CN113130001A - 一种提高免疫抑制环境中t细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法及其应用 - Google Patents

一种提高免疫抑制环境中t细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法及其应用，属于医药技术领域，通过基于构建的T细胞免疫检查点PD‑L1结合位点晶体结构模型筛选所得的中药小分子可以纠正PD‑L1诱发T细胞增殖数量异常减少、T细胞活化细胞因子分泌异常减少及免疫抑制分子PD‑1表达的异常升高，从而筛选出对肿瘤细胞起到抑制作用的中药小分子，进而通过药物组合的方式对肿瘤进行治疗，通过协同效应，在肿瘤治疗中的多环节起作用，有效提高了中药对肿瘤的治疗效果，并且通过快速筛选抗肿瘤中药小分子，有效的减少中药的筛选范围，提高了配伍中药的速度，保证了中药对肿瘤治疗的及时性。

Description

一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化 合物配伍的筛选方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术，更具体地说，涉及一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法及其应用。
背景技术
肿瘤细胞高表达PD-L1可以与T细胞表面免疫检查点受体PD-1结合，抑制T细胞活性有利于肿瘤细胞免疫逃逸而促进肿瘤的发生发展。肿瘤细胞高表达HER2有利于促进自身的增殖活化。因此针对PD-L1、PD-1、HER2等靶点的小分子阻滞剂已成为肿瘤靶向治疗的重要方向。肿瘤患者中HER2的过度表达通常与PD-L1的表达呈正相关，而PD-L1的表达可能依赖于PI3K-AKT-mTOR通路，这表明针对上述靶点的药物组合可能是一种新的治疗方法。且不同于化学药治疗肿瘤以调节单一的作用靶点，中药具有多途径、多靶点、散弹式的治疗特点，尽管单一成分含量低，作用不明显，但可通过多环节起作用，具有协同效应。中药的多点微调、协同增效作用具有扶正祛邪的特点，在抗肿瘤方面应具有更大的优势。
药物发现中的主导模式是设计最具选择性的配体来作用于单个药物靶点的概念。然而，许多有效的药物是通过调节多个蛋白质而不是单个靶点发挥作用的。系统生物学的进展揭示了一种表型稳健性和网络结构，这强烈表明，与多靶点药物相比，精选的化合物可能表现出低于预期的临床疗效。这种对多元药理学作用的新认识对解决药物开发中的两个主要损耗来源－有效性和毒性－具有重要意义。
网络药理学强调对信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果，降低毒副作用，从而提高新药临床试验的成功率，节省药物的研发费用，鉴于网络药理可通过对多种复杂网络及多水平相互连接的分析来阐述中药多成分、多靶点、多通路的潜在作用机制。网络药理学的计算工具越来越多地被开发和应用于药物发现，以期解决诸如单个靶点分子缺乏疗效、副作用、耐药性和治疗反应的个体差异等问题。同时，中药等天然产物及其组合通常是多靶点的，靶点被认为涵盖并超过了食品和药物管理局批准的药物目前有限的靶点空间，因此具有开发新型治疗机会的潜力。
分子对接是结合了物理、化学和科学计算算法的一项前沿科学，是两个或多个分子之间通过几何匹配和能量匹配而相互识别的过程。分子对接技术是利用计算机模式识别和优化技术，依据配体与受体作用的“锁－钥”原理及“诱导契合”原理，模拟小分子配体与受体生物大分子相互作用，实现计算机辅助药物筛选(虚拟筛选)。其主要思路是针对某一个或多个与目标疾病相关的靶标蛋白，对中药化学成分和天然产物数据库进行虚拟筛选，根据对接后的得分结果，寻找与靶标蛋白具有特异作用的候选化合物，然后进行生物活性检测，最终筛选出具有活性的先导化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法，它可以实现有效免疫抑制环境中T细胞活性中药小分子筛选作用靶蛋白活性位点晶体结构模型的确定。
发明的另一目的在于更好应用活性中药小分子与抗肿瘤中药小分子配伍治疗肿瘤。
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：
一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法，包括以下几个步骤：
S1、确定T细胞免疫检查点PD-L1结合位点的晶体结构模型；
S2、将S1中的靶蛋白晶体结构及热点氨基酸位点使用Pymol可视化软件进行图片处理，根据PD-1/PD-L1相互作用的结合分析，得到PD-L1蛋白的晶体结构，根据PD-1与PD-L1结合的相互作用分析得到构建格点文件的热点氨基酸残基；
S3、使用薛定谔软件
Figure BDA0003000400550000031
软件中的ADME/Tox模块将收集到临床抗肿瘤有效复方中的所有中药药物成分进行类药性分析，筛选得到符合类药性的小分子X个；
S4、根据S3中的对接结果分别筛选靶向PD-L1的中药小分子进行微量热泳动实验(microscale thermophoresis，MST)，检测中药小分子与靶蛋白的结合亲和力；
S5、分子动力学模拟及中药小分子与靶蛋白的结合自由能，判断S4中筛选出的中药小分子与靶蛋白的结合能力；
S6、使用CCK8法、流式细胞术检测不同浓度PD-L1对T淋巴细胞增殖的影响，在各组加入PD-L1基础上，分组加入筛选所获得中药小分子培养72小时；
S7、对S6中的中药小分子干预后不同组细胞增殖计数；
S8、对S6中的中药小分子干预后不同组上清液中T细胞分泌活化细胞因子(IFN-γ/IL-2)表达量检测；
S9、对S6中各对照组进行流式检测，检测中药小分子干预后各组T细胞PD-1表达情况；
S10、对比S7-S9中各步骤中的中药小分子进行综合筛选，筛选出能够纠正PD-L1诱发T细胞增殖数量异常减少、减少T细胞活化细胞因子分泌异常及导致免疫抑制分子PD-1(PD-L1的受体)表达的异常升高的中药小分子。
作为本发明的一种优选方案，所述S1中PD-L1结合位点属于蛋白质－蛋白质界面结合位点，潜在活性残基选择为Tyr56、Met115、Ala121、Tyr122和Asp123。
作为本发明的一种优选方案，所述S3中的中药小分子筛选工作运用
Figure BDA0003000400550000041
中的Glide Docking模块将靶蛋白与符合类药性的小分子逐一进行对接，得到对接后打分，对接得分负值越大，小分子与靶蛋白的结合越好。
作为本发明的一种优选方案，所述S5中结合自由能计算方法为使用分子动力学软件包AMBER20进行50ns的分子动力学模拟，并基于模拟所得轨迹，使用MM-PBSA方法计算中药小分子与靶蛋白PD-L1的结合自由能。
作为本发明的一种优选方案，所述S5中的中药小分子与靶蛋白PD-L1的结合自由能计算结果以负值表示，结果小于－15kcal/mol，说明结合能力较好。
作为本发明的一种优选方案，所述S6检测结果显示300ng/ml干预72h能够明显抑制T淋巴细胞增殖，并且在加入筛选所获得中药小分子的模型组外额外设置空白对照组。
上述提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法的应用，包括以下几个步骤：
S1、根据权1中的方法获得可提高PD-L1诱发免疫抑制环境中T细胞活性中药小分子；
S2、确定靶蛋白晶体结构模型，根据文献查阅得到靶蛋白与小分子抑制剂结合的晶体结构，在此基础上使用薛定谔软件进行配体剥离，得到蛋白质晶体结构，结合文献及小分子与靶蛋白结合位点得到构建格点文件的热点氨基酸残基；
S3、使用薛定谔软件
Figure BDA0003000400550000042
软件中的ADME/Tox模块将收集到临床抗肿瘤有效复方中的787个中药药物成分进行类药性分析，筛选得到符合类药性的小分子N个，运用
Figure BDA0003000400550000043
中的Glide Docking模块将靶蛋白与符合类药性的小分子逐一进行对接，得到对接后打分，筛选出结合性好的中药小分子；
S4、根据S3中的对接结果分别筛选靶向蛋白的中药小分子进行MST实验，检测中药小分子与白蛋白的结合亲和力，筛选出结合能力较高的中药小分子；
S5、使用分子动力学软件包AMBER20进行50ns的分子动力学模拟，并基于模拟所得轨迹，使用MM-PBSA方法，计算中药小分子与靶蛋白的结合自由能，选择结合能力好的中药小分子；
S6、EGF和S5中筛选得到的中药小分子最佳浓度干预肿瘤细胞，观察细胞生长状态，并检测各组细胞生长抑制情况，用靶细胞激活剂EGF刺激肿瘤细胞，同时分组加入筛选所获得中药小分子培养48h，显微镜下观察细胞增殖数量，并且与空白组比较，判断中药小分子的干预能力；
S7、使用CCK8法检测中药小分子干预EGF刺激的肿瘤细胞48h的抑制情况；
S8、基于构建的肿瘤细胞结合位点晶体结构模型筛选所得的中药小分子能够抑制EGF诱发肿瘤细胞增殖数量、提高增殖抑制率、抑制克隆点形成能力，综合选择配伍所需的中药小分子；
S9、根据S8中选择的中药小分子配伍抗肿瘤中药。
作为本发明的一种优选方案，所述S1中HER2的结合位点为底物结合位点，其活性残基为Lys753、Asp863、Thr862、Phe864和Met801。
作为本发明的一种优选方案，所述S3中中药小分子与靶蛋白对接得分负值越大，小分子与靶蛋白的结合越好，筛选出的中药小分子对接得分小于等于负四分。
作为本发明的一种优选方案，所述配伍组合包括PD-L1阻断剂中药小分子Formononetin和肿瘤细胞HER2抑制剂Quercetin。
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本方案通过基于构建的T细胞免疫检查点PD-L1结合位点晶体结构模型筛选所得的中药小分子可以纠正PD-L1诱发T细胞增殖数量异常减少、T细胞活化细胞因子分泌异常减少及免疫抑制分子PD-1表达的异常升高，从而筛选出对肿瘤细胞起到抑制作用的中药小分子，进而通过药物组合的方式对肿瘤进行治疗，通过协同效应，在肿瘤治疗中的多环节起作用，有效提高了中药对肿瘤的治疗效果，并且通过快速筛选抗肿瘤中药小分子，有效的减少中药的筛选范围，提高了配伍中药的速度，保证了中药对肿瘤治疗的及时性。
(2)通过使用Pymol可视化软件、薛定谔软件和分子动力学软件包AMBER20辅助抗肿瘤中药小分子的筛选，大幅度提高了抗肿瘤中药小分子的筛选效率，提高了中药抗肿瘤的实用性。
附图说明
图1为本发明中PD-L1的蛋白质晶体结构及其热点氨基酸位点图；
图2为本发明中PD-L1与中药小分子进行MST实验结果图；
图3为本发明中不同的中药小分子干预T细胞后的细胞增殖图片的二十倍放大图；
图4为本发明中靶蛋白HER2晶体结构及热点氨基酸位点；
图5为本发明中靶向HER2与中药小分子进行MST实验结果图；
图6为本发明中EGF及中药小分子干预48h后各组细胞生长情况的十倍放大图；
图7为本发明中中药小分子干预EGF刺激的MKN-45细胞48h抑制率比较图；
图8为本发明中EGF及中药小分子干预后MKN-45细胞的克隆点形成图；
图9为本发明中中药小分子干预共培养体系后各组细胞图片；
图10为本发明中WB检测中药小分子干预共培养体系后各组细胞中MKN-45细胞相关蛋白表达量分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。需要说明的是，当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例：
请参阅图1-3，一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法，包括以下几个步骤：
S1、确定T细胞免疫检查点PD-L1结合位点的晶体结构模型；
S2、将S1中的靶蛋白晶体结构及热点氨基酸位点使用Pymol可视化软件进行图片处理，T细胞免疫检查点PD-L1结合位点晶体结构模型的确定，PD-L1结合位点属于蛋白质－蛋白质界面结合位点，潜在活性残基选择为Tyr56、Met115、Ala121、Tyr122、Asp123。使用Pymol可视化软件进行图片处理，见图1；
图1中，A：PD-L1的蛋白质晶体结构(Structure of human PD-L1，Resolution:
Figure BDA0003000400550000081
)：根据PD-1/PD-L1相互作用的结合分析，得到PD-L1蛋白的晶体结构。B：PD-L1蛋白质晶体结构的热点氨基酸残基：根据PD-1与PD-L1结合的相互作用分析得到构建格点文件的热点氨基酸残基；
S3、使用薛定谔软件
Figure BDA0003000400550000082
软件中的ADME/Tox模块将收集到临床抗肿瘤有效复方中的787个中药药物成分进行类药性分析，筛选得到符合类药性的小分子483个，运用
Figure BDA0003000400550000083
中的Glide Docking模块将靶蛋白与符合类药性的小分子逐一进行对接，得到对接后打分(对接得分负值越大，小分子与靶蛋白的结合越好)，获得189个与PD-L1对接得分≤-4分，排名前十名见表1；
表1:归芪白术方中与PD-L1对接后得分较高的中药小分子
Figure BDA0003000400550000084
Figure BDA0003000400550000091
S4、根据S3中的对接结果分别筛选靶向PD-L1的中药小分子进行微量热泳动实验(microscale thermophoresis，MST)，检测中药小分子与靶蛋白的结合亲和力，结合亲和力较高的中药小分子与靶蛋白相互作用模式及相应的结合亲和力见图2，图2中MST实验结果为A的Kd等于355nM，B的Kd等于667nM；
S5、使用分子动力学软件包AMBER20进行50ns的分子动力学模拟，并基于模拟所得轨迹，使用MM-PBSA方法计算中药小分子Formononetin和Isorhamnetin与靶蛋白PD-L1的结合自由能(表2)，以负值表示，结果小于－15kcal/mol，说明结合能力较好。
表2:中药小分子与蛋白质结合自由能计算结果(kcal/mol)
Figure BDA0003000400550000092
S6、使用CCK8法、流式细胞术检测不同浓度PD-L1对T淋巴细胞增殖的影响，结果显示300ng/ml干预72h能够明显抑制T淋巴细胞增殖，在各组加入PD-L1基础上，分组加入筛选所获得中药小分子Formononetin、Isorhamnetin培养72小时；
S7、对S6中的中药小分子干预后不同组细胞增殖计数；
表3：中药小分子干预后不同组细胞计数结果
Figure BDA0003000400550000093
注：与空白组比较，模型组M(PD-L1)细胞数量明显减少(P<0.05)，Formononetin与模型组M(PD-L1)比较细胞数量明显增多(P<0.05)。
S8、对S6中的中药小分子干预后不同组上清液中T细胞分泌活化细胞因子(IFN-γ/IL-2)表达量检测；
表4：中药小分子干预后不同组上清液中T细胞分泌活化细胞因子(IFN-γ/IL-2)表达量检测
Figure BDA0003000400550000101
注：与空白组比较，模型组M(PD-L1)T细胞分泌的细胞因子明显减少(P<0.05)，中药小分子Formononetin、Isorhamnetin与模型组M(PD-L1)比较T细胞分泌活化细胞因子表达量明显增多(P<0.05)。
S9、对S6中各对照组进行流式检测，检测中药小分子干预后各组T细胞PD-1表达情况；
表5：中药小分子干预后各组PD-1+T细胞百分比
Figure BDA0003000400550000102
注：与空白组比较，模型组M(PD-L1)PD-1+T细胞明显增多(P<0.05)，中药小分子Formononetin、Isorhamnetin与模型组M(PD-L1)比较，PD-1+T细胞明显减少(P<0.05)。
S10、对比S7-S9中各步骤中的中药小分子进行综合筛选，筛选出能够纠正PD-L1诱发T细胞增殖数量异常减少、减少T细胞活化细胞因子分泌异常及导致免疫抑制分子PD-1(PD-L1的受体)表达的异常升高的中药小分子。
综上所述，基于构建的T细胞免疫检查点PD-L1结合位点晶体结构模型(残基Tyr56、Met115、Ala121、Tyr122、Asp123)筛选所得的中药小分子可以纠正PD-L1诱发T细胞增殖数量异常减少、T细胞活化细胞因子分泌异常减少及免疫抑制分子PD-1(PD-L1的受体)表达的异常升高。并获得Formononetin、Isorhamnetin。
请参阅图4-10，上述提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法的应用，包括以下几个步骤：
S1、根据上述方法首先获得可提高PD-L1诱发免疫抑制环境中T细胞活性中药小分子，如Formononetin；
S2、确定靶蛋白晶体结构模型，参考图4，根据文献查阅得到HER2与小分子抑制剂结合的晶体结构，在此基础上使用薛定谔软件进行配体剥离，得到蛋白质晶体结构，结合文献及小分子与靶蛋白HER2结合位点得到构建格点文件的热点氨基酸残基；
S3、使用薛定谔软件
Figure BDA0003000400550000112
软件中的ADME/Tox模块将收集到临床抗肿瘤有效复方中的787个中药药物成分进行类药性分析，筛选得到符合类药性的小分子483个，运用
Figure BDA0003000400550000113
中的Glide Docking模块将靶蛋白与符合类药性的小分子逐一进行对接，得到对接后打分(对接得分负值越大，小分子与靶蛋白的结合越好)，获得385个小分子与HER2对接得分≤-4分(绝对值)，排名前十名见表6；
表6：归芪白术方中与HER2对接后得分较高的中药小分子
Figure BDA0003000400550000111
Figure BDA0003000400550000121
S4、据对接结果分别筛选靶向HER2的中药小分子进行MST实验，检测中药小分子与白蛋白的结合亲和力。结合亲和力较高的中药小分子与靶蛋白相互作用模式及相应的结合亲和力见图5，图5中MST实验结果为A：HER2 vs quercetin，Kd＝490nM；B：HER2 vsdaidzein,Kd＝3.7μM；
S5、使用分子动力学软件包AMBER20进行50ns的分子动力学模拟，并基于模拟所得轨迹，使用MM-PBSA方法，计算中药小分子quercetin和daidzein与靶蛋白HER2的结合自由能(表7)，以负值表示，结果小于－15kcal/mol，说明结合能力较好；
表7：中药小分子与蛋白质结合自由能计算结果(kcal/mol)
Figure BDA0003000400550000122
S6、EGF和筛选的到的中药小分子最佳浓度干预肿瘤细胞MKN-45，观察细胞生长状态，并检测各组细胞生长抑制情况；
用HER2激活剂EGF刺激肿瘤细胞MKN-45，同时分组加入筛选所获得中药小分子quercetin和daidzein培养48h，显微镜下观察发现，与空白组比较，模型组细胞增殖明显；与模型组比较，中药小分子干预组细胞增殖降低(图6)；
S7、同时使用cck8检测中药小分子干预EGF刺激的MKN-45细胞48h抑制情况，如图6和表6所示：EGF促进MKN-45细胞的生长，而中药小分子不同程度抑制MKN-45细胞的生长；如图7所示，与模型组M(EGF)比较，中药小分子quercetin和daidzein能够明显抑制胃癌MKN-45细胞增殖(P<0.05)；
表8：中药小分子干预EGF刺激的MKN-45细胞48h抑制率
Figure BDA0003000400550000123
注：与模型组M(EGF)比较，中药小分子对细胞有明显的抑制作用，P<0.05。
S8、基于构建的肿瘤细胞结合位点晶体结构模型筛选所得的中药小分子能够抑制EGF诱发肿瘤细胞增殖数量、提高增殖抑制率、抑制克隆点形成能力，综合选择配伍所需的中药小分子；
如图8，与模型组比较，中药小分子对细胞克隆点形成有明显的抑制作用，P<0.05。
综上所述，基于构建的肿瘤细胞HER2结合位点晶体结构模型(残基Lys753、Asp863、Thr862、Phe864、Met801)筛选所得的中药小分子可以抑制EGF诱发肿瘤细胞增殖数量、提高增殖抑制率、抑制克隆点形成。并获得中药小分子Quercetin、Daidzein。
S9、根据S8中选择的中药小分子配伍抗肿瘤中药。
中药小分子干预T淋巴细胞与胃癌MKN-45细胞共培养体系24h，普通光学显微镜像观察细胞生长状态并拍照，如图9，再通过ELISA检测细胞上清液中T细胞活化关键细胞因子IFN-γ和IL-2水平，如表9所示；
表9：中药小分子干预共培养体系后各组细胞上清液中细胞因子(IFN-γ/IL-2)表达情况
Figure BDA0003000400550000131
注：与空白组比较，共培养组细胞上清液中细胞因子表达量明显减少(P<0.05)，与共培养组比较，formononetin组及formononetin联合quercetin组细胞上清液中细胞因子表达量明显增多(P<0.05)。
然后通过流式检测中药小分子干预共培养体系后各组细胞中T细胞PD-1的表达水平，如表10所示；
表10：流式检测中药小分子干预共培养体系后各组细胞中PD-1+T细胞百分比
Figure BDA0003000400550000141
注：与空白组比较，共培养组PD-1+T细胞百分比明显增多(P<0.05)，与共培养组比较，中药小分子干预组PD-1+T细胞百分比明显减少(P<0.05)，且与单独中药小分子干预组比较，formononetin联合quercetin组PD-1+T细胞百分比减少更为明显(P<0.05)。
然后进行肿瘤细胞活化增殖相关蛋白表达水平，如图10所示，图10中；与空白组比较，共培养组(M)MKN-45细胞HER2、PD-L1和PI3K表达量明显增加(P<0.05)；与共培养组(M)比较，formononetin组和formononetin联合quercetin组MKN-45细胞的各蛋白表达量明显减少(P<0.05)；与单独中药小分子干预组比较，formononetin联合quercetin组能明显降低PD-L1、AKT和Ki67的表达(P<0.05)。
最后通过PCR检测各组肿瘤细胞增殖相关核酸水平，如表11所示；
表11：中药小分子干预共培养体系后各组细胞中MKN-45细胞相关基因表达情况
Figure BDA0003000400550000142
注：与空白组比较，共培养组(M)MKN-45细胞PI3K、AKT、HER2和PD-L1基因表达量明显增加(P<0.05)；与共培养组(M)比较，formononetin组和formononetin联合quercetin组MKN-45细胞的各基因表达量明显减少(P<0.05)；与单独中药小分子干预组比较，formononetin联合quercetin组能明显降低AKT的表达(P<0.05)。
综上所述，T细胞免疫检查点PD-L1阻断剂中药小分子Formononetin组可以提高肿瘤环境中T细胞的活性，并抑制肿瘤细胞增殖；肿瘤细胞HER2抑制剂Quercetin可以抑制共培养环境中肿瘤细胞增殖相关蛋白表达；PD-L1阻断剂中药小分子Formononetin与肿瘤细胞HER2抑制剂Quercetin的配伍组对提高肿瘤环境中T细胞的活性、抑制肿瘤细胞增殖方面均优于单独用药组。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
S1、确定T细胞免疫检查点PD-L1结合位点的晶体结构模型；
S2、将S1中的靶蛋白晶体结构及热点氨基酸位点使用Pymol可视化软件进行图片处理，根据PD-1/PD-L1相互作用的结合分析，得到PD-L1蛋白的晶体结构，根据PD-1与PD-L1结合的相互作用分析得到构建格点文件的热点氨基酸残基；
S3、使用薛定谔软件
Figure FDA0003000400540000011
软件中的ADME/Tox模块将收集到临床抗肿瘤有效复方中的所有中药药物成分进行类药性分析，筛选得到符合类药性的小分子X个；
S4、根据S3中的对接结果分别筛选靶向PD-L1的中药小分子进行微量热泳动实验(microscale thermophoresis，MST)，检测中药小分子与靶蛋白的结合亲和力；
S5、分子动力学模拟及中药小分子与靶蛋白的结合自由能，判断S4中筛选出的中药小分子与靶蛋白的结合能力；
S6、使用CCK8法、流式细胞术检测不同浓度PD-L1对T淋巴细胞增殖的影响，在各组加入PD-L1基础上，分组加入筛选所获得中药小分子培养72小时；
S7、对S6中的中药小分子干预后不同组细胞增殖计数；
S8、对S6中的中药小分子干预后不同组上清液中T细胞分泌活化细胞因子(IFN-γ/IL-2)表达量检测；
S9、对S6中各对照组进行流式检测，检测中药小分子干预后各组T细胞PD-1表达情况；
S10、对比S7-S9中各步骤中的中药小分子进行综合筛选，筛选出能够纠正PD-L1诱发T细胞增殖数量异常减少、减少T细胞活化细胞因子分泌异常及导致免疫抑制分子PD-1(PD-L1的受体)表达的异常升高的中药小分子。
2.根据权利要求1所述的一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法，其特征在于：所述S1中PD-L1结合位点属于蛋白质－蛋白质界面结合位点，潜在活性残基选择为Tyr56、Met115、Ala121、Tyr122和Asp123。
3.根据权利要求1所述的一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法，其特征在于：所述S3中的中药小分子筛选工作运用
Figure FDA0003000400540000021
中的Glide Docking模块将靶蛋白与符合类药性的小分子逐一进行对接，得到对接后打分，对接得分负值越大，小分子与靶蛋白的结合越好。
4.根据权利要求1所述的一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法，其特征在于：所述S5中结合自由能计算方法为使用分子动力学软件包AMBER20进行50ns的分子动力学模拟，并基于模拟所得轨迹，使用MM-PBSA方法计算中药小分子与靶蛋白PD-L1的结合自由能。
5.根据权利要求1所述的一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法，其特征在于：所述S5中的中药小分子与靶蛋白PD-L1的结合自由能计算结果以负值表示，结果小于－15kcal/mol，说明结合能力较好。
6.根据权利要求1所述的一种提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法，其特征在于：所述S6检测结果显示300ng/ml干预72h能够明显抑制T淋巴细胞增殖，并且在加入筛选所获得中药小分子的模型组外额外设置空白对照组。
7.根据权利要求1-6所述的提高免疫抑制环境中T细胞活性天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法的应用，其特征在于，包括以下几个步骤：
S1、根据权1中的方法获得可提高PD-L1诱发免疫抑制环境中T细胞活性中药小分子；
S2、确定靶蛋白晶体结构模型，根据文献查阅得到靶蛋白与小分子抑制剂结合的晶体结构，在此基础上使用薛定谔软件进行配体剥离，得到蛋白质晶体结构，结合文献及小分子与靶蛋白结合位点得到构建格点文件的热点氨基酸残基；
S3、使用薛定谔软件
Figure FDA0003000400540000031
软件中的ADME/Tox模块将收集到临床抗肿瘤有效复方中的787个中药药物成分进行类药性分析，筛选得到符合类药性的小分子N个，运用
Figure FDA0003000400540000032
中的Glide Docking模块将靶蛋白与符合类药性的小分子逐一进行对接，得到对接后打分，筛选出结合性好的中药小分子；
S4、根据S3中的对接结果分别筛选靶向蛋白的中药小分子进行MST实验，检测中药小分子与白蛋白的结合亲和力，筛选出结合能力较高的中药小分子；
S5、使用分子动力学软件包AMBER20进行50ns的分子动力学模拟，并基于模拟所得轨迹，使用MM-PBSA方法，计算中药小分子与靶蛋白的结合自由能，选择结合能力好的中药小分子；
S6、EGF和S5中筛选得到的中药小分子最佳浓度干预肿瘤细胞，观察细胞生长状态，并检测各组细胞生长抑制情况，用靶细胞激活剂EGF刺激肿瘤细胞，同时分组加入筛选所获得中药小分子培养48h，显微镜下观察细胞增殖数量，并且与空白组比较，判断中药小分子的干预能力；
S7、使用CCK8法检测中药小分子干预EGF刺激的肿瘤细胞48h的抑制情况；
S8、基于构建的肿瘤细胞结合位点晶体结构模型筛选所得的中药小分子能够抑制EGF诱发肿瘤细胞增殖数量、提高增殖抑制率、抑制克隆点形成能力，综合选择配伍所需的中药小分子；
S9、根据S8中选择的中药小分子配伍抗肿瘤中药。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述S1中HER2的结合位点为底物结合位点，其活性残基为Lys753、Asp863、Thr862、Phe864和Met801。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述S3中中药小分子与靶蛋白对接得分负值越大，小分子与靶蛋白的结合越好，筛选出的中药小分子对接得分小于等于负四分。
10.根据权利要求7所述的应用筛选出的一种中药小分子与肿瘤细胞抑制剂的配伍组合，其特征在于，所述配伍组合包括PD-L1阻断剂中药小分子Formononetin和肿瘤细胞HER2抑制剂Quercetin。
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