CN111344002A - 用于治疗视网膜血管生成性疾病的Angio-3 - Google Patents

Abstract

本公开提供了治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病的方法，其包括施用有效量的Angio‑3肽。

Description

用于治疗视网膜血管生成性疾病的Angio-3

相关申请的交叉部分

本申请要求于2017年8月31日提交的美国专利申请号62/553,051的优先权，其公开内容出于目的而整体通过引用在此并入。

背景技术

视网膜血管生成性疾病包括年龄相关性黄斑变性、视网膜病变、血管阻塞、糖尿病视网膜病变，糖尿病黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞以及角膜新血管形成。视网膜血管生成性疾病，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)，是工业化国家中老年人法定失明的最常见原因(Van Leeuwen等，(2003)，European Journal of Epidemiology 18:845-854)。其为一种异质性疾病，特征在于逐渐丧失中央高敏锐视力。对于患者而言，这会极大地损害生活质量，因为他们失去了阅读、识别脸部的能力，且日常任务也成为主要障碍。根据世界卫生组织(WHO)的统计，由于AMD，共有3000-5000万人受到影响，约有1400万人失明或严重视力障碍(Gehrs等，(2006)Annals of Medicine 38:450-471)。

引起视网膜血管生成性疾病的病理过程是视网膜下混沌定向的和生理上缺乏的新血管的形成，称为脉络膜新血管形成(CNV)。尽管衰老、氧化应激、遗传和炎症均已被描述为导致CNV发病的原因；目前认为血管生成是造成最终共同途径的原因。

AMD的当前治疗选项包括激光治疗、去除或破坏异常血管的手术以及抗血管生成疗法，例如抗血管内皮生长因子(“VEGF”)，即抗VEGF疗法。这些抗血管生成药物通常注入眼睛的玻璃体，这给患者带来极大的不适和不便。另外，一些患者已经发展出对抗VEGF疗法的抗性且需要其他治疗选项。Yang等，Drug.Des.Devel.Ther.2016:10:1857-1867。

发明内容

本文提供了一种治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病的方法。该方法包括向受试者施用药物有效量的组合物，所述组合物包含具有序列Thr Pro His Thr His Asn ArgThr Pro Glu(SEQ ID NO:1)的肽。该组合物可以经口服、通过静脉内注射、或通过玻璃体内注射、或通过舌下递送向受试者施用，其中施用治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病。

任选地，该组合物包含2至50mg/kg体重(Bwt)的肽，并通过静脉内注射施用。任选地，该组合物包含0.1μg/kg至5mg/kg Bwt的肽，并通过玻璃体内注射施用。任选地，该组合物包含2至10mg/kgBwt的肽，并且口服施用。

任选地，该组合物至少每4至24周一次通过静脉内(IV)或玻璃体内(IVT)途径施用。任选地，至少每天一次口服施用该组合物1-2周，间隔为6个月。在该治疗方案中，在6个月的间隔期间不施用组合物。任选地，用于对抗VEGF疗法(例如，VEGF抗体)无反应的受试者。

任选地，该受试者患有年龄相关性黄斑变性、视网膜病变或血管闭塞。任选地，该受试者患有糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞或角膜新血管形成。任选地，该受试者是人。

本文还提供了一种治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病的方法。该方法包括选择患有对抗血管生成疗法无反应的视网膜血管生成性疾病的受试者，以及向该受试者施用包含具有序列SEQ ID NO:1的肽的组合物，其中施用治疗该受试者中的视网膜血管生成性疾病。任选地，该受试者对抗VEGF疗法无反应。

任选地，本文公开的组合物经配制用于静脉内施用、用于玻璃体内注射或用于口服施用。任选地，该受试者患有年龄相关性黄斑变性、视网膜病变或血管闭塞。任选地，该受试者患有糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞或角膜新血管形成。任选地，该受试者对抗血管生成疗法没有反应。任选地，该受试者对抗VEGF疗法例如VEGF抗体无反应。任选地，该受试者是人。

还提供了一种治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病的方法。该方法包括向受试者施用药物有效量的组合物，所述组合物包含具有序列Thr Pro His Thr His Asn XaaThr Pro Glu(SEQ ID NO:3)的肽N，其中Xaa是高精氨酸。可以经口服、通过静脉内注射或通过玻璃体内注射将组合物施用于受试者，其中施用治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病。

还提供了一种治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病的方法。该方法包括向受试者施用药物有效量的组合物，所述组合物包含具有序列Thr Pro His Thr His Gln XaaThr Pro Glu(SEQ ID NO:4)的肽Q，其中Xaa是高精氨酸。可以经口服、通过静脉内注射或通过玻璃体内注射将组合物施用于受试者，其中施用治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病。

附图说明

图1A，1B，1C和1D显示单次IV剂量的angio-3减弱KIMBA小鼠中视网膜血管生成的功效，该小鼠具有人VEGF的过表达(KIMBA-hVEGF转基因)。图1A是实验设计的示意图。图1B是显示基线和治疗后每周的眼底荧光素血管造影(FFA)图像的图像。采用局部施用1％托吡卡胺(Alcon Laboratories，Inc.，Fort Worth，TX)和2.5％苯肾上腺素(Bausch and LombPharmaceuticals，Inc.，Tampa，FL)眼用溶液扩张瞳孔后，使用用于啮齿类动物视网膜成像的MICRON IV综合系统(Alcon Laboratories，Inc.，Fort Worth，TX)拍摄数字彩色眼底照片。对于FFA，以0.01mL/5-6g BWt的剂量向小鼠腹膜内注射10％荧光素钠染料，并使用MICRON IV获得眼底图像。图1C是显示每只眼睛和每批次的Kimba小鼠中渗漏消退的图。在第4周给与IV单次注射100μL Angio-3，然后再进行4周(25mg/Kg Bwt)。读数为药物施用后视网膜血管生成的渗漏。n＝6只眼/批次；n＝3批次；值表示为均值±标准差，**P<0.01，*P<0.05，学生t检验。图1D是显示同工凝集素视网膜染色的图像。摘除对照和Angio-3处理的眼睛，并在室温下于PBS中的4％多聚甲醛(PFA)中固定15分钟。然后将眼睛转移到冰上的冷1×PBS中5-10分钟。分别切开神经视网膜和脉络膜/RPE，并将其置于冷(-70℃)乙醇中。然后将视网膜在PBS中冲洗，并在1％Triton-X/PBS中封闭30分钟。然后将整个载片与来自Griffonia Simplicofolia的同工凝集素GS-IB4，Alexa Fluor 594缀合物(MolecularProbes，I21413 1:100)在4℃下孵育过夜。将染色的整个载片用Prolong Gold(Invitrogen)平面安装，并放置过夜。所有成像均使用激光扫描共聚焦荧光显微镜进行。

图2A，2B，2C和2D显示单次IVT剂量的Angio-3和Eylea(抗VEGF)阳性对照在减弱KIMBA小鼠中的视网膜血管生成中的功效。图2A是实验设计的示意图。图2B是显示基线和治疗后每周的眼底荧光素血管造影术(FFA)图像的图像。图2C是显示Kimba小鼠中每只眼睛的渗漏的消退的图。图2D是显示每批次Kimba小鼠中渗漏消退的图。IVT单次注射1μL中1μg的乱序重排Angio-3；在第7周给予Angio-3肽和Eylea，然后再持续16周。读数为施用药物后视网膜血管生成的渗漏。n＝10只眼/批次；n＝2批次；值表示为均值±标准差，**P<0.01，*P<0.05，学生t检验。结果显示，用Eylea(阳性对照)治疗在治疗后有效减弱视网膜血管生成4周，而用Angio-3治疗小鼠在治疗后有效减弱视网膜血管生成16周。

图3A是在小鼠(B6J WT小鼠)中激光诱导的脉络膜新血管形成(CNV)模型中Angio-3的功效的实验设计的示意图。图3B是基线和治疗后不同时间点的FFA图像。在第0天(预防模式)和激光治疗后4天(消退模式)进行IV单次注射100μL Angio-3(25mg/Kg Bwt)。随后进行10周。图3C是显示各组的每只眼睛的渗漏面积的图。图3D是每组所有批次的平均渗漏面积的图。单剂量Angio-3通过IV途径在预防和消退模式下减少激光诱导的小鼠CNV模型中的病变直至10周，这在预防模式下非常显著。减弱的视网膜血管形成优于乱序重排肽。n＝6只眼/批次；n＝3批次。值表示为均值±标准差，**P<0.01，*P<0.05，学生t检验。图3E是视网膜功能测试结果的图，其测量了Angio-3治疗和对照中的ERG变化。然而，Angio-3治疗组的a和b波振幅与第1周后的基线值相似。

图4A是通过IVT施用的Angio-3功效的实验设计的示意图。图4B是各组每只眼的渗漏面积的图，图4C示出了每组所有批次的平均渗漏面积。该图说明在激光诱导的小鼠CNV模型中，通过IVT途径的单剂量Angio-3与Eylea(抗VEGF)和乱序重排肽相比显著降低了血管生成。n＝6只眼/批次；n＝3批次；值表示为均值±标准差，**P<0.01，*P<0.05，学生t检验。

图5A是在激光诱导的CNV模型中通过舌下途径的Angio-3功效的实验设计的示意图。图5B是显示在激光诱导的小鼠CNV模型中，通过舌下途径的Angio-3比鼠抗VEGF或乱序重排肽显著减少血管生成的图。图5C是按组划分的平均渗漏面积的图，图5D示出了每组所有批次的平均渗漏面积。n＝6只眼/批次；n＝3批次。值表示为均值±标准差，**P<0.01，*P<0.05，学生t检验。

图6A是在预防模式下在激光诱导的CNV模型中通过IVT途径的Angio-3功效的实验设计的示意图。图6B是显示在激光诱导的大鼠CNV模型中，通过IVT途径的单剂量Angio-3与Eylea(抗-VEGF)相比显著降低血管生成的图。n＝10只大鼠/组；值表示为均值±标准差，n＝3个独立实验，**P<0.01，*P<0.05，学生t检验。

图7A是在激光诱导的CNV的猴子模型中Angio-3的功效的研究设计的示意图。图7B是在激光诱导的猴CNV模型中采用通过IVT途径的单剂量(2mg)Angio-3，抗VEGF(Eylea和Lucentis)治疗的猴子中的眼睛的眼底荧光素血管造影术(“FFA”)的图。图7C是显示在治疗之前和之后每组中的每只眼睛所绘制的渗漏消退的图。n＝2只猴/组；值表示为均值±标准差，***P<0.001，*P<0.05，学生t检验。

图8是显示如图7中所述治疗的猴子中的等级严重性和等级百分比的图。在单次IVT剂量的Angio-3、Eylea和

之后，测试制品制剂被良好耐受并且所有动物看起来总体健康。在所有组中，玻璃体内注射后，有几只动物在研究眼中发生了眼内炎症，大部分是短期的。在该干预研究中，对于媒介物对照，未观察到病变严重程度的变化，并且与媒介物对照相比，所有治疗的病变严重程度变化均显著不同。

图9是显示在施用Eylea或Angio-3之前和之后猴子中激光光斑面积厚度和体积的结果的图。Angio-3或Eyelea的量与图7中描述的相同。与预处理相比，两组中的激光光斑面积在处理后均显著减少。

图10是用甲苯胺蓝(Magnification 20X)染色的Araldite视网膜切片的图像。移除眼睛，在半强度Karnovsky固定剂中固定2至3天，然后在福尔马林中保存直至处理。将包含1个或2个病变部位的组织条埋入塑料中。通过每个病变的中部以30-μm的步长取2μm厚的切片。将切片用甲苯胺蓝染色，并将具有最强病变的样品指定为纵剖。然后由对其隐蔽治疗条件的观察者(R.R.D.)评估该切片。根据以下三个标准计算每个病变的组织增殖评分：纺锤状细胞增殖性病变的大小，视网膜下腔中新血管增殖的程度以及脉络膜毛细血管上方视网膜的升高。与药物治疗的眼睛相比，经媒介物处理(对照)的切片更厚，且血管更多。

与药物治疗的眼睛相比，对照切片显示出更多的脉络膜纤维化、增加的视网膜厚度、更多的脉络膜新血管形成，多个血管延伸视网膜厚度和视网膜高度的一倍或两倍。

图11A是基线和治疗后不同时间点的FFA图像。小鼠接受单次IVT注射的Angio-3(剂量为1μl中的1μg或1μl中的100ng)和化学修饰的Angio-3肽Pep-N(剂量分别为5μg/μl；1μg/μl；和100ng/1μl)和Pep-Q肽(剂量分别为5μg/μl；1μg/μl；和100ng/1μl)。图11B是每只眼睛的渗漏面积的图。通过IVT途径单剂量减弱激光诱导的小鼠CNV模型中的视网膜血管生成直至4周。在激光诱导的CNV小鼠模型中，所有三种肽均能够显著减弱脉络膜血管生成。Eylea是阳性对照。n＝18只眼/组；值表示为均值±标准差，n＝3个独立实验，**P<0.01，*P<0.05，学生t检验。

图12A和12B说明了Angio-3对VEGF诱导的HRMEC细胞增殖的影响。图12A是显示Angio-3与10ng/ml VEGF组合的作用的图。图12B是显示Angio-3与50ng/ml VEGF组合的作用的图。

图13A和13B显示以下物质的存在下Angio-3对HRMEC细胞迁移的影响：1)仅在EBM-2中，2)补充50ng/ml VEGF的EBM-2，3)补充300ug/ml阿瓦斯汀和50g/ml VEGF的EBM-2，4)补充300ug/ml Angio3和50g/ml VEGF的EBM-2，和5)补充600ug/ml Angio3和50g/ml VEGF的EBM-2。图13B是FFA图像，且图13A是基于图13B的图像在100x物镜下的显微视野中的细胞数目图。

图14A和14B显示以下物质的存在下Angio-3对VEGF诱导的HRMEC管形成的作用：1)仅在EBM-2中，2)补充50ng/ml VEGF的EBM-2，3)补充300ug/ml阿瓦斯汀和50g/ml VEGF的EBM-2，4)补充300ug/ml Angio3和50g/ml VEGF的EBM-2，和5)补充600ug/ml Angio3和50g/ml VEGF的EBM-2。图14B是细胞的FFA图像。图14A是基于图14B中的图像的总管长度、连接数量和环总数的量化图。**P<0.01，*P<0.05。除非另有明确说明，否则在本申请中公开的VEGF肽是指VEGF₁₆₅，其为具有最强的生物学活性且在体内存在最丰富的一种人VEGF亚型。

图15A和15B是显示在VEGF或bFGF的存在下，Angio-3诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的图。图15A显示在20ng/ml VEGF的存在下，Angio-3以剂量依赖性方式诱导HUVEC凋亡。图15B显示在20ng/ml bFGF的存在下，Angio-3以剂量依赖性方式诱导HUVEC凋亡。*表示p<0.05，n＝3。

图16A和16B是显示Angio-3抑制由VEGF和bFGF刺激的HUVEC增殖的图。图16A显示Angio-3以剂量依赖性方式抑制由20ng/ml VEGF诱导的HUVEC增殖。图16B显示Angio-3以剂量依赖性方式抑制由20ng/ml bFGF诱导的HUVEC增殖。*表示p<0.05，n＝3。

图17A，17B，17C和17D显示Angio-3抑制VEGF和bFGF诱导的EC迁移并抑制毛细血管网络形成。图17A是图像，图17C是显示Angio-3以剂量依赖性方式抑制由20ng/ml VEGF诱导的HUVEC趋化迁移的图。将迁移的细胞用Hoechst染色，成像并计数。图17B是图像，图17D是显示Angio-3以剂量依赖性方式抑制由20ng/ml bFGF诱导的HUVEC趋化迁移的图。将迁移的细胞用Hoechst染色，成像并计数。n＝3；*表示与对照相比显著减少，单向ANOVA P<0.05。

图18A和18B显示Angio-3抑制基质胶(Matrigel)上HUVEC毛细血管网络的形成。图18A是在基质胶上的HUVEC管形成的代表性图像。将HUVEC与递增剂量的Angio-3一起预孵育30分钟，然后接种到基质胶上。图18B是由HUVEC管覆盖的百分比面积的图。n＝3；*表示与对照相比显著减少，单向ANOVA P<0.05。

图19A，19B和19C是显示Angio-3是一种新型抗渗剂的图，其可以抑制VEGF诱导的多种内皮细胞类型的血管通透性(VP)。在图19A中，用增加浓度的Angio-3或单独的培养基处理融合后的HUVEC单层。结果表明，Angio-3以剂量依赖性方式抑制融合的HUVEC间VEGF诱导的通透性，而没有影响基础水平的通透性。在这些实验中，在用100ng/ml VEGF刺激之前，将融合后的HUVEC单层用Angio-3预处理30分钟。在图19B中，用增加浓度的Angio-3或单独的培养基处理融合后的HMVEC单层。结果表明，Angio-3以剂量依赖性方式抑制VEGF诱导的融合人类真皮微血管内皮细胞(HMVEC)间的通透性，而没有影响基础水平的通透性。在图19C中，将融合后的HREC单层用Angio-3和VEGF处理3小时。结果表明，Angio-3以剂量依赖性方式抑制融合人类视网膜内皮细胞(HREC)间的VEGF诱导的通透性，而没有影响基础水平的通透性。*表示p<0.05，n＝3。

图20A和20B分别是图像和图，显示Angio-3抑制小鼠中局部VEGF诱导的皮肤血管通透性。在图20A中，通过皮内注射向小鼠施用Angio-3，结果表明Angio-3在15分钟内以剂量依赖性方式抑制了VEGF诱导的皮肤通透性。皮肤通透性通过伊文思蓝染料外渗而可视化。在图20B中，通过染料的甲酰胺提取并测量OD 610来定量染料外渗。每组n＝5只动物，*表示与同时对照相比显著增加，p＜0.05。

图21A，21B，21C和21D是显示Angio-3阻止VEGF诱导的血管内皮(“VE”)-钙粘蛋白自HUVEC上的粘着连接(AJ)解离的图像。Angio-3保护VE-钙粘蛋白免受VEGF诱导的细胞-细胞AJ解离。将融合的HUVEC单层用100μM Angio-3预处理30分钟，然后用100ng/ml VEGF刺激单层20分钟。然后将细胞固定，透化并探测VE-钙粘蛋白。图21A-D分别显示了对照细胞、用100ng/ml VEGF处理的细胞、用100uM Angio-3处理的细胞和用100ng/ml VEGF以及100uMAngio-3处理的细胞。

图22A和22B是显示Angio-3抑制VEGF诱导的HUVEC中紧密连接(TJ)蛋白ZO-1和ZO-2自TJ解离的图。分别在对照、100ng/ml VEGF、100μM Angio-3以及100ng/ml VEGF和100μMAngio-3下处理细胞。

图23A，23B，23C和23D是显示Angio-3在HUVEC中抑制VEGF诱导的肌动蛋白应力纤维形成的图像。然而，在缺乏VEGF的情况下，Angio-3促进皮质肌动蛋白纤维的形成。红色代表肌动蛋白染色，蓝色代表DAPI染色。

图24是示出了通过视网膜电图(ERG)记录的视网膜功能测试结果的图。未治疗的小鼠在12周龄后对a波和b波均无反应。Angio-3在治疗后6周增加a波和b波反应，然后第二次给药再次增加反应20周。该结果表明Angio-3正拯救KIMBA小鼠中的视网膜功能。数据表示为平均值±标准误差。**＝P<0.05；***＝P<0.01。

图25A，25B，25C，25D，25E和25F显示在作为湿性AMD实验模型开发的食蟹猴中的激光诱导的脉络膜新生血管形成(CNV)模型中的测试结果。图25A是研究设计的示意图。图25B是所有组的代表性眼底荧光素血管造影(FFA)图像。图25C是显示用单剂量2mg的Angio-3，剂量2mg的抗-VEGF(Eylea)，2mg的肽(Q2)和4mg的肽(Q4)和对照处理的猴子中眼睛的平均损伤等级变化的图。图25D是在激光诱导的脉络膜新血管形成非人类灵长类动物模型中测试的Angio-3，PepQ-低剂量(2mg)；PepQ-高剂量(4mg)，Eylea和对照眼治疗前后所有等级百分数的图。图25E是通过ImageJ软件从FFA图像量化的激光面积的图。图25F是通过ImageJ软件从PS-OCT图像量化的激光体积的图。与媒介物对照相比，所有四个治疗组均显著减少了渗漏和新血管面积。与测试肽相比，Eylea显示出优越的功效。然而，Pep-Q显示出剂量依赖性功效以及与Eylea接近的较高的剂量功效。

图26A和26B是显示碱烧伤后7天角膜新血管形成进展的图像。图26A是经媒介物治疗的眼睛的代表图像。图26B是每天用我们的目标化合物(肽Q)处理3次的眼睛的代表性图像。白色箭头表示角膜混浊和新血管形成的差异。

图27是通过ImageJ软件定量的碱烧伤后后7天的角膜新血管形成(NV)面积的图。与媒介物对照眼相比，肽Q治疗的眼角膜NV面积显著减少。

图28A和28B是显示在小鼠模型中测试伤口愈合的结果的图像和图。图28A是在从Angio-3治疗的和对照的野生型小鼠中去除角膜上皮以及上皮缺损的局部荧光素染色(绿色)之后的鼠角膜的代表性裂隙灯生物显微镜图像。图28B是在Angio-3治疗的和对照的野生型小鼠中剩余的伤口缺损(垂直轴)随时间(水平轴)的百分比的图，来自2个独立实验的每组n＝6。两组均具有统计学显著性。Angio-3不会影响正常的伤口愈合过程。数据表示为平均值±标准误差。

具体实施方式

本文提供了通过施用包含Angio-3肽的组合物来治疗患有视网膜血管生成性疾病的受试者的组合物和方法。Angio-3肽用于阻断患有视网膜血管生成性疾病的患者中的新血管形成，且对于对抗VEGF治疗无反应的患者特别有用。该疗法可以方便地经口服或通过静脉内注射或通过玻璃体内注射而递送。

当与值结合使用时，术语“约”是指合理地接近该值的任何值，即，在该值的±10％的范围内。特别地，它将包括值本身。例如，将45mg/kg的值和55mg/kg的值均视为“约50mg/kg”。

术语“受试者”、“患者”或“个体”在本文中可互换使用以指代人或动物。例如，动物受试者可以是哺乳动物、灵长类动物(例如猴)、牲畜(例如马、牛、绵羊、猪或山羊)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室测试动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、鸟)、具有兽医意义的动物或具有经济意义的动物。

如本文所用，术语对治疗“无反应”和“非应”在本文中可互换使用，是指患者或受试者对特定治疗无反应或在治疗特定疾病后未获得所需的益处。术语“无反应”和“非应”包括其中受试者接受治疗但未经历在没有治疗的情况下与疾病相关的至少一种症状的减轻的情形。举例而言，如果尽管接受抗VEGF疗法而患者视网膜下的新血管继续形成，或者如果接受治疗时新血管持续生长，则受试者对抗VEGF疗法无反应。

如本文所用，术语“无反应者”是指施用针对特定疾病的治疗性治疗但不对该治疗起反应或从中获得益处的受试者。该术语是指没有经历与疾病例如视网膜血管生成性疾病有关的至少一种症状的减轻的受试者。

如本文所用，“治疗”病症、疾病或病况或与病症、疾病或病况相关的症状是指获得有益或期望的结果，包括临床结果的方法。有益或期望的临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病症，减轻病症、病况或疾病的程度，稳定病症、病况或疾病的状态，预防病症、病况或疾病的发展，预防病症、病况或疾病的传播，延迟或减慢病症、病况或疾病进展，延迟或减慢病症、病况或疾病发作，改善或缓和病症、病况或疾病状态，以及缓解，无论是部分还是全部。“治疗”也可意指延长受试者的生存期，使其超出未进行治疗时的预期生存期。“治疗”还可意指抑制病症、病况或疾病的进展，暂时减慢病症、病况或疾病的进展，尽管在某些情况下，它涉及永久停止病症、病况或疾病的进展。如本文所用，术语治疗是指减少以蛋白酶表达为特征的疾病或病症的一种或多种症状或以蛋白酶表达为特征的疾病或病症的症状的效应的方法。因此，在所公开的方法中，治疗可以指已确定疾病、病症或者疾病或病症的症状的严重性降低10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。例如，如果与对照相比，受试者中的一种或多种疾病症状减少了10％，则认为治疗疾病的方法为治疗。因此，与天然或对照水平相比，减少可以是10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，或在10％和100％之间的任何百分比减少。应当理解，治疗不一定指治愈，或者完全消融疾病、病症或者疾病或病症的症状。此外，如本文所用，对减少、降低或抑制的引用包括与对照水平相比10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更大的变化，并且此类术语可以包括但不一定包括完全消除。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以包括氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。

术语“氨基酸”包括天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物包括具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”包括具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以类似于天然氨基酸的方式起作用的化合物。

氨基酸在本文中可以用IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的众所周知的三字母符号或一字母符号表示。同样，核苷酸可以用它们普遍接受的单字母代码来指代。

关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的编码序列中的氨基酸的个体取代、缺失和/或添加是“保守修饰的变体”，其中该改变导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。此类保守修饰的变体是多态变体、种间同系物和/或等位基因的补充，并且不排除所述多态变体、种间同系物和/或等位基因。

以下八组各自包含彼此保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)

(参见例如Creighton，Proteins(1984))。

术语“治疗有效量”或“有效量”包括达到所需的治疗或预防结果所需的剂量和时间段有效的量或数量。

术语“施用”包括口服施用、局部接触、作为栓剂施用、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用，或缓释装置(例如微型-渗透泵)植入至受试者。施用为通过任何途径进行，包括肠胃外和透粘膜(例如颊、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其他递送方式包括但不限于脂质体制剂的使用、静脉内输注、透皮贴剂等。本领域技术人员将知晓用于施用治疗有效量的本文所述的融合蛋白的其他方法。

本文描述的是治疗患有多种视网膜血管生成性疾病例如年龄相关性黄斑变性、视网膜病变或血管闭塞的受试者的方法。视网膜病变是指导致视力受损或丧失的视网膜疾病。年龄相关性黄斑变性(“AMD”)的特征在于新血管侵入到眼睛的不同结构中，例如黄斑和视网膜色素上皮。血管闭塞是视网膜血管，动脉或静脉的阻塞。任选地，所述受试者患有糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞或角膜新血管形成。具有这些病症之一的受试者可能会经历以下一种或多种症状：视野缺损，难以看到纹理和环境中的细微变化，难以适应变化的光照水平以及深度感知受损。视网膜血管生成性疾病可以由受过训练的验光师或其他医学专家使用本领域众所周知的方法检查视网膜下的血管形成而诊断，所述方法例如散瞳检查、自发荧光、眼底照相术、荧光素血管造影术、光学相干断层扫描术(OCT)、眼压测量、眼底检查或检眼镜检查。

任选地，先前确定用Angio-3肽治疗的受试者对抗血管生成疗法，例如抗VEGF疗法无反应。如本文所用，抗血管生成疗法是指阻断血管生成的疗法。如本文所用，抗VEGF疗法是指阻断一种或多种VEGF功能的疗法。抗血管生成疗法的非限制性实例包括哌加他尼(Pfizer的Macugen^TM)，兰尼单抗(Genentech的Lucentis^TM)贝伐单抗(Genentech的Avastin^TM)，羧胺三唑，TNP-470，CM101，IFN-a，IL-12，血小板因子4，苏拉明，SU5416，血小板反应蛋白，VEGFR拮抗剂，血管抑制类固醇+肝素，软骨衍生的血管生成抑制因子，基质金属蛋白酶抑制剂，血管抑素，内皮抑素，2-甲氧基雌二醇，替可加兰，催乳素，α_v.β₃抑制剂，利诺胺，VEGF-Trap(Reminron Pharmaceuticals的产品)，氨甾醇(Genera公司的

)，Cortisen(Alcon的

)，酪氨酸激酶抑制剂，抗血管生成siRNA，补体系统抑制剂，基因治疗(gentherapeutic)疗法(例如Genvec(Gaithersburg，MD)的AdPEDF.11)。任选地，抗VEGF疗法是抗VEGF抗体，例如可商购的贝伐单抗。

任选地，治疗视网膜血管生成性疾病的方法包括选择已被诊断患有视网膜血管生成性疾病但对抗VEGF疗法无反应的受试者。施用组合物包含本文公开的Angio-3肽，例如SEQ ID No 1-4中的任一个，或其任何组合。

血管抑素是纤溶酶的片段，而纤溶酶是纤溶酶原的片段。纤溶酶原(UniProtNo.P00747)包含五个同源重复，这些重复形成通过二硫键连接在一起的环状“圈形区(kringle)”结构。纤溶酶原通过位于五个圈形区结构域(k1至k5)上的赖氨酸结合位点与血纤蛋白结合(Folkman等，Nature Medicine，vol.1，No.1，pp.27-31 1999)。每个圈形区结构域的长度为约80个氨基酸残基，并且不同的圈形区结构域在氨基酸序列上彼此高度同源。Angio-3源自纤溶酶原的圈形区结构域k4，并且是一种血管生成抑制剂，即，它阻止新血管的生长，并具有抗炎/抗血管生成活性。Angio-3信号通路介导了静止和活化(即血管生成)内皮之间的转换。与似乎均匀促进血管生成的血管内皮生长因子(VEGF)不同，Angio-3似乎具有不同的功能，具体取决于内皮细胞的情况，细胞与细胞之间以及细胞与基质之间的接触均调节所产生的信号。

据信，在许多情况下，患有视网膜血管生成性疾病的患者对VEGF抑制剂治疗无反应或在治疗一段时间后变得无反应，导致保护VEGF依赖性内皮。如本文所述，递送Angio-3可破坏新血管的形成，并且患者可能能够克服对抗VEGF疗法的抗性。特别地，施用Angio-3肽可以减弱视网膜和/或脉络膜血管生成和/或减少由视网膜血管生成引起的眼中渗漏的病变区域。

可用于治疗视网膜血管生成性疾病的Angio-3肽可以是天然的Angio-3肽，其具有Thr Pro His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu的序列(SEQ ID NO:1)。Angio-3肽也可以是包含自SEQ ID NO:1的修饰但仍保留阻断血管生成的功能的肽。对肽的一些示例性修饰包括序列修饰和化学修饰。

如本文所述，多核苷酸序列可编码Angio-3多肽，其包括具有不同核苷酸的缺失、插入或取代的那些序列，其导致编码具有本发明多肽的至少一种功能特征的多肽的多核苷酸。该定义包括多态性，该多态性可能使用编码本发明多肽的多核苷酸的特定寡核苷酸探针容易地检测，或可能不易于检测，并且采用编码本发明多肽的多核苷酸序列的正常染色体基因座以外的基因座与等位基因变体进行不正确或意外的杂交。

不改变由多核苷酸编码的氨基酸序列的序列改变称为“沉默”变异。由于遗传密码的简并性，除了分别编码甲硫氨酸和色氨酸的密码子ATG和TGG外，同一氨基酸的任何可能密码子都可以通过多种技术取代，例如位点定向诱变，其可在本领域中获得。因此，从序列表中选择的序列的任何和所有这样的变异均为本公开的特征。

除了沉默变异之外，还可以进行改变Angio-3肽中一个或几个氨基酸残基的其他保守变异，而不改变多肽的功能。例如，还可以设想在本文提供的序列中引入取代、缺失和插入。氨基酸取代通常是单个残基；插入通常将为大约1至10个氨基酸残基的数量级；缺失范围将为约1至30个残基。在优选的实施方式中，在相邻对中进行缺失或插入，例如，两个残基的缺失或两个残基的插入。取代、缺失、插入或其任何组合可以经组合以得到序列。在编码肽的多核苷酸中发生的突变不应将序列置于阅读框之外，也不应创建可能产生二级mRNA结构的互补区。优选地，由DNA编码的多肽执行期望的功能。

保守取代是其中氨基酸序列中的至少一个残基已被去除并且在其位置插入了不同残基的那些取代。通常当需要维持蛋白质的活性时进行此类取代。尽管多肽中的所有保守氨基酸取代(例如，一个碱性氨基酸取代另一碱性氨基酸)不一定会导致该多肽保留与天然多肽相同的活性，但可以预期，许多这些保守突变会导致在多肽保留其活性。

可以根据本领域技术人员众所周知的方法通过修饰相应的野生型序列来产生Angio-3肽的序列变体。此类方法包括但不限于通过PCR诱变，其使用设计为包含所需变化的引物；嵌套引物以突变目标区域；以及反向PCR，其使用反向定向的引物扩增未知序列的区域。许多其他的突变和进化方法也是可用的，并且预期在相关领域的普通技术人员的技术范围内。Angio-3肽(SEQ ID NO:1)的序列变体以及Angio-3肽本身也可以在实验室中使用本领域公知的肽合成方法来合成。

因此，本公开还提供了具有Asn Thr Thr Glu Thr Pro His Pro His Arg(SEQ IDNO:2)序列的乱序重排(scrambled)的Angio-3肽，其用作本文公开的某些研究的阴性对照。

表达的核酸和多肽的化学或酶促改变可以通过标准方法进行。例如，可以通过添加脂质、糖、肽、有机或无机化合物，通过包含修饰的核苷酸或氨基酸等来修饰序列。这些方法可用于修饰任何给定的序列，或修饰由本文所述且本领域技术人员已知的各种突变和人工进化修饰方法产生的任何序列。

本文公开的Angio-3肽可包括天然氨基酸，以及任选地其翻译后修饰。然而，体外肽合成允许使用修饰的和/或非天然氨基酸。下文中提供了示例性但非限制性的修饰的和/或非天然氨基酸的表格。

表1.修饰的氨基酸

因此，本公开提供了通过突变、化学或酶促修饰或其他可用方法对任何给定核酸的修饰，以及通过实践此类方法产生的产物，例如，使用本文的序列作为起始底物用于各种修饰方法。

任选地，对天然Angio-3的修饰是用高精氨酸替代精氨酸。高精氨酸是L-精氨酸(Arg)的亚甲基同系物。它是一种氨基酸衍生物，可增加一氧化氮的利用率并增强内皮功能。因此，任选地，可用于治疗视网膜血管生成性疾病的Angio-3肽是Pep-N，其具有Thr ProHis Thr His Asn Xaa Thr Pro Glu序列(SEQ ID NO:3)，其中Xaa是高精氨酸。任选地，可用于治疗视网膜血管生成性疾病的Angio-3肽是Pep-Q，其具有Thr Pro His Thr His GlnXaa Thr Pro Glu序列(SEQ ID NO:4)，其中Xaa是高精氨酸。

可以通过本领域已知的方法制备Angio-3肽。这些方法包括合成肽化学，使用合适的原核或真核宿主细胞和表达系统重组表达本公开的肽，或作为体细胞基因转移的特征的肽的重组表达，即作为治疗部位处的施用方案的一部分表达。

任选地，可以使用标准肽合成技术例如固相或溶液相肽合成化学合成肽。即，例如，可以使用本领域公知的组合物和方法，在固相支持物上或在溶液中化学合成如SEQ IDNO:1-4所公开的肽，参见例如Fields，G.B.(1997)Solid-Phase Peptide Synthesis.，Academic Press，San Diego，其以引用的方式整体并入本文。此类标准肽制备技术包括例如溶液合成或Merrifield型固相合成，Boc(叔丁氧羰基)和Fmoc(9-芴基甲氧羰基)策略。任选地，使用本领域众所周知的方法通过固相Fmoc化学合成肽(Ajikumar PK，Lakshminarayanan R，Ong BT，Valiyaveettil S，Kini RM.Biomacromolecules.2003 Sep-Oct；4(5):1321-6)。

本文提供了包含药学上可接受的赋形剂和Angio-3肽的药物组合物。还提供了一种用于治疗视网膜血管生成性疾病的组合物的施用方法，特别是用于对抗血管生成疗法(例如抗VEGF疗法)无反应的受试者。

药物组合物或药物可以使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂通过标准技术配制。合适的药物载体在本文和例如E.W.Martin的“Remington:The Science andPractice of Pharmacy，第21版”中进行了描述。可以将Angio-3肽及其生理学上可接受的盐和溶剂化物配制成用于通过任何合适的途径施用，包括但不限于口服、局部、经鼻、直肠、肠胃外(例如静脉内、皮下、肌内等)及其组合。任选地，将治疗剂溶解在液体例如水中。

对于口服施用，本文公开的药物组合物或药物可以采取例如通过常规方式与药学上可接受的赋形剂一起制备的片剂或胶囊剂的形式。优选的是片剂和明胶胶囊，其包含活性成分以及(a)稀释剂或填充剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素(例如乙基纤维素、微晶纤维素)、甘氨酸、果胶、聚丙烯酸酯和/或磷酸氢钙、硫酸钙；(b)润滑剂，例如二氧化硅、无水胶体二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其镁或钙盐(例如硬脂酸镁或硬脂酸钙)、金属硬脂酸盐、胶体二氧化硅、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、乙酸钠和/或聚乙二醇；对于片剂还包含(c)粘合剂，例如硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或羟丙基甲基纤维素；如果需要的话，(d)崩解剂，例如淀粉(例如马铃薯淀粉或淀粉钠)、乙醇酸盐、琼脂、藻酸或其钠盐或泡腾混合物；(e)润湿剂，例如十二烷基硫酸钠，和/或(f)吸收剂、着色剂、调味剂和甜味剂。任选地，片剂包含羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇6000和二氧化钛的混合物。片剂可以根据本领域已知的方法进行薄膜包衣或肠溶包衣。

用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液剂，糖浆剂或混悬剂的形式，或者它们可以以干燥产品的形式存在，以在使用前用水或其他合适的媒介物配制。这样的液体制剂可以通过常规方式与药学上可接受的添加剂一起制备，所述添加剂例如助悬剂，例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂或阿拉伯胶；非水媒介物，例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油；和防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸。制剂还可以适当地包含缓冲盐、调味剂、着色剂和/或甜味剂。如果需要，可以适当地配制用于口服施用的制剂以控制释放活性化合物。

对于局部施用，本公开的组合物可以是乳剂、洗剂、凝胶、乳膏、胶冻、溶液、悬浮液、软膏和透皮贴剂的形式。对于通过吸入递送，组合物可以通过喷雾器以干燥粉末或液体形式递送。对于肠胃外施用，组合物可以是无菌注射溶液和无菌包装粉末的形式。优选地，可注射溶液在约4.5至约7.5的pH下配制。

组合物也可以冻干形式提供。这样的组合物可以包括用于在施用前重构的缓冲剂，例如碳酸氢盐，或者该缓冲剂可以被包括在冻干的组合物中以采用例如水重构。冻干的组合物可进一步包含合适的血管收缩剂，例如肾上腺素。冻干的组合物可以在注射器中提供，其任选地与缓冲液一起包装以用于重构，使得可以将重构的组合物立即施用于患者。

化合物可以封装在诸如压力控制递送胶囊、结肠靶向递送系统、渗透控制药物递送系统等的受控药物递送系统中。压力控制递送胶囊可以包含乙基纤维素膜。结肠靶向递送系统可包含含有乳果糖的片剂核，其采用酸溶性材料例如Eudragit

包覆，然后采用肠溶性材料例如Eudragit

包覆。渗透控制药物递送系统可以是用硬明胶胶囊封装的单个或多个渗透单元(例如，胶囊渗透泵；可从例如Alzet，Cupertino，CA商购)。通常，渗透单元包含渗透推动层和药物层，两者均被半透膜围绕。

药物组合物或药物可以治疗有效剂量施用于受试者，以治疗如本文所述的视网膜血管生成性疾病。任选地，将药物组合物或药物以足以在受试者中引起有效治疗反应的量施用于受试者。

通常，活性化合物的剂量是足以实现所需效果的剂量。最佳给药方案可以根据受试者体内药剂积聚的测量而计算得出。通常，施用剂量可以根据多种因素而变化，这些因素包括但不限于受试者的体重、年龄、个体状况、待接触区域的表面积或体积、和/或施用途径。剂量的大小也将由在特定受试者中施用特定化合物所伴随的任何不良作用的存在、性质和程度来确定。优选地，应当使用产生期望结果所需的最小剂量和浓度。对于儿童、老年人、虚弱的患者以及患有心脏和/或肝脏疾病的患者，应适当调整剂量。可使用评估剂量的实验动物模型，从本领域已知的研究中获得更多指导。

任选地，通过静脉内注射施用组合物。静脉内施用于个体(例如，人)的单位剂量可为每1kg体重包含2-50mg活性成分，其也称为2-50mg/kg Bwt。例如，对于约50kg的患者，单位剂量可包含100mg-2,500mg的Angio-3肽活性成分。任选地，单位剂量为2-50mg/kg Bwt，例如10-50mg/kg Bwt，25-45mg/kg Bwt或20至40mg/kg Bwt。单位剂量的体积发生变化。任选地，体积在10-200μl的范围内，例如40-150μl，100-200μl，120-150μl或50-160μl。

任选地，通过玻璃体内注射来施用组合物。通常，玻璃体内施用的单位剂量可以包含0.1μg/kg Bwt-2mg/kg Bwt，例如0.5μg/kg Bwt-2mg/kg Bwt，1-2mg/kg Bwt或1至1.5mg/kg的angio-3肽。单位剂量的体积可以变化，例如，其可以在10-80μl的范围内，例如20-60μl或30-50μl。

任选地，该组合物经口服施用。通常，口服施用的单位剂量可包含2mg/kg Bwt-10mg/kg Bwt，例如2μg/kg Bwt-8mg/kg Bwt，5-10mg/kg Bwt或4至6mg/kg的Angio-3肽。

组合物的剂量可以在整个施用期间进行监测和调整，这取决于症状的严重程度、复发频率和/或对治疗方案的生理反应。本领域技术人员通常在治疗方案中进行此类调整。

为了实现期望的治疗效果，可以以治疗有效剂量施用组合物多天。因此，治疗受试者中的本文所述的相关病症或疾病的本公开的组合物的治疗有效施用需要定期(例如每天)使用，其持续四周或两年或更长时间。如果每天施用药剂，或以足以在受试者中维持药剂的治疗有效浓度的频率施用药剂，则可以实现治疗有益效果。例如，可以每天、每隔一天，或者如果受试者采用更高的剂量范围并且可以耐受，则例如每周两次施用药剂。

用Angio-3肽治疗患者的治疗持续时间根据受试者中病症的严重程度和受试者对Angio-3的反应而变化。因此，采用根据本公开的Angio-3进行的治疗可以持续长达五、六、八、十周甚至更长时间。任选地，可以将组合物施用约4周至2年，更通常约6周至约1年，最通常约6个月至1年的时间。合适的施用期还包括约18周至1年，9至16周，16至24周，16至32周，24至32周，24至48周，32至48周，32至52周，48至52周，48至64周，52至64周，52至72周，64至72周，64至80周，72至80周，72至88周，80至88周，80至96周，88至96周和96至104周。合适的施用期还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40，45、48和50周。通常应继续施用组合物，直至观察到病症的临床显著改善。

任选地，包含Angio-3肽的组合物的施用是不连续的，并且可以停止一个或多个时间段，然后在施用恢复的一个或多个时间段后停止。停止施用的合适时间包括1至9个月，1至6个月，9至16周，16至24周，2至32周，24至32周，24至48周，32至48天，32至52天，48至52天，48至64天，52至64天，52至72天，64至72天，64至80天，72至80天，72至88天，80至88天，80至96天，88至96天和96至100天。停止施用的合适时间还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40，45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96和100天。

任选地，每天将组合物口服施用于患者一次，两次或多次。任选地，在时间间隔内，每天口服施用包含Angio-3肽的组合物至少两(2)周，至少三(3)周或1-2周。在一些情况下，间隔为3、4、6、7或8个月。通常，持续施用Angio-3直至实现所需的治疗益处。从递送第一剂至递送最后剂的整个治疗期可为6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，24，25，30，32个月。任选地，整个治疗期持续6至10个月，12至24个月，6至32周，24至32周，24至48周，32至48个月或32至52个月。

任选地，每24周，每20周，每15周，每12周，每10周或每4周至少一次、两次或多次静脉内或玻璃体内递送组合物。任选地，每4至10周一次静脉内或玻璃体内递送组合物。

本文公开的Angio-3组合物可以与已知可用于治疗视网膜血管生成性疾病的其他活性剂组合使用，或与可能单独无效但可能有助于阿托品功效的辅助剂组合使用。Angio-3组合物还可与激光疗法或外科手术结合使用，以治疗视网膜血管生成性疾病。

本文公开的Angio-3组合物可以放置在合适的容器例如瓶或滴管中，并标注用于治疗指定的病症。对于阿托品组合物的施用，这种标注将包括例如关于施用量、频率和方法的说明。

在治疗开始时以及在治疗期间和/或之后的定期检查期间，通过眼睛检查来监测患者。在一些情况下，例如在治疗期期间和/或之后每四个，五个，六个月，七个或八个月对患者进行监测。确定视网膜血管生成性疾病进展的方法是众所周知的，例如通过彩色眼底照相术(“CFP”)、眼底荧光素血管造影术(“FFA”)、光学相干断层扫描术(“OCT”)和视力测试。经由临床评分系统通过定性和定量分析评估对治疗的反应。

实施例

以下实施例仅用于说明目的，不应解释为限制。本领域技术人员可以使用多种替代技术和程序，其将类似地允许人们成功地执行所提供的方法。

实施例1.Angio-3在非人灵长类(NHP)激光诱导的CNV中的功效

本项先导功效研究是在NHP激光诱导的脉络膜新生血管(“CNV”)模型上进行的。该初步研究使用四只猴子，并对每只动物进行眼睛检查程序。用肌内氯胺酮(10-20mg/kg)和美托咪定(0.02mg/kg；IM)镇静动物。进行局部麻醉(1-2滴1％的赛罗卡因)以减轻眼睛不适感。将非人类灵长类动物的瞳孔用2.5％盐酸去氧肾上腺素和1％托吡卡胺滴剂进行扩张以用于眼部程序。

激光光凝(激光诱导的CNV)：

如先前所述，在动物的两只眼睛上进行激光光凝以建立CNV模型(Lai CM等，2005)。简而言之，采用500-800mW功率强度，50微米光斑大小和0.1-s持续时间的方案以网格方式在每只眼睛的黄斑周围递送9次激光烧伤。从每个激光光斑到中央凹的距离保持在0.5至1个圆盘直径大小。注意避免损伤中央凹。

每天两次观察动物的潜在不良事件的迹象，每天一次观察动物的食物消耗的定性评估。在转移日选择动物进行激光损伤时和在剂量施用日以及在整个研究的其余部分中每周记录动物的体重。

玻璃体内注射：

将动物麻醉后，通过在结膜囊中放一滴赛罗卡因将眼睛局部麻醉。将5％聚维酮碘溶液放入结膜囊中。将自固定眼睑窥器放置在眼睛中。卡尺用于测量和标记角膜缘后2mm的位置。还使用镊子稳定眼睛，并使用30号针头进行玻璃体内注射。在第15天(激光损伤后14天)向两只眼睛单次IVT注射测试化合物(50μl中2mg)。对所有动物进行每日笼侧观察，以监测健康状况不佳的临床体征，包括任何眼部异常。

彩色眼底照相术(CFP)和眼底荧光素血管造影(FFA)：

在激光治疗前和激光治疗后第14天以及激光治疗后第29天(治疗后2周)在两只眼睛上进行眼底照相。对于照相，如上所述将瞳孔扩大并用眼底照相机(TopCon Corp.，东京，日本)成像。眼底照片用于检测视网膜中的任何变化，例如炎症和色素沉着。

通过静脉内注射10％荧光素钠染料(0.1ml/kg体重)在两只眼睛上进行FFA。在染料注入后10秒至15分钟之间拍摄眼底图像。根据标准系统对FFA图像进行评估和分级：

·1级-无高荧光-无渗漏

·2级-高荧光-无渗漏

·3级-超荧光-后期渗漏

·4级-明亮的高荧光，后期渗漏超出斑点

光学相干断层扫描(OCT)：

在激光治疗前和激光治疗后第14天以及激光治疗后第29天(治疗后2周)在两只眼睛上进行OCT。

安乐死和组织收集：

在第30天处死动物。收集眼睛、血液、眼液和内脏进行进一步分析。

在提议日(第30天)处死动物，并用半强度的Karnovsky固定剂通过主动脉(下行夹紧)灌注上半身。移除眼睛，在半强度的Karnovsky固定剂中固定2至3天，然后保存在福尔马林中直至处理。将包含1个或2个损伤部位的组织条嵌入塑料中。通过每个损伤的中部以30-μm的步长取2μm厚的切片。将切片用甲苯胺蓝染色，并将具有最强损伤的样品指定为纵剖。然后由观察者掩盖治疗条件来评估该部分。

基于3个标准计算每个损伤的组织增殖评分：纺锤状细胞增殖性病变的大小，视网膜下腔中新血管增殖的程度以及脉络膜毛细血管层上方的视网膜升高。每个度量从0到3分级，其中0表示不存在。总的组织增殖分数包括针对每个激光损伤部位的每个所述量度的总和。

结果

我们的研究结果表明，Angio-3肽显著减弱KIMBA小鼠中的视网膜血管生成(图1A-D)。当通过IVT对6周大的Kimba小鼠开始治疗时，Eylea(阳性对照)仅在治疗后有效4周。然而，Angio-3(测试肽)在治疗后长达16周有效(图2A-D)。该数据表明小鼠模型中Angio-3疗效的持续时间较长。激光诱导的小鼠模型研究表明，Angio-3肽经由I/V途径通过单次剂量显著减弱视网膜和脉络膜血管生成直至第10周(图3A-C)。全身途径未影响自然伤口愈合过程，月经周期和行为改变，这表明通过IV途径给予Angio-3是安全的。通过IVT途径，与抗VEGF相比，Angio-3还显著减弱了视网膜和脉络膜的血管生成(图4A-B)。Angio-3还显示通过舌下途径相比抗VEGF显著减弱视网膜和脉络膜血管生成物(图5A-C)。此外，我们的研究表明，Angio-3可能是视网膜和脉络膜血管生成性疾病的潜在长效抗血管生成药物(图3和4)。此外，我们还可以确定具有或不具有Angio-3治疗的视网膜功能。所有组中关注到的视网膜功能均无显著差异。然而，由于正常的衰老过程，第26周的a波和b波响应低于基线(图3D)。在大鼠CNV模型研究中发现了最佳剂量。在5μg剂量下，Angio-3通过IVT途径相比抗VEGF显著减弱了视网膜和脉络膜的血管生成(图6A-B)。

这项NHP初步研究表明，通过IVT可以很好地耐受50μl中2mg剂量的SIPRAD-0276(Angio-3)，并且没有发现炎症迹象。与50μl中2mg的Eylea相比，该剂量显示出相同的功效(图7A-C)。然而，这并不优于Lucentis。与媒介物对照相比，损伤等级的严重程度显著降低(图8)。治疗后病变区域的体积和厚度明显减少(图9)。

基于组织病理学分析(图10)，与药物治疗的眼睛相比，媒介物治疗(对照)切片更厚且血管更多。与药物治疗的眼睛相比，对照切片显示出更多的脉络膜纤维化(红色箭头)、增加的视网膜厚度、更多的脉络膜新血管形成(白色箭头)、多个血管延伸视网膜厚度和视网膜高度的一倍或两倍。在该图中，血管渗漏的程度与激光损伤部位视网膜的形态变化有关。如果在29天的时间点激光光斑严重漏出，则视网膜结构会明显扭曲，如视网膜增厚、大量纤维化和水肿性液泡所显示。与药物治疗的眼睛相比，对照切片更厚且血管更多。

Angio-3肽还可以在体外抑制VEGF诱导的内皮细胞血管通透性(VP)，包括VEGF诱导的人视网膜内皮细胞(HREC)的VP。它还抑制小鼠中的皮肤血管通透性。可以预见，Angio-3还将抑制眼睛中的VP，并且该功能有助于Angio-3抑制Kimba小鼠眼睛中的血管渗漏的功能。

结论

NHP中激光诱导的CNV是RAD药物发现和开发的金标准。该初步研究结果证实，Angio-3显示出与Eylea相似的功效，并且该肽将有益于抗血管生成治疗的非应答者。

该肽可以静脉内或口服或通过IVT应用而施用，以预防或治疗视网膜血管生成性疾病。

动物模型研究结果证实，Angio-3具有长期的抗VEGF作用，因此比市场上现有的药物具有更大的益处。

与用于相同疾病病症的当前药物相比，我们可以以更低的成本产生甚至更高的浓度(将从下一研究中发现可耐受的最高剂量)，因为该肽仅具有10个氨基酸残基。

实施例2.针对比较剂鼠抗VEGF的Angio-3肽对于视网膜血管生成性疾病的功效

动物：

本项研究的目的是评估针对比较剂鼠抗VEGF的Angio-3肽在视网膜血管生成性疾病中的功效。C57BL/6J野生型(WT)小鼠购自InVivos(新加坡)。Kimba转基因小鼠繁殖者购自Lions Eye Institute，Perth，澳大利亚。Brown-Norway大鼠购自Charles&River实验室。在我们的设施中，维持KIMBA小鼠繁殖群，并为本研究繁殖了小鼠。以12小时光照/12小时黑暗周期饲养动物，随意提供食物和水。所有动物的处理和护理均根据新加坡SingHealth机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的指南进行，并根据视觉和眼科研究协会(ARVO)对于动物实验的建议进行。

动物模型

Kimba小鼠(n＝39)是用于视网膜新血管形成的转基因小鼠模型，其通过人血管内皮生长因子(hVEGF)蛋白的光感受器特异性过度表达而产生。视网膜新血管改变包括通透性增加、周细胞和内皮细胞损失、血管曲折、白细胞停滞和毛细血管阻塞、脱落和出血。Kimba小鼠模型特别适用于测试旨在靶向hVEGF的抗血管生成分子。

在C57/BL6J(B6J)野生型小鼠(n＝90)中，激光诱导脉络膜新生血管形成(CNV)。

在Brown-Norway大鼠(n＝30)中，激光诱导脉络膜新生血管形成(CNV)。

治疗方式

Kimba小鼠通过静脉内(IV)途径接受25mg/kg Bwt Angio-3，单次注射100μl体积。

还通过玻璃体内(IVT)途径在Kimba小鼠中注射Angio-3，以1μg剂量单次注射1μl体积。

在B6J小鼠中，通过静脉内(i/v)途径以25mg/kg Bwt浓度单次注射100μl体积的Angio-3，并以预防模式(激光之前)和消退模式(激光后4天)进行测试。

在B6J小鼠中，通过舌下(口服)途径给与3mg/kg Bwt浓度的Angio-3 10μl体积；3mg/kg Bwt浓度的Angio-3乱序重排物10μl体积和0.1mg/kg Bwt浓度的抗VEGF 10ul，并以消退模式(激光后4天后)进行该测试并持续5天(每天单剂量)。

还通过玻璃体内(IVT)途径注射Angio-3，以2种不同剂量单次注射1μl体积；1μg(高剂量)和100ng(低剂量)。

进一步在Brown-Norway大鼠中对其进行评估，以鉴定Angio-3的最佳剂量。大鼠通过IVT途径单次注射3μl体积而接受5μg(高剂量)和1μg(低剂量)Angio-3。

激光诱导的CNV：

将四个激光光凝部位同心地放置在两只眼睛的视盘周围以诱导CNV。使用二极管激光器(810nm)，其针对小鼠的相对效能等级为120mW，针对大鼠的相对效能等级为250mW，曝光时间为0.05s，光斑尺寸为50μm。用晶体盖聚焦激光点以避免激光束分散。气泡的形成证实布鲁赫膜的破裂。

使用MICRON IV眼底照相机(Phoenix Laboratories USA)对眼底照相术和眼底荧光素血管造影术(FFA)成像。对于FFA，以每5-6克体重0.01ml的剂量向动物腹膜内注射10％荧光素钠。

每只动物整个过程花费约10-15分钟。在治疗后第28天(Kimba和IVT小鼠；大鼠组)和第25周(IV小鼠组)结束时，通过过量的戊巴比妥安乐死动物以收集血液和组织。

视网膜电图(ERG)

使动物黑暗适应过夜(12小时)，并且在暗红色光下进行记录的准备。如所述诱导麻醉和瞳孔扩张。将动物轻轻固定在台上，并穿过上背部和下背部安装扣带，以确保ERG记录的稳定，可重现位置。用固定在台顶部的抽水加热垫(TP500 T/Pump；GaymarIndustries，Orchard Park，NY)将体温保持在37℃和38℃之间。用角膜单极电极(Mayo，Aichi，日本)记录ERG(Espion；Diagnosis LLC，Redwood City，CA.)。将金杯电极(Grass-Telefactor，West Warwick，RI)置于嘴中作为参比电极，将银-氯化银电极(Grass-Telefactor，West Warwick，RI)置于尾中以用作接地电极。在暗适应(暗视)条件下，以各种刺激强度范围(3.3至1.0log cd*s/m2，以0.3-log单位增量)进行记录。每种强度下的反应至少是五次试验的平均值。对信号进行1至100Hz的带通滤波，并以1kHz的频率采集。对于每只动物，ERG记录期的持续时间约为30分钟。

同工凝集素染色

使扁平的视网膜在冰冷的70％体积/体积乙醇中渗透20分钟，然后在PBS/1％Triton X-100中渗透30分钟。将视网膜与AlexaFluor 568缀合的Griffoniasimplicifolia同工凝集素B4(5μg/mL；Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR)在1XPBS中于4℃下孵育过夜，以对血管进行染色。然后将视网膜在1X PBS中冲洗3次，每次10分钟，并固定在抗褪色培养基(Prolong Antifade Kit(P7481)；Invitrogen-MolecularProbes)中，并用盖玻片密封。用荧光成像和共聚焦显微镜(Live Cell TIRF系统和A1R共聚焦显微镜；新加坡生物成像中心-尼康成像中心，新加坡)捕获视网膜血管图像。

结果

我们的研究结果表明，Angio-3肽显著减弱了KIMBA小鼠中的视网膜血管生成(图1A-D)。当通过IVT对6周龄的Kimba小鼠开始治疗时，Eylea(阳性对照)仅在治疗后4周有效。然而，Angio-3(测试肽)在治疗后长达16周有效(图2A-D)。该数据表明，Angio-3功效长期存在于小鼠模型中。激光诱导的小鼠模型研究表明，Angio-3肽可经由I/V途径通过单次给药显著减弱视网膜和脉络膜血管生成直至第10周(图3A-C)。全身途径未影响自然伤口愈合过程、月经周期和行为改变，这表明通过IV途径给予Angio-3是安全的。通过IVT途径，与抗VEGF相比，Angio-3还显著减弱了视网膜和脉络膜的血管生成(图4A-B)。Angio-3还显示通过舌下途径相比抗VEGF显著减弱视网膜和脉络膜血管生成物(图5A-C)。此外，我们的研究表明，Angio-3可能是视网膜和脉络膜血管生成疾病的潜在长效抗血管生成药物(图2和图3)。

该肽可以静脉内或通过IVT应用而施用，以预防或治疗视网膜血管生成性疾病。我们的动物模型研究结果证实，Angio-3是一种长效抗VEGF，与目前市场上的药物相比具有潜在的益处。

实施例3.修饰的Angio-3肽对视网膜血管生成性疾病的功效

在B6J小鼠中，进行了100ng，1μg，5μg PEP-Q，PEP-N(经修饰的Angio-3)，Angio-3和Eylea的单次玻璃体(IVT)注射，并以预防模式(激光之前)对其进行测试。激光诱导的CNV模型和注射的方法如上所述。

研究结果表明，化学修饰的angio-3肽：PEP-N和PEP-Q肽通过100ng，1μg和5μg剂量下的单次玻璃体内注射显著减弱了激光诱导的CNV小鼠中的脉络膜血管生成(图11A-B)。原始Angio-3(100ng和1μg)和相同剂量(100ng，1μg和5μg)下的阳性对照

也显示出与PEP-Q和PEP-N相似的优越功效(图11；表2)。PEP-Q和PEP-N可能是视网膜和脉络膜血管生成性疾病的潜在长效抗血管生成药物。

表2.PEP-N，PEP-Q，Angio-3和

对于渗漏面积的汇总

这两种Angio-3肽，PEP-Q和PEP-N，可以玻璃体内注射的形式施用，用于预防或治疗视网膜血管生成性疾病。动物模型研究结果证实，化学修饰的Angio-3肽PEP-Q和PEP-N是新颖的，并且比市场上现有的药物具有潜在更大的益处。

实施例4.Angio-3的机理研究

Angio-3对VEGF诱导的HRMEC细胞增殖的影响

将2000个HRMEC细胞接种在100μl培养基中的96孔板中，并置于37℃的CO₂培养箱中。为了评估化合物对VEGF诱导的HRMEC增殖的影响，在添加0.5％FBS的EBM-2中血清饥饿过夜后，在不同浓度的Angio-3的存在下，用10ng/ml VEGF₁₆₅或50ng/ml VEGF₁₆₅处理细胞。300μg/ml阿瓦斯汀用作阳性对照。治疗3天后进行Alamar-Blue测定。

在存在或不存在VEGF₁₆₅的情况下，将HRMEC细胞与不同浓度的化合物一起孵育3天。结果显示，10ng/ml和50ng/ml的VEGF₁₆₅诱导HRMEC增殖。300μg/ml阿瓦斯汀足以抑制VEGF诱导的增殖。然而，Angio-3在所有三种测试浓度下均未显示对VEGF诱导的增殖的影响(图12A和B)。

Angio-3对HRMEC细胞迁移的影响

在含有8.0μm孔径插入物的24孔细胞培养板中进行Transwell迁移测定。在测定前将HRMEC细胞血清饥饿过夜。下室充满EBM-2，补充有50ng/ml VEGF₁₆₅和不同浓度的抑制剂的EBM-2。将EBM-2中的1x10⁵个细胞接种到上室中。使细胞在37℃下迁移到膜的另一侧过夜。擦去膜顶部的细胞，固定迁移到另一侧的细胞，并用0.4％的结晶紫染色。对于随机选择的5个区域，在10倍物镜下对细胞数进行计数。

结果显示，VEGF₁₆₅强烈诱导HRMEC细胞迁移。VEGF刺激的迁移被300μg/ml阿瓦斯汀300μg/ml完全阻断。300μg/ml和600μg/ml Angio-3对VEGF诱导的迁移也显示出中等抑制作用(图13A-B)。

Angio-3对HRMEC管形成的影响

将冷的50μl基质胶GFR(BD Biosciences)加入96孔板中，并将板在37℃下孵育1小时以允许凝胶形成。然后将EBM-2，补充有50ng/ml VEGF₁₆₅并具有或不具有不同浓度的Angio-3的EBM-2中的HRMEC(1x 10⁵/孔)涂在基质胶上，将300μg/ml阿瓦斯汀用作阳性对照。过夜温育后，使用倒置相差显微镜拍摄细胞的网络生长区域的5个随机选择的区域。使用Image J血管生成分析仪对管网络进行定量。

检查Angio-3对VEGF诱导的HRMEC细胞管形成的影响，并根据总管长、连接数和环数进行量化。图14显示VEGF诱导的内皮细胞管形成网络被所有测试药物强烈抑制。

图15A和15B显示在VEGF和bFGF存在下，Angio-3诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡。图15A显示在20ng/ml VEGF存在下，Angio-3以剂量依赖性方式诱导HUVEC凋亡。图15B显示在20ng/ml bFGF存在下，Angio-3以剂量依赖性方式诱导HUVEC凋亡。*表示p<0.05，n＝3。

图16A和16B显示Angio-3抑制了由VEGF和bFGF刺激的HUVEC增殖。图16A显示Angio-3以剂量依赖性方式抑制由20ng/ml VEGF诱导的HUVEC增殖。图16B显示Angio-3以剂量依赖性方式抑制由20ng/ml bFGF诱导的HUVEC增殖。*表示p<0.05，n＝3。

图17A-D显示Angio-3抑制VEGF和bFGF诱导的EC迁移并抑制毛细血管网络形成。图17A和22C显示Angio-3以剂量依赖性方式抑制由20ng/ml VEGF诱导的HUVEC趋化迁移。将迁移的细胞用Hoechst染色，成像并计数。图17B和22D显示Angio-3以剂量依赖性方式抑制由20ng/ml bFGF诱导的HUVEC趋化迁移。将迁移的细胞用Hoechst染色，成像并计数。

图18显示Angio-3抑制基质胶上HUVEC毛细血管网络的形成。将HUVEC与递增剂量的Angio-3预孵育30分钟，然后接种到基质胶上，并在完全EC生长培养基下培养。温育6小时后对HUVEC管的形成进行成像。HUVEC管覆盖的面积百分比量化为管形成的水平。n＝3；*表示相比于对照的显著降低，单向ANOVA P<0.05。

图19A、19B和19C显示Angio-3是新型的抗渗剂，可以抑制VEGF诱导的多种内皮细胞类型的血管通透性(VP)。在图19A中，用增加浓度的Angio-3或单独的培养基处理融合后的HUVEC单层。结果表明，Angio-3以剂量依赖性方式抑制融合的HUVEC间VEGF诱导的通透性，而未影响基础水平的通透性。在这些实验中，在用100ng/ml VEGF刺激之前，用Angio-3预处理融合后的HUVEC单层30分钟。在图19B中，用增加浓度的Angio-3或单独的培养基处理融合后的HMVEC单层。结果表明，Angio-3以剂量依赖性方式抑制VEGF诱导的融合人类真皮微血管内皮细胞(HMVEC)的通透性，而未影响基础水平的通透性。在图19C中，用Angio-3和VEGF处理融合后的HREC单层3小时。结果表明，Angio-3以剂量依赖性方式抑制VEGF诱导的融合人类视网膜内皮细胞(HREC)间的通透性，而未影响基础水平的通透性。*表示p<0.05，n＝3。

图20A和20B显示Angio-3抑制小鼠中局部VEGF诱导的皮肤血管通透性。在图20A中，通过皮内注射向小鼠施用Angio-3，结果表明Angio-3在15分钟内以剂量依赖性方式抑制VEGF诱导的皮肤通透性。皮肤渗透性通过伊文思蓝染料外渗而可视化。在图20B中，通过染料的甲酰胺提取并测量OD 610来定量染料外渗。每组n＝5只动物，*表示与同时对照相比显著增加，p<0.05。

图21显示Angio-3阻止VEGF诱导的血管内皮(“VE”)-钙粘蛋白自HUVEC上的粘着连接(AJ)解离。用100ng/ml VEGF刺激融合的HUVEC，以诱导VE-钙粘蛋白自AJ解离。在VEGF刺激之前，用100μM Angio-3预处理融合的HUVEC单层。VE-钙粘蛋白经抗体染色，且DAPI用于对细胞核进行染色。Angio-3可能干扰VEGF诱导VE-钙粘蛋白自AJ解离的能力。

图22显示在HUVEC中，Angio-3抑制VEGF诱导的紧密连接(TJ)蛋白ZO-1和ZO-2自TJ的解离。如上所述处理HUVEC细胞，并用ZO-1抗体或ZO-2抗体染色，并用DAPI复染以显示细胞核。结果表明，VEGF诱导TJ蛋白ZO-1和ZO-2自融合的HUVEC单层的TJ中解离。Angio-3预处理(100μM)可以抑制这种VEGF功能。

图23显示Angio-3抑制HUVEC中VEGF诱导的肌动蛋白应力纤维形成。然而，在缺乏VEGF的情况下，Angio-3促进皮质肌动蛋白纤维形成。

实施例4.过表达hVEGF的KIMBA小鼠中的视网膜功能测试

将过表达hVEGF的八周龄KIMBA小鼠黑暗适应过夜(至少12小时)，并且所有程序在暗红色光下进行。用氯胺酮(20mg/kg体重)和甲苯噻嗪(2mg/kg体重)的组合麻醉小鼠。通过局部施用1％托吡卡胺(Alcon Laboratories，Inc.，Fort Worth，TX，USA)和2.5％苯肾上腺素(Bausch and Lomb Pharmaceuticals，Inc.，Tampa，FL，USA)眼用溶液扩张瞳孔。

将动物置于具有体温控制器的ERG记录台中以进行ERG记录。用角膜单极电极记录视网膜电图(Espion；Diagnosys LLC，Lowell，MA，USA)。将金杯电极放在嘴中作为参比电极，将银-氯化银电极(Grass-Telefactor，West Warwick，RI，USA)放在尾中作为接地电极。在暗适应(暗视)条件下，在宽范围的刺激强度(-3.0至1.0log cd.s/m2)下进行记录。每次闪光强度的反应为至少五次试验的平均值。对信号进行1至100Hz的带通滤波，并在1kHz下采集。

在未治疗组(未处理组)中记录8周龄至24周龄小鼠的ERG。在Angio-3 IVT治疗组中，在8周龄时记录ERG作为基线(BL)，然后在治疗后6周和12周记录。在第一次治疗后12周时进行第二次IVT，然后在治疗后进行8周。学生t检验用于比较两组之间的数据；P<0.05被认为是显著的。结果显示在图24中。未治疗小鼠在12周龄后对a波和b波均无反应。Angio-3在治疗后6周增加了a波和b波反应，然后在第二次给药后再次增加了反应20周。该结果表明Angio-3正拯救KIMBA小鼠中的视网膜功能。

实施例5.在作为湿性AMD的实验模型的食蟹猴中开发的激光诱导的脉络膜新生血 管形成(CNV)模型中测试Angio-3

在食蟹猴中建立并确认激光诱导的脉络膜新生血管形成(CNV)模型作为湿性AMD的实验模型。目的是区分测试肽与Eylea(临床化合物)的功效和剂量反应。在本研究中使用5组5只雄性食蟹猴。3组分别IVT给药2mg Angio-3；肽Q(SEQ ID NO:4)和

(剂量体积50μL)。1组的5只猴接受4mg的肽Q。1组作为无任何药物治疗的激光对照。在应用激光后第14天，通过单次IVT注射药物注射两只眼睛。通过荧光素血管造影术评估活性CNV的进展，在第14天测量基线新生血管形成和渗漏程度，并在第28天进行最终的荧光素血管造影术评估。通过ImageJ软件量化渗漏面积。通过Spectralis-Heidelberg软件使用SD-OCT图像定量激光体积。结果显示在图25A-F中。

在该干预研究中，对于激光对照，未观察到病变严重程度的变化，并且与对照相比，所有药物治疗组的病变严重程度和激光面积的变化均显著不同(方差分析[ANOVA]，随后是Tukey多重比较，与对照相比，@＝p<0.05)。与测试肽相比，Eylea显示出优越的功效。然而，肽Q显示出剂量依赖性功效和接近Eylea的较高剂量功效。

实施例6.碱烧伤后Angio-3肽的作用

用80mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪的组合麻醉小鼠。将一滴1％赛罗卡因施用至角膜表面以进行局部镇痛。将直径约2mm的圆形滤纸浸入1M NaOH溶液中。用无菌镊子挑取一块浸有NaOH的滤纸。将浸有NaOH的滤纸在显微镜下放置在角膜中央，以确保正确放置滤纸。将其放置30秒钟以产生面积约2x 2mm²的急性碱烧伤。除去滤纸，然后用10ml的1x PBS温和冲洗眼睛两次，以洗去残留的1M NaOH。只有一只老鼠的眼睛受伤，另一只作为对照。将一滴1x肽Q(1％溶液作为测试化合物)或由PBS组成的媒介物对照局部施用至角膜。每天3次重复施用，持续7天。最终，如下所述进行临床评估，并摘除眼睛用于角膜平片。

在手术显微镜下以盲法对小鼠进行每日检查，并且基于角膜混浊度、NV和血管大小对角膜新血管形成(NV)进行评分。两名观察员进行评分，并记录最终得分，其为两者的平均值。评分角膜混浊度的等级为0-4。0＝完全清晰；1＝略微模糊，虹膜和瞳孔容易看见；2＝略微不透明，虹膜和瞳孔仍可检测；3＝不透明，几乎无法检测到瞳孔；以及4＝完全不透明，看不到瞳孔。评分NV的等级为0-3。0＝无新血管；1＝角膜缘的新血管；2＝跨角膜缘并接近角膜中心的新血管；3＝跨角膜中心的新血管。评分血管大小为的等级为0-3。0＝无新血管；1＝在手术显微镜下可检测到新血管；2＝在手术显微镜下容易看到新血管；3＝在没有显微镜的情况下容易看到新血管。使用手术显微镜照相机和裂隙灯生物显微镜捕获图像。结果显示在图26和27中。与媒介物对照眼睛相比，肽Q处理的眼睛具有显著减少的角膜NV面积。

实施例7.小鼠模型中的伤口愈合

使用两(2)-mm环锯标记伤口大小。通过使用镊子剥离去除上皮、基底膜和一些基质层。从第0天至第5天对角膜的受伤区域进行荧光素染色(n＝6只小鼠/组，来自2个独立实验)。当伤害和处理小鼠角膜时，采用柔和细致的方法，将荧光素稀释，在染色后数秒钟内必须拍摄裂隙灯图像。通过ImageJ软件定量伤口面积。学生t检验用于比较两组之间的数据；P<0.05被认为是显著的。结果显示在图28A和28B中。Angio-3对正常伤口愈合过程没有不利影响。

应当理解，本文描述的实施例和实施方式仅用于说明目的，并且鉴于其的各种修改或改变将由本领域技术人员所建议，并且将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请出于所有目的而通过引用整体并入本文。

Claims (24)

1.一种治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病的方法，其包括：

向所述受试者施用药物有效量的组合物，所述组合物包含具有序列Thr Pro His ThrHis Asn Arg Thr Pro Glu(SEQ ID NO:1)的肽，

其中所述组合物经口服、通过静脉内注射或通过玻璃体内注射施用于所述受试者，且其中施用治疗所述受试者中的所述视网膜血管生成性疾病。

2.权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含2至50mg/kg体重(Bwt)的所述肽，并且通过静脉内注射施用。

3.权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含0.1μg/kg至2mg/kg体重的所述肽，并且通过玻璃体内注射施用。

4.权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含2至10mg/kg体重的所述肽，并且经口服施用。

5.权利要求1所述的方法，其中所述组合物至少每4至10周一次通过静脉内(IV)或玻璃体内(IVT)途径施用。

6.权利要求1所述的方法，其中至少每天一次口服施用所述组合物1至2周，间隔为6个月。

7.权利要求1所述的方法，其中受试者对抗VEGF疗法无反应。

8.权利要求2所述的方法，其中所述抗VEGF疗法是抗VEGF抗体。

9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述受试者患有年龄相关性黄斑变性、视网膜病变或血管闭塞。

10.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述受试者患有糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿，视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞或角膜新血管形成。

11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

12.一种治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病的方法，其包括：

(a)选择患有对抗VEGF疗法无反应的视网膜血管生成性疾病的受试者；以及

(b)向所述受试者施用包含具有序列SEQ ID NO:1的肽的组合物，其中施用治疗所述受试者中的视网膜血管生成性疾病。

13.权利要求12所述的方法，其中所述组合物经配制用于静脉内施用。

14.权利要求12所述的方法，其中所述组合物经配制成用于玻璃体内注射。

15.权利要求12所述的方法，其中所述组合物经配制用于口服施用。

16.权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述受试者患有年龄相关性黄斑变性、视网膜病变或血管闭塞。

17.权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述受试者患有糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞或角膜新血管形成。

18.权利要求12-17中任一项所述的方法，其中所述受试者对抗血管生成疗法无反应。

19.权利要求18所述的方法，其中所述抗血管生成疗法是抗VEGF疗法。

20.权利要求19中任一项所述的方法，其中所述抗VEGF疗法是抗VEGF抗体。

21.权利要求12-20中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

22.一种治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病的方法，其包括：

向所述受试者施用药物有效量的组合物，所述组合物包含具有序列Thr Pro His ThrHis Asn Xaa Thr Pro Glu(SEQ ID NO:3)的肽N，其中Xaa是高精氨酸，

其中所述组合物经口服、通过静脉内注射或通过玻璃体内注射施用于所述受试者，且其中施用治疗所述受试者中的所述视网膜血管生成性疾病。

23.一种治疗受试者中的视网膜血管生成性疾病的方法，其包括：

向所述受试者施用药物有效量的组合物，所述组合物包含具有序列Thr Pro His ThrHis Gln Xaa Thr Pro Glu(SEQ ID NO:4)的肽Q，其中Xaa是高精氨酸，

其中所述组合物经口服、通过静脉内注射或通过玻璃体内注射施用于所述受试者，且其中施用治疗所述受试者中的所述视网膜血管生成性疾病。

24.一种制造上述权利要求中任一项的组合物的方法，其中所述肽通过固相Fmoc化学合成。

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