CN111548331A - 一种靶向免疫节点pd-1与shp-2互作的先导化合物及其应用 - Google Patents

一种靶向免疫节点pd-1与shp-2互作的先导化合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向免疫节点PD‑1与SHP‑2互作的先导化合物。在T细胞的PD‑1信号通路中，膜受体PD‑1胞内域酪氨酸残基被酪氨酸磷酸激酶磷酸化后招募细胞内SHP‑2而抑制T细胞活性。利用SHP‑2与PD‑1互作蛋白质结构基础与大规模小分子先导化合物计算机模拟设计，筛选出一种可特异阻断PD‑1与SHP‑2互作先导化合物PSdis。PSdis可被用于靶向PD‑1免疫节点和增强T细胞活性的癌症治疗。与抗PD‑1单抗药或其他已知SHP‑2酶抑制剂相比，PSdis不影响T细胞与肿瘤细胞的相互作用；PSdis阻断PD‑1与SHP‑2互作的能力强且T细胞激活持久；PSdis可被口服吸收。

Description

一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物及其应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物，并公开了该先导化合物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
背景技术
据《2018癌症数据报告》显示，癌症的发病率及死亡率仍呈现逐年升高的趋势，成为威胁人类生命健康的最大原因之一。随着人们对肿瘤与机体免疫系统关系的深入认识，肿瘤治疗出现了新的手段，即免疫治疗。其中，PD-L1/PD-1免疫检查点抑制剂治疗以其显著的临床疗效而备受瞩目。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞膜上的PD-L1配体通过和T细胞膜上的PD-1受体特异结合，PD-1胞内域酪氨酸可被磷酸化，从而募集附近的带有SH2结构域的酪氨酸磷酸酶SHP-2。PD-1招募的SHP-2抑制了PD-1邻近的TCR的磷酸化活化，导致TCR-LCK介导的CD3、ZAP-70等信号分子磷酸化减弱，T细胞激活受到抑制。从而增强肿瘤细胞的免疫耐受性，这是肿瘤细胞免疫逃逸机制的重要组成部分。因此，靶向抑制PD-L1/PD-1信号通路是一种有潜力的癌症治疗策略。
目前靶向PD-L1/PD-1信号通路的免疫治疗药物大多数为抗PD-L1或PD-1的单克隆抗体(单抗)药物，虽然临床上已取得巨大成功，但是仍有大部分肿瘤患者对单抗阻断治疗无应答，其内在的单抗药物作用机制仍不十分清楚、以及不能口服等弱点楚。国内外已有7种以上PD-L1/PD-1免疫检查点抑制性剂单抗药物被批准上市治疗人类肿瘤。由于大部分肿瘤细胞都表达PD-L1，使得这类单抗药物抑制剂具有较为广谱的肿瘤治疗活性。临床上这些单抗药物单抗的主要适应症为不可切除或转移性黑色素瘤、晚期非小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌及尿路上皮癌等。数据显示，单抗药物的使用可以提高恶性肿瘤患者生存率，甚至增加晚期肿瘤患者治愈率。花旗集团分析预测，包括免疫检查点抑制剂、癌症疫苗和其他免疫调节剂的免疫疗法药物，在未来10年的市场将会达到上百亿美元，占据60％的新增癌症治疗药物市场份额。
然而，单抗药物在药代动力学方面也存在着一定的劣势，如肿瘤穿透力差、半衰期长、口服生物利用度不足、免疫原性副作用和生产成本高等缺点。随着人们对蛋白晶体活性构象了解的不断加深及化合物数据库的不断丰富，PD-L1/PD-1小分子抑制剂应运而生。小分子抑制剂可以克服单抗药物的严重缺陷，且具有高度选择性和有效性，可作为补充现有的治疗性单抗药物或联合单抗药物协同使用。然而，目前有关PD-L1/PD-1免疫检查点小分子抑制剂开发应用的报道较少，国内外仅有利用BMS-8、BMS-202和CA-170等在开展临床前研究，且尚未有小分子抑制剂进入临床。而且，其作用机制也基本与目前单抗药物一样，通过抑制PD-L1与PD-1结合发挥作用。
因此，有必要研发一种药物可选择性阻断PD-1/SHP-2信号通路、恢复TCR信号通路活性而可更广泛作用于其他肿瘤免疫治疗靶点。
发明内容
本发明目的是：提供一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物及该药物的应用。
本发明的技术方案是：
一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物，包括PSdis-24，所述PSdis-24的分子结构式如式I所示：
Figure BDA0002453191140000021
进一步的，所述PSdis-24阻断T细胞内膜受体PD-1胞内域与SHP-2相互作用并抑制SHP-2去磷酸化酶活性。
进一步的，所述小分子药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂中的任意一种。
进一步的，所述PSdis-24应用于制备治疗癌症的药物。
进一步的，所述PSdis-24应用于制备治疗乳腺癌、黑色素瘤、肺癌的药物。
本发明还公开了一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物的选取方法，包括步骤：
(1)利用T细胞内c-Src磷酸激酶将PD-1胞内域酪氨酸残基诱导磷酸化；
(2)胞内域发生酪氨酸残基磷酸化的PD-1与SHP-2互作功能结构域鉴定；
(3)筛选获得能特异高效阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物；
(4)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对T细胞内PD-1/SHP-2信号转导通路抑制而导致TCR信号转导通路激活调控；
(5)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对原代CD8+T细胞增殖与活化的影响；
(6)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对肿瘤生长的抑制。
进一步的，所述步骤(1)利用T细胞内c-Src磷酸激酶将PD-1胞内域酪氨酸残基诱导磷酸化具体为：
a、PD-L1刺激诱导PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：将Jurkat细胞体外培养，用GST系统提纯的PD-L1胞外域多肽刺激不同时间后，收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清后加入细胞裂解液提取蛋白，向蛋白样品中加入适量蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮5分钟变性待用，随后将样品进行蛋白免疫印迹实验，用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平，并用GAPDH作为内参；
b、PD-L1刺激促进PD-1招募磷酸激酶c-Src：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激15分钟之后，收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清加入细胞裂解液提取蛋白，向蛋白样品中加入适量的抗PD-1抗体混匀，4℃翻转过夜，第二天加入适量蛋白A/G磁珠混匀，继续4℃翻转4～6小时后，将样品3000rpm离心5分钟，弃上清收集磁珠沉淀，加入适量蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮5分钟变性待用，随后将样品进行蛋白免疫印迹实验，用抗c-Src抗体检测与PD-1发生互作的c-Src蛋白量；
c、外源转染磷酸激酶c-Src基因可催化PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：将HEK293T细胞以5×105个/孔密度种在6孔板，转染1μg Flag-PD-1和1μgHA-c-Src基因质粒，转染48小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清后加入细胞裂解液提取蛋白，向蛋白样品中加入适量的抗Flag M2磁珠抗体混匀，4℃翻转4～6小时。将样品3000rpm离心5分钟，弃上清收集磁珠沉淀，加入适量蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮5分钟变性待用，随后将样品进行蛋白免疫印迹实验，用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平；
d、磷酸激酶c-Src抑制剂降低PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：将Jurkat细胞用不同浓度的磷酸激酶c-Src抑制剂SKI-606预处理24小时后，再加入PD-L1胞外域多肽刺激，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平；
e、小干扰RNA敲低磷酸激酶c-Src蛋白表达降低PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：首先设计合成小干扰RNA敲低c-Src蛋白表达，将Jurkat细胞转染小干扰RNA 72小时后，再加入PD-L1胞外域多肽刺激，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用抗c-Src抗体检测c-Src蛋白量，并且用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平；
所述步骤(2)胞内域发生酪氨酸残基磷酸化的PD-1与SHP-2互作功能结构域鉴定具体为：
a、首先构建含N-fluc融合的不同SH2结构域SHP-2质粒与C-fluc融合的PD-1胞内域质粒，利用荧光素酶裂解互补技术研究PD-1与SHP-2相互作用，将HEK293T细胞以1×105个/孔密度种在24孔板，转染0.02μg Renilla质粒、0.1μg c-Src基因表达质粒、0.2μg PD-1-CYT质粒和0.2μg含不同SH2结构域SHP-2质粒，转染48小时后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作，裂解细胞，快速加入底物用酶标仪检测发光值；
b、构建带Flag标签PD-1胞内域Y223F、Y248F和双位点Y223F&Y248F突变质粒，将HEK293T细胞以5×105个/孔密度种在6孔板，转染1μg HA-c-Src、1μg Myc-SHP-2和不同突变的Flag-PD-1质粒，转染48小时后，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用抗Myc抗体检测与PD-1发生互作的SHP-2蛋白量。
进一步的，所述步骤(3)筛选获得能特异高效阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物具体为：
a、计算机模拟筛选及体外生物活性筛选：利用SHP-2与PD-1互作蛋白质结构基础，筛选一系列可能阻断SHP-2与PD-1相互作用的候选先导化合物，在进行生物活性筛选之前，利用计算机分子对接软件模拟SHP-2与候选先导化合物之间的相互作用，计算蛋白质口袋和候选先导化合物两者之间的亲和力大小，以降低实际筛选候选先导化合物的数目，提高先导化合物发现率，然后利用荧光素酶裂解互补技术从一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物库中筛选得到高效阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24；
b、蛋白免疫印迹实验研究PSdis-24阻断PD-1与SHP-2互作：将HEK293T细胞以5×105个/孔密度种在6孔板，转染1μg HA-c-Src基因表达质粒、1μgFlag-PD-1质粒和1μg Myc-SHP-2质粒，转染24小时后再加入0、0.5、1、5、10μM的PSdis-24再孵育另一个24小时，转染48小时后进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用抗Myc抗体检测与PD-1发生互作的SHP-2蛋白量；
c、免疫荧光实验研究PSdis-24阻断PD-1与SHP-2互作：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激后，再加入5μM的PSdis-24处理24小时后，收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清后用4％多聚甲醛固定细胞20分钟，然后用0.1％Triton X-100破膜10分钟，然后用3％BSA室温封闭1小时后加入适量的鼠源性抗PD-1抗体和兔源性抗SHP-2抗体4℃孵育过夜，第二天PBS洗细胞两次，加入不同波长的荧光二抗室温孵育2小时，最后用激光共聚焦显微镜观察T细胞内PD-1与SHP-2蛋白分布情况。
进一步的，所述步骤(4)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对T细胞内PD-1/SHP-2信号转导通路抑制而导致TCR信号转导通路激活调控具体为：
a、检测TCR信号通路关键蛋白磷酸化水平：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激后，再加入不同浓度的PSdis-24处理24小时后，收集细胞，PBS洗细胞一次，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用特异性抗体检测CD3ζ、ZAP70和ERK蛋白水平以及它们的磷酸化水平；
b、检测T细胞内细胞因子的mRNA水平：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激后，再加入5μM的PSdis-24处理24小时后，收集细胞，用适量Trizol混匀裂解细胞，随后按RNA提取试剂盒说明书提取RNA，逆转录cDNA后，用q-PCR技术检测IFN-γ、TNF-α及IL-2等细胞因子的mRNA水平。
进一步的，所述步骤(5)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对原代CD8+T细胞增殖与活化的影响具体为：
a、免疫磁珠分选技术提取荷瘤小鼠脾脏原代CD8+T细胞：将4T1小鼠乳腺癌细胞皮下注射Balb/c小鼠右大腿处，待肿瘤直径长至约1cm后，颈椎脱臼处死小鼠，无菌操作将小鼠脾脏取出进行研磨和裂解红细胞后，将CD8+T细胞磁珠分选试剂盒提取得到的CD8+T细胞体外培养，培养液中加入一定浓度的抗CD3/CD28抗体以及IL-2细胞因子；
b、流式细胞仪检测CD8+T细胞活化水平：将CD8+T细胞体外培养，加入不同浓度的PSdis-24处理24小时后，收集细胞，PBS洗细胞一次，用50μL DPBS重悬细胞，加入适量的抗CD25荧光抗体4℃孵育30分钟，后用DPBS洗一次，上机检测分泌IFN-γ水平，将CD8+T细胞用PSdis-24处理24小时后，加入适量的PMA、Ionomycin和Golgi Plug活化T细胞4～5小时，再进行流式染色上机；
c、流式细胞仪检测CD8+T细胞增殖水平：将CD8+T细胞提取计数，用CFSE染料进行染色后体外培养，并且随后加入不同浓度的PSdis-24处理，培养第五天后收集细胞上机检测CFSE荧光强度。
进一步的，所述步骤(6)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对肿瘤生长的抑制具体为：
a、绘制肿瘤生长曲线：将15只C57小鼠背部皮下注射小鼠黑色素瘤B16-F10细胞，当肿瘤长至约100mm3时随机分为三组：对照(Ctrl)组，Anti-PD-1组和PSdis-24组，Anti-PD-1组指的是腹腔注射抗鼠源性PD-1单克隆抗体，200μg/次/只，隔天注射，共五次，PSdis-24组指的是瘤内注射一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24，100μg/次/只，隔天注射，共两次，治疗期间记录肿瘤大小与体重，治疗结束后颈椎脱臼处死小鼠，解剖分离瘤体称重及后续试验；
b、流式细胞仪检测肿瘤内CD8+T细胞浸润及细胞因子分泌：将实验6a中各个治疗组分离的肿瘤剪碎研磨，加入胶原酶37℃消化30分钟后，用淋巴细胞分离液提取肿瘤浸润性淋巴细胞；随后将分离得到的细胞进行流式染色，上机检测CD8+T细胞阳性比例及CD8+T细胞IFN-γ细胞因子的分泌水平。
本发明的优点是：
(a)本发明中不同于现有的PD-L1/PD-1免疫检查点抑制剂治疗，首次以阻断T细胞内PD-1与SHP-2相互作用为肿瘤免疫治疗靶点的新策略，为未来的肿瘤治疗，开辟了新的方向；
(b)该药物具有口服优势和特异性强等特点，能够克服单抗药物的静脉注射对人体伤害大、药品价格昂贵等弱点。
附图说明
图1显示了磷酸激酶c-Src催化PD-1胞内域酪氨酸磷酸化；
图2显示了SHP-2的两个SH2结构域和酪氨酸磷酸化的PD-1互作分析鉴定，其中图2A柱状图的纵坐标为相对荧光报告基因酶活性强度，横坐标为含不同SH2结构域的SHP-2质粒；
图3显示了SHP-2蛋白质结构的三个凹陷型口袋；
图4显示了筛选能够特异阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis，其中图4A的纵坐标为相对荧光强度，横坐标为PSdis处理浓度；
图5显示了一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24激活T细胞内TCR信号通路，其中图5B的纵坐标相对mRNA水平，横坐标为不同细胞因子基因名称；
图6显示了PSdis-24促进CD8+T细胞增殖与活化，其中图6A柱状图纵坐标为高表达CD25的CD8+T细胞阳性比例，横坐标为PSdis-24的处理浓度；图6B柱状图的纵坐标为高表达IFN-γ的CD8+T细胞阳性比例，横坐标为PSdis-24处理浓度；图6C柱状图的纵坐标为低表达CFSE的CD8+T细胞阳性比例，横坐标为PSdis-24处理浓度；
图7显示了PSdis-24抑制肿瘤生长，其中图7A的纵坐标为肿瘤体积，横坐标为天数；图7B的纵坐标为肿瘤质量，横坐标为处理组别；图7C的纵坐标为CD45+CD8+T细胞阳性比例，横坐标为处理组别；图7D纵坐标为高表达IFN-γ的CD8+T细胞阳性比例，横坐标为处理组别。
具体实施方式
一种新型靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物，其包括如下步骤：
1、T细胞内磷酸激酶c-Src可将PD-1胞内域酪氨酸残基磷酸化：
a、PD-L1刺激诱导PD-1胞内域酪氨酸残基磷酸化：将Jurkat细胞体外培养，用GST系统提纯的PD-L1胞外域多肽刺激不同时间(0、15、60、120分钟)后，收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清后加入细胞裂解液提取蛋白，向蛋白样品中加入适量蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮5分钟变性待用，随后将样品进行蛋白免疫印迹实验，用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平，并用GAPDH作为内参；
b、PD-L1刺激促进PD-1招募磷酸激酶c-Src：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激15分钟之后，收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清加入细胞裂解液提取蛋白，向蛋白样品中加入适量的抗PD-1抗体混匀，4℃翻转过夜，第二天加入适量蛋白A/G磁珠混匀，继续4℃翻转4～6小时后，将样品3000rpm离心5分钟，弃上清收集磁珠沉淀，加入适量蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮5分钟变性待用，随后将样品进行蛋白免疫印迹实验，用抗c-Src抗体检测与PD-1发生互作的c-Src蛋白量；
c、外源转染磷酸激酶c-Src表达基因可催化PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：将HEK293T细胞以5×105个/孔密度种在6孔板，转染1μg Flag-PD-1和1μgHA-c-Src质粒，转染48小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清后加入细胞裂解液提取蛋白，向蛋白样品中加入适量的抗Flag M2磁珠抗体混匀，4℃翻转4～6小时。将样品3000rpm离心5分钟，弃上清收集磁珠沉淀，加入适量蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮5分钟变性待用，随后将样品进行蛋白免疫印迹实验，用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平；
d、磷酸激酶c-Src抑制剂降低PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：将Jurkat细胞用不同浓度(0、1、10、100、1000nM)的c-Src磷酸激酶抑制剂SKI-606预处理24小时后，再加入PD-L1胞外域多肽刺激。之后同实验(1a)方法，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平；
e、小干扰RNA敲低磷酸激酶c-Src降低PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：首先设计合成小干扰RNA(正义链：5’-GCCUCUCAGUGUCUGACUUTT-3’)敲低c-Src蛋白表达量，将Jurkat细胞转染小干扰RNA 72小时后，再加入PD-L1胞外域多肽刺激，之后同实验(1a)方法，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用抗c-Src抗体检测c-Src蛋白量，并且用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平。
2、胞内域发生酪氨酸残基磷酸化的PD-1与SHP-2互作功能结构域鉴定：
a、SHP-2的两个SH2结构域在PD-1与SHP-2互作中具有关键作用：首先构建含N-fluc融合的不同SH2结构域SHP-2质粒(N-SH2、C-SH2和N-SH2-C-SH2)与C-fluc融合的PD-1胞内域质粒(PD-1-CYT)。利用荧光素酶裂解互补技术(当两个蛋白质相互作用时候，荧光素酶活性升高，反之则降低)研究PD-1与SHP-2相互作用。将HEK293T细胞以1×105个/孔密度种在24孔板，转染0.02μg Renilla质粒、0.1μg c-Src质粒、0.2μg PD-1-CYT质粒和0.2μg含不同SH2结构域SHP-2质粒。转染48小时后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作，裂解细胞，快速加入底物用酶标仪检测发光值；
b、PD-1胞内域Y223和Y248位点在PD-1与SHP-2互作中具有关键作用：构建带Flag标签PD-1胞内域Y223F、Y248F和双位点Y223F&Y248F突变质粒。将HEK293T细胞以5×105个/孔密度种在6孔板，转染1μg HA-c-Src、1μgMyc-SHP-2和不同突变的Flag-PD-1质粒。转染48小时后，同实验(1c)方法进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用抗Myc抗体检测与PD-1发生互作的SHP-2蛋白量。
3、筛选能特异高效阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物：
a、计算机模拟筛选及体外生物活性筛选：利用SHP-2与PD-1互作蛋白质结构基础，我们筛选了一系列可能阻断SHP-2与PD-1相互作用的候选先导化合物。在进行生物活性筛选之前，利用计算机分子对接软件模拟SHP-2与候选先导化合物之间的相互作用，计算蛋白质口袋和候选先导化合物两者之间的亲和力大小，以降低实际筛选候选先导化合物数目，提高先导化合物发现率。然后利用荧光素酶裂解互补技术从一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物库中筛选阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis。经过反复体外实验我们得到效果较为稳定的两个化合物PSdis-18和PSdis-24，随后我们继续研究比较这两个化合物的阻断效果。将HEK293T细胞以1×105个/孔密度种在24孔板，转染0.02μg Renilla质粒、0.1μgc-Src质粒、0.2μg PD-1-CYT质粒和0.2μg含N-SH2-C-SH2结构域SHP-2质粒。转染24小时后加入1、5、10、25、50、100μM的PSdis-18和PSdis-24再孵育另一个24小时，转染48小时后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作，裂解细胞，快速加入底物用酶标仪检测发光值。经过比较，我们得到最优一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24；
Figure BDA0002453191140000101
b、蛋白免疫印迹实验研究PSdis-24阻断PD-1与SHP-2互作：将HEK293T细胞以5×105个/孔密度种在6孔板，转染1μg HA-c-Src质粒、1μg Flag-PD-1质粒和1μg Myc-SHP-2质粒。转染24小时后再加入0、0.5、1、5、10μM的PSdis-24再孵育另一个24小时。转染48小时后同实验(1c)方法进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用抗Myc抗体检测与PD-1发生互作的SHP-2蛋白量；
c、免疫荧光实验研究PSdis-24阻断PD-1与SHP-2互作：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激后，再加入5μM的PSdis-24处理24小时后，收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清后用4％多聚甲醛固定细胞20分钟，然后用0.1％Triton X-100破膜10分钟，然后用3％BSA室温封闭1小时后加入适量的鼠源性抗PD-1抗体和兔源性抗SHP-2抗体4℃孵育过夜，第二天PBS洗细胞两次，加入不同波长的荧光二抗室温孵育2小时，最后用激光共聚焦显微镜观察T细胞内PD-1与SHP-2蛋白分布情况。
4、检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对T细胞内PD-1/SHP-2信号转导通路抑制而导致TCR信号转导通路激活调控作用：
a、检测TCR信号通路关键蛋白磷酸化水平：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激后，再加入不同浓度(0、1、5、10μM)的PSdis-24处理24小时后，收集细胞，PBS洗细胞一次，之后同实验(1a)方法，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用特异性抗体检测CD3ζ、ZAP70和ERK蛋白水平以及它们的磷酸化水平；
b、检测T细胞内细胞因子的mRNA水平：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激后，再加入5μM的PSdis-24处理24小时后。收集细胞，用适量Trizol混匀裂解细胞，随后按RNA提取试剂盒说明书提取RNA，逆转录cDNA后，用q-PCR技术检测IFN-γ、TNF-α及IL-2等细胞因子的mRNA水平。
5、一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对原代CD8+T细胞增殖与活化的影响：
a、免疫磁珠分选技术提取荷瘤小鼠脾脏原代CD8+T细胞：将4T1小鼠乳腺癌细胞皮下注射Balb/c小鼠右大腿处，待肿瘤直径长至约1cm后，颈椎脱臼处死小鼠，无菌操作将小鼠脾脏取出进行研磨和裂解红细胞后，将CD8+T细胞磁珠分选试剂盒提取得到的CD8+T细胞体外培养，培养液中加入一定浓度的抗CD3/CD28抗体以及IL-2细胞因子；
b、流式细胞仪检测CD8+T细胞活化水平：将CD8+T细胞体外培养，加入不同浓度(0、0.5、1、5、10μM)的PSdis-24处理24小时后。收集细胞，PBS洗细胞一次，用50μL DPBS重悬细胞，加入适量的抗CD25荧光抗体4℃孵育30分钟，后用DPBS洗一次，上机检测。同上检测分泌IFN-γ水平时，将CD8+T细胞用PSdis-24处理24小时后，加入适量的PMA、Ionomycin和Golgiplug活化T细胞4～5小时，再进行流式染色上机；
c、流式细胞仪检测CD8+T细胞增殖水平：将CD8+T细胞提取计数，用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE染料)进行染色后体外培养，并且随后加入不同浓度(0、0.5、1、5、10μM)的PSdis-24处理。培养第五天后收集细胞上机检测CSFE荧光强度。
6、一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对肿瘤生长的抑制功能：
a、绘制肿瘤生长曲线：将15只C57小鼠背部皮下注射小鼠黑色素瘤B16-F10细胞，当肿瘤长至约100mm3时随机分为三组(Ctrl组，Anti-PD-1组和PSdis-24组。Anti-PD-1组指的是腹腔注射抗鼠源性PD-1单克隆抗体，200μg/次/只，隔天注射，共五次。PSdis-24组指的是瘤内注射一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24，100μg/次/只，隔天注射，共两次。Ctrl组指的是注射等量的PBS缓冲液。治疗期间记录肿瘤大小与体重，治疗结束后颈椎脱臼处死小鼠，解剖分离瘤体称重及后续试验；
b、流式细胞仪检测肿瘤内CD8+T细胞浸润及细胞因子分泌：将实验6a中各个治疗组分离的肿瘤剪碎研磨，加入胶原酶37℃消化30分钟后，用淋巴细胞分离液提取肿瘤浸润性淋巴细胞。随后将分离得到的细胞进行流式染色，上机检测CD8+T细胞阳性比例及CD8+T细胞IFN-γ细胞因子的分泌水平。
当PSdis-24应用于制备治疗乳腺癌、黑色素瘤、肺癌的药物时，它可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，从而形成药物组合物。
液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和叔丁基羟基茴香醚(BHA)。
通常，本发明的药物组合物包括以下剂型：口服给药剂型：如片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(混悬剂)(含有如约0.05-5％悬浮剂(助溶剂))、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)；或者以无菌可注射溶液或混悬剂形式(在等渗介质中含有约0.05-5％助溶剂)进行非肠胃道给药。
在制备药物组合物时，通常，可将这些本发明的化合物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其pH通常约为5-8，较佳的pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服或局部给药。优选口服给药方式。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
另外，需说明的是，文中PD-1表示Programmed cell death 1,CD279；SHP-2表示The Src homology 2domain containing protein tyrosine phosphatase-2；PSdis表示PD-1/SHP-2disruption；Y表示Tyrosine；TCR表示T cell receptor；PD-L1表示Programmedcell death 1ligand 1,CD274；GST表示Glutathione S-transferase；PBS表示Phosphatebuffer saline；DPBS表示Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline；PD-1-CYT表示PD-1cytoplasmic domain；PMA表示Phorbol 12-myristate 13-acetate；CFSE表示5(6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester；WCL表示Whole cell lysis；N-fluc表示N-terminal fireflyluciferase；C-fluc表示C-terminal fireflyluciferase。
实施例1
T细胞内c-Src磷酸激酶催化PD-1胞内域酪氨酸残基磷酸化
1、c-Src磷酸激酶与PD-1发生相互作用：将Jurkat细胞体外培养，用GST系统提纯的PD-L1胞外域多肽刺激不同时间(0、15、60、120分钟)后。收集细胞裂解液，免疫印迹实验结果显示，PD-L1刺激诱导PD-1胞内域Y223和Y248发生磷酸化，并且在15分钟时间最强，详见图1A。随后进行抗PD-1抗体免疫共沉淀实验发现c-Src磷酸激酶可与PD-1发生相互作用，详见图1B。说明PD-1在PD-L1刺激条件下，c-Src可能是其胞内域酪氨酸磷酸化激酶，进行PD-1下游信号的调控。
2、免疫印迹实验证实c-Src磷酸激酶将PD-1胞内域酪氨酸诱导磷酸化：利用HEK293T细胞转染Flag-PD-1和HA-c-Src质粒，转染48小时后收集细胞裂解液，免疫印迹实验结果显示，外源过表达c-Src磷酸激酶可催化PD-1胞内域Y223和Y248两个位点磷酸化，详见图1C。为了进一步验证c-Src磷酸激酶催化PD-1胞内域酪氨酸磷酸化。用不同浓度的c-Src磷酸激酶抑制剂SKI-606提前处理细胞后，检测PD-1胞内域Y223和Y248磷酸化水平。结果显示c-Src磷酸激酶抑制剂处理之后，PD-1胞内域Y223和Y248磷酸化水平都降低，详见图1D。同时我们也用小干扰RNA敲低T细胞内c-Src蛋白表达水平，结果显示c-Src敲低后，PD-1胞内域Y223和Y248磷酸化水平也下降，详见图1E。
实施例2
胞内域发生酪氨酸残基磷酸化的PD-1与SHP-2互作功能结构域鉴定
1、Luciferase体系检测PD-1与SHP-2相互作用：利用荧光素酶裂解互补技术，构建含N-fluc融合的不同SH2结构域SHP-2质粒(N-SH2、C-SH2和N-SH2-C-SH2)与C-fluc融合的PD-1胞内域质粒(PD-1-CYT)。在HEK293T细胞过转染PD-1和SHP-2质粒后，结果显示在加入c-Src条件下，荧光素酶活性增高，说明PD-1被c-Src磷酸化后，会促进招募SHP-2详见图2A。并且当SHP-2的两个SH2结构域都存在时，PD-1与SHP-2结合能力最强，这说明两个SH2结构域对SHP-2与PD-1的结合都很重要。
2、免疫印迹实验检测PD-1突变体与SHP-2相互作用：进一步的我们又将PD-1胞内Y223和Y248位点突变为F后，在HEK293T细胞过转染HA-c-Src、Myc-SHP-2和野生及突变的Flag-PD-1质粒。转染48小时后收集细胞裂解液，进行抗Flag抗体免疫共沉淀实验。免疫印迹结果显示，当PD-1胞内域Y223或Y248突变为F后，会减少与SHP-2的结合，并且当PD-1双位点YF突变后，几乎失去了与SHP-2结合的能力，详见图2B，这说明PD-1胞内域Y223或Y248位点与SHP-2的结合都很重要。
实施例3
通过筛选得到能够特异高效阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物
1、计算机模拟筛选及体外活性筛选阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物：利用SHP-2与PD-1互作蛋白质结构基础发现SHP-2蛋白质结构具有三个潜在结合的凹陷性口袋，详见图3，我们计算机模拟筛选得到一系列可能阻断SHP-2与PD-1相互作用的候选先导化合物，然后将候选一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物，利用实施例2中Luciferase实验进行了体外生物活性筛选。结果显示若干小分子可以显著降低PD-1和SHP-2的互作，详见图4A。经过反复实验，最终得到阻断效果最优一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物，该一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物为PSdis-24，CAS号：321941-71-3，化学名为N-2-，N-7-双(2-呋喃甲基)-9-(羟基亚氨基)-4,5-双硝基-9H-芴-2,7-二磺酰胺。
2、免疫印迹实验检测PSdis-24阻断PD-1与SHP-2互作：接下来用免疫共沉淀及免疫印迹实验分析PSdis-24对PD-1与SHP-2相互作用的影响。首先在HEK293T细胞过转染HA-c-Src、Myc-SHP-2和Flag-PD-1质粒。转染24小时后加入不同浓度的PSdis-24共孵育另一个24小时，之后收集细胞裂解液，用抗Flag抗体进行共沉淀实验，结果显示PSdis-24处理之后，SHP-2与PD-1结合会减少，详见图4B。
3、免疫荧光实验检测PSdis-24阻断PD-1与SHP-2互作：进一步我们利用免疫荧光实验检测PSdis-24对T细胞内PD-1与SHP-2互作影响。将Jurkat细胞体外培养，用PD-L1胞外域多肽刺激后，加入5μM浓度的PSdis-24药物刺激24小时后，同时DMSO作为药物对照加入。第二天将细胞进行固定、通透、封闭和孵育抗PD-1和抗SHP-2抗体过夜。第三天将细胞孵育荧光二抗及细胞核染色，最后用激光共聚焦进行观察。如图4C结果显示，与文献报道一致PD-1蛋白主要表达在T细胞膜上。用PD-L1刺激之后，SHP-2会分布到细胞膜上，与PD-1发生共定位，这也说明PD-1招募SHP-2进行去磷酸化。而当再加入PSdis-24药物之后，SHP-2与PD-1的共定位减少，说明PSdis-24可以阻断T细胞内PD-1与SHP-2的结合。
实施例4
PSdis-24对T细胞内PD-1/SHP-2信号转导通路抑制而导致TCR信号转导通路激活调控从实施例3可以看出，一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24可以在T细胞内阻断PD-1招募SHP-2蛋白。接下来我们又进一步的研究了当PSdis-24阻断PD-1招募SHP-2蛋白到达细胞膜表面时，对邻近的TCR信号通路会产生什么影响？利用免疫印迹实验检测TCR信号通路关键蛋白CD3ζ、ZAP70等磷酸化水平。如图5A所示，Jurkat细胞在加入不同浓度的PSdis-24药物刺激后，CD3ζ、ZAP70及ERK信号分子的磷酸化水平都有所增加。说明PSdis-24可以通过阻断PD-1招募SHP-2蛋白，解除肿瘤细胞对T细胞TCR信号通路激活抑制。同时，我们也用q-PCR检测PSdis-24处理后，T细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2等mRNA水平。如图5B，5μM浓度的PSdis-24处理之后，T细胞内IFN-γ、TNF-α和IL-2等细胞因子的mRNA水平都增加。这说明PSdis-24处理增强T细胞内细胞因子转录水平，提高免疫活性。
实施例5
PSdis-24对原代CD8+T细胞增殖与活化的影响研究
1、PSdis-24处理增加CD8+T细胞表面活化标志物CD25的表达：进一步我们研究PSdis-24对小鼠原代CD8+T细胞活化的影响。不同浓度的PSdis-24处理CD8+T细胞24小时后，收集细胞流式检测CD8+T细胞表面CD25蛋白表达水平。如图6A所示，PSdis-24处理可以促进CD8+T细胞表面CD25的表达，并且随着药物浓度的升高，CD25的表达也增加。并且我们同时检测了CD8+T细胞IFN-γ细胞因子分泌水平，如图6B结果所示，PSdis-24处理后CD8+T细胞分泌IFN-γ增加，这说明CD8+T细胞在体外可被PSdis-24活化。
2、PSdis-24处理促进CD8+T细胞增殖：利用CFSE染色技术，细胞用CFSE染色后，随着细胞发生分裂增殖，荧光强度会降低，检测不同浓度的PSdis-24处理对CD8+T细胞增殖的影响。如图6C结果所示，用PSdis-24处理CD8+T细胞后，CFSE荧光强度弱的CD8+T细胞比例增多，细胞增殖更多，说明PSdis-24促进了CD8+T细胞增殖。
实施例6
探索PSdis-24对肿瘤生长的抑制功能
1、PSdis-24抑制肿瘤生长：进一步利用动物肿瘤模型检测PSdis-24在活体水平的抑瘤效果。由图7A所示，腹腔注射抗PD-1抗体组小部分小鼠肿瘤增长会受到抑制，而瘤内注射PSdis-24组几乎全部小鼠肿瘤增长较其他组别都被明显抑制。这说明PSdis-24在活体水平有很好的抑瘤生长效果。图7B为治疗结束分离解剖的肿瘤质量，结果与肿瘤生长曲线一致。
2、PSdis-24对肿瘤内CD8+T细胞浸润及细胞因子分泌影响：进一步我们利用流式细胞仪检测各组肿瘤内浸润CD8+T细胞的数量及细胞因子IFN-γ分泌能力。从图7C中可以看出，相对于对照(Ctrl)组，Anti-PD-1组和PSdis-24组的肿瘤内CD8+T细胞浸润比例都有所增加，说明抗体和小分子抑制剂PSdis-24都能增加肿瘤内CD8+T细胞浸润，具体机制有待进一步研究。同时从图7D中可以看出，相对于对照(Ctrl)组，Anti-PD-1组和PSdis-24组的肿瘤内CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力也都有所增强，说明抗体和小分子抑制剂PSdis-24可促进肿瘤内CD8+T细胞激活，且PSdis-24组与对照(Ctrl)组差异具有显著性意义。
综上所述，本发明前期靶向PD-L1/PD-1信号通路中PD-1酪氨酸磷酸化招募SHP-2关键节点，利用蛋白质结构基础药物设计与大规模计算机模拟筛选，首次研发出一种可特异阻断PD-1与SHP-2互作全新一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis。相较于单抗或其他小分子抑制剂，PSdis不会影响T细胞与肿瘤细胞的相互作用。PSdis阻断PD-1与SHP-2互作对T细胞免疫功能激活调控，进而抑制肿瘤生长。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物，其特征在于，包括PSdis-24，所述PSdis-24的分子结构式如式I所示：
Figure FDA0002453191130000011
2.根据权利要求1所述的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物，其特征在于：所述PSdis-24阻断T细胞内膜受体PD-1胞内域与SHP-2相互作用并抑制SHP-2去磷酸化酶活性。
3.根据权利要求1所述的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物，其特征在于：所述小分子药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂中的任意一种。
4.根据权利要求1-3任一项权利要求所述的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物，其特征在于：所述PSdis-24应用于制备治疗癌症的药物。
5.一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物的选取方法，其特征在于，包括步骤：
(1)利用T细胞内c-Src磷酸激酶将PD-1胞内域酪氨酸诱导磷酸化；
(2)胞内域发生酪氨酸残基磷酸化的PD-1与SHP-2互作功能结构域鉴定；
(3)筛选获得能阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物；
(4)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对T细胞内PD-1/SHP-2信号转导通路抑制而导致TCR信号转导通路激活调控；
(5)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对原代CD8+T细胞增殖与活化的影响；
(6)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对肿瘤生长的抑制。
6.根据权利要求5所述的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物的选取方法，其特征在于，所述步骤(1)利用T细胞内c-Src磷酸激酶将PD-1胞内域酪氨酸诱导磷酸化具体为：
a、PD-L1刺激诱导PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：将Jurkat细胞体外培养，用GST系统提纯的PD-L1胞外域多肽刺激不同时间后，收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清后加入细胞裂解液提取蛋白，向蛋白样品中加入适量蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮5分钟变性待用，随后将样品进行蛋白免疫印迹实验，用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平，并用GAPDH作为内参；
b、PD-L1刺激促进PD-1招募磷酸激酶c-Src：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激15分钟之后，收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清加入细胞裂解液提取蛋白，向蛋白样品中加入适量的抗PD-1抗体混匀，4℃翻转过夜，第二天加入适量蛋白A/G磁珠混匀，继续4℃翻转4～6小时后，将样品3000rpm离心5分钟，弃上清收集磁珠沉淀，加入适量蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮5分钟变性待用，随后将样品进行蛋白免疫印迹实验，用抗磷酸激酶c-Src抗体检测与PD-1发生互作的磷酸激酶c-Src蛋白量；
c、外源转染磷酸激酶c-Src可催化PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：将HEK293T细胞以5×105个/孔密度种在6孔板，转染1μg Flag-PD-1和1μg HA-c-Src基因表达质粒，转染48小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清后加入细胞裂解液提取蛋白，向蛋白样品中加入适量的抗Flag M2磁珠抗体混匀，4℃翻转4～6小时。将样品3000rpm离心5分钟，弃上清收集磁珠沉淀，加入适量蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮5分钟变性待用，随后将样品进行蛋白免疫印迹实验，用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平；
d、磷酸激酶c-Src抑制剂降低PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：将Jurkat细胞用不同浓度的磷酸激酶c-Src抑制剂SKI-606预处理24小时后，再加入PD-L1胞外域多肽刺激，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的酪氨酸磷酸化水平；
e、小干扰RNA(siRNA)敲低磷酸激酶c-Src降低PD-1胞内域酪氨酸磷酸化：首先设计合成小干扰RNA敲低c-Src蛋白表达，将Jurkat细胞转染小干扰RNA 72小时后，再加入PD-L1胞外域多肽刺激，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用抗c-Src抗体检测c-Src蛋白量，并且用特异性抗体检测PD-1胞内域Y223和Y248位点的磷酸化水平；
所述步骤(2)胞内域发生酪氨酸残基磷酸化的PD-1与SHP-2互作功能结构域鉴定具体为：
a、首先构建含N-fluc融合的不同SH2结构域SHP-2质粒与C-fluc融合的PD-1胞内域质粒，利用荧光素酶裂解互补技术研究PD-1与SHP-2相互作用，将HEK293T细胞以1×105个/孔密度种在24孔板，转染0.02μg Renilla质粒、0.1μg c-Src质粒、0.2μg PD-1-CYT质粒和0.2μg含不同SH2结构域SHP-2质粒，转染48小时后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作，裂解细胞，快速加入底物用酶标仪检测发光值；
b、构建带Flag标签PD-1胞内域Y223F、Y248F和双位点Y223F&Y248F突变质粒，将HEK293T细胞以5×105个/孔密度种在6孔板，转染1μg HA-c-Src、1μg Myc-SHP-2和不同突变的Flag-PD-1质粒，转染48小时后，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用抗Myc抗体检测与PD-1发生互作的SHP-2蛋白量。
7.根据权利要求6所述的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物的选取方法，其特征在于，所述步骤(3)筛选获得能特异高效阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物具体为：
a、计算机模拟筛选及体外生物活性筛选：利用SHP-2与PD-1互作蛋白质结构基础，筛选一系列可能阻断SHP-2与PD-1相互作用的候选先导化合物，在进行生物活性筛选之前，利用计算机分子对接软件模拟SHP-2与候选先导化合物之间的相互作用，计算蛋白质口袋和候选先导化合物两者之间的亲和力大小，以降低实际筛选候选先导化合物的数目，提高先导化合物发现率，然后利用荧光素酶裂解互补技术从一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物库中筛选阻断PD-1与SHP-2互作的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24；
b、蛋白免疫印迹实验研究PSdis-24阻断PD-1与SHP-2互作：将HEK293T细胞以5×105个/孔密度种在6孔板，转染1μg HA-c-Src质粒、1μg Flag-PD-1质粒和1μg Myc-SHP-2质粒，转染24小时后再加入0、0.5、1、5、10μM的PSdis-24再孵育另一个24小时，转染48小时后进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用抗Myc抗体检测与PD-1发生互作的SHP-2蛋白量；
c、免疫荧光实验研究PSdis-24阻断PD-1与SHP-2互作：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激后，再加入5μM的PSdis-24处理24小时后，收集细胞，PBS洗细胞一次，离心弃上清后用4％多聚甲醛固定细胞20分钟，然后用0.1％Triton X-100破膜10分钟，然后用3％BSA室温封闭1小时，后加入适量的鼠源性抗PD-1抗体和兔源性抗SHP-2抗体4℃孵育过夜，第二天PBS洗细胞两次，加入不同波长的荧光二抗室温孵育2小时，最后用激光共聚焦显微镜观察T细胞内PD-1与SHP-2蛋白分布情况。
8.根据权利要求7所述的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物的选取方法，其特征在于，所述步骤(4)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对T细胞内PD-1/SHP-2信号转导通路抑制而导致TCR信号转导通路激活调控具体为：
a、检测TCR信号通路关键蛋白磷酸化水平：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激后，再加入不同浓度的PSdis-24处理24小时后，收集细胞，PBS洗细胞一次，进行蛋白样品制备及免疫印迹实验，用特异性抗体检测CD3ζ、ZAP70和ERK蛋白水平以及它们的磷酸化水平；
b、检测T细胞内细胞因子的mRNA水平：将Jurkat细胞加入PD-L1胞外域多肽刺激后，再加入5μM的PSdis-24处理24小时后，收集细胞，用适量Trizol混匀裂解细胞，随后按RNA提取试剂盒说明书提取RNA，逆转录cDNA后，用q-PCR技术检测IFN-γ、TNF-α及IL-2等细胞因子的mRNA水平。
9.根据权利要求7所述的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物的选取方法，其特征在于，所述步骤(5)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对原代CD8+T细胞增殖与活化的影响具体为：
a、免疫磁珠分选技术提取荷瘤小鼠脾脏原代CD8+T细胞：将4T1小鼠乳腺癌细胞皮下注射Balb/c小鼠右大腿处，待肿瘤直径长至约1cm后，颈椎脱臼处死小鼠，无菌操作将小鼠脾脏取出进行研磨和裂解红细胞后，将CD8+T细胞磁珠分选试剂盒提取得到的CD8+T细胞体外培养，培养液中加入一定浓度的抗CD3/CD28抗体以及IL-2细胞因子；
b、流式细胞仪检测CD8+T细胞活化水平：将CD8+T细胞体外培养，加入不同浓度的PSdis-24处理24小时后，收集细胞，PBS洗细胞一次，用50μL DPBS重悬细胞，加入适量的抗CD25荧光抗体4℃孵育30分钟，后用DPBS洗一次，上机检测分泌IFN-γ水平，将CD8+T细胞用PSdis-24处理24小时后，加入适量的PMA、Ionomycin和包含布雷菲德菌素A的Golgiplug活化T细胞4～5小时，再进行流式染色上机；
c、流式细胞仪检测CD8+T细胞增殖水平：将CD8+T细胞提取计数，用CFSE染料进行染色后体外培养，并且随后加入不同浓度的PSdis-24处理，培养第五天后收集细胞上机检测CFSE荧光强度。
10.根据权利要求7所述的一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物的选取方法，其特征在于，所述步骤(6)检测靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24对肿瘤生长的抑制具体为：
a、绘制肿瘤生长曲线：将15只C57小鼠背部皮下注射小鼠黑色素瘤B16-F10细胞，当肿瘤长至约100mm3时随机分为三组：对照组，Anti-PD-1组和PSdis-24组，Anti-PD-1组指的是腹腔注射抗鼠源性PD-1单克隆抗体，200μg/次/只，隔天注射，共五次，PSdis-24组指的是瘤内注射一种靶向免疫节点PD-1与SHP-2互作的先导化合物PSdis-24，100μg/次/只，隔天注射，共两次，治疗期间记录肿瘤大小与体重，治疗结束后颈椎脱臼处死小鼠，解剖分离瘤体称重及后续试验；
b、流式细胞仪检测肿瘤内CD8+T细胞浸润及细胞因子分泌：将实验6a中各个治疗组分离的肿瘤剪碎研磨，加入胶原酶37℃消化30分钟后，用淋巴细胞分离液提取肿瘤浸润性淋巴细胞；随后将分离得到的细胞进行流式染色，上机检测CD8+T细胞阳性比例及CD8+T细胞的细胞因子IFN-γ的分泌水平。
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