및 클래스 II 에피토프를 파악하는데 이미 성공적으로 사용되었다(Neumann et al., 2004). 표 20은 선택된 펩티드에 결합할 가능성이 있는 HLA 클래스 II 동종이형을 나열한다. SYFPEITHI 점수가 18이거나 그 이상이면 해당 펩티드가 HLA 분자에 결합하는 것으로 간주되었다.

표 20은 클래스 II 펩티드의 다양한 HLA 클래스 II 동종이형에 대한 결합을 나타낸다. SYFPEITHI 알고리듬에 의한 예측에 근거하면, 선택된 펩티드들이 알려진 결합 모티프가 있는 적어도 4개의 HLA 클래스 II 동종이형에 결합할 가능성이 있다. SYFPEITHI 예측 매트릭스가 있는 모든 HLA 클래스 II 대립유전자들이 나열되어 있다.

[표 20]

참조 문헌 목록

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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 715 Gly Leu Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln 1 5 10 15 Lys Asn <210> 716 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 716 Gly Leu Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln 1 5 10 15 <210> 717 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 717 Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg Gln Arg Ser Ser Arg Asp 1 5 10 15 Pro Ser <210> 718 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 718 Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser 1 5 10 15 <210> 719 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 719 Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg Gln Arg Ser Ser Arg 1 5 10 15 <210> 720 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 720 Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu 1 5 10 15 Ser <210> 721 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 721 Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu Ser Thr 1 5 10 15 Glu <210> 722 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 722 Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln 1 5 10 15 <210> 723 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 723 Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 <210> 724 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 724 Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 <210> 725 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 725 Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 726 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 726 Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu 1 5 10 <210> 727 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 727 Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val 1 5 10 15 <210> 728 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 728 Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu 1 5 10 15 <210> 729 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 729 Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu 1 5 10 <210> 730 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 730 Leu Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu 1 5 10 <210> 731 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 731 Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala 1 5 10 <210> 732 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 732 Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln 1 5 10 15 <210> 733 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 733 Ser Pro Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly 1 5 10 15 <210> 734 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 734 Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu 1 5 10 15 <210> 735 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 735 Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys 1 5 10 15 <210> 736 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 736 Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu 1 5 10 <210> 737 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 737 Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu 1 5 10 <210> 738 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 738 Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu 1 5 10 <210> 739 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 739 Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 740 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 740 Ala Pro Glu Arg Gln Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 741 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 741 Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr 1 5 10 <210> 742 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 742 Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly 1 5 10 <210> 743 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 743 Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly 1 5 <210> 744 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 744 Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile Arg Lys 1 5 10 <210> 745 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 745 Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Ser Val Thr Glu Leu Gly Pro Tyr 1 5 10 15 Thr Leu Asp Arg Asp 20 <210> 746 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 746 Glu Ile Thr Ile Thr Thr Gln Thr Gly Tyr Ser Leu Ala Thr Ser Gln 1 5 10 15 Val Thr Leu Pro 20 <210> 747 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 747 Ala Thr Thr Pro Ser Trp Val Glu Thr His Ser Ile Val Ile Gln Gly 1 5 10 15 Phe Pro His <210> 748 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 748 Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr 1 5 10 15 Val Asn Gly <210> 749 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 749 Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu 1 5 10 15 <210> 750 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 750 Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly 1 5 10 <210> 751 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 751 Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn 1 5 10 <210> 752 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 752 Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val 1 5 10 <210> 753 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 753 Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr 1 5 10 <210> 754 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 754 Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu 1 5 10 <210> 755 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 755 Ile Glu Leu Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Arg Gly Ser Leu Tyr Val Asn 1 5 10 15 Gly <210> 756 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 756 Leu Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Arg Gly Ser Leu Tyr Val Asn Gly 1 5 10 15 <210> 757 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 757 Leu Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Arg Gly Ser Leu Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 758 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 758 Leu Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Arg Gly Ser Leu Tyr Val 1 5 10 <210> 759 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 759 Glu Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn 1 5 10 15 Gly <210> 760 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 760 Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly 1 5 10 15 <210> 761 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 761 Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 762 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 762 Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr 1 5 10 <210> 763 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 763 Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu 1 5 10 <210> 764 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 764 Phe Asp Lys Ala Phe Thr Ala Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu 1 5 10 15 <210> 765 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 765 Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn 1 5 10 15 <210> 766 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 766 Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu 1 5 10 15 <210> 767 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 767 Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Ser Thr Ser Val Gly Pro Leu 1 5 10 <210> 768 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 768 Ser Asp Pro Tyr Lys Ala Thr Ser Ala Val Val Ile Thr Ser Thr 1 5 10 15 <210> 769 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 769 Ser Asp Pro Tyr Lys Ala Thr Ser Ala Val Val Ile Thr Ser 1 5 10 <210> 770 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 770 Ser Arg Lys Phe Asn Thr Met Glu Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu 1 5 10 15 <210> 771 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 771 Ser Arg Lys Phe Asn Thr Met Glu Ser Val Leu Gln Gly 1 5 10 <210> 772 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 772 Leu Gly Phe Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn 1 5 10 <210> 773 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 773 Ala Leu Tyr Gly Lys Leu Leu Lys Leu 1 5 <210> 774 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 774 Val Tyr Val Asp Asp Ile Tyr Val Ile 1 5 <210> 775 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 775 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 776 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 776 Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile 1 5

Claims (32)

1. 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 772로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 772에 대해 88% 이상 상동성인 이의 변이체 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 변이체는 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합하고/거나 상기 변이체 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하고, 상기 펩티드는 전장 폴리펩티드가 아닌, 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 MHC 클래스 I 또는 II 분자에 결합하는 능력을 갖고, 상기 MHC와 결합 시 CD4 및/또는 CD8 T 세포에 의해 인식될 수 있는, 펩티드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 772 중 어느 하나에 따른 아미노산의 연속적인 신장을 포함하는, 펩티드 또는 이의 변이체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체의 전체 길이는 8 내지 100개, 바람직하게는 8 내지 30개, 더욱 바람직하게는 8 내지 16개의 아미노산이고, 가장 바람직하게는 상기 펩티드가 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 772 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되는, 펩티드 또는 이의 변이체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 변형되고/되거나 비펩티드 결합을 포함하는, 펩티드 또는 이의 변이체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가, 특히 HLA-DR 항원-연관 불변 쇄(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는, 융합 단백질의 일부인, 펩티드 또는 이의 변이체.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합 시 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하는, 항체, 특히 가용성 또는 막 결합된 항체, 바람직하게는 단클론 항체 또는 이의 단편.
8. HLA 리간드와 반응성인 T 세포 수용체, 바람직하게는 가용성 또는 막 결합된 T 세포 수용체, 또는 이의 단편으로서, 상기 리간드가 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합 시 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체인, T 세포 수용체.
9. 제8항에 있어서, 상기 리간드의 아미노산 서열이 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 772 중 어느 하나에 대해 88% 이상 동일하거나, 상기 리간드의 아미노산 서열이 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 772 중 어느 하나로 구성되는, T 세포 수용체.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 T 세포 수용체가 가용성 분자로서 제공되고 임의적으로 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 효과기 기능을 보유하는, T 세포 수용체.
11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합된 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하는 압타머.
12. 임의적으로 이종 프로모터 서열에 연계된, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 발현하는 발현 벡터.
13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 또는 제12항에 따른 핵산 또는 발현 벡터를 포함하고, 바람직하게는 수지 세포, T 세포 또는 NK 세포와 같은 항원 제시 세포로부터 선택되는, 재조합 숙주 세포.
14. 활성화된 T 림프구를 생산하는 시험관 내 방법으로서, T 세포를 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 적절한 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포를 모방하는 인공 구축물의 표면에 발현된 항원 로딩된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자와 상기 T 세포를 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 항원이 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드인, 방법.
15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 세포를 선택적으로 인식하는, 제14항에 따른 방법에 의해 생산되는 활성화된 T 림프구.
16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제11항에 따른 압타머, 제12항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제13항에 따른 숙주 세포, 또는 제15항에 따른 활성화된 T 림프구, 또는 접합되거나 표지된 활성 성분으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성 성분, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 및 임의적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 안정화제를 포함하는 약학 조성물.
17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 생산하는 방법으로서, 제13항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포 및/또는 그 배양 배지로부터 상기 펩티드 또는 이의 변이체, 상기 항체 또는 이의 단편, 또는 상기 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
18. 의학에서의 사용을 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제11항에 따른 압타머, 제12항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제13항에 따른 숙주 세포, 또는 제15항에 따른 활성화된 T 림프구.
19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 표적 세포를 환자에서 괴사시키는 방법으로서, 효과적인 수의 제15항에 정의된 활성화된 T 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
20. 암의 진단 및/또는 치료 또는 암에 대한 약제의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제11항에 따른 압타머, 제12항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제13항에 따른 숙주 세포, 또는 제15항에 따른 활성화된 T 림프구.
21. 제20항에 있어서, 상기 암이 난소암, 간세포 암종, 결장직장암, 아교모세포종, 위암, 식도암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암, 신세포 암종, 전립선암, 흑색종, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 담낭암 및 담관암종, 방광암, 자궁암, 두경부 편평 세포 암종, 중피종, 및 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 772 중 어느 하나의 펩티드가 유래하는 단백질의 과발현을 보여주는 기타 종양의 군으로부터 선택되는, 사용.
22. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제11항에 따른 압타머, 제12항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제13항에 따른 숙주 세포, 또는 제15항에 따른 활성화된 T 림프구를 용액 또는 동결건조된 형태로 함유하는 약학 조성물을 포함하는 용기;
    (b) 임의적으로, 동결건조된 제형을 위한 희석제 또는 재구성 용액을 함유하는 제2 용기;
    (c) 임의적으로, 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 774로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드; 및
    (d) 임의적으로, (i) 용액의 사용 또는 (ii) 동결건조된 제형의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명서
    를 포함하는 키트.
23. 제22항에 있어서, (iii) 완충제, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘 또는 (vii) 주사기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 키트.
24. 개별 환자를 위한 개인화된 항암 백신 또는 화합물 기반 및/또는 세포 요법의 생산 방법으로서,
    (a) 상기 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 연관 펩티드(TUMAP)를 동정하는 단계;
    (b) 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성 및/또는 과다제시에 대해 사전선별된 펩티드들의 창고를 이용하여 상기 단계 (a)에서 동정된 펩티드를 비교하는 단계;
    (c) 상기 환자에서 동정된 TUMAP와 일치하는 하나 이상의 펩티드를 상기 창고로부터 선택하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)에 근거한 개인화된 항암 백신 또는 화합물 기반 또는 세포 요법을 제조 및/또는 배합하는 단계
    를 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 TUMAP가
    (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 동정을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교함; 및
    (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 동정하기 위해, 상기 발현 데이터와 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열의 상관관계를 결정함
    에 의해 동정되는 방법.
26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 종양 샘플로부터 분리된 MHC 분자로부터 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드를 서열결정함에 의해 MHC 리간드의 서열을 동정하는 방법.
27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직을 동일한 환자로부터 얻는 방법.
28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 창고에 포함된 펩티드들이 다음 단계들에 근거하여 동정되는 방법:
    (aa) 정상 조직과 비교하여 악성 조직에서 과발현된 유전자의 동정을 포함하는, 마이크로어레이 또는 서열결정-기반의 발현 프로필결정과 같은 고도의 병렬 방법에 의한 게놈-전체 전령 리보핵산(mRNA) 발현 분석을 수행하는 단계,
    (ab) 상기 단계 (aa)에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드를 선택하는 단계, 및
    (ac) 건강한 공여자 또는 상기 환자의 인간 T 세포를 사용하는 시험관 내 면역원성 검정을 포함하는 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도를 결정하는 단계; 또는
    (ba) 질량 분광분석 방법을 사용하여 상기 종양 샘플로부터 HLA 리간드를 동정하는 단계,
    (bb) 정상 조직과 비교하여 악성 조직에서 과발현된 유전자의 동정을 포함하는, 마이크로어레이 또는 서열결정-기반의 발현 프로필결정과 같은 고도의 병렬 방법에 의한 게놈-전체 전령 리보핵산(mRNA) 발현 분석을 수행하는 단계,
    (bc) 동정된 HLA 리간드와 상기 유전자 발현 데이터를 비교하는 단계,
    (bd) 상기 단계 (bc)에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드를 선택하는 단계,
    (be) 종양 조직 상에서 상기 단계 (bd)로부터 선택된 TUMAP 및 건강한 조직 상에서 결여되거나 덜 빈번한 검출을 재검출하고 mRNA 수준에서 과발현의 타당성을 확인하는 단계, 및
    (bf) 건강한 공여자 또는 상기 환자의 인간 T 세포를 사용하는 시험관 내 면역원성 검정을 포함하는 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도를 결정하는 단계.
29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을, 시험관 내 면역원성 검정, 개별 HLA 결합에 대한 환자 면역 모니터링, MHC 멀티머 염색, ELISPOT 검정 및/또는 세포내 시토카인 염색을 포함하는 방법으로 결정하는 방법.
30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 창고가 서열 식별 번호 1 내지 서열 식별 번호 774로 구성된 군으로부터 선택된 복수의 펩티드를 포함하는 방법.
31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 정상의 상응하는 조직에 대해 종양 샘플에 고유한 하나 이상의 돌연변이를 개별 환자로부터 동정하고, 백신에 포함시키거나 세포 요법을 생성하기 위해 상기 돌연변이와 상관관계가 있는 펩티드를 선택함을 추가로 포함하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이가 전체 유전체 서열결정에 의해 동정되는 방법.

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