BR112019015237A2

BR112019015237A2 - peptídeos e combinações de peptídeos para uso em imunoterapia contra câncer de ovário e outros cânceres

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Publication number: BR112019015237A2
Application number: BR112019015237A
Authority: BR
Inventors: Rammensee Hans-Georg; Schuster Heiko; Peper Janet; Roehle Kevin; Wagner Philipp
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2017-01-27
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2020-04-14
Also published as: ES2946584T3; US20230002473A1; IL268278A; US11248035B1; AU2021201350B2; EP4035675A3; AU2021201347A1; IL299051A; AU2021201350B9; CR20210130A; CL2020000817A1; CR20190388A; US20230312680A1; CL2021002461A1; LT3573647T; PH12019501377A1; EP3573647A1; CL2022003407A1; US20240034769A1; CL2021002459A1

Abstract

a presente invenção refere-se a peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e células para uso em métodos de imunoterapia. mais especificamente, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. a presente invenção refere-se também a epítopos de peptídeos obtidos de células t associadas a tumores, isoladamente ou combinados com outros peptídeos associados a tumores, que podem, por exemplo, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais ou que estimulam células t ex vivo, que são depois transferidas a pacientes. peptídeos, quer ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (mhc) ou peptídeos como tal, também podem ser alvos de anticorpos, de receptores de células t solúveis e de outras moléculas ligantes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PEPTÍDEOS E COMBINAÇÕES DE PEPTÍDEOS PARA USO EM IMUNOTERAPIA CONTRA CÂNCER DE OVÁRIO E OUTROS CÂNCERES. [001] A presente invenção refere-se a peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e células para uso em métodos de imunoterapia. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. A presente invenção refere-se também a epítopos de peptídeos obtidos de células T associadas a tumores, isoladamente ou combinados com outros peptídeos associados a tumores, que podem, por exemplo, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais ou que estimulam células T ex vivo, que são depois transferidas a pacientes. Peptídeos, quer ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) ou peptídeos como tal, também podem ser alvos de anticorpos, de receptores de células T solúveis e de outras moléculas ligantes.

[002] A presente invenção refere-se a diversas novas sequências peptídicas e variantes das mesmas, ambas derivadas de moléculas de HLA classe I e classe II de células tumorais humanas, que podem ser utilizadas em composições vacinais para produzir respostas imunes antitumorais ou como alvos para o desenvolvimento de compostos e células com atividade imunofarmacêutica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Câncer de ovário [003] Com cerca de 239.000 casos novos em 2012, o câncer de ovário é o sétimo câncer mais comum em mulheres, sendo responsável por 4% de todos os cânceres em mulheres. A taxa de letalidade do câncer de ovário tende a ser maior que a de outros tumores dos órgãos reprodutores femininos e ainda maior em localidades com poucos recursos. Assim, o câncer de ovário é o oitava causa mais frePetição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 20/538

2/287 quente de morte por câncer em mulheres, com 152.000 óbitos. Em 2012, quase 55% de todos os casos novos ocorreram em regiões com nível de desenvolvimento humano alto ou muito alto, sendo que 37% dos casos novos e 39% dos óbitos ocorreram na Europa e na América do Norte. As taxas de incidência são máximas na Europa Setentrional e Oriental, América do Norte e Oceania, e relativamente baixas na África e grande parte da Ásia. As taxas de incidência vêm diminuindo em alguns países com níveis de desenvolvimento humano muito alto, em especial na Europa e na América do Norte.

[004] O câncer de ovário mais comum é o carcinoma de ovário, que também é o câncer ginecológico mais letal. A doença é classificada em função da histopatologia e genética molecular em cinco tipos: carcinoma seroso de alto grau (70%), endometrioide (10%), células claras (10%), mucinoso (3%), e carcinoma de baixo grau (< 5%). Esses tipos correspondem a mais de 95% dos casos. Alguns tipos mais raros são os tumores de células germinativas (disgerminomas, tumores do saco vitelino e teratomas imaturos) (3% dos casos) e tumores do estroma do cordão sexual (1% a 2%), que podem ser malignos e cujo tipo mais comum é o tumor de células da granulosa.

[005] O câncer de ovário é mais frequente em mulheres nulíparas e mais raro em mulheres com supressão da ovulação, sobretudo pela gravidez ou por anticoncepcionais orais. Acredita-se que esses tumores se originam das células que recobrem a superfície ovariana ou o peritônio ao nível da pelve. A transformação maligna do mesotélio é explicada pela teoria da ovulação incessante (La, 2001).

[006] A história familiar de câncer de ovário é responsável por 10% dos casos, e o risco é cerca de três vezes maior em mulheres com dois ou mais parentes de primeiro grau afetados pela doença. Mulheres com mutações germinativas de BRCA1 ou BRCA2 apresentam risco 30% a 70% maior de desenvolver câncer de ovário, em es

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3/287 pecial carcinomas serosos de alto grau, até os 70 anos de idade (Risch etal., 2006).

[007] O principal tratamento do câncer de ovário, tanto nas formas precoces como nas avançadas, é a ressecção cirúrgica. O objetivo final do tratamento é remover completamente a massa tumoral do tecido saudável adjacente. A retirada cirúrgica é seguida de quimioterapia sistêmica com análogos da platina, exceto por câncer de ovário de grau muito baixo (estádio IA, grau 1), onde a quimioterapia não é indicada. No câncer de ovário avançado, a quimioterapia de primeira linha consiste em uma combinação de carboplatina com paclitaxel, que pode ser complementada com bevacizumabe. O tratamento padrão do câncer de ovário resistente à platina consiste em monoterapia com um ou mais quimioterápicos dentre doxorrubicina lipossômica peguilada, topotecana, gemcitabina ou paclitaxel (S3-I_eitlinie maligne Ovarialtumore, 2013).

[008] A imunoterapia parece ser uma estratégia promissora para melhorar o tratamento de pacientes com câncer de ovário, pois a presença de linfócitos pró-inflamatórios infiltrantes de tumores, em especial células T CD8-positivas, correlaciona-se com bom prognóstico, e células T específicas para antígenos associados a tumores podem ser isoladas de tecidos cancerosos.

[009] Portanto, grandes esforços científicos vêm sendo realizados para investigar várias imunoterapias contra o câncer de ovário. Diversos estudos pré-clínicos e clínicos já foram realizados, e outros estudos estão em andamento. Existem dados clínicos disponíveis para tratamento com citocinas, vacinação, anticorpos monoclonais, transferência de células adotivas e imunomodulação.

[0010] O tratamento com citocinas como interleucina 2, interferon alfa, interferon gama ou fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos visa a estimular a resposta imune antitumoral da paciente.

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Esses tratamentos se mostraram promissores em estudos em pequenos grupos.

[0011] Os ensaios fase I e fase II de vacinação com um ou vários peptídeos derivados de diversas proteínas associadas a tumores (por exemplo, Her2/neu, NY-ESO-1, p53 ou Tumor de Wilms-1) ou com antígenos derivados de células tumorais autólogas mostraram perfis favoráveis de eficácia e tolerabilidade, mas seus efeitos clínicos foram poucos ou moderados.

[0012] Acredita-se que os anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente as proteínas associadas a tumores promovem a morte imunomediada de células tumorais. Os anticorpos anti-CA-125 oregovomabe e abagovomabe e o anticorpo anti-EpCAM catumaxomabe produziram resultados promissores em estudos de fase 2 e 3. Por outro lado, o anticorpo anti-MUC1 HMFG1 não produziu melhora da sobrevida em um estudo de fase III.

[0013] Outra abordagem consiste em usar anticorpos monoclonais que atuam sobre receptores de células tumorais, bloqueando fatores de crescimento e agindo sobre receptores que influenciam a sobrevida celular. A administração do anticorpo anti-HER2/neu trastuzumabe e dos anticorpos antirreceptor alfa de folato MOv18 e MORAb-003 proporcionaram pouco benefício clínico, mas a adição do anticorpo antiVEGF bevacizumabe ao esquema quimioterápico padrão do câncer de ovário parece ser vantajosa.

[0014] A transferência adotiva de células imunológicas produziu resultados inconstantes em ensaios clínicos. A transferência de células T infiltrantes de tumores autólogas e expandidas in vitro se mostrou promissora em um ensaio, mas a transferência de células T com um receptor antigênico quimérico específico para o receptor alfa de folato não produziu respostas clínicas significativas em um ensaio de fase I. Células dendríticas pulsadas in vitro com um lisado de células tumo

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5/287 rais ou proteínas associadas a um tumor mostraram-se capazes de promover a atividade antitumoral de células T após serem transferidas, mas a magnitude da ativação de células T não se correlacionou com os efeitos clínicos. A transferência de células natural killer produziu toxicidade significativa em um ensaio fase II.

[0015] A imunidade antitumoral intrínseca e a imunoterapia são inibidas pelo microambiente do tumor, que possui propriedades imunossupressoras. Para contornar esse obstáculo, fármacos imunomoduladores como a ciclofosfamida, anticorpos anti-CD25 e doxorrubicina lipossômica peguilada vêm sendo testadas em associação com imunoterapia. Os dados mais confiáveis disponíveis atualmente são os do ipilimumabe, um anticorpo anti-CTLA4 que promove a atividade de células T. O ipilimumabe demonstrou efeitos antitumorais significativos em pacientes com câncer de ovário (Mantia-Smaldone etaL, 2012).

[0016] Como o tratamento do câncer é dispendioso e produz graves efeitos colaterais, existe uma necessidade de identificação de fatores que possam se empregados no tratamento do câncer em geral e do carcinoma de ovário em particular. Também é necessário identificar fatores que representem biomarcadores de câncer em geral e do câncer de ovário em particular. Isso permitiría melhorar o diagnóstico, avaliar o prognóstico e prever o sucesso do tratamento do câncer.

[0017] A imunoterapia é uma modalidade que age sobre antígenos associados a tumores existentes e serve como opção que age especificamente sobre as células tumorais e, ao mesmo tempo, minimiza os efeitos colaterais.

[0018] A classificação atual de antígenos associados a tumores (AATs) compreende os seguintes grupos principais:

[0019] Antígenos de câncer testicular: Os primeiros AATs reconhecíveis por células T a serem identificados pertencem a essa classe, que foi denominada inicialmente antígenos de câncer testicular (CT)

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6/287 porque seus membros são expressos em tumores humanos histologicamente diferentes ao passo que, em tecidos normais, ocorrem apenas em espermatócitos e espermatogônias nos testículos e, ocasionalmente, na placenta. Como as células testiculares não expressam moléculas de HLA classe I e II, esses antígenos não podem ser reconhecidos pelas células T em tecidos normais e podem, portanto, ser considerados imunologicamente específicos para o tumor. Alguns exemplos mais bem conhecidos de antígenos de CT são os membros da família MAGE e o NY-ESO-1.

[0020] Antígenos de diferenciação: Estes AATs são compartilhados por tumores e pelos tecidos normais dos quais o tumor se originou, e a maioria dos antígenos de diferenciação conhecidos se concentram em melanomas e em melanócitos normais. Muitas dessas proteínas relacionadas à linhagem melanocitária participam da biossíntese da melanina e, portanto, não são específicas para tumores, embora sejam amplamente utilizadas para imunoterapia do câncer. Alguns exemplos são, entre outros, a tirosinase e Melan-A/MART-1 em melanoma e PSA em câncer de próstata.

[0021] AATs sobrexpressos: Os genes que codificam AATs amplamente expressos foram detectados tanto em tumores de diversos tipos histológicos como em muitos tecidos normais, geralmente com níveis de expressão mais baixos. É possível que muitos dos epítopos processados e que podem ser apresentados por tecidos normais estejam abaixo do limiar para reconhecimento pelas células T, ao passo que sua sobrexpressão em células tumorais pode desencadear uma resposta anticâncer ao quebrar a tolerância estabelecida anteriormente. Alguns exemplos conhecidos desta classe de AAT são o Her-2/neu, a survivina e a telomerase ou WT1.

[0022] Antígenos específicos para tumores: Estes AATs únicos se originam de mutações de genes normais (por exemplo, β-catenina,

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CDK4, etc.). Algumas dessas alterações moleculares estão associadas a transformação e/ou progressão neoplásica. Os antígenos específicos para tumores são geralmente capazes de induzir fortes respostas imunológicas sem criar risco de reações imunes contra tecidos normais. Por outro lado, estes AATs são, na maioria dos casos, relevantes apenas ao tumor específico em que foram identificados e geralmente não são compartilhados por vários tumores individuais. Um peptídeo também pode ser específico para tumores (ou associado a tumores) se for originário de um éxon presente em (ou associado a) um tumor no caso de proteínas com isoformas específicas para (ou associadas a) tumores.

[0023] AATs originários de modificações pós-traducionais anormais: Estes AATs podem se originar de proteínas que não são nem específicas nem sobrexpressas em tumores, mas mesmo assim adquirem associação tumoral por processos pós-traducionais que atuam sobretudo em tumores. Alguns exemplos dessa classe surgem de alterações de padrões de glicosilação, que produzem novos epitopes em tumores como no MUC1 ou eventos como splicing de proteínas durante a degradação, que podem ou não ser específicos para tumores.

[0024] Proteínas oncovirais: Estes AATs são proteínas virais que podem desempenhar um importante papel no processo oncogênico e, por serem de origem estranha (não humana), podem produzir respostas de células T. São exemplos destas proteínas as proteínas do papilomavírus humano tipo 16, E6 e E7, que são expressas no carcinoma de colo do útero.

[0025] A imunoterapia baseada em células T age contra epitopes peptídicos derivados de proteínas associadas a ou específicas para tumores, que são apresentadas por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Os antígenos reconhecidos por linfócitos T específicos para tumores, ou seja, epitopes dos mesmos, podem

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8/287 ser moléculas derivadas de todas as classes de proteínas, como enzimas, receptores, fatores de transcrição, etc., que são expressas e normalmente apresentam regulação positiva em células do tumor em comparação com células inalteradas da mesma origem.

[0026] As moléculas de MHC podem ser de duas classes: MHC classe I e MHC classe II. As moléculas de MHC classe I consistem em uma cadeia pesada alfa e em uma beta-2 microglobulina, As moléculas de MHC classe II consistem em uma cadeia alfa e outra beta. Sua conformação tridimensional produz um sulco de ligação, que é empregado na interação não covalente com peptídeos.

[0027] As moléculas de MHC classe I são encontradas na maioria das células nucleadas. Elas apresentam peptídeos derivados da divagem proteolítica de proteínas predominantemente endógenas, produtos ribossômicos defeituosos (DRIPs) e peptídeos maiores. Entretanto, os peptídeos derivados de compartimentos endossômicos ou de fontes exógenas também são frequentemente encontrados em moléculas de MHC classe I. Na literatura, essa apresentação não clássica de MHC classe I é denominada apresentação cruzada (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). As moléculas de MHC classe II são encontradas predominantemente em células apresentadores de antígenos (CAA) profissionais e apresentam sobretudo peptídeos de proteínas exógenas ou de proteínas transmembrana, que são captadas pelas CAA, por exemplo, durante a endocitose e depois processadas.

[0028] Os complexos formados por peptídeos e MHC classe I são reconhecidos por células T CD8-positivas que apresentam o receptor de célula (TCR) apropriado, ao passo que complexos de peptídeos com moléculas de MHC classe II são reconhecidos por células T auxiliares CD4-positivas que apresentam o TCR apropriado. É bem sabido que, em razão dessa modalidade o TCR, o peptídeo e o MHC estão presentes em proporções estequiométricas de 1:1:1.

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9/287 [0029] As células T auxiliares CD4-positivas desempenham um importante papel em induzir e manter respostas eficazes de células T citotóxicas CD8-positivas. A identificação de epítopos CD4-positivos de células T derivados de antigenos associados a tumores (AAT) é de grande importância para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos para desencadear respostas imunes antitumorais (Gnjatic etal., 2003). No sítio do tumor, as células T auxiliares suportam um meio com células T citotóxicas propício para LTC (Mortara et al., 2006) e atraem células efetoras como, por exemplo, LTCs, células natural killer (NK), macrófagos e granulócitos (Hwang etal., 2007).

[0030] Na ausência de inflamação, a expressão de moléculas de MHC classe II restringe-se basicamente a células do sistema imunológico, especialmente células apresentadoras de antigenos (APC) profissionais, como monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos e células dendríticas. Em pacientes com câncer, constatou-se que as células tumorais expressam moléculas de MHC classe II (Dengjel et al., 2006).

[0031] Os peptídeos prolongados (mais longos) da invenção podem atuar como epítopos ativos de MHC classe II.

[0032] As células T auxiliares ativadas por epítopos do MHC classe II desempenham um importante papel em orquestrar a função efetora de LTC na imunidade antitumoral. Os epítopos de células T auxiliares que desencadeiam a resposta de células T auxiliares do tipo TH1 auxiliam as funções efetoras de células T killer CD8-positivas, incluindo funções citotóxicas dirigidas contra células tumorais cujas superfícies apresentam complexos de peptídeos associados a tumor e MHC. Desse modo, os epítopos peptídicos em células T auxiliares associadas a tumores podem, isoladamente ou em associação com outros peptídeos associados a tumores, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes

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10/287 antitumorais.

[0033] Mostrou-se em modelos animais mamíferos (por exemplo, camundongos) que, mesmo na ausência de linfócitos T CD8-positivos, as células T CD4-positivas são suficientes para inibir a manifestação de tumores por meio da inibição da angiogênese mediada pela secreção de interferon gama (IFNy) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Algumas evidências indicam que as células T CD4 exercem efeitos antitumorais diretos (Braumuller et al., 2013; Tran et al.,

2014).

[0034] Como a expressão constitutiva de moléculas de HLA classe é geralmente limitada a células imunológicas, a possibilidade de isolar peptídeos de classe II diretamente de tumores primários era considerada implausível. Entretanto, Dengjel et al. conseguiram identificar uma série de epítopos de MHC classe II diretamente em tumores (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).

[0035] Como ambos os tipos de resposta (a dependente de CD4 e a dependente de CD8) contribuem conjunta e sinergisticamente para o efeito antitumoral, a identificação e caracterização de antígenos associados a tumores reconhecidos tanto por células T CD8+ (cujo ligante é a molécula de MHC classe I e seu epítopo peptídico) como por células T auxiliares CD4-positivas (cujo ligante é a molécula de MHC classe II e seu epítopo peptídico) são importantes para o desenvolvimento de vacinas antitumorais.

[0036] Para que um peptídeo de MHC classe I possa desencadear (provocar) uma resposta imune celular, ele precisa ligar-se a uma molécula de MHC. O processo depende do alelo da molécula de MHC e de polimorfismos específicos da sequência de aminoácidos do peptídeo. Os peptídeos ligantes de MHC classe I geralmente possuem 8 a resíduos de aminoácidos de comprimento e geralmente contêm dois resíduos conservados (âncoras) em suas sequências que inte

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11/287 ragem com o sulco de ligação correspondente da molécula de MHC. Dessa forma, cada alelo de MHC possui um motivo de ligação que determina quais peptídeos podem se ligar especificamente ao sulco de ligação.

[0037] Nas reações imunes dependentes do MHC classe I, os peptídeos precisam tanto ser capazes de se ligarem a certas moléculas de MHC classe I expressas em células tumorais como serem posteriormente reconhecidos por células T que apresentam receptores de células T (TCR) específicos.

[0038] Para as proteínas serem reconhecidas pelos linfócitos T como antigenos específicos para ou associados a tumores, e serem usadas como tratamentos, alguns pré-requisitos precisam ser atendidos. O antígeno deve ser expresso sobretudo por células tumorais e ser expresso relativamente pouco ou nada por tecidos normais saudáveis. Em uma modalidade preferida, o peptídeo deve ser apresentado de maneira exacerbada pelas células tumorais em comparação com os tecidos normais. Outrossim, é desejável também que o respectivo antígeno esteja presente apenas em um determinado tipo de tumor, mas também em concentrações elevadas (isto é, números de cópias do respectivo peptídeo por célula). Os antigenos específicos para ou associados a tumores são frequentemente derivados de proteínas que participam diretamente da transformação de uma célula normal em uma célula tumoral devido à sua função; por exemplo, controle do ciclo celular ou supressão da apoptose. Além disso, alvos distais da proteína que causa diretamente a transformação podem apresentar regulação positiva e, portanto, associarem-se indiretamente ao tumor. Tais antigenos associados indiretamente a tumores também podem ser alvos de abordagens vacinais (Singh-Jasuja et al., 2004). É essencial que os epítopos estejam presentes na sequência de aminoácidos do antígeno para garantir que o peptídeo (peptídeo imunogênico) deri

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12/287 vado de um antígeno associado a tumor produza uma resposta de células T in vivo ou in vitro.

[0039] Basicamente, qualquer peptídeo capaz de se ligar a uma molécula de MHC pode funcionar como epítopo de célula T. Um prérequisito para indução de resposta de células T in vitro ou in vivo é a presença de uma célula T com um TCR correspondente e ausência de tolerância imunológica para o epítopo em questão.

[0040] Portanto, os AATs servem como ponto de partida para desenvolver tratamentos à base de células T, incluindo, entre outros, vacinas antitumorais. Os métodos utilizados para identificar e caracterizar os AATs normalmente se baseiam no uso de células T, que podem ser isoladas de pacientes ou de indivíduos saudáveis ou baseadas na geração de perfis diferentes de transcrição ou de expressão peptídica em tumores e em tecidos normais. Entretanto, a identificação de genes sobrexpressos em tecidos tumorais ou em linhagens de tumores humanos ou expressos seletivamente em tais tecidos ou linhagens celulares não proporciona informações precisas sobre o uso dos antígenos que são transcritos a partir desses genes em imunoterapia. Isso ocorre porque apenas uma determinada subpopulação de epitopes desses antígenos é apropriada para tal aplicação, pois uma célula T com um TCR correspondente precisa estar presente e é preciso que haja pouca ou nenhuma tolerância imunológica ao epítopo em questão. Portanto, é importante, em uma modalidade bastante preferida da invenção, selecionar apenas peptídeos sobrexpressos ou apresentados seletivamente contra os quais se possa encontrar células T funcionais e/ou em proliferação. Tais células T funcionais são definidas como células T que, quando estimuladas por um antígeno específico, podem se expandir de forma clonal e são capazes de executar funções efetoras (célula T efetora).

[0041] No caso de TCRs específicos contra complexos peptídeo

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MHC (por exemplo, TCRs solúveis) e anticorpos ou outras moléculas ligantes (suportes) de acordo com a invenção, a imunogenicidade dos peptídeos subjacentes é secundária. Nesses casos, o fator determinante é a apresentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0042] Em um primeiro aspecto da presente invenção, a mesma refere-se a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 ou a uma sequência variante dos mesmos com pelo menos 77% de homologia, e preferivelmente pelo menos 88% de homologia (preferivelmente pelo menos 77% ou pelo menos 88% idêntica) com SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772, em que a referida variante se liga ao MHC e/ou induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo no qual o referido peptídeo não corresponde ao polipeptídeo completo original.

[0043] A presente invenção refere-se a um peptídeo da presente invenção que compreende uma sequência selecionada do grupo formado por SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 ou uma variante das mesmas que seja pelo menos 77%, e preferivelmente pelo menos 88%, homóloga (preferivelmente pelo menos 77% ou pelo menos 88% idêntica) à SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772, sendo que cada um dos peptídeos referidos ou variantes dos mesmos possui comprimento total de 8 a 100, preferivelmente de 8 a 30 e, mais preferivelmente, de 8 a 14 aminoácidos.

[0044] As tabelas a seguir mostram os peptídeos de acordo com a presente invenção, seus respectivos números de SEQ e os genes que podem originá-los (subjacentes). Na Tabela 1, os peptídeos com SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 9 se ligam ao HLA-A*02, peptídeos com SEQ N^Q 10 a SEQ N^Q 19 se ligam ao HLA-A*24, peptídeos com SEQ N^Q 20 a SEQ N^Q 30 se ligam ao HLA-A*03, peptídeos com SEQ N^Q 31 se ligam ao HLA-A*01, peptídeos com SEQ N^Q 32 a SEQ N^Q 41 se ligam ao HLAPetição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 32/538

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B*07, peptideos com SEQ N^Q 42 a SEQ N^Q 51 se ligam ao HLA-B*08, peptideos com SEQ N^Q 52 a SEQ N^Q 59 se ligam ao HLA-B*44 Na Tabela 2, os peptideos com SEQ N^Q 60 a SEQ N^Q 75 se ligam ao HLAA*02, peptideos com SEQ N^Q 76 a SEQ N^Q 82 se ligam ao HLA-A*24, peptideos com SEQ N^Q 83 a SEQ N^Q 111 se ligam ao HLA-A*03, peptideos com SEQ N^Q 112 a SEQ N^Q 116 se ligam ao HLA-A*01, peptideos com SEQ N^Q 117 a SEQ N^Q 149 se ligam ao HLA-B*07, peptideos com SEQ N^Q 150 a SEQ N^Q 172 se ligam ao HLA-B*08, peptideos com SEQ N^Q 173 a SEQ N^Q 215 se ligam ao HLA-B*44. Na Tabela 3, os peptideos com SEQ N^Q 216 a SEQ N^Q 245 se ligam ao HLAA*02, peptideos com SEQ N^Q 246 a SEQ N^Q 255 se ligam ao HLAA*24, peptideos com SEQ N^Q 256 a SEQ N^Q 287 se ligam ao HLAA*03, peptideos com SEQ N^Q 288 a SEQ N^Q 292 se ligam ao HLAA*01, peptideos com SEQ N^Q 293 a SEQ N^Q 392 se ligam ao HLAB*07, peptideos com SEQ N^Q 393 a SEQ N^Q 395 se ligam ao HLAB*08, peptideos com SEQ N^Q 396 a SEQ N^Q 438 se ligam ao HLAB*44. Na Tabela 4, os peptideos com SEQ N^Q 439 a SEQ N^Q 551 se ligam a vários alelos de HLA classe I, peptideos com SEQ N^Q 773 se ligam ao HLA-A*02, peptideos com SEQ N^Q 774 se ligam ao HLAA*24. Na Tabela 5, os peptideos com SEQ N^Q 552 a SEQ N^Q 772 se ligam a vários alelos de HLA classe II.

Tabela 1: Peptideos de acordo com a presente invenção.

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
1	MIPTFTALL	LILRB4	Q8NHJ6	A*02
2	TLLKALLEI	IDO1	P14902	A*02
3	ALIYNLVGI	ATP7A, ATP7B, CTAGE1	P35670	A*02
4	ALFKAWAL	IRF4	Q15306	A*02
5	RLLDFINVL	OVGP1	Q12889	A*02
6	SLGKHTVAL	OVGP1	Q12889	A*02

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 33/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
7	ALQAFEFRV	PCDHB5, PCDHB15, PCDHB11, PCDHB10, PCDHB9, PCDHB8, PCDHB7, PCDHB4, PCDHB3, PCDHB2, PCDHB16	Q9Y5E7	A*02
8	YLVTKVVAV	PCDHGA12, PCDHB5, PCDHB1, PCDHB18, PCDHGB7, PCDHGB6, PCDHGB5, PCDHGB3, PCDHGB2, PCDHGB1, PCDHGA11, PCDHGA10, PCDHGA9, PCDHGA7, PCDHGA6, PCDHGA5, PCDHGA4, PCDHGA3, PCDHGA2, PCDHGA1, PCDHGB8P, PCDHB15, PCDHB14, PCDHB13, PCDHB12, PCDHB11, PCDHB10, PCDHB9, PCDHB8, PCDHB7, PCDHB6, PCDHB4, PCDHB3, PCDHB2, PCDHB16, PCDHGB4, PCDHGA8	060330, Q96TA0, Q9NRJ7, Q9UN66, Q9UN67, Q9UN71, Q9Y5E1, Q9Y5E2, Q9Y5E3, Q9Y5E4, Q9Y5E5, Q9Y5E6, Q9Y5E7, Q9Y5E8, Q9Y5E9, Q9Y5F0, Q9Y5F1, Q9Y5F2, Q9Y5F3, Q9Y5F8, Q9Y5F9, Q9Y5G0, Q9Y5G1, Q9Y5G2, Q9Y5G3, Q9Y5G4, Q9Y5G5, Q9Y5G6, Q9Y5G7, Q9Y5G8, Q9Y5G9, Q9Y5H0, Q9Y5H1, Q9Y5H2, Q9Y5H3, Q9Y5H4	A*02
9	VLLAGFKPPL	RNF17	Q9BXT8	A*02
10	RYSDSVGRVS F	CAPN13	Q6MZZ7	A*24
11	SYSDLHYGF	CAPN13	Q6MZZ7	A*24
12	KYEKIFEML	CT45A3, CT45A4, CT45A5, CT45A6, CT45A1, CT45A2	Q5DJT8	A*24
13	VYTFLSSTL	ESR1	P03372	A*24
14	FYFPTPTVL	FOLR1	P15328	A*24
15	VYHDDKQPTF	GXYLT2	A0PJZ3	A*24
16	IYSPQFSRL	MY03B	Q8WXR4	A*24
17	RFTTMLSTF	OVGP1	Q12889	A*24
18	KYPVHIYRL	RAD54B	Q9Y620	A*24
19	KYVKVFHQF	ZNF90, ZNF93, ZNF486	Q96H40	A*24

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 34/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
20	RMASPVNVK	C2orf88	Q9BSF0	A*03
21	AVRKPIVLK	CDCA5	Q96FF9	A*03
22	SLKERNPLK	CDH3	P22223	A*03
23	GMMKGGIRK	ESR1	P03372	A*03
24	SMYYPLQLK	GXYLT2	A0PJZ3	A*03
25	GTSPPSVEK	MUC16	Q8WXI7	A*03
26	RISEYLLEK	MY03B	Q8WXR4	A*03
27	VLYGPAGLGK	NLRP2	Q9NX02	A*03
28	KTYETNLEIKK	NLRP7	Q8WX94	A*03
29	QQFLTALFY	NLRP7, NLRP2	Q8WX94	A*03
30	ALEVAHRLK	ZBTB12	Q9Y330	A*03
31	LLDEGAMLLY	NLRP7	Q8WX94	A*01
32	SPNKGTLSV	BCAM	P50895	B*07
33	SPTFHLTL	BCAM	P50895	B*07
34	LPRGPLASLL	CDH3	P22223	B*07
35	FPDNQRPAL	ETV4	P43268	B*07
36	APAAWLRSA	MMP11	P24347	B07/B5 5
37	RPLFQKSSM	MUC16	Q8WXI7	B*07
38	SPHPVTALLTL	MUC16	Q8WXI7	B*07
39	RPAPFEVVF	NXNL2	Q5VZ03	B*07
40	KPGTSYRVTL	SPON1	Q9HCB6	B*07
41	RVRSRISNL	TCEA1P2, TCEA1, TCEA2, TCEA3	Q15560	B*07
42	TLKVTSAL	BCAM	P50895	B*08
43	ALKARTVTF	CCR2, CCR5	P51681	B*08
44	LNKQKVTF	CTAGE4, CTAGE5	015320	B*08
45	VGREKKLAL	CTAGE4, CTAGE5	015320	B*08
46	DMKKAKEQL	FUNDC2P2, FUNDC2P3, FUNDC2	Q9BWH2	B*08
47	MPNLRSVDL	LRRTM1	Q86UE6	B*08
48	DVKKKIKEV	MFN1	Q8IWA4	B*08
49	LPRLKAFMI	ST6GALNAC5	Q9BVH7	B*08
50	DMKYKNRV	TCEA1P2, TCEA1, TCEA2	Q15560	B*08
51	SLRLKNVQL	VTCN1	Q7Z7D3	B*08
52	AEFLLRIFL	CAPN13	Q6MZZ7	B*44

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 35/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
53	MEHPGKLLF	ESR1	P03372	B*44
54	AEITITTQTGY	MUC16	Q8WXI7	B*44
55	HETETRTTW	MUC16	Q8WXI7	B*44
56	SEPDTTASW	MUC16	Q8WXI7	B*44
57	QESDLRLFL	NLRP7, NLRP2	Q9NX02	B*44
58	GEMEQKQL	PNOC	Q13519	B*44
59	SENVTMKVV	VTCN1	Q7Z7D3	B*44

Tabela 2: Outros peptídeos de acordo com a presente invenção.

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
60	GLLSLTSTLYL	BCAM	P50895	A*02
61	YMVHIQVTL	CD70	P32970	A*02
62	KVLGVNVML	CRABP2	P29373	A*02
63	MMEEMIFNL	EYA2	000167	A*02
64	FLDPDRHFL	FAM83H	Q6ZRV2	A*02
65	TMFLRETSL	GUCY1A2	P33402	A*02
66	GLLQELSSI	HTR3A	P46098	A*02
67	SLLLPSIFL	HTR3A	P46098	A*02
68	KLFDTQQFL	IRF4	Q15306	A*02
69	TTYEGSITV	MUC16	Q8WXI7	A*02
70	VLQGLLRSL	MUC16	Q8WXI7	A*02
71	YLEDTDRNL	NFE2L3	Q9Y4A8	A*02
72	YLTDLQVSL	NFE2L3	Q9Y4A8	A*02
73	FLIEELLFA	OVGP1	Q12889	A*02
74	SQSPSVSQL	PRAME	P78395	A*02
75	KVVSVLYNV	VTCN1	Q7Z7D3	A*02
76	KYVAELSLL	CCNA1	P78396	A*24
77	RYGPVFTV	CYP2W1	Q8TAV3	A*24
78	SFAPRSAVF	HOXD9	P28356	A*24
79	SYNEHWNYL	LTBR	P36941	A*24
80	TAYMVSVAAF	SDK2	Q58EX2	A*24
81	VYNHTTRPL	SPINT1	043278	A*24
82	SYFRGFTLI	SPON1	Q9HCB6	A*24

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 36/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
83	GTYAHTVNR	ALPI, ALPP, ALPPL2	P05187, P09923	A03/ A31
84	KLQPAQTAAK	ALPP, ALPPL2	P05187	A*03
85	VLLGSLFSRK	BCL2L1	Q07817	A*03
86	VVLLGSLFSRK	BCL2L1	Q07817	A03/ A31/ A*66
87	AVAPPTPASK	CBX2	Q14781	A*03/ ΑΊ1
88	VVHAVFALK	CCR5	P51681	A*03
89	RVAELLLLH	CDKN2A, CDKN2B	P42771, P42772	A*03
90	KVAGERYVYK	ETV1, ETV4, ETV5	P41161, P43268, P50549	A*03
91	RSLRYYYEK	ETV1, ETV4, ETV5	P43268	A*03
92	SVFPIENIY	EYA2	000167	A*03
93	KILEEHTNK	FSBP, RAD54B	095073	A*03
94	ATFERVLLR	GUCY1A2	P33402	A*03/ ΑΊ1
95	QSMYYPLQLK	GXYLT2	A0PJZ3	A*03
96	TAFGGFLKY	LAMA1	P25391	A*03
97	TMLDVEGLFY	LAMA1	P25391	A*03
98	LLQPPPLLAR	MMP11	P24347	A*03
99	KVVDRWNEK	MRPL51	Q4U2R6	A*03
100	RLFTSPIMTK	MUC16	Q8WXI7	A*03
101	RVFTSSIKTK	MUC16	Q8WXI7	A*03
102	SVLTSSLVK	MUC16	Q8WXI7	A*03
103	TSRSVDEAY	MUC16	Q8WXI7	A*03
104	VLADSVTTK	MUC16	Q8WXI7	A*03
105	RLFSWLVNR	MY01B	Q8WXR4	A*03
106	AAFVPLLLK	NCAPD2	Q15021	A*03/ ΑΊ1
107	RLQEWKALK	PDCL2	Q8N4E4	A*03
108	VLYPVPLESY	PRAME	P78395	A*03
109	KTFTIKRFLAK	RPL39L	Q96EH5	A*03
110	SAAPPSYFR	SPON1	Q9HCB6	A03/ ΑΊ1/ A66

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 37/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
111	TLPQFRELGY	WNT7A	000755	A*03
112	TVTGAEQIQY	CAPN13	Q6MZZ7	A*01
113	QLDSNRLTY	LRRTM1	Q86UE6	A*01
114	VMEQSAGIMY	LYPD1	Q8N2G4	A*01
115	FVDNQYWRY	MMP12	P39900	A*01
116	VLLDEGAMLLY	NLRP7	Q8WX94	A*01
117	APRLLLLAVL	BCAM	P50895	B*07
118	SPASRSISL	CD70	P32970	B*07
119	APLPRPGAVL	CTAG2	075638	B*07
120	RPAMNYDKL	ETV1, ETV4, ETV5, SPDEF	P43268	B*07
121	VPNQSSESL	EYA2	000167	B07/ B35
122	YPGFPQSQY	EYA2	000167	B07/ B35
123	KPSESIYSAL	FAM111B	Q6SJ93	B*07
124	LPSDSHFKITF	FAM111B	Q6SJ93	B*07
125	VPVYILLDEM	FAM83H	Q6ZRV2	B07/ B35
126	KPGPEDKL	FOLR1, FOLR2	P15328	B*07
127	APRAGSQVV	FUNDC2	Q9BWH2	B*07
128	YPRTITPGM	KLK14	Q9P0G3	B*07
129	APRPASSL	MMP11	P24347	B*07
130	FPRLVGPDF	MMP11	P24347	B*07
131	APTEDLKAL	MSLN	Q13421	B*07
132	IPGPAQSTI	MUC16	Q8WXI7	B*07
133	MPNLPSTTSL	MUC16	Q8WXI7	B*07
134	RPIVPGPLL	MUC16	Q8WXI7	B*07
135	RVRSTISSL	MUC16	Q8WXI7	B*07
136	SPFSAEEANSL	MUC16	Q8WXI7	B*07
137	SPGATSRGTL	MUC16	Q8WXI7	B*07
138	SPMATTSTL	MUC16	Q8WXI7	B*07
139	SPQSMSNTL	MUC16	Q8WXI7	B*07
140	SPRTEASSAVL	MUC16	Q8WXI7	B*07
141	SPMTSLLTSGL	MUC16	Q8WXI7	B*07
142	TPGLRETSI	MUC16	Q8WXI7	B*07

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 38/538

20/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
143	SPAMTSTSF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
144	SPSPVSSTL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
145	SPSSPMSTF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
146	IPRPEVQAL	PLEKHG4	Q58EX7	B*07
147	APRWFPQPTV V	VTCN1	Q7Z7D3	B*07
148	KPYGGSGPL	ZNF217	075362	B*07
149	GPREALSRL	ZSCAN30, ZNF263, ZNF500, ZKSCAN4, ZNF323, ZKSCAN1, ZNF165, ZNF187, ZKSCAN3, ZNF397, ZSCAN12	014978, 043309, 060304, P17029, P49910, Q16670, Q86W11, Q8NF99, Q969J2, Q96LW9, Q9BRR0	B*07
150	MAAVKQAL	BCL2L1	Q07817	B*08
151	HLLLKVLAF	CCNA1	P78396	B*08
152	MGSARVAEL	CDKN2A, CDKN2B	P42771	B*08
153	NAMLRKVAV	CRABP1	P29762	B*08
154	MLRKIAVAA	CRABP2	P29373	B*08
155	NKKMMKRLM	DPPA2	Q7Z7J5	B*08
156	HVKEKFLL	FAM83H	Q6ZRV2	B*08
157	EAMKRLSYI	LAMC2	Q13753	B*08
158	LPKLAGLL	LINC00176	Q6ZNR8	B08/ B07
159	VLKHKLDEL	MSLN	Q13421	B*08
160	YPKARLAF	MSLN	Q13421	B*08
161	ALKI I I IAL	DNAJC22, MUC16	Q8WXI7	B*08
162	QAKTHSTL	MUC16	Q8WXI7	B*08
163	QGLLRPVF	MUC16	Q8WXI7	B*08
164	SIKTKSAEM	MUC16	Q8WXI7	B*08
165	SPRFKTGL	MUC16	Q8WXI7	B*08
166	TPKLRETSI	MUC16	Q8WXI7	B*08
167	TSHERLTTL	MUC16	Q8WXI7	B*08
168	TSHERLTTY	MUC16	Q8WXI7	B*08
169	TSMPRSSAM	MUC16	Q8WXI7	B*08

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 39/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
170	YLLEKSRVI	MY03B, MYH15, MYH6, MYH7, MY01 D, MY03A, MYH7B	A7E2Y1, B0I1T2, 094832, P12883, P13533, Q8NEV4, Q8WXR4, Q9Y2K3	B*08
171	FAFRKEAL	OVGP1	Q12889	B*08
172	KLKERNREL	OVGP1	Q12889	B*08
173	AEAQVGDERD Y	BCAM	P50895	B*44
174	AEATARLNVF	BCAM	P50895	B*44
175	AEIEPKADG	BCAM	P50895	B*44
176	AEIEPKADGSW	BCAM	P50895	B*44
177	TEVGTMNLF	BCAT1	P54687	B*44
178	NELFRDGVNW	BCL2L1	Q07817	B*44
179	REAGDEFEL	BCL2L1	Q07817	B*44
180	REAGDEFELRY	BCL2L1	Q07817	B*44
181	GEGPKTSW	CRABP2	P29373	B*44
182	KEATEAQSL	CTAGE4, CTAGE10P, CTAGE16P, CTAGE5, CTAGE1	Q96RT6	B44/ B40
183	YEKGIMQKV	ETV1, ETV4, ETV5	P43268	B44/ B49
184	AELEALTDLW	EYA2	000167	B*44
185	AERQPGAASL	FAM83H	Q6ZRV2	B*44
186	REGPEEPGL	FAM83H	Q6ZRV2	B*44
187	GEAQTRIAW	FOLR1	P15328	B*44
188	AEFAKKQPWW	FUNDC2	Q9BWH2	B*44
189	KEFLFNMY	H0XA9, HOXA10, HOXB9, HOXC9, HOXC10, HOXD9, HOXD10	P28356	B*44
190	YEVARILNL	HOXD9	P28356	B*44
191	EEDAALFKAW	IRF4	Q15306	B*44
192	YEFKFPNRL	LGALS1	P09382	B44/ ΒΊ8/ B40
193	LEAQQEAL	MAGEA1, MRPL40	P43355	B*44
194	KEVDPTSHSY	MAGEA11	P43364	B*44

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 40/538

22/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
195	AEDKRHYSV	MFN1	Q8IWA4	B*44
196	REMPGGPVW	MMP12	P39900	B*44
197	AEVLLPRLV	MSLN	Q13421	B*44
198	QEAARAAL	MSLN	Q13421	B*44
199	REIDESLIFY	MSLN	Q13421	B*44
200	AESIPTVSF	MUC16	Q8WXI7	B*44
201	AETILTFHAF	MUC16	Q8WXI7	B*44
202	HESEATASW	MUC16	Q8WXI7	B*44
203	IEHSTQAQDTL	MUC16	Q8WXI7	B*44
204	RETSTSEETSL	MUC16	Q8WXI7	B*44
205	SEITRIEM	MUC16	Q8WXI7	B*44
206	SESVTSRTSY	MUC16	Q8WXI7	B*44
207	TEARATSDSW	MUC16	Q8WXI7	B*44
208	TEVSRTEAI	MUC16	Q8WXI7	B*44
209	TEVSRTEL	MUC16	Q8WXI7	B*44
210	VEAADIFQNF	NXNL2	Q5VZ03	B*44
211	EEKVFPSPLW	PNOC	Q13519	B*44
212	MEQKQLQKRF	PNOC	Q13519	B*44
213	KESIPRWYY	SPINT1	043278	B*44
214	VEQTRAGSLL	TDRD5	Q8NAT2	B*44
215	SEDGLPEGIHL	ZNF217	075362	B*44

Tabela 3: Outros peptídeos de acordo com a presente invenção.

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
216	IMFDDAIERA	ALPP, ALPPL2	P05187	A*02
217	VSSSLTLKV	BCAM	P50895	A*02
218	TIASQRLTPL	CD70	P32970	A*02
219	PLPRPGAVL	CTAG2	075638	A*02
220	RMTTQLLLL	FOLR1	P15328	A*02/ ΒΊ3
221	SLLDLYQL	FTHL17	Q9BXU8	A02/ B35
222	ALMRLIGCPL	GPC2	Q8N158	A*02
223	FAHHGRSL	IRF4	Q15306	A*02

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 41/538

23/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
224	SLPRFQVTL	IRF4	Q15306	A*02
225	SVFAHPRKL	MAGEA2B, MAGEA2, MAGEA6, MAGEA12	P43365	A*02
226	QVDPKKRISM	MELK	Q14680	A*02
227	YTFRYPLSL	MMP11	P24347	A*02
228	RLWDWVPLA	MRPL51	Q4U2R6	A*02
229	ISVPAKTSL	MUC16	Q8WXI7	A*02
230	SAFREGTSL	MUC16	Q8WXI7	A*02
231	SVTESTHHL	MUC16	Q8WXI7	A*02
232	TISSLTHEL	MUC16	Q8WXI7	A*02
233	GSDTSSKSL	MUC16	Q8WXI7	A*02/ ΒΊ4
234	GVATRVDAI	MUC16	Q8WXI7	A*02/ ΒΊ4
235	SAIETSAVL	MUC16	Q8WXI7	A02/ B35
236	SAIPFSMTL	MUC16	Q8WXI7	A02/ B35
237	SAMGTISIM	MUC16	Q8WXI7	A02/ B35
238	PLLVLFTI	MUC16	Q8WXI7	A02/ B51
239	FAVPTGISM	MUC16	Q8WXI7	A02/ C03
240	FSTDTSIVL	MUC16	Q8WXI7	A02/ C03
241	RQPNILVHL	MUC16	Q8WXI7	A*02:05
242	STIPALHEI	MUC16	Q8WXI7	A*02:05
243	YASEGVKQV	SPON1	Q9HCB6	A02/ B51
244	DTDSSVHVQV	TENM4	Q6N022	A*02
245	LAVEGGQSL	UBXN8	000124	A*02
246	RYLAVVHAVF	CCR5	P51681	A24/ A23
247	ARPPWMWVL	KLK5	Q9Y337	A24/ B27
248	SVIQHLGY	MSLN	Q13421	A*24

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 42/538

24/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
249	VYTPTLGTL	DNAJC22, MUC16	Q8WXI7	A*24
250	HFPEKTTHSF	MUC16	Q8WXI7	A24/ C14
251	KQRQVLIFF	PCDHB2	Q9Y5E7	A*24/ ΒΊ5
252	LYQPRASEM	PNOC	Q13519	A24/ A25
253	AYPEIEKF	PTTG2, PTTG1	095997	A24/ C04
254	IIQHLTEQF	STAG3	Q9UJ98	A24/ C03
255	VFVSFSSLF	ZNF560	Q96MR9	A24/ B27
256	RTEEVLLTFK	GPR64	Q8IZP9	A*03
257	VTADHSHVF	ALPI, ALPL, ALPP, ALPPL2	P05187	A*03
258	GAYAHTVNR	ALPPL2	P10696	A*03
259	KTLELRVAY	BCAM	P50895	A03/ A32
260	GTNTVILEY	C2orf88	Q9BSF0	A*03
261	HTFGLFYQR	FAM111B	Q6SJ93	A*03
262	RSRLNPLVQR	FAM83H	Q6ZRV2	A*03
263	SSSSATISK	HOXD3	P31249	A*03/ ΑΊ1
264	AIKVIPTVFK	IDO1	P14902	A*03
265	QIHDHVNPK	IDO1	P14902	A*03/ ΑΊ1
266	ISYSGQFLVK	IGF2BP1	Q9NZI8	A*03
267	VTDLISPRK	LAMA1	P25391	A*03
268	GLLGLSLRY	LRRTM1	Q86UE6	A03/ ΑΊ1/ A29
269	RLKGDAWVYK	MELK	Q14680	A*03
270	AVFNPRFYRTY	MMP12	P39900	A*03/ ΑΊ1
271	RMFADDLHNL NK	MRPL51	Q4U2R6	A*03
272	RQPERTILRPR	MSLN	Q13421	A*03

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 43/538

25/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
273	RVNAIPFTY	MSLN	Q13421	A03/ A26
274	KTFPASTVF	MUC16	Q8WXI7	A*03
275	STTFPTLTK	MUC16	Q8WXI7	A*03
276	VSKTTGMEF	MUC16	Q8WXI7	A*03
277	TTALKTTSR	DNAJC22, MUC16	Q8WXI7	A03/ A66
278	NLSSITHER	MUC16	Q8WXI7	A03/ A68
279	SVSSETTKIKR	MUC16	Q8WXI7	A03/ A68
280	SVSGVKTTF	MUC16	Q8WXI7	A*03/ ΒΊ5
281	RAKELEATF	NLRP7, NLRP2	Q9NX02	A*03
282	CLTRTGLFLRF	NLRP7, NLRP2	Q9NX02	A*03
283	IVQEPTEEK	PAGE2, PAGE2B	Q7Z2X7	A*03/ ΑΊ1
284	KSLIKSWKK	TCEA1P2, TCEA1, TCEA2	P23193, Q15560	A*03/ ΑΊ1
285	GTVNPTVGK	TENM4	Q6N022	A*03/ ΑΊ1
286	TVAPPQGVVK	ZBTB12	Q9Y330	A03/ A68
287	RRIHTGEKPYK	ZNF271, KLF8, ZNF816, ZFP28, ZSCAN29, ZNF597, ZNF480, ZNF714, ZNF836, ZNF600, ZNF320, ZNF100, ZNF721, ZNF841, ZNF678, ZNF860, ZNF429, ZNF888, ZNF761, ZNF701, ZNF83, ZNF695, ZNF471, ZNF22, ZNF28, ZNF137P, ZNF665, ZNF606, ZNF430, ZNF34, ZNF616, ZNF468, ZNF160, ZNF765, ZNF845	Q8IW36	A*03/ ΑΊ1

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 44/538

26/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
288	SPVTSVHGGTY	LILRB4	Q8NHJ6	A01/ B35
289	RWEKTDLTY	MMP11	P24347	A*01
290	DMDEEIEAEY	MY03B	Q8WXR4	A01/ A25
291	ETIRSVGYY	TENM4	Q6N022	A01/ A25
292	NVTMKVVSVLY	VTCN1	Q7Z7D3	A*01
293	VPDSGATATAY	ALPP, ALPPL2	P05187	B07/ B35
294	YPLRGSSIF	ALPP, ALPPL2	P05187	B07/ B35
295	YPLRGSSIFGL	ALPP, ALPPL2	P05187	B07/ B35
296	YPLRGSSI	ALPP, ALPPL2	P05187	B51/ B07
297	TVREASGLL	BCAM	P50895	B*07
298	YPTEHVQF	BCAM	P50895	B07/ B35
299	HPGSSALHY	BCAT1	P54687	B07/ B35
300	IPMAAVKQAL	BCL2L1	Q07817	B*07
301	SPRRSPRISF	CDCA5	Q96FF9	B*07
302	RVEEVRALL	CDKN2A	P42771	B*07
303	LPMWKVTAF	CLDN6	P56747	B*07
304	LPRPGAVL	CTAG2	075638	B*07
305	TPWAESSTKF	DPEP3	Q9H4B8	B07/ B35
306	APVIFSHSA	DPEP2, DPEP3	Q9H4B8	B55/ B56/ B*07
307	LPYGPGSEAAA F	ESR1	P03372	B07/ B35
308	YPEGAAYEF	ESR1	P03372	B07/ B35
309	FPQSQYPQY	EYA2	000167	B07/ B35
310	RPNPITIIL	FBN2	P35556	B*07

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 45/538

27/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
311	RPLFYVVSL	HTR3A	P46098	B*07
312	LPYFREFSM	HTR3A	P46098	B07/ B35
313	KVKSDRSVF	HTR3A	P46098	ΒΊ5/ B*07
314	VPDQPHPEI	IRF4	Q15306	B07/ B35
315	SPRENFPDTL	KLK8	060259	B*07
316	EPKTATVL	LAMA1	P25391	B42/ B07
317	FPFQPGSV	LGALS1	P09382	B51/ B07
318	FPNRLNLEA	LGALS1	P09382	B54/ B55/ B*07
319	SPAEPSVYATL	LILRB4	Q8NHJ6	B*07
320	FPMSPVTSV	LILRB4	Q8NHJ6	B07/ B51
321	SPMDTFLLI	LILRB4	Q8NHJ6	B51/ B07
322	SPDPSKHLL	LRRK1	Q38SD2	B07/ B35
323	RPMPNLRSV	LRRTM1	Q86UE6	B55/ B07
324	VPYRVVGL	MEX3D, MEX3C, MEX3B, MEX3A	A1L020	B51/ B07
325	GPRNAQRVL	MFN1	Q8IWA4	B*07
326	VPSEIDAAF	MMP11	P24347	B07/ B35
327	SPLPVTSLI	MUC16	Q8WXI7	B*07
328	EPVTSSLPNF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
329	FPAMTESGGMI L	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
330	FPFVTGSTEM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
331	FPHPEMTTSM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 46/538

28/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
332	FPHSEMTTL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
333	FPHSEMTTVM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
334	FPYSEVTTL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
335	HPDPVGPGL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
336	HPKTESATPAA Y	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
337	HPVETSSAL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
338	HVTKTQATF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
339	LPAGTTGSLVF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
340	LPEISTRTM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
341	LPLDTSTTL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
342	LPLGTSMTF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
343	LPSVSGVKTTF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
344	LPTQTTSSL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
345	LPTSESLVSF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
346	LPWDTSTTLF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
347	MPLTTGSQGM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
348	MPNSAIPFSM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
349	MPSLSEAMTSF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
350	NPSSTTTEF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 47/538

29/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
351	NVLTSTPAF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
352	SPAETSTNM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
353	SPAMTTPSL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
354	SPLPVTSLL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
355	SPLVTSHIM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
356	SPNEFYFTV	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
357	SPSPVPTTL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
358	SPSPVTSTL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
359	SPSTIKLTM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
360	SPSVSSNTY	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
361	SPTHVTQSL	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
362	SPVPVTSLF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
363	TAKTPDATF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
364	TPLATTQRF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
365	TPLATTQRFTY	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
366	TPLTTTGSAEM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
367	TPSVVTEGF	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35
368	VPTPVFPTM	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 48/538

30/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
369	FPHSEMTTV	MUC16	Q8WXI7	B07/ B35/ B*51
370	PGGTRQSL	MUC16	Q8WXI7	ΒΊ4Ό2/ B*07
371	LYVDGFTHW	MUC16	Q8WXI7	B35/ B55/ B*07
372	IPRNPPPTLL	MY03B	Q8WXR4	B*07
373	RPRALRDLRIL	NLRP7, NLRP2	Q9NX02	B*07
374	NPIGDTGVKF	NLRP7	Q8WX94	B07/ B35
375	AAASPLLLL	NMU	P48645	B*07
376	RPRSPAGQVA	NMU	P48645	B07/ B55
377	RPRSPAGQVA AA	NMU	P48645	B07/ B55
378	RPRSPAGQVA A	NMU	P48645	B07/ B56
379	GPFPLVYVL	OVGP1	Q12889	B07/ B35
380	IPTYGRTF	OVGP1	Q12889	B07/ B35
381	LPEQTPLAF	OVGP1	Q12889	B07/ B35
382	SPMHDRWTF	OVGP1	Q12889	B07/ B35
383	TPTKETVSL	OVGP1	Q12889	B07/ B35
384	YPGLRGSPM	OVGP1	Q12889	B07/ B35
385	SPALHIGSV	PCDHB5, PCDHB18, PCDHB17, PCDHB15, PCDHB14, PCDHB11, PCDHB10, PCDHB9, PCDHB8, PCDHB6, PCDHB4, PCDHB3, PCDHB2, PCDHB16	Q96TA0, Q9NRJ7, Q9UN66, Q9UN67, Q9Y5E1, Q9Y5E3, Q9Y5E4, Q9Y5E5, Q9Y5E6, Q9Y5E7, Q9Y5E8, Q9Y5E9, Q9Y5F2	B*07

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 49/538

31/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
386	FPFNPLDF	PTTG1	095997	B07/ B35
387	APLKLSRTPA	SPON1	Q9HCB6	B07/ B55
388	SPAPLKLSRTP A	SPON1	Q9HCB6	B07/ B55/ B*56
389	SPGAQRTFFQL	STAG3, STAG3L3, STAG3L2, STAG3L1	P0CL83, Q9UJ98	B*07
390	NPDLRRNVL	TCEA2	Q15560	B*07
391	APSTPRITTF	TCEA2	Q15560	B*07
392	KPIESTLVA	TMEM158	Q8WZ71	B07/ B55
393	ASKPHVEI	CRABP1	P29762	B*08
394	MYKMKKPI	MAGEB3	015480	B*08
395	VLLPRLVSC	MSLN	Q13421	B08/ A02
396	REASGLLSL	BCAM	P50895	B*44
397	REGDTVQLL	BCAM	P50895	B*44
398	SFEQVVNELF	BCL2L1	Q07817	B*44
399	RELLHLVTL	CAPN13	Q6MZZ7	B44/ B37
400	GEIEIHLL	CCDC146	Q8IYE0	B44/ B40
401	EDLKEELLL	CPXCR1	Q8N123	B*44/ ΒΊ8
402	RELANDELIL	CRABP1	P29762	B*44
403	EEAQWVRKY	FAM111B	Q6SJ93	B*44
404	NEAIMHQY	FAM111B	Q6SJ93	B*44/ ΒΊ8
405	NEIWTHSY	FOLR1	P15328	B*44/ ΒΊ8
406	EDGRLVIEF	FRAS1	Q86XX4	B*44/ ΒΊ8
407	AEHEGVSVL	GXYLT2	A0PJZ3	B*44
408	LEKALQVF	IDO1	P14902	B*44
409	REFVLSKGDAG L	IDO1	P14902	B*44

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 50/538

32/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
410	SEDPSKLEA	IDO1	P14902	B*44
411	LELPPILVY	IDO1	P14902	B*44/ ΒΊ8
412	QEILTQVKQ	IGF2BP3	000425	B44/ B40
413	IEALSGKIEL	IGF2BP3	000425	B44/ B45
414	EDAALFKAW	IRF4	Q15306	B*44
415	REEDAALFKA W	IRF4	Q15306	B*44
416	SEEETRVVF	MELK	Q14680	B*44
417	AEHFSMIRA	MEX3C, MEX3B, MEX3A	A1L020, Q5U5Q3, Q6ZN04	B44/ B50
418	FEDAQGHIW	MMP11	P24347	B*44
419	HEFGHVLGL	MMP11	P24347	B44/ B40
420	FESHSTVSA	MUC16	Q8WXI7	B*44
421	GEPATTVSL	MUC16	Q8WXI7	B*44
422	SETTFSLIF	MUC16	Q8WXI7	B*44
423	SEVPTGTTA	MUC16	Q8WXI7	B*44
424	TEFPLFSAA	MUC16	Q8WXI7	B*44
425	SEVPLPMAI	MUC16	Q8WXI7	B*44/ ΒΊ8
426	PEKTTHSF	MUC16	Q8WXI7	B44/ C04:01
427	HESSSHHDL	NFE2L3	Q9Y4A8	B*44
428	LDLGLNHI	NLRP2	Q9NX02	B44/ B47
429	REKFIASVI	OVGP1	Q12889	B*44
430	DEKILYPEF	OVGP1	Q12889	B*44/ ΒΊ8
431	AEQDPDELNKA	POMZP3, ZP3	P21754, Q6PJE2	B44/ B41
432	EEQYIAQF	PRAME	P78395	B*44/ ΒΊ8
433	SDSQVRAF	STAG1, STAG3, STAG2	Q8N3U4, Q8WVM7, Q9UJ98	B44/ B37

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 51/538

33/287

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
434	KEAIREHQM	TCEA1P2, TCEA1, TCEA2	P23193, Q15560	B44/ B41
435	REEFVSIDHL	TMPRSS3	P57727	B*44
436	REPGDIFSEL	WISP3	095389	B*44
437	TEAVVTNEL	XPR1	Q9UBH6	B*44
438	SEVDSPNVL	ZNF217	075362	B*44

Tabela 4: Peptideos HLA classe I de acordo com a presente invenção.

SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
439	EALAKLMSL	ATP7B	P35670	B*51
440	ELFEGLKAF	BCAT1	P54687	A*25
441	HQITEVGTM	BCAT1	P54687	ΒΊ5
442	ILSKLTDIQY	BCAT1	P54687	ΒΊ5
443	GTFNPVSLW	BCAT1	P54687	B*58
444	KLSQKGYSW	BCL2L1	Q07817	A*32
445	LHITPGTAY	BCL2L1	Q07817	ΒΊ3
446	GRIVAFFSF	BCL2L1	Q07817	B*27
447	MQVLVSRI	BCL2L1	Q07817	B*52/ ΒΊ3
448	LSQKGYSW	BCL2L1	Q07817	B*57
449	RAFSDLTSQL	BCL2L1	Q07817	C*15
450	KQTFPFPTI	C2orf88	Q9BSF0	ΒΊ3
451	DYLNEWGSRF	CDH3	P22223	A*23
452	LKVLGVNVM	CRABP2	P29373	C*07
453	DVKLEKPK	DPPA2	Q7Z7J5	A*68
454	AQTDPTTGY	LOXL2, ENTPD4	Q9Y4K0	ΒΊ5
455	AAAANAQVY	ESR1	P03372	B*35
456	IPLERPLGEVY	ESR1	P03372	B*35
457	NAAAAANAQV Y	ESR1	P03372	B*35
458	TDTLIHLM	ESR1	P03372	B*37
459	KVAGERYVY	ETV1, ETV4, ETV5	P41161, P43268, P50549	A32/ A31
460	RLSSATANALY	FAM83H	Q6ZRV2	A*26

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 52/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
461	AQRMTTQLL	FOLR1	P15328	ΒΊ5
462	QRMTTQLLL	FOLR1	P15328	B27/ C07
463	VNQSLLDLY	FTHL17	Q9BXU8	A*26
464	MSALRPLL	GPC2	Q8N158	0*15
465	DLIESGQLR	IDO1	P14902	A*66
466	DLIESGQLRER	IDO1	P14902	A*66
467	MQMQERDTL	IDO1	P14902	ΒΊ5
468	ALAKLLPL	KLK10	043240	B*35
469	QEQSSVVRA	KLK6	Q92876	B*45
470	QGERLLGAAV	LAG3	P18627	C*03
471	AQRLDPVYF	LAMC2	Q13753	ΒΊ5
472	MRLLVAPL	LRRN2	075325	ΒΊ4
473	MLNNNALSAL	LRRN2	075325	B*35
474	AADGGLRASVT L	LY6E	Q16553	C*05
475	GRDPTSYPSL	MAGEA11	P43364	B*39
476	ISYPPLHEW	MAGEA3, MAGEA12	P43357	B*57
477	RIQQQTNTY	MEX3A	A1L020	ΒΊ5
478	VVGPKGATI	MEX3D, MEX3C, MEX3B, MEX3A	A1L020, Q5U5Q3, Q6ZN04, Q86XN8	C*14
479	TEGSHFVEA	MFN1	Q8IWA4	B*45
480	GRADIMIDF	MMP11	P24347	B*27
481	GRWEKTDLTY	MMP11	P24347	B*27
482	GRWEKTDLTY R	MMP11	P24347	B*27
483	VRFPVHAALV W	MMP11	P24347	B*27
484	AWLRSAAA	MMP11	P24347	B*56
485	VRFPVHAAL	MMP11	P24347	C*07
486	DRFFWLKV	MMP12	P39900	ΒΊ4
487	GMADILVVF	MMP12	P39900	ΒΊ5
488	RSFSLGVPR	MRPL51	Q4U2R6	A*31
489	EVSGLSTER	MSLN	Q13421	A*68
490	AEVQKLLGP	MSLN	Q13421	B*50
491	EAYSSTSSW	MUC16	Q8WXI7	A*25

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 53/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
492	EVTPWISLTL	MUC16	Q8WXI7	A*25
493	DTNLEPVTR	MUC16	Q8WXI7	A*68
494	ETTASLVSR	MUC16	Q8WXI7	A*68
495	EVPSGATTEVS R	MUC16	Q8WXI7	A*68
496	EVPTGTTAEVS R	MUC16	Q8WXI7	A*68
497	EVSRTEVISSR	MUC16	Q8WXI7	A*68
498	EVYPELGTQG R	MUC16	Q8WXI7	A*68
499	SSETTKIKR	MUC16	Q8WXI7	A*68
500	AHVLHSTL	MUC16	Q8WXI7	ΒΊ4
501	IQIEPTSSL	MUC16	Q8WXI7	ΒΊ4
502	SGDQGITSL	MUC16	Q8WXI7	ΒΊ4
503	TVFDKAFTAA	MUC16	Q8WXI7	ΒΊ4
504	TVSSVNQGL	MUC16	Q8WXI7	ΒΊ4
505	YVPTGAITQA	MUC16	Q8WXI7	ΒΊ4
506	HQFITSTNTF	MUC16	Q8WXI7	ΒΊ5
507	TSIFSGQSL	MUC16	Q8WXI7	ΒΊ5
508	TVAKI I I I F	MUC16	Q8WXI7	ΒΊ5
509	GRGPGGVSW	MUC16	Q8WXI7	B*27
510	RRIPTEPTF	MUC16	Q8WXI7	B*27
511	SRIPQDVSW	MUC16	Q8WXI7	B*27
512	SRSPENPSW	MUC16	Q8WXI7	B*27
513	SRTEISSSR	MUC16	Q8WXI7	B*27
514	SRTEVASSR	MUC16	Q8WXI7	B*27
515	TRIEMESTF	MUC16	Q8WXI7	B*27
516	TASTPISTF	MUC16	Q8WXI7	B*35
517	TAETILTFHAF	MUC16	Q8WXI7	B*35
518	TSDFPTITV	MUC16	Q8WXI7	B*35
519	VTSLLTPGMV	MUC16	Q8WXI7	B*35
520	THSAMTHGF	MUC16	Q8WXI7	B*38
521	THSTASQGF	MUC16	Q8WXI7	B*38
522	THSTISQGF	MUC16	Q8WXI7	B*38
523	APKGIPVKPTS A	MUC16	Q8WXI7	B*55

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 54/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
524	AVSPTVQGL	MUC16	Q8WXI7	C*07
525	QRFPHSEM	MUC16	Q8WXI7	C*07
526	SVPDILST	MUC16	Q8WXI7	C*07
527	QSTPYVNSV	MUC16	Q8WXI7	C*16
528	TRTGLFLRF	NLRP7, NLRP2	Q9NX02	B*27
529	PFSNPRVL	NLRP2	Q9NX02	C*04
530	MLPRAALL	NLRP7	Q8WX94	B*51
531	QGAQLRGAL	NLRP7, NLRP2	Q8WX94	B*52
532	AISFSYKAW	OVGP1	Q12889	A*25
533	GQHLHLETF	PRAME	P78395	ΒΊ5
534	CRPGALQIEL	RAD54B	Q9Y620	C*02
535	IKDVRKIK	RNF17	Q9BXT8	ΒΊ3
536	VQDQACVAKF	RNF17	Q9BXT8	ΒΊ5
537	IRRLKELKDQ	RPL37A, RPL37AP8	A6NKH3, P61513	n/ a
538	QLEKALKEI	SAGE1	Q9NXZ1	C*05
539	IPIPSTGSVEM	SPINT1	043278	B35/ B42
540	AGIPAVALW	SPINT1	043278	B*58
541	RLSPAPLKL	SPON1	Q9HCB6	ΒΊ3
542	QIIDEEETQF	SPON1	Q9HCB6	ΒΊ5
543	MRLSPAPLK	SPON1	Q9HCB6	B*27
544	LRNPSIQKL	SPON1	Q9HCB6	C*07
545	RVGPPLLI	TMEM158	Q8WZ71	ΒΊ5
546	GRAFFAAAF	TMEM158	Q8WZ71	B*27
547	EVNKPGVYTR	TMPRSS3	P57727	A*68
548	VSEASLVSSI	ZBTB12	Q9Y330	C*05
549	ARSKLQQGL	ZNF217	075362	B*27
550	RRFKEPWFL	ZNF217, ZNF516, ZNF536	015090, 075362, Q92618	B*27
551	RLHTGEKPYK	ZNF816, ZNF813, ZNF578, ZNF599, ZNF600, ZNF320, ZNF525, ZNF485, ZNF860, ZNF429, ZNF808, ZNF888, ZNF761, ZNF701, ZNF83,	A2RRD8, A6NHJ4, A6NK21, A6NK53, A6NK75, A6NN14, A6NNF4, A6NP11, A8MTY0, A8MUV8, B4DU55, B4DX44, B4DXR9, 014628,	A*30

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 55/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
		ZNF167, ZFP62, ZNF28, ZSCAN21, ZNF91, ZNF229, ZNF702P, ZNF528, ZNF468, ZNF765, ZNF845	014709, 015090, 043309, 043345, 043361,075346, 075373, 075437, 075820, 095600, 095780, P0CB33, P0CJ79, PODKXO, P10073, P17019, P17026, P17035, P17038, P17040, P17097, P35789, P51522, P51815, P52742, Q02386, Q03923, Q03924, Q03936, Q03938, Q05481, Q08AN1, Q09FC8, Q0VGE8, Q14584, Q14586, Q14590, Q14591, Q14593, Q15928, Q15929, Q15937, Q16587, Q2M3W8, Q2M3X9, Q2VY69, Q3KP31, Q3MIS6, Q3SXZ3, Q4V348, Q53GI3, Q5HY98, Q5JNZ3, Q5SXM1, Q5VIY5, Q5VV52, Q68DY1, Q6AZW8, Q6P280, Q6P9G9, Q6PDB4, Q6ZMV8, Q6ZMW2, Q6ZN06, Q6ZN08, Q6ZN19, Q6ZN57, Q6ZNA1, Q6ZNG1, Q6ZR52, Q76KX8, Q7L2R6, Q7L945, Q7Z3V5, Q7Z7L9, Q86TJ5, Q86UE3, Q86V71, Q86XN6, Q86XU0, Q86Y25,

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 56/538

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SEQ N^e	Sequência	Gene	N^e de sequência (Accession) Uniprot	Alótipo de HLA
			Q8IW36, Q8IWY8, Q8IYN0, Q8IZ26, Q8N4W9, Q8N782, Q8N7Q3, Q8N823, Q8N859, Q8N8C0, Q8N8J6, Q8N972, Q8N988, Q8N9F8, Q8NB50, Q8NCK3, Q8NDQ6, Q8NEM1, Q8NF99, Q8NHY6, Q8TAQ5, Q8TBZ5, Q8TD23, Q8TF20, Q8TF32, Q8TF39, Q8WV37, Q8WXB4, Q96CX3, Q96IR2, Q96JC4, Q96LX8, Q96MR9, Q96N22, Q96N38, Q96N58, Q96NI8, Q96NL3, Q96PE6, Q96RE9, Q96SE7, Q99676, Q9BX82, Q9H5H4, Q9H7R5, Q9H8G1, Q9H963, Q9HBT7, Q9HCG1, Q9HCL3, Q9NQX6, Q9NV72, Q9P0L1, Q9P255, Q9P2F9, Q9P2J8, Q9UEG4, Q9UII5, Q9UJW7, Q9UL36, Q9Y2Q1, Q9Y473, Q9Y5A6
773	ALYGKLLKL	VPS13B		A*02
774	VYVDDIYVI	CASC5		A*24

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 57/538

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Tabela 5: Peptídeos HLA classe II de acordo com a presente invenção

SEQ N^e	Sequência	Outras variantes de sequências	Gene
552	GVNAMLRKVAVAAASKP HVE		CRABP1
553		VNAMLRKVAVAAASKPHVE	CRABP1
554		GVNAMLRKVAVAAASKPH	CRABP1
555		VNAMLRKVAVAAASKPH	CRABP1
556		NAMLRKVAVAAASKPH	CRABP1
557		AMLRKVAVAAASKPH	CRABP1
558		LRKVAVAAASKPH	CRABP1
559		RKVAVAAASKPH	CRABP1
560	PNFSGNWKIIRSENFEEL LK		CRABP2
561		PNFSGNWKIIRSENFEELL	CRABP2
562		GNWKIIRSENFEELLKVL	CRABP2
563		PNFSGNWKIIRSENFEEL	CRABP2
564		GNWKIIRSENFEELLKV	CRABP2
565		NWKIIRSENFEELLKV	CRABP2
566		NWKIIRSENFEELLK	CRABP2
567		NWKIIRSENFEELL	CRABP2
568		WKIIRSENFEELLK	CRABP2
569		WKIIRSENFEELL	CRABP2
570		GNWKIIRSENF	CRABP2
571		PNFSGNWKIIR	CRABP2
572	INFKVGEEFEEQTV		CRABP2
573	RLLSADTKGWVRLQ		DPPA2
574	LPDFYNDWMFIAKHLPDL		IDO1
575	VGDDHLLLLQGEQLRRT		KLK10
576		VGDDHLLLLQGEQLRR	KLK10
577		GDDHLLLLQGEQLRR	KLK10
578		DDHLLLLQGEQLRR	KLK10
579	SGGPLVCDETLQGILS		KLK10
580		GGPLVCDETLQGILS	KLK10
581		GGPLVCDETLQGIL	KLK10
582	GSQPWQVSLFNGLSFH		KLK10
583	LTVKLPDGYEFKFPNRLN LEAINY		LGALS1
584		TVKLPDGYEFKFPNRLNLEAINY	LGALS1

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 58/538

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SEQ N^e	Sequência	Outras variantes de sequências	Gene
585		LTVKLPDGYEFKFPNRLNL	LGALS1
586		TVKLPDGYEFKFPNRLNL	LGALS1
587	DQANLTVKLPDGYEFKFP NRLNL		LGALS1
588	VAPDAKSFVLNLGKDSNN L		LGALS1
589		APDAKSFVLNLGKDSNNL	LGALS1
590	RVRGEVAPDAKSFVLNL G		LGALS1
591		VRGEVAPDAKSFVLNL	LGALS1
592		VRGEVAPDAKSFVLNLG	LGALS1
593		GEVAPDAKSFVLNLG	LGALS1
594		VRGEVAPDAKSFVLN	LGALS1
595		VRGEVAPDAKSFVL	LGALS1
596	MAADGDFKIKCVAFD		LGALS1
597	SPDAESLFREALSNKVDE L		MAGEA4
598		AESLFREALSNKVDEL	MAGEA4
599		AESLFREALSNKVDE	MAGEA4
600		FREALSNKVDE	MAGEA4
601	LSNKVDELAHFLLRK		MAGEA4
602	KDPVAWEAGMLMH		MAGEB1
603	KARDETRGLNVPQ		MAGEB2
604	KLITQDLVKLKYLEYRQ		MAGEB3
605	LTVAEVQKLLGPHVEGLK AEERHRP		MSLN
606		LTVAEVQKLLGPHVEGLKAEER	MSLN
607		LTVAEVQKLLGPHVEGLKAEE	MSLN
608		LTVAEVQKLLGPHVEGLKAE	MSLN
609		LTVAEVQKLLGPHVEGLKA	MSLN
610		LTVAEVQKLLGPHVEGLK	MSLN
611		LTVAEVQKLLGPHVEGL	MSLN
612		TVAEVQKLLGPHVEGLK	MSLN
613		LTVAEVQKLLGPHVEG	MSLN
614		TVAEVQKLLGPHVEGL	MSLN
615		VAEVQKLLGPHVEGLK	MSLN
616		TVAEVQKLLGPHVEG	MSLN
617		VAEVQKLLGPHVEGL	MSLN

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 59/538

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SEQ N^e	Sequência	Outras variantes de sequências	Gene
618		VAEVQKLLGPHVEG	MSLN
619		VAEVQKLLGPHVE	MSLN
620		EVQKLLGPHVEG	MSLN
621		LTVAEVQKLLG	MSLN
622	MDALRGLLPVLGQPIIRSI PQGIVA		MSLN
623		ALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVA	MSLN
624		LRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVA	MSLN
625		DALRGLLPVLGQPIIRSIPQG	MSLN
626		RGLLPVLGQPIIRSIPQGIVA	MSLN
627		ALRGLLPVLGQPIIRSIPQG	MSLN
628		DALRGLLPVLGQPIIRSIPQ	MSLN
629		GLLPVLGQPIIRSIPQGIVA	MSLN
630		ALRGLLPVLGQPIIRSIPQ	MSLN
631		DALRGLLPVLGQPIIRSIP	MSLN
632		LLPVLGQPIIRSIPQGIVA	MSLN
633		LRGLLPVLGQPIIRSIPQ	MSLN
634		DALRGLLPVLGQPIIRS	MSLN
635		ALRGLLPVLGQPIIRS	MSLN
636		DALRGLLPVLGQPIIR	MSLN
637		ALRGLLPVLGQPIIR	MSLN
638		LRGLLPVLGQPIIRS	MSLN
639		ALRGLLPVLGQPII	MSLN
640		ALRGLLPVLGQPI	MSLN
641		RGLLPVLGQPIIR	MSLN
642		GLLPVLGQPIIR	MSLN
643		LRGLLPVLGQPI	MSLN
644		RGLLPVLGQPI	MSLN
645	RGLLPVLGQPIIRSIPQGIV AAWRQ		MSLN
646		GLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQ	MSLN
647		LPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQ	MSLN
648		GLLPVLGQPIIRSIPQGIVAA	MSLN
649		LLPVLGQPIIRSIPQGIVAA	MSLN
650		LPVLGQPIIRSIPQGIVAAW	MSLN
651		LPVLGQPIIRSIPQGIVAA	MSLN
652		PVLGQPIIRSIPQGIVAAW	MSLN
653		LPVLGQPIIRSIPQGIVA	MSLN

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 60/538

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SEQ N^e	Sequência	Outras variantes de sequências	Gene
654		PVLGQPIIRSIPQGIVA	MSLN
655		LGQPIIRSIPQGIVAA	MSLN
656		VLGQPIIRSIPQGIVA	MSLN
657		QPIIRSIPQGIVA	MSLN
658	VSTMDALRGLLPVLGQPII RSIPQG		MSLN
659		VSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQ	MSLN
660		VSTMDALRGLLPVLGQPIIR	MSLN
661		LRGLLPVLGQPIIRSIPQG	MSLN
662	LRTDAVLPLTVAEVQKLL GPHVEG		MSLN
663		RTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVE G	MSLN
664		AVLPLTVAEVQKLLGPHVEG	MSLN
665		VLPLTVAEVQKLLGPHVEG	MSLN
666		LPLTVAEVQKLLGPHVEG	MSLN
667		TDAVLPLTVAEVQ	MSLN
668		AVLPLTVAEVQK	MSLN
669	VLPLTVAEVQKLLGPHVE GLKAEE		MSLN
670		VLPLTVAEVQKLLGPHVEGLK	MSLN
671		LPLTVAEVQKLLGPHVEGLK	MSLN
672	LRGLLPVLGQPIIRSIPQGI VAA		MSLN
673	IPFTYEQLDVLKHKLDELY PQ		MSLN
674		IPFTYEQLDVLKHKLDE	MSLN
675		IPFTYEQLDVLKHKLD	MSLN
676	VPPSSIWAVRPQDLDTCD PR		MSLN
677		IWAVRPQDLDTCDPR	MSLN
678		AVRPQDLDTCDPR	MSLN
679	WGVRGSLLSEADVRALG GLA		MSLN
680		GVRGSLLSEADVRALGGLA	MSLN
681		WGVRGSLLSEADVRALGGL	MSLN
682		GVRGSLLSEADVRALGGL	MSLN
683		VRGSLLSEADVRALGGLA	MSLN

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 61/538

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SEQ N^e	Sequência	Outras variantes de sequências	Gene
684		WGVRGSLLSEADVRALGG	MSLN
685		GVRGSLLSEADVRALGG	MSLN
686		VRGSLLSEADVRALGGL	MSLN
687		WGVRGSLLSEADVRALG	MSLN
688		GVRGSLLSEADVRALG	MSLN
689		WGVRGSLLSEADVRAL	MSLN
690		GSLLSEADVRALGGL	MSLN
691		GVRGSLLSEADVRAL	MSLN
692		RGSLLSEADVRALGG	MSLN
693		WGVRGSLLSEADVRA	MSLN
694		GSLLSEADVRALGG	MSLN
695		RGSLLSEADVRALG	MSLN
696		WGVRGSLLSEADVR	MSLN
697		GSLLSEADVRALG	MSLN
698		VRGSLLSEADVRA	MSLN
699		LLSEADVRALGG	MSLN
700		SLLSEADVRALG	MSLN
701		GSLLSEADVRA	MSLN
702		LLSEADVRALG	MSLN
703		LSEADVRALGG	MSLN
704		SEADVRALGG	MSLN
705		EADVRALGG	MSLN
706	LSTERVRELAVALAQKNV K		MSLN
707		LSTERVRELAVALAQKN	MSLN
708		ERVRELAVALAQKNVK	MSLN
709		LSTERVRELAVALAQK	MSLN
710		LSTERVRELAVALAQ	MSLN
711		STERVRELAVALAQK	MSLN
712		TERVRELAVALAQKN	MSLN
713		VRELAVALAQKNVK	MSLN
714	AIPFTYEQLDVLKHKLDE		MSLN
715	GLSTERVRELAVALAQKN		MSLN
716		GLSTERVRELAVALAQ	MSLN
717	IPQGIVAAWRQRSSRDPS		MSLN
718		GIVAAWRQRSSRDPS	MSLN
719		IPQGIVAAWRQRSSR	MSLN

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 62/538

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SEQ N^e	Sequência	Outras variantes de sequências	Gene
720	ALGGLACDLPGRFVAES		MSLN
721	RELAVALAQKNVKLSTE		MSLN
722	LKALLEVNKGHEMSPQ		MSLN
723	TFMKLRTDAVLPLTVA		MSLN
724		FMKLRTDAVLPLTVA	MSLN
725		FMKLRTDAVLPLT	MSLN
726		FMKLRTDAVLPL	MSLN
727	TLGLGLQGGIPNGYLV		MSLN
728	DLPGRFVAESAEVLL		MSLN
729		DLPGRFVAESAEVL	MSLN
730		LPGRFVAESAEVL	MSLN
731		DLPGRFVAESA	MSLN
732	ERHRPVRDWILRQRQ		MSLN
733	SPRQLLGFPCAEVSG		MSLN
734	SRTLAGETGQEAAPL		MSLN
735	VTSLETLKALLEVNK		MSLN
736	LGLQGGIPNGYLVL		MSLN
737		LQGGIPNGYLVL	MSLN
738		GGIPNGYLVL	MSLN
739	LQGGIPNGYLVLDL		MSLN
740	APERQRLLPAALA		MSLN
741	FVKIQSFLGGAPT		MSLN
742		FVKIQSFLGG	MSLN
743		FVKIQSFLG	MSLN
744	FLKMSPEDIRK		MSLN
745	WELSQLTNSVTELGPYTL DRD		MUC16
746	EITITTQTG YS LATSQVTL P		MUC16
747	ATTPSWVETHSIVIQGFP H		MUC16
748	GIKELGPYTLDRNSLYVN G		MUC16
749		GIKELGPYTLDRNSL	MUC16
750		GPYTLDRNSLYVNG	MUC16
751		GIKELGPYTLDRN	MUC16
752		LGPYTLDRNSLYV	MUC16
753		LGPYTLDRNSLY	MUC16

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SEQ N^e	Sequência	Outras variantes de sequências	Gene
754		LGPYTLDRNSL	MUC16
755	IELGPYLLDRGSLYVNG		MUC16
756		LGPYLLDRGSLYVNG	MUC16
757		LGPYLLDRGSLYVN	MUC16
758		LGPYLLDRGSLYV	MUC16
759	EELGPYTLDRNSLYVNG		MUC16
760	LKPLFKSTSVGPLYSG		MUC16
761		LKPLFKSTSVGPLYS	MUC16
762		LKPLFKSTSVGPLY	MUC16
763		LKPLFKSTSVGPL	MUC16
764	FDKAFTAATTEVSRTE		MUC16
765	ELGPYTLDRDSLYVN		MUC16
766	GLLKPLFKSTSVGPL		MUC16
767		LLKPLFKSTSVGPL	MUC16
768	SDPYKATSAVVITST		MUC16
769		SDPYKATSAVVITS	MUC16
770	SRKFNTMESVLQGLL		MUC16
771		SRKFNTMESVLQG	MUC16
772	LGFYVLDRDSLFIN		MUC16

[0045] A presente invenção geral mente se refere também aos peptídeos de acordo com a presente invenção para uso no tratamento de doenças proliferai ivas, tais como, por exemplo, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, leucemia linfocítica crônica, linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda, câncer da vesícula biliar e colangiocarcinoma, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e mesotelioma.

[0046] São particularmente preferidos, isoladamente ou em associações, os peptídeos de acordo com a presente invenção selecionados do grupo formado por SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772. São mais preferidos, isoladamente ou em associações, os peptídeos sele

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46/287 cionados do grupo formado por SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 215 (ver Tabelas 1 e 2) e suas aplicações na imunoterapia do câncer de ovário, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, leucemia linfocítica crônica, linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda, câncer da vesícula biliar e colangiocarcinoma, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, mesotelioma e, preferivelmente, câncer de ovário.

[0047] Portanto, outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso dos peptídeos de acordo com a presente invenção para tratamento, preferivelmente de forma combinada, de uma doença proliferativa selecionada do grupo formado por câncer de ovário, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, leucemia linfocítica crônica, linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda, câncer da vesícula biliar e colangiocarcinoma, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e mesotelioma.

[0048] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção que possuem a capacidade de se ligarem a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou, em uma forma alongada, a uma variante de comprimento diferente do MHC classe II.

[0049] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, onde cada um de tais peptídeos consiste ou consiste principalmente em uma sequência de aminoáci

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47/287 dos de acordo com SEQ N^Q1 a SEQ N^Q 772.

[0050] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção nos quais os referidos peptídeos são modificados e/ou incluem ligações não peptídicas.

[0051] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, nos quais os referidos peptídeos constituem parte de uma proteína de fusão, em particular fusão com aminoácidos N-terminais da cadeia invariante associada ao antígeno do HLA-DR (li) ou fundido a (ou incorporado à sequência de) um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo específico para células dendríticas.

[0052] A presente invenção refere-se também a um ácido nucleico que codifica os peptídeos de acordo com a presente invenção. A presente invenção refere-se também ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção que consista em DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos.

[0053] A presente invenção refere-se também a um vetor de expressão capaz de expressar e/ou que expresse um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[0054] A presente invenção refere-se também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão de acordo com a presente invenção para emprego no tratamento de doenças e em medicina, em especial para o tratamento de câncer.

[0055] A presente invenção refere-se também aos anticorpos específicos contra os peptídeos de acordo com a presente invenção ou complexos de tais peptídeos de acordo com a presente invenção com MHC e métodos para produzi-los.

[0056] A presente invenção refere-se ainda a receptores de células T (TCR, T-cell receptors) e em particular a TCRs solúveis (sTCR)

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48/287 e a TCRs clonados introduzidos por engenharia genética em células T autólogas ou alogênicas, e também a variantes funcionais dos mesmos, assim como a métodos de produzi-las, além de células NK ou outras células que apresentam o referido TCR ou que participem de reações cruzadas com os referidos TCRs.

[0057] Os anticorpos e os TCRs são modalidades adicionais do uso imunoterapêutico dos peptídeos de acordo com a presente invenção.

[0058] A presente invenção refere-se também a células hospedeiras que compreendem um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão conforme descrito anteriormente. A presente invenção refere-se também as células hospedeiras de acordo com a presente invenção, que são células apresentadoras de antígenos e, preferivelmente, células dendríticas.

[0059] A presente invenção refere-se também a um método de produção de um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende o cultivo da célula hospedeira de acordo com a presente invenção e o isolamento do peptídeo da referida célula hospedeira ou do respectivo meio de cultura.

[0060] A presente invenção refere-se também ao referido método de acordo com a presente invenção, sendo que o antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada ou de uma célula apresentadora de antígenos artificial colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos.

[0061] A presente invenção refere-se também a um método de acordo com a presente invenção, no qual a célula apresentadora de antígenos compreende um vetor de expressão que expressa ou é capaz de expressar o referido peptídeo contendo as sequências SEQ N^Q

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49/287 a SEQ N^Q 772, preferivelmente contendo SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 215, ou uma sequência de aminoácidos variante das mesmas.

[0062] A presente invenção relaciona-se também com células T ativadas produzidas de acordo com o método da presente invenção, sendo que as referidas células T reconhecem seletivamente células que expressam um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção.

[0063] A presente invenção refere-se também a um método para destruir células-alvo em um paciente no qual as células-alvo expressam de forma aberrante um polipeptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, sendo que o método compreende a administração ao paciente de um número eficaz de células T produzidas de acordo com a presente invenção.

[0064] A presente invenção refere-se também ao uso de qualquer peptídeo conforme descrito, ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção, ao vetor de expressão de acordo com a presente invenção, à célula de acordo com a presente invenção, ao linfócito T ativado, ao receptor de célula T ou ao anticorpo ou a outro peptídeo e/ou a moléculas ligantes de peptídeo e MHC de acordo com a presente invenção como medicamento ou para fabricação de um medicamento. Preferivelmente, o medicamento possui atividade anticâncer.

[0065] Preferivelmente, o referido medicamento destina-se a terapia celular, uma vacina ou proteína à base de um TCR solúvel ou anticorpo.

[0066] A presente invenção se refere também a um uso de acordo com a presente invenção, onde as referidas células cancerosas são células de câncer de ovário, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de

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50/287 próstata, melanoma, câncer de mama, leucemia linfocítica crônica, linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda, câncer da vesícula biliar e colangiocarcinoma, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, mesotelioma e, preferivelmente, células de câncer de ovário.

[0067] A presente invenção refere-se também a biomarcadores baseados nos peptídeos de acordo com a presente invenção, doravante denominados alvos, que podem ser utilizados para diagnóstico de câncer, preferivelmente do câncer de ovário. O marcador pode ser a sobreapresentação do(s) peptídeo(s) em si ou a sobrexpressão do(s) gene(s) correspondente(s). Os marcadores também podem ser empregados para prever a possibilidade de sucesso de um determinado tratamento, preferivelmente uma imunoterapia, sendo mais preferida uma imunoterapia que atue sobre os alvos identificados pelo biomarcador. Pode-se, por exemplo, usar um anticorpo ou TCR solúvel para corar cortes de um tumor para detectar um peptídeo relevante em complexo com MHC.

[0068] Opcionalmente, o anticorpo exerce outra função efetora, como um domínio de estimulação imunológica ou uma toxina.

[0069] A presente invenção refere-se também ao uso desses novos alvos no âmbito do tratamento do câncer.

[0070] Aplicações terapêuticas e diagnosticas contra outras doenças oncológicas são reveladas na descrição mais detalhada a seguir dos produtos de expressão (polipeptídeos) subjacentes dos peptídeos de acordo com a invenção.

[0071] O ALPP, também denominado ALP, PLAP ou PALP, codifica uma metaloenzima com atividade de fosfatase alcalina que catalisa a hidrólise de monoésteres de ácido fosfórico (RefSeq, 2002). Foi descrita hiperexpressão de ALPP em vários tumores humanos e em linhagens celulares derivadas dos mesmos, sobretudo em câncer de

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51/287 testículo e de ovário (Millan and Fishman, 1995). Constatou-se ainda que o ALPP é um fator prognóstico independente para sobrevida de pacientes com osteossarcoma e se correlaciona também com metástases pulmonares. Ademais, o ALPP também foi descrito como marcador imunohistoquímico de neoplasias do músculo liso gastrointestinal, precursores de tumores de células germinativas (por exemplo, carcinoma in situ e gonadoblastoma) e como biomarcador promissor de câncer de ovário (Ravenni etal., 2014; Wong etal., 2014b; Faure et al., 2016; Han etal., 2012).

[0072] O ALPPL2, também denominado GCAP, codifica uma enzima glicosilada ligada à membrana e é encontrado em testículo, timo e em alguns tumores germinativos, estando intimamente relacionado com as formas placentária e intestinal de fosfatase alcalina (RefSeq, 2002). Demonstrou-se que o ALPPL2 apresentou expressão ectópica em seminoma e em diversas linhagens de células de câncer de pâncreas, tanto na forma de mRNA como de proteína, e que o gene participa da proliferação e invasão de células cancerosas. Igualmente, o ALPPL2 também foi descrito como possível marcador diagnóstico de adenocarcinoma ductal pancreático (Hofmann and Millan, 1993; Dua et al., 2013; Fishman, 1995). Foi descrito que a RT-PCR para ALPPL2 pode ser usada e possui sensibilidade apropriada para detectar resíduos de células tumorais germinativas em coletas de sangue periférico e de células progenitoras (Hildebrandt etal., 1998).

[0073] O BCAM codifica a molécula de adesão celular basal (grupo sanguíneo Lutheran), que pertence à superfamília das imunoglobulinas e atua como receptora da laminina, que é uma proteína da matriz extracelular (RefSeq, 2002). O receptor codificado por BCAM é específico para a laminina alfa 5 (LAMA5), que é uma subunidade da laminina 511 (LM-511), atua como um dos principais componentes das membranas basais de vários tecidos. O sistema BCAM/LAMA5 de

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52/287 sempenha um papel funcional essencial na disseminação metastática de células de câncer colorretal positivas para KRAS mutante e para a migração de células de carcinoma hepatocelular (Kikkawa et al., 2013; Kikkawa et al., 2014; Bartolini et al., 2016). Em pacientes com câncer de mama, observou-se que os níveis séricos de BCAM apresentam aumento significativo, e a sobrexpressão de BCAM foi associada com câncer de pele, ovário e pâncreas, assim como com carcinoma endometrial do tipo endometrioide, carcinoma de ovário do tipo endometrioide e carcinoma cutâneo de células escamosas (Kikkawa etal., 2008; Planaguma etal., 2011; Latini etal., 2013; Kim etal., 2015a; Li etal., 2017) (Kikkawa etal., 2008; Planaguma etal., 2011; Latini etal., 2013; Kim et al., 2015a; Li et al., 2017). O gene BCAM pode formar uma proteína de fusão com AKT2 e foi identificado como ativador da quinase AKT2 em carcinoma de ovário seroso de alto grau (Kannan et al.,

2015).

[0074] O CBX2 codifica a cromobox 2, que é um dos componentes do complexo multiproteico policomb. Esse complexo é necessário para manter a repressão da transcrição de diversos genes durante o desenvolvimento e atua por meio de remodelagem da cromatina e modificação de histonas (RefSeq, 2002). A regulação do CBX2 é realizada pelo SMARCE1 e suprime a transcrição de EGFR. Observou-se que também que o CBX2 participa da proliferação celular e metastização (Clermont et al., 2016) e da regulação de três genes supressores tumorais codificados pelo lócus INK4A/ARF (Papadakis et al., 2015; Agherbi et al., 2009; Miyazaki et al., 2008). A sobrexpressão de CBX2 é observada no câncer, incluindo câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de próstata neuroendócrino ou resistente à castração e carcinoma endometrial endometrioide do tipo basaloide (Parris et al., 2010; Clermont et al., 2016; Clermont et al., 2014; Clermont et al., 2015; Jiang et al., 2015; Xu et al., 2016). A presença do

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CBX2 está associada com progressão metastática e diminuição da sobrevida dos pacientes. Observou-se relação entre o CBX2 e a infiltração inflamatória peritumoral, disseminação metastática para os linfonodos cervicais e tamanho tumoral (Parris et al., 2014; Clermont et al., 2014; Xu et al., 2016). A sobrexpressão de CBX2 induz diferenciação e exaustão de células-tronco hematopoiéticas (Klauke etal., 2013).

[0075] O CCNA1 codifica a ciclina A1 pertencente a uma família de ciclinas altamente conservadas que participa da regulação das CDK quinases (RefSeq, 2002). Níveis altos de CCNA1 foram observados em câncer de ovário do tipo epitelial, em linhagens de leucemia linfoblástica e em pacientes com leucemia linfoblástica aguda infantil. Outros autores observaram sobrexpressão da proteína CCNA1 e de seu mRNA em câncer de próstata e em tecidos tumorais de pacientes com carcinoma anaplásico da tireoide (Holm et al., 2006; Wegiel et al., 2008; Marlow et al., 2012; Arsenic et al., 2015). Estudos recentes mostraram que o silenciamento de CCNA1 em células ML1 (linhagem de leucemia) que expressam altos níveis de ciclina A1 alenteceu a entrada na fase S, diminuiu a proliferação e inibiu a formação de colônias (Ji etal., 2005).

[0076] O CD70 codifica a molécula CD70, que é uma citocina da família dos ligantes do fator de necrose tumoral (TNF). A proteína induz proliferação de células T coestimuladas, promove a geração de células T citolíticas e contribui para a ativação de células T. A citocina CD70 também regula a ativação de células B, a função citotóxica de células natural killer e a síntese de imunoglobulinas (RefSeq, 2002). A atuação sobre CD70 pode ser usada para agir especificamente sobre células cancerosas e matá-las. A expressão de CD70 é observada em carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e, de forma ectópica, em linfomas, carcinoma de células renais e glioblastomas; no câncer oral (Bundela et al., 2014; Jacobs et al., 2015b; Wang et al.,

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2016a), o CD70 poderá vir a servir como alvo. Os níveis de CD70 diminuem com a progressão do melanoma. São observados níveis altos de expressão de CD70 em células T CD4+ e CD25+ de pacientes com leucemia ou linfoma de células T aguda do tipo adulto (Jacobs et al., 2015b; Curran et al., 2015; De et al., 2016; Jacobs et al., 2015a; Masamoto et al., 2016; Pich et al., 2016b; Ruf et al., 2015a). A participação do CD70 foi documentada tanto na resposta imune como no desenvolvimento e progressão do câncer (Petrau et al., 2014; Pich et al., 2016a). No carcinoma de células renais, a sobrerregulação do CD70 está associada com piora da sobrevida (Ruf et al., 2015b). A citotoxicidade da cisplatina é mediada por células apresentadoras de antígenos que expressam níveis relativamente mais elevados de CD70 (Beyranvand et al., 2016). Embora sua expressão não seja afetada pela radiação ionizante, o CD70 está associado com radiossensibilidade no câncer de pulmão. Quando aplicada em dose única, a radioterapia externa sobrerregula o CD70 em células PC3 (Bernstein et al., 2014; Kumari and Garnett-Benson, 2016; Pu etal., 2014).

[0077] O CDH3, também denominado P-caderina, codifica a caderina 3, uma caderina clássica da superfamília das caderinas. Essa proteína de adesão intercelular dependente de cálcio é formada por cinco repetições de caderina extracelular, uma região transmembrana e uma cauda citoplasmática altamente conservada. O gene CDH3 se encontra em um cluster gênico em uma região no braço longo do cromossomo 16, que está envolvida em eventos de perda de heterozigosidade em câncer de mama e de próstata. A expressão aberrante da proteína CDH3 também é observada em adenocarcinomas cervicais (RefSeq, 2002). O CDH3 participa da sinalização oncogênica e ativa integrinas, tirosina quinases de receptores, moléculas pequenas com atividade de GTPase, fatores de transcrição de EMT e outros membros da família das caderinas. A sinalização por CDH3 induz invasão e me

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55/287 tástase (Albergaria etal., 2011; Paredes etal., 2012; Bryan, 2015; Vieira and Paredes, 2015). A ativação oncogênica do CDH3 participa da carcinogênese gástrica (Resende et al., 2011). A sobrexpressão de CDH3 promove os cânceres de mama, bexiga, ovário, próstata, endométrio, pele, gástrico, de pâncreas e de cólon (Albergaria et al., 2011; Paredes et al., 2007; Bryan and Tselepis, 2010; Reyes et al., 2013; Vieira and Paredes, 2015). O CDH3 é um marcador epitelial basal expresso em de células de câncer de mama basaloide. Os carcinomas associados ao BRCA1 caracterizados pela expressão de marcadores basaloides como CDH3 apresentam um fenótipo agressivo, com grau histológico elevado, hiperproliferação e ausência dos receptores de estrogênio e de HER3 (Honrado et al., 2006; Palacios et al., 2008; Rastelli etal., 2010; Dewar etal., 2011). O CDH3 atua como supressor de tumor no melanoma e no carcinoma oral de células escamosas (Haass et al., 2005; Vieira and Paredes, 2015). Pode-se usar o CDH3 como marcador da transição de epitelial para mesenquimal (TEM). Durante a formação e a progressão tumoral, ocorre um deslocamento de E-caderina para N-caderina acompanhado de expressão de CDH3 (Piura et al., 2005; Bonitsis et al., 2006; Bryan and Tselepis, 2010; Ribeiro and Paredes, 2014). A interação competitiva entre o CDH3 e a beta-catenina interfere nas interações celulares e na metastização do câncer gástrico (Moskvina and Mal'kov, 2010). Também é possível que o CDH3 seja um marcador precoce da formação de câncer de cólon (Alrawi et al., 2006). A desregulação de CDH3 é um marcador de mau prognóstico e aumento da malignidade (Knudsen and Wheelock, 2005).

[0078] O CDKN2A, também denominado p16 e p16INK4a, codifica um inibidor de quinase 2A dependente de ciclina, que produz diversas variantes transcricionais cujos éxons iniciais são diferentes. Foram descritas pelo menos três variantes com splicing alternativo que codifi

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56/287 cam proteínas diferentes, sendo que duas delas codificam isoformas estruturalmente relacionadas que se sabe atuam como inibidoras da CDK4 quinase. O produto de transcrição remanescente inclui um éxon inicial variante localizado 20 Kb à jusante do remanescente do gene. Esse produto de transcrição contém uma fase de leitura aberto (ARF, alternative reading frame) variante, que especifica uma proteína cuja estrutura não está relacionada com os produtos das outras variantes. O produto do ARF funciona como estabilizador da proteína supressora tumoral p53, pois pode interagir com a proteína ligase MDM2 associada à ubiquitina E3, que é uma das proteínas responsáveis pela degradação do p53 (RefSeq, 2002), e sequestrá-la. O CDKN2A apresenta mutações no adenocarcinoma ductal pancreático, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas da vulva e câncer do trato biliar. Essas mutações podem ser herdadas e, assim, aumentar o risco de câncer de pâncreas. A deleção de CDKN2A é observada no mesotelioma pleural, e esse gene também é subregulado no câncer de bexiga (Clancy et al., 2016; Fabbri et al., 2017; Gan et al., 2016; Kleeff et al., 2016; Nabeshima etal., 2016; Pacholczyk etal., 2016; Petersen, 2016; Sohal et al., 2016; Tatarian and Winter, 2016). A participação do CDKN2A foi observada na proliferação de células cancerosas, tumorigênese, metástase, sinalização por Wnt, senescência, apoptose e mecanismos de reparo de DNA (Gupta et al., 2016; Ko et al., 2016; Low et al., 2016; Sedgwick and D'Souza-Schorey, 2016; Zhao et al., 2016). Além disso, o CDKN2A interage com p53 para suprimir o câncer de mama (Alhosin etal., 2016; Fry etal., 2017)e atua como gene supressor tumoral ao ser subregulado pela sobrexpressão da proteína oncogênica UHRF1. A hipermetilação do promotor do CDKN2A está associada com aumento do risco de lesões intraepiteliais escamosas de baixo ou alto grau, câncer de colo do útero e com o tabagismo. A desregulação epigenética do CDKN2A é observada durante o desenvol

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57/287 vimento do carcinoma hepatocelular e do carcinoma de esôfago de células escamosas (Han et al., 2017; Khan et al., 2017; Ma et al., 2016a). Pode-se usar o CDKN2A no diagnóstico de câncer de colo do útero e no carcinoma de orofaringe de células escamosas (Mahajan, 2016; Savone et al., 2016; Tjalma, 2017). A expressão de CDKN2A é induzida pela infecção por HPV, um vírus que sabidamente possui potencial oncogênico (Hoff et a!., 2017; Lorincz, 2016).

[0079] O CDKN2B, também denominado p15, codifica o inibidor de quinase 2B dependente de ciclina, cuja localização é adjacente à do gene supressor tumoral CDKN2A em uma região que frequentemente apresenta mutações e deleções em vários tipos de tumores. O gene CDKN2B codifica um inibidor de quinase dependente de ciclina, que forma um complexo com CDK4 ou CDK6 e inibe a ativação das quinases CDK; assim, a proteína codificada funciona como regulador do crescimento celular que controla a progressão da fase G1 do ciclo celular. O TGF-beta induz forte expressão de CDKN2B, o que sugere que esse gene pode participar da inibição do crescimento induzida por TGF-beta (RefSeq, 2002). O CDKN2B participa da regulação da progressão do ciclo celular e da inibição da proliferação celular (Hu and Zuckerman, 2014; Roy and Banerjee, 2015). A deleção de CDKN2B está relacionada com o câncer de bexiga associado à esquistossomíase. Algumas mutações do CDKN2B podem estar envolvidas na suscetibilidade hereditária a tumores gliais. Foram observadas anomalias do CDKN2B em meningiomas e mutações no carcinoma urotelial sem invasão muscular (Mawrin and Perry, 2010; Melin, 2011; Pollard et a!., 2010; Alentorn et al., 2013; Idbaih, 2011; Koonrungsesomboon et al., 2015). Outras anomalias do CDKN2B são a hipermetilação na leucemia mieloide aguda e em adenomas hipofisários e a regulação aberrante no melanoma cutâneo maligno (Bailey et al., 2010; Jiang et al., 2014; Popov and Gil, 2010; van den Hurk et al., 2012; Wolff and Bies,

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2013; Zhou et al., 2014). A interação entre o CDKN2B e o supressor tumoral RB é regulada pelo Miz-1 e pelo TGF-beta (Zhou et al., 2014; Geyer, 2010; Morey etal., 2011). Ao atuar como gene supressor tumoral, o CDKN2B é afetado por RNAs não codificantes longos. O próprio CDKN2B também pode se associar com AS1 para forma um RNA não codificante longo que talvez participe do desenvolvimento do câncer (Popov and Gil, 2010; Aguilo et al., 2016; Shi et al., 2013; Wanli and Ai, 2015).

[0080] O CLDN6, também conhecido como claudina 6, codifica um membro da família das claudinas que é uma proteína integral de membrana e constitui parte dos filamentos das junções adesivas (RefSeq, 2002). Demonstrou-se que a expressão de CLDN6 está associada com metástases linfonodais e estádio TNM de câncer de pulmão de células não pequenas (Wang etal., 2015b). Constatou-se também que níveis baixos de expressão de CLDN6 estão associados com níveis de sobrevida significativamente menores em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (Wang et al., 2015b). Portanto, essa redução da expressão é um fator prognóstico independente em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (Wang et al., 2015b). Demonstrou-se que o CLDN6 é subregulado no carcinoma de colo do útero e no câncer gástrico (Zhang et al., 2015e; Lin et al., 2013b) e sobrerregulado no câncer de mama relacionado ao BRCA1 e no carcinoma de ovário seroso papilífero (Wang et al., 2013; Heerma van Voss et al., 2014). Foi descrito que o CLDN6 atua como supressor tumoral no câncer de mama (Zhang et al., 2015e). Demonstrou-se também que o ganho de expressão de CLDN6 nas linhagens HeLa e C33A de carcinoma de colo do útero suprime a proliferação celular, a formação de colônias in vitro e a proliferação tumoral in vivo. Esses achados sugerem que o CLDN6 pode funcionar como supressor tumoral em linhagens de carcinoma de colo do útero (Zhang et al., 2015e).

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É possível que o CLDN6 tenha efeito benéfico na invasão e metástase associadas com câncer de ovário (Wang et al., 2013). Demonstrou-se que a expressão de CLDN6 é consistente em tumores de células germinativas, permitindo que ele sirva como marcador diagnóstico em tumores primitivos de células germinativas (Ushiku et al., 2012), e positiva na maioria de um conjunto de casos de tumores teratoides ou rabdoides atípicos do sistema nervoso central. Nestes tumores, a positividade acentuada para CLDN6 pode servir como marcador prognóstico independente para a evolução da doença (Dufour etal., 2012).

[0081] O CT45A1, também denominado CT45, codifica o membro 45 da família dos antígenos de câncer e testículo e se localiza no cromossomo Xq26.3 (RefSeq, 2002). Demonstrou-se que os genes CT45 podem servir como potenciais biomarcadores prognósticos e alvos terapêuticos no câncer de ovário do tipo epitelial (Zhang etal., 2015d). A proteína CT45A1, que normalmente é expressa apenas em células germinativas testiculares, também é expressa em câncer de pulmão, câncer de mama e câncer de ovário (Chen et al., 2009). Demonstrouse também que o CT45A1 está associado com mau prognóstico e evolução desfavorável no mieloma múltiplo (Andrade et al., 2009). Foi descrito que o gene CT45A1 sobrerregula genes associados à transição de epitelial para mesenquimal (TEM) e a metástases de modo a promover a TEM e a metastização. Também foi descrito que o gene CT45A1 está envolvido na iniciação ou manutenção de células-tronco cancerosas, promovendo a tumorigênese e a progressão maligna (Yang et al., 2015b). Em um modelo de câncer de mama, a sobrexpressão de CT45A1 acarretou sobrerregulação de vários genes oncogênicos e promotores de metástases, induziu ativação constitutiva das vias de sinalização ERK e CREB, e aumentou a tumorigênese, a invasão e a metástase. Foi demonstrado que o silenciamento de CT45A1 reduz a migração e invasão de células cancerosas. Portanto, o

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CT45A1 pode atuar como um novo proto-oncogene e servir como alvo para descoberta de novos fármacos e tratamentos anticâncer (Shang etal., 2014).

[0082] O CT45A2 codifica um gene de um cluster que contém vários genes semelhantes entre si. Esse gene pertence à família de antígenos de câncer e testículo e se localiza no cromossomo Xq26.3 (RefSeq, 2002). Demonstrou-se que o CT45A2 funciona como parceiro de fusão MLL com splicing em pacientes pediátricos com leucemia aguda bifenotípica de novo, podendo, portanto, ser relevante para a leucemogênese (Cerveira et al., 2010). Foi demonstrado que a proteína 45 da família de antígenos de câncer e testículo frequentemente é expressa tanto em linhagens de células cancerosas como em amostras de câncer de pulmão (Chen etal., 2005). Demonstrou-se que os genes CT45 podem servir como potenciais biomarcadores prognósticos e alvos terapêuticos no câncer de ovário do tipo epitelial (Zhang et al., 2015d).

[0083] O gene CT45A3 codifica o membro 45 A3 da família dos antígenos de câncer e testículo e se localiza no cromossomo Xq26.3 (RefSeq, 2002). Foi demonstrado que a proteína 45 da família de antígenos de câncer e testículo frequentemente é expressa tanto em linhagens de células cancerosas como em amostras de câncer de pulmão (Chen et al., 2005). Demonstrou-se que os genes CT45 podem servir como potenciais biomarcadores prognósticos e alvos terapêuticos no câncer de ovário do tipo epitelial (Zhang etal., 2015d).

[0084] O gene CT45A4 codifica o membro 45 A4 da família dos antígenos de câncer e testículo e se localiza no cromossomo Xq26.3 (RefSeq, 2002). Foi demonstrado que a proteína 45 da família de antígenos de câncer e testículo frequentemente é expressa tanto em linhagens de células cancerosas como em amostras de câncer de pulmão (Chen et al., 2005). Demonstrou-se que os genes CT45 podem

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61/287 servir como potenciais biomarcadores prognósticos e alvos terapêuticos no câncer de ovário do tipo epitelial (Zhang etal., 2015d).

[0085] O gene CT45A5 codifica o membro 45 A5 da família dos antígenos de câncer e testículo e se localiza no cromossomo Xq26.3 (RefSeq, 2002). Foi demonstrado que a proteína 45 da família de antígenos de câncer e testículo frequentemente é expressa tanto em linhagens de células cancerosas como em amostras de câncer de pulmão (Chen et al., 2005). Demonstrou-se que os genes CT45 podem servir como potenciais biomarcadores prognósticos e alvos terapêuticos no câncer de ovário do tipo epitelial (Zhang etal., 2015d).

[0086] O gene CT45A6 codifica o membro 45 A6 da família dos antígenos de câncer e testículo e se localiza no cromossomo Xq26.3 (RefSeq, 2002). Foi demonstrado que a proteína 45 da família de antígenos de câncer e testículo frequentemente é expressa tanto em linhagens de células cancerosas como em amostras de câncer de pulmão (Chen et al., 2005). Demonstrou-se que os genes CT45 podem servir como potenciais biomarcadores prognósticos e alvos terapêuticos no câncer de ovário do tipo epitelial (Zhang etal., 2015d).

[0087] O CTAG2 codifica o antígeno de câncer e testículo do tipo 2, um antígeno tumoral autoimunogênico da família ESO/LAGE de antígenos de câncer e testículo. A proteína CTAG2 é expressa em diversos cânceres (por exemplo, melanoma, câncer de mama, bexiga e próstata) e também em tecido testicular normal (RefSeq, 2002). Foi observado envolvimento do CTAG2 na migração e invasividade de células cancerosas (Maine et al., 2016). A expressão de CTAG2 é sobrerregulada pelo LSAMP, o que reduz a proliferação celular (Baroy et al., 2014). Alguns tumores que expressam CTAG2 são o lipossarcoma, câncer de pulmão, urotelial e colorretal. Além disso, diversas entidades sobrexpressam CTAG2, incluindo o carcinoma de esôfago de células escamosas (Kim etal., 2012; Dyrskjot etal., 2012; Hemminger etal.,

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2014; Forghanifard et al., 2011; McCormack et al., 2013; Shantha Kumara etal., 2012). Células T modificadas que agem contra CTAG2 podem ser usadas no tratamento do mieloma múltiplo, e autoanticorpos anti-CTAG2 são úteis para o diagnóstico de câncer. A imunoterapia também pode empregar o CTAG2 como alvo. A expressão de CTAG2 está associada com redução da sobrevida livre de progressão (van et al., 2011; Dyrskjot et al., 2012; Hudolin et al., 2013; Pollack et al., 2012; Rapoport etal., 2015; Wang etal., 2015a).

[0088] O CYP2W1 codifica um membro da superfamília de enzimas do citocromo P450, que são monoxigenases catalisadoras de reações relevantes para o metabolismo de fármacos e na síntese de colesterol, esteroides e outros lipídios (RefSeq, 2002). A sobrexpressão de CYP2W1 ocorre em diversos cânceres humanos (por exemplo, hepatocelular, colorretal e gástrico) e está associada com progressão tumoral e redução da sobrevida (Aung et al., 2006; Gomez etal., 2010; Zhang et al., 2014a). Como induz expressão gênica de forma específica para tumores, o CYP2W1 é interessante como alvo de fármacos ou ativador enzimático no tratamento do câncer (Karlgren and IngelmanSundberg, 2007; Nishida etal., 2010).

[0089] O DPPA2 codifica proteína associada à pluripotência de desenvolvimento e está localizado no cromossomo 3q13.13 (RefSeq, 2002). A sobrexpressão de DPPA2 é observada em câncer gástrico, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário do tipo epitelial e câncer colorretal. O oncogene DPPA2 é sobrerregulado em diversas entidades e também apresenta repressão recíproca no teratoma (Tung et al., 2013; Ghodsi et al., 2015; John et al., 2008; Raeisossadati etal., 2014; Shabestarian et al., 2015; Tchabo etal., 2009; Western et al., 2011). A expressão de DPPA2 se correlaciona com a profundidade de invasão tumoral, estádio, metástases linfonodais e agressividade (Ghodsi etal., 2015; Raeisossadati etal., 2014; Shabes

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63/287 tarian et al., 2015). Observou-se também que o DPPA2 está envolvido na patogênese de câncer de pulmão de células não pequenas (Watabe, 2012)e apresenta metilação diferencial no câncer de tireoide (Rodriguez-Rodero etal., 2013).

[0090] O ENTPD4 (UDPase) codifica a ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 4, uma proteína da família das apirases cuja função talvez seja recuperar nucleotídeos de lisossomos (RefSeq, 2002). A atividade de UDPase aumenta em pacientes com câncer de ovário ou câncer testicular e diminui com a quimioterapia (Papadopoulou-Boutis etal., 1985).

[0091] O ESR1 codifica um receptor de estrogênio, um fator de transcrição ativado por ligante que é importante para a ligação de hormônios, ligação ao DNA e ativação da transcrição, que é essencial para o desenvolvimento sexual e da função reprodutora (RefSeq, 2002). As mutações e polimorfismos de nucleotídeo único do ESR1 estão associados com risco para vários tipos diferentes de câncer, como câncer de fígado, próstata, vesícula biliar e mama. A sobrerregulação da expressão de ESR1 está associada com proliferação celular e crescimento tumoral, mas pacientes com tumores positivos para ESR1 apresentam sobrevida geral melhor porque o tratamento com moduladores seletivos de receptores de estrogênio é mais bemsucedido (Sun etal., 2015; Hayashi etal., 2003; Bogush etal., 2009; Miyoshi etal., 2010; Xu et aí., 2011; Yakimchuk et aí., 2013; Fuqua et al., 2014). A sinalização por ESR1 interfere em diversas vias responsáveis pela transformação, crescimento e sobrevida celular, tais como EGFR/IGFR, PI3K/Akt/mTOR, p53, HER2, NFkappaB e TGF-beta (Frasor etal., 2015; Band and Laiho, 2011; Berger etal., 2013; Skandalis etal., 2014; Mehta and Tripathy, 2014; Ciruelos Gil, 2014).

[0092] O ETV1 codifica a variante 1 de ETS, que é membro da família ETS (E26) de fatores de transcrição. A proteína ETS regula di

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64/287 versos genes-alvo que modulam processos biológicos como o crescimento celular, angiogênese, migração, proliferação e diferenciação (RefSeq, 2002). Foi constatado envolvimento do ETV1 na transição de epitelial para mesenquimal, resposta a danos ao DNA, sinalização AR e PTEN, invasão de células oncológicas e metástases. Ao interagir com JMJD2A, o ETV1 promove a formação de carcinoma de próstata e aumenta a expressão de YAP1, afetando assim a via de sinalização Hippo (Mesquita etal., 2015; Baty etal., 2015; Heeg etal., 2016; Higgins etal., 2015; Kim etal., 2016; Lunardi etal., 2015). A expressão de ETV1 diminui no câncer de próstata, mas o gene apresenta sobrexpressão em câncer de pâncreas, tumores do estroma gastrointestinal, tumores da oligodendroglia e carcinoma de células renais. No câncer de pulmão de células não pequenas, o ETV1 pode atuar como oncogene (Heeg et al., 2016; Gleize et al., 2015; Ta et al., 2016; Al et al., 2015; Hashimoto etal., 2017; Jang et al., 2015). Existe ainda uma correlação entre aumento dos níveis de mRNA de ETV1 em microvesículas de células de linhagens celulares de câncer de próstata e progressão da doença (Lazaro-lbanez et al., 2017). O oncogene ETV1 interage com a proteína do ponto de quebra do sarcoma de Ewing (EWS, Ewing’s sarcoma breakpoint) e com Sparc e Has2, que medeiam a metastização de células cancerosas e a expansão do estroma desmoplásico (Heeg et al., 2016; Kedage et al., 2016). Os produtos de fusão do gene ETV1 e o nível de metilação do promotor ETV1 também têm utilidade diagnostica (Angulo et al., 2016; 2015; Kumar-Sinha et al., 2015; Linn etal., 2015).

[0093] O ETV4, também denominado E1AF ou PEA3, codifica um membro da família Ets de fatores de transcrição de oncogenes e está envolvido na regulação da expressão gênica em metástases e na indução de genes associados à diferenciação em células-tronco embrionárias (Akagi et al., 2015; Coutte et al., 1999; Ishida et al., 2006). A

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65/287 sobrexpressão de ETV4 é observada em diversos cânceres (por exemplo, mama, pulmão, colorretal e gástrico) e está associada com migração, invasão, metástase e mau prognóstico (Benz et al., 1997; Horiuchi etal., 2003; Yamamoto et al., 2004; Keld et al., 2011; Hiroumi et al., 2001). A sobrerregulação do ETV4 é promovida por diversas vias (por exemplo, ERK/MAPK, HER2, PI3K e Ras) após indução de vários alvos, incluindo MMPs e IL-8 (Maruta et al., 2009; Keld et al., 2010; Chen etal., 2011b; Aytes etal., 2013).

[0094] O ETV5 codifica a variante 5 da proteína ETS e se encontra no cromossomo 3q28 (RefSeq, 2002). Foi descrito que as vias das quais o ETV5 participa apresentam estreita relação com o processo de transição de epitelial para mesenquimal em câncer de endométrio (Colas et al., 2012). Demonstrou-se que o ETV5 interage com diversas vias de sinalização, tais como a de progressão do ciclo celular e a de sinalização por TGF-beta na linhagem OV90 de câncer de ovário, e a expressão de ETV5 está associada com a expressão do fator de transcrição oncogênico FOXM1 no câncer de ovário (Llaurado et al., 2012b). Além disso, o ETV5 também apresenta sobrerregulação no câncer de ovário. No modelo esferoide, a inibição e a sobrerregulação de ETV5 promoveram proliferação e migração celular, assim como adesão a componentes da matriz extracelular, adesão intercelular e sobrevida celular. Portanto, é possível que o ETV5 participe da progressão do câncer de ovário, disseminação celular e metástases (Llaurado et al., 2012a). Foi descrito que tumores de próstata apresentam rearranjos cromossômicos de ETV5 e de outros membros da subfamília de oncogenes PEA3. Acredita-se que este seja um dos principais fatores da gênese do câncer de próstata. Também foi assinalado que o ETV5 é uma oncoproteína envolvida em melanomas, câncer de mama e alguns outros tipos de câncer (Oh et al., 2012). Foi sugerido que o ETV5 tem participação relevante na regulação da expressão da me

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66/287 taloproteinase de matriz 2, afetando assim a reabsorção no condrossarcoma humano. Por isso, é possível que esse gene atue como efetor na porção proximal da cascata metastática desse tipo de tumor (Power etal., 2013) e possa servir de alvo terapêutico.

[0095] Ο EYA2 codifica o coativador de transcrição EYA e a fosfatase 2, que pertence à família de proteínas de olhos ausentes (EYA, eyes absent), que está envolvida na formação dos olhos (RefSeq, 2002). A sobrexpressão de EYA2 foi observada em vários tipos de tumor, tais como tumor de ovário epitelial, câncer de mama, próstata, trato urinário, glioblastoma, adenocarcinoma de pulmão, câncer de colo do útero, câncer de cólon e hematopoiético (Bierkens et al., 2013; Zhang et al., 2005; Guo et al., 2009; Patrick et al., 2013; Kohrt et al.,

2014). Estudos mostraram que ο EYA2 influencia a transcrição dos membros da via do TGF beta e a fosforilação do TGFBR2. Esses dois achados sugerem que ο EYA2 pode ter um duplo papel no pâncreas (Vincent et al., 2014).

[0096] O FAM111B codifica o membro B da família da família com similaridade de sequência 111. Essa proteína possui um domínio de cisteína/serina peptidase semelhante ao da tripsina em sua porção Cterminal. Quando este segmento sofre mutação, ocorrem manchas pigmentares, telangiectasia, atrofia da epiderme, contraturas tendíneas e fibrose pulmonar progressiva (RefSeq, 2002). Constatou-se também que o FAM111B apresenta subregulação durante a inibição induzida por metformina e aspirina do desenvolvimento de câncer de pâncreas (Yue etal., 2015).

[0097] O FAM83H codifica o membro H da família com similaridade de sequências 83, que tem importante participação no desenvolvimento estrutural e calcificação do esmalte dentário. Defeitos nesse gene são uma das causas da amelogênese imperfeita tipo 3 (AI3) (RefSeq, 2002). O RNA não codificante longo FAM83H-AS1 regula a sina

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67/287 lização pela via MET/EGFR, está envolvido na proliferação, migração e invasão celular (Zhang et al., 2017)e é sobrexpresso no câncer de pulmão e no câncer colorretal. O oncogene FAM83H é sobrexpresso em várias entidades, tais como câncer de mama e câncer colorretal (Zhang etal., 2017; Kuga etal., 2013; Snijders etal., 2017; Yang etal., 2016c; Yang et al., 2016b). O aumento da expressão do RNA não codificante longo FAM83H-AS1 está associado com redução da sobrevida e com mau prognóstico (Yang et al., 2016c; Yang et al., 2016b). É possível que o FAM83H esteja envolvido no câncer de próstata independente de androgênio (Nalla et al., 2016). Sabe-se também que o FAM83H interage com CKIalfa de modo a formar filamentos de queratina e desmossomos (Kuga et al., 2016).

[0098] O FBN2, também denominado fibrilina 2, codifica uma proteína que atua como componente do tecido conjuntivo e pode estar envolvida na construção de fibras elásticas (RefSeq, 2002). Essa proteína foi descrita como proteína reguladora da atividade sinalizadora de TGF-beta na matriz extracelular (Lilja-Maula et al., 2014). A hipermetilação de FBN2 foi descrita como biomarcadora epigenética no carcinoma de células renais de células claras, além de ser útil para detecção precoce de câncer colorretal e associada com mau prognóstico em pacientes com câncer colorretal (Ricketts et al., 2014; Rasmussen etal., 2016; Yi etal., 2012). Demonstrou-se que o FBN2 apresenta concentração maior na superfície celular do meduloblastoma e, portanto, podería ser usado para o desenvolvimento de sondas específicas para tumores para ressecção guiada de meduloblastomas (Haeberle etal., 2012).

[0099] O FOLR1 codifica o receptor de folato 1, que se liga ao ácido fólico e derivados reduzidos do mesmo e transporta o 5metiltetrahidrofolato para o interior das células. Após ser secretado, o FOLR1 se ancora em membranas por meio de uma ligação glicosil

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68/287 fosfatidilinositol ou se mantém em forma solúvel (RefSeq, 2002). Por ser uma parte importante da via FOLR1/cSrc/ERK1/2/NFKB/p53, que é essencial para a captação do ácido fólico, o FOLR1 consegue regular a proliferação de células de câncer de mama, pulmão e cólon (Kuo and Lee, 2016; Cheung et al., 2016). Foi observado que o FOLR1 é amplamente expresso em células de câncer de ovário do tipo epitelial, onde sua expressão aumenta com a progressão do estádio tumoral, e pode ser um possível alvo terapêutico (Leung etal., 2016; Ponte et al., 2016; Moore et al., 2016; Hou et al., 2017; Notaro etal., 2016; Bergamini et al., 2016). Demonstrou-se também que a redução da expressão de FOLR1 durante o tratamento do câncer colorretal tornou mais eficaz a terapia com 5-fluorouracila (Tsukihara et al., 2016). Como marcador tumoral, o FOLR1 é ideal para imunoterapia de câncer de mama triplo-negativo e de câncer de cólon (Liang et al., 2016; Song et al., 2016).

[00100] O GPR64 codifica o receptor de adesão G2 acoplado à proteína G, um membro da família de receptores acoplados à proteína G, cuja estrutura consiste em uma proteína transmembrana específica do epidídimo (RefSeq, 2002). Em linhagens de câncer de mama, o knockdown de GPR64 causou forte redução da adesão e da migração celular (Peeters etal., 2015).

[00101] Ο HOXA10 codifica o homeobox A10. O gene HOXA10 é parte do cluster A no cromossomo 7 codifica um fator de transcrição ligante de DNA que talvez atue na regulação gênica, morfogênese e diferenciação. Mais especificamente, ο HOXA10 pode influenciar a fertilidade, viabilidade embrionária e regulação da diferenciação de linhagens hematopoiéticas. O gene HOXA10 é transcrito além do sinal de parada junto com o gene seguinte, que é o homeobox A9 (RefSeq, 2002). O produto do gene HOXA10 é um fator de células-tronco cuja expressão se correlaciona com a expressão de CD133 em gliomas e

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69/287 pode favorecer a progressão de câncer. Alguns efeitos do HOXA10 são a proliferação, migração, invasão e metástase de câncer, resistência a múltiplos fármacos ao induzir a expressão de gp-P e MRP1 e promoção da transição de epitelial para mesenquimal. A sinalização miR-218/PTEN/AKT/PI3K pode ter como alvo distai ο HOXA10. Além disso, ο HOXA10 promove a expressão do fator de transcrição Prdm16 associado à LMA, talvez medeie a interrupção do ciclo celular em G1 de forma dependente de p21 e participa da sinalização de MAPK por TGF-beta2/p38. Esta última propriedade promove a invasão de células cancerosas de forma dependente de MMP-3 (Carrera et al., 2015; Cui etal., 2014; Emmrich etal., 2014; Han et al., 2015; Li etal., 2014a; Li et al., 2016a; Sun et al., 2016; Xiao et al., 2014; Yang et al., 2016a; Yi et al., 2016; Yu et al., 2014; Zhang et al., 2014b; Zhang et al., 2015b). Quanto à expressão, ο HOXA10 apresenta sobrerregulação no câncer gástrico, expressão diferenciada no carcinoma oral de células escamosas e diferenças na metilação no carcinoma de ovário seroso e glioblastoma (Carrera et al., 2015; Han et al., 2015; Kurscheid et al., 2015; Niskakoski et al., 2014; Oue et al., 2015; Shima et al., 2014). O nível de metilação de HOXA10 pode ser usado no diagnóstico de câncer de mama. No câncer gástrico, a coexpressão de HOXA10 e CD44 se correlaciona com o tamanho tumoral e a sobrevida do paciente, e a coexpressão de HOXA10 e miR-196b se correlaciona com mau prognóstico (Han et al., 2015; Lim et al., 2013; Uehiro et al., 2016). O tratamento com SGI-110 hipometila ο HOXA10, sensibilizando células de câncer de ovário à quimioterapia (Fang etal., 2014a).

[00102] Ο HOXA9 codifica a proteína homeobox A9. O gene HOXA9 é parte do cluster A do cromossomo 7 e codifica um fator de transcrição ligante de DNA que talvez atue na regulação gênica, morfogênese e diferenciação. A leucemogênese mieloide foi associada com um evento de translocação específico, que causa uma fusão en

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70/287 tre os genes HOXA9 e NUP98 (RefSeq, 2002). Na leucemia mieloide aguda, a expressão de HOXA9 em níveis elevados está associada com prognóstico menos favorável. A coexpressão de HOXA9 e MEIS1 induz LMA. Ο HOXA9 é subregulado no câncer colorretal e é frequentemente metilado no câncer de endométrio (Alvarado-Ruiz et al., 2016; Chen et al., 2015; Li etal., 2016b; Li etal., 2016e; Sykes etal., 2016). O produto da fusão NUP98-HOXA9 atua como oncogene (Abe et al., 2016; Sontakke et al., 2016). A resposta à quimioterapia à base de cisplatina depende do nível de metilação do promotor HOXA9. Na leucemia, a coexpressão de HOXA9, MEIS1 e MN1 sensibiliza as células à inibição farmacológica do DOT1L (Li et al., 2016c; Riedel et al., 2016; Xylinas et al., 2016). A expressão de HOXA9, que atua como supressor tumoral, pode ser usada para diagnosticar câncer (Ma etal., 2016b). Na leucemia, ο HOXA9 medeia a autorrenovação de célulastronco leucêmicas, um processo que é acelerado pela deleção de HIF2alfa (Vukovic etal., 2015; Zhu etal., 2016).

[00103] Ο HOXB9 codifica o homeobox B9, um membro da família homeobox Abd-B que codifica uma proteína com um domínio ligante de DNA de homeobox, e se localiza em um cluster de genes homeobox B localizado no cromossomo 17. A proteína nuclear codificada funciona como fator de transcrição específico para uma sequência e está envolvida na proliferação e diferenciação celular. A expressão desse gene aumenta em alguns casos de leucemia, câncer de próstata e câncer de pulmão (RefSeq, 2002). O gene também participa de vias angiogênicas reguladas pelo miR-192 e é alvo da ação distai da sinalização por Wnt/beta-catenina induzida pela Nacetilgalactosaminiltransferase, um processo que resulta em metastização. É possível que ο HOXB9 regule a transição de mesenquimal para epitelial no carcinoma gástrico e adenocarcinoma de cólon e a transição de epitelial para mesenquimal em câncer de mama e carci

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71/287 noma hepatocelular de forma dependente de TGF-beta1. Também foi descrito o envolvimento do HOXB9 na proliferação, migração e invasão celular. O TGF-beta1 subregula ο HOXB9 de forma dependente de Kindlina-2/PDAC (Chang etal., 2015b; Darda etal., 2015; Hoshino et al., 2014; Huang et al., 2014; Kwon et al., 2015; Seki et al., 2012; Sha et al., 2015; Wu et al., 2016; Zhan et al., 2014; Zhan et al., 2015; Zhussupova et al., 2014). A expressão de HOXB9 é diferenciada em carcinoma de células renais de células claras com PBRM1 mutante e exacerbada em câncer de ovário seroso resistente à platina e em câncer de mama, glioma, adenocarcinoma de cólon, carcinoma hepatocelular e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço. No carcinoma gástrico, a expressão de HOXB9 é reduzida. São observadas mutações de HOXB9 na leucemia (Menezes et al., 2014; Chang et al., 2015b; Darda et al., 2015; Zhan etal., 2014; Zhussupova et al., 2014; Fang etal., 2014b; Hayashida etal., 2010; Kelly etal., 2016; Sha etal., 2013; Shrestha et al., 2012; Wang et al., 2016b; Yuan et al., 2014). A expressão de HOXB9 é regulada por E2F1 e FAT10 (Zhussupova et al., 2014; Yuan etal., 2014) e se correlaciona com o tamanho do tumor no câncer oral e com estádio clínico avançado no glioma. A subregulação de HOXB9 está associada com diminuição da sobrevida do paciente no carcinoma gástrico (Fang et al., 2014b; Sha et al., 2013; Oliveira-Costa et al., 2015; Tomioka et al., 2010). Além disso, ο HOXB9 regula a progressão do câncer de bexiga (Zhang et al., 2016b): o DNA não codificante longo nc-HOXB9-205 é subregulado no carcinoma urotelial de bexiga (Luo et al., 2014). O produto do gene de fusão BCAS3HOXB9 é expresso no câncer de mama (Schulte etal., 2012).

[00104] O HOXC10 codifica o homeobox C10, que pertence à família de genes homeobox. Os genes homeobox codificam uma família altamente conservada de fatores de transcrição, que desempenha um importante papel na morfogênese em todos os organismos multicelula

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72/287 res. 0 gene HOXC10 é um dos vários genes HOXC de homeobox localizados em um cluster no cromossomo 12. A produção da proteína desse gene é controlada durante a diferenciação e a proliferação celular, o que sugere que essa proteína influencia a ativação original (RefSeq, 2002). Outros efeitos do HOXC10 são a indução de quimiorresistência (ao suprimir a apoptose e sobrerregular o NF-kappaB e o reparo de danos ao DNA), indução de apoptose e inibição do crescimento celular e envolvimento na progressão e invasão do câncer de colo do útero (Pathiraja etal., 2014; Sadik etal., 2016; Zhai etal., 2007). A sobrerregulação de HOXC10 é observada no câncer de tireoide, carcinoma de células escamosas do colo do útero e câncer de mama (Abba et al., 2007; Zhai et al., 2007; Ansari et al., 2012; Feng et al., 2015). A expressão de HOXC10 se correlaciona com diminuição do tempo livre de recorrência e da sobrevida geral no câncer de mama negativo para RE e está associada com estádio avançado, patologia desfavorável, mau prognóstico, interação entre receptores de citocina e vias de sinalização por quimioquinas no câncer de tireoide (Sadik et al., 2016; Feng et al., 2015). A metilação de HOXC10 é diferenciada no carcinoma oral de células escamosas e no linfoma de células B de pequenas células (Marcinkiewicz and Gudas, 2014a; Marcinkiewicz and Gudas, 2014b; Rahmatpanah etal., 2006).

[00105] O HOXC9 codifica o homeobox C9, que pertence à família de genes homeobox. Os genes do homeobox codificam uma família altamente conservada de fatores de transcrição, que são essenciais para a morfogênese em todos os organismos pluricelulares. O gene HOXC9 é um dos vários genes do homeobox HOXC e se localiza no cromossomo 12 (RefSeq, 2002). O knockdown de HOXC9 reduz a viabilidade, migração, invasão e tumorigenicidade celular, além de promover a autofagia. Sabe-se também que o HOXC9 está envolvido na invasão e proliferação de células cancerosas, na quimiorresistência

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73/287 no câncer de bexiga (efeito mediado por miR-193a-3p), na sinalização por ácido retinoico e na proliferação e diferenciação celular (Hur et al., 2016; Kocak etal., 2013; Lv etal., 2015a; Mao etal., 2011; Simeone et al., 1991; Stornaiuolo et al., 1990; Xuan et al., 2016; Zha et al., 2012). Outras alterações do HOXC9 são a expressão diferenciada no câncer de mama, pulmão e neuroblastoma, metilação no câncer de pulmão de células não pequenas em estádio 1 e sobrerregulação no astrocitoma. A expressão de HOXC9 é observada no câncer de esôfago e de colo do útero (Hur et al., 2016; Xuan etal., 2016; Gu et al., 2007; Lin et al., 2009; Lopez et al., 2006; Okamoto et al., 2007). A transcrição do HOXC9 pode ser inibida por Smad4 (Zhou et al., 2008). A expressão de HOXC9 está inversamente associada com a sobrevida livre de doença e com a sobrevida livre de metástases distantes no câncer de mama e com mau prognóstico no glioblastoma (Hur et al., 2016; Xuan etal., 2016) (Hur etal., 2016; Xuan etal., 2016). A inibição de DAPK1 pelo HOXC9 interfere na autofagia induzida pelo Beclin-1 (Xuan et al.,

2016).

[00106] O HOXD10 codifica a proteína do homeobox D10, que funciona como fator de transcrição específico para sequências, é expresso nos brotamentos dos membros em desenvolvimento e participa da diferenciação e desenvolvimento dos membros (RefSeq, 2002). O HOXD10 foi identificado como gene-alvo do miR-10b, que é sobrerregulado no câncer gástrico (CG) e pode desempenhar um importante papel na patogênese e desenvolvimento do CG (Ma etal., 2015; Wang et al., 2015c). Constatou-se também que o HOXD10 é sobrerregulado no carcinoma de células escamosas de pescoço e no câncer urotelial, onde promove a proliferação e invasão celular e pode ser um novo biomarcador para o carcinoma de mama ductal invasive (Sharpe et al., 2014; Vardhini etal., 2014; Heubach et al., 2015). Contudo, o HOXD10 também apresenta funções supressoras tumorais no carcinoma colan

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74/287 giocelular ao inativar a via RHOC/AKT/MAPK e induzir interrupção do ciclo celular na fase G1 (Yang et al., 2015a). Ao participar da via de sinalização miR-224/HOXD10/p-PAK4/MMP-9, o HOXD10 contribui para a regulação da migração e invasão celular, podendo portanto vir a servir como novo alvo biológico para tratamento do carcinoma hepatocelular (Li etal., 2014b).

[00107] O HOXD9 codifica o homeobox D9, que pertence à família de genes homeobox. Os genes homeobox codificam uma família altamente conservada de fatores de transcrição, que desempenha um importante papel na morfogênese em todos os organismos multicelulares. O gene HOXD9 é um dos vários genes HOXD de homeobox localizados na região cromossômica 2q31-2q37. Deleções que extirparam todo o cluster do gene HOXD ou a extremidade 5’ do cluster foram associadas com graves malformações de membros e genitália. Contudo, ainda não se sabe a função exata desse gene (RefSeq, 2002). Outros fatores influenciados pelo HOXD9 de forma dependente de ZEB1 são a transição de epitelial para mesenquimal, a migração e invasão de células cancerosas e metástase. A sobrexpressão de HOXD9 promove a proliferação independente de ancoragem e reduz a inibição induzida por contato. Outros efeitos do HOXD9 são a interrupção da proliferação e a diferenciação neuronial. A depleção de HOXD9 diminui a proliferação celular, a interrupção do ciclo celular e a indução de apoptose (Zha etal., 2012; Lawrenson et al., 2015b; Lv etal., 2015b; Tabuse et al., 2011). Em cânceres, o HOXD9 é sobrerregulado no carcinoma de pulmão de células escamosas e no carcinoma hepatocelular; expresso no carcinoma esofágico, astrocitomas e glioblastomas; e expresso de forma diferenciada no câncer de colo do útero (Bao et al., 2016; Gu et al., 2007; Lv etal., 2015b; Tabuse etal., 2011; Li etal., 2002; Liu etal., 2005). A sinalização por ácido retinoico e Wnt induz a expressão de HOXD9 (Ishikawa and Ito, 2009), e o gene pode estar envolvido na

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75/287 carcinogênese cervical (Lopez-Romero et al., 2015). A hipermetilação do HOXD9, que ocorre no colangiocarcinoma e em metástases cerebrais de melanoma (Marzese etal., 2014) está associada com redução da sobrevida livre de doença e da sobrevida geral associada a metástases linfonodais (Marzese etal., 2014; Sriraksa etal., 2013). HOXD9 pode estar envolvido na suscetibilidade do carcinoma mucinoso de ovário (Kelemen et al., 2015). HOXD9 pode ser um oncogene (Wu et al., 2013).

[00108] O HTR3A codifica um receptor de 5-hidroxitriptamina (serotonina) da superfamília dos receptores com canais iônicos modulados por ligantes, que produz as respostas despolarizantes rápidas que ocorrem após a ativação de neurônios (RefSeq, 2002). O HTR3A (também chamado 5-HT3) é desregulado em diversos tipos de câncer. Observa-se, por exemplo, regulação negativa em linfoma de células do manto, expressão diferencial em diversos tumores de células B e diminuição da expressão em linhagens de câncer de mama (Pai et al., 2009; Rinaldi etal., 2010; Ek etal., 2002).

[00109] O IGF2BP1, também denominado CRD-BP, codifica um membro da família das proteínas ligantes do mRNA-do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 2, que age ligando-se ao mRNA de determinados genes e regulando a sua tradução (RefSeq, 2002). Dois membros da família de proteínas ligantes de mRNA de IGF2, entre eles o IGF2BP1, foram descritos como proteínas oncofetais genuínas, cuja expressão é retomada em vários cânceres humanos e que pode atuar como um potente oncogene pós-transcricional, promovendo o crescimento, a resistência a fármacos e a metástase de tumores (Lederer et al., 2014). Descreveu-se que a expressão de IGF2BP1 correlaciona-se com mau prognóstico geral e metástase em diversos cânceres humanos (Lederer et al., 2014). Portanto, sugeriu-se que a IGF2BP1 é um potente biomarcador e possível alvo de tratamentos

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76/287 anticâncer (Lederer et al., 2014). Foi descrito que os membros da família IGF2BP apresentam estreita associação com metástase de câncer e expressão de fatores oncogênicos como KRAS, MYC e MDR1 (Bell et al., 2013). Demonstrou-se que a IGF2BP1 interage com o cMyc e é expresso na grande maioria de tumores de cólon e de mama, em sarcomas e em tumores benignos como fibroadenomas de mama e meningiomas (loannidis etal., 2003). O IGF2BP1 apresenta regulação positiva em carcinoma hepatocelular e no carcinoma de células basais (Noubissi etal., 2014; Zhang etal., 2015c). A regulação positiva do IGF2BP1 e de outros genes apresentou associação significativa com mau prognóstico pós-operatório no carcinoma hepatocelular (Zhang et al., 2015c). Demonstrou-se também que a IGF2BP1 é alvo dos supressores tumorais miR-9 no carcinoma hepatocelular e miR372 no carcinoma de células renais (Huang et al., 2015; Zhang et al., 2015c). A perda de IGF2BP1 no estrema cria um microambiente tumorigênico no cólon. Isso indica que o IGF2BP1 pode atuar como supressor de tumores em células do estrema colônico (Hamilton et al., 2015). O IGF2BP1 apresentou associação com tumores em estágio 4, redução da sobrevida dos pacientes e amplificação do gene MYCN no neuroblastoma; portanto, o IGF2BP1 pode ser um oncogene em potencial e um fator independente de prognóstico negativo no neuroblastoma (Bell etal., 2015). O IGF2BP1 foi descrito como alvo direto da sinalização por WNT/3-catenina, que regula a expressão e as atividades de GLI1 no desenvolvimento de carcinoma de células basais (Noubissi et al., 2014).

[00110] O IGF2BP3 codifica a proteína ligante 3 do mRNA do fator de crescimento semelhante à insulina, uma proteína oncofetal que reprime a tradução do fator de crescimento semelhante à insulina II (RefSeq, 2002). Vários estudos mostraram que o IGF2BP3 age em vários aspectos importantes da função celular, tais como polarização, migra

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77/287 ção, morfologia, metabolismo, proliferação e diferenciação. Estudos in vitro mostraram que o IGF2BP3 promove a proliferação, adesão e invasão de células tumorais. O IGF2BP3 também foi associada a cânceres agressivos e avançados (Bell et al., 2013; Gong et al., 2014): sua sobrexpressão foi descrita em diversos tipos de tumores e correlacionou-se com mau prognóstico, tumores em estágio avançado e metástase em, por exemplo, neuroblastoma, carcinoma colorretal, colangiocarcinoma intra-hepático, carcinoma hepatocelular, câncer de próstata e carcinoma de células renais (Bell etal., 2013; Findeis-Hosey and Xu, 2012; Hu et al., 2014; Szarvas et al., 2014; Jeng et al., 2009; Chen et al., 2011a; Chen et al., 2013; Hoffmann et al., 2008; Lin et al., 2013a; Yuan etal., 2009).

[00111] O IRF4 codifica o fator regulador de interferon 4, um fator transcricional que regula negativamente a sinalização pelo receptor semelhante a Toll (TLR, Toll-like receptor) em linfócitos. Esse mecanismo é essencial para ativação do sistema imune, seja inata ou adaptativa (RefSeq, 2002). O IRFA é considerado um dos principais reguladores de várias etapas da diferenciação de células linfoides, mieloides e dendríticas. O amadurecimento dessas células é caracterizado por sua variação dentro do sistema hematopoiético de forma dependente da linhagem da célula de seu estágio de maturação (Shaffer et al., 2009; Gualco et al., 2010). A participação do IRF4 é essencial na imunidade adaptativa, proliferação celular, diferenciação e tumorigênese da leucemia mieloide crônica, linfoma primário do sistema nervoso central, linfoma de células T, leucemia de células T induzida por HTLV1 em adultos e linfoma intravascular de grandes células B (Mamane et al., 2002; Orwat and Batalis, 2012; Bisig et al., 2012; Ponzoni et al., 2014; Manzella et al., 2016). Sabe-se também que o IRF4 é um oncogene que no mieloma múltiplo é regulado pelo promotor do homólogo zeste 2 (EZH2) (Alzrigat etal., 2016).

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78/287 [00112] O KLK14 codifica a peptidase relacionada à calicreína 14, que faz parte da subfamília das calicreínas das serina proteases. Essas peptidases exercem diversas funções fisiológicas, tais como regulação da pressão arterial e da descamação. Variações na expressão desse gene afetam a progressão de diversos tipos de câncer, incluindo de mama e de próstata. A proteína codificada é uma precursora, que sofre processamento proteolítico para gerar a enzima funcional. O gene é apenas um dos quinze membros da subfamília das calicreínas, que se localizam em um cluster no cromossomo 19 (RefSeq, 2002). Além disso, o KLK14 participa da tumorigênese e da proliferação celular por meio da fosforilação da ERK1/2/MAP quinase, induz sinalização por PAR-2 e pode estar envolvido na progressão, proliferação, invasão e angiogênese tumoral (Walker et al., 2014; Borgono et al., 2007; Chung etal., 2012a; Devetzi etal., 2013; Gratio etal., 2011; Sanchez et al., 2012; Zhang et al., 2012a). A subregulação de KLK14 pode ser induzida por miR-378/422a e pela sinalização de receptores de androgênio. A sinalização por receptores de androgênio induz sobrerregulação da expressão de KLK14 no câncer de mama (Paliouras and Diamandis, 2008b; Lose et al., 2012; Paliouras and Diamandis, 2007; Paliouras and Diamandis, 2008a; Samaan et al., 2014). A sobrexpressão de KLK14 também ocorre na leucemia linfocítica crônica, câncer de pulmão de células não pequenas, tumores de glândula salivar e câncer de ovário. No câncer de mama, o KLK14 apresenta expressão diferenciada (Planque et al., 2008b; Fritzsche et al., 2006; Hashem et al., 2010; Kontos et al., 2016; Papachristopoulou et al., 2013; Planque et al., 2008a). A expressão de KLK14 apresenta associação inversa com a sobrevida geral, pode ser usada como biomarcadora e preditora do risco de recorrência da doença e se correlaciona com o estádio clínico do tumor e com a presença de linfonodos positivos (Devetzi et al., 2013; Lose etal., 2012; Fritzsche etal., 2006; Kontos etal., 2016; Bor

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79/287 gono et al., 2003; Obiezu and Diamandis, 2005; Rabien et al., 2008; Rajapakse and Takahashi, 2007; Talieri etal., 2009).

[00113] O KLK8 codifica a peptidase 8 relacionada à calicreína, uma serina protease que talvez esteja envolvida em uma cascata proteolítica da pele e pode servir como biomarcador de câncer de ovário (RefSeq, 2002). Demonstrou-se que a expressão de KLK8 se correlaciona com a progressão do câncer de mama e do câncer colorretal (CaCR), carcinoma de endométrio e câncer de ovário, podendo representar um indicador de prognóstico independente em câncer colorretal, mamário ou ovariano (Liu et al., 2017; Jin etal., 2006; Kountourakis et al., 2009; Darling etal., 2008; Michaelidou etal., 2015; Borgono etal., 2006). O splicing alternativo do KLK8 transcreve um mRNA sem o éxon 4. Essa variante, ao contrário do KLK8, apresenta subregulação acentuada em células cancerosas (Angelopoulou and Karagiannis,

2010). Contudo, a variante com splicing alternativo KLK8-T4 pode, isoladamente ou associada com outros fatores, vir a ser um novo marcador independente de prognóstico favorável de câncer de pulmão (Planque et al., 2010). A expressão de KLK8 confere um prognóstico clínico favorável no câncer de pulmão de células não pequenas ao suprimir a invasividade das células tumorais (Sher etal., 2006).

[00114] O LAMA1 codifica a subunidade alfa 1 da laminina, uma glicoproteína da matriz extracelular com estrutura heterotrimérica que é um dos principais componentes da membrana basal (RefSeq, 2002). Diversos cânceres são acompanhados de desregulação de LAMA1, incluindo sobrerregulação em glioblastomas, hipermetilação no câncer colorretal, metilação anormal no câncer de mama e mutações frameshift no câncer gástrico (Scrideli et al., 2008; Choi et al., 2015; Simonova et al., 2015; Kim et al., 2011). O TGF-beta pode induzir expressão de LAMA1. Ao ser ativado, o LAMA1 promove a produção de colagenase IV, o que induz um fenótipo invasivo em células tumorais benig

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80/287 nas, mas não é suficiente para conferir potencial metastático (Chakrabarty etal., 2001; Royce etal., 1992).

[00115] O LAMC2 pertence à família das lamininas, que são glicoproteínas da matriz extracelular. As lamininas são o principal componente não colagenoso das membranas basais e foram implicadas em diversos processos biológicos, tais como adesão, diferenciação, migração, sinalização, brotamento de neuritos e metástases. A proteína codificada pelo LAMC2 é expressa em diversos tecidos fetais e se localiza especificamente em células epiteliais da pele, pulmão e rim (RefSeq, 2002). A expressão de LAMC2 é acentuada no carcinoma anaplásico da tireoide e está associada com progressão, migração e invasão tumoral mediada pela sinalização via EGFR (Garg et al., 2014). A expressão de LAMC2 foi preditora de prognóstico menos favorável em pacientes com câncer colorretal em estádio II (Kevans et al., 2011). Observou-se também associação significativa entre a expressão de LAMC2 e de três outros biomarcadores e a presença de metástases linfonodais em pacientes com carcinoma oral de células escamosas (Zanaruddin etal., 2013).

[00116] O LILRB4, também denominado ILT-3, codifica o receptor leucocitário semelhante à imunoglobulina B4, que pertence à família dos receptores leucocitários semelhantes à imunoglobulina (LIR, leukocyte immunoglobulin-like receptor). O gene se localiza em um cluster na região cromossômica 19q13.4. O receptor é expresso em células imunes, onde se liga a moléculas de MHC classe I em células apresentadoras de antígenos, realiza transdução de um sinal negativo que inibe a estimulação de uma resposta imune e pode participar da captura e apresentação de antígenos. Acredita-se que o receptor controle a resposta inflamatória e a toxicidade, ajudando assim a concentrar a resposta imune e limitar a autorreatividade (RefSeq, 2002). A sobrexpressão de LILRB4 pode contribuir para a tolerância das células

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81/287 dendríticas em casos de câncer. Também é possível que o LILRB4 esteja envolvido na imunossupressão. Sabe-se que o LILRB4 participa do escape de células cancerosas do sistema imune (Zhang et al., 2012b; Trojandt et al., 2016; Cortesini, 2007; de Goeje et al., 2015; Suciu-Foca et al., 2007). A expressão de LILRB4 é induzida por TNFalfa. A sobrexpressão de LILRB4 inibe a ativação de NF-kappaB, a transcrição de citocinas inflamatórias e as moléculas coestimulatórias. A ciclosporina induz sobrexpressão de LILRB4, o que diminui a citotoxicidade antitumoral das células natural killer (Si et al., 2012; Thorne et al., 2015; Vlad and Suciu-Foca, 2012). O gene LILRB4 é expresso na leucemia mieloide aguda monocítica e sobrexpresso no câncer de ovário e em células dendríticas em casos de câncer (Dobrowolska et al., 2013; Khan et al., 2012; Orsini et al., 2014). A expressão de LILRB4 está associada com redução da sobrevida no câncer de pulmão de células não pequenas e pode ser usada para determinar o prognóstico da leucemia linfocítica crônica (Colovai et al., 2007; de Goeje etal., 2015).

[00117] O LOXL2 codifica uma amina oxidase dependente de cobre conhecida como análogo da lisil oxidase 2. Essa enzima é essencial para a biogênese do tecido conjuntivo e catalisa a primeira etapa da formação de ligações cruzadas entre colágeno e elastina (RefSeq, 2002). Demonstrou-se que o LOXL2 participa da regulação de vias de sinalização intra e extracelulares. No compartimento extracelular, o LOXL2 remodela a matriz extracelular do microambiente tumoral; no compartimento intracelular, regula a transição de epitelial para mesenquimal (Cano etal., 2012; Moon etal., 2014). Do modo geral, o LOXL2 foi associado com progressão tumoral, com promoção de invasão de células cancerosas, metástase, angiogênese e transformação maligna de diversos tumores sólidos. Níveis altos de expressão de LOXL2 estão associados com mau prognóstico (Wu and Zhu, 2015). Demons

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82/287 trou-se também que o LOXL2 é sobrexpresso em câncer de cólon, câncer de esôfago de células escamosas, câncer de mama, câncer de células renais de células claras, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, câncer de pulmão do tipo escamoso e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço. Em diversos tipos de câncer, níveis altos de expressão de LOXL2 foram associados com aumento da recorrência, progressão ou metástase. Em diversas linhagens de células cancerosas, níveis altos de expressão de LOXL2 foram associados com aumento da mobilidade celular e da invasão, e o silenciamento produziu efeitos opostos (Xu et al., 2014a; Kim et al., 2014; Wong et al., 2014a; Hase et al., 2014; Lv et al., 2014; Torres et al., 2015). No câncer gástrico, demonstrou-se que o LOXL2 derivado de fibroblastos exercia potencial estimulatório sobre a motilidade de células de câncer gástrico. A expressão de LOXL2 em células do estroma pode servir como marcador prognóstico (Kasashima et al., 2014). Algumas famílias de micro-RNAs apresentam redução significativa em tecidos cancerosos, e foi demonstrado que o LOXL2 é um regulador direto desses micro-RNAs supressores de tumores (Fukumoto et al., 2016; Mizuno et al., 2016).

[00118] O EGF induz a translocação de LRRK1, pois é um parceiro de interação específico para o receptor de EGF (Ishikawa et al., 2012; Hanafusa and Matsumoto, 2011; Reyniers et al., 2014). O LRRK1 é um componente do complexo Grb2/Gab2/Shc1, interage com Arapl.e pode ser um dos componentes da sinalização por MAPK que ocorre em resposta ao estresse celular (Titz et al., 2010). O trióxido de arsênio, que é usado no tratamento da leucemia promielocítica aguda, sobrerregula o LRRK1 em células de câncer de mama (Wang et al.,

2011). A expressão de LRRK1 é extremamente específica para alelos no câncer de pâncreas familiar (Tan etal., 2008). O produto da LRRK1 é a quinase 1 rica em repetições de leucina, localizada no cromosso

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83/287 mo 15q26.3, e pertence à família de proteínas ROCO, um subgrupo recém-descoberto de GTPases semelhantes à Ras (RefSeq, 2002; Korr etal., 2006).

[00119] O LYPD1 codifica a proteína que contém o domínio LY6/PLAUR tipo 1 e se localiza no cromossomo 2q21.2 (RefSeq, 2002). A expressão de LYPD1 é exacerbada em metástases cerebrais de câncer de mama, em metástases em geral e é diferenciada no câncer de ovário. O produto do LYPD1 é um supressor tumoral que é subregulado em células CD133 e em células semelhantes a células-tronco de câncer derivadas de carcinossarcoma uterino (Burnett et al., 2015; Choijamts etal., 2011; Dat etal., 2012; Ge etal., 2015b; Lawrenson et al., 2015a)e atua como regulador negativo da proliferação celular (Salazar etal., 2011).

[00120] O MAGEA11 codifica o membro A11 da família MAGE, que é um dos membros da família de genes MAGEA. Os membros da família MAGEA codificam proteínas cujas sequências são 50% a 80% idênticas entre si. Os promotores e os primeiros éxons dos genes MAGEA apresentam variabilidade elevada. Isso sugere que a existência dessa família de genes permite que a mesma função seja expressa por meio de diferentes controles transcricionais. Os genes MAGEA se localizam em um cluster na região cromossômica Xq28 (RefSeq, 2002). A proteína MAGEA11 atua como antígeno germinativo de câncer, participa da progressão tumoral e se relaciona com mau prognóstico e sobrevida reduzida in silico. Além disso, o MAGEA11 participa da sinalização por PR-B, atua como corregulador do receptor de androgênio, interage diretamente com TIF2 e está envolvido na sinalização hipóxica. Seu knockdown diminui a expressão de HIF-1alfa (Aprelikova et al., 2009; Askew et al., 2009; James et al., 2013; Liu et al., 2011; Su etal., 2012; Wilson, 2010; Wilson, 2011). O MAGEA11 é sobrerregulado no carcinoma oral de células escamosas, no câncer de

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84/287 ovário resistente ao paclitaxel e durante a progressão do câncer de próstata (Duan etal., 2003; Wilson, 2010; Ge etal., 2015a; Karpf etal., 2009). Sua expressão está associada com hipometilação no câncer de próstata e no câncer de ovário do tipo epitelial (James etal., 2013).

[00121] O MAGEA12 codifica o membro A12 da família MAGE, um gene que apresenta relação estreita com outros genes agrupados no cromossomo X (RefSeq, 2002). A expressão de MAGEA12 é observada em 20,5% de pacientes com mieloma múltiplo (Andrade et al., 2008). Foi descrito surgimento de imunorreatividade sistêmica contra um epítopo crítico de MAGEA12 após regressão temporária de uma metástase única de melanoma induzida por uma vacina específica (Lally et al., 2001). A expressão de MAGEA12 é mais frequente que a de outros antigenos MAGE nas formas precoces de melanoma maligno (Gibbs etal., 2000).

[00122] O MAGEA3 codifica o membro A3 da família de antigenos associados ao melanoma. O MAGEA3 é bem conhecido com antígeno de câncer testicular (RefSeq, 2002; Pineda et al., 2015; De et al., 1994). Sabe-se há muito tempo que o MAGEA3 é usado em ensaios de vacinas terapêuticas de melanoma metastático. Foi observado que a imunização com peptídeos percutâneos realizada atualmente com MAGEA3 e quatro outros antigenos em pacientes com melanoma avançado contribui significativamente para a sobrevida geral em indivíduos que apresentam resposta completa em comparação com aqueles cuja resposta é incompleta (Coulie et al., 2002; Fujiyama et al., 2014). No CPCNP, a expressão de MAGEA3 foi observada com frequência. A expressão de MAGEA3 se correlacionou com um número mais elevado de necrose em amostras de tecido de CPCNP e mostrou efeitos de inibição da proliferação e invasão, assim como a promoção de apoptose em linhagens de câncer de pulmão. Entre pacientes com adenocarcinomas, a expressão de MAGEA3 foi associada com melhor

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85/287 sobrevida. A vacina anti-MAGEA3 de células inteiras vem sendo investigada em ensaios clínicos de fase III para tratamento de CPCNP e vem se mostrando bastante promissora (Perez et al., 2011; Reck, 2012; Hall etal., 2013; Grah etal., 2014; Liu etal., 2015b). A MAGEA3 e quatro outros genes são frequentemente expressos em CHC. Em pacientes com CHC, a expressão desses genes correlacionou-se com o número de células tumorais circulantes, tumores de alto grau e estágio avançado. As metástases hepáticas foram significativamente mais frequentes em casos nos quais as amostras tumorais expressaram MAGE3 que naqueles nos quais esse gene não foi expresso (Bahnassy et al., 2014; Hasegawa et al., 1998). Populações colaterais de células semelhantes a células-tronco de câncer isoladas de uma linhagem celular de câncer de bexiga mostraram expressão de MAGEA3 e outros antígenos de câncer testicular, e o mesmo ocorre em linhagens de câncer de pulmão, cólon ou mama. Em geral, as células-tronco de câncer são conhecidas por serem resistentes ao tratamento oncológico atual e causam recorrência e progressão do câncer após o tratamento. Em resumo, a MAGEA3 talvez possa servir como um novo alvo para abordagens imunoterápicas, especialmente no câncer de bexiga (Yamada et al., 2013; Yin et al., 2014). No carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, a expressão de MAGEA3 se correlacionou com melhora da sobrevida livre de doença (Zamuner et al., 2015). O MAGEA3 também pode ser usado como marcador prognóstico no câncer de ovário (Szajnik etal., 2013).

[00123] O MAGEA4, também conhecido como MAGE4, codifica um membro da família de genes MAGEA e se encontra no cromossomo Xq28 (RefSeq, 2002). O MAGEA4 foi descrito como antígeno de câncer testicular, que é expresso em uma pequena proporção dos seminomas clássicos (mas não em tumores testiculares de células germinativas não seminomatosos), em carcinoma de mama, em casos de

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86/287 linfoma de Hodgkin negativos para o virus Epstein-Barr, carcinoma de esôfago, carcinoma de pulmão, carcinoma de bexiga, carcinoma de cabeça e pescoço e câncer colorretal, carcinoma oral de células escamosas e carcinoma hepatocelular (Ries et al., 2005; Bode et al., 2014; Li et al., 2005; Ottaviani et al., 2006; Hennard et al., 2006; Chen et al., 2003). Constatou-se que o MAGEA4 é frequentemente sobrexpresso em melanomas primários da mucosa de cabeça e pescoço e, portanto, pode servir de alvo para imunoterapia baseada em antígenos do câncer testicular (Prasad etal., 2004). Observou-se que o MAGEA4 é expresso preferencialmente em linhagens de células semelhantes a células-tronco derivadas de células LHK2 de adenocarcinoma de pulmão, células SW480 de adenocarcinoma de cólon e células MCF7 de adenocarcinoma de mama (Yamada et al., 2013). A sobrexpressão de MAGEA4 em queratinócitos orais que sofreram transformação espontânea mostrou-se capaz de promover o crescimento ao evitar a interrupção do ciclo celular e inibindo a apoptose mediada pelo BAX e pelo CDKN1A, dois alvos transcricionais do p53 (Bhan et al., 2012). O MAGEA4 foi expresso mais frequentemente em pacientes infectados por hepatite C com cirrose e em carcinoma hepatocelular em estágio tardio que em pacientes com carcinoma hepatocelular em estágio precoce; portanto, a detecção de produtos de transcrição de MAGEA4 pode ajudar a prever o prognóstico (Hussein et al., 2012). O MAGEA4 é um dos vários antígenos de câncer de testículo expressos em câncer de pulmão e poderá vir a ser um candidato a imunoterapia polivalente em paciente com câncer de pulmão (Kim et al., 2012). A regulação positiva do MAGEA4 também foi descrita em carcinoma de esôfago e em carcinoma hepatocelular (Zhao et al., 2002; Wu et al., 2011). Um análogo de peptídeo derivado de MAGEA4 denominado p286-1Y2L9L foi apontado como um novo epítopo candidato apropriado para o desenvolvimento de vacinas contra o câncer de esôfago (Wu et al., 2011).

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87/287 [00124] O MAGEA6 codifica ο membro Α6 da família de antígenos associados ao melanoma. O MAGEA3 é bem conhecido com antígeno de câncer testicular (RefSeq, 2002; Pineda et al., 2015; De et al., 1994). A sobrexpressão de MAGEA6 é frequente em melanoma, mieloma avançado, rabdomiossarcoma pediátrico, sarcoma, câncer de pulmão, bexiga, próstata, mama e colorretal, carcinoma escamoso de cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas do esôfago e carcinoma escamoso oral (Ries etal., 2005; Hasegawa etal., 1998; Gibbs et al., 2000; Dalerba et al., 2001; Otte et al., 2001; van der Bruggen et al., 2002; Lin et al., 2004; Tanaka et al., 1997). Em pacientes com mieloma múltiplo, a expressão de MAGEA6 foi associada com sobrevida livre de progressão da doença mais curta. Ao contrário do carcinoma escamoso de cabeça e pescoço, a expressão de MAGEA6 se correlacionou com melhora da sobrevida livre de doença (van et al., 2011; Zamuner et al., 2015). O MAGEA6 foi um dos genes sobrexpressos em uma linhagem de câncer de ovário resistente ao paclitaxel. A transfecção de MAGEA6 também conferiu maior resistência medicamentosa a células sensíveis ao paclitaxel (Duan et al., 2003). O MAGEA6 pode ser usado como marcador prognóstico para câncer de ovário (Szajnik et al., 2013). Populações colaterais de células semelhantes a células-tronco de câncer isoladas de câncer de pulmão, cólon ou mama mostraram expressão de MAGEA6 e de outros antígenos de câncer testicular (Yamada etal., 2013).

[00125] O MAGEB2 é classificado como antígeno de câncer testicular, pois é expresso no testículo, na placenta e em uma fração substancial de tumores de vários tipos histológicos, entre eles o mieloma múltiplo e o carcinoma escamoso de cabeça e pescoço (Pattani et al., 2012; van etal., 2011).

[00126] O MELK codifica a quinase com zíper de leucina materna embrionária e se localiza no cromossomo 9p13.2 (RefSeq, 2002). Tra

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88/287 ta-se de uma proteína quinase dependente do ciclo celular, que pertence à família SNF1/AMPK de serina-treonina quinases e desempenha papel essencial em vários processos celulares, tais como proliferação, progressão do ciclo celular, mitose e montagem do spliceossomo. Mais recentemente, o MELK1 vem sendo considerado como oncogene e biomarcador sobrexpresso em diversas células-tronco de câncer (Du et al., 2014). A sobrexpressão de MELK é observada em vários cânceres (por exemplo, de cólon, gástrico, de mama, ovário, pâncreas, próstata e cérebro) e se correlaciona com mau prognóstico (Pickard et al., 2009; Kuner et al., 2013; Gu et al., 2013; Liu et al., 2015a). A inibição de MELK vem sendo estudada como estratégia terapêutica para diversos cânceres, incluindo câncer de mama, câncer de pulmão e câncer de próstata. O MELK-T1 inibe a atividade catalítica e interfere na estabilidade da proteína MELK, podendo sensibilizar tumores a agentes que danificam o DNA ou à radioterapia ao reduzir o limiar de danos ao DNA. O OTSSP167 é um inibidor de MELK e vem sendo avaliado em estudos clínicos de fase 1 (Chung et al., 2012b; Ganguly etal., 2014; Beke etal., 2015).

[00127] Ο MEX3A codifica um membro da família mex-3 de ligantes de RNA, que consiste em proteínas ligantes de RNA conservadas do ponto de vista evolutivo que são recrutadas para os corpos P e podem estar envolvidas em mecanismos regulatórios pós-transcricionais (Buchet-Poyau etal., 2007). Em tumores de Wilms com recorrência tardia, observa-se sobrexpressão e amplificação gênica de MEX3A (Krepischi et al., 2016). Por meio de um mecanismo pós-transcricional, ο MEX3A regula a CDX2 de modo a influenciar a diferenciação intestinal, a polaridade e a presença de propriedades de células-tronco, contribuindo assim para a homeostase e para a carcinogênese intestinal (Pereira et al., 2013).

[00128] A MMP-11, também denominada estromelisina 3, é mem

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89/287 bro do subgrupo da estromelisina e pertence à superfamília das MMPs, que foi detectada em células neoplásicas, células estromais e no microambiente adjacente. Em tumores, contudo, a MMP-11 exerce um efeito duplo. Por um lado, a MMP-11 promove o desenvolvimento tumoral ao inibir a apoptose e aumentar a migração e invasão de células cancerosas; por outro lado, a MMP-11 exerce ação antagônica ao desenvolvimento do câncer ao suprimir as metástases em modelos animais. A sobrexpressão de MMP-11 foi descoberta no soro de pacientes com câncer em comparação com um grupo controle normal e também em amostras de tecidos tumorais de câncer gástrico, câncer de mama e câncer de pâncreas (Zhang et al., 2016c). A MMP-11 apresentou sobrexpressão ao nível de mRNA, e ao nível de proteínas em tecidos de CaCR em relação a um controle de mucosa normal. Também em CaCR, a expressão de MMP-11 se correlacionou com metástase linfonodal, metástases distantes e estágio TNM (Tian et al.,

2015). A sobrexpressão de MMP-11 está associada com fenótipos tumorais agressivos e evolução clínica desfavorável em carcinomas uroteliais do trato urinário superior (CUTUS) e carcinomas uroteliais de bexiga (CUB), sugerindo que a proteína poderá vir a ser um novo marcador prognóstico e terapêutico (Li etal., 2016d).

[00129] A MMP12, também denominada MME, codifica um membro da família das metaloproteinases de matriz (MMP), que participam da quebra da matriz extracelular em processos fisiológicos (por exemplo, desenvolvimento embrionário, reprodução e remodelagem tecidual) ou patológicos (por exemplo, artrite e metástase) (RefSeq, 2002). A desregulação de MMP-12 foi observada em diversas entidades oncológicas. A sobrerregulação de MMP-12 está relacionada com invasão tumoral e metástase e é observada no câncer de pulmão, pele, pâncreas e estômago. Em contraste, a sobrexpressão de mRNA de MMP12 foi observada em câncer gástrico e colorretal e se correlaciona com me

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Ihor prognóstico (Zhang et al., 2007; Yang et al., 2001; Balaz et al., 2002; Zheng et al., 2013; Wen and Cai, 2014; Zhang et al., 2015f). O TNF-alfa e o EGF sobrerregulam ο MMP12 através das vias NFkappaB/MAPK e JNK/AP-1 (Yu etal., 2010; Yang etal., 2012).

[00130] Ο MYO3B codifica a miosina IIIB, um membro da classe das miosinas caracterizado por um domínio de quinase aminoterminal e que está presente em fotorreceptores (RefSeq, 2002). Em algumas linhagens HER2+, ο MYO3B funciona como antagonista ao tratamento com trastuzumabe (Lapin et al., 2014). Constatou-se também que o gene MYO3B apresenta polimorfismos associados a mudanças no Escore de Sintomas AUA após radioterapia do câncer de próstata (Kerns etal., 2013).

[00131] O NFE2L3 codifica o fator nuclear semelhante ao eritroide 2 tipo 3, um fator de transcrição da família com região básica chapéu-egola cap 'n' collar e zíper de leucina (RefSeq, 2002). Trabalhos recentes mostraram que a perde NFE2L3 predispõe camundongos ao linfoma. Também foram observados níveis mais elevados de NFE2L3 em células de câncer colorretal e expressão aberrante em linfoma de Hodgkin. Além disso, o NFE2L3 apresenta hipermetilação em tumores positivos para RE (Kuppers etal., 2003; Chevillard etal., 2011; Palma etal., 2012; Rauscher etal., 2015).

[00132] O NLRP2 (também denominado NALP2) codifica a proteína que contém domínio PYRIN tipo 2 da família NLR, participa da ativação da caspase 1 e pode formar complexos proteicos que ativam caspases pró-inflamatórias. O NLRP7 é parálogo do NLRP2 (RefSeq, 2002; Wu et al., 2010; Slim etal., 2012). O domínio PYRIN do NLRP2 inibe a proliferação celular e o crescimento tumoral do glioblastoma (Wu et al., 2010). Uma via dependente de ATM, NLRP2 e MDC1 pode desligar a resposta de transcrição do gene do ribossomo em resposta a quebras cromossômicas (Kruhlak et al., 2007). Mutações do NLRP2

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91/287 causam doenças humanas raras associadas ao 'imprinting', tais como mola hidatidiforme, síndrome de Beckwith-Wiedemann e diabetes melito transitório neonatal e familial (Aghajanova et al., 2015; Dias and Maher, 2013; Ulker et al., 2013). A ativação de NF-kappaB também é inibida pelo NLRP2 (Kinoshita et al., 2005; Kinoshita et al., 2006; Fontalba etal., 2007; Bruey etal., 2004).

[00133] O NLRP7 codifica a família NLR que contém domínio de pirina tipo 7, um membro das famílias NACHT, rico em repetição de leucinas e contenedora de PYD (NLRP), que talvez atue como regulador de feedback da secreção de interleucina-1 beta dependente de caspase 1 (RefSeq, 2002). A expressão de NLRP7 se correlaciona significativamente com a profundidade da invasão tumoral e mau prognóstico no câncer de endométrio, além de ser um dos genes cuja expressão é fortemente acentuada no carcinoma embrionário (Ohno et al., 2008; Skotheim et al., 2005). O gene NLRP7 talvez seja essencial para a proliferação celular na tumorigênese testicular e é um alvo terapêutico promissor para tumores testiculares de células germinativas (Okada etal., 2004).

[00134] O OVGP1 é uma glicoproteína específica do oviduto. O gene codifica uma glicoproteína grande e rica em carboidratos secretada pelas células epiteliais não ciliadas dos ovidutos e está associada com oócitos ovulados, blastomeres e regiões acrossômicas dos espermatozóides (RefSeq, 2002). Demonstrou-se que o ganho de OVGP1 está associado com o surgimento de hiperplasia e câncer do endométrio (Woo etal., 2004). Também foi descrito que o OVGP1 atua como marcador molecular de invasão na tumorigênese endometrial e marcador de diferenciação em vários tipos de câncer de ovário (Maines-Bandiera etal., 2010; Wang etal., 2009).

[00135] O PAGE2 codifica um membro da família de proteínas PAGE, que é expressa sobretudo em testículo (Brinkmann et al.,

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1998). O gene de câncer e testículo PAGE2 é sobrerregulado por desmetilação durante a diferenciação espontânea de células de câncer colorretal, o que promove a transição de epitelial para mesenquimal (TEM). Assim, a subregulação de PAGE2 foi demonstrada na TEM (Yilmaz-Ozcan etal., 2014). Um rastreamento pangenômico identificou o PAGE2 como possível regulador da sinalização por telômeros em células humanas (Lee etal., 2011).

[00136] O PNOC codifica a prepronociceptina, uma preproproteína que sofre processamento proteolítico e gera diversos produtos, tais como a nociceptina, nocistatina e orfanina FQ2 (OFQ2). A nociceptina, também conhecida como orfanina FQ, é um neuropeptídeo de 17 aminoácidos que se liga ao receptor de nociceptina e induz aumento da sensibilidade à dor e pode também contribuir para regular a temperatura corporal, o aprendizado, a memória e a fome. A nocistatina é outro produto da preproproteína codificada, que pode inibir os efeitos da nocicepção (RefSeq, 2002). A inibição da dor causada pelo câncer também inibe o crescimento tumoral e a metastização pulmonar. O PNOC participa do desenvolvimento de tolerância à morfina, do crescimento neuronial e dos danos celulares, viabilidade, inflamação e déficits de função imune (Caputi et al., 2013; Chan et al., 2012; Kirkova et al., 2009; Kuraishi, 2014; Stamer et al., 2011). Além disso, o PNOC é sobrerregulado no ganglioglioma, subregulado no câncer terminal e expresso em níveis elevados no plasma de pacientes com câncer hepatocelular (Chan et al., 2012; Stamer et al., 2011; Horvath et al., 2004; Spadaro et al., 2006; Szalay etal., 2004). O cebranopadol é um peptídeo derivado de PNOC com ação analgésica, que pode ser usado no tratamento do câncer ósseo, assim como a buprenorfina no tratamento do câncer de pulmão (Davis, 2012; Linz et al., 2014). Além disso, o PNOC participa da expressão de c-Fos (Gottlieb et al., 2007; Kazi et al., 2007).

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93/287 [00137] O PRAME codifica um antígeno que é expresso preferencialmente em melanomas humanos e atua como repressor do receptor de ácido retinoico, função que provavelmente confere uma vantagem proliferativa ao câncer (RefSeq, 2002). Demonstrou-se que o PRAME é sobrerregulado em linhagens celulares de mieloma múltiplo, carcinoma de células renais de células claras, câncer de mama, leucemia mieloide aguda, melanoma, leucemia mieloide crônica, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e osteossarcoma (Dannenmann etal., 2013; Yao etal., 2014; Zou etal., 2012; Szczepanski and Whiteside, 2013; Zhang et al., 2013; Beard etal., 2013; Abdelmalak et al., 2014; Qin et al., 2014). Além disso, o PRAME está associado com lipossarcoma mixoide e de células redondas (Hemminger et al., 2014) e com redução da sobrevida livre de progressão e da resposta à quimioterapia no linfoma difuso de grandes células B tratado com RCHOP, marcadores de mau prognóstico no carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, má resposta à quimioterapia no carcinoma urotelial e mau prognóstico e metástases pulmonares no osteossarcoma (Tan etal., 2012; Dyrskjot etal., 2012; Szczepanski etal., 2013; Mitsuhashi et al., 2014) e diminuição da recorrência, redução da mortalidade e sobrevida geral na leucemia linfoblástica aguda (Abdelmalak et al., 2014). Talvez o PRAME sirva como marcador prognóstico no linfoma difuso de grandes células B tratado com R-CHOP (Mitsuhashi etal., 2014).

[00138] O RAD54 codifica uma proteína da superfamília da helicase semelhante à DEAD e apresenta semelhanças com a RAD54 e RDH54 de Saccharomyces cerevisiae, duas proteínas que participam da recombinação homóloga e do reparo de DNA. Essa proteína se liga a DNA de dupla fita e exibe atividade de ATPase na presença de DNA. Esse gene é altamente sobrexpresso em testículos e baço. Isso sugere que ele exerce atividade na recombinação tanto na mitose como na

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94/287 meiose (RefSeq, 2002). Foram observadas mutações homozigotas de RAD54B em linfoma primário e câncer de cólon (Hiramoto et al.,

1999). O RAD54B contrabalança os efeitos desestabilizantes do genoma da ligação direta de RAD51 ao DNA de dupla fita em células tumorais humanas (Mason etal., 2015).

[00139] O RNF17 codifica a proteína de dedo de zinco 17, que é semelhante a um gene de camundongo que codifica uma proteína específica para testículos que contém um domínio digitiforme tipo RING. Foram descritas diversas transcrições variantes, que codificam isoformas diferentes da proteína (RefSeq, 2002). O RNF17 participa da produção de citocinas e da apoptose, promove a função de c-Myc (Jnawali etal., 2014; Lee et al., 2013; Yin et al., 1999; Yin etal., 2001), é sobrerregulada quando ocorre o knockdown de RHOXF1 (Seifi-Alan et al., 2014) e é expressa em câncer de fígado (Yoon et al., 2011), além de servir como marcador associado ao câncer (de Matos et al., 2015).

[00140] O SDK2 codifica a molécula de adesão sidekick tipo 2, que pertence à superfamília das imunoglobulinas e contém dois domínios de imunoglobulina e treze domínios de fibronectina tipo 3, que representam sítios de ligação de DNA, de heparina e da superfície celular (RefSeq, 2002). Foi demonstrado que o SDK2 guia terminais axonais a sinapses específicas durante o desenvolvimento dos neurônios e promove ação específica para a lâmina em dendritos retinianos na camada plexiforme interna (Kaufman et al., 2004; Yamagata and Sanes, 2012).

[00141] O SPDEF, também denominado PDEF, codifica o domínio pontiagudo SAM, que contém o fator de transcrição ETS e pertence à família de fatores de transcrição específicos para a transformação (ETS, E26 transformation-specific). A proteína é expressa em níveis elevados em células epiteliais de próstata, onde atua como transativa

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95/287 dor independente de androgênio do promotor do antígeno prostático específico (PSA) (RefSeq, 2002). A expressão de SPDEF é frequentemente perdida ou subregulada nas fases tardias da progressão tumoral, o que significa que esse gene participa da invasão de células tumorais e metástase. Em fases mais precoces da progressão tumoral, o SPDEF às vezes é sobrerregulado. A desregulação de SPDEF é descrita em diversos cânceres, incluindo de mama, próstata e colorretal (Moussa etal., 2009; Schaefer etal., 2010; Steffan and Koul, 2011). Outros efeitos do SPDEF são a indução de E-caderina, que suprime a invasão e a migração celular (Pal et al., 2013) e a interação com betacatenina. Esta última bloqueia a atividade transcricional, diminuindo assim os níveis de proteína dos oncogenes ciclina D1 e c-Myc (Noah etal., 2013).

[00142] O SPON1 codifica a espondina 1 e se localiza no cromossomo 11 p15.2 (RefSeq, 2002). A proteína SPON1 participa da proliferação, migração, invasão e metástase de células cancerosas, e também da sinalização por Fak e Src. Além disso, a SPON1 também participa da manutenção da IL-6 via sinalização MEKK/p38 MAPK/NFkappaB, o que pode contribuir para a sobrevida do neuroblastoma murino (Chang etal., 2015a; Cheng etal., 2009; Dai etal., 2015). O miR506 induz subregulação de SPON1 (Dai et al., 2015), que também é sobrexpresso em câncer de ovário (Davidson et al., 2011; Jiao et al., 2013; Pyle-Chenault et al., 2005). É possível que o SPON1 tenha potencial para determinar o prognóstico do câncer (Pagnotta et al., 2013).

[00143] O STAG3 codifica o antígeno estromal 3, que é expresso no núcleo e constitui uma subunidade do complexo de coesina, que regula a coesão das cromátides irmãs durante a divisão celular (RefSeq, 2002). Algumas pesquisas descreveram que um alelo comum do STAG3 está envolvido no desenvolvimento de câncer de ovário do tipo

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96/287 epitelial. Outros pesquisadores constataram que o STAG3 é eficaz em distinguir entre câncer de pulmão, doença pulmonar obstrutiva crônica e fibrose intersticial pulmonar. Outros ainda detectaram a expressão do gene STAG3 em células de linfoma com p53 mutante (Notaridou et al., 2011; Wielscher etal., 2015; Kalejs etal., 2006).

[00144] O TDRD5 codifica a proteína 5 que contém o domínio Tudor, que se localiza no cromossomo 2q21.2 (RefSeq, 2002). O câncer de mama pode apresentar sobrexpressão de TDRD5 (Jiang et al.,

2016) , e a metilação desse gene é modificada pelo tratamento com resveratrol no câncer de mama triplo-negativo (Medina-Aguilar et al.,

2017) . No câncer de tireoide, o gene TDRD5 é parte de uma sequência de homozigosidade associada a esse tumor (Thomsen et al.,

2016).

[00145] Ο TENM4 codifica a teneurina transmembrana 4, uma proteína expressa no sistema nervoso e em tecidos mesenquimais que atua como reguladora da condrogênese (Suzuki et al., 2014). O gene TENM4 é um dos quatro que mais apresentam mutações modificadoras de proteínas em linfomas primários do sistema nervoso central (Vater et al., 2015). A linhagem celular MD A-MB-175 contém uma translocação cromossômica que promove a fusão do TENM4 e dos receptores da família ErbB. Esses genes quiméricos também foram encontrados em neuroblastomas (Wang et al., 1999; Boeva et al., 2013).

[00146] O TMPRSS3 codifica a serina protease transmembrana 3, que pertence à família das serina proteases. A proteína codificada contém um domínio de serina protease, um domínio transmembrana, um domínio semelhante ao receptor de LDL e um domínio captante rico em cisteína. As serina proteases participam de diversos processos biológicos, e seu mau funcionamento pode causar doenças e patologias humanas. O gene TMPRSS3, que foi identificado por sua associa

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97/287 ção com surdez recessiva autossômica congênita e de início da infância, é expresso na cóclea fetal e em diversos outros tecidos. A proteína pode estar envolvida no desenvolvimento e manutenção do ouvido interno ou do conteúdo da perilinfa e da endolinfa. Além disso, o gene também apresentou associação com tumores e apresenta sobrexpressão em tumores de ovário (RefSeq, 2002). Além disso, o TMPRSS3 está envolvido na proliferação, invasão e migração celular; induz sinalização por ERK 1/2 (Zhang et al., 2016a); e afeta a expressão de Ecaderina, vimentina e Twist. O TMPRSS3 é subregulado pelo hexametileno bisacetamida (Zhang etal., 2016a; Zhang et al., 2004), sobrerregulado nos cânceres de mama, pâncreas e ovário e desregulado no câncer gástrico e no adenocarcinoma ductal pancreático (Rui et al., 2015; Zhang etal., 2016a; Zhang etal., 2004; Amsterdam et al., 2014; lacobuzio-Donahue et al., 2003; Luo et al., 2017; Underwood et al., 2000; Wallrapp et al., 2000). Foram observadas associações do TMPRS33 com estádio TNM, metástases linfonodais, metástases em órgãos distantes, diminuição da sobrevida livre de doença e mau prognóstico. Uma possível aplicação do TMPRS33 é como biomarcador de câncer. As mutações de TMPRSS3 estão associadas com risco de câncer, e o TMPRSS3 pode ser usado para detecção precoce do adenocarcinoma ductal pancreático (Rui etal., 2015; Amsterdam etal., 2014; Luo et al., 2017; Dorn et al., 2014; Luostari et al., 2014; Pelkonen et al., 2015; Sawasaki et al., 2004). Além disso, o TMPRSS3 apresenta hipometilação no câncer (Guerrero etal., 2012).

[00147] O VTCN1, também denominado B7-H4, codifica um membro da família das proteínas coestimulatórias B7, que é encontrado na superfície de células apresentadoras de antígenos e interage com ligantes ligados a receptores superficiais de células T (RefSeq, 2002). Demonstrou-se que o VTCN1 é sobrerregulado no câncer de pulmão, câncer colorretal, carcinoma hepatocelular, osteossarcoma, câncer de

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98/287 mama, câncer de colo do útero, carcinoma de células uroteliais, câncer gástrico, câncer de endométrio, câncer de tireoide e carcinoma de laringe (Klatka etal., 2013; Zhu etal., 2013; Vanderstraeten etal., 2014; Shi etal., 2014; Fan etal., 2014; Wang etal., 2014; Leong etal., 2015; Dong and Ma, 2015; Zhang etal., 2015a; Peng etal., 2015; Xu etal., 2015a). Foram observadas associações entre VTCN1 e sobrevida geral desfavorável e maior probabilidade de recorrência no carcinoma hepatocelular e sobrevida geral desfavorável no osteossarcoma, carcinoma de células uroteliais, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de colo do útero, melanoma e câncer de tireoide (Zhu et al., 2013; Seliger, 2014; Liu et al., 2014b; Chen et al., 2014; Fan et al., 2014; Dong and Ma, 2015; Zhang et al., 2015a). O carcinoma de células renais de células claras também está associado ao VTCN1 (Xu et al., 2014b). Demonstrou-se também que os níveis de expressão de VTCN1 apresentam correlação inversa com a sobrevida do paciente no câncer de ovário (Smith et al., 2014). Além disso, o VTCN1 pode servir como indicador prognóstico no carcinoma de células uroteliais e no câncer gástrico (Shi etal., 2014; Fan etal., 2014).

[00148] O WNT7A codifica o membro 7A da família Wnt, que é membro da família de genes WNT. Essas proteínas foram implicadas na oncogênese e em vários processos do desenvolvimento, tais como a regulação do destino celular e o desenvolvimento de padrões durante a embriogênese. O gene WNT7 participa do desenvolvimento do eixo ântero-posterior do trato reprodutor feminino e também tem participação essencial na formação do padrão da musculatura lisa e na manutenção da função do útero em adultos. Mutações do gene WNT7 estão associadas com as síndromes de focomelia de Fuhrmann, AlAwadi, Raas-Rothschild e Schinzel (RefSeq, 2002). O STAT4 induz o WNT7A, ativando assim fibroblastos associados ao câncer. Outras atividades do WNT7A são a potenciação da sinalização por receptores

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99/287 de TGF-beta, proliferação celular e migração e indutor proximal de senescência. O PG545 interage com o WNT7A, inibindo a proliferação celular. Além disso, o WNT7A suprime o crescimento tumoral, está envolvido na sinalização por Wnt/beta-catenina e regula o hsa-miR29b (Avasarala etal., 2013; Avgustinova et al., 2016; Bikkavilli etal., 2015; Borowicz et al., 2014; Jung et al., 2015; King et al., 2015; RamosSolano et al., 2015; Zhao et al., 2017). O WNT7A é regulado por miR15b e subregulado por DNMT1. A endossulfana interfere no WNT7A. O gene WNT7A é alvo da miR-199a-5p e da miR-195/497. A exposição crônica ao etanol subregula o WNT7A, mas esse efeito pode ser resgatado pelo tratamento com agonistas de PPAR-delta. O Dkk-1 afeta o WNT7A. A bilobalida promove a expressão de WNT7A (Kim et al., 2015a; Chandra et al., 2014; Ingaramo et al., 2016; Itesako et al., 2014; Liu etal., 2014a; MacLean etal., 2016; Mercer etal., 2014; Mercer et al., 2015; Xu et al., 2015b). O WNT7A é subregulado e hipermetilado no câncer de colo do útero, perdido no câncer de pulmão e sobrexpresso no câncer de endométrio (Ramos-Solano et al., 2015; Kim etal., 2015b; Liu etal., 2013). A expressão de WNT7A se correlaciona com mau prognóstico e evolução clínica desfavorável. A metilação do promotor do WNT7A se correlaciona com estádio tumoral avançado, metástases distantes e perda da E-caderina. A diminuição da expressão de WNT7A se correlaciona com diminuição da sobrevida geral no mesotelioma pleural maligno e pode ser usada para predição da quimiossensibilidade (Avgustinova et al., 2016; King et al., 2015; Kim et al., 2015b; Hirata et al., 2015). No câncer nasofaríngeo, o WNT7A pode atuar como supressor tumoral (Nawaz etal., 2015).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00149] A estimulação de uma resposta imune depende da presença de antígenos reconhecidos como estranhos pelo sistema imune do hospedeiro. A descoberta da existência de antígenos associados a

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100/287 tumores levantou a possibilidade de usar o sistema imune do hospedeiro para intervir no crescimento tumoral. Vários mecanismos para acionar tanto a imunidade humoral como a celular vêm sendo explorados para imunoterapia do câncer.

[00150] Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir especificamente células tumorais. O isolamento de células T de populações de células infiltrantes de tumor ou do sangue periférico sugere que tais células podem desempenhar um importante papel nas defesas imunes naturais contra o câncer. Em particular, as células T CD8-positivas que reconhecem moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), que normalmente possuem 8 a 10 resíduos de aminoácidos derivados de proteínas ou proteínas produtos de defeitos ribossômicos (DRIPS, defect ribosomal products) localizadas no citossol, desempenham um importante papel nessa resposta. As moléculas de MHC humanas também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA, human leucocyte antigen).

[00151] O termo resposta de célula T significa a proliferação específica e a ativação das funções efetoras induzidas por peptídeos in vitro ou in vivo. No caso de células T citotóxicas restritas por MHC classe I, as funções efetoras podem consistir em lise de células alvo que foram pulsadas com peptídeos ou com precursores de peptídeos ou que apresentam os peptídeos naturalmente; em secreção de citocinas induzida por peptídeos, preferivelmente interferon-gama, TNF-α ou IL-2; em secreção induzida por peptídeos de moléculas efetoras, preferivelmente granzimas ou perforinas; ou em desgranulação.

[00152] O termo peptídeo é aqui utilizado para designar uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. Preferivelmente, os peptídeos possuem 9

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101/287 aminoácidos de comprimento, mas podem ter apenas 8 aminoácidos de comprimento ou até 10, 11, 12 ou mais aminoácidos; os peptídeos de MHC classe II (variantes alongadas dos peptídeos da invenção) podem ter comprimento de até 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais aminoácidos de comprimento.

[00153] O termo peptídeo designa também sais de uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. Preferivelmente, tais sais são sais farmaceuticamente aceitáveis de peptídeos como, por exemplo, sais de cloreto ou acetato (trifluoracetato). Cabe notar que os sais dos peptídeos de acordo com a presente invenção diferem substancialmente dos peptídeos em seu estado in vivo, pois esses peptídeos não se apresentam como sais in vivo.

[00154] O termo peptídeo abrange também oligopeptídeo. O termo oligopeptídeo é aqui utilizado para designar uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. O comprimento do oligopeptídeo não é essencial para a invenção, conquanto o epítopo ou epítopos corretos sejam nele mantidos. Os oligopeptídeos tipicamente possuem mais de cerca de 15 e menos de cerca de 30 resíduos de aminoácidos de comprimento.

[00155] O termo polipeptídeo designa uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. O comprimento do polipeptídeo não é essencial para a invenção, conquanto os epítopos corretos sejam nele mantidos. Ao contrário dos termos peptídeo e oligopeptídeo, o termo polipeptídeo designa apenas moléculas com mais de cerca de 30 resíduos de aminoácidos.

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102/287 [00156] Um peptídeo, oligopeptídeo, proteína ou polinucleotídeo que codifica tal molécula é imunogênico (e, portanto, imunogênico no escopo da presente invenção) se for capaz de induzir uma resposta imune. No caso da presente invenção, a imunogenicidade é definida mais especificamente como a capacidade de induzir uma resposta de células T. Portanto, um imunogênio seria uma molécula capaz de induzir uma resposta imune e, no caso da presente invenção, uma molécula capaz de induzir uma resposta de células T. Em outro aspecto, o imunogênio pode ser o peptídeo, o complexo formado pelo peptídeo com MHC, o oligopeptídeo e/ou proteína empregada para produzir anticorpos específicos ou TCRs contra ele.

[00157] Um epítopo de células T classe I requer um peptídeo curto ligado a um receptor de MHC classe I formando um complexo ternário (cadeia alfa de MHC classe I, beta-2 microglobulina e peptídeo), que pode ser reconhecido por receptores de células T que se ligam com afinidade apropriada ao complexo de MHC com peptídeo. Os peptídeos que se ligam a moléculas de MHC classe I geralmente possuem 8-14 aminoácidos de comprimento, e mais tipicamente 9 aminoácidos de comprimento.

[00158] Em seres humanos, três lócus genéticos diferentes codificam as moléculas de MHC classe I. (As moléculas de MHC de seres humanos também são designadas antigenos leucocitários humanos (HLA, human leukocyte antigens)). O HLA-A, HLA-B e HLA-C. HLAA*01, HLA-A*02 e HLA-B*07 são exemplos de alelos de MHC classe I diferentes que podem ser expressos a partir desses lócus.

Tabela 6: Frequências de expressão (F) dos sorotipos de HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 e HLA-B*44. As frequências dos haplótipos (Gf) são derivadas de um estudo que usou dados de tipagem de HLA de um registro com mais de 6,5 milhões de doadores voluntários nos EUA (Gragert et al., 2013). A fre

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103/287 quência de haplótipos é a frequência de um alelo distinto em um cromossomo individual. Como as células mamíferas possuem um conjunto diploide de cromossomos, a frequência de ocorrência genotípica deste alelo será maior e pode ser calculada empregando-se o princípio de Hardy-Weinberg (F = 1 - (1 - Gf)²).

Alelo	População	Fenótipo calculado a partir da frequência de alelos (F)
A*02	Africano (N=28557)	32,3%
Caucasiano europeu (N=1242890)	49,3%
Japonês(N=24582)	42,7%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	46,1%
Sudeste Asiático (N=27978)	30,4%
A*01	Africano (N=28557)	10,2%
Caucasiano europeu (N=1242890)	30,2%
Japonês(N=24582)	1,8%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	14,0%
Sudeste Asiático (N=27978)	21,0%
A*03	Africano (N=28557)	14,8%
Caucasiano europeu (N=1242890)	26,4%
Japonês(N=24582)	1,8%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	14,4%
Sudeste Asiático (N=27978)	10,6%
A*24	Africano (N=28557)	2,0%

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Alelo	População	Fenótipo calculado a partir da frequência de alelos (F)
	Caucasiano europeu (N=1242890)	8,6%
Japonês(N=24582)	35,5%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	13,6%
Sudeste Asiático (N=27978)	16,9%
B*07	Africano (N=28557)	14,7%
Caucasiano europeu (N=1242890)	25,0%
Japonês(N=24582)	11,4%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	12,2%
Sudeste Asiático (N=27978)	10,4%
B*08	Africano (N=28557)	6,0%
Caucasiano europeu (N=1242890)	21,6%
Japonês(N=24582)	1,0%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	7,6%
Sudeste Asiático (N=27978)	6,2%
B*44	Africano (N=28557)	10,6%
Caucasiano europeu (N=1242890)	26,9%
Japonês(N=24582)	13,0%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	18,2%
Sudeste Asiático (N=27978)	13,1%
00159] Os peptídeos da invenção, preí	ferivelmente quando incluí-

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105/287 dos em uma vacina da invenção conforme aqui descrita, liga-se a A*02, A*01, A*03, A*24, B*07, B*08 ou B*44. Uma vacina também pode apresentar ligação a todos os peptídeos de MHC classe II. Portanto, a vacina da invenção pode ser empregada para tratar o câncer em pacientes positivos para A*02-, A*01-, A*03-, A*24-, B*07-, B*08- ou B*44, ao passo que nenhuma seleção de alótipos de MHC classe II é necessária porque esses peptídeos se ligam a todos os MHC classe II. [00160] Se os peptídeos A*02 da invenção forem combinados com peptídeos que se ligam a outro alelo (por exemplo, A*24), uma porcentagem maior de qualquer população de pacientes poderá ser tratada que com a abordagem de apenas um dos alelos de MHC classe I. Enquanto na maioria das populações menos de 50% dos pacientes podería ser tratada com qualquer desses alelos isoladamente, uma vacina compreendendo epítopos de HLA-A*02 e HLA-A*24 pode tratar pelo menos 60% dos pacientes em qualquer população relevante. Mais especificamente, os seguintes porcentuais de pacientes serão positivos para pelo menos um desses alelos em várias regiões: EUA 61%, Europa Ocidental 62%, China 75%, Coréia do Sul 77%, Japão 86% (porcentagens calculadas a partir de www.allelefrequencies.net).

Tabela 7: Cobertura de alelos de HLA em uma população caucasiana europeia (calculada segundo (Gragert et al., 2013)).

	cobertura (pelo menos um alelo A)	combinado com B*07	combinado com B*44	combinado com B07 e B44
A02/A01	70%	78%	78%	84%
A02/A03	68%	76%	76%	83%
A02/A24	61%	71%	71%	80%
A'01/A03	52%	64%	65%	75%
A01/A24	44%	58%	59%	71%
A03/A24	40%	55%	56%	69%

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106/287

	cobertura (pelo menos um alelo A)	combinado com B*07	combinado com B*44	combinado com B07 e B44
A02/A01/A*03	84%	88%	88%	91%
A02/A01/A*24	79%	84%	84%	89%
A02/A03/A*24	77%	82%	83%	88%
A01/A03/A*24	63%	72%	73%	81%
A02/A01 /A03/A24	90%	92%	93%	95%

00161] Em uma modalidade preferida, o termo sequência de nucleotídeos refere-se a um heteropolímero de desoxirribonucleotídeos.

[00162] A sequência de nucleotídeos que codifica um determinado peptídeo, oligopeptídeo ou polipeptídeo pode ocorrer naturalmente ou ser construída por meios sintéticos. Em geral, os segmentos de DNA que codificam peptídeos, polipeptídeos e proteínas desta invenção são construídos a partir de fragmentos de cDNA e ligantes oligonucleotídeos curtos ou de uma série de oligonucleotídeos de modo a fornecer um gene sintético capaz de ser expresso em uma unidade de transcrição recombinante que compreende elementos regulatórios derivados de um operon microbiano ou viral.

[00163] Conforme aqui utilizado, o termo nucleotídeo codificador [ou que codifica] um peptídeo refere-se a uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo, incluindo códons de início e parada artificiais (produzidos pelo homem) compatíveis com o sistema biológico que será expresso, por exemplo, por uma célula dendrítica ou por outro sistema celular útil para a produção de TCRs.

[00164] Conforme aqui utilizadas, referências a uma sequência de ácido nucleico abrangem tanto ácidos nucleicos de fita única como de dupla fita. Portanto, por exemplo, para DNA, a sequência específica refere-se, salvo indicação em contrário no contexto, ao DNA de fita única de tal sequência, à forma dúplex de tal sequência com o respectivo complemento (DNA de dupla fita) e ao complemento de tal sePetição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 125/538

107/287 quência.

[00165] O termo região codificadora refere-se à porção do gene que, natural ou normalmente, codifica o produto expresso pelo gene em questão em seu ambiente genômico natural, isto é, a região codificadora in vivo do produto de expressão nativo do gene em questão.

[00166] A região codificadora pode ser derivada de um gene não mutante (normal), mutante ou alterado e pode até mesmo ser derivada de uma sequência de DNA ou gene sintetizado inteiramente em laboratório empregando métodos bem conhecidos dos versados na técnica de síntese de DNA.

[00167] O termo produto de expressão significa o polipeptídeo ou proteína que é o produto de tradução natural do gene e de quaisquer sequências de ácidos nucleicos que produzam codificação equivalente resultantes da natureza degenerada do código genético produzindo o(s) mesmo(s) aminoácido(s).

[00168] O termo fragmento significa, quando se refere a uma sequência codificante, uma porção do DNA que compreende menos que a região codificadora completa, cujo produto de expressão retém basicamente a mesma função ou atividade biológica que o produto de expressão da região codificante completa.

[00169] O termo segmento de DNA refere-se a um polímero de DNA, seja como fragmento separado ou como componente de uma estrutura de DNA maior, derivado do DNA isolado pelo menos uma vez de forma basicamente pura, isto é, livre de materiais contaminantes endógenos e em quantidade ou concentração suficientes para permitir identificação, manipulação e recuperação do segmento e das sequências de nucleotídeos componentes empregando-se métodos bioquímicos padrão como, por exemplo, um vetor de clonagem. Tais segmentos são fornecidos como um frame (matriz) de leitura aberto sem interrupções de sequências internas não traduzidas, denomina

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108/287 das introns, que geralmente estão presentes em genes eucarióticos. As sequências de DNA não traduzido podem estar presentes em posição distai à matriz de leitura aberta, onde a mesma não interfere na manipulação nem na expressão das regiões codificantes.

[00170] O termo iniciador significa uma sequência curta de ácidos nucleicos que pode ser pareada com uma fita de DNA e fornece uma terminação 3ΌΗ livre na qual a DNA polimerase inicia a síntese de uma cadeia de desoxirribonucleotídeos.

[00171] O termo promotor significa uma região do DNA envolvida em ligar a RNA polimerase para iniciar a transcrição.

[00172] O termo isolado significa que o material foi retirado de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente original em que ocorria naturalmente). Por exemplo, polinucleotídeos que ocorrem na natureza ou que estão presentes em um animal vivo não são considerados isolados, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo é considerado isolado quando é separado de alguns ou de todos os materiais que com ele coexistem em um sistema natural. Tais polinucleotídeos podem formar parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser parte de uma composição e mesmo assim ser isolados, mesmo que tal vetor ou composição não seja parte de seu ambiente natural.

[00173] Os polinucleotídeos e os polipeptídeos recombinantes ou imunogênicos revelados de acordo com a presente invenção também podem estar em forma purificada. O termo purificado não requer pureza absoluta; é uma definição relativa e abrange tanto preparações altamente purificadas como preparações apenas parcialmente purificadas, conforme tais termos são compreendidos pelos versados na técnica relevante. Por exemplo, clones individuais isolados de uma biblioteca de cDNA foram purificados empregando-se técnicas convencionais para se obter homogeneidade eletroforética. A purificação de

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109/287 um material inicial ou de material natural em pelo menos uma ordem de grandeza, e preferivelmente em duas ou três ordens, e mais preferivelmente em quatro a cinco ordens de magnitude é expressamente contemplada. Outrossim, o polipeptídeo reivindicado que possui pureza de, preferivelmente 99,999% ou pelo menos 99,99% ou 99,9% e, ainda desejável mente, 99% por peso ou mais, fica expressamente incluído.

[00174] Os ácidos nucleicos e produtos da expressão de polipeptídeos revelados de acordo com a presente invenção, assim com os vetores de expressão que contêm tais ácidos nucleicos e/ou tais polipeptídeos, podem estar presentes em forma enriquecida. Conforme aqui utilizado, o termo enriquecido significa que a concentração do material é de pelo menos 2, 5, 10, 100 ou 1000 vezes sua concentração natural (por exemplo), vantajosamente 0,01% por peso e preferivelmente pelo menos 0,1% por peso. Preparações enriquecidas de cerca de 0,5%, 1%, 5%, 10% e 20% por peso também são contempladas. As sequências, produtos de construção, vetores, clones e outros materiais que compreendem a presente invenção podem, vantajosamente, estar em forma enriquecida ou isolada. O termo fragmento ativo significa um fragmento, normalmente de um peptídeo, polipeptídeo ou sequência de ácido nucleico, que gera uma resposta imune (isto é, possui atividade imunogênica) quando administrado — isolado ou, opcionalmente, com um adjuvante apropriado ou em um vetor — a um animal como um mamífero (por exemplo, coelho, camundongo) ou a um ser humano. A resposta imune assume a forma de estimulação da resposta de células T em um animal receptor como, por exemplo, um ser humano. Alternativamente, o fragmento ativo também pode ser empregado para induzir uma resposta de células T in vitro.

[00175] Conforme aqui utilizados, os termos porção, segmento e fragmento referem-se, quando usados em relação a peptídeos, a

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110/287 uma sequência contínua de resíduos, como resíduos de aminoácidos, que forma um subconjunto de uma sequência maior. Por exemplo, se um polipeptídeo for sujeito a tratamento com qualquer uma das endopeptidases comuns como a tripsina ou a quimotripsina, os oligopeptídeos resultantes de tal tratamento representariam porções, segmentos ou fragmentos do polipeptídeo inicial. Quando utilizados em relação a polinucleotídeos, esses termos referem-se a produtos produzidos pelo tratamento dos referidos nucleotídeos com qualquer uma das endonucleases.

[00176] De acordo com a presente invenção, os termos percentual de identidade e porcentagem de idênticos significam, quando usados em referência a uma sequência, que uma sequência é comparada com uma sequência reivindicada ou descrita após alinhamento da sequência a ser comparada (Sequência de Comparação) com a sequência descrita ou reivindicada (Sequência de Referência). O percentual de identidade é então determinado de acordo com a seguinte fórmula:

Percentual de identidade = 100 [1 - (C/R)] [00177] Onde C é o número de diferenças entre a Sequência de Referência e a Sequência de Comparação ao longo do alinhamento entre a Sequência de Referência e a Sequência de Comparação, onde:

(i) Cada base ou aminoácido da Sequência de Referência que não possui uma base ou aminoácido alinhado correspondente na Sequência de Comparação; e (ii) Cada lacuna na sequência; e (iii) Cada base ou aminoácido da Sequência de Referência diferente da base ou aminoácido alinhado correspondente na Sequência de Comparação constitui uma diferença; e (iiii) O alinhamento deve começar na posição 1 das se

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111/287 quências alinhadas;

e Réo número de bases ou aminoácidos na Sequência de Referência ao longo do comprimento do alinhamento com a Sequência de Comparação, sendo que quaisquer lacunas criadas na Sequência de Referência também são consideradas como uma base ou aminoácido.

[00178] Se existir um alinhamento entre a Sequência de Comparação e a Sequência de Referência para o qual o porcentual de identidade calculado acima for igual ou superior a um porcentual de identidade mínimo especificado, a Sequência de Comparação possui o porcentual de identidade mínimo especificado em relação à Sequência de Referência, mesmo que possa haver alinhamentos em que o porcentual de identidade calculado acima seja inferior à identidade porcentual especificada.

[00179] Conforme mencionado anteriormente, a presente invenção refere-se, portanto, a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q772 ou a uma variante dos mesmos com 88% de homologia com SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 ou uma variante da mesma que induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo. Os peptídeos da presente invenção possuem capacidade de ligação com uma das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC) de classe I ou com versões alongadas dos referidos peptídeos a moléculas de classe II.

[00180] Na presente invenção, o termo homólogo refere-se ao grau de identidade (ver o conceito de percentual de identidade descrito anteriormente) entre duas sequências de aminoácidos, isto é, sequências de peptídeos ou de polipeptídeos. A homologia mencionada anteriormente é determinada comparando-se duas sequências alinhadas sob condições ideais com as sequências a serem comparadas. Tal homologia entre sequências pode ser calculada criando-se um alinha

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112/287 mento utilizando-se, por exemplo, o algoritmo ClustaIW. Alguns softwares de análise de sequências comumente disponíveis, mais especificamente o Vector NTI, o GENETYX e outras ferramentas de análise, são disponibilizados por bancos de dados abertos ao público.

[00181] Os versados na técnica poderão avaliar se as células T induzidas por um peptídeo variante de um peptídeo específico podem apresentar reação cruzada com o peptídeo original (Appay etal., 2006; Colombetti etal., 2006; Fong etal., 2001; Zaremba etal., 1997).

[00182] Por variante de uma determinada sequência de aminoácidos, os inventores entendem que as cadeias laterais de, por exemplo, um ou dois resíduos de aminoácidos são alterados (por exemplo, substituindo-os pela cadeia lateral de outro resíduo de aminoácido encontrado na natureza ou alguma outra cadeia lateral) de modo que o peptídeo continue sendo capaz de se ligar a uma molécula de HLA basicamente da mesma maneira que um peptídeo com a mesma sequência de aminoácidos que as SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772. Por exemplo, um peptídeo pode ser modificado de modo a pelo menos manter, ou até melhorar, sua capacidade de interagir com e se ligar ao sulco de ligação de uma molécula de MHC apropriada, tal como HLA-A*02 ou -DR, e dessa forma pelo menos manter, ou até melhorar, a capacidade de ligar-se ao TCR de células T ativadas.

[00183] Em seguida, essas células T ativadas podem participar de reação cruzada com outras células e destruir células que expressam um polipeptídeo que contém a sequência natural de aminoácidos do peptídeo cognato, conforme definido nos aspectos da invenção. Como se pode depreender da literatura e de bancos de dados científicos (Rammensee etal., 1999; Godkin etal., 1997), determinadas posições em peptídeos ligantes de HLA são geralmente resíduos de ancoragem que formam uma sequência central que se fixa ao motivo ligante do receptor de HLA, que é definido por propriedades de polaridade, ele

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113/287 trofísicas, hidrofóbicas e espaciais das cadeias polipeptídicas que constituem o sulco de ligação. Assim, os versados na técnica saberão modificar as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ N^Q1 a SEQ N^Q 772 mantendo os resíduos de ancoragem conhecidos e serão capazes de determinar se tais variantes preservam sua capacidade de ligação com moléculas de MHC classe I ou classe II. As variantes da presente invenção preservam a capacidade de ligação ao TCR de células T ativadas, que podem participar posteriormente de reações cruzadas e destruir células que expressam um polipeptídeo contendo a sequência natural de aminoácidos do peptídeo cognato, conforme definido nos aspectos da invenção.

[00184] Os peptídeos originais (não modificados) aqui revelados podem ser modificados por substituição de um ou mais resíduos em sítios diferentes, e possivelmente seletivos, dentro da cadeia peptídica, salvo indicação em contrário. Preferivelmente, essas substituições se encontram no final da cadeia de aminoácidos. Tais substituições podem ser de natureza conservadora, substituindo-se por exemplo, um aminoácido por outro de estrutura e características semelhantes, como, por exemplo, substituir um aminoácido hidrofóbico por outro aminoácido hidrofóbico. Ainda mais conservador seria substituir aminoácidos de tamanho e natureza química semelhantes ou idênticos, como substituir leucina por isoleucina. Em estudos de variações de sequências em famílias de proteínas homólogas que ocorrem naturalmente, determinadas substituições de aminoácidos são toleradas com muito mais frequência que outras, e estas frequentemente mostram correlação com semelhanças de tamanho, carga, polaridade e hidrofobicidade entre o aminoácido original e seu substituto, sendo esta a base para definição de substituições conservadoras.

[00185] As substituições conservadoras são aqui definidas como trocas dentro de um dos seguintes grupos: Grupo 1: Resíduos peque

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114/287 nos alifáticos, apoiares ou ligeiramente polares (Ala, Ser, Tre, Pro, Gli); Grupo 2: Resíduos polares com carga negativa e as respectivas amidas (Asp, Asn, Glu, Gin); Grupo 3: Resíduos polares com carga positiva (His, Arg, Lis); Grupo 4: Resíduos alifáticos grandes e apoiares (Met, Leu, lie, Vai, Cis); e Grupo 5: resíduos aromáticos grandes (Fen, Tir, Trp).

[00186] Algumas substituições menos conservadoras podem consistir em substituição de um aminoácido por outro com características semelhantes mas algo diferente em tamanho, como substituição de uma alanina por um resíduo de isoleucina. Substituições pouquíssimo conservadoras podem consistir em substituir um aminoácido ácido por outro polar ou até mesmo por outro básico. Entretanto, tais substituições radicais não podem ser descartadas como possivelmente ineficazes, pois seus efeitos químicos não são totalmente previsíveis e as substituições radicais podem produzir efeitos fortuitos que não podem ser previstos de outra forma a partir de princípios químicos simples.

[00187] Evidentemente, tais substituições podem envolver outras estruturas que não os L-aminoácidos comuns. Portanto, os Daminoácidos podem ser substituídos pelos L-aminoácidos comumente encontrados em peptídeos antigênicos da invenção, não deixando de ser contemplados pela presente revelação. Além disso, aminoácidos não padrão (isto é, outros aminoácidos que não os 20 aminoácidos proteinogênicos) também podem ser empregados para finalidades de substituição de modo a produzir imunogênios e polipeptídeos imunogênicos de acordo com a presente invenção.

[00188] Se for constatado que substituições em mais de uma posição produzem peptídeos com atividade antigênica substancialmente equivalente ou maior conforme definido a seguir, combinações dessas substituições serão testadas para determinar se as substituições combinadas produzem efeitos aditivos ou sinergísticos sobre a antigenici

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115/287 dade do peptideo. No máximo, não mais de quatro posições no peptídeo devem ser substituídas simultaneamente.

[00189] Um peptídeo que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos aqui indicada pode possuir um ou dois aminoácidos não âncoras (o motivo âncora é descrito mais detalhadamente a seguir), que são trocados sem que a capacidade de ligação a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II seja modificada significativamente ou prejudicada em comparação com o peptídeo não modificado. Em outra modalidade, que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos aqui indicada, um ou dois aminoácidos podem ser trocados por elementos de troca conservadores (ver adiante) sem que a capacidade de ligação a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II seja modificada significativamente ou prejudicada em comparação com o peptídeo não modificado.

[00190] Os resíduos de aminoácidos que não contribuem significativamente para as interações com o receptor de células T podem ser modificados substituindo-se com outro aminoácido, cuja incorporação não afeta significativamente a reatividade de células T nem elimina a ligação ao MHC relevante. Assim, considerando-se a condição acima, o peptídeo da invenção pode ser qualquer peptídeo (termo sob o qual os inventores incluem oligopeptídeo e polipeptídeo), incluindo sequência de aminoácidos ou uma porção ou variante das mesmas conforme apresentadas.

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116/287

Tabela 8: Variantes e motivos dos peptideos de acordo com as SEQs

N^Q3, 225, 13, 17, 84, 108, 113, 114, 147, 36, 51, 172, 54 e 57

Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ N^Q 3	A	L	I	Y	N	L	V	G	I
Variante									V
								L
								A
	M							V
	M
	M							L
	M							A
	A							V
	A
	A							L
	A							A
	V							V
	V
	V							L
	V							A
	T							V
	T
	T							L
	T							A
	Q							V
	Q
	Q							L
	Q							A
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ N^Q 225	S	V	F	A	H	P	R	K	L
Variante		L							V
	L							I
	L
	L							A

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		M							V
	M							I
	M
	M							A
	A							V
	A							I
	A
	A							A
								V
								I
								A
	T							V
	T							I
	T
	T							A
	Q							V
	Q							I
	Q
	Q							A
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ N^Q 13	V	Y	T	F	L	S	S	T	L
Variante									I
								F
	F							I
	F
	F							F
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ N^Q17	R	F	T	T	M	L	S	T	F
Variante		Y							I
	Y							L
	Y
								I
								L

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Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
SEQ N^Q 84	K	L	Q	P	A	Q	T	A	A	K
Variante										Y
									R
									F
	I
	I								Y
	I								R
	I								F
	M
	M								Y
	M								R
	M								F
	V
	V								Y
	V								R
	V								F
	T
	T								Y
	T								R
	T								F
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
SEQ N^Q108	V	L	Y	P	V	P	L	E	S	Y
Variante										K
									R
									F
	I								K
	I
	I								R
	I								F
	M								K
	M
	M								R

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		M								F
	V								K
	V
	V								R
	V								F
	T								K
	T
	T								R
	T								F
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ N^Q113	Q	L	D	S	N	R	L	T	Y
Variante		S
	S							A
	S	E
	S	E						A
	T
	T							A
	T	E
	T	E						A
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
SEQ N^Q114	V	M	E	Q	S	A	G	I	M	Y
Variante		S	D
	S	D							A
	S
	S								A
	T	D
	T	D							A
	T
	T								A
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
SEQ N^Q 147	A	P	R	W	F	P	Q	P	T	V	V
Variante											L
										F

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											M
										A
										I
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ N^Q 36	A	P	A	A	W	L	R	S	A
Variante									L
								F
								V
								M
								I
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ N^Q 51	S	L	R	L	K	N	V	Q	L
Variante			K
		K						V
		K						I
		K						M
		K						F
		K		R
		K		R				V
		K		R				I
		K		R				M
		K		R				F
		K		H
		K		H				V
		K		H				I
		K		H				M
		K		H				F
								V
								I
								M
								F
				R
				R				V

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					R				I
				R				M
				R				F
				H
				H				V
				H				I
				H				M
				H				F
		L
		L						V
		L						I
		L						M
		L						F
		L		R
		L		R				V
		L		R				I
		L		R				M
		L		R				F
		L		H
		L		H				V
		L		H				I
		L		H				M
		L		H				F
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ N^Q 172	K	L	K	E	R	N	R	E	L
Variante					K
				K				V
				K				I
				K				M
				K				F
								V
								I
								M

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			L		H				I
		L		H				M
		L		H				F
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
SEQ N^Q 54	A	E	I	Τ	I	Τ	Τ	Q	Τ	G	Y
Variante											F
										W
										L
	D									F
	D									W
	D
	D									L
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ N^Q 57	Q	E	S	D	L	R	L	F	L
Variante									F
								W
								Y
	D							F
	D							W
	D							Y
	D

[00191] Peptídeos mais longos (alongados) também podem ser apropriados. Também é possível que epítopos de MHC classe I, embora normalmente tenham de 8 a 11 aminoácidos de comprimento, sejam gerados pelo processamento de peptídeos mais longos ou por proteínas que incluam o epítopo real. É preferível que os resíduos que flanqueiam o epítopo sejam resíduos que não afetem significativamente a divagem proteolítica necessária para expor o epítopo durante o processamento.

[00192] Os peptídeos da invenção podem ser alongados em até quatro aminoácidos, ou seja, podem-se adicionar 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos a qualquer extremidade em qualquer combinação entre 4:0 e

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0:4. A Tabela 9 apresenta combinações de alongamentos de acordo com a invenção.

Tabela 9: Algumas combinações de peptídeos alongados da presente invenção

C terminal	N terminal
4	0
3	0 ou 1
2	0, 1 ou 2
1	0, 1,2 ou 3
0	0, 1,2, 3 ou 4
N terminal	C terminal
4	0
3	0 ou 1
2	0, 1 ou 2
1	0, 1,2 ou 3
0	0, 1,2, 3 ou 4

[00193] Os aminoácidos do alongamento/extensão podem ser os peptídeos da sequência original da proteína ou quaisquer outros aminoácidos. O alongamento pode ser utilizado para tornar os peptídeos mais estáveis ou mais solúveis.

[00194] Portanto, os epitopes da presente invenção podem ser idênticos a epitopes que ocorrem natural mente e que são associados a ou específicos para tumores, ou podem incluir epitopes que diferem em no máximo quatro resíduos do peptídeo de referência, conquanto apresentem atividade antigênica substancialmente idêntica.

[00195] Em uma modalidade alternativa, o peptídeo é alongado em mais de quatro aminoácidos em um ou ambos os lados, preferivelmente até atingir um comprimento total de até 30 aminoácidos. Assim, podem-se criar peptídeos ligantes de MHC classe II. A ligação ao MHC classe II pode ser testada por métodos conhecidos na técnica.

[00196] Dessa forma, a presente invenção fornece peptídeos e va

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125/287 riantes de epitopes de MHC classe I nas quais o peptídeo ou variante tem comprimento total entre 8 e 100, preferivelmente entre 8 e 30, mais preferivelmente entre 8 e 14, especificamente, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 aminoácidos; no caso de peptídeos ligantes de classe II prolongados o comprimento também pode ser de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos.

[00197] Evidentemente, o peptídeo ou variante de acordo com a presente invenção terá a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I ou II. A ligação de um peptídeo ou variante a um complexo de MHC pode ser testada por métodos conhecidos na técnica.

[00198] Preferivelmente, quando células T específicas para um peptídeo de acordo com a presente invenção são testadas contra os peptídeos substituídos, a concentração de peptídeos em que os peptídeos substituídos produzem metade do aumento máximo de lise em relação aos níveis basais é de não mais que cerca de 1 mM, preferivelmente não mais que cerca de 1 μΜ, mais preferivelmente não mais que cerca de 1 nM e ainda mais preferivelmente não mais que cerca de 100 pM e, mais preferivelmente, não mais que 10 pM. É preferível também que o peptídeo substituído possa ser reconhecido por células T citotóxicas de mais de um indivíduo, de pelo menos dois e, mais preferivelmente, de três indivíduos.

[00199] Em uma modalidade especialmente preferida da invenção, o(s) peptídeo(s) consiste(m) basicamente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ N^Q1 a SEQ N^Q 772.

[00200] Consiste essencialmente em significa que um peptídeo de acordo com a presente invenção contém, além da sequência de acordo com qualquer sequência de SEQ N^Q 1 a SEQ ID N^Q 772 ou variante das mesmas, outros prolongamentos formados por segmentos aminoácidos N- e/ou C-terminais, que não necessariamente formam parte do

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126/287 peptídeo que funciona como epítopo para epítopos que possuem moléculas de MHC.

[00201] Contudo, esses segmentos podem ser importantes para tornar eficiente a introdução do peptídeo de acordo com a presente invenção em células. Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo é parte de uma proteína de fusão que compreende, por exemplo, os 80 aminoácidos N-terminais da cadeia invariante associada ao antígeno HLA-DR (p33, no seguinte li) conforme derivado do NCBI, GenBank número de acesso X00497. Em outras fusões, os peptídeos da presente invenção podem ser fundidos com um anticorpo conforme aqui descrito ou com uma parte funcional do mesmo, e em particular com uma sequência de um anticorpo, de modo a se tornar um alvo específico do referido anticorpo ou, por exemplo, em ou no interior de um anticorpo específico para células dendríticas, conforme aqui descrito.

[00202] O peptídeo ou variante também pode ser modificado ainda mais para melhorar a estabilidade e/ou a ligação a moléculas de MHC a fim de produzir uma resposta imune mais forte. Os métodos de otimização de tais sequências peptídicas são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a introdução de ligações peptídicas reversas ou de ligações não peptídicas.

[00203] Em uma ligação peptídica reversa, os aminoácidos não se ligam por meio de ligações peptídicas (-CO-NH-), mas por uma ligação peptídica invertida. Tal peptideomimetismo retroinvertido pode ser produzido usando-se métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, os descritos por Mezière et al (1997) (Meziere et al., 1997), que fica aqui incorporado por referência. Esta abordagem inclui criar pseudopeptídeos contendo alterações na cadeia básica e não na orientação das cadeias laterais. Mezière etal. (Meziere et al., 1997) demonstraram que esses pseudopeptídeos podem ser úteis para respos

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127/287 tas de ligação de MHC e de células T auxiliares. Os peptídeos retroinvertidos, que contêm ligações NH-CO em vez de CO-NH, são muito mais resistentes à proteólise.

[00204] São exemplos de ligações não peptídicas, -CH2 -NH, CH₂S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH₂- e -CH2SO-. US 4.897.445 fornece um método para síntese em fase sólida de ligações não peptídicas (-CH2-NH-) em cadeias polipeptídicas envolvendo polipeptídeos sintetizados por procedimentos padrão, onde a ligação não peptídica é sintetizada pela reação de um aminoaldeído com um aminoácido na presença de NaCNBHs.

[00205] Os peptídeos que compreendem as sequências descritas acima podem ser sintetizados com outros grupamentos químicos presentes em suas terminações amina ou carboxila para melhorar a estabilidade, biodisponibilidade e/ou afinidade dos peptídeos. Por exemplo, grupamentos hidrofóbicos como a carbobenzoxila, dansila ou tbutiloxicarbonila podem ser adicionados à amina terminal dos peptídeos. Da mesma forma, um grupamento acetila ou um grupamento 9fluorenilmetóxi-carbonila pode ser adicionado à amina terminal dos peptídeos. Além disso, 0 grupamento hidrofóbico t-butiloxicarbonila ou um grupamento amida podem ser adicionados às carboxilas terminais dos peptídeos.

[00206] Outrossim, os peptídeos descritos podem ser sintetizados de forma a alterar suas modalidades estéricas. Por exemplo, 0 Disômero de um ou mais resíduos de aminoácidos do peptídeo pode ser utilizado em vez do L-isômero. Ainda mais, um ou mais resíduos de aminoácidos dos peptídeos da invenção podem ser substituídos por um dos resíduos de aminoácidos bem conhecidos e que não ocorrem naturalmente. Alterações como essas podem contribuir para aumentar a estabilidade, a biodisponibilidade ou a ação ligante dos peptídeos da invenção.

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128/287 [00207] Da mesma forma, um peptídeo da invenção ou variante do mesmo pode ser modificado quimicamente por meio de reações com aminoácidos específicos antes ou depois da síntese do peptídeo. Alguns exemplos de tais modificações são bem conhecidos na técnica e resumidos em, por exemplo, R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004), que fica aqui incorporado por referência. A modificação química de aminoácidos inclui, entre outras, modificação por acilação, amidinação, piridoxilação de lisina, alquilação redutora, trinitrobenzilação de grupamentos amina com ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS), modificação amídica de grupamentos carboxila e modificações sulfidrila mediante oxidação por ácido perfórmico de cisteína formando ácido cisteico, formação de derivados mercuriais, formação de dissulfetos mistos com outros compostos de tiol, reação com maleimida, carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida e carbamoilação com cianato em pH alcalino, sem limitar-se a estes. Em relação a isso, os versados na técnica podem referir-se ao Capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-

2000) (Coligan etal., 1995) para obter mais detalhes sobre as metodologias de modificação química de proteínas.

[00208] Sumariamente, a modificação de, por exemplo, resíduos de arginila em proteínas baseia-se muitas vezes na reação de compostos com dicarbonilas vicinais como o fenilglioxal, o 2,3-butanediona e o

1,2-ciclo-hexanediona para formar um adutor. Outro exemplo é a reação de metilglioxal com resíduos de arginina. A cisteína pode ser modificada sem alteração concomitante de outros sítios nucleofílicos como a lisina e a histidina. Com isso, grande número de reagentes estão disponíveis para modificar a cisteína. Os websites de empresas como a Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) apresentam informações sobre reagentes específicos.

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129/287 [00209] A redução seletiva de ligações dissulfeto em proteínas também é comum. As ligações dissulfeto podem ser encontradas e oxidadas durante o tratamento térmico de produtos biofarmacêuticos. O Reagente K de Woodward pode ser empregado para modificar resíduos específicos de ácido glutâmico. A N-(3-(dimetilamino)propil)-N’etilcarbodi-imida pode ser empregada para formar ligações cruzadas intramoleculares entre resíduos de lisina e um resíduo de ácido glutâmico. Por exemplo, o dietilpirocarbonato é um reagente para modificação de resíduos histidil em proteínas. A histidina também pode ser modificada usando-se 4-hidróxi-2-nonenal. A reação de resíduos de lisina e outros grupamentos a-amino é útil, por exemplo, para ligar peptídeos a superfícies ou para ligação cruzada de proteínas ou peptídeos. A lisina é o local de fixação do poli(etileno)glicol e é o principal sítio de modificação na glicosilação de proteínas. Os resíduos de metionina das proteínas podem ser modificados por, por exemplo, iodoacetamida, bromoetilamina e cloramina T.

[00210] O tetranitrometano e o N-acetilimidazol podem ser usados para modificar os resíduos de tirosila. A ligação cruzada por meio da formação de ditirosina pode ser efetuada com peróxido de hidrogênio e íons de cobre.

[00211] Estudos recentes sobre a modificação do triptofano vem empregando a N-bromosuccinimida, 2-hidróxi-5-nitrobenzil brometo ou

3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-2H-indol (BPNS-escatol).

[00212] A modificação bem-sucedida de proteínas e peptídeos terapêuticos com PEG frequentemente prolonga a meia-vida na circulação, e a ligação cruzada de proteínas com glutaraldeído, polietilenoglicol diacrilato e formaldeído é empregada para preparar hidrogéis. Muitos alergênios são modificados para imunoterapia por carbamilação com cianato de potássio.

[00213] Um peptídeo ou variante onde o peptídeo é modificado ou

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130/287 inclui ligações não peptídicas é uma modalidade preferida da invenção.

[00214] Outra modalidade da presente invenção se refere a um peptídeo que não é encontrado naturalmente, sendo que o referido peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 e foi produzido sinteticamente (por exemplo, sintetizado) na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Os métodos de produção sintética de peptídeos são bem conhecidos na técnica. Os sais dos peptídeos de acordo com a presente invenção diferem substancialmente dos peptídeos em seu estado in vivo, pois esses peptídeos não se apresentam como sais in vivo. O peptídeo em forma de sal não natural medeia a solubilidade do peptídeo, sobretudo no âmbito de composições farmacêuticas que compreendem os peptídeos (por exemplo, as vacinas peptídicas aqui reveladas). Para fornecer eficientemente os peptídeos ao indivíduo a ser tratado, requer-se uma solubilidade suficiente e pelo menos substancial do(s) peptídeos(s) Preferivelmente, os sais são sais farmaceuticamente aceitáveis dos peptídeos. Os referidos sais de acordo com a invenção incluem sais alcalinos e alcalino-terrosos, tais como os sais da série de Hofmeister, que compreendem os ânions PO4³·, SO4²·, CH3COO-, Cl’, Br, NO3·, CIO4-, I’, SCN- e os cátions NH4⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺ e Ba²⁺. São especialmente preferidos os sais selecionados entre (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (ΝΗ4)Η₂ΡΟ4, (NH₄)2SQ₄, NH4CH3COO, NH4CI, NH₄Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH₄SCN, Rb₃PO₄, Rb₂HPO₄, RbH₂PO4, Rb₂SO₄, Rb4CH₃COO, Rb₄CI, Rb₄Br, Rb₄NO₃, Rb₄CIO₄, Rb₄l, Rb₄SCN, K3PO4, K₂HPO₄, KH₂PQ₄, K₂SO₄, KCH3COO, KCI, KBr, KNO₃, KCIO₄, Kl, KSCN, Na₃PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂SO₄, NaCH₃COO, NaCI, NaBr, NaNO₃, NaCIO₄, Nal, NaSCN, ZnCI₂ Cs₃PO₄, Cs₂HPO₄, CsH₂PO4, Cs₂SO4, CsCHsCOO, CsCI, CsBr, CsNOs, CSCIO4, Csl,

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CsSCN, LÍ3PO4, LÍ2HPO4, LÍH2PO4, U2SO4, L1CH3COO, LiCI, LiBr, LiN0₃, UCIO4, Lil, LiSCN, CU2SO4, Mg₃(PO₄)₂, Mg₂HPO₄, Mg(H₂PO₄)2, Mg2SO4, Mg(CH₃COO)2, MgCk, MgBr2, Mg(NO₃)2, Mg(CIO4)2, Mgk, Mg(SCN)₂, MnCk, Ca₃(PO₄), Ca₂HPO₄, Ca(H₂PO₄)2, CaSO₄, Ca(CH₃COO)₂, CaCk, CaBr₂, Ca(NO₃)₂, Ca(CIO₄)₂, Cak, Ca(SCN)₂, Ba₃(PO₄)₂, Ba₂HPO₄, Ba(H₂PO₄)2, BaSO₄, Ba(CH₃COO)₂, BaCI₂, BaBr2, Ba(NO₃)2, Ba(CIO4)2, Bak e Ba(SCN)2. São particularmente preferidos 0 acetato de NH, MgCk, KH2PO4, Na2SO4, KCI, NaCI e CaCk, tais como, por exemplo, sais cloreto ou acetato (trifluoroacetato).

[00215] Geralmente, os peptídeos e variantes (pelo menos aquelas que contêm ligações peptídicas entre resíduos de aminoácidos) podem ser sintetizadas pelo método Fmoc-poliamida ou por síntese de peptídeos em fase sólida, conforme revelado por Lukas etal. (Lukas et al., 1981) e nas respectivas referências. O grupamento 9fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) protege temporariamente 0 grupamento N-amino. A divagem repetitiva do grupo protetor altamente baselábil é efetuada usando-se 20% piperidina em N, N-dimetilformamida. Os grupamentos em cadeias laterais podem ser protegidos mediante formação dos respectivos éteres butílicos (para treonina e tirosina), ésteres butílicos (para ácido glutâmico e ácido aspártico), derivados butiloxicarbonila (para lisina e histidina), derivados tritila (para cisteína) e derivados 4-metóxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonil (para arginina). Se houver resíduos C-terminais de glutamina ou asparagina, 0 grupamento 4,4'-dimetoxibenzidrila é usado para proteger os grupamentos amido das cadeias laterais. O suporte de fase sólida é baseado em um polímero de polidimetil-acrilamida constituído a partir de três monômeros: dimetilacrilamida (monômero da cadeia básica), bisacriloiletileno diamina (ligante cruzado) e acriloilsarcosina metil éster (agente funcionalizante). O agente clivável da ligação peptídeo-resina empregado é um derivado ácido-lábil do ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético. Todos os

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132/287 derivados de aminoácidos são adicionados na forma de anidridos simétricos pré-formados, com exceção de asparagina e glutamina, que são adicionadas usando-se um procedimento de acoplamento reverso mediado por N, N-dicicloexilcarbodi-imida/1-hidroxibenzotriazol. Todas as reações de acoplamento e desproteção são monitoradas por procedimentos de teste com ninhidrina, ácido trinitrobenzenossulfônico ou isotina. Ao final da síntese, os peptideos são clivados da resina de suporte e, ao mesmo tempo, os grupamentos protetores das cadeias laterais são removidos por tratamento com ácido trifluoracético a 95% contendo uma mistura de 50% de captantes. Alguns captantes comumente utilizados são etanoditiol, fenol, anisol e água, e a escolha exata depende dos aminoácidos constituintes do peptídeo que está sendo sintetizado. Também é possível combinar metodologias de fase sólida e fase em solução para sintetizar peptideos (ver, por exemplo, (Bruckdorfer etal., 2004), e referências nele citadas).

[00216] O ácido trifluoracético é removido por evaporação a vácuo seguida de trituração com éter dietílico para produzir o peptídeo bruto. Quaisquer captantes que ainda estiverem presentes serão retirados por um procedimento de extração simples, no qual a liofilização da fase aquosa produz o peptídeo bruto livre de captantes. Os reagentes para síntese de peptideos são geralmente fornecidos por, por exemplo, Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Reino Unido).

[00217] A purificação pode ser realizada por qualquer uma ou por uma combinação de técnicas como recristalização, cromatografia de exclusão por tamanho molecular, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e (geralmente) cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa empregando, por exemplo, um gradiente de separação de acetonitrilo/água.

[00218] A análise dos peptideos pode ser realizada empregando-se cromatografia em camada fina, eletroforese — sobretudo a eletrofore

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133/287 se capilar com extração em fase sólida (CSPE, capillary solid phase extraction) —, cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, análise de aminoácidos após hidrólise ácida e por espectrometria de massa com bombardeio por átomos rápidos (FAB, fast atom bombardment), assim como análise espectrométrica de massa por MALDI e ESI-Q-TOF.

[00219] Para identificação de ligantes de HLA por espectrometria de massa, moléculas de HLA de amostras de tecido congeladas criogenicamente foram purificadas e peptídeos associados ao HLA foram isolados. Os peptídeos isolados foram separados e suas sequências foram identificadas por ensaios de cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC-MS) com ionização por nanoeletrospray (nanoESl). As sequências peptídicas resultantes foram verificadas comparando-se o padrão de fragmentação dos peptídeos associados a tumores (TUMAPs) naturais registrado em amostras de carcinoma ovário (N > 80 amostras) com os padrões de fragmentação de peptídeos de referência sintéticos correspondentes cujas sequências eram idênticas. Como os peptídeos foram identificados diretamente como ligantes de moléculas de HLA de tumores primários, esses resultados constituem uma evidência direta de que os peptídeos identificados são processados e apresentados naturalmente nos tecidos cancerosos primários obtidos de 80 pacientes com câncer de ovário (ver Exemplo 1).

[00220] O pipeline de descoberta /PRESIDENT® v2.1 (ver, por exemplo, US 2013-0096016, que fica aqui integralmente incorporada por referência) permite identificar e selecionar peptídeos sobreapresentados que possam ser relevantes como candidatos a uso vacinai com base na quantificação relativa direta dos níveis de peptídeo restrito por HLA em tecidos cancerosos em comparação com diversos outros tecidos e órgãos não cancerosos. Isso foi obtido mediante desenvolvimento de quantificação diferencial sem marcadores com emprego

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134/287 dos dados adquiridos por cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC-MS), que foram processados por um pipeline de dados exclusivo. O pipeline combina algoritmos de identificação de sequências, agregação espectral, contagem de íons, alinhamento de tempos de retenção e desconvolução e normalização de estados de carga.

[00221] Os complexos HLA-peptídeo em amostras de tecido de câncer de ovário foram purificados e os peptídeos associados ao HLA foram isolados e analisados por LC-MS (ver Exemplo 1). Todos os TUMAPs contidos na presente solicitação foram identificados mediante essa abordagem em amostras de câncer de ovário primário, e as amostras de tumor confirmaram sua apresentação em câncer de ovário primário.

[00222] Além da apresentação do peptídeo, a expressão do mRNA do gene subjacente também foi testada. Os dados de mRNA foram obtidas por meio de análises de sequenciamento de RNA de tecidos normais e de tecidos cancerosos (cf. Exemplo 2 na Figura 1). Preferivelmente, foram incluídos na presente invenção peptídeos derivados de proteínas codificadas por mRNAs expressos de forma acentuada em tecidos cancerosos e pouco ou nada expressos em tecidos normais.

[00223] A presente invenção fornece peptídeos úteis para o tratamento de cânceres e tumores, preferivelmente câncer de ovário com apresentação exacerbada ou exclusiva dos peptídeos da invenção. A espectrometria de massa mostrou que esses peptídeos são apresentados naturalmente por moléculas de HLA em amostras de câncer de ovário primário em humanos.

[00224] Muitas das proteína e/ou genes fonte (também designada proteínas completas ou proteínas subjacentes) dos quais os peptídeos são derivados apresentaram altos níveis de sobrexpressão no câncer em comparação com tecidos normais. Para fins desta inven

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135/287 ção, tecidos normais são células saudáveis de ovário ou outras células de tecidos normais, que demonstram a existência de níveis elevados de associação com os genes originais (ver Exemplo 2). Os peptídeos também estão presentes em tecido tumoral. Para fins desta invenção, tecido tumoral são amostras de pacientes que sofrem de câncer de ovário.

[00225] Os peptídeos ligados ao HLA podem ser reconhecidos pelo sistema imunológico, especificamente pelos linfócitos T. As células T podem destruir as células que apresentam o complexo HLA/peptídeo reconhecido, por exemplo, células de câncer de ovário que apresentam os peptídeos derivados.

[00226] Os peptídeos da presente invenção mostraram-se capazes de estimular respostas de células T e/ou são sobreapresentados; portanto, pode-se usá-los para produzir anticorpos e/ou TCRs, tais como os sTCRs solúveis de acordo com a presente invenção (ver Exemplo 3 e Exemplo 4). Além disso, os peptídeos da presente invenção também podem ser usados, quando formam complexos com os respectivos MHCs, para produzir anticorpos e/ou sTCRs, sobretudo sTCRs, de acordo com a presente invenção. Os respectivos métodos são bem conhecidos de indivíduos versados na técnica e também podem ser encontrados na respectiva literatura (ver também adiante). Assim, os peptídeos da presente invenção são úteis para gerar uma resposta imune em um paciente, por meio da qual as células tumorais podem ser destruídas. Pode-se induzir uma resposta imune em um paciente administrando-se os peptídeos descritos ou substâncias precursoras apropriadas (por exemplo, peptídeos alongados, proteínas ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos) diretamente ao paciente, idealmente em combinação com agentes que promovem a imunogenicidade (isto é, um adjuvante). Pode-se esperar que a resposta imune originária de tal vacinação terapêutica seja altamente específica contra

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136/287 células tumorais porque os peptídeos-alvo da presente invenção não são apresentados em tecidos normais em números de cópias semelhantes, evitando o risco de reações autoimunes indesejadas contra células normais do paciente.

[00227] A presente descrição refere-se também a receptores de células T (TCRs) que compreendem uma cadeia alfa e uma cadeia beta (TCRs alfa/beta). Também são fornecidos peptídeos de acordo com a invenção capazes de se ligar a TCR e anticorpos quando apresentados por uma molécula de MHC.

[00228] A presente descrição se refere também a fragmentos dos TCRs de acordo com a presente invenção que são capazes de se ligarem a um antígeno peptídico de acordo com a presente invenção quando estes são apresentados por uma molécula de HLA. O termo se refere em particular a fragmentos de TCR solúveis (por exemplo, TCRs sem as porções transmembrana e/ou sem as regiões constantes, TCRs de cadeia única e fusões dos mesmos, por exemplo, com imunoglobulinas).

[00229] A presente descrição refere-se também a ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras para expressão de TCRs e peptídeos da presente descrição, assim como a métodos de usar os mesmos.

[00230] O termo receptor de células T (abreviatura TCR) refere-se a uma molécula heterodimérica que compreende uma cadeia polipeptídica alfa (cadeia alfa) e uma cadeia polipeptídica beta (cadeia beta), na qual o receptor heterodimérico é capaz de se ligar a um antígeno peptídico apresentado por uma molécula de HLA. O termo também inclui os chamados TCRs gama/delta.

[00231] Em uma modalidade, a descrição fornece um método de produção de um TCR conforme aqui descrito, sendo que o método compreende cultivar células hospedeiras capazes de expressar o TCR em condições apropriadas para promover a expressão do TCR.

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137/287 [00232] Em outro aspecto, a descrição refere-se a métodos de acordo com a descrição, sendo que o antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada ou de uma célula apresentadora de antígenos artificial colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos ou o antígeno é carregado em tetrâmetros de MHC classe I ou II por meio da tetramerização de monômeros de complexos de MHC classe I ou II com antígenos.

[00233] As cadeias alta e beta dos TCRs alfa/beta e as cadeias gama e delta dos TCRs gama/delta são geralmente consideradas como possuindo dois domínios cada: o domínio variável e o domínio constante. O domínio variável consiste na concatenação de uma região variável (V) com uma região juncional (J). O domínio variável também pode incluir uma região líder (L), e as cadeias beta e delta também podem apresentar uma região de diversidade (D). Os domínios constantes das cadeias alfa e beta também podem incluir domínios transmembrana (TM) C-terminais que ancoram as cadeias alfa e beta à membrana celular.

[00234] Em relação aos TCRs gama/delta, o termo domínio variável do TCR gama conforme aqui utilizado refere-se à concatenação da região gama V do TCR (TRGV) sem região líder (L) com a região TCR gama J (TRGJ), e o termo TCR gama de domínio constante refere-se à região extracelular do TRGC ou a uma sequência de TRGC com truncamento C-terminal. Da mesma forma, o termo domínio variável de TCR delta refere-se à concatenação da região TCR delta V (TRDV) sem região líder (L) com a região TCR delta D/J (TRDD/TRDJ), e o termo domínio constante do TCR delta refere-se à região extracelular do TRDC ou a uma sequência de TRDC com truncamento C-terminal.

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138/287 [00235] Os TCRs da presente invenção se ligam preferivelmente a um complexo de peptideo com HLA com afinidade de ligação (Kd) de cerca de 100 μΜ ou menos, cerca de 50 μΜ ou menos, cerca de 25 μΜ ou menos ou cerca de 10 μΜ ou menos. São mais preferíveis os TCRs de alta afinidade cujas afinidades de ligação sejam de aproximadamente 1 μΜ ou menos, cerca de 100 nM ou menos, cerca de 50 nM ou menos ou cerca de 25 nM ou menos. São exemplos não limitantes dos intervalos de afinidade de ligação preferidos de TCRs da presente invenção cerca de 1 nM a cerca de 10 nM; cerca de 10 nM a cerca de 20 nM; cerca de 20 nM a cerca de 30 nM; cerca de 30 nMa cerca de 40 nM; cerca de 40 nM a cerca de 50 nM; cerca de 50 nMa cerca de 60 nM; cerca de 60 nM a cerca de 70 nM; cerca de 70 nMa cerca de 80 nM; cerca de 80 nM a cerca de 90 nM; e cerca de 90 nM a cerca de 100 nM.

[00236] Conforme aqui utilizado em relação aos TCRs da presente descrição, ligação específica e variações gramaticais do termo são usados para designar um TCR com afinidade de ligação (Kd) de 100 μΜ ou menos para um complexo de HLA com peptídeo.

[00237] As TCRs alfa/beta heterodiméricas da presente descrição podem ter uma ligação dissulfeto introduzida entre seus domínios constantes. Os TCRs preferidos deste tipo incluem aqueles com uma sequência de domínio TRAC constante e uma sequência de TRBC1 ou TRBC2 constante, exceto que a Tre 48 do TRAC e a Ser 57 do TRBC1 ou TRBC2 são substituídas por resíduos de cisteína, e essas cisteínas formam uma ponte dissulfeto entre a sequência de domínio constante do TRAC e a sequência de domínio constante do TRBC1 ou TRBC2 do TCR.

[00238] Com ou sem a introdução da ligação entre cadeias mencionada anteriormente, os TCRs alfa/beta heterodiméricos da presente descrição podem apresentar um domínio com sequência constante

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139/287 codificado pelo gene TRAC e um domínio TRBC1 ou TRBC2 com sequência constante, e as sequências do domínio constante TRAC e dos domínios constantes TRBC1 ou TRBC2 do TCR podem ser ligadas uma à outra pela ligação dissulfeto nativa entre a Cis4 do éxon 2 da TRAC e a Cis2 do éxon 2 da TRBC1 ou da TRBC2.

[00239] Os TCRs da presente descrição podem compreender um marcador detectável, selecionado do grupo formado por um radionuclídeo, um fluoróforo e biotina. Os TCRs da presente descrição podem ser conjugados com um agente terapeuticamente ativo, como um radionuclídeo, um agente quimioterápico ou uma toxina.

[00240] Em uma modalidade, um TCR da presente descrição que apresenta pelo menos uma mutação na cadeia alfa e/ou apresenta pelo menos uma mutação na cadeia beta exibe glicosilação modificada em comparação com o TCR sem mutação.

[00241] Em uma modalidade, um TCR que compreende pelo menos uma mutação na cadeia alfa do TCR e/ou a cadeia beta do TCR possui afinidade de ligação por e/ou meia-vida de ligação para um complexo de peptídeo com molécula de HLA que corresponde a pelo menos o dobro do de um TCR que compreende a cadeia alfa não mutante do TCR e/ou a cadeia beta não mutante do TCR. A melhora da afinidade de TCRs específicas para tumores e sua exploração depende da existência de uma janela na qual o TCR apresenta máxima afinidade. A existência dessa janela baseia-se em observações de que TCRs específicos para patógenos restritos por HLA-A2 geralmente possuem valores de Kd 10 vezes menores que os de TCRs específicos para autoantígenos associados a tumor restritos por HLA-A2. Sabe-se atualmente que, embora os antígenos tumorais tenham potencial imunogênico, apenas proteínas mutantes ou cujo processamento pós-tradução foi alterado serão consideradas estranhas pelo sistema imune; afinal, os tumores se originam das células do próprio indivíduo. Os antígenos

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140/287 supra-regulados ou sobrexpressos (os chamados autoantigenos) nem sempre induzem uma resposta imune funcional contra o tumor. As células T que expressam TCRs reativos a esses antígenos são selecionadas negativamente no timo por um processo conhecido como tolerância central, no qual apenas células T com TCRs de baixa afinidade para autoantigenos permanecem. Portanto, a afinidade dos TCRs ou de variantes da presente descrição para os peptídeos pode ser melhorada por métodos bem conhecidos na técnica.

[00242] A presente descrição se refere também a um método de identificação de isolamento de um TCR de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende a incubação de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de doadores negativos para HLA-A*02 com, por exemplo, monômeros de peptídeo-A2, incubação das CMSPs com ficoeritrina tetramérica (PE) e isolamento das células T que apresentam avidez elevada por separação celular ativada por fluorescência (FACS)-Calibur.

[00243] A presente descrição refere-se também a um método de identificação e isolamento de TCR de acordo com a presente descrição, sendo que o referido método compreende a obtenção de um camundongo transgênico com a totalidade dos lócus do gene TCRap humano (1,1 e 0,7 Mb), no qual as células T expressam um repertório diversificado de TCR humano que compensa a deficiência de TCR de camundongo e imuniza o animal com o peptídeo de interesse; referese ainda à incubação de CMSP obtidas de camundongos transgênicos com ficoeritrina tetramérica (PE) e isolamento de células T de alta avidez por separação de células ativadas por fluorescência segundo FACS-Calibur.

[00244] Em um aspecto, para obter células T que expressem TCRs da presente descrição, realiza-se a clonagem de ácidos nucleicos que codificam as cadeias TCR-alfa e/ou TCR-beta da presente descrição

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141/287 em vetores de expressão, como retrovirus gama ou lentivírus. Uma vez gerados, os vírus recombinantes têm sua funcionalidade testada, incluindo especificidade para antígenos e avidez funcional. Em seguida, uma alíquota do produto final é utilizada para transdução da população de células T alvo (geralmente purificada de CMSP do paciente), que é então expandida antes de ser infundida no paciente.

[00245] Em outro aspecto, para se obter TCRs que expressam células T da presente descrição, RNAs de TCR são sintetizados por meio de procedimentos conhecidos na técnica, por exemplo, sistemas de transcrição in vitro. Os RNAs de TCRs sintetizados in vitro são então introduzidos em células T CD8+ primárias obtidas de doadores saudáveis por eletroporação para que reexpressem as cadeias TCR-alfa e/ou TCR-beta específicas para tumores.

[00246] Para aumentar a expressão, os ácidos nucleicos que codificam os TCRs da presente descrição podem ser ligados operacionalmente a promotores fortes, tais como repetição terminal longa (LTRs) em retrovirus, citomegalovírus (CMV), vírus de células tronco murinas (MSCV) U3, fosfoglicerato quinase (PGK), β-actina, ubiquitina e um promotor composto de vírus símio 40 (SV40)/CD43, fator de alongamento (EF)-1a e o promotor do vírus formador de foco esplênico (SFFV). Em uma modalidade preferida, o promotor é heterólogo em relação ao ácido nucleico expresso.

[00247] Além dos promotores fortes, os cassetes de expressão de TCR da presente descrição podem conter outros elementos que podem incentivar a expressão de transgenes, tais como um trato central de polipurina (cPPT), que promove a translocação central de estruturas lentivirais (Follenzi et al., 2000), e o elemento regulatório póstranscricional do vírus da hepatite da marmota (wPRE), que aumenta os níveis da expressão do transgene ao melhorar a estabilidade do RN A (Zufferey etal., 1999).

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142/287 [00248] As cadeias alfa e beta de um TCR da presente invenção podem ser codificadas por ácidos nucleicos localizados em vetores separados ou por polinucleotídeos localizados no mesmo vetor.

[00249] Para obter níveis elevados de expressão superficial de TCR, tanto a cadeia TCR-alfa como a TCR-beta do TCR introduzido precisam ser transcritas em volumes elevados. Isso requer que as cadeias TCR-alfa e TCR-beta da presente descrição sejam clonadas com formação de estruturas bicistrônicas em um único vetor, o que se mostrou suficiente para superar esse obstáculo. O uso de um sítio de entrada intra-ribossômico viral (IRES) entre as cadeias TCR-alfa e TCR-beta induz a expressão coordenada das duas cadeias, pois as cadeias TCR-alfa e TCR-beta são ambas geradas a partir de um único produto de transcrição, que é clivado em duas proteínas durante a tradução, garantindo que as cadeias TCR-alfa e TCR-beta sejam produzidas em proporção equimolar (Schmitt etal., 2009).

[00250] Os ácidos nucleicos que codificam os TCRs da presente descrição podem ser otimizados ao nível de seus códons para aumentar a expressão em uma célula hospedeira. O código genético é redundante e permite que alguns aminoácidos sejam codificados por mais de um códon, mas alguns códons são menos adequados que outros devido a fatores como, por exemplo, a disponibilidade relativa de tRNAs correspondentes (Gustafsson et al., 2004). Demonstrou-se que a modificação das sequências dos genes TCR-alfa e TCR-beta de modo que cada aminoácido seja codificado pelo códon ideal para expressão de genes de mamíferos e de modo que a instabilidade de motivos ou de sítios de splicing crípticos seja eliminada aumenta significativamente a expressão de genes de TCR-alfa e TCR-beta (Scholten et al., 2006).

[00251] Além disso, erros de pareamento entre a cadeia de TCR endógena e a introduzida podem criar especificidades que acarretam

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143/287 risco significativo de autoimunidade. Por exemplo, a formação de dímeros mistos de TCR pode reduzir o número de moléculas CD3 disponíveis para formar complexos TCR devidamente pareados, o que diminui significativamente a avidez funcional das células que expressam o TCR introduzido (Kuball etal., 2007).

[00252] Para reduzir erros de pareamento, o domínio C-terminal das cadeias do TCR introduzidas na presente descrição pode ser modificado para promover afinidade entre cadeias e, ao mesmo tempo, tornar as cadeias introduzidas menos capazes de emparelhar com o TCR endógeno. Essas estratégias podem consistir em substituição dos domínios C-terminais de TCR-alfa e TCR-beta humanos por seus correspondentes murinos (domínio C-terminal murinizado), geração de uma segunda ponte dissulfeto entre as cadeias no domínio C-terminal introduzindo-se um segundo resíduo de cisteína tanto na cadeia TCRalfa como na cadeia TCR-beta do TCR introduzido (modificação por cisteína), troca de resíduos que interagem nos domínios C-terminais das cadeias TCR-alfa TCR-beta (knob in hole) e fusão dos domínios variáveis das cadeias TCR-alfa e TCR-beta diretamente no CD3< (fusão de CD3<) (Schmitt etal., 2009).

[00253] Em uma modalidade, uma célula hospedeira é modificada para expressar um TCR da presente descrição. Em modalidades preferidas, a célula hospedeira é uma célula Τ humana ou um progenitor de célula Τ. Em algumas modalidades, a célula Τ ou a célula progenitora de célula Τ é obtida de um paciente com câncer. Em outras modalidades, a célula Τ ou a célula progenitora de célula Τ é obtida de um doador saudável. As células hospedeiras da presente descrição podem ser alogênicas ou autólogas em relação ao paciente a ser tratado. Em uma modalidade a célula hospedeira é uma célula Τ gama/delta transformada para expressar um TCR alfa/beta.

[00254] Uma composição farmacêutica significa uma composição

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144/287 apropriada para administração a um ser humano em um ambiente clínico. Preferivelmente, a composição farmacêutica é estéril e produzida de acordo com as diretrizes de Boas Práticas de Fabricação.

[00255] As composições farmacêuticas compreendem os peptídeos tanto em forma livre como na forma de um sal farmaceuticamente aceitável (ver também o texto anterior). Conforme aqui utilizado, sal farmaceuticamente aceitável refere-se a um derivado dos peptídeos revelados onde o peptídeo é modificado elaborando-se sais ácidos ou básicos do agente. Por exemplo, os sais ácidos são preparados a partir da base livre (geralmente onde a forma neutra do fármaco possui um grupamento NH2 neutro) envolvendo reação com um ácido apropriado. Entre os ácidos apropriados para preparar sais ácidos estão tanto ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e assemelhados) como ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e assemelhados. Por outro lado, a preparação de sais básicos de grupamentos ácidos que podem estar presentes em um peptídeo são preparados usando-se uma base farmaceuticamente aceitável como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônia, hidróxido de cálcio, trimetilamina ou assemelhados.

[00256] Em uma modalidade especialmente preferida, as composições farmacêuticas compreendem os peptídeos na forma de sais do ácido acético (acetates), de trifluoracetatos ou do ácido clorídrico (cloretos).

[00257] Preferivelmente, 0 medicamento da presente invenção é um imunoterápico como uma vacina. Ela pode ser administrada ao pa

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145/287 ciente, seja no órgão afetado ou por via sistêmica i.d., i.m., s.c., i.p. e

i.v. ou aplicada ex vivo em células derivadas do paciente ou de linhagens celulares humanas que são posteriormente administradas ao paciente ou usadas in vitro para selecionar uma subpopulação de células imunes derivadas do paciente, que são então read ministradas ao paciente. Se o ácido nucleico for administrado a células in vitro, pode ser útil que as células sejam transfectadas para que coexpressem citocinas imunoestimulatórias como a interleucina 2. O peptídeo pode ser basicamente puro ou associado a um adjuvante imunoestimulatório (ver adiante) ou usado em associação com citocinas imunoestimulatórias ou ser administrado por um sistema de administração apropriado como, por exemplo, lipossomos. O peptídeo também pode ser conjugado com um transportador apropriado, como a hemocianina de lapa (KLH, keyhole limpet hemocyanin) ou manana (ver WO 95/18145 e (Longenecker etal., 1993)). O peptídeo também pode ser marcado por uma proteína de fusão ou ser uma molécula híbrida. Espera-se que os peptídeos cujas sequências são mostradas na presente invenção sejam capazes de estimular células T CD4 ou CD8. Entretanto, a estimulação de células T CD8 é mais eficiente na presença do auxílio proporcionado por células T auxiliares CD4. Portanto, para epitopes de MHC classe I que estimulam células T CD8, o elemento de fusão ou seções de uma molécula híbrida proporcionam epitopes de maneira apropriada, que estimulam células T CD4-positivas. Os epitopes estimulantes de CD4 e CD8 são bem conhecidos na técnica e incluem aqueles identificados na presente invenção.

[00258] Em um aspecto, a vacina compreende pelo menos um peptídeo cuja sequência de aminoácidos é apresentada em SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 e pelo menos um outro peptídeo, preferivelmente de 2 a 50, mais preferivelmente de 2 a 25, ainda mais preferivelmente de 2 a 20 e, mais preferivelmente de todos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,

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13, 14, 15, 16, 17 ou 18 peptídeos. Os peptídeos podem ser derivados de um ou mais AATs específicos e podem se ligar a moléculas de MHC classe I.

[00259] Outro aspecto da invenção proporciona um ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídeo) que codifica um peptídeo ou variante de um peptídeo da invenção. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos, tanto de fita única como de dupla fita, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeos como, por exemplo, polinucleotídeos com uma cadeia básica de fosforotioato, e pode ou não conter introns, contanto que codifique o peptídeo. Evidentemente, apenas peptídeos que contenham os resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente e unidos por ligações peptídicas que ocorrem naturalmente podem ser codificados por um polinucleotídeo. Outro aspecto da invenção fornece um vetor de expressão capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[00260] Diversos métodos foram desenvolvidos para ligar polinucleotídeos, sobretudo de DNA, a vetores empregando, por exemplo, terminações coesivas complementares. Por exemplo, trechos de homopolímeros complementares podem ser adicionados ao segmento de DNA a ser inserido no DNA do vetor. Em seguida, o vetor e o segmento de DNA são unidos pela ponte de hidrogênio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de DNA recombinante.

[00261] Ligantes sintéticos que contêm um ou mais sítios de restrição constituem um método alternativo de unir o segmento de DNA aos vetores. Ligantes sintéticos contendo diversos sítios de endonucleases de restrição estão disponíveis comercialmente de diversas fontes, tais como a International Biotechnologies Inc. New Haven, CT, EUA.

[00262] Um método desejável de modificar o DNA que codifica o

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147/287 polipeptídeo da invenção emprega a reação em cadeia de polimerase, conforme descrita por Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988). Esse método pode ser usado introduzindo-se DNA em um vetor apropriado, por exemplo, mediante engenharia de sítios de restrição apropriados, ou pode-se usá-lo para modificar o DNA de outras formas úteis, como é conhecido na técnica. Se forem usados vetores virais, são preferidos os vetores de varíola ou adenovirus.

[00263] O DNA (ou RNA, no caso de vetores retrovirais) pode então ser expresso em um hospedeiro apropriado para produzir um polipeptídeo que compreende um peptídeo da invenção ou variante do mesmo. Portanto, o DNA que codifica o peptídeo da invenção ou variante do mesmo pode ser usado de acordo com técnicas conhecidas e modificado apropriadamente conforme os ensinamentos aqui apresentados para construir um vetor de expressão, que é então utilizado para transformar uma célula hospedeira apropriada e produzir o polipeptídeo da invenção. Tais técnicas incluem as reveladas nas, por exemplo, em US 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 e 4.810.648.

[00264] O DNA (ou, no caso de vetores retrovirais, RNA) que codifica o polipeptídeo que constitui o composto da invenção pode ser unido a várias outras sequências de DNA para introdução em um hospedeiro apropriado. O DNA acompanhante dependerá da natureza do hospedeiro, do modo como o DNA é introduzido no hospedeiro e em se o desejado é a manutenção epissômica ou a integração.

[00265] Em geral, o DNA é inserido em um vetor de expressão como um plasmídio na orientação correta e no frame de leitura correto para expressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às sequências de nucleotídeos de controle regulatória da transcrição e tradução reconhecidas pelo hospedeiro desejado, embora tais controles geralmente estejam disponíveis no vetor de expressão. Em seguida, o vetor

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148/287 é introduzido no hospedeiro por meio de técnicas padrão. Em geral, nem todos os hospedeiros serão transformados pelo vetor. Portanto, é necessário selecionar as células transformadas do hospedeiro. Uma técnica de seleção consiste em incorporar ao vetor de expressão uma sequência de DNA, junto com os elementos de controle necessários, que codifique uma característica selecionada na célula transformada, como resistência a um antibiótico.

[00266] Como alternativa, o gene para tal característica selecionável pode estar em outro vetor, que é usado conjuntamente para transformar a célula hospedeira desejada.

[00267] As células hospedeiras transformadas pelo DNA recombinante da invenção são então cultivadas por um período de tempo suficiente e sob condições apropriadas, bem conhecidas dos versados na técnica em vista dos ensinamentos aqui revelados, para permitir a expressão do polipeptídeo, que poderá então ser recuperado.

[00268] Muitos vetores de expressão são conhecidos, incluindo bactérias (por exemplo, E. coli e Bacillus subtilis), leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), fungos filamentosos (por exemplo, Aspergillus sp.), células vegetais, células animais e células de insetos. Preferivelmente, o sistema pode consistir em células mamíferas como células CHO disponibilizadas pela ATCC Cell Biology Collection. [00269] Um vetor plasmídio típico para expressão constitutiva em célula mamífera compreende o promotor de CMV ou SV40 com uma cauda poli-A apropriada e um marcador de resistência como a neomicina. Um exemplo é o pSVL, disponibilizado pela Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA. Um exemplo de vetor de expressão induzível para células mamíferas é o pMSG, também fornecido pela Pharmacia. O pRS403-406 e o pRS413-416 são vetores plasmídicos úteis, que são geralmente disponibilizados pela Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Os plasmídios pRS403, pRS404, pRS405 e

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149/287 pRS406 são plasmídios de integração a leveduras (Yips, Yeast Integrating plasmids) e incluem os marcadores selecionáveis de leveduras HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Os plasmídios pRS413-416 são plasmídios de centromeres de leveduras (Ycps, Yeast Centromere plasmids). Os vetores à base de promotor de CMV (por exemplo, os fornecidos pela Sigma-Aldrich) proporcionam expressão transitória ou estável, expressão citoplasmática ou secreção, e a marcação Nterminal ou C-terminal em várias combinações de FLAG, 3xFLAG, cmyc ou MAT. Essas proteínas de fusão permitem detectar, purificar e analisar a proteína recombinante, e as proteínas de fusão com marcação dupla aumentam a flexibilidade de detecção.

[00270] A região regulatória promotora forte do citomegalovírus humano (CMV) promove a expressão de níveis constitutivos de proteína de até 1 mg/L em células COS. Em linhagens celulares menos potentes, os níveis proteicos são geralmente —0,1 mg/L. A presença da origem de replicação do SV40 proporciona níveis elevados de replicação de DNA em células COS que permitem a replicação de SV40. Os vetores de CMV podem conter, por exemplo, a origem pMB1 (derivada de pBR322) para permitir a replicação em células bacterianas, o gene de β-lactamase para seleção de resistência à ampicilina em bactérias, poli-A de hGH e a origem f1. Os vetores que contêm a sequência líder de preprotripsina (PPT) podem direcionar a secreção de proteínas de fusão FLAG no meio de cultura para purificação mediante o uso de anticorpos anti-FLAG, resinas e placas. Outros vetores e sistemas de expressão são bem conhecidos na técnica para emprego com diversas células hospedeiras.

[00271] Em outra modalidade, dois ou mais peptídeos ou variantes de peptídeos da invenção são codificados e, portanto, expressos em ordem sucessiva, numa estrutura semelhante a contas em um colar. Ao fazê-lo, os peptídeos ou variantes de peptídeos podem ser ligados

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150/287 ou fundidos por trechos de aminoácidos ligantes, como, por exemplo, LLLLLL, ou podem ser ligados um ao outro sem nenhum outro peptídeo entre eles. Essas estruturas podem ser usadas para tratamento do câncer e podem induzir respostas imunes que envolvem tanto MHC I como MHC II.

[00272] A presente invenção refere-se também a uma célula hospedeira transformada por uma estrutura de vetor polinucleotídeo da presente invenção. A célula hospedeira pode ser procariota ou eucariota. As células bacterianas, que podem ser, preferivelmente, procariotas em algumas situações e normalmente são uma cepa de E. coli como, por exemplo, as cepas de E. coli DH5 fornecidas por Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA e RR1, fornecidas pela American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EUA (ATCC N^Q 31343). As células eucariotas preferidas são as de levedura, inseto e mamífero, preferivelmente células de vertebrados como camundongo, rato, macaco ou linhagens celulares de fibroblastos ou cólon humano. São células hospedeiras de levedura YPH499, YPH500 e YPH501, que são geralmente disponibilizadas por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. São células preferidas de hospedeiros mamíferos as de ovário de hamster chinês (CHO) fornecidas pela ATCC sob o número CCL61, células embrionárias NIH/3T3 de camundongo suíço do NIH fornecidas pela ATCC sob o número CRL 1658, células COS-1 derivadas de rim de macaco fornecidas pela ATCC sob o número CRL 1650 e células HEK-293 derivadas de rim embrionário humano. As células de inseto preferidas são as células Sf9, que podem ser transfectadas por vetores de expressão baseados em baculovírus. Uma visão geral da escolha de células hospedeiras apropriadas para expressão é apresentada, por exemplo, no livro-texto de Paulina Balbás e Argélia Lorence Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols, Part One,

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Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9 e em outras publicações conhecidas dos versados na técnica.

[00273] A transformação de células hospedeiras apropriadas por uma estrutura de DNA da presente invenção é realizada por métodos bem conhecidos na técnica, que normalmente dependem do tipo de vetor utilizado. Em relação à transformação de células hospedeiras procariotas, ver, for exemplo, Cohen et al. (Cohen et al., 1972) e (Green and Sambrook, 2012). A transformação de células de levedura foi descrita por Sherman et al. (Sherman et al., 1986) - O método de Beggs (Beggs, 1978) também é útil. A Stratagene Cloning Systems e a Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA fornecem reagentes úteis para transfectar células de vertebrados (por exemplo, fosfato de cálcio, DEAE-dextrana e formulações de lipossomos). A eletroporação também pode ser empregada para transformar e/ou transfectar células e é bem conhecida na técnica como processo para transformação de células de leveduras, células de bactérias, células de insetos e células de vertebrados.

[00274] As células cuja transformação foi bem-sucedida, isto é, células contendo uma estrutura de DNA da presente invenção, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas, como PCR. Alternativamente, a presença de proteínas no sobrenadante pode ser detectada usando-se anticorpos.

[00275] Perceber-se-á que algumas células hospedeiras da invenção são úteis na preparação dos peptídeos da invenção, como, por exemplo, células bacterianas, de levedura e de inseto. Entretanto, outras células hospedeiras podem ser úteis em determinados métodos terapêuticos. Por exemplo, células apresentadoras de antígenos, como as células dendríticas, podem ser utilizadas com proveito para expressar os peptídeos da invenção de forma que possam ser carregados em moléculas de MHC apropriadas. Portanto, a presente invenção for

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152/287 nece uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[00276] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antigenos, podendo ser uma célula dendrítica ou outra célula apresentadora de antigenos. Em 29 de abril de 2010, a Food and Drug Administration (FDA) aprovou o sipuleucel-T, que consiste em APCs carregadas com uma proteína de fusão recombinante que contém fosfatase ácida prostática (PAP), para tratamento de CPRC assintomático ou minimamente sintomático (Rini et al., 2006; Small etal., 2006).

[00277] Outro aspecto da invenção fornece um método de produção de um peptídeo ou de uma variante do mesmo, sendo que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira descrita e isolamento do peptídeo da célula hospedeira ou do meio de cultura da mesma.

[00278] Em outra modalidade, o peptídeo, o ácido nucleico ou o vetor de expressão da invenção são usados em medicina. Por exemplo, o peptídeo ou uma variante do mesmo podem ser preparados para injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.), injeção intradérmica (i.d.), injeção intraperitoneal (i.p.) ou injeção intramuscular (i.m.). Os métodos preferidos de injeção de peptídeos são s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Os métodos preferidos de injeção de DNA são i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Doses de, por exemplo, 50 pg a 1,5 mg e, preferivelmente 125 pg a 500 pg de peptídeo ou DNA, podem ser administradas, dependendo do peptídeo ou do DNA em questão. O uso de doses nesse intervalo já foi bem-sucedido em ensaios clínicos (Walter etal., 2012).

[00279] O polinucleotídeo usado para vacinação ativa pode ser basicamente puro ou contido em um sistema apropriado de vetor ou de transporte. Os ácidos nucleicos podem ser DNA, cDNA, PNA, RNA ou uma combinação dos mesmos. Os métodos usados para projetar e introduzir tais ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Uma

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153/287 visão geral é apresentada em, por exemplo, Teufel et al. (Teufel et al., 2005) Vacinas de polinucleotídeos são fáceis de preparar, mas o modo de ação pelo qual esses vetores induzem uma resposta imune não é totalmente compreendido. Os vetores e sistemas de administração apropriados utilizam DNA e/ou RNA viral, tais como sistemas baseados em adenovirus, vírus da vacínia, retrovirus, herpesvirus, vírus associados ao adenovirus ou híbridos contendo elementos de mais de um vírus. Alguns sistemas não virais consistem em lipídios catiônicos e polímeros catiônicos, que são bem conhecidos na técnica de administração de DNA. A administração física por dispositivos como o gene gun (canhão gênico) também pode ser empregada. O(s) peptídeo(s) codificados pelos ácidos nucleicos pode(m) ser uma proteína de fusão, por exemplo, com um epitopo que estimula as células T do respectivo CDR oposto, conforme descrito anteriormente.

[00280] O medicamento da invenção também pode incluir um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes são substâncias que promovem ou potencializam de maneira inespecífica a resposta imune (por exemplo, a resposta imune mediada por células T CD8-positivas e células T auxiliares (TH)) contra um antígeno e que, portanto, seriam consideras úteis no medicamento da presente invenção. Alguns adjuvantes apropriados são, entre outros, 1018 ISS, sais de alumínio, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870.893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina ou ligantes TLR5 derivados da flagelina, ligante FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferon alfa ou beta ou derivados peguilados dos mesmos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipídio A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsões de água-em-óleo ou óleo-em-água, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vetor PepTel®, micropartículas à base de

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154/287 poli(lactídeo coglicolídeo) [PLG] e dextrana, talactoferrina, SRL172, virossomas e outras partículas semelhantes a vírus, YF-17D, armadilha de VEGF, R848, beta-glucana, Pam3Cys, estimulon QS21 de Áquila (derivado da saponina), extratos micobacterianos e simuladores da parede celular bacteriana e outros adjuvantes exclusivos como Ribi's Detox, Quil ou Superfos. São preferidos adjuvantes como o de Freund ou GM-CSF. Vários adjuvantes imunológicos (por exemplo, MF59) específicos para células dendríticas e suas preparações já foram descritos anteriormente (Allison and Krummel, 1995). Citocinas também podem ser usadas. Várias citocinas (por exemplo, TNF) foram associadas diretamente à influência sobre a migração de células dendríticas para tecidos linfoides, acelerando a maturação de células dendríticas de modo a formar células apresentadoras de antígenos que interagem de forma eficiente com linfócitos T (por exemplo, GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Pat. EUA N^Q 5.849.589, que fica específica e integralmente incorporada por referência) e que possuam atividade imunoadjuvante (por exemplo, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa e IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).

[00281] Descreveu-se também que os oligonucleotídeos CpG imunoestimulatórios podem potencializar os efeitos dos adjuvantes em situações vacinais. Sem restringir-se a nenhuma teoria, os oligonucleotídeos CpG agem ativando o sistema imune inato (não adaptativo) por meio de receptores do tipo Toll (TLR, Toll-like receptors), especialmente o TLR9. A ativação de TLR9 desencadeada pelo CpG promove respostas humorais e celulares específicas contra diversos antígenos, incluindo antígenos peptídicos ou proteicos, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares autólogas e conjugados de polissacarídeos, em vacinas tanto profiláticas como terapêuticas. Ainda mais importante, o CpG promove a maturação e diferenciação de células dendríticas, produzindo ativação de células TH1 e

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155/287 forte geração de linfócitos T citotóxicos (LTC), mesmo na ausência de auxílio de células T CD4. O viés para TH1 induzido pela estimulação por TLR9 se mantém mesmo na presença de adjuvantes vacinais como o alúmen ou o adjuvante incompleto de Freund (AIF), que normalmente promovem um viés para TH2. Os oligonucleotídeos CpG apresentam atividade adjuvante ainda mais acentuada quando formulados ou coadministrados com outros adjuvantes ou em formulações como micropartículas, nanopartículas, emulsões lipídicas ou formulações semelhantes, que são especialmente necessárias para induzir uma resposta acentuada a antígenos relativamente fracos. Eles também aceleram a resposta imune, permitindo reduzir as doses de antígenos em cerca de duas ordens de grandeza e obter uma resposta de anticorpos comparável à obtida com a dose plena da vacina sem CpG em alguns experimentos (Krieg, 2006). US 6.406.705 B1 descreve o uso combinado dos oligonucleotídeos CpG, adjuvantes que não consistem em ácidos nucleicos e um antígeno para induzir uma resposta imune antígeno-específica. Um antagonista de CpG TLR9 é o dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator), produzido pela Mologen (Berlim, Alemanha), que é o componente preferido para a composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculas ligantes de TLR como o TLR 7, TLR 8 e/ou TLR 9 ligantes de RNA também podem ser utilizadas.

[00282] Outros exemplos de adjuvantes úteis são, entre outros, CpGs modificados quimicamente (por exemplo, CpR, Idera), análogos de dsRNA como o Poli(l:C) e derivados do mesmo (por exemplo, AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(l:C12U), DNA ou RNA bacteriano sem CpG e moléculas pequenas ou anticorpos com atividade imunológica como a ciclofosfamida, sunitinibe, bevacizumabe®, Celebrex, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafenibe, temozolomida, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanibe, armadi

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156/287 lha de VEGF, ZD2171, AZD2171 e anti-CTLA4, outros anticorpos contra estruturas-chave do sistema imune (por exemplo, anti-CD40, antiTGF-beta e antirreceptor de TNF-α) e SC58175, que podem exercer ação terapêutica ou como adjuvantes. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser determinadas facilmente e sem experimentação excessiva por indivíduos praticantes da técnica.

[00283] São adjuvantes preferidos o anti-CD40, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamida, sunitinibe, bevacizumabe, interferon-a, oligonucleotídeos CpG e derivados, poli-(LC) e derivados, RNA, sildenafila e formações particuladas com PLG ou virossomos.

[00284] Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado de um grupo formado por fatores estimuladores de colônias como o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, sargramostina), ciclofosfamida, imiquimod, resiquimod e interferon-a.

[00285] Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado de um grupo formado por fatores estimuladores de colônias como o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod e resiquimod. Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é a ciclofosfamida, o imiquimod ou o resiquimod. São adjuvantes ainda mais preferidos o Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) e anticorpos monoclonais anti-CD40 ou combinações dos mesmos.

[00286] Esta composição é usada para administração parenteral, como por via subcutânea, intradérmica, intramuscular ou oral. Para esse fim, os peptídeos e, opcionalmente, outras moléculas, são dissolvidos ou suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável, pre

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157/287 ferivelmente um veículo aquoso. A composição também pode conter excipientes como tampões, agentes de ligação, agentes abrasivos, diluentes, flavorizantes, lubrificantes, etc. Os peptídeos também podem ser administrados conjuntamente com substâncias estimuladoras do sistema imune, como as citocinas. Uma ampla lista de excipientes que podem ser empregados em tais composições pode ser encontrada em, por exemplo, A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). A composição pode ser usada para prevenção, profilaxia e/ou tratamento de doenças adenomatosas ou cancerosas. Podem-se encontrar formulações exemplares em, por exemplo, EP2112253.

[00287] Cabe ressaltar que a resposta imune produzida pela vacina de acordo com a invenção ataca o câncer em diferentes estágios celulares e em vários estágios de desenvolvimento. Além disso, outras vias de sinalização associadas com o câncer também são atacadas. Isso constitui uma vantagem em relação às vacinas que agem apenas sobre um ou poucos alvos, pois o tumor pode se adaptar a esse tipo de ataque (escape tumoral) e nem todos os tumores expressam o mesmo padrão de antígenos. Por isso, uma combinação de vários peptídeos associados a tumores garante que todos os tumores apresentarão pelo menos alguns dos alvos. A composição foi projetada para tumores que expressem vários dos antígenos e age sobre diversas vias independentes necessárias para o crescimento e a manutenção do tumor. Portanto, a vacina pode ser usada sem individualização em uma população maior de pacientes. Isso significa que os pacientes a serem tratados com a vacina podem ser selecionados apenas por tipagem de HLA e não requerem análise de outros biomarcadores de expressão antigênica. Mesmo assim, a resposta imune induzida ataca vários alvos ao mesmo tempo, o que é importante para a eficácia (Banchereau etal., 2001; Walter etal., 2012).

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158/287 [00288] Conforme aqui utilizado, o termo arcabouço (scaffold) designa uma molécula que se liga especificamente a um determinante (por exemplo, antigênico). Em uma modalidade, o arcabouço é capaz de direcionar a entidade à qual está vinculado (por exemplo, um (segundo) grupamento ligante de antígeno) a um sítio alvo como, por exemplo, um tipo específico de célula tumoral ou estrema tumoral que apresenta um determinante antigênico (por exemplo, um complexo de peptídeo com MHC de acordo com a aplicação ora contemplada). Em outra modalidade, o arcabouço é capaz de ativar a sinalização por meio de seu antígeno alvo, que pode ser, por exemplo, um antígeno de um complexo receptor de células T. Os arcabouços incluem, entre outros, anticorpos e fragmentos dos mesmos, domínios ligantes de antígenos em um anticorpo, que compreendem uma região de cadeia pesada do anticorpo e uma região de cadeia leve do anticorpo, proteínas ligantes que compreendem pelo menos um motivo repetitivo de anquirina e molécula ligantes de antígenos de domínio único (SDAB), aptâmeros, TCRs (solúveis) e células (modificadas) como, por exemplo, células T alogênicas ou autólogas. Para avaliar se uma molécula funciona como arcabouço e se liga a um alvo, podem ser realizados ensaios de ligação.

[00289] Por ligação específica, entende-se uma ligação na qual o arcabouço se liga ao complexo de peptídeo com MHC relevante melhor que a outros complexos de peptídeo com MHC, de modo que um arcabouço dotado de uma molécula ativa capaz de destruir uma célula portadora de um alvo específico não seja capaz de destruir outra célula que não possui o alvo específico mas apresenta outros complexos de peptídeo com MHC. A ligação a outros complexos de peptídeo com MHC é irrelevante quando o peptídeo do complexo de peptídeo com MHC que produz reação cruzada não ocorre naturalmente, isto é, não é derivado do peptidoma do HLA humano. Os ensaios de avaliação da

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159/287 morte de células alvo são bem conhecidos na técnica e devem ser realizados usando células-alvo (células primárias ou linhagens celulares) nas quais o complexo de peptídeo com MHC seja apresentado inalterado ou células carregadas com peptídeos de modo que se atinjam os níveis observados naturalmente de complexos de peptídeo com MHC.

[00290] Um arcabouço pode incluir uma marcação que permite detectá-lo por meio da determinação da presença ou não do sinal fornecido pelo marcador. Por exemplo, o arcabouço pode ser marcado por um corante fluorescente ou qualquer outra molécula marcadora celular pertinente. Tais moléculas marcadoras são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a marcação fluorescente proporcionada, por exemplo, por um corante fluorescente, pode permitir a visualização do aptâmero ligado por meio de microscopia de fluorescência ou de varredura a laser ou detecção por citometria de fluxo.

[00291] Os arcabouços podem ser conjugados com uma segunda molécula ativa como, por exemplo, IL-21, anti-CD3 e anti-CD28. Para mais informações sobre arcabouços polipeptídicos, ver, por exemplo, a seção geral de WO 2014/071978A1 e as referências nela citadas.

[00292] A presente invenção refere-se também a aptâmeros. Os aptâmeros (ver, por exemplo, WO 2014/191359 e a literatura nela citada) são moléculas curtas de ácido nucleico de fita única, que podem se dobrar formando estruturas tridimensionais e reconhecer estruturasalvo específicas. Eles parecem ser opções apropriadas para o desenvolvimento de terapias direcionadas. Os aptâmeros se mostraram capazes de se ligar seletivamente e com alta afinidade e especificidade a diversos alvos complexos.

[00293] Na última década, foram identificados aptâmeros que reconhecem moléculas da superfície celular e proporcionam meios para o desenvolvimento de abordagens diagnosticas e terapêuticas. Como são praticamente atóxicos e não imunogênicos, os aptâmeros são

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160/287 candidatos promissores para aplicações biomédicas. Com efeito, aptâmeros como aqueles que reconhecem o antígeno prostático específico na membrana celular foram empregados com sucesso como terapias direcionadas e demonstraram sua funcionalidade em modelos de xenoenxerto in vivo. Também foram identificados aptâmeros que reconhecem linhagens específicas de células tumorais.

[00294] Podem-se selecionar aptâmeros de DNA que revelem propriedades de reconhecimento de amplo espectro para várias células oncológicas, sobretudo aquelas derivadas de tumores sólidos, e que não reconheçam células não tumorigênicas nem células saudáveis primárias. Se os aptâmeros identificados, em vez de reconhecer um subtipo tumoral específico, interagissem com diversos tumores, isso os tornaria úteis para o diagnóstico e tratamento dito de amplo espectro.

[00295] Além disso, pesquisas sobre o comportamento de ligação celular, realizadas por citometria de fluxo, também mostraram que os aptâmeros apresentaram excelentes afinidades aparentes na faixa de nanomoles.

[00296] Os aptâmeros podem ter aplicações diagnosticas e terapêuticas. Também foi demonstrado que alguns aptâmeros são captados por células tumorais e, portanto, podem funcionar como veículos moleculares para administração dirigida de agentes anticâncer (por exemplo, siRNA) a células tumorais.

[00297] Podem-se selecionar aptâmeros contra alvos complexos como células e tecidos e complexos de peptídeos que compreendem ou, preferivelmente, que consistem em uma sequência de acordo com SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 da invenção ora em pauta com a molécula de MHC empregando a técnica de seleção cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment).

[00298] Os peptídeos da presente invenção podem ser empregados para gerar e desenvolver anticorpos específicos contra complexos de

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MHC com peptídeo, que podem ser usados para tratamentos nos quais toxinas ou substâncias radioativas são guiadas até o tecido patológico. Outra aplicação desses anticorpos é guiar radionuclídeos ao tecido patológico para exames de imagem como o PET. Esta aplicação pode ajudar a detectar metástases pequenas ou determinar o tamanho e a localização exata dos tecidos patológicos.

[00299] Portanto, constitui outro aspecto da invenção o fornecimento de um método de produção de um anticorpo recombinante que se ligue especificamente a um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II que forme um complexo com um antígeno restrito por HLA (preferivelmente um peptídeo de acordo com a presente invenção), sendo que o método compreende imunizar um mamífero não humano submetido à engenharia genética com células que expressam o referido complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II com uma forma solúvel de uma molécula de MHC classe I ou II que forme complexo com o referido antígeno restrito por HLA; isolar moléculas de mRNA de células produtoras de anticorpo do referido mamífero não humano; produzir uma biblioteca de exposição em fagos que exiba as moléculas de proteína codificadas pelas referidas moléculas de mRNA; e isolar ao menos um fago da referida biblioteca de exposição em fagos, sendo que o pelo menos um fago referido expõe o referido anticorpo e se liga especificamente ao referido complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II em complexo com o referido antígeno restrito por HLA.

[00300] Constitui portanto outro aspecto da presente invenção o fornecimento de um anticorpo que se ligue especificamente a um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II em complexo com um antígeno restrito por HLA, no qual o anticorpo é preferivelmente um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo biespecífico ou um anticorpo quimérico.

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162/287 [00301] Os respectivos métodos usados para produzir tais anticorpos e complexos principais de histocompatibilidade classe I de cadeia única, assim como outras ferramentas empregadas para produzir tais anticorpos, são revelados em WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 e em publicações (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003) que, para as finalidades da presente invenção, ficam aqui integralmente incorporadas por referência.

[00302] Preferivelmente, o anticorpo se liga ao complexo com afinidade inferior a 20 nanomolares, e preferivelmente inferior a 10 nanomolares, o que é também considerado específico no contexto da presente invenção.

[00303] A presente invenção refere-se a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 ou a uma variante dos mesmos com pelo menos 88% de homologia (preferivelmente idêntico) com SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 ou uma variante da mesma que induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo, sendo que o referido peptídeo não é o peptídeo completo subjacente.

[00304] A presente invenção refere-se ainda a um peptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo formado por SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 ou uma variante das mesmas que seja pelo menos 88% homóloga (preferivelmente idêntico) à SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772, sendo que cada um dos peptídeos referidos ou variantes possui comprimento total de 8 a 100, preferivelmente de 8 a 30 e, mais preferivelmente que todos, de 8 a 14 aminoácidos.

[00305] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção que possuem a capacidade de se ligarem a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II.

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163/287 [00306] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, nos quais o referido peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ N^Q1 a SEQ N^Q 772.

[00307] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção, sendo que o peptídeo é modificado quimicamente e/ou inclui ligações não peptídicas.

[00308] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção, nos quais o peptídeo constitui parte de uma proteína de fusão, compreendendo em particular aminoácidos Nterminais da cadeia invariante associada ao antígeno do HLA-DR (li), ou nos quais o peptídeo é fundido a (ou incorporado à sequência de) um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo específico para células dendríticas.

[00309] A presente invenção refere-se também a um ácido nucleico que codifica os peptídeos de acordo com a invenção, conquanto tal peptídeo não seja uma proteína humana completa (total).

[00310] A presente invenção refere-se também ao ácido nucleico de acordo com a invenção que consista em DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos.

[00311] A presente invenção refere-se também a um vetor de expressão capaz de expressar um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[00312] A presente invenção refere-se também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão de acordo com a presente invenção para emprego em medicina, em especial para o tratamento de câncer de ovário.

[00313] A presente invenção refere-se também a uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico de acordo com a invenção

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164/287 ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[00314] A presente invenção refere-se também a células hospedeiras de acordo com a presente invenção, que sejam células apresentadoras de antígenos e, preferivelmente, células dendríticas.

[00315] A presente invenção refere-se também a um método de produção de um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende o cultivo da célula hospedeira de acordo com a presente invenção e o isolamento do peptídeo da referida célula hospedeira ou do meio de cultura da mesma.

[00316] A presente invenção refere-se também ao método de acordo com a presente invenção, sendo que o referido antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos.

[00317] A presente invenção refere-se também ao método de acordo com a presente invenção, sendo que a célula apresentadora de antígenos compreende um vetor de expressão capaz de expressar o referido peptídeo contendo SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 ou a referida sequência variante de aminoácidos.

[00318] A presente invenção relaciona-se também com células T ativadas produzidas de acordo com o método da presente invenção, sendo que as referidas células T reconhecem seletivamente células com expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção.

[00319] A presente invenção refere-se também a um método para destruir células-alvo em um paciente no qual as células-alvo expressam aberrantemente um polipeptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, sendo que o método compreende a administração ao paciente de um número

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165/287 eficaz de células T ativadas de acordo com a presente invenção.

[00320] A presente invenção refere-se também ao uso de qualquer um dos peptídeos descritos, de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, de um vetor de expressão de acordo com a presente invenção, de uma célula de acordo com a presente invenção ou de um linfócito T citotóxico ativado de acordo com a presente invenção como medicamento ou para fabricação de um medicamento. A presente invenção refere-se também a um uso de acordo com a presente invenção, onde o medicamento possui atividade anticâncer.

[00321] A presente invenção refere-se também a um uso de acordo com a invenção, na qual o medicamento é uma vacina. A presente invenção refere-se também a um uso de acordo com a invenção, onde o medicamento possui atividade anticâncer.

[00322] A presente invenção se refere também a um uso de acordo com a invenção, onde as referidas células cancerosas são células de câncer de ovário ou células de outros tumores sólidos ou hematológicos, tais como carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, leucemia linfocítica crônica, linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda, câncer da vesícula biliar e colangiocarcinoma, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e mesotelioma.

[00323] A presente invenção refere-se também a proteínas marcadoras específicas e a biomarcadores baseados nos peptídeos de acordo com a presente invenção, doravante denominados alvos, que podem ser utilizados para diagnóstico e/ou determinação do prognóstico de câncer de ovário. A presente invenção refere-se também ao uso desses novos agentes para tratamento do câncer.

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166/287 [00324] O termo anticorpo ou anticorpos é aqui utilizado em sentido amplo e inclui tanto anticorpos policlonais como monoclonais. Além de moléculas de imunoglobulina intactas ou completas, o termo anticorpos abrange também fragmentos (por exemplo, fragmentos CDRs, Fv, Fab e Fc) ou polímeros dessas moléculas de imunoglobulina e versões humanizadas de moléculas de imunoglobulina, conquanto apresente qualquer uma das propriedades desejadas (por exemplo, ligação específica a (poli)peptídeos marcadores de câncer de ovário, transporte de uma toxina a uma célula de câncer de ovário que expresse um gene marcador tumoral em níveis mais elevados e/ou inibição da atividade de um peptídeo marcador de câncer de ovário) de acordo com a invenção.

[00325] Sempre que possível, os anticorpos da invenção podem ser adquiridos de fontes comerciais. Os anticorpos da invenção também podem ser gerados usando-se métodos bem conhecidos. Os versados na técnica compreenderão que os polipeptídeos marcadores de câncer de ovário (completos ou em fragmentos) podem ser usados para gerar os anticorpos da invenção. Um polipeptídeo para uso na geração de um anticorpo da invenção pode ser total ou parcialmente purificado a partir de uma fonte natural ou pode ser produzido usando-se técnicas de DNA recombinante.

[00326] Por exemplo, um peptídeo que codifica cDNA de acordo com a presente invenção, tal como o peptídeo de acordo com os polipeptídeos SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 ou uma variante ou fragmento do mesmo pode ser expresso em células procariotas (por exemplo, bactérias) ou eucariotas (por exemplo, células de leveduras, insetos ou mamíferos). Em seguida, a proteína recombinante pode ser purificada e usada para gerar uma preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais que se liga especificamente ao peptídeo marcador de câncer de ovário usado para gerar o anticorpo de acordo com a invenção.

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167/287 [00327] Os versados na técnica perceberão que a geração de dois ou mais conjuntos diferentes de anticorpos monoclonais ou policlonais maximiza a possibilidade de obter um anticorpo com a especificidade e a afinidade necessárias para o uso pretendido (por exemplo, ELISA, imunohistoquímica, imagem in vivo, imunoterapia com toxinas). Os anticorpos foram testados para avaliar se possuíam a atividade desejada usando-se métodos conhecidos de acordo com o propósito para o qual os anticorpos serão empregados (por exemplo, ELISA, imunohistoquímica, imunoterapia, etc.; para mais informações sobre a geração e teste de anticorpos, consulte, por exemplo, Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Por exemplo, os anticorpos podem ser testados em ensaios ELISA, Western Blot ou coloração imunohistoquímica de cânceres fixados em formalina ou cortes de tecido congelado. Após serem caracterizados inicialmente in vitro, os anticorpos destinados a emprego terapêutico ou diagnóstico in vivo são testados de acordo com métodos de ensaio clínico bem conhecidos.

[00328] Conforme aqui utilizado, o termo anticorpo monoclonal refere-se a um anticorpo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por mutações que podem ocorrer naturalmente e estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais aqui descritos incluem especificamente anticorpos quiméricos nos quais uma parte das cadeias leves e/ou pesadas é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes de anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos específicos, ao passo que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes de anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, conquanto apresentem a atividade antagonista deseja

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168/287 da (Pat. US 4.816.567, que fica aqui integralmente incorporada).

[00329] Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser preparados usando métodos com hibridomas. Em um método com hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado é tipicamente imunizado com um agente imunizante para produzir linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente ao agente imunizante. Como alternativa, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

[00330] Os anticorpos monoclonais também podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante, tais como os descritos em US 4.816.567. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais da invenção pode ser prontamente isolado e sequenciado mediante procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas de anticorpos murinos).

[00331] Os métodos in vitro também são apropriados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos dos mesmos, sobretudo fragmentos Fab, pode ser realizada usando-se técnicas rotineiras conhecidas na técnica. Por exemplo, a digestão pode ser realizada usando-se papaína. Alguns exemplos de digestão por papaína são descritos em WO 94/29348 e Pat. US 4.342.566. A digestão de anticorpos por papaína geralmente produz dois fragmentos idênticos ligantes de antígenos denominados fragmentos Fab, cada um dos quais com um único sítio de ligação de antígenos e um fragmento Fc residual. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 e um fragmento pFc'.

[00332] Sejam ou não conectados a outras sequências, os fragmentos de anticorpos podem incluir inserções, deleções, substituições ou outras modificações selecionadas de regiões específicas ou de resíduos de aminoácidos específicos, com a condição de que a atividade

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169/287 do fragmento não seja significativamente alterada ou prejudicada em comparação com o anticorpo ou fragmento de anticorpo não modificado. Essas modificações podem proporcionar novas propriedades, como a retirada ou inclusão de aminoácidos capazes de formar pontes dissulfeto para aumentar a biolongevidade, alterar as caraterísticas secretórias, etc. Em qualquer caso, o fragmento de anticorpos deve possuir uma propriedade bioativa, como atividade de ligação, regulação da ligação no domínio de ligação, etc. As regiões funcionais ou ativas do anticorpo podem ser identificadas por mutagênese de uma região específica da proteína, seguida de expressão e teste do polipeptídeo expresso. Tais métodos, que serão prontamente evidentes para os versados na técnica, podem incluir mutagênese em sítios específicos do ácido nucleico codificador do fragmento de anticorpo.

[00333] Os anticorpos da invenção também podem compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (como Fv, Fab, Fab' ou outra subsequência ligante de antígeno de um anticorpo) que contêm a sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região determinante complementar (CDR, complementary determining region) do receptor são substituídas por resíduos do CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) como camundongo, rato ou coelho, que tenha especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem no CDR importado ou nas sequências da estrutura. Em geral, os anticor

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170/287 pos humanizados compreendem basicamente ao menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis nos quais todas ou substancialmente todas as regiões do CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Idealmente, o anticorpo humanizado compreende também ao menos parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente uma região de imunoglobulina humana.

[00334] Os métodos de humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. De forma geral, um anticorpo humanizado recebe um ou mais resíduos de aminoácidos obtidos de uma fonte não humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente denominados resíduos importados, pois são obtidos de um domínio variável importado. Essencialmente, a humanização pode ser realizada usando-se CDRs ou sequências de CDR de roedores para substituir sequências correspondentes de um anticorpo humano. Portanto, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Pat. US 4.816.567) nos quais uma porção substancialmente menor que um domínio variável humano intacto foi substituída pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e talvez alguns resíduos de FR foram substituídos por resíduos de sítios análogos de anticorpos de roedores.

[00335] Podem ser empregados animais transgênicos (por exemplo, camundongos) capazes de, quando imunizados, produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene na região juncional da cadeia pesada dos anticorpos em camundongos quiméricos com mutação germinativa inibe completamente a produção endógena de anticorpos. Nesses camun

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171/287 dongos com mutação germinativa, a transferência do conjunto de genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana leva à produção de anticorpos humanos após exposição antigênica. Também é possível produzir anticorpos humanos usando bibliotecas de exposição de fagos.

[00336] Preferivelmente, os anticorpos da invenção devem ser administrados a indivíduos em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em geral, usa-se uma formulação contendo uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável para tornar a formulação isotônica. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 8, e mais preferivelmente de cerca de 7 a cerca de 7,5. Outros veículos possíveis são preparações de liberação prolongada como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, sendo que as matrizes possuem o formato de artigos moldados (por exemplo, filmes, lipossomos ou micropartículas). Os versados na técnica perceberão que alguns veículos podem ser mais preferíveis, dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração do anticorpo a ser administrado.

[00337] Os anticorpos podem ser administrados ao indivíduo, paciente ou célula por injeção (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular) ou por outros métodos, como a infusão, para garantir a introdução na circulação de forma eficaz. Os anticorpos também podem ser administrados pelas vias intra ou peritumoral para que produzam efeitos terapêuticos locais e sistêmicos. A injeção local ou intravenosa é preferida.

[00338] As doses efetivas e cronogramas de administração dos anticorpos podem ser determinados empiricamente, e a realização dessas determinações são contempladas pelas habilidades conhecidas na

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172/287 técnica. Os versados na técnica compreenderão que a dose de anticorpos que precisa ser administrada variará dependendo, por exemplo, do indivíduo que receberá o anticorpo, da via de administração, do tipo específico de anticorpo utilizado e de outros fármacos administrados. Uma dose diária típica do anticorpo usado isoladamente pode variar de cerca de 1 pg/kg até 100 mg/kg de peso corporal por dia, dependendo dos fatores mencionados anteriormente. Após administração de um anticorpo, preferivelmente para tratamento de câncer de ovário, pode-se avaliar avaliar a eficácia do anticorpo terapêutico de várias maneiras bem conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, o tamanho, o número e/ou a distribuição do câncer em um indivíduo em tratamento podem ser monitorados por técnicas padrão de imagem tumoral. Um anticorpo administrado com finalidade terapêutica que detenha o crescimento tumoral, faça o tumor encolher e/ou impeça que surjam novos tumores (em relação a como a doença evoluiría se não se administrasse o anticorpo) constitui um anticorpo eficaz para tratamento de câncer.

[00339] Outro aspecto da invenção é o fornecimento de um método de produção de um receptor de células T solúvel (sTCR) que reconheça um complexo peptídeo-MHC específico. Esses receptores de células T solúveis podem ser gerados a partir de clones específicos de células T, e sua afinidade pode ser aumentada por mutagênese nas regiões determinantes de complementaridade. Para selecionar receptores de células T, pode-se empregar a exibição em fagos (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). Para estabilizar os receptores de células T durante a exibição em fagos e em aplicações práticas envolvendo seu uso como fármaco, podem-se ligar as cadeias alfa e beta uma à outra por, por exemplo, ligações dissulfeto não nativas, outras ligações covalentes (receptor de células T de cadeia única) ou domínios de dimerização (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et

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173/287 al., 1999). 0 receptor de célula T pode ser ligado a toxinas, fármacos, citocinas (ver, por exemplo, US 2013/0115191), domínios de recrutamento de células efetoras (por exemplo, domínio anti-CD3), etc., para executar funções específicas em células-alvo. O receptor também pode ser expresso em células T usadas para transferência adotiva. Para mais informações, consulte WO 2004/033685A1 e WO 2004/074322A1. Uma combinação de sTCRs é descrita em WO 2012/056407A1. Outros métodos para sua produção são revelados em WO 2013/057586A1.

[00340] Os peptídeos e/ou TCRs ou anticorpos ou outras moléculas ligantes da presente invenção podem ser usadas também para verificar o diagnóstico de câncer de um patologista a partir de uma amostra de biópsia.

[00341] Os anticorpos ou TCRs também podem ser usados para ensaios diagnósticos In vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado por um radionuclídeo (como ¹¹¹1n, Tc, ¹⁴C, ¹³¹1, ³H, ³²P ou ³⁵S) para que se possa localizar o tumor por imunocintigrafia. Em uma modalidade, anticorpos ou fragmentos dos mesmos se ligam aos domínios extracelulares de dois ou mais alvos de uma proteína selecionada do grupo formado pelas proteínas supramencionadas, e o coeficiente de afinidade (Kd) é menor que 1x10 μΜ.

[00342] Os anticorpos para uso diagnóstico podem ser marcados com sondas apropriadas para detecção por vários métodos de imagem. São métodos para detecção de sondas, entre outros, fluorescência, microscopia óptica, confocal ou eletrônica; imagem e espectroscopia de ressonância magnética; fluoroscopia; tomografia computadorizada; e tomografia por emissão de positrons. São sondas apropriadas, entre outras, fluoresceína, rodamina, eosina e outros fluoróforos, radioisotopes, ouro, gadolínio e outros lantanídeos, ferro paramagnético, flúor-18 e outros radionuclídeos emissores de positrons. As sondas

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174/287 também podem ser bi ou multifuncionais e os métodos de detecção podem incluir mais de um dos métodos listados anteriormente. Esses anticorpos podem ser marcados direta ou indiretamente pelas referidas sondas. A conexão das sondas aos anticorpos requer ligação covalente da sonda, incorporação da sonda ao anticorpo e ligação covalente de um composto quelante para ligação da sonda, entre outros procedimentos bem conhecidos na técnica. Para imunohistoquímica, a amostra de tecido patológico pode ser fresca, congelada ou emblocada em parafina e fixada com um conservante como a formalina. O corte fixado ou emblocado contendo a amostra é colocado em contato com um anticorpo primário marcado e com um anticorpo secundário, sendo que o anticorpo é usado para detectar a expressão de proteínas in situ.

[00343] Outro aspecto da presente invenção inclui um método in vitro de produção de células T ativadas, sendo que o método compreende colocar células T em contato in vitro com moléculas de MHC humano expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos por um período suficientemente longo para ativar a célula T de forma específica para o antígeno, sendo que o antígeno é um peptídeo de acordo com a invenção. Preferivelmente, emprega-se uma quantidade de antígeno apropriada junto com uma célula apresentadora de antígeno.

[00344] Preferivelmente, as células de mamíferos não possuem ou apresentam níveis reduzidos de função do transportador de peptídeos TAP. Algumas células apropriadas, que não possuem o transportador de peptídeos TAP, são as células T2, RMA-S e células de drosófila. O TAP é o transportador associado ao processamento de antígenos.

[00345] A linhagem celular T2, que é deficiente em carregamento de peptídeos humanos, está disponível na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA,

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175/287 sob o n^Q de catálogo CRL 1992; a linhagem celular de drosófila Schneider 2 está disponível na ATCC sob o n^Q de catálogo CRL 19863; e a linhagem celular de camundongo RMA-S é descrita em Ljunggren e/a/(Ljunggren and Karre, 1985).

[00346] Preferivelmente, antes da transfecção a célula hospedeira praticamente não expressa moléculas de MHC classe I. Também é preferível que a célula estimulatória expresse uma molécula importante para o fornecimento de um sinal coestimulatório para células T, tais como qualquer um entre B7.1, B7.2, ICAM-1 e LFA 3. As sequências de ácidos nucleicos de várias moléculas de MHC classe I e de moléculas coestimulatórias estão disponíveis publicamente nos bancos de dados GenBank e EMBL.

[00347] No caso de epítopos de MHC classe I usados como antígeno, as células T são células T CD8-positivas.

[00348] Se uma célula apresentadora de antígeno for transfectada para expressar um desses epítopos, a célula deve compreender, preferivelmente, um vetor de expressão capaz de expressar um peptídeo contendo SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 ou uma sequência de aminoácidos variante dos mesmos.

[00349] Diversos outros métodos podem ser usados para gerar células T in vitro. Por exemplo, linfócitos autólogos infiltrantes de tumores podem ser usados para geração de LTC. Plebanski etal. (Plebanski et al., 1995) utilizaram linfócitos autólogos de sangue periférico (PLBs) para preparar células T. Pode-se produzir células T citotóxicas autólogas pulsando células dendríticas com peptídeos ou polipeptídeos ou mediante infecção por um vírus recombinante. As células B também podem ser usadas para produzir células T autólogas. Macrófagos pulsados com peptídeos ou polipeptídeos ou infectados com vírus recombinantes também podem ser usados para preparar células T autólogas. S. Walter et al. (Walter et al., 2003) descreveram a preparação

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176/287 (priming) in vitro de células T por meio de células apresentadoras de antígenos (aAPCs) artificiais, que também são uma maneira apropriada de gerar células T contra o peptídeo escolhido. Na presente invenção, as aAPCs foram geradas acoplando-se complexos MHC-peptídeo pré-formados à superfície de partículas de poliestireno (microesférulas) por bioquímica de biotina:estreptavidina. Esse sistema permite controlar exatamente a densidade de MHC sobre as aAPCs, permitindo induzir, de forma seletiva e altamente eficiente, respostas de células T específicas para antígenos de avidez baixa ou elevada em amostras de sangue. Além dos complexos de MHC com peptídeo, as aAPCs devem transportar outras proteínas com atividade coestimulatória como anticorpos anti-CD28 acoplados à sua superfície. Além disso, tais sistemas à base de aAPC frequentemente requerem adição de fatores solúveis apropriados, como, por exemplo, citocinas como a interleucina 12.

[00350] Células alogênicas também podem ser usadas para preparar células T, e um método é descrito detalhadamente em WO 97/26328, que fica aqui incorporada por referência. Por exemplo, além de células de drosófila e células T2, podem-se usar outras células para apresentar antígenos, tais como células CHO, células de inseto infectadas por baculovírus, bactérias, leveduras e células-alvo infectadas por vacínia. Também podem ser usados vírus de plantas (ver, por exemplo, Porta et al. (Porta et al., 1994), que descreve o desenvolvimento do vírus do mosaico de caupi como um sistema de alto rendimento para apresentação de peptídeos exógenos).

[00351] As células T ativadas direcionadas contra os peptídeos da invenção possuem utilidade terapêutica. Portanto, outro aspecto da invenção fornece células T ativadas que podem ser obtidas pelos métodos da invenção apresentados anteriormente.

[00352] As células T ativadas produzidas pelo método descrito an

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177/287 teriormente reconhecem seletivamente células com expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos do grupo SEQ N^Q1 a SEQ N^Q 772.

[00353] Preferivelmente, a célula T reconhecerá a célula ao interagir através de seu TCR com o complexo HLA-peptídeo (por exemplo, ligação). As células T são úteis em um método de destruição célulasalvo em um paciente cujas células-alvo apresentem expressão aberrante de um polipeptídeo que compreenda uma sequência de aminoácidos da invenção, sendo que o paciente recebe um número eficaz de células T ativadas. As células T administradas ao paciente podem ser derivadas do próprio paciente e ativadas conforme descrito anteriormente (isto é, são células T autólogas). Alternativamente, as células T não são do paciente, mas de outro indivíduo. Evidentemente, preferese que o indivíduo seja um indivíduo saudável. Por indivíduo saudável, os inventores designam um indivíduo com boa saúde geral, preferivelmente com um sistema imune competente e, mais preferivelmente, que não apresente nenhuma doença que possa ser facilmente detectada por exames.

[00354] In vivo, as células-alvo das células T CD8-positivas de acordo com a presente invenção podem ser células tumorais (que às vezes expressam MHC classe II) e/ou células estromais que circundam o tumor (células tumorais) (que às vezes também expressam MHC classe II (Dengjel etal., 2006)).

[00355] As células T da presente invenção podem ser utilizadas como ingredientes ativos de uma composição terapêutica. Portanto, a invenção fornece também um método de destruição de células-alvo em um paciente cujas células-alvo apresentam expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos da invenção, sendo que o método compreende administrar ao paciente um número eficaz de células T, conforme definido anteriormente.

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178/287 [00356] Com o termo expressão aberrante, os inventores também querem dizer que o polipeptídeo é sobrexpresso em comparação com os níveis de expressão em tecidos normais ou que o gene é expresso no tumor apesar de permanecer silencioso no tecido do qual o tumor é derivado. Com o termo sobrexpresso, os autores querem dizer que o peptídeo está presente em níveis pelo menos 1,2 vez o nível encontrado no tecido normal, preferivelmente pelo menos 2 vezes e, mais preferivelmente pelo menos 5 ou 10 vezes o nível encontrado no tecido normal.

[00357] As células T podem ser obtidas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, os métodos descritos anteriormente.

[00358] Os protocolos para a chamada transferência adotiva de células T são bem conhecidos na técnica. São apresentadas revisões em Gattioni et al. e Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006) [00359] Outro aspecto da presente invenção inclui o uso de peptídeos em complexo com MHC para gerar um receptor de células T cujo ácido nucleico seja clonado e introduzido na célula hospedeira, preferivelmente uma célula T. Essa célula T modificada pode então ser introduzida em um paciente para tratamento do câncer.

[00360] Qualquer molécula da invenção, isto é, o peptídeo, ácido nucleico, anticorpo, vetor de expressão, célula, célula T ativada, receptor de célula T ou ácido nucleico que o codifique, é útil no tratamento de distúrbios caracterizados por células que escapam de uma resposta imune. Portanto, qualquer molécula da presente invenção pode ser empregada como medicamento ou na fabricação de um medicamento. A molécula pode ser empregada isoladamente ou combinada com outras moléculas da invenção ou com moléculas conhecidas.

[00361] A presente invenção refere-se também a um kit que compreende:

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179/287 [00362] um recipiente que contém uma composição farmacêutica conforme descrito anteriormente, em solução ou em forma liofilizada;

[00363] opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução para reconstituição de uma formulação liofilizada; e [00364] opcionalmente, instruções de (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e/ou uso da formulação liofilizada.

[00365] O kit pode compreender também um ou mais dentre (iii) um tampão, (iv) um diluente, (v) um filtro, (vi) uma agulha ou (v) uma seringa. O recipiente é preferivelmente um frasco, uma ampola, uma seringa ou um tubo de ensaio e pode ser um recipiente multiuse. A composição farmacêutica é preferivelmente liofilizada.

[00366] Kits da presente invenção, compreendendo preferivelmente uma formulação liofilizada da presente invenção em um recipiente apropriado e instruções para sua reconstituição e uso. São recipientes adequados, por exemplo, frascos, ampolas (por exemplo, ampolas de câmara dupla), seringas (como seringas de câmara dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser constituído de diversos materiais como vidro ou plástico. Preferivelmente, o kit e/ou o recipiente contêm instruções no ou associadas ao recipiente que apresentam instruções para reconstituição e/ou uso. Por exemplo, o rótulo pode indicar que a formulação liofilizada pode ser reconstituída até atingir as concentrações peptídicas descritas anteriormente. O rótulo também pode indicar que a formulação é útil ou destina-se a administração subcutânea.

[00367] O recipiente contendo a formulação pode ser um frasco multiuse, que permite administrações repetidas (por exemplo, de 2 a 6 administrações) da formulação reconstituída. O kit pode compreender também um segundo recipiente que contém um diluente apropriado (por exemplo, solução de bicarbonate de sódio).

[00368] Ao misturar o diluente e a formulação liofilizada, a concentração final do peptídeo na formulação reconstituída é preferivelmente

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180/287 pelo menos 0,15 g/mL/peptídeo (75 pg) e preferivelmente não mais que 3 mg/mL/peptídeo (1500 pg). O kit pode incluir também outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, como outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso.

[00369] Os kits da presente invenção podem conter um único recipiente que contém a formulação das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, com ou sem outros componentes (por exemplo, outros compostos ou composições farmacêuticas desses outros compostos) ou pode possuir recipientes distintos para cada componente.

[00370] Preferivelmente, os kits da presente invenção contêm uma formulação farmacêutica embalada para uso em associação com a coadministração de um segundo composto (como os adjuvantes (por exemplo, GM-CSF), um agente quimioterápico, um produto natural, um hormônio ou antagonista, um agente antiangiogênese ou inibidor, um agente indutor de apoptose ou um quelante) ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Os componentes do kit podem ser précomplexados ou cada componente pode ser fornecido em um recipiente diferente e separado antes da administração a um paciente. Os componentes do kit podem ser fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, preferivelmente soluções aquosas e, mais preferivelmente, soluções aquosas estéreis. Os componentes do kit também podem ser fornecidos no estado sólido e serem convertidos em líquido adicionando-se solventes apropriados, que são preferivelmente fornecidos em outro recipiente separado.

[00371] O recipiente de um kit terapêutico pode ser uma ampola, tubo de ensaio, frasco, garrafa, seringa ou qualquer outro meio de envasar um sólido ou líquido. Usualmente, quando existe mais de um componente, o kit conterá um segundo frasco ou outro recipiente, que

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181/287 permitirá administração separada. O kit também pode conter outro recipiente para um líquido farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, um kit terapêutico contém um aparato (por exemplo, uma ou mais agulhas, seringas, conta-gotas, pipetas, etc.), que permite administrar os agentes da invenção que são componentes do presente kit.

[00372] A presente formulação é de um tipo apropriado para administração de peptídeos por qualquer via aceitável, como a oral (entérica), nasal, oftálmica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou transdérmica. A administração deve ser preferivelmente s.c. e, mais preferivelmente, i.d., podendo também ser realizada por uma bomba de infusão.

[00373] Como os peptídeos da invenção foram isolados de câncer de ovário, o medicamento da invenção é usado preferivelmente para tratar câncer de ovário.

[00374] A presente invenção refere-se também a método de produção de um medicamento personalizado para um paciente individual, que compreende a fabricação de uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um peptídeo selecionado de um depósito de TUMAPs pré-selecionados, no qual pelo menos um peptídeo empregado na composição farmacêutica é selecionado conforme seja mais apropriado para o paciente individual. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é uma vacina. O método também pode ser adaptado para produzir clones de células T para aplicações subsequentes, tais como isolamento de TCR, ou anticorpos solúveis e outras opções de tratamento.

[00375] Medicamento personalizado significa tratamentos adaptados especificamente a um paciente e que serão usados apenas para tratamento desse paciente, incluindo vacinas anticâncer personalizadas ativamente e terapias adotivas com células usando tecido autólogo do paciente.

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182/287 [00376] Conforme aqui utilizado, o termo depósito refere-se a um grupo ou conjunto de peptídeos pré-selecionados por sua imunogenicidade e apresentação aumentada em um determinado tipo de tumor. O termo depósito não pretende sugerir que os peptídeos específicos incluídos na vacina foram pré-fabricados e armazenados em uma instalação física, embora se contemple essa possibilidade. Contempla-se expressamente que os peptídeos podem ser fabricados de novo para cada vacina individualizada fabricada ou podem ser pré-fabricados e armazenados. O depósito (por exemplo, na forma de um banco de dados) é formado por peptídeos associados a tumores com níveis elevados de sobrexpressão no tecido tumoral de pacientes com Igualmente, o ALPPL2 também foi descrito como possível marcador diagnóstico de adenocarcinoma ductal pancreático e diversos alelos de HLA-A, HLAB e HLA-C. O depósito pode conter peptídeos de MHC classe I ou MHC classe II ou peptídeos alongados de MHC classe I. Além dos peptídeos associados a tumores obtidos de diversos tecidos de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, o depósito pode conter peptídeos marcadores de HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 e HLA-B*44. Esses peptídeos permitem comparar quantitativamente a magnitude da imunidade mediada por células T induzida por TUMAPs, permitindo assim tirar importantes conclusões sobre a capacidade da vacina de produzir respostas antitumorais. Segundo, os peptídeos funcionam como importantes controles positivos derivados de um antígeno não próprio (non-self) nos casos em que não se observam respostas de células T induzidas pela vacina a TUMAPs derivados de antígenos próprios (self) em um paciente. Terceiro, eles podem permitir tirar conclusões sobre o nível de imunocompetência do paciente.

[00377] Os TUMAPs usados para constituir o depósito foram identificados por meio de uma abordagem de genômica funcional integrada

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183/287 que combina análise de expressão gênica, espectrometria de massa e imunologia de células T (/President®). Essa abordagem garante que apenas TUMAPs que estejam realmente presentes em uma porcentagem elevada de tumores e sejam minimamente ou nada expressos em tecidos normais sejam selecionados para análises posteriores. Para seleção inicial de peptídeos, amostras de câncer de ovário de pacientes e sangue de doadores saudáveis foram analisados em etapas: [00378] Ligantes de HLA do material maligno foram identificados por espectrometria de massa.

[00379] A análise da expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) em todo o genoma foi usada para identificar genes sobrexpressos em tecidos malignos (câncer de ovário) em comparação com uma série de órgãos e tecidos normais.

[00380] Os ligantes de HLA identificados foram comparados com os dados de expressão gênica. Os peptídeos apresentados em tecidos tumorais, preferivelmente codificados por genes expressos seletivamente ou expressos de forma excessiva conforme detectados na etapa 2, foram considerados candidatos a TUMAPs apropriados para uma vacina multipeptídica.

[00381] Uma busca na literatura foi realizada para identificar mais evidências indicativas da relevância dos peptídeos identificados como TUMAPs.

[00382] A relevância da sobrexpressão ao nível de mRNA foi confirmada pela detecção dos TUMAPs selecionados na etapa 3 em tecido tumoral e pela detecção baixa ou ausente em tecidos saudáveis.

[00383] Para avaliar a viabilidade da indução de respostas de células T in vivo pelos peptídeos selecionados, foram realizados ensaios de imunogenicidade in vitro usando células T humanas de doadores saudáveis e de pacientes com câncer de ovário.

[00384] Em um aspecto, os peptídeos são pré-selecionados por sua

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184/287 imunogenicidade antes de serem incluídos no depósito. A título exemplificative e não limitante, a imunogenicidade dos peptídeos incluídos no depósito é determinada por um método que compreende a preparação (priming) in vitro de células T mediante estimulações repetidas de células T CD8+ de doadores saudáveis com células apresentadoras de antígenos artificiais carregadas com complexos de peptídeo com MHC e anticorpo anti-CD28.

[00385] Esse método é preferido para cânceres raros e pacientes com perfis de expressão raros. Ao contrário dos coquetéis multipeptídicos com composição fixa desenvolvidos atualmente, o depósito permite obter correspondências significativamente melhores entre a vacina e a expressão efetiva de antígenos do tumor. Peptídeos selecionados disponíveis comercialmente ou combinações dos mesmos serão usados para cada paciente em uma abordagem multialvo. Teoricamente, uma abordagem baseada na seleção de, por exemplo, 5 peptídeos antigênicos diferentes de uma biblioteca de 50 proporcionaria cerca de 17 milhões de possíveis composições de produtos medicamentosos (PM).

[00386] Em um aspecto, os peptídeos são selecionados para inclusão na vacina com base em sua adequação ao paciente individual baseado no método de acordo com a presente invenção conforme aqui descrito ou conforme apresentado a seguir.

[00387] Os dados de fenótipo de HLA, transcriptoma e peptidoma são coligidos do material obtido do tumor do paciente e de amostras de sangue para identificar os peptídeos mais apropriados para cada paciente contendo TUMAPs do depósito específicos para o paciente (isto é, mutantes). Serão selecionados peptídeos expressos de forma excessiva ou seletiva nos tumores dos pacientes e que, sempre que possível, mostrem forte imunogenicidade in vitro quando testados com células mononucleares do sangue periférico (CMSPs) do paciente.

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185/287 [00388] Preferivelmente, os peptideos incluídos na vacina são identificados por um método que compreende: (a) identificação de peptideos associados ao tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual; (b) comparação dos peptideos identificados em (a) com um depósito (banco de dados) de peptideos conforme descrito anteriormente; e (c) seleção de pelo menos um peptídeo do depósito (banco de dados) que se correlacione com um peptídeo associado ao tumor identificado no paciente. Por exemplo, os TUMAPs apresentados em amostras tumorais são identificados da seguinte maneira: (a1) comparação dos dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido da amostra tumoral para identificar proteínas que são sobrexpressas ou apresentam expressão aberrante na amostra tumoral; e (a2) correlação dos dados de expressão com sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC classe I e/ou classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas sobrexpressas ou expressas de forma aberrante pelo tumor. Preferivelmente, as sequências dos ligantes de MHC são identificadas eluindo-se os peptideos ligados das moléculas de MHC isoladas da amostra tumoral e sequenciando-se os ligantes eluídos. Preferivelmente, a amostra de tumor e a amostra de tecido normal devem ser obtidas do mesmo paciente.

[00389] Além de, ou como alternativa a, selecionar peptideos usando um modelo de depósito (banco de dados), os TUMAPs podem ser identificados em pacientes de novo e incluídos na vacina. Como exemplo, os TUMAPs candidatos podem ser identificados no paciente da seguinte maneira: (a1) comparação dos dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido da amostra tumoral para identificar proteínas que são sobrexpressas ou apresentam expressão

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186/287 aberrant© na amostra tumoral; e (a2) correlação dos dados de expressão com sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC classe I e/ou classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas sobrexpressas ou expressas de forma aberrante pelo tumor. Como outro exemplo, podem-se identificar proteínas que contêm mutações específicas para a amostra tumoral em relação ao tecido normal correspondente de um paciente individual, e podem-se identificar TUMAPs que atuam especificamente sobre a mutação. Por exemplo, os genomas do tumor e do tecido normal correspondente podem ser sequenciados por sequenciamento de genoma inteiro. Para descobrir mutações não sinônimas nas regiões codificadoras de proteínas dos genes, o DNA e o RNA genômicos são extraídos de tecidos tumorais e o DNA germinativo não mutante do genoma normal é extraído de células mononucleares do sangue periférico (CMSPs). A abordagem NGS aplicada restringe-se ao ressequenciamento de regiões codificadoras de proteínas (ressequenciamento do exoma). Para essa finalidade, o DNA exônico de amostras humanas é capturado usando kits de enriquecimento fornecidos comercialmente seguido por sequenciamento usando, por exemplo, um instrumento HiSeq2000 (Illumina). O mRNA tumoral também é sequenciado para quantificação direta da expressão gênica e validação do fato de que os tumores dos pacientes expressam os genes mutantes. As milhões de leituras de sequências assim produzidas são processadas por algoritmos em software. A lista produzida contém mutações e expressão gênica. As mutações somáticas específicas para tumores são determinadas comparando-se as variações germinativas derivadas de CMSP, e essas derivações recebem prioridade. Os peptídeos identificados de novo podem então ter sua imunogenicidade testada conforme descrito anteriormente em relação ao depósito, e os TUMAPs candidatos que possuírem imunogenicidade apropriada são selecionados para inclu

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187/287 são na vacina.

[00390] Em uma modalidade exemplar, os peptídeos incluídos na vacina são identificados pelo seguinte procedimento: (a) identificação de peptídeos associados a tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual usando o método descrito anteriormente; (b) comparação dos peptídeos identificados na etapa a) com um depósito de peptídeos pré-selecionados de acordo com a imunogenicidade e apresentação aumentada em tumores em comparação com os tecidos normais correspondentes; (c) seleção de pelo menos um peptídeo do depósito que se correlaciona com um peptídeo associado a tumores identificado no paciente; e (d) opcionalmente, seleção de pelo menos um peptídeo identificado de novo em (a) para confirmar sua imunogenicidade.

[00391] Em uma modalidade exemplar, os peptídeos incluídos na vacina são identificados pelo seguinte procedimento: (a) identificação de peptídeos associados a tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual; e (b) seleção de pelo menos um peptídeo identificado de novo em (a) para confirmar sua imunogenicidade.

[00392] Uma vez selecionados os peptídeos para uma vacina peptídica personalizada, a vacina é produzida. Preferivelmente, a vacina é uma formulação líquida que consiste em peptídeos individuais dissolvidos em 20% a 40% de DMSO, preferivelmente de 30% a 35% de DMSO, como cerca de 33% de DMSO.

[00393] Todos os peptídeos a serem incluídos em um produto são dissolvidos em DMSO. A concentração das soluções de peptídeo único deve ser escolhida em função do número de peptídeos a serem incluídos no produto. Soluções de um peptídeo em DMSO são misturadas em partes iguais para criar uma solução contendo todos os peptídeos a serem incluídos no produto a uma concentração de ~2,5 mg/ml

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188/287 por peptídeo. A solução misturada é então diluída 1:3 em água para injeção de modo a atingir uma concentração de 0,826 mg/ml por peptídeo em DMSO a 33%. A solução diluída é filtrada por um filtro estéril de 0,22 pm. A solução bruta final é obtida.

[00394] A solução bruta final é acondicionada em ampolas e armazenada a -20Ό até o momento do uso. Cada ampola co ntém 700 pl_ de uma solução que contém 0,578 mg de cada peptídeo. Destes, 500 μΙ_ (cerca de 400 μρ por peptídeo) serão administrados por injeção intradérmica.

[00395] Além de ser usados no tratamento do câncer, os peptídeos da presente invenção também têm aplicações diagnosticas. Como os peptídeos foram gerados a partir de células de câncer de ovário e como se determinou que esses peptídeos estão pouco ou nada presentes em tecidos normais, esses peptídeos podem ser utilizados para diagnosticar a presença de um câncer.

[00396] A presença dos peptídeos reivindicados em biópsias de tecidos ou em amostras de sangue pode ajudar um patologista a diagnosticar câncer. A detecção de determinados peptídeos por meio de anticorpos, espectrometria de massa ou outros métodos conhecidos na técnica pode dizer ao patologista que a amostra de tecido é maligno, está inflamado ou apresenta patologia em geral ou pode ser usada como biomarcador de câncer de ovário. A presença de grupos de peptídeos pode permitir a classificação ou subclassificação de tecidos patológicos.

[00397] A detecção de peptídeos em amostras de tecido doente pode permitir a decisão sobre o benefício de tratamentos que envolvem o sistema imune, sobretudo se os linfócitos T participarem ou se esperar que participem do mecanismo de ação. A perda da expressão de MHC é um mecanismo bem descrito pelo qual células malignas infectadas escapam da imunovigilância. Portanto, a presença de peptí

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189/287 deo mostra que esse mecanismo não é explorado pelas células analisadas.

[00398] Os peptídeos da presente invenção podem ser empregados para analisar respostas linfocitárias contra esses peptídeos, tais como respostas de células T ou de anticorpos contra o peptídeo ou contra o peptídeo em complexo com moléculas de MHC. Essas respostas podem ser usadas como marcadores prognósticos para tomar decisões sobre as próximas etapas do tratamento. Essas respostas também podem ser empregadas como marcadores de resposta sucedâneos em abordagens imunoterápicas que visam a induzir respostas linfocitárias por outros meios (por exemplo, vacinação com proteínas, ácidos nucleicos, materiais autólogos e transferência adotiva de linfócitos). No âmbito de terapias gênicas, as respostas linfocitárias contra peptídeos podem ser consideradas na avaliação dos efeitos colaterais. O monitoramento das respostas linfocitárias também pode ser um valioso recurso para exames de acompanhamento de tratamentos envolvendo transplantes; por exemplo, para detectar doença enxerto-versushospedeiro ou hospedeiro-versus-enxerto.

[00399] A presente invenção será agora descrita nos seguintes exemplos, que descrevem modalidades preferidas da mesma, com referência às figuras apresentadas a seguir, mas sem limitar-se aos exemplos. Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui citadas ficam integralmente incorporadas por referência.

FIGURAS [00400] As Figuras 1A a 1S mostram perfis de expressão exemplares de genes fonte da presente invenção que são sobrexpressos em várias amostras de câncer. Os tumores (pontos pretos) e amostras normais (pontos cinzas) são agrupados de acordo com o órgão de origem. Os gráficos de caixa de bigodes representam a mediana, 25^Q e 75^Q percentis (caixa), mínima e máxima (bigodes) de RPKM. Os ór

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190/287 gãos normais aparecem ordenados por categoria de risco. RPKM = leituras por quilobase por milhão de leituras mapeadas. Amostras normais: células sanguíneas, vasos sanguíneos, cérebro, coração, fígado, pulmão, tecido adiposo, gl. suprarr (glândula suprarrenal), dueto biliar; bexiga, MO (medula óssea), cartilagem, esôf. (esôfago), olho, vesb (vesícula biliar), cabeça-e-pescoço, rim; int.grosso (intestino grosso), LN (linfonodo), nervo, pâncreas, paratir (glândula paratireoide), hipóf (hipófise), mus.esquel (músculo esquelético); pele, int.delgado (intestino delgado), baço, estômago, tireoide, traqueia, bexiga, mama, ovário, placenta, próstata, testículo; timo e útero. Amostras tumorais: LMA: leucemia mieloide aguda; CAM: câncer de mama; LLC: leucemia linfocítica crônica; CaCR: carcinoma colorretal; CVB: câncer da vesícula biliar; GB: glioblastoma; CG: câncer gástrico; CHC: carcinoma hepatocelular; CCECP: câncer de cabeça e pescoço; MEL: melanoma; LNH: linfoma não Hodgkin; CPCNP: câncer de pulmão de células não pequenas; CO: câncer de ovário; CJEG: câncer da junção esofagogástrica; CE: câncer de esôfago; CP: câncer de pâncreas; CPr: câncer de próstata; CCR: carcinoma de células renais; CPPC: câncer de pulmão de pequenas células; CB: câncer de bexiga; CAU: câncer de útero e endométrio. Figura 1A) Símbolo do gene: CT45A2; peptídeo KYEKIFEML (SEQ N^Q 12). Figura 1B) Símbolo do gene: NLRP2; peptídeo VLYGPAGLGK (SEQ N^Q 27), Figura 1C) Símbolo do gene: NLRP7; peptídeo LLDEGAMLLY (SEQ N^Q 31), Figura 1D) Símbolo do gene: HTR3A, peptídeo GLLQELSSI (SEQ N^Q 66), Figura 1E) Símbolo do gene: VTCN1, peptídeo KVVSVLYNV (SEQ N^Q 75), Figura 1F) Símbolo do gene: CYP2W1; peptídeo RYGPVFTV (SEQ N^Q 98), Figura 1G) Símbolo do gene: MMP11; peptídeo LLQPPPLLAR (SEQ N^Q 98), Figura 1H) Símbolo do gene: MMP12; peptídeo FVDNQYWRY (SEQ N^Q 115), Figura 11) Símbolo do gene: CTAG2; peptídeo APLPRPGAVL (SEQ N^Q 119), Figura 1J) Símbolo do gene: FAM111B; pep

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191/287 tídeo KPSESIYSAL (SEQ N^Q 123), Figura 1K) Símbolo do gene: CCNA1; peptídeo HLLLKVLAF (SEQ N^Q 151), Figura 1L) Símbolo do gene: FAM83H; peptídeo HVKEKFLL (SEQ N^Q 156), Figura 1M) Símbolo do gene: MAGEA11; peptídeo KEVDPTSHSY (SEQ N^Q 194), Figura 1N) Símbolo do gene: MMP11; peptídeo YTFRYPLSL (SEQ N^Q227), Figura 10) Símbolo do gene: ZNF560; peptídeo VFVSFSSLF (SEQ N^Q 255), Figura 1P) Símbolo do gene: IGF2BP1; peptídeo ISYSGQFLVK (SEQ N^Q 266), Figura 1Q) Símbolo do gene: CLDN6; peptídeo LPMWKVTAF (SEQ N^Q 303), Figura 1R) Símbolo do gene: IGF2BP3; peptídeo IEALSGKIEL (SEQ N^Q 413), Figura 1S) Símbolo do gene: PRAME; peptídeo EEQYIAQF (SEQ N^Q 432).

[00401] As Figuras 1T a 1V mostram perfis de expressão exemplares de genes fonte da presente invenção, que são sobrexpressos em várias amostras de câncer. As amostras tumorais (pontos pretos) e normais (pontos cinzas) são agrupadas de acordo com o órgão de origem. As caixas de bigodes representam o valor mediano de FPKM, o 25^Q e o 75^Q percentis (caixa), o ponto mais baixo dentro de 1,5 do intervalo interquartis (IIQ) do quartil inferior e o ponto mais alto dentro de

1,5 do IIQ do quartil superior. Os órgãos normais aparecem ordenados por categoria de risco. FPKM: Fragmentos por quilobase por milhão de leituras mapeadas. Amostras normais: Células sanguíneas; vsang (vasos sanguíneos); cérebro; coração; fígado; pulmão; adiposo (tecido adiposo); glsuprarr (glândula suprarrenal); dueto biliar; bexiga; medula óssea; cartilagem; esôf (esôfago); olho; ves bil (vesícula biliar); cabeça&pescoço; intest. gr (intestino grosso); intest, dei (intestino delgado); rim; linfonodo; nervo perif (nervo periférico); pâncreas; paratir (glândula paratireoide); perit (peritônio); hipóf (hipófise); pleura; mus esquel. (Músculo esquelético); pele; baço; estômago; tireoide; traqueia; ureter; mama; ovário; placenta; próstata; testículo; timo; útero. Amostras tumorais: LMA (leucemia mieloide aguda); CAM (câncer de mama); CCC

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192/287 (carcinoma colangiocelular); LLC (leucemia linfocítica crônica); CaCR (câncer colorretal); CVB (câncer da vesícula biliar); GBM (glioblastoma); CG (câncer gástrico); CHC (carcinoma hepatocelular); CCECP (carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço); MEL (melanoma); LNH (linfoma não Hodgkin); adenoCPCNP (adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas); outroCPCNP (amostras de CPCNP que não podem ser caracterizadas com certeza como adenoCPCNP ou CPCNP escamoso); NSCLCescam (câncer de pulmão de células não pequenas do tipo escamoso); CO (câncer de ovário); CE (câncer de esôfago); CP (câncer de pâncreas); CPr (câncer de próstata); CCR (carcinoma de células renais); CPPC (câncer de pulmão de pequenas células); CB (carcinoma de bexiga); CAU (câncer de útero e endométrio). Figura 1T) Símbolo do gene: MAGEA4, peptídeo SPDAESLFREALSNKVDEL (SEQ N^Q 597). Figura 1U) Símbolo do gene: MAGEA4, peptídeo LSNKVDELAHFLLRK (SEQ N^Q 601). Figura 1V) Símbolo do gene: MAGEB3; peptídeo KLITQDLVKLKYLEYRQ (SEQ N^Q 604).

[00402] A Figura 2 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*02+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se APCs artificiais revestidos por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-A*02 em complexo com o peptídeo ALYGKLLKL de SEQ N^Q 773 (A, painel esquerdo). Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração 2D para multímeros com A*02/SEQ N^Q773 (A). O painel à direita (A) mostra a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*02 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão

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193/287 indicadas.

[00403] A Figura 3 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*24+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se APCs artificiais revestidos por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-A*24 em complexo com o peptídeo SEQ N^Q 774 (A, painel esquerdo). Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração com A*24/SEQ N^Q 774 (VYVDDIYVI, SEQ N^Q 774 (A). O painel direito (A) mostra a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*24 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00404] A Figura 4 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*02+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se APCs artificiais revestidos por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-A*02 em complexo com o peptídeo SLLLPSIFL de SEQ N^Q 67 (A, painel esquerdo) e com o peptídeo KVVSVLYNV de SEQ N^Q 28 (B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração com A*02/SEQ N^Q 67 (A) ou A*02/SEQ N^Q 75 (B). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*02 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

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194/287 [00405] A Figura 5 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*24+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se APCs artificiais revestidos por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-A*24 em complexo com o peptídeo SYSDLHYGF de SEQ N^Q 11 (A, painel esquerdo) e com o peptídeo SYNEHWNYL de SEQ N^Q 28 (B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração com A*24/SEQ N^Q 11 (A) ou A*24/SEQ N^Q 79 (B). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*24 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00406] A Figura 6 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-B*07+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se APCs artificiais revestidos por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-B*07 em complexo com o peptídeo SPTFHLTL de SEQ N^Q 33 (A, painel esquerdo) e KPGTSYRVTL de SEQ N^Q 40 (B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração 2D com o multímero relevante (por exemplo, B*07/SEQ N^Q 33 (A) ou B*07/SEQ N^Q 40 (B)). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de B*07 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

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195/287 [00407] A Figura 7 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*01+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se APCs artificiais revestidos por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-A*01 em complexo com o peptídeo QLDSNRLTY de SEQ N^Q 113 (A, painel esquerdo) e FVDNQYWRY de SEQ N^Q 115 (B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração 2D com o multímero relevante (por exemplo, A*01/SEQ N^Q. 113 (A) ou A*01/SEQ N^Q 115 (B)). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*01 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00408] A Figura 8 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*03+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se APCs artificiais revestidos por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-A*03 em complexo com o peptídeo GMMKGGIRK de SEQ N^Q 23 (A, painel esquerdo) e KVAGERYVYK de SEQ N^Q 90 (B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração 2D com o multímero relevante (por exemplo, A*02/SEQ N^Q. 23 (A) ou A*02/SEQ N^Q 90 (B)). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*03 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células espe

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196/287 cíficas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00409] A Figura 9 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-B*44+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se APCs artificiais revestidos por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-B*44 em complexo com o peptídeo AESIPTVSF de SEQ N^Q 200 (A, painel esquerdo) e EEKVFPSPLW de SEQ N^Q 211 (B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração 2D com o multímero relevante (por exemplo, B*44/SEQ N^Q. 200 (A) ou B*44/SEQ N^Q 211 (B)). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de B*44 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Identificação de peptídeos associados ao tumor apresentados na superfície celular

Amostras de tecido [00410] Os tecidos tumorais e tecidos normais de pacientes foram obtidos do Hospital Universitário de Tübingen (Tübingen, Alemanha). Todos os pacientes deram consentimento livre e esclarecido antes da cirurgia ou autópsia. Os tecidos foram criocongelados logo após a excisão e armazenados a -70^QC ou menos até o isolamento dos TUMAPs.

Isolamento de peptídeos de HLA de amostras de tecido [00411] Misturas de peptídeos HLA de amostras de tecido sujeitas a

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197/287 congelamento criogênico foram obtidas por imunoprecipitação de tecidos sólidos de acordo com um protocolo ligeiramente modificado (Falk etal., 1991; Seeger etal., 1999) empregando o anticorpo BB7.2, que é específico para HLA-A*02; o anticorpo W6/32, que é específico para HLA-A, B ou C; o anticorpo L243, que é específico para HLA-DR; e o anticorpo TÜ39, que é específico para HLA classe II em geral. Foram usadas sefarose ativada por CNBr, tratamento com ácido e ultrafiltração.

Análises por espectrometria de massa [00412] Os agregados de peptídeos de HLA foram obtidos e separados de acordo com sua hidrofobicidade por cromatografia de fase reversa (sistema Ultimate 3000 RSLC de Nano UHPLC, Dionex) e os peptídeos eluídos foram analisados por espectrômetros de massa híbridos LTQ Orbitrap e Fusion Lumos (ThermoElectron) equipados com fontes ESI. Amostras de peptídeos foram carregadas com 3% de solvente B (20% H2O, 80% acetonitrilo e 0,04% ácido fórmico) em uma coluna PepMap 100 C18 Nanotrap de 2 cm (Dionex) com taxa de fluxo de 4 μΙ/min por 10 minutos. A separação foi realizada em colunas PepMap C18 de 25 cm ou 50 cm com partículas de 2 μιτι (Dionex) montadas em um forno de colunas aquecido a 50Ό. O gradiente aplicado variou de 3% a 32% de solvente B durante 90 minutos com taxa de fluxo de 300 nl/min (colunas de 25 cm) ou 140 min com taxa de fluxo de 175 nl/min (colunas de 50 cm), (solvente A: H₂O 99%, ACN 1% e ácido fórmico 0,1%; solvente B: H₂O 20%, ACN 80% e ácido fórmico 0,1%).

[00413] As análises de espectrometria de massa foram realizadas em um modo de aquisição dependente de dados empregando um método de atuação sobre os cinco maiores peptídeos, ou seja, um método no qual em cada varredura os cinco íons precursores mais abundantes são selecionados para fragmentação. Alternativamente, a aná

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198/287 lise empregou um método TopSpeed usando instrumentos Fusion Lumos.

[00414] As varreduras foram realizadas no Orbitrap a uma resolução de 60.000 (Orbitrap XL) ou 120.000 (Orbitrap Fusion Lumos). A análise MS/MS foi realizada com dissociação induzida por colisão (CID, collision induced dissociation) com energia de colisão normalizada de 35%, tempo de ativação de 30 ms, largura de isolamento de

1,3 m/z) e análise subsequente em trap iônico linear quadripolar (LTQ). O intervalo de massas para ligantes de HLA classe I foi limitado em 400 a 650 m/z e os possíveis estados de carga 2+ e 3+ selecionados para fragmentação. Para HLA classe II, o intervalo de massas foi ajustado para 300 a 1500 m/z, permitindo fragmentação com todos os estados de carga positivos iguais ou maiores que 2.

[00415] Os espectros de massa em tandem foram interpretados por MASCOT ou SEQUEST com uma taxa fixa de descobertas falsas (q<0,05) e suplementadas com controle manual. Em casos onde a sequência de peptídeos identificada era incerta, ela foi submetida a mais uma etapa de validação, na qual se comparou o padrão de fragmentação do peptídeo gerado naturalmente com o padrão de fragmentação de um peptídeo de referência sintético com a mesma sequência.

[00416] A Tabela 19 mostra a apresentação de peptídeos selecionados em diversas entidades tumorais, o que serve como indicador da relevância de cada peptídeo mencionado para o diagnóstico e o tratamento dos cânceres assinalados (por exemplo, peptídeo SEQ N^Q 1 para câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, linfoma não Hodgkin, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de útero e câncer de endométrio; peptídeo SEQ N^Q 2 para câncer de mama, carcinoma colangiocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, melanoma, linfoma não Hodgkin, câncer de pulmão de células não pe

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199/287 quenas, câncer de esôfago, câncer de pâncreas, câncer de próstata, carcinoma de células renais, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de útero e câncer de endométrio).

Tabela 19: Apresentação de alguns peptídeos associados a tumores da presente invenção em diversos tipos de tumor.

LMA: leucemia mieloide aguda; CAM: câncer de mama; CCC: carcinoma colangiocelular; LLC: leucemia linfocítica crônica; CaCR: carcinoma colorretal; CVB: câncer da vesícula biliar; GBM: glioblastoma; CG: câncer gástrico; CJEG: câncer da junção esofagogástrica; CHC: carcinoma hepatocelular; CCECP: carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço; MEL: melanoma; LNH: linfoma não Hodgkin; CPCNP: câncer de pulmão de células não pequenas; CO: câncer de ovário; CE: câncer de esôfago; CP: câncer de pâncreas; CPr: câncer de próstata; CCR: carcinoma de células renais; CPPC: câncer de pulmão de pequenas células; CB: carcinoma de bexiga; CAU: câncer de útero e endométrio.

SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
1	MIPTFTALL	CaCR, CVB, LNH, CPCNP, CAU
2	TLLKALLEI	CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CAU
3	ALIYNLVGI	CHC
4	ALFKAWAL	LMA, CAM, LLC, CaCR, CVB, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CCR, CPPC, CB, CAU
5	RLLDFINVL	CAU
7	ALQAFEFRV	CG, CJEG, CCECP, CPCNP, CP, CPPC, CB
8	YLVTKVVAV	LMA, CAM, CCC, LLC, CaCR, CVB, GBM, CG, CJEG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU

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SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
10	RYSDSVGRVSF	CAM, CaCR, CVB, CG, CPCNP, CPPC, CB, CAU
11	SYSDLHYGF	CG, CPCNP, CAU
12	KYEKIFEML	LMA, CPCNP
13	VYTFLSSTL	CPCNP
14	FYFPTPTVL	CVB, CPCNP
15	VYHDDKQPTF	GBM, CG, CPCNP, OSCAR, CAU
16	IYSPQFSRL	CAM, LNH, CPCNP, CE, CB, CAU
18	KYPVHIYRL	LMA, CAM, CVB, CG, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CCR, CB, CAU
19	KYVKVFHQF	LMA, CAM, LLC, CaCR, CVB, GBM, CG, CHC, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
20	RMASPVNVK	LLC
21	AVRKPIVLK	LMA, CAM, CCC, CaCR, CVB, GBM, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CCR, CPPC, CB, CAU
22	SLKERNPLK	CPCNP
24	SMYYPLQLK	CAM, CaCR, GBM, CHC, LNH, CCR
25	GTSPPSVEK	CAU
27	VLYGPAGLGK	CHC, CCECP, CPCNP, CE, CP, CPPC, CB, CAU
28	KTYETNLEIKK	CPCNP, CB
29	QQFLTALFY	CP, CPr
31	LLDEGAMLLY	CVB, CCECP, CPCNP, CPPC, CB
32	SPNKGTLSV	CPCNP
33	SPTFHLTL	CPCNP, CPr, CPPC, CB, CAU
34	LPRGPLASLL	CCECP, CPCNP, CE, CP, CPPC
35	FPDNQRPAL	CAM, CaCR, CVB, MEL, CPCNP, CP, CB, CAU
36	APAAWLRSA	CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CHC, CCECP, CPCNP, CE, CP, CPPC, CB, CAU

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SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
38	SPHPVTALLTL	CP, CAU
40	KPGTSYRVTL	GBM
43	ALKARTVTF	CAM, CCC, GBM, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CPr, CPPC, CB, CAU
48	DVKKKIKEV	CPCNP, CCR, CPPC
53	MEHPGKLLF	CAU
56	SEPDTTASW	CPCNP, CAU
57	QESDLRLFL	CAM, LLC, CaCR, CG, CJEG, CCECP, LNH, CPCNP, CP, CB, CAU
59	SENVTMKVV	CAU
60	GLLSLTSTLYL	CAM
62	KVLGVNVML	CAM, CCECP, MEL, CPCNP, CPPC
63	MMEEMIFNL	CB
64	FLDPDRHFL	CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CJEG, CHC, CCECP, MEL, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
65	TMFLRETSL	MEL, LNH, CPCNP, CPr, CPPC
68	KLFDTQQFL	LMA, CAM, CaCR, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CCR
69	TTYEGSITV	CPCNP, CAU
71	YLEDTDRNL	LMA, CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CJEG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
72	YLTDLQVSL	LMA, CAM, CCC, LLC, CaCR, CVB, GBM, CG, CJEG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
74	SQSPSVSQL	CAU
75	KVVSVLYNV	CAM, CAU
77	RYGPVFTV	CCC, CG
78	SFAPRSAVF	CPPC

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202/287

SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
79	SYNEHWNYL	CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
81	VYNHTTRPL	CE
85	VLLGSLFSRK	LMA, CaCR, CHC, MEL, LNH, CPCNP, CCR, CAU
86	VVLLGSLFSRK	LMA, CaCR, CG, CHC, CP, CCR
87	AVAPPTPASK	LMA, CaCR, CVB, MEL, CPCNP, CE, CCR, CPPC, CAU
90	KVAGERYVYK	CCC, CAU
92	SVFPIENIY	CAU
94	ATFERVLLR	CAM, CPCNP
96	TAFGGFLKY	CE, CCR
97	TMLDVEGLFY	CG
99	KVVDRWNEK	CaCR, LNH, CCR
101	RVFTSSIKTK	CPCNP, CP, CAU
106	AAFVPLLLK	LMA, CAM, LNH, CPCNP, CPPC
108	VLYPVPLESY	LMA, MEL, LNH, CPCNP, CCR, CPPC, CAU
109	KTFTIKRFLAK	CAM, CCC, MEL, LNH, CPCNP, CE, CPPC, CAU
110	SAAPPSYFR	CCR, CAU
113	QLDSNRLTY	CHC
115	FVDNQYWRY	CAM, CVB, CJEG, CPCNP, CE, CP, CPPC
116	VLLDEGAMLLY	CPCNP, CP
117	APRLLLLAVL	CAM, CaCR, CCECP, MEL, CPCNP, CE, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
118	SPASRSISL	LNH, CE, CCR
119	APLPRPGAVL	MEL, CE
120	RPAMNYDKL	CaCR
123	KPSESIYSAL	CAM, CaCR, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CPPC, CB
124	LPSDSHFKITF	CaCR, CCECP, LNH, CE, CPPC

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SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
125	VPVYILLDEM	CCC, CG, CCECP, CAU
127	APRAGSQVV	LMA, CAM, CaCR, GBM, CHC, CCECP, MEL, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
129	APRPASSL	CAM, CaCR, CPCNP, CE, CPPC, CAU
133	MPNLPSTTSL	CAU
141	SPMTSLLTSGL	CAU
146	IPRPEVQAL	LMA, CaCR, CG, CCECP, MEL
147	APRWFPQPTVV	CAM
148	KPYGGSGPL	LMA, CAM, LNH, CCR
149	GPREALSRL	LMA, CAM, CCC, CaCR, CHC, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CAU
150	MAAVKQAL	CCC, CPCNP, CP
151	HLLLKVLAF	CCECP
152	MGSARVAEL	CCECP
156	HVKEKFLL	CCC, CCECP
157	EAMKRLSYI	CCC, CCECP, CP
174	AEATARLNVF	CPCNP
176	AEIEPKADGSW	CCC, CPCNP, CPr
178	NELFRDGVNW	LMA, CAM, CCC, LLC, CaCR, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CPPC, CB, CAU
179	REAGDEFEL	CCC, CPCNP, CPPC
180	REAGDEFELRY	CaCR, CHC, MEL, CPCNP, CE, CP, CCR, CAU
181	GEGPKTSW	CPCNP
182	KEATEAQSL	CPCNP
184	AELEALTDLW	LNH, CPCNP, CPCNP
186	REGPEEPGL	CG
188	AEFAKKQPWW	CCC, LLC, CaCR, MEL, LNH, CPCNP

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204/287

SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
191	EEDAALFKAW	LMA, CAM, CCC, LLC, CaCR, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
192	YEFKFPNRL	CAM, CHC, CPCNP, CE, CAU
196	REMPGGPVW	CAM, CCC, CaCR, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPPC, CB, CAU
197	AEVLLPRLV	CPCNP, CP, CAU
199	REIDESLIFY	CPCNP
200	AESIPTVSF	CPCNP
208	TEVSRTEAI	CPCNP, CAU
211	EEKVFPSPLW	LNH
215	SEDGLPEGIHL	LLC, CG, CJEG, CCECP, LNH, CPCNP, CP
216	IMFDDAIERA	CAU
217	VSSSLTLKV	CAM, CCR
224	SLPRFQVTL	CAM, CHC, LNH, CPCNP, CE, CB, CAU
225	SVFAHPRKL	CAM, CE
226	QVDPKKRISM	CAM, LNH, CPCNP, CPPC
227	YTFRYPLSL	CCC, CaCR, CVB, CG, CHC, CCECP, CPCNP, CE, CP, CPPC, CB, CAU
228	RLWDWVPLA	LMA, LNH
235	SAIETSAVL	CPCNP, CAU
237	SAMGTISIM	CAU
240	FSTDTSIVL	CP
241	RQPNILVHL	CAU
243	YASEGVKQV	CAU
245	LAVEGGQSL	LMA, CAM, CCC, CaCR, CVB, GBM, CG, CJEG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
246	RYLAVVHAVF	CHC, LNH, CPCNP, CP, CPPC
247	ARPPWMWVL	CAM, CVB, CCECP, CE

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SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
251	KQRQVLIFF	GBM, CPCNP, CE, CP, CCR
252	LYQPRASEM	LNH
256	RTEEVLLTFK	CCR, CPPC, CAU
257	VTADHSHVF	CAU
259	KTLELRVAY	CVB, CCECP
260	GTNTVILEY	MEL, CP, CAU
262	RSRLNPLVQR	CCECP, CPCNP
264	AIKVIPTVFK	CCECP, MEL, CPCNP, CCR, CAU
268	GLLGLSLRY	CPr
269	RLKGDAWVYK	MEL, LNH, CE, CAU
271	RMFADDLHNLNK	CPCNP
273	RVNAIPFTY	CVB
275	STTFPTLTK	CAU
277	TTALKTTSR	CPCNP
279	SVSSETTKIKR	CAU
280	SVSGVKTTF	CHC, CAU
281	RAKELEATF	LLC, CG, CPCNP
283	IVQEPTEEK	CHC, LNH, CPCNP
286	TVAPPQGVVK	CHC
288	SPVTSVHGGTY	LNH
289	RWEKTDLTY	CaCR, CAU
291	ETIRSVGYY	GBM, CPCNP, CB
295	YPLRGSSIFGL	CAU
296	YPLRGSSI	CAU
299	HPGSSALHY	LMA, CCC, CaCR, CG, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CAU
300	IPMAAVKQAL	LMA, CAM, LLC, CaCR, CG, CHC, CCECP, MEL, CPCNP, CE, CP, CCR, CAU
302	RVEEVRALL	CAM, CaCR, GBM, CB
306	APVIFSHSA	LMA, CCC, CHC, MEL, CPCNP, CB
307	LPYGPGSEAAAF	CAM, CAU
308	YPEGAAYEF	CPr, CAU

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206/287

SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
314	VPDQPHPEI	CP
315	SPRENFPDTL	CCECP
317	FPFQPGSV	LMA, CAM, LLC, CaCR, CVB, GBM, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
318	FPNRLNLEA	CCC, LLC, CG, CCECP, MEL, CPCNP, CPr, CCR, CPPC, CB
319	SPAEPSVYATL	CAM, CG, CPCNP, CE
320	FPMSPVTSV	LMA, CAM, CCC, CaCR, CVB, GBM, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
321	SPMDTFLLI	LMA, CAM, LLC, CaCR, CVB, GBM, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU
322	SPDPSKHLL	LNH, CPCNP, CPr, CCR
324	VPYRVVGL	LLC, CaCR, CG, MEL, LNH, CPCNP, CPr, CPPC
325	GPRNAQRVL	CaCR, CVB, LNH, CPCNP
326	VPSEIDAAF	CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CPCNP, CE, CP, CCR, CPPC, CAU
330	FPFVTGSTEM	CAU
331	FPHPEMTTSM	CAU
332	FPHSEMTTL	CPCNP, CP
333	FPHSEMTTVM	CPCNP, CPPC, CAU
334	FPYSEVTTL	CPCNP, CPPC, CAU
335	HPDPVGPGL	CPCNP, CAU
337	HPVETSSAL	CAU
355	SPLVTSHIM	CAU
363	TAKTPDATF	CCC
369	FPHSEMTTV	CP, CAU
371	LYVDGFTHW	CPCNP, CAU
376	RPRSPAGQVA	CP

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207/287

SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
378	RPRSPAGQVAA	LNH, CP, CPPC
385	SPALHIGSV	CAM, GBM, CHC, CPCNP, CPr, CPPC, CB, CAU
386	FPFNPLDF	CG, LNH
388	SPAPLKLSRTPA	MEL
389	SPGAQRTFFQL	LMA, MEL
391	APSTPRITTF	CHC, LNH
392	KPIESTLVA	GBM, MEL, CPCNP, CAU
393	ASKPHVEI	CaCR
395	VLLPRLVSC	CPCNP
399	RELLHLVTL	CPCNP, CPPC, CAU
403	EEAQWVRKY	CAM, LLC, LNH
404	NEAIMHQY	CAM, CCC, LLC, CaCR, CVB, CG, CHC, MEL, LNH, CPCNP, CE, CPPC, CB, CAU
405	NEIWTHSY	CPCNP, CAU
407	AEHEGVSVL	CPCNP, CAU
408	LEKALQVF	CaCR, CG, CCECP, CE, CAU
409	REFVLSKGDAGL	CVB, CG, CJEG, CCECP, CPCNP
410	SEDPSKLEA	CAM, CCECP, CPCNP, CE, CPPC, CAU
411	LELPPILVY	CAM, CaCR, CVB, GBM, CG, LNH, CPCNP, CE, CPr, CPPC, CB, CAU
414	EDAALFKAW	LLC, CaCR, MEL, LNH
415	REEDAALFKAW	CAM, LLC, CaCR, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CPr, CB, CAU
416	SEEETRVVF	LMA, CaCR, CCECP, CPCNP, CAU
417	AEHFSMIRA	LMA, CAM, CaCR, GBM, CG, CCECP, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CCR, CAU
418	FEDAQGHIW	CAM, CCC, CaCR, CHC, CPCNP, CE, CP, CB, CAU
419	HEFGHVLGL	CAM, CCC, CaCR, CG, CCECP, MEL, CPCNP, CE, CP, CAU

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SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
420	FESHSTVSA	CAU
423	SEVPTGTTA	CVB, GBM
425	SEVPLPMAI	CPCNP, CAU
429	REKFIASVI	CAU
430	DEKILYPEF	CAU
431	AEQDPDELNKA	CaCR, CE, CPPC, CAU
432	EEQYIAQF	CE, CPPC
433	SDSQVRAF	GBM, CG, CHC, CCECP, CPCNP, CE, CCR, CPPC, CAU
436	REPGDIFSEL	CaCR
437	TEAVVTNEL	CaCR, CG, CPCNP, CPPC, CAU
438	SEVDSPNVL	CCC, LLC, CaCR, CG, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CPPC, CB
442	ILSKLTDIQY	CAM, GBM, LNH, CPCNP
443	GTFNPVSLW	CAM, CVB, GBM, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPPC
444	KLSQKGYSW	CAM, CCC, CaCR, GBM, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CPPC, CB
445	LHITPGTAY	CHC, CPr
446	GRIVAFFSF	LMA, CAM, CaCR, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNP, CE, CP, CPr, CPPC, CB, CAU
447	MQVLVSRI	CG, CPCNP, CP, CPr, CCR, CPPC
448	LSQKGYSW	LNH, CPCNP, CB
451	DYLNEWGSRF	CPCNP, CE, CAU
454	AQTDPTTGY	GBM, CG, CPCNP
455	AAAANAQVY	CAM, CAU
456	IPLERPLGEVY	CAM, CAU
457	NAAAAANAQVY	CAM, CPCNP, CAU
458	TDTLIHLM	CAU
459	KVAGERYVY	CAM, CCC, CaCR, GBM, CCECP, MEL, CPCNP, CE, CP, CPr, CPPC, CB
460	RLSSATANALY	CVB

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 227/538

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SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
461	AQRMTTQLL	CaCR, MEL, CPCNP, CCR
462	QRMTTQLLL	CPCNP, CCR, CAU
466	DLIESGQLRER	CAU
467	MQMQERDTL	CJEG, CCECP, LNH, CPCNP, CE
471	AQRLDPVYF	CCC, CaCR, CVB, CJEG, CPCNP, CE, CP, CPPC, CB
472	MRLLVAPL	CPPC, CAU
474	AADGGLRASVTL	CAM, CPCNP, CE
477	RIQQQTNTY	GBM, CPPC
479	TEGSHFVEA	CAM, CPPC, CAU
480	GRADIMIDF	CAM, CaCR, CCECP, MEL, CPCNP, CE, CPPC, CAU
481	GRWEKTDLTY	CAM, CVB, CCECP, MEL, CPCNP, CE, CP, CPPC, CB, CAU
482	GRWEKTDLTYR	CCECP, CPCNP, CE, CP, CPPC, CAU
484	AWLRSAAA	CCC
485	VRFPVHAAL	MEL, CPCNP, CE
486	DRFFWLKV	CPCNP, CPPC
487	GMADILVVF	CPCNP
488	RSFSLGVPR	LMA, LLC, CG, CHC, CCECP, LNH, CPCNP, CPr, CPPC, CAU
490	AEVQKLLGP	CCECP, CPCNP, CE, CAU
491	EAYSSTSSW	CVB, CAU
493	DTNLEPVTR	CAU
495	EVPSGATTEVSR	CAU
496	EVPTGTTAEVSR	CAU
498	EVYPELGTQGR	CAU
503	TVFDKAFTAA	CPCNP
507	TSIFSGQSL	CAU
508	TVAKTTTTF	CAU
509	GRGPGGVSW	CPCNP
518	TSDFPTITV	CP
520	THSAMTHGF	LNH

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 228/538

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SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
527	QSTPYVNSV	CAU
528	TRTGLFLRF	CCECP, CPCNP, CAU
533	GQHLHLETF	LMA, CCC, CVB, CG, CHC, MEL, LNH, CPCNP, CE, CCR, CPPC, CB, CAU
537	IRRLKELKDQ	CPCNP
539	IPIPSTGSVEM	CCC, CG, CCECP, CPCNP, CE, CPr, CPPC, CB, CAU
540	AGIPAVALW	CHC, CPCNP, CE
541	RLSPAPLKL	GBM, CPCNP
544	LRNPSIQKL	GBM
545	RVGPPLLI	CAM, CaCR, CPCNP, CE, CAU
546	GRAFFAAAF	CaCR, GBM, CCECP, MEL, CPCNP, CE, CP, CPPC, CB, CAU
547	EVNKPGVYTR	CHC, CAU
549	ARSKLQQGL	MEL
550	RRFKEPWFL	CAM, CHC, MEL, CPCNP, CPr, CPPC, CB, CAU
563	PNFSGNWKIIRSENFEEL	CPCNP
589	APDAKSFVLNLGKDSNNL	CPCNP
590	RVRGEVAPDAKSFVLNLG	CPCNP
591	VRGEVAPDAKSFVLNL	CPCNP, CCR
592	VRGEVAPDAKSFVLNLG	CPCNP, CCR
593	GEVAPDAKSFVLNLG	CPCNP, CCR
594	VRGEVAPDAKSFVLN	CPCNP, CCR
598	AESLFREALSNKVDEL	CPCNP
599	AESLFREALSNKVDE	CPCNP
607	LTVAEVQKLLGPHVEGLKAE E	CPCNP
608	LTVAEVQKLLGPHVEGLKAE	CPCNP
609	LTVAEVQKLLGPHVEGLKA	CPCNP
610	LTVAEVQKLLGPHVEGLK	CPCNP
611	LTVAEVQKLLGPHVEGL	CPCNP
612	TVAEVQKLLGPHVEGLK	CPCNP

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 229/538

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SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
613	LTVAEVQKLLGPHVEG	CPCNP
614	TVAEVQKLLGPHVEGL	CPCNP
615	VAEVQKLLGPHVEGLK	CPCNP
616	TVAEVQKLLGPHVEG	CPCNP
617	VAEVQKLLGPHVEGL	CPCNP
618	VAEVQKLLGPHVEG	CPCNP
619	VAEVQKLLGPHVE	CPCNP
620	EVQKLLGPHVEG	CPCNP
625	DALRGLLPVLGQPIIRSIPQG	CPCNP
628	DALRGLLPVLGQPIIRSIPQ	CPCNP
629	GLLPVLGQPIIRSIPQGIVA	CPCNP
630	ALRGLLPVLGQPIIRSIPQ	CPCNP
633	LRGLLPVLGQPIIRSIPQ	CPCNP
634	DALRGLLPVLGQPIIRS	CPCNP
635	ALRGLLPVLGQPIIRS	CPCNP
637	ALRGLLPVLGQPIIR	CPCNP
638	LRGLLPVLGQPIIRS	CPCNP
639	ALRGLLPVLGQPII	CPCNP
646	GLLPVLGQPIIRSIPQGIVAA WRQ	CPCNP
648	GLLPVLGQPIIRSIPQGIVAA	CPCNP
651	LPVLGQPIIRSIPQGIVAA	CPCNP
653	LPVLGQPIIRSIPQGIVA	CPCNP
654	PVLGQPIIRSIPQGIVA	CG,CPCNP
656	VLGQPIIRSIPQGIVA	CPCNP
661	LRGLLPVLGQPIIRSIPQG	CPCNP
666	LPLTVAEVQKLLGPHVEG	CPCNP
668	AVLPLTVAEVQK	CAM, CaCR, CVB, CG, CPCNP, CP, CAU
677	IWAVRPQDLDTCDPR	CPCNP
680	GVRGSLLSEADVRALGGLA	CPCNP
682	GVRGSLLSEADVRALGGL	CPCNP
686	VRGSLLSEADVRALGGL	CPCNP
694	GSLLSEADVRALGG	CPCNP

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SEQ N^s	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
695	RGSLLSEADVRALG	CPCNP
697	GSLLSEADVRALG	CPCNP
717	IPQGIVAAWRQRSSRDPS	CG
730	LPGRFVAESAEVL	CPCNP

EXEMPLO 2

Perfil da expressão de genes que codificam peptídeos da invenção [00417] A apresentação exacerbada ou apresentação específica de um peptídeo em células tumorais em comparação com células normais é suficiente para demonstrar a utilidade dos peptídeos para imunoterapia, e alguns peptídeos são específicos para tumores, mesmo que a proteína da qual se originaram também esteja presente em tecidos normais. Contudo, o perfil de expressão de mRNA cria um nível adicional de segurança para selecionar peptídeos para uso em imunoterapia. Sobretudo para opções de tratamento mais arriscadas, como TCRs maturados por afinidade, o peptídeo-alvo ideal é derivado de uma proteína específica para o tumor e que não é encontrada em tecidos normais.

Fontes de RNA e preparação [00418] Amostras de tecido retiradas cirurgicamente foram fornecidas conforme descrito anteriormente (ver Exemplo 1) após obtenção de consentimento livre e esclarecido de cada paciente. As amostras de tecido congeladas foram criocongeladas imediatamente após a cirurgia e depois homogeneizadas em cadinho com pistilo sob nitrogênio líquido. O RNA total foi preparado a partir dessas amostras usando-se o reagente TRI (Ambion, Darmstadt, Alemanha) seguido de limpeza com RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemanha). Ambos os métodos foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante.

[00419] O RNA total de tecidos humanos saudáveis de experimen

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 231/538

213/287 tos de sequenciamento de RNA foi obtido de Asterand (Detroit, Ml, EUA e Royston, Herts, Reino Unido), Bio-Options Inc. (Brea, CA, EUA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, EUA), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, EUA) e Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Reino Unido).

[00420] O RNA total de tecidos tumorais para experimentos de sequenciamento de RNA foi obtido de Asterand (Detroit, Ml, EUA e Royston, Herts, Reino Unido), BioCat GmbH (Heidelberg, Alemanha, BioServe (Beltsville, MD, EUA), Geneticist Inc. (Glendale, CA, EUA), Istituto Nazionale Tumori Pascale (Nápoles, Itália), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, EUA) e Hospital Universitário de Heidelberg (Heidelberg, Alemanha).

[00421] A qualidade e a quantidade de todas as amostras de RNA foram analisadas em um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Alemanha) usando um kit RNA 6000 Pico LabChip (Agilent). Experimentos de sequenciamento de DNA [00422] A análise de expressão gênica em amostras de RNA de tumores e tecidos normais foi realizada por sequenciamento de próxima geração (RNAseq) da CeGaT (Tübingen, Alemanha). Sumariamente, bibliotecas de sequenciamento foram preparadas usando o kit de reagentes Illumina HiSeq v4 de acordo com o protocolo do fornecedor (Illumina Inc., San Diego, CA, Estados Unidos), que inclui fragmentação de RNA, conversão em cDNA e adição de adaptadores de sequenciamento. Bibliotecas derivadas de várias amostras são misturadas em proporção equimolar e sequenciadas em um sequenciador Illumina HiSeq 2500 de acordo com as instruções do fabricante, gerando leituras de extremidade única com 50 bp cada. As leituras processadas foram mapeadas em relação ao genoma humano (GRCh38) usando-se o software STAR. Os dados de expressão ao nível de transcrição são fornecidos em RPKM (leituras por quilobase por milhões de leituras mapeadas, geradas pelo software Cufflinks) e ao ní

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214/287 vel de éxon (leituras totais, geradas pelo software Bedtools), baseado nas anotações do banco de dados Ensembl77. As leituras de éxons foram normalizadas para o comprimento e alinhamento dos éxons para gerar valores de RKPM.

[00423] A Figura 1 mostra alguns perfis de expressão exemplares da presente invenção que apresentam sobrexpressão acentuada ou exclusiva em câncer de ovário. Os escores de expressão para outros genes exemplificativos são mostrados na Tabela 10.

Tabela 10: Escores de expressão. A tabela apresenta uma lista de peptídeos derivados de genes cuja expressão é, quando comparada com um painel de tecidos normais, fortemente acentuada (+++), acentuada (++) ou sobrexpressa (+). O nível basal para essa pontuação foi calculado a partir de mensurações realizadas nos seguintes tecidos normais: tecido adiposo, glândula suprarrenal, dueto biliar, células sanguíneas, vasos sanguíneos, medula óssea, cérebro, cartilagem, esôfago, olho, vesícula biliar, coração, cabeça e pescoço, rim, intestino grosso, fígado, pulmão, linfonodo, nervo, paratireoide, pâncreas, hipófise, músculo esquelético, pele, intestino delgado, baço, estômago, tireoide, traqueia e bexiga. Em casos para os quais existiam dados para várias amostras de um mesmo tipo de tecido, a média aritmética de todas as respectivas amostras foi usada para o cálculo.

SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
1	MIPTFTALL	++
5	RLLDFINVL	+++
6	SLGKHTVAL	+++
10	RYSDSVGRVSF	+
11	SYSDLHYGF	++
12	KYEKIFEML	+++
13	VYTFLSSTL	+++
14	FYFPTPTVL	++
16	IYSPQFSRL	+++

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SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
17	RFTTMLSTF	+++
18	KYPVHIYRL	+
20	RMASPVNVK	++
21	AVRKPIVLK	+
22	SLKERNPLK	++
23	GMMKGGIRK	+++
25	GTSPPSVEK	++
26	RISEYLLEK	+++
27	VLYGPAGLGK	+++
28	KTYETNLEIKK	+++
29	QQFLTALFY	+++
30	ALEVAHRLK	+
31	LLDEGAMLLY	+++
32	SPNKGTLSV	+
33	SPTFHLTL	+
34	LPRGPLASLL	++
35	FPDNQRPAL	++
36	APAAWLRSA	+++
37	RPLFQKSSM	+++
38	SPHPVTALLTL	++
39	RPAPFEVVF	++
40	KPGTSYRVTL	+++
42	TLKVTSAL	+
43	ALKARTVTF	+
47	MPNLRSVDL	+++
51	SLRLKNVQL	+++
52	AEFLLRIFL	+
53	MEHPGKLLF	+++
54	AEITITTQTGY	++
55	HETETRTTW	++
56	SEPDTTASW	++
57	QESDLRLFL	+++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 234/538

216/287

SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
58	GEMEQKQL	+++
59	SENVTMKVV	+++
60	GLLSLTSTLYL	+
61	YMVHIQVTL	++
62	KVLGVNVML	++
63	MMEEMIFNL	++
64	FLDPDRHFL	++
66	GLLQELSSI	+++
67	SLLLPSIFL	+++
69	TTYEGSITV	++
70	VLQGLLRSL	+++
71	YLEDTDRNL	+
72	YLTDLQVSL	+
73	FLIEELLFA	+++
74	SQSPSVSQL	+++
75	KVVSVLYNV	+++
76	KYVAELSLL	+++
77	RYGPVFTV	+++
78	SFAPRSAVF	++
82	SYFRGFTLI	+++
83	GTYAHTVNR	+++
84	KLQPAQTAAK	+++
87	AVAPPTPASK	++
88	VVHAVFALK	+
89	RVAELLLLH	+++
90	KVAGERYVYK	++
91	RSLRYYYEK	++
92	SVFPIENIY	++
96	TAFGGFLKY	+++
97	TMLDVEGLFY	++
98	LLQPPPLLAR	+++
100	RLFTSPIMTK	++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 235/538

217/287

SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
101	RVFTSSIKTK	++
102	SVLTSSLVK	++
103	TSRSVDEAY	++
104	VLADSVTTK	++
107	RLQEWKALK	+++
108	VLYPVPLESY	+++
110	SAAPPSYFR	+++
111	TLPQFRELGY	++
112	TVTGAEQIQY	++
113	QLDSNRLTY	++
114	VMEQSAGIMY	+++
115	FVDNQYWRY	+++
116	VLLDEGAMLLY	+++
117	APRLLLLAVL	++
118	SPASRSISL	++
119	APLPRPGAVL	+++
120	RPAMNYDKL	++
121	VPNQSSESL	+++
122	YPGFPQSQY	+++
123	KPSESIYSAL	+++
124	LPSDSHFKITF	+++
125	VPVYILLDEM	++
126	KPGPEDKL	++
128	YPRTITPGM	+
129	APRPASSL	++
130	FPRLVGPDF	+
131	APTEDLKAL	++
132	IPGPAQSTI	++
133	MPNLPSTTSL	++
135	RVRSTISSL	++
136	SPFSAEEANSL	++
137	SPGATSRGTL	++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 236/538

218/287

SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
138	SPMATTSTL	++
139	SPQSMSNTL	++
140	SPRTEASSAVL	++
141	SPMTSLLTSGL	++
142	TPGLRETSI	++
143	SPAMTSTSF	++
144	SPSPVSSTL	++
145	SPSSPMSTF	++
147	APRWFPQPTVV	+++
151	HLLLKVLAF	+++
152	MGSARVAEL	+++
154	MLRKIAVAA	++
155	NKKMMKRLM	+++
156	HVKEKFLL	++
157	EAMKRLSYI	+
159	VLKHKLDEL	++
160	YPKARLAF	++
161	ALKI I I I AL	++
162	QAKTHSTL	++
163	QGLLRPVF	+++
164	SIKTKSAEM	++
165	SPRFKTGL	++
166	TPKLRETSI	++
167	TSHERLTTL	++
168	TSHERLTTY	++
169	TSMPRSSAM	++
170	YLLEKSRVI	+++
171	FAFRKEAL	+++
172	KLKERNREL	+++
173	AEAQVGDERDY	+
174	AEATARLNVF	+
175	AEIEPKADG	+

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 237/538

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SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
176	AEIEPKADGSW	+
177	TEVGTMNLF	++
181	GEGPKTSW	+
183	YEKGIMQKV	++
184	AELEALTDLW	++
185	AERQPGAASL	++
186	REGPEEPGL	++
187	GEAQTRIAW	++
189	KEFLFNMY	++
190	YEVARILNL	++
193	LEAQQEAL	++
194	KEVDPTSHSY	+++
195	AEDKRHYSV	+
196	REMPGGPVW	+++
197	AEVLLPRLV	++
198	QEAARAAL	++
199	REIDESLIFY	++
200	AESIPTVSF	++
201	AETILTFHAF	++
202	HESEATASW	++
203	IEHSTQAQDTL	++
204	RETSTSEETSL	++
205	SEITRIEM	++
206	SESVTSRTSY	+++
207	TEARATSDSW	++
208	TEVSRTEAI	++
209	TEVSRTEL	++
210	VEAADIFQNF	++
211	EEKVFPSPLW	+++
212	MEQKQLQKRF	+++
214	VEQTRAGSLL	++
216	IMFDDAIERA	+++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 238/538

220/287

SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
217	VSSSLTLKV	+
218	TIASQRLTPL	++
219	PLPRPGAVL	+++
220	RMTTQLLLL	++
225	SVFAHPRKL	++
226	QVDPKKRISM	++
227	YTFRYPLSL	++
229	ISVPAKTSL	++
230	SAFREGTSL	++
231	SVTESTHHL	++
232	TISSLTHEL	++
233	GSDTSSKSL	++
234	GVATRVDAI	+++
235	SAIETSAVL	++
236	SAIPFSMTL	++
237	SAMGTISIM	++
238	PLLVLFTI	+++
239	FAVPTGISM	++
240	FSTDTSIVL	++
241	RQPNILVHL	++
242	STIPALHEI	++
243	YASEGVKQV	++
244	DTDSSVHVQV	++
246	RYLAVVHAVF	+
247	ARPPWMWVL	+++
248	SVIQHLGY	++
249	VYTPTLGTL	++
250	HFPEKTTHSF	++
252	LYQPRASEM	+++
254	IIQHLTEQF	+++
255	VFVSFSSLF	+++
256	RTEEVLLTFK	++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 239/538

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SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
257	VTADHSHVF	+++
258	GAYAHTVNR	+++
259	KTLELRVAY	+
260	GTNTVILEY	++
261	HTFGLFYQR	++
262	RSRLNPLVQR	++
263	SSSSATISK	++
266	ISYSGQFLVK	+++
267	VTDLISPRK	+++
268	GLLGLSLRY	+++
269	RLKGDAWVYK	++
270	AVFNPRFYRTY	+++
272	RQPERTILRPR	++
273	RVNAIPFTY	++
274	KTFPASTVF	++
275	STTFPTLTK	++
276	VSKTTGMEF	++
277	TTALKTTSR	++
278	NLSSITHER	++
279	SVSSETTKIKR	++
280	SVSGVKTTF	++
281	RAKELEATF	+++
282	CLTRTGLFLRF	+++
285	GTVNPTVGK	++
286	TVAPPQGVVK	+
287	RRIHTGEKPYK	++
288	SPVTSVHGGTY	+
289	RWEKTDLTY	++
290	DMDEEIEAEY	+++
291	ETIRSVGYY	++
292	NVTMKVVSVLY	+++
293	VPDSGATATAY	+++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 240/538

222/287

SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
294	YPLRGSSIF	+++
295	YPLRGSSIFGL	+++
296	YPLRGSSI	+++
297	TVREASGLL	+
298	YPTEHVQF	+
299	HPGSSALHY	++
301	SPRRSPRISF	+
302	RVEEVRALL	+++
303	LPMWKVTAF	+++
304	LPRPGAVL	+++
305	TPWAESSTKF	++
306	APVIFSHSA	++
307	LPYGPGSEAAAF	+++
308	YPEGAAYEF	+++
309	FPQSQYPQY	+++
310	RPNPITIIL	+++
311	RPLFYVVSL	+++
312	LPYFREFSM	+++
313	KVKSDRSVF	+++
315	SPRENFPDTL	+++
316	EPKTATVL	++
320	FPMSPVTSV	+
321	SPMDTFLLI	+
322	SPDPSKHLL	+
323	RPMPNLRSV	+++
324	VPYRVVGL	+++
326	VPSEIDAAF	++
327	SPLPVTSLI	++
328	EPVTSSLPNF	++
329	FPAMTESGGMIL	++
330	FPFVTGSTEM	++
331	FPHPEMTTSM	++

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223/287

SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
332	FPHSEMTTL	++
333	FPHSEMTTVM	++
334	FPYSEVTTL	++
335	HPDPVGPGL	+++
336	HPKTESATPAAY	++
337	HPVETSSAL	++
338	HVTKTQATF	++
339	LPAGTTGSLVF	++
340	LPEISTRTM	++
341	LPLDTSTTL	++
342	LPLGTSMTF	++
343	LPSVSGVKTTF	++
344	LPTQTTSSL	++
345	LPTSESLVSF	++
346	LPWDTSTTLF	++
347	MPLTTGSQGM	++
348	MPNSAIPFSM	++
349	MPSLSEAMTSF	++
350	NPSSIIIEF	++
351	NVLTSTPAF	++
352	SPAETSTNM	++
353	SPAMTTPSL	++
354	SPLPVTSLL	++
355	SPLVTSHIM	++
356	SPNEFYFTV	++
357	SPSPVPTTL	++
358	SPSPVTSTL	++
359	SPSTIKLTM	++
360	SPSVSSNTY	++
361	SPTHVTQSL	++
362	SPVPVTSLF	++
363	TAKTPDATF	++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 242/538

224/287

SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
364	TPLATTQRF	++
365	TPLATTQRFTY	++
366	TPLI I IGSAEM	++
367	TPSVVTEGF	++
368	VPTPVFPTM	++
369	FPHSEMTTV	++
370	PGGTRQSL	++
372	IPRNPPPTLL	+++
373	RPRALRDLRIL	+++
374	NPIGDTGVKF	+++
375	AAASPLLLL	+++
376	RPRSPAGQVA	+++
377	RPRSPAGQVAAA	+++
378	RPRSPAGQVAA	+++
379	GPFPLVYVL	+++
380	IPTYGRTF	+++
381	LPEQTPLAF	+++
382	SPMHDRWTF	+++
383	TPTKETVSL	+++
384	YPGLRGSPM	+++
387	APLKLSRTPA	+++
388	SPAPLKLSRTPA	+++
389	SPGAQRTFFQL	++
395	VLLPRLVSC	++
396	REASGLLSL	+
397	REGDTVQLL	+
399	RELLHLVTL	+
400	GEIEIHLL	+
403	EEAQWVRKY	++
404	NEAIMHQY	++
405	NEIWTHSY	++
411	LELPPILVY	+

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 243/538

225/287

SEQ N^Q	Sequência	Expressão gênica
412	QEILTQVKQ	+++
413	IEALSGKIEL	+++
416	SEEETRVVF	++
417	AEHFSMIRA	+++
418	FEDAQGHIW	++
419	HEFGHVLGL	++
420	FESHSTVSA	++
421	GEPATTVSL	++
422	SETTFSLIF	++
423	SEVPTGTTA	++
424	TEFPLFSAA	++
425	SEVPLPMAI	++
426	PEKTTHSF	++
427	HESSSHHDL	+
428	LDLGLNHI	++
429	REKFIASVI	+++
430	DEKILYPEF	+++
432	EEQYIAQF	+++
433	SDSQVRAF	+++
435	REEFVSIDHL	+++
436	REPGDIFSEL	+++
437	TEAVVTNEL	+

EXEMPLO 3

Imunogenicidade in vitro de peptídeos apresentados por MHC classe I [00424] Para obter informações sobre a imunogenicidade dos TUMAPs da presente invenção, os investigadores realizaram investigações usando um ensaio de priming in vitro de células T baseado em estimulações repetidas de células T CD8+ com células apresentadoras de antigenos artificiais (aAPCs) carregadas com complexos peptídeo/MHC e anticorpo anti-CD28. Assim, os inventores puderam de

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226/287 monstrar a imunogenicidade dos TUMAPs restritos por HLA-A*0201, HLA-A*24:02, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLA-B*07:02 ou HLAB*44:02 da invenção, demonstrando que esses peptídeos são epitopes de células T contra os quais existem células T CD8+ precursoras em humanos (Tabela 11).

Preparação in vitro de células T CD8+ [00425] Para realizar estimulações in vitro por células apresentadoras de antígenos artificiais carregadas com complexo peptídeo-MHC (pMHC) e anticorpo anti-CD28, os inventores primeiramente isolaram células T CD8+ de produtos frescos de leucaférese de HLA-A*02, HLA-A*0201, HLA-A*24:02, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLA-B*07:02 ou HLA-B*44:02 usando seleção positiva com microesférulas de CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) de doadores saudáveis, obtidas da Clínica Universitária de Mannheim, Alemanha, após consentimento livre e esclarecido.

[00426] As CMSPs e os linfócitos CD8+ isolados foram incubados por uma noite em um meio para células T (TCM, T-cell medium) que consistia em RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) suplementado com 10% de soro humano AB termoinativado (PANBiotech, Aidenbach, Alemanha), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml (Cambrex, Colônia, Alemanha), piruvato de sódio 1 mM (CC Pro, Oberdorla, Alemanha) e gentamicina 20 pg/ml (Cambrex). Nesta etapa, também foram adicionados ao TCM 2,5 ng/ml de IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Alemanha) e 10 U/ml de IL-2 (Novartis Pharma, Nuremberg, Alemanha).

[00427] A geração de esférulas revestidas por pMHC/anti-CD28, a estimulação de células Tea leitura foram realizadas em um sistema in vitro muito bem definido, no qual foram usadas 4 moléculas de pMHC diferentes por condição de estimulação e 8 moléculas de pMHC diferentes por condição de leitura.

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227/287 [00428] A lgG2a de camundongo anti-CD28 humano purificada e co-estimulatória de Ab 9.3 (Jung et al., 1987)foi biotinilada quimicamente per sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina conforme recomendado pelo fabricante (Perbio, Bonn, Alemanha). Foram usadas esférulas que consistiam em partículas de poliestireno de 5,6 μιτι de diâmetro revestidas por estreptavidina (Bangs Laboratories, Illinois, EUA).

[00429] Os pMHCs usados para estimulações de controle positivo e controle negativo foram A*0201/MLA-001 (peptídeo ELAGIGILTV, SEQ N^Q 775 de Melan-A/MART-1 modificado) e A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5, SEQ N^Q 776), respectivamente.

[00430] Um total de 800.000 esférulas / 200 μΙ foram revestidas em placas de 96 cavidades na presença de 4 x 12,5 ng de complexos biotina-pMHC diferentes e lavados. Em seguida, 600 ng de anti-CD28 biotinilado foram adicionados até atingir o volume de 200 μΙ. As estimulações foram iniciadas em placas de 96 cavidades por incubação conjunta de 1x10⁶ células T CD8+ com 2x10⁵ esférulas revestidas lavadas em 200 μΙ TOM suplementado com IL-12 5 ng/ml (PromoCell) por 3 dias a 37Ό. Em seguida, metade do meio foi suplementado por TOM fresco suplementado com IL-2 80 U/ml. A incubação foi mantida por 4 dias a 37Ό, e o ciclo estimulatório foi realizado um total de três vezes. Para leitura do multímero pMHC com 8 moléculas diferentes de pMHC por condição, uma abordagem de codificação combinatória bidimensional foi empregada conforme descrito anteriormente (Andersen et al.,

2012)com pequenas modificações relacionadas ao acoplamento com 5 fluorocromos diferentes. Finalmente, foram realizadas análises multiméricas por coloração das células com um corante quaseinfravermelho indicativo de vida ou morte (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), clone SK1 de anticorpo contra CD8-FITC (BD, Heidelberg, Alemanha) e multímeros fluorescentes de pMHC. Para análise, foi usado um citômetro BD LSRII SORP equipado com lasers e filtros

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228/287 apropriados. As células específicas para peptídeos foram calculadas como porcentagem das células CD8+ totais. A avaliação da análise multimérica foi realizada pelo software FlowJo (Tree Star, Oregon, EUA). A ativação in vitro de linfócitos CD8+ específicos e positivos nos multímeros foi detectada por comparação com as estimulações de controles negativos. A imunogenicidade para um determinado antígeno foi detectada quando pelo menos uma cavidade estimulada in vitro avaliável de um doador saudável apresentava uma linhagem específica de células T CD8+ após estimulação in vitro (isto é a cavidade continha no mínimo 1% do multímero+ específico entre as células T CD8+, e a porcentagem de células multímero+ positivas era pelo menos 10x a mediana das simulações em controles negativos). Imunogenicidade in vitro contra peptídeos de CHC [00431] Para peptídeos de HLA classe I testados, a imunogenicidade in vitro pôde ser demonstrada pela geração de linhagens de células T específicas para os peptídeos. A Figura 9 mostra resultados exemplares de citometria de fluxo após coloração específica para multímeros TUMAP de 14 peptídeos da invenção mostrados na Figuras 3 a 9, junto com os controles negativos correspondentes. As Tabelas 11a e 11b resumem os resultados obtidos com os 118 peptídeos da invenção.

Tabela 11A: Imunogenicidade in vitro de peptídeos de HLA classe I da invenção. Exemplos de resultados de experimentos de imunogenicidade in vitro realizados pelo depositante com os peptídeos da invenção. <20% = +; 20% a 49% = ++; 50% a 69%= +++; > 70% = ++++

SEQ N^Q	Sequência	Cavidades positivas [%]
773	ALYGKLLKL	+++
774	VYVDDIYVI	+++

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229/287

Tabela 11b: Imunogenicidade in vitro de peptídeos de HLA classe I da invenção Exemplos de resultados de experimentos de imunogenicidade in vitro realizados pelo depositante com os peptídeos da invenção. <20% = +; 20% a 49% = ++; 50% a 69%= +++; > 70% = ++++

SEQ N^Q	Sequência	Cavidades positivas [%]	HLA
2	TLLKALLEI	++	A*02
3	ALIYNLVGI	++	A*02
4	ALFKAWAL	++++	A*02
5	RLLDFINVL	++	A*02
7	ALQAFEFRV	++++	A*02
60	GLLSLTSTLYL	+	A*02
62	KVLGVNVML	++	A*02
64	FLDPDRHFL	+++	A*02
66	GLLQELSSI	+	A*02
67	SLLLPSIFL	+++	A*02
71	YLEDTDRNL	+	A*02
73	FLIEELLFA	+++	A*02
75	KVVSVLYNV	+++	A*02
11	SYSDLHYGF	+++	A*24
12	KYEKIFEML	+	A*24
13	VYTFLSSTL	+	A*24
16	IYSPQFSRL	+	A*24
18	KYPVHIYRL	+	A*24
79	SYNEHWNYL	+	A*24
80	TAYMVSVAAF	+	A*24
82	SYFRGFTLI	+	A*24
113	QLDSNRLTY	+	A*01
115	FVDNQYWRY	+	A*01
20	RMASPVNVK	+	A*03
21	AVRKPIVLK	+	A*03
22	SLKERNPLK	+	A*03
23	GMMKGGIRK	++	A*03
24	SMYYPLQLK	+	A*03

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230/287

SEQ N^Q	Sequência	Cavidades positivas [%]	HLA
25	GTSPPSVEK	+++	A*03
26	RISEYLLEK	+	A*03
27	VLYGPAGLGK	+	A*03
28	KTYETNLEIKK	+	A*03
30	ALEVAHRLK	++	A*03
83	GTYAHTVNR	+	A*03
84	KLQPAQTAAK	+	A*03
85	VLLGSLFSRK	+	A*03
86	VVLLGSLFSRK	+	A*03
87	AVAPPTPASK	+	A*03
90	KVAGERYVYK	+++	A*03
91	RSLRYYYEK	++	A*03
94	ATFERVLLR	+	A*03
95	QSMYYPLQLK	+	A*03
99	KVVDRWNEK	++	A*03
100	RLFTSPIMTK	+	A*03
102	SVLTSSLVK	+	A*03
106	AAFVPLLLK	+++	A*03
109	KTFTIKRFLAK	+	A*03
110	SAAPPSYFR	++	A*03
32	SPNKGTLSV	+	B*07
33	SPTFHLTL	++++	B*07
34	LPRGPLASLL	+	B*07
35	FPDNQRPAL	+	B*07
36	APAAWLRSA	+++	B*07
37	RPLFQKSSM	+	B*07
38	SPHPVTALLTL	+	B*07
39	RPAPFEVVF	+++	B*07
40	KPGTSYRVTL	++++	B*07
41	RVRSRISNL	+	B*07
118	SPASRSISL	+	B*07
119	APLPRPGAVL	++	B*07

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231/287

SEQ N^Q	Sequência	Cavidades positivas [%]	HLA
120	RPAMNYDKL	+	B*07
121	VPNQSSESL	+	B*07
123	KPSESIYSAL	++	B*07
124	LPSDSHFKITF	++	B*07
128	YPRTITPGM	+	B*07
129	APRPASSL	+	B*07
130	FPRLVGPDF	+++	B*07
131	APTEDLKAL	++	B*07
133	MPNLPSTTSL	++++	B*07
134	RPIVPGPLL	++	B*07
139	SPQSMSNTL	+	B*07
140	SPRTEASSAVL	+	B*07
141	SPMTSLLTSGL	++	B*07
146	IPRPEVQAL	+++	B*07
147	APRWFPQPTVV	++	B*07
148	KPYGGSGPL	+	B*07
149	GPREALSRL	++	B*07
52	AEFLLRIFL	+	B*44
53	MEHPGKLLF	+	B*44
55	HETETRTTW	+++	B*44
57	QESDLRLFL	+	B*44
58	GEMEQKQL	++++	B*44
59	SENVTMKVV	++	B*44
174	AEATARLNVF	+	B*44
175	AEIEPKADG	++++	B*44
177	TEVGTMNLF	++	B*44
178	NELFRDGVNW	+	B*44
179	REAGDEFEL	+	B*44
180	REAGDEFELRY	++++	B*44
181	GEGPKTSW	+	B*44
182	KEATEAQSL	+	B*44
183	YEKGIMQKV	++++	B*44

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232/287

SEQ N^Q	Sequência	Cavidades positivas [%]	HLA
184	AELEALTDLW	+	B*44
186	REGPEEPGL	+	B*44
187	GEAQTRIAW	++	B*44
188	AEFAKKQPWW	++	B*44
189	KEFLFNMY	++++	B*44
190	YEVARILNL	++++	B*44
191	EEDAALFKAW	+++	B*44
192	YEFKFPNRL	+	B*44
195	AEDKRHYSV	+++	B*44
197	AEVLLPRLV	++	B*44
198	QEAARAAL	++	B*44
199	REIDESLIFY	+	B*44
200	AESIPTVSF	+++	B*44
201	AETILTFHAF	+++	B*44
202	HESEATASW	++	B*44
203	IEHSTQAQDTL	++++	B*44
205	SEITRIEM	++++	B*44
207	TEARATSDSW	+	B*44
208	TEVSRTEAI	+	B*44
209	TEVSRTEL	++++	B*44
210	VEAADIFQNF	+	B*44
211	EEKVFPSPLW	+++	B*44
212	MEQKQLQKRF	++	B*44
213	KESIPRWYY	+	B*44

EXEMPLO 4

Síntese de peptídeos [00432] Todos os peptídeos foram sintetizados por técnicas padronizadas e bem estabelecidas de síntese de peptídeos em fase sólida empregando a estratégia Fmoc. A identidade e a pureza de cada peptídeo foram determinadas por espectrometria de massa e RP-HPLC analítica. Os peptídeos foram obtidos na forma de liofilizados brancos

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233/287 a esbranquiçados com pureza >50%. Preferivelmente, todos os TUMAPs são administrados como sais de trifluoracetato ou sais acetato, mas outras formas em sal também são possíveis.

EXEMPLO 5

Ensaios de ligação a MHC [00433] Os peptídeos candidatos para terapias à base de células T de acordo com a presente invenção foram testados também para sua capacidade (afinidade) de ligação ao MHC. Os complexos individuais de peptídeo com MHC foram produzidos por troca de ligantes induzida por UV, na qual um peptídeo sensível a UV é clivado por irradiação UV e trocado pelo peptídeo de interesse a ser analisado. Entre os peptídeos candidatos, apenas aqueles capazes de se ligar eficazmente e estabilizar as moléculas de MHC receptivas a peptídeos podem impedir a dissociação dos complexos de MHC. Para determinar o rendimento da reação de troca, foi realizado um ELISA baseado na detecção da cadeia leve (β2ιτι) de complexos de MHC estabilizados. De forma geral, o ensaio foi realizado conforme descrito por Rodenko et al. (Rodenko etal., 2006).

[00434] Placas MAXISorp de 96 cavidades (NUNC) foram revestidas de um dia para outro com estreptavidina 2 pg/ml em PBS em temperatura ambiente, lavadas 4 vezes e bloqueadas por 1 ha 37Ό em BSA 2% contendo tampão bloqueador. Monômeros de HLAA*02:01/MLA-001 foram usados como padrões, cobrindo o intervalo de 15 a 500 ng/ml. Os monômeros peptídeo-MHC da reação de troca induzida por UV foram diluídos 100 vezes em um tampão bloqueador. As amostras foram incubadas por 1 ha 37^QC, lavadas 4 vezes, incubadas com HRP 2 pg/ml conjugado com anti-p2m por 1 ha 37^QC, lavadas novamente e detectadas com solução de TMB, que foi interrompida com NH2SO4. A absorbância foi medida a 450 nm. Os peptídeos candidatos que mostram altas taxas de trocas (preferivelmente

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234/287 maior que 50% e, mais preferivelmente, maior que 75%) são geralmente preferidos para geração e produção de anticorpos ou fragmentos de anticorpos e/ou de receptores de células T ou fragmentos dos mesmos, pois apresentam avidez suficiente pelas moléculas de MHC e impedem a dissociação dos complexos de MHC.

Tabela 12: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-A*02:01 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; >75% = ++++

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
1	MIPTFTALL	+++
2	TLLKALLEI	++++
3	ALIYNLVGI	++++
4	ALFKAWAL	++++
5	RLLDFINVL	++++
6	SLGKHTVAL	+++
7	ALQAFEFRV	++++
8	YLVTKVVAV	++++
9	VLLAGFKPPL	+
60	GLLSLTSTLYL	++++
61	YMVHIQVTL	++++
62	KVLGVNVML	++++
63	MMEEMIFNL	++++
64	FLDPDRHFL	++++
66	GLLQELSSI	++++
67	SLLLPSIFL	++++
68	KLFDTQQFL	++++
69	TTYEGSITV	++++
70	VLQGLLRSL	++++
71	YLEDTDRNL	++++
72	YLTDLQVSL	++++
73	FLIEELLFA	++++

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235/287

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
75	KVVSVLYNV	++++
216	IMFDDAIERA	++++
217	VSSSLTLKV	+
219	PLPRPGAVL	+
220	RMTTQLLLL	+++
221	SLLDLYQL	++
222	ALMRLIGCPL	++++
223	FAHHGRSL	+
224	SLPRFQVTL	++++
225	SVFAHPRKL	+++
227	YTFRYPLSL	+++
228	RLWDWVPLA	++++
229	ISVPAKTSL	+
231	SVTESTHHL	+++
232	TISSLTHEL	++++
234	GVATRVDAI	++
236	SAIPFSMTL	+++
241	RQPNILVHL	++
242	STIPALHEI	+++
243	YASEGVKQV	+++
244	DTDSSVHVQV	+

Tabela 13: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-A*24:02 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; >75% = ++++

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
10	RYSDSVGRVSF	++++
11	SYSDLHYGF	++++
12	KYEKIFEML	++++
13	VYTFLSSTL	++++
14	FYFPTPTVL	++++

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236/287

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
15	VYHDDKQPTF	++++
16	IYSPQFSRL	++++
17	RFTTMLSTF	++++
18	KYPVHIYRL	++++
19	KYVKVFHQF	++++
76	KYVAELSLL	++++
77	RYGPVFTV	++++
78	SFAPRSAVF	++++
79	SYNEHWNYL	++++
80	TAYMVSVAAF	+++
81	VYNHTTRPL	++++
82	SYFRGFTLI	++++
246	RYLAVVHAVF	++++
249	VYTPTLGTL	++++
252	LYQPRASEM	+++
255	VFVSFSSLF	+++

Tabela 14: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptideos restritos por HLA classe I a HLA-A*01:01 foi determinada em função do rendimento de troca de peptideos. >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; >75% = ++++

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
31	LLDEGAMLLY	++++
112	TVTGAEQIQY	++
113	QLDSNRLTY	+++
114	VMEQSAGIMY	++
115	FVDNQYWRY	+++
116	VLLDEGAMLLY	++
288	SPVTSVHGGTY	++
289	RWEKTDLTY	++
290	DMDEEIEAEY	++
291	ETIRSVGYY	+++
292	NVTMKVVSVLY	+++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 255/538

237/287

Tabela 15: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-A*03:01 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; >75% = ++++

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
20	RMASPVNVK	++++
21	AVRKPIVLK	+++
22	SLKERNPLK	++
23	GMMKGGIRK	+++
24	SMYYPLQLK	+++
25	GTSPPSVEK	++
26	RISEYLLEK	++
27	VLYGPAGLGK	+++
28	KTYETNLEIKK	+++
30	ALEVAHRLK	++
83	GTYAHTVNR	+++
84	KLQPAQTAAK	++
85	VLLGSLFSRK	++
86	VVLLGSLFSRK	++
87	AVAPPTPASK	++
88	VVHAVFALK	+++
89	RVAELLLLH	++
90	KVAGERYVYK	+++
91	RSLRYYYEK	++
93	KILEEHTNK	++
94	ATFERVLLR	+++
95	QSMYYPLQLK	++
98	LLQPPPLLAR	++
99	KVVDRWNEK	++
100	RLFTSPIMTK	+++
101	RVFTSSIKTK	++
102	SVLTSSLVK	++
104	VLADSVTTK	++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 256/538

238/287

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
105	RLFSWLVNR	+++
106	AAFVPLLLK	++
107	RLQEWKALK	+++
109	KTFTIKRFLAK	++
110	SAAPPSYFR	++
256	RTEEVLLTFK	++
257	VTADHSHVF	+
258	GAYAHTVNR	+++
259	KTLELRVAY	++
260	GTNTVILEY	+++
261	HTFGLFYQR	++
262	RSRLNPLVQR	++
263	SSSSATISK	++
264	AIKVIPTVFK	++
265	QIHDHVNPK	++
266	ISYSGQFLVK	+++
267	VTDLISPRK	++
269	RLKGDAWVYK	+++
270	AVFNPRFYRTY	++
271	RMFADDLHNLNK	+++
272	RQPERTILRPR	++
273	RVNAIPFTY	+++
274	KTFPASTVF	+
275	STTFPTLTK	++
276	VSKTTGMEF	+
277	TTALKTTSR	+
278	NLSSITHER	++
279	SVSSETTKIKR	++
280	SVSGVKTTF	++
281	RAKELEATF	+
283	IVQEPTEEK	++
284	KSLIKSWKK	++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 257/538

239/287

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
285	GTVNPTVGK	++
286	TVAPPQGVVK	++
287	RRIHTGEKPYK	++

Tabela 16: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-B*07:02 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; >75% = ++++

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
32	SPNKGTLSV	+++
33	SPTFHLTL	+++
34	LPRGPLASLL	+++
35	FPDNQRPAL	+++
36	APAAWLRSA	++
37	RPLFQKSSM	+++
38	SPHPVTALLTL	+++
39	RPAPFEVVF	+++
40	KPGTSYRVTL	+++
41	RVRSRISNL	+++
118	SPASRSISL	+++
119	APLPRPGAVL	+++
120	RPAMNYDKL	++
121	VPNQSSESL	+++
122	YPGFPQSQY	++
123	KPSESIYSAL	+++
124	LPSDSHFKITF	+++
125	VPVYILLDEM	++
126	KPGPEDKL	++
127	APRAGSQVV	+++
128	YPRTITPGM	+++
129	APRPASSL	+++
130	FPRLVGPDF	+++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 258/538

240/287

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
131	APTEDLKAL	+++
132	IPGPAQSTI	++
133	MPNLPSTTSL	+++
134	RPIVPGPLL	+++
135	RVRSTISSL	+++
136	SPFSAEEANSL	+++
137	SPGATSRGTL	+++
138	SPMATTSTL	+++
139	SPQSMSNTL	+++
140	SPRTEASSAVL	+++
141	SPMTSLLTSGL	+++
142	TPGLRETSI	++
143	SPAMTSTSF	++
144	SPSPVSSTL	+++
145	SPSSPMSTF	++
146	IPRPEVQAL	+++
147	APRWFPQPTVV	+++
148	KPYGGSGPL	+++
149	GPREALSRL	+++
293	VPDSGATATAY	++
294	YPLRGSSIF	+++
295	YPLRGSSIFGL	+++
296	YPLRGSSI	++
297	TVREASGLL	+++
298	YPTEHVQF	++
299	HPGSSALHY	++
300	IPMAAVKQAL	+++
301	SPRRSPRISF	++
302	RVEEVRALL	+++
303	LPMWKVTAF	+++
304	LPRPGAVL	+++
305	TPWAESSTKF	++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 259/538

241/287

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
306	APVIFSHSA	++
307	LPYGPGSEAAAF	+++
308	YPEGAAYEF	++
309	FPQSQYPQY	++++
311	RPLFYVVSL	++
312	LPYFREFSM	+++
313	KVKSDRSVF
314	VPDQPHPEI	+++
315	SPRENFPDTL	+++
316	EPKTATVL	++
317	FPFQPGSV	+++
318	FPNRLNLEA	+++
319	SPAEPSVYATL	++++
320	FPMSPVTSV	+++
321	SPMDTFLLI	++
322	SPDPSKHLL	++
323	RPMPNLRSV	+++
324	VPYRVVGL	++
325	GPRNAQRVL	+++
326	VPSEIDAAF	++
327	SPLPVTSLI	+++
328	EPVTSSLPNF	++
329	FPAMTESGGMIL	+++
330	FPFVTGSTEM	++
331	FPHPEMTTSM	+++
332	FPHSEMTTL	+++
333	FPHSEMTTVM	+++
334	FPYSEVTTL	+++
335	HPDPVGPGL	++
336	HPKTESATPAAY	++
337	HPVETSSAL	+++
338	HVTKTQATF	++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 260/538

242/287

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
339	LPAGTTGSLVF	+++
340	LPEISTRTM	++
341	LPLDTSTTL	+++
342	LPLGTSMTF	+++
343	LPSVSGVKTTF	++
344	LPTQTTSSL	+++
345	LPTSESLVSF	++
346	LPWDTSTTLF	+++
347	MPLTTGSQGM	++
348	MPNSAIPFSM	+++
349	MPSLSEAMTSF	+++
350	NPSSIIIEF	+++
351	NVLTSTPAF	++
352	SPAETSTNM	+++
353	SPAMTTPSL	+++
354	SPLPVTSLL	+++
355	SPLVTSHIM	+++
356	SPNEFYFTV	+++
357	SPSPVPTTL	+++
358	SPSPVTSTL	+++
359	SPSTIKLTM	+++
360	SPSVSSNTY	++
361	SPTHVTQSL	+++
362	SPVPVTSLF	+++
363	TAKTPDATF	++
364	TPLATTQRF	++
365	TPLATTQRFTY	++
367	TPSVVTEGF	++
368	VPTPVFPTM	++
369	FPHSEMTTV	+++
370	PGGTRQSL
371	LYVDGFTHW	++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 261/538

243/287

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
372	IPRNPPPTLL	+++
373	RPRALRDLRIL	+++
374	NPIGDTGVKF	+++
375	AAASPLLLL	++
376	RPRSPAGQVA	+++
377	RPRSPAGQVAAA	+++
378	RPRSPAGQVAA	+++
379	GPFPLVYVL	+++
380	IPTYGRTF	+++
381	LPEQTPLAF	++
382	SPMHDRWTF	+++
383	TPTKETVSL	+++
384	YPGLRGSPM	++++
385	SPALHIGSV	+++
386	FPFNPLDF	++
387	APLKLSRTPA	+++
388	SPAPLKLSRTPA	++
389	SPGAQRTFFQL	+++
390	NPDLRRNVL	+++
391	APSTPRITTF	+++
392	KPIESTLVA	+++

Tabela 17: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-B*44:02 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; >75% = ++++

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
52	AEFLLRIFL	++
53	MEHPGKLLF	++++
54	AEITITTQTGY	+++
55	HETETRTTW	+++
56	SEPDTTASW	+++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 262/538

244/287

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
57	QESDLRLFL	+++
58	GEMEQKQL	++
59	SENVTMKVV	+++
173	AEAQVGDERDY	+++
174	AEATARLNVF	++++
175	AEIEPKADG	++
176	AEIEPKADGSW	+++
177	TEVGTMNLF	+++
178	NELFRDGVNW	+++
179	REAGDEFEL	++
180	REAGDEFELRY	++
181	GEGPKTSW	++
182	KEATEAQSL	+++
183	YEKGIMQKV	++
184	AELEALTDLW	+++
185	AERQPGAASL	++
186	REGPEEPGL	++
187	GEAQTRIAW	+++
188	AEFAKKQPWW	+++
189	KEFLFNMY	++
190	YEVARILNL	++
191	EEDAALFKAW	+++
192	YEFKFPNRL	+++
193	LEAQQEAL	++
194	KEVDPTSHSY	++
195	AEDKRHYSV	++
196	REMPGGPVW	+++
197	AEVLLPRLV	+++
198	QEAARAAL	++
199	REIDESLIFY	+++
200	AESIPTVSF	+++
201	AETILTFHAF	+++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 263/538

245/287

SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
202	HESEATASW	+++
203	IEHSTQAQDTL	++
204	RETSTSEETSL	+++
205	SEITRIEM	++
206	SESVTSRTSY	+++
207	TEARATSDSW	+++
208	TEVSRTEAI	++
209	TEVSRTEL	++
210	VEAADIFQNF	+++
211	EEKVFPSPLW	+++
212	MEQKQLQKRF	+++
213	KESIPRWYY	++
214	VEQTRAGSLL	++
215	SEDGLPEGIHL	++
396	REASGLLSL	+++
397	REGDTVQLL	++
398	SFEQVVNELF	++
399	RELLHLVTL	+++
400	GEIEIHLL
402	RELANDELIL	++
403	EEAQWVRKY	++
404	NEAIMHQY	++
405	NEIWTHSY
406	EDGRLVIEF
407	AEHEGVSVL	++
408	LEKALQVF	++
409	REFVLSKGDAGL	+++
410	SEDPSKLEA
411	LELPPILVY
412	QEILTQVKQ	++
413	IEALSGKIEL	++
414	EDAALFKAW	++

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 264/538

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SEQ N^Q	Sequência	Troca de peptídeo
415	REEDAALFKAW	+++
416	SEEETRVVF	+++
417	AEHFSMIRA	++
418	FEDAQGHIW	+++
419	HEFGHVLGL	++
420	FESHSTVSA
421	GEPATTVSL	++
422	SETTFSLIF	+++
423	SEVPTGTTA	++
424	TEFPLFSAA
425	SEVPLPMAI	+++
426	PEKTTHSF
427	HESSSHHDL	++
429	REKFIASVI	++
431	AEQDPDELNKA	++
432	EEQYIAQF
433	SDSQVRAF
434	KEAIREHQM	++
435	REEFVSIDHL	++
436	REPGDIFSEL	++
437	TEAVVTNEL	++
438	SEVDSPNVL	+++

EXEMPLO 6

Estabilidade dos complexos de peptideo-MHC classe I [00435] Foram realizados ensaios de estabilidade para peptídeos ligantes de HLA-B*08:01. Os dados foram obtidos a partir de um ensaio baseado em proximidade, que foi realizado de forma homogênea e em tempo real para medir a dissociação de peptídeos de moléculas de HLA classe I. Primeiramente, HLA-B*08:01 e b2m humanos recombinantes foram expressos em E. coli e purificados em uma série de

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247/287 etapas baseadas em cromatografia líquida (Ferre et al., 2003; Ostergaard et al., 2001). Em seguida, determinou-se a estabilidade de um complexo de peptídeo com MHC (pMHC) medindo-se a quantidade de b2m associada a cadeias pesadas de MHC por um intervalo de tempo a 370 (Harndahl et al., 2012). A estabilidade dos pMHC (expressa como meia-vida do b2m associado à respectiva cadeia pesada) foi calculada ajustando-se os dados a uma equação de dissociação monofásica.

[00436] A estabilidade do pMHC foi medida em três experimentos independentes com os peptídeos em questão. Constatou-se que com o HLA-B*08:01 a ligação pode ser de fraca (+) a muito intensa (++++). A meia-vida média (ti/2) é mostrada na Tabela 18.

Tabela 18: Meia-vida média (ti/2) baseada em três medições individuais. ti/2 > 2 h: +; ti/2 > 4 h: ++; ti/2 > 6 h: +++; ti/2 > 10 h: ++++

SEQ N^Q	Sequência	Meia-vida média (ti/2)
43	ALKARTVTF	+++
44	LNKQKVTF	++++
45	VGREKKLAL	++
46	DMKKAKEQL	+
47	MPNLRSVDL	++
48	DVKKKIKEV	+
49	LPRLKAFMI	++
50	DMKYKNRV	+
51	SLRLKNVQL	+
150	MAAVKQAL	++
151	HLLLKVLAF	++
152	MGSARVAEL	++
153	NAMLRKVAV	+
154	MLRKIAVAA	+
156	HVKEKFLL	++
157	EAMKRLSYI	+
158	LPKLAGLL	+

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SEQ N^Q	Sequência	Meia-vida média (ti/2)
159	VLKHKLDEL	+
160	YPKARLAF	+++
161	ALKI I I I AL	+
162	QAKTHSTL	+
163	QGLLRPVF	++
164	SIKTKSAEM	+++
166	TPKLRETSI	++
167	TSHERLTTL	++
169	TSMPRSSAM	+++
170	YLLEKSRVI	++
171	FAFRKEAL	++
172	KLKERNREL	+++
394	MYKMKKPI	+
395	VLLPRLVSC	+

EXEMPLO 7

Escores de ligação de peptideos selecionados em função de alótipos de HLA classe II [00437] As moléculas do complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC classe II) são expressas sobretudo na superfície de células apresentadoras de antígenos especializadas, onde apresentam peptideos para células T auxiliares, o que desencadeia o início e determina a evolução de diversas respostas imunes do hospedeiro. Portanto, é importante determinar quais peptideos serão apresentados pela por cada molécula de MHC classe II. Com essa informação, pode-se caracterizar a ativação de células T auxiliares e identificar epitopes de células T. Os peptideos apresentados por moléculas de MHC classe II se encaixam em sulcos de ligação formados por resíduos das cadeias α e β da molécula de MHC. A afinidade de ligação dos peptideos pelo MHC é determinada principalmente pela sequência de aminoácidos da região ligante do peptídeo. Para os principais alelos de

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249/287

HLA classe II, existem algoritmos de previsão de ligação entre peptídeos e o HLA. Alguns desses algoritmos foram testados por meio do algoritmo SYFPEITHI (Rammensee et al., 1999). O algoritmo já foi usado de forma bem-sucedida para identificar epítopos de classe I e classe II para diversos antígenos, por exemplo, os antígenos associados a tumores humanos TRP2 (classe I) (Sun et al., 2000) e SSX2 (classe II) (Neumann et al., 2004). A Tabela 20 mostra os alótipos de HLA classe II mais propensos a se ligarem aos peptídeos selecionados. Os peptídeos cujo escore SYFPEITHI foi igual ou superior a 18 foram classificados como ligantes das moléculas de HLA.

Tabela 20: Ligação de diversos peptídeos classe II a vários alótipos de HLA classe II. Segundo previsto pelo algoritmo SYFPEITHI, os peptídeos selecionados provavelmente se ligarão a pelo menos quatro dos alótipos de HLA classe II que apresentam motivos de ligação conhecidos. A lista mostra todos os alelos de HLA classe II para os quais existe uma matriz de previsão SYFPEITHI.

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
552	GVNAMLRKVAV AAASKPHVE	DRB1 *11:04	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), QA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB113:02, DRB1*15:01	15
560	PNFSGNWKIIRS ENFEELLK	DRB1 *07:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB1 08:03, DRB1 09:01, DRB111:01, DRB113:02, DRB115:01, DRB1*15:02	14

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 268/538

250/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
574	LPDFYNDWMFIA KHLPDL	DRB1*11:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB1 08:03, DRB1 11:01, DRB1 11:04, DRB113:02, DRB115:01, DRB115:02	15
575	VGDDHLLLLQGE QLRRT	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 09:01, DRB115:01, DRB1*15:02	8
579	SGGPLVCDETLQ GILS	DQA1*0501/D ΟΒΓ0201 (DQ2)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB115:01	8
582	GSQPWQVSLFN GLSFH	DRB1*15:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB115:01, DRB1*15:02	10
583	LTVKLPDGYEFK FPNRLNLEAINY	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB1 08:03, DRB1 09:01, DRB111:01, DRB113:02, DRB115:01, DRB1*15:02	14

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 269/538

251/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
587	DQANLTVKLPDG YEFKFPNRLNL	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB104:05, DRB1 07:01, DRB108:02, DRB1 08:03, DRB1 11:01, DRB113:02, DRB115:01, DRB115:02	13
588	VAPDAKSFVLNL GKDSNNL	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01 /DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB104:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB108:03, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB113:02	16
590	RVRGEVAPDAK SFVLNLG	DRB1 *03:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01 /DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB1 11:04, DRB115:01	10
596	MAADGDFKIKCV AFD	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2); DRB1 03:01; DRB1 07:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB104:05, DRB1 07:01, DRB108:03, DRB109:01, DRB1*15:01	10
597	SPDAESLFREAL SNKVDEL	DRB1 *07:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01 /DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 04:01, DRB104:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 09:01	8

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 270/538

252/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
601	LSNKVDELAHFL LRK	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB1 08:03, DRB1 11:01, DRB1 11:04, DRB115:01, DRB1*15:02	14
604	KLITQDLVKLKYL EYRQ	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 08:02, DRB113:01, DRB113:02, DRB115:01	9
605	LTVAEVQKLLGP HVEGLKAEERH RP	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB115:01, DRB1*15:02	15
622	MDALRGLLPVLG QPIIRSIPQGIVA	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB1 11:04, DRB115:01, DRB1*15:02	15

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 271/538

253/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
645	RGLLPVLGQPIIR SIPQGIVAAWRQ	DRB1 01:01; DRB1 09:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB115:01, DRB115:02	14
658	VSTMDALRGLLP VLGQPIIRSIPQG	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB115:01, DRB115:02	14
662	LRTDAVLPLTVA EVQKLLGPHVEG	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB115:01, DRB1*15:02	15
669	VLPLTVAEVQKL LGPHVEGLKAEE	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB115:01, DRB1*15:02	15

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 272/538

254/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
672	LRGLLPVLGQPII RSIPQGIVAA	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, , DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB115:01, DRB115:02	14
673	IPFTYEQLDVLKH KLDELYPQ	DRB1 *08:03	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB1 08:03, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB1 11:04, DRB113:02, DRB115:01, DRB115:02	15
676	VPPSSIWAVRPQ DLDTCDPR	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:03, DRB109:01, DRB1*15:01	10
679	WGVRGSLLSEA DVRALGGLA	DRB1 *09:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB115:01	12

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 273/538

255/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
706	LSTERVRELAVA LAQKNVK	DQA105:01/D QB1 03:01 (DQ7)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB104:02, DRB1 04:04, DRB104:05, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB115:01, DRB1*15:02	15
714	AIPFTYEQLDVLK HKLDE	DRB1 *08:03	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB104:05, DRB1 07:01, DRB108:02, DRB1 08:03, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB1 11:04, DRB113:02, DRB115:01, DRB115:02	15
715	GLSTERVRELAV ALAQKN	DQA105:01/D QB1 03:01 (DQ7)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB104:02, DRB1 04:04, DRB104:05, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB115:01, DRB1*15:02	15
717	IPQGIVAAWRQR SSRDPS	DRB1 *11:04	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB104:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 11:01, DRB1 11:04, DRB113:01, DRB1*15:01	13

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 274/538

256/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
720	ALGGLACDLPGR FVAES	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:05, DRB1 11:01, DRB1 11:04	8
721	RELAVALAQKNV KLSTE	DQA105:01/D QB1 03:01 (DQ7)	DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 09:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB115:01	11
722	LKALLEVNKGHE MSPQ	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ 2); DRB1 01:01; DRB1 04:05; DRB1 08:03; DRB1 11:04	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 08:03, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB115:01	13
723	TFMKLRTDAVLP LTVA	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB1 08:03, DRB1 09:01, DRB113:02, DRB115:01, DRB115:02	13
727	TLGLGLQGGIPN GYLV	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ 2); DRB1 01:01; DRB115:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB115:01	9

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 275/538

257/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
728	DLPGRFVAESAE VLL	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB109:01, DRB115:01, DRB115:02	12
732	ERHRPVRDWILR QRQ	DRB1*15:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 04:01, DRB104:04, DRB1*15:01	4
733	SPRQLLGFPCAE VSG	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB1 01:01, DRB1 04:01, DRB104:04, DRB115:01, DRB115:02	8
734	SRTLAGETGQEA APL	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB104:05, DRB1*15:01	6
735	VTSLETLKALLEV NK	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:03, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB115:01, DRB1*15:02	15

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 276/538

258/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
745	WELSQLTNSVTE LGPYTLDRD	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2); DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB109:01, DRB113:01, DRB115:01, DRB1*15:02	13
746	EITITTQTGYSLA TSQVTLP	DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB115:01	10
747	ATTPSW VETHS 1 VIQGFPH	DRB1 *07:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB115:01, DRB1*15:02	9
748	GIKELGPYTLDR NSLYVNG	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2); DRB1 *01:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB1 09:01, DRB113:02, DRB115:01, DRB115:02	13
755	IELGPYLLDRGSL YVNG	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB1 09:01, DRB111:04, DRB113:02, DRB115:01, DRB1*15:02	14

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 277/538

259/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
759	EELGPYTLDRNS LYVNG	DRB1 *03:01	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB109:01, DRB113:02, DRB115:01, DRB1*15:02	12
760	LKPLFKSTSVGP LYSG	DRB1 *11:04	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB1 08:03, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB113:02, DRB1*15:01	16
764	FDKAFTAATTEV SRTE	DQA105:01/D QB1 03:01 (DQ7)	DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB1 01:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB115:01	9
765	ELGPYTLDRDSL YVN	DQA105:01/D QB1 02:01 (DQ2)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB113:02, DRB115:01, DRB115:02	11
766	GLLKPLFKSTSV GPL	DRB1 *11:04	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DRB1 01:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:02, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 08:02, DRB1 08:03, DRB1 09:01, DRB1 11:01, DRB111:04, DRB113:01, DRB113:02, DRB1*15:01	16

Petição 870190070497, de 24/07/2019, pág. 278/538

260/287

SEQ N^e	Sequência	Melhores ligantes de HLA classe II	Ligantes de HLA classe II	N^e de ligantes de HLA classe II
768	SDPYKATSAVVI TST	DQA1 05:01/D QB1 03:01 (DQ7)	DQA1 05:01/DQB1 02:01 (DQ2), DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DQB1 06:02, DRB101:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 07:01, DRB109:01, DRB115:01, DRB115:02	10
770	SRKFNTMESVLQ GLL	DRB1 *09:01	DQA1 05:01/DQB1 03:01 (DQ7), DRB101:01, DRB1 03:01, DRB1 04:01, DRB1 04:04, DRB1 04:05, DRB1 07:01, DRB1 09:01, DRB113:02, DRB1*15:01	10

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ N^Q. 1 a SEQ N^Q. 772 e sequências variantes da mesma com pelo menos 88% de homologia com SEQ N^Q. 1 a SEQ N^Q. 772, em que as referidas variantes se ligam a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e/ou induzem reação cruzada de células T com o referido peptídeo variante, e um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, sendo que o referido peptídeo não é um polipeptídeo completo.
2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo possui capacidade de se ligar a uma molécula de MHC classe I ou II, sendo que tal peptídeo pode, quando ligado ao referido MHC, ser reconhecido por células T CD4 e/ou CD8.
3. Peptídeo ou variante do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do mesmo compreende um segmento contínuo de aminoácidos de acordo com qualquer elemento de SEQ N^Q. 1 a SEQ N^Q. 772.
4. Peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo ou variante do mesmo possui comprimento total de 8 a 100, preferivelmente de 8 a 30, mais preferivelmente de 8 a 16 aminoácidos e, mais preferido onde o peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ N^Q. 1 a SEQ N^Q. 772.
5. Peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é modificado e/ou inclui ligações não peptídicas.
6. Peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer

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2/9 uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo é parte de uma proteína de fusão, em especial uma proteína que contém aminoácidos N-terminais da cadeia invariante (li) associada ao antígeno HLA-DR.
7. Anticorpo, em particular um anticorpo solúvel ou ligado a membrana, preferivelmente um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que reconhece especificamente o peptídeo ou variante do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, preferivelmente o peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 quando ligado a uma molécula de MHC.
8. Receptor de célula T, preferivelmente solúvel ou ligado à membrana, ou um fragmento do mesmo que reaja com um ligante de HLA, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é o peptídeo ou variante do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, preferivelmente o peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 quando ligado a uma molécula de MHC.
9. Receptor de célula T de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida sequência ligante de aminoácidos é pelo menos 88% idêntica a qualquer uma das sequências SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q 772 ou onde a referida sequência ligante de aminoácidos consiste em qualquer uma das sequências SEQ N^Q 1 a SEQ N^Q772.
10. Receptor de células T de acordo com as reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o referido receptor de células T é fornecido como molécula solúvel e, opcionalmente, realiza outra função efetora como um domínio de imunoestimulação ou uma toxina.
11. Aptâmero, caracterizado pelo fato de que reconhece especificamente o peptídeo ou variante do mesmo como definido em

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3/9 qualquer uma das reivindicações 1 a 5, preferivelmente o peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ligado a uma molécula de MHC.
12. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica um peptídeo ou uma variante do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, um anticorpo ou fragmento do mesmo como definido na reivindicação 7 ou um receptor de célula T ou fragmento do mesmo como definido nas reivindicações 8 ou 9, ligado opcionalmente a uma sequência promotora heteróloga ou a um vetor de expressão que expressa o referido ácido nucleico.
13. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido na reivindicação 7, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo como definido nas reivindicações 8 ou 9 ou o ácido nucleico ou o vetor de expressão como definido na reivindicação 12, em que a referida célula hospedeira é selecionada preferivelmente entre uma célula apresentadora de antígeno, tal como uma célula dendrítica, uma célula T ou uma célula NK.
14. Método in vitro de produção de linfócitos T ativados, caracterizado pelo fato de que o método compreende colocar células T em contato in vitro com moléculas de MHC classe I ou II humanas expressas na superfície de células apresentadoras de antígeno adequadas ou uma estrutura artificial que mimetiza uma célula apresentadora de antígeno por um período suficientemente longo para ativar as referidas células T de forma específica para o antígeno, em que tal antígeno é o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
15. Linfócito T ativado, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método como definido na reivindicação 14 que reco

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4/9 nhece seletivamente uma célula que apresenta um polipeptídeo que compreende uma das sequências de aminoácidos como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um ingrediente ativo selecionado do grupo que consiste em peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido na reivindicação 7, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo como definido nas reivindicações 8 ou 9, o aptâmero como definido na reivindicação 11, o ácido nucleico ou vetor de expressão como definido na reivindicação 12, a célula hospedeira como definida na reivindicação 13 ou o linfócito T ativado como definido na reivindicação 15 ou um ingrediente ativo conjugado ou marcado e um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, excipientes e/ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis.
17. Método de produção de um peptídeo ou variante do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido na reivindicação 7 ou o receptor de célula T ou fragmento do mesmo como definido nas reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o método compreende a cultura da célula hospedeira como definida na reivindicação 13 e o isolamento do peptídeo ou variante do mesmo, do anticorpo ou fragmento do mesmo ou do receptor de célula T ou fragmento do mesmo da referida célula hospedeira e/ou de seu meio de cultura.
18. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 7, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo de acordo com as reivindicações 8 ou 9, o aptâmero de acordo com a reivindicação 11,o ácido nucleico ou vetor de expressão de acordo com a reivindicação 12, a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13

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5/9 ou o linfócito T ativado de acordo com a reivindicação 15, caracterizados pelo fato de que são para uso em medicina.
19. Método para matar células alvo em um paciente no qual as células-alvo apresentam um polipeptídeo que compreende uma das sequências de aminoácidos como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao paciente um número eficaz de células T ativadas, como definidas na reivindicação 15.
20. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 7, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo de acordo com as reivindicações 8 ou 9, o aptâmero de acordo com a reivindicação 11,o ácido nucleico ou vetor de expressão de acordo com a reivindicação 12, a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13 ou o linfócito T ativado de acordo com a reivindicação 15, caracterizados pelo fato de que são para uso no diagnóstico e/ou tratamento do câncer ou para uso na fabricação de um medicamento anticâncer.
21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é selecionado do grupo formado por câncer de ovário, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, leucemia linfocítica crônica, linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda, câncer da vesícula biliar e colangiocarcinoma, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, mesotelioma e outros tumores que apresentam sobrexpressão de uma proteína da qual é derivado um peptídeo com SEQ N^Q1 a SEQ N^Q 772.
22. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:

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6/9

a) um recipiente que compreende uma composição farmacêutica que contém o(s) peptídeo(s) como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo ou fragmento do mesmo como definidos na reivindicação 7, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo como definidos nas reivindicações 8 ou 9, o aptâmero como definido na reivindicação 11, o ácido nucleico ou vetor de expressão como definido na reivindicação 12, a célula hospedeira como definida na reivindicação 13 ou o linfócito T ativado como definido na reivindicação 15 em solução ou em forma liofilizada.

b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução para reconstituição de uma formulação liofilizada;

c) opcionalmente, pelo menos mais um peptídeo selecionado do grupo formado por SEQ N^Q. 1 a SEQ N^Q. 774; e

d) opcionalmente, instruções de (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e/ou uso da formulação liofilizada.
23. Kit de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um ou mais dentre (iii) uma solução tampão, (iv) um diluente, (v) um filtro, (vi) uma agulha ou (v) uma seringa.
24. Método de produção de uma vacina anticâncer personalizada para terapia a base de compostos e/ou células para pacientes individuais, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende:

a) identificar os peptídeos associados a tumores (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral obtida do referido paciente;

b) comparar os peptídeos identificados em a) com um depósito de peptídeos pré-selecionados de acordo com sua imunogenicidade e/ou apresentação aumentada em tumores em comparação com tecidos normais;

c) selecionar pelo menos um peptídeo do depósito que cor

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7/9 responda a um TUMAP identificado no paciente; e

d) fabricar e/ou formular a vacina personalizada ou produto para terapia a base de compostos ou de células de acordo com a etapa c).
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os TUMAPs são identificados por:

a1) comparações dos dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido do tumor para identificar proteínas sobrexpressas ou com expressão aberrante na amostra tumoral; e a2) correlações dos dados de expressão com as sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC classe I e/ou MHC classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas sobrexpressas ou expressas de maneira aberrante pelo tumor.
26. Método de acordo com as reivindicações 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que as sequências dos ligantes de MHC são identificadas eluindo-se os peptideos ligados das moléculas de MHC isoladas da amostra tumoral e sequenciando-se os ligantes eluídos.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que o tecido normal correspondente ao tipo de tecido do tumor é obtido do mesmo paciente.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que os peptideos incluídos no depósito são identificados conforme as seguintes etapas:

aa. Realizar análise de expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) em todo o genoma, empregando microarrays ou perfis de expressão baseados em sequenciamento, compreendendo a identificação de genes sobrexpressos em tecidos malignos em comparação com um ou mais tecidos normais;

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8/9 ab. Selecioanr os peptídeos codificados pelos genes sobrexpressos ou expressos seletivamente detectados na etapa aa; e ac. Determinar as respostas de células T induzidas in vivo pelos peptídeos selecionados a partir de ensaios de imunogenicidade in vitro usando células T humanas de doadores saudáveis ou do referido paciente; ou ba. Identificar ligantes de HLA da amostra tumoral por espectrometria de massa;

bb. Realizar análise de expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) em todo o genoma, empregando microarrays ou perfis de expressão baseados em sequenciamento, compreendendo a identificação de genes sobrexpressos em tecidos malignos em comparação com um ou mais tecidos normais;

bc. Comparar os ligantes de HLA identificados com os referidos dados de expressão gênica;

bd. Selecionar peptídeos codificados por genes sobrexpressos ou expressos seletivamente detectados na etapa bc;

be. redetectar os TUMAPs selecionados na etapa bd em tecidos tumorais e pouca ou nenhuma detecção em tecidos saudáveis e confirmação da relevância da sobrexpressão ao nível de mRNA; e bf. Determinar a indução de respostas de células T in vivo pelos peptídeos selecionados a partir de ensaios de imunogenicidade in vitro em células T humanas de doadores saudáveis ou do referido paciente.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que a imunogenicidade dos peptídeos incluídos no depósito é determinada por um método que compreende ensaios de imunogenicidade in vitro, monitoramento da imunidade do paciente para detecção de ligação a HLAs individuais, coloração para multímeros de MHC, ensaios ELISPOT e/ou coloração

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9/9 para citocinas intracelulares.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que o referido depósito compreende uma pluralidade de peptídeos selecionados do grupo formado por SEQ N^Q. 1 a SEQ N^Q. 774.
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30, caracterizado pelo fato de compreender a identificação de pelo menos uma mutação exclusiva para a amostra tumoral em relação ao tecido normal correspondente de um paciente individual e seleção de um peptídeo que se correlaciona com a mutação para inclusão na vacina ou na criação de terapias celulares.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado fato de que pelo menos uma mutação é identificada por sequenciamento de genoma inteiro.