BR112020015074A2 - Métodos e composições para tratamento de transtornos angiogênicos com uso de agentes anti-vegf - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a métodos e composições para o tratamento de distúrbios angiogênicos com uso de agentes anti-vegf. os agentes anti-vegf compreendem domínios de ligação do vegf e têm a capacidade de ligação vítrea. são fornecidas modalidades exemplificativas de proteínas de fusão fc-igg com domínios de ligação do vegf com fortes características de ligação à heparina, forte inibição da atividade mitogênica do vegf e farmacocinética aprimorada, ou seja, meias-vidas mais longas dos agentes anti-vegf e, consequentemente, dosagens menos frequentes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “MÉTODOS E

COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS ANGIOGÊNICOS COM USO DE AGENTES ANTI-VEGE” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório nº US 62/622.382, depositado em 26 de janeiro de 2018, cujo pedido é incorporado ao presente documento a título de referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada eletronicamente no formato ASCII e é incorporada ao presente documento a título de referência na sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 25 de janeiro de 2019, é denominada 24978-0470 SL.txt e tem 50.960 bytes de tamanho.

ANTECEDENTES

[003] O desenvolvimento de um suprimento neovascular ou angiogênese desempenha papéis homeostáticos cruciais, uma vez que os vasos sanguíneos transportam nutrientes para tecidos e órgãos e removem produtos catabólicos *. No entanto, o crescimento descontrolado dos vasos sanguíneos pode promover ou facilitar vários processos de doenças, incluindo tumores e distúrbios vasculares intraoculares *'. Embora vários fatores angiogênicos tenham sido inicialmente identificados e caracterizados (por exemplo, EGF, TGF-a, TGF-B, aFGF, bFGF, angiogenina) ?, o trabalho realizado nas últimas três décadas estabeleceu o papel crítico do VEGF-A (VEGF doravante) na angiogênese normal e patológica ? º. O VEGF é um membro de uma família de genes que também inclui PIGF, VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D. Foi relatado que três receptores tirosina quinase (RTKs) se ligam a ligantes de VEGF: VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR- 3 ”. O PIGF e o VEGF-B interagem seletivamente com o VEGFR-1, o VEGF liga o VEGFR-1 e o VEGFR-2. Um terceiro membro dessa família de RTKs, VEGFR-3 “º, liga VEGF-C e VEGF-D, que estão implicados na linfangiogênese. Cada membro dessa classe RTK tem sete domínios semelhantes a imunoglobulina (Ig) na porção extracelular /. Há um acordo de que o VEGFR-2 é o principal receptor de sinalização do VEGF *. No entanto, o VEGFR-1 se liga ao VEGF com afinidade de ligação substancialmente mais alta que o VEGFR-2 '.

[004] Os inibidores do VEGF se tornaram um padrão de terapia em múltiplos tumores e revolucionaram o tratamento de distúrbios neovasculares intraoculares, como a forma neovascular de degeneração macular relacionada à idade

(DMRI), retinopatia diabética proliferativa e oclusão da veia retiniana, que são as principais causas de perda de visão severa e cegueira legalº “. Atualmente, três fármacos anti- VEGF são amplamente utilizados nos EUA para indicações oftalmológicas: bevacizumabe, ranibizumabe e aflibercept *. O bevacizumabe é um anticorpo IgG completo direcionado ao VEGF º. Embora o bevacizumabe não tenha sido desenvolvido para indicações oftalmológicas, ele é amplamente utilizado off label devido ao seu baixo custo. Ranibizumabe é um anti-VEGF maturado por afinidade !º. Aflibercept é uma proteína de fusão IgG-Fc *' !?, com elementos de VEGFR-l e VEGFR-2, que liga VEGF, PIGF e VEGF-B !?. Conbercept é um receptor VEGF solúvel estruturalmente relacionado ao aflibercept, amplamente utilizado como tratamento de neovascularização intraocular na China". Milhões de pacientes em todo o mundo foram tratados com esses fármacos. É importante ressaltar que, após cinco anos de tratamento com ranibizumabe ou bevacizumabe, cerca de metade dos pacientes com DMRI neovascular tiveram boa visão, ou seja, acuidade visual 20/40 ou melhor, um resultado que estaria fora de alcance antes da disponibilidade dos agentes anti-VEGF *º.

[005] No entanto, em contextos clínicos da vida real,

muitos pacientes recebem menos injeções de anti-VEGF do que em ensaios clínicos e foi levantada a hipótese de que isso pode estar relacionado a maus resultados visuais '!º*. De fato, a necessidade de realizar injeções intravítreas relativamente frequentes prejudicou a adesão do paciente e, finalmente, os benefícios da terapia, especialmente em alguns países '“. Portanto, é necessário desenvolver agentes com maior duração quando injetados no olho, reduzindo, assim, a frequência das injeções, e várias abordagens para esse fim foram tentadas !" 1º. O aflibercept (EYLEA) foi aprovado com base em ensaios clínicos que mostram que uma administração a cada 8 semanas da dose de 2 mg pode corresponder à eficácia do ranibizumabe mensal (0,5 mg). No entanto, apesar da previsão de que uma mudança para o aflibercept reduziria o número de injeções intravítreas, estudos recentes sugerem que não é o caso *º. Portanto, ainda há uma necessidade médica não atendida de agentes anti-VEGF intravítreos com meia-vida melhorada.

[006] Em 1996, Davis-Smyth et al. ?º (consultar também Patente nº US 5.952.199) relatou que o domínio (D) 2 de VEGFR-1 é o elemento de ligação crítica para VEGF e PIGF. A eliminação de D2 aboliu completamente a ligação. A substituição de D2 do VEGFR-3 pelo VEGFR-l1 D2 conferiu ao

VEGFR-3 a especificidade de ligando do VEGFR-1ºº. Trabalhos subsequentes documentaram a interação entre D2 e VEGF (ou PIGF) por cristalografia de raios-X 2º ??,

[007] Os estudos iniciais levaram ao projeto de um construto com características completas de ligação de VEGF, compreendendo os três primeiros Ds semelhantes ao Ig do VEGFR-1, fundidos a um Fc-lgG (Flt-1-3-IgG) ºº. Flt-1-3-1gG mostrou uma capacidade potente de neutralizar VEGF, in vitro e in vivo ?º?. No entanto, a meia-vida sistêmica dessa molécula foi prejudicada pela presença de D3, que tem afinidade significativa com heparina devido à presença de aglomerados de resíduos básicos, resultando na ligação a HSPGs em vários tecidos. Em 2002, Holash et al *?º (Patente nº Us 7.070.959) descreveu um construto de fusão IgG compreendendo VEGFR-l1 D2 (o elemento de ligação) e D3 de VEGFR2, que tem uma afinidade com heparina muito mais fraca em comparação com VEGFR-1 D3. Foi relatado que essa molécula, conhecida hoje como aflibercept (comercializada como EYLEA), tem uma meia-vida mais longa em comparação com Flt-(1-3-1gG) após administração sistêmica!?, claramente uma vantagem para o tratamento que visa, por exemplo, indicações oncológicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção fornece composições e métodos para inibir a angiogênese e para tratar afecções associadas ao VEGF, como doença ocular, incluindo, entre outros, degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética proliferativa, oclusão da veia da retina, neovascularização de coroide secundária à miopia, retinopatia de prematuridade, edema macular diabético, vasculopatia polipoidal da coroide, compreendendo a administração de um agente anti-VEGF que inibe a atividade do VEGF e, ao mesmo tempo, tem fortes características de ligação à heparina, proporcionando farmacocinética superior, a saber, tendo meia- vida mais longa do agente terapêutico após administração intravítrea.

[009] Nas modalidades, a presente invenção fornece composições e métodos de tratamento de afecções nas quais a administração direta local de um agente anti-VEGF é benéfica, por exemplo, tratamento e prevenção de afecções proliferativas de células endoteliais ou angiogênese, por exemplo, no tratamento de tumores sólidos, como, porém sem limitação, administração intracraniana em glioblastomas.

[0010] Nas modalidades, a presente invenção fornece um agente anti-VEGF, em que o agente anti-VEGF é um construto

Fc-IgG que funde domínios com características de ligação a VEGF e domínios que se ligam a proteoglicanos de heparina. Nas modalidades, a presente invenção fornece um agente anti- VEGF, em que o agente anti-VEGF é um construto de Fc-IgG com capacidade de se ligar à heparina e contém um ou mais domínios com características de ligação a VEGF. Nas modalidades, a presente invenção fornece um agente anti-VEGF, em que o agente anti-VEGF é uma proteína de fusão com eficácia melhorada para ligação a VEGF e heparina. Nas modalidades, a presente invenção fornece um agente anti-VEGF, em que o agente anti-VEGF é uma proteína de fusão com níveis muito baixos de endotoxina.

[0011] Nas modalidades, a presente invenção fornece um agente anti-VEGF, em que o agente anti-VEGF é uma proteína quimérica IgG compreendendo elementos de receptores de VEGF. Nas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína quimérica IgG, em que a proteína quimérica IgG compreende um ou mais fragmentos dos sete domínios semelhantes a imunoglobulina (Ig) na porção extracelular dos receptores de tirosina quinase de VEGF. Nas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína quimérica IgG, em que a proteína quimérica IgG compreende um ou mais fragmentos de domínio extracelular de VEGFR-l fundidos com Fc-IgG. Nas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína quimérica IgG compreendendo pelo menos um domínio de VEGFR-1 2 do domínio de ligação do VEGF e pelo menos um domínio de VEGFR-1 adicional 1 ou 3, e não incluindo o domínio 4. Nas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína quimérica IgG, em que a proteína quimérica IgG compreende um ou mais fragmentos de domínio extracelular de VEGFR-2 fundidos com Fc-IgG. Nas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína quimérica IgG, em que a proteína quimérica IgG compreende um ou mais fragmentos de domínio extracelular de VEGFR-1 e VEGFR-2 fundidos com Fc-IgG.

[0012] Nas modalidades, a presente invenção fornece um agente anti-VEGF compreendendo uma porção de ligação a VEGF ligada operacionalmente a um Fc-IgG, em que a porção de ligação a VEGF compreende pelo menos um domínio de ligação a VEGF que é um domínio semelhante a IgG 2 de VEGFR-1, e em que o agente anti-VEGF tem uma capacidade de inibição da mitogênese estimulada por VEGF maior que o aflibercept. Nas modalidades, a presente invenção fornece o agente anti-VEGF que tem uma capacidade de ligação vítrea maior que oO aflibercept. Nas modalidades, a presente invenção fornece o agente anti-VEGF que tem uma capacidade de inibição da proliferação de células endoteliais estimulada por VEGF de ligação vítrea maior que o aflibercept. Nas modalidades, a presente invenção fornece o agente que tem uma meia-vida aumentada in vivo em comparação com o aflibercept.

[0013] Nas modalidades, a presente invenção fornece a porção de ligação do VEGF que consiste essencialmente nos domínios 1, 2 e 3 semelhantes a IgG do VEGFR-1 (V1-2-3). Nas modalidades, o agente anti-VEGF compreende a sequência de aminoácidos conforme definido na SEQ ID No: 1.

[0014] Nas modalidades, a presente invenção fornece a porção de ligação a VEGF que consiste essencialmente nos domínios 2 e 3 semelhantes a IgG do VEGFR-1 (V2-3). Nas modalidades, o agente anti-VEGF compreende a sequência de aminoácidos conforme definido na SEQ ID No: 3.

[0015] Nas modalidades, a presente invenção fornece a porção de ligação do VEGF que consiste essencialmente em domínios 1, 2, 3 e 3 semelhantes a IgG do VEGFR-1 (Vi-2-3-3). Nas modalidades, o agente anti-VEGF compreende a sequência de aminoácidos conforme definido na SEQ ID No: 5.

[0016] Nas modalidades, a presente invenção fornece a porção de ligação do VEGF que consiste essencialmente nos domínios 2, 3 e 3 semelhantes a IgG do VEGFR-1 (V2>-3-3). Nas modalidades, o agente anti-VEGF compreende a sequência de aminoácidos conforme definido na SEQ ID No: 7.

[0017] Nas modalidades, a presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-VEGEF como reivindicações definidas e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Nas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratamento de um distúrbio relacionado ao VEGF em um sujeito em necessidade compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-VEGF conforme definido. O agente anti-VEGF pode ser injetado diretamente no tecido ou órgão afetado, como um olho.

[0018] Nas modalidades, a presente invenção fornece um método para o tratamento de doenças oculares, em que um agente anti-VEGF é administrado localmente no olho em uma dosagem correspondente a uma razão molar de 2:1 em comparação com o VEGF. Nas modalidades, a presente invenção fornece um método para o tratamento de doenças oculares, em que um agente anti-VEGF é administrado por injeção intravítrea. Nas modalidades, a presente invenção fornece um método para o tratamento de doenças oculares, em que um agente anti-VEGF é administrado a cada 4 a 6 semanas e, em outras modalidades, o tratamento é continuado por um período de pelo menos um ano.

[0019] De acordo com uma modalidade, a presente invenção fornece um método para o tratamento de doenças oculares compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-VEGF localmente no olho, em que o tratamento é eficaz para tratar formas oculares, minimamente clássicas e predominantemente clássicas de degeneração macular úmida, em que o agente é uma proteína de fusão.

[0020] Nas modalidades, a invenção pode ser usada para tratar uma ampla variedade de distúrbios relacionados ao VEGF, incluindo degeneração macular relacionada à idade neovascular, neovascularização de coroide secundária à miopia, retinopatia diabética proliferativa, edema macular diabético, obstrução vascular da retina, como oclusão da veia da retina, tumores oculares, síndrome de von Hippel Lindau, retinopatia da prematuridade, Vvasculopatia polipoidal da coroide, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer do colo do útero, câncer do endométrio, câncer de ovário, câncer de rim, schwannomas, gliomas, ependimomas e distúrbios neoplásicos ou não neoplásicos que se beneficiam de terapia de anti-VEGF.

[0021] De acordo com outro aspecto, a presente invenção fornece uma formulação farmacêutica compreendendo um agente anti-VEGF em uma formulação carreadora farmaceuticamente aceitável para administração local, como no olho.

[0022] Nas modalidades, a presente invenção descreve novos construtos, em que os construtos neutralizam potentemente a atividade do VEGF enquanto, ao mesmo tempo, apresentam fortes características de ligação à heparina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023] Uma —melhor compreensão dos recursos e das vantagens da presente divulgação será obtida com referência à seguinte descrição detalhada que apresenta modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da divulgação são utilizados, e aos desenhos anexos, dos quais:

[0024] À FIGURA 1 representa uma representação esquemática de proteínas de fusão construídas exemplificativas com vários domínios extracelulares semelhantes a Ig de VEGFR-1 (V) fundidos a Fc-IgG (Fc). os seguintes construtos são mostrados: V1i-2-3-Fc; V2z-3-Fc; Vi-2-3-37 Fc; Va-3-37FC; Vi-a-3-arEC; Vo-a-arEFC; Vi-a-arFC e Vo-arFC.

[0025] À FIGURA 2 representa uma estratégia de construção e expressão de plasmídeo.

[0026] A FIGURA 3 representa a sequência de aminoácidos e a sequência de ácidos nucleicos da construção V1-2-3. SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 2, respectivamente.

[0027] A FIGURA 4 representa a sequência de aminoácidos e a sequência de ácidos nucleicos da construção V2-3. SEQ ID No: 3 e SEQ ID No: 4, respectivamente.

[0028] A FIGURA 5 representa a sequência de aminoácidos e a sequência de ácidos nucleicos da construção Vi-2-3-3. SEQ ID No: 5 e SEQ ID No: 6, respectivamente.

[0029] A FIGURA 6 representa a sequência de aminoácidos e a sequência de ácidos nucleicos da construção V2-3-3. “SEQ ID No: 7 e SEQ ID No: 8, respectivamente.

[0030] A FIGURA 7 representa a sequência de aminoácidos e a sequência de ácidos nucleicos da construção V1-2-3-3-4. SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10, respectivamente.

[0031] A FIGURA 8 representa a sequência de aminoácidos e a sequência de ácidos nucleicos da construção V2-3-4. "SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 12, respectivamente.

[0032] A FIGURA 9 representa a sequência de aminoácidos e a sequência de ácidos nucleicos da construção Vo-a. SEQ ID

No: 13 e SEQ ID No: 14, respectivamente.

[0033] A FIGURA 10 representa a expressão de construções de VEGFR-1 em 293 células.

[0034] A FIGURA 11 representa géis PAGE corados com prata sob condições redutoras e não redutoras de 200 ng de cada proteína de fusão VEGFR-1 Fc em comparação com EYLEA.

[0035] A FIGURA 12 representa os efeitos inibitórios das proteínas quiméricas do receptor de VEGF na proliferação de células endoteliais estimuladas por VEGF.

[0036] A FIGURA 13 representa a competição de VEGF por VEGF biotinilado (a 100 ng/ml) que se liga ao receptor solúvel em VEGFRI1.

[0037] A FIGURA 14 representa a ligação do receptor solúvel em VEGFR-1 ao VEGF biotinilado e ao vítreo bovino.

[0038] A FIGURA 15 representa Vi1-2-3-3 ligado a vítreo bovino que é biologicamente ativo.

[0039] A FIGURA 16 mostra os efeitos de IgG de controle, EYLEA ou proteínas de fusão Fc de VEGFR-l na área de neovascularização de coroide (CNV) . Cada proteína foi injetada por via intravítrea no camundongo na dose de 2,5 mg um dia antes do tratamento com laser. O EYLEA foi testado também em 25 mg. Asteriscos denotam diferenças significativas

(teste t de Student) em comparação com os grupos controle IgG apropriados (**p <0,01, *p <0,05).

[0040] As FIGURAS 17A e 17B mostram efeitos de EYLEA, V1,2,3,3 OU IgG de controle na área de CNV após uma única administração intravítrea (2,5 mg), 1 dia, 7 dias ou 14 dias antes do tratamento com laser. O Asterisk denota diferenças significativas (p <0,05, teste t de Student) em comparação ao grupo controle de IgG. A Figura 17B mostra imagens representativas de imunofluorescência CD3l dos grupos na FIGURA 17A.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0041] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento a título de referência na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

[0042] Entende-se que aspectos e modalidades da invenção descritos neste documento incluem aspectos e modalidades "que consistem" e/ou "que consistem essencialmente em". Outros objetos, vantagens e características da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir do seguinte relatório descritivo tomado em conjunto com as figuras anexas.

[0043] Ao introduzir elementos da presente invenção ou sua modalidade (ou modalidades) preferencial, os artigos “um(a)”, “o(a)" e “dito(a)" são destinados a significar que há um ou mais dos elementos. Os termos "que compreende", "que inclui" e "que tem" são destinados a ser inclusivos e significar que pode haver outros elementos além dos elementos listados.

[0044] Conforme usado neste documento, os termos "compreende", "que compreende", "inclui", "que inclui", "tem", "que tem", "contém", "que contém", "caracterizado por" ou qualquer outra variação dos mesmos são destinados a abranger uma inclusão não exclusiva, sujeita a qualquer limitação explicitamente indicada em contrário, dos componentes recitados. Por exemplo, uma proteína de fusão, uma composição farmacêutica e/ou um método que "compreende" uma lista de elementos (por exemplo, componentes, recursos ou etapas) não são necessariamente limitados apenas a esses elementos (ou componentes ou etapas), mas podem incluir outros elementos (ou componentes ou etapas) não expressamente listados ou inerentes à proteína de fusão, à composição farmacêutica e/ou ao método.

[0045] Conforme usado neste documento, as frases de transição "consistem em" e "que consiste em" excluem qualquer elemento, etapa ou componente não especificado. Por exemplo, "consiste em" ou "que consiste em" usado em uma reivindicação limitaria a reivindicação aos componentes, aos materiais ou às etapas especificamente citados na reivindicação, exceto por impurezas normalmente associadas aos mesmos (isto é, impurezas dentro de um determinado componente). Quando a frase "consiste em" ou "que consiste em" aparece em uma cláusula do corpo de uma reivindicação, em vez de seguir imediatamente o preâmbulo, a frase "consiste em" ou "que consiste em" limita apenas os elementos (ou componentes ou etapas) estabelecidos nessa cláusula; outros elementos (ou componentes) não são excluídos da reivindicação como um todo.

[0046] Conforme usado neste documento, as frases de transição "consiste essencialmente em" e "que consiste essencialmente em" são usadas para definir uma proteína de fusão, uma composição farmacêutica e/ou um método que inclui materiais, etapas, características, componentes ou elementos, além daqueles divulgados literalmente, desde que esses materiais, etapas, características, componentes ou elementos adicionais não afetem materialmente as características básicas e inovadoras da invenção reivindicada. O termo "que consiste essencialmente em" ocupa um meio termo entre "que compreende" e "que consiste em".

[0047] Como usado neste documento, o termo "composição farmacêutica" contempla composições que compreendem um ou mais agentes terapêuticos ou fármacos, conforme descrito abaixo, e um ou mais excipientes, carreadores ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[0048] Como utilizado neste documento, o termo "excipientes, carreadores ou veículos farmaceuticamente aceitáveis" compreende quaisquer materiais aceitáveis e/ou qualquer um ou mais aditivos conhecidos na técnica. Como utilizado neste documento, o termo "excipientes", "carreadores" ou "veículo" se refere a materiais adequados para administração de fármacos por várias vias de administração convencionais conhecidas na técnica. Excipientes, carreadores e veículos úteis neste documento incluem quaisquer materiais conhecidos na técnica, que não são tóxicos e não interagem com outros componentes da composição de maneira prejudicial e geralmente se referem a um excipiente, diluente, conservante, solubilizador, emulsificante, adjuvante e/ou veículo com o qual um agente ou fármaco ativo é administrado. Esses carreadores podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos. Agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetracético; e agentes para o ajuste da tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose, também podem ser um carreador. Os métodos para produzir composições em combinação com carreadores são conhecidos pelos especialistas na técnica. Em algumas modalidades, a linguagem “carreador farmaceuticamente aceitável" pretende incluir todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimentos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, e similares, compatíveis com a administração farmacêutica. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na técnica.

[0049] Como utilizado neste documento, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere àquelas quantidades que, quando administradas a um sujeito em particular, tendo em vista a natureza e a gravidade da afecção desse sujeito, terão um efeito terapêutico desejado, por exemplo, uma quantidade que irá curar, impedir, inibir ou pelo menos deter parcialmente ou impedir parcialmente uma afecção alvo.

Em algumas modalidades, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" se refere uma quantidade de um agente terapêutico ou fármaco que, quando administrado isoladamente ou em combinação com um agente ou fármaco terapêutico adicional a uma célula, tecido, órgão ou sujeito, é eficaz para prevenir ou melhorar doenças oculares e cânceres, incluindo, entre outros, degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética proliferativa, oclusão de veias retinianas, neovascularização de coroide secundária à miopia; retinopatia da prematuridade, edema macular diabético, vasculopatia coroide polipoidal, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de pâncreas e câncer de próstata.

Uma dose terapeuticamente eficaz se refere ainda àquela “quantidade do agente terapêutico ou fármaco suficiente para resultar na melhoria dos sintomas, por exemplo, tratamento, cura, prevenção ou melhoria da afecção médica relevante, ou um aumento na taxa de tratamento, cura, prevenção ou melhoria de tais afecções. Quando aplicada a um ingrediente ativo individual administrado isoladamente, uma dose terapeuticamente eficaz se refere apenas a esse ingrediente. Quando aplicada a uma combinação, uma dose terapeuticamente eficaz se refere a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, seja administrado em combinação, em série ou simultaneamente.

[0050] Conforme usado neste documento, os termos "que trata", "tratamento" ou "alívio" se referem ao tratamento terapêutico em que o objetivo é desacelerar (diminuir) se não curar a afecção ou distúrbio patológico alvo ou impedir a recorrência da afecção. Um sujeito é “tratado” com sucesso se, após receber uma quantidade terapêutica de um agente ou fármaco terapêutico, o sujeito mostra redução observável e/ou mensurável ou ausência de um ou mais sinais e sintomas da afecção específica. A redução dos sinais ou sintomas de uma afecção também pode ser sentida pelo sujeito. Um sujeito também é considerado tratado se experimentar uma condição estável. Em algumas modalidades, o tratamento com um agente ou fármaco terapêutico é eficaz para resultar em indivíduos livres de sintomas 3 meses após o tratamento,

preferencialmente 6 meses, mais preferencialmente um ano, ainda mais preferencialmente 2 ou mais anos após O tratamento. Esses parâmetros para avaliar o sucesso do tratamento e o aprimoramento da afecção são facilmente mensuráveis por procedimentos de rotina familiares a um médico com habilidade apropriada na técnica.

[0051] Conforme usado neste documento, o tratamento "preventivo" é destinado a indicar um adiamento do desenvolvimento de uma afecção ou sintoma de uma afecção, suprimindo os sintomas que possam aparecer ou reduzindo o risco de desenvolvimento ou recorrência de uma afecção ou sintoma. O tratamento "curativo" inclui reduzir a gravidade ou suprimir a piora de um sintoma ou afecção existente.

[0052] Como usado neste documento, o termo "agente terapêutico", "agente anti-VEGE", "proteína de fusão", "proteína quimérica" ou "proteína recombinante" compreende um primeiro polipeptídeo operacionalmente ligado a um segundo polipeptídeo, em que o "agente terapêutico", o "agente anti- VEGF", a "proteína de fusão", a "proteína quimérica" ou a "proteína recombinante" inibe a atividade do VEGF. As proteínas quiméricas podem opcionalmente compreender um terceiro, quarto ou quinto ou outro polipeptídeo operacionalmente ligado a um primeiro ou um segundo polipeptídeo. As proteínas quiméricas podem compreender dois ou mais polipeptídeos diferentes. As proteínas quiméricas podem compreender várias cópias do mesmo polipeptídeo. As proteínas quiméricas também podem compreender uma ou mais mutações em um ou mais dos polipeptídeos. Os métodos para produzir proteínas quiméricas são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o termo "agente terapêutico", "proteína de fusão", "proteína quimérica" ou "proteína recombinante" se refere a quaisquer construções expressas ou sintetizadas, incluindo, porém sem limitação, peptídeos ou proteínas que ligam operacionalmente um ou mais dos domínios ou fragmentos de domínio semelhantes a Ig de VEGFR-l1 e/ou VEGFR-2 com Fc-IgG.

[0053] O termo "domínios semelhantes a Ig" se refere aos domínios 1 a 7 semelhantes a Ig de VEGFR-l1 e VEGFR-2. o termo "fragmentos de domínio semelhante a Ig" compreende uma porção de um domínio de comprimento total, geralmente a heparina e/ou a região de ligação de VEGF ou região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de domínio incluem sequências de aminoácidos compreendendo um segmento de pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, 90%, 95% e mais preferencialmente 99% do domínio de comprimento total com 100% de identidade de sequência e variações do mesmo.

As variações nas sequências de aminoácidos das proteínas de fusão são contempladas como abrangidas pela presente divulgação, desde que as variações na sequência de aminoácidos mantenham pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, 90%, 95% e mais preferencialmente 99%. Certas porcentagens são incluídas, como 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de identidade de sequência.

Em particular, são contempladas substituições conservadoras de aminoácidos.

Substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos relacionados em suas cadeias laterais.

Os aminoácidos codificados geneticamente são geralmente divididos em famílias: (1) aminoácidos ácidos são aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos são lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos não polares são alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano e (4) aminoácidos polares não carregados são glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina.

Os aminoácidos hidrofílicos incluem arginina, asparagina,

aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina e treonina.

Os aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina.

Outras famílias de aminoácidos incluem (i) serina e treonina, que são a família alifática-hidróxi; (ii) asparagina e glutamina, que são a família contendo amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que são a família alifática; e (iv) fenilalanina, triptofano e tirosina, que são a família aromática.

Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina ou uma substituição semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado não tenha um efeito importante na ligação ou nas propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido dentro de um local da estrutura.

A possibilidade de uma mudança de aminoácido resultar em uma proteína de fusão funcional pode ser facilmente determinada através do teste da atividade específica do derivado da proteína de fusão.

Fragmentos ou análogos de proteínas de fusão podem ser prontamente preparados por aqueles versados na técnica.

Os terminais amino e carbóxi preferenciais de fragmentos ou análogos ocorrem perto dos limites dos domínios funcionais.

[0054] Como usado neste documento, uma proteína de fusão "isolada" ou "purificada" significa que a proteína de fusão é a espécie predominante presente (ou seja, em uma base molar, é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição) e, de preferência, uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a proteína de fusão compreende pelo menos cerca de 50% (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em geral, uma composição purificada compreenderá mais de cerca de 80% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, mais preferencialmente mais do que cerca de 85%, 90%, 95% e 299%. Mais preferencialmente, a proteína de fusão é purificada para homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular.

[0055] Valores ou faixas podem ser expressos neste documento como "cerca de", de "cerca de" um valor em particular e/ou para "cerca de" outro valor em particular. Quando tais valores ou faixas são expressos, outras modalidades divulgadas incluem o valor específico recitado, de um valor em particular e/ou a outro valor em particular. Da mesma forma, quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente "cerca de", será entendido que o valor específico forma outra modalidade. Será entendido ainda que há um número de valores divulgados na mesma e que cada valor também é divulgado neste documento como "cerca de" esse valor específico, além do próprio valor. Nas modalidades, "cerca de" pode ser usado para significar, por exemplo, dentro de 10% do valor recitado, dentro de 5% do valor recitado ou dentro de 2% do valor recitado.

[0056] Em um aspecto, a presente invenção divulga uma composição compreendendo um agente terapêutico, em que o agente terapêutico compreende um ou mais domínios de ligação à heparina do VEGFR-l1 ou VEGFR-2 e um ou mais domínios de ligação do VEGF, inibindo, assim, a ligação do VEGF ao seu receptor cognato.

[0057] Nas modalidades, a presente invenção fornece um agente anti-VEGF compreendendo uma porção de ligação a VEGF ligada operacionalmente a um Fc-IgG, em que a porção de ligação a VEGF compreende pelo menos um domínio de ligação a VEGF que é um domínio semelhante a IgG 2 de VEGFR-1, e em que o agente anti-VEGF tem uma capacidade de inibição da mitogênese estimulada por VEGF maior que o aflibercept. Nas modalidades, a presente invenção fornece o agente anti-VEGF que tem uma capacidade de ligação vítrea maior que o aflibercept. Nas modalidades, a presente invenção fornece o agente anti-VEGF que tem uma capacidade de inibição da proliferação de células endoteliais estimulada por VEGF de ligação vítrea maior que o aflibercept. Nas modalidades, a presente invenção fornece o agente que tem uma meia-vida aumentada in vivo em comparação com o aflibercept.

[0058] Nas modalidades, a presente invenção fornece a porção de ligação do VEGF que consiste essencialmente nos domínios 1, 2 e 3 semelhantes a IgG do VEGFR-1 (V1-2-3). Nas modalidades, o agente anti-VEGF compreende a sequência de aminoácidos conforme definido na SEQ ID No: 1.

[0059] Nas modalidades, a presente invenção fornece a porção de ligação a VEGF que consiste essencialmente nos domínios 2 e 3 semelhantes a IgG do VEGFR-l1 (V2>-3). Nas modalidades, o agente anti-VEGF compreende a sequência de aminoácidos conforme definido na SEQ ID No: 3.

[0060] Nas modalidades, a presente invenção fornece a porção de ligação do VEGF que consiste essencialmente em domínios 1, 2, 3 e 3 semelhantes a IgG do VEGFR-1 (Vi-2-3-3). Nas modalidades, o agente anti-VEGF compreende a sequência de aminoácidos conforme definido na SEQ ID No: 5.

[0061] Nas modalidades, a presente invenção fornece a porção de ligação do VEGF que consiste essencialmente nos domínios 2, 3 e 3 semelhantes a IgG do VEGFR-1 (V2-3-3). Nas modalidades, o agente anti-VEGF compreende a sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID No: 7.

[0062] Nas modalidades, a presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-VEGF como reivindicações definidas e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Nas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratamento de um distúrbio relacionado ao VEGF em um sujeito em necessidade compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-VEGF conforme definido. O agente anti-VEGF pode ser injetado diretamente no tecido ou órgão afetado, como um olho.

[0063] Nas modalidades, a invenção pode ser usada para tratar uma ampla variedade de distúrbios relacionados ao VEGF, incluindo degeneração macular relacionada à idade neovascular, neovascularização de coroide secundária à miopia, retinopatia diabética proliferativa, edema macular diabético, obstrução vascular da retina, como oclusão da veia da retina, tumores oculares, síndrome de von Hippel Lindau, retinopatia da prematuridade, Vvasculopatia polipoidal da coroide, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer do colo do útero, câncer do endométrio, câncer de ovário, câncer de rim, schwannomas, gliomas, ependimomas e distúrbios neoplásicos ou não neoplásicos que se beneficiam de terapia de anti-VEGF.

[0064] Em algumas modalidades, o agente terapêutico está em uma forma de dosagem administrável, compreendendo o agente terapêutico e um excipiente, carreador, adjuvante, solvente ou diluente adicional.

[0065] Em algumas modalidades, a presente invenção divulga uma composição farmacêutica adequada para o tratamento e/ou tratamento preventivo de um sujeito, em que o agente terapêutico está contido em uma quantidade eficaz para atingir seu objetivo pretendido.

[0066] Em algumas modalidades, o agente ou composições terapêuticas divulgadas neste documento são administradas por injeção. Em certas modalidades, as composições ou o agente terapêutico são injetados diretamente no órgão ou tecido doente. Em algumas modalidades, o agente terapêutico pode ser administrado topicamente, por exemplo, por adesivo Ou aplicação direta no órgão ou tecido doente, ou por iontoforese. O agente terapêutico pode ser fornecido em composições de liberação sustentada, tais como as descritas em, por exemplo, nas Pat. nºº US 5.672.659 e 5.595.760. O uso de composições de liberação imediata ou sustentada depende da natureza da afecção a ser tratada. Se a afecção consistir em um distúrbio agudo ou superagudo, o tratamento com uma forma de liberação imediata será preferencial a uma composição de liberação prolongada. Alternativamente, para certos tratamentos preventivos ou de longo prazo, uma composição liberada de forma sustentada pode ser apropriada.

[0067] O agente terapêutico também pode ser entregue usando um implante, tal como, porém sem limitação, um implante intraocular. Tais implantes podem ser biodegradáveis e/ou biocompatíveis ou podem ser não biodegradáveis. Os implantes podem ser permeáveis ou impermeáveis ao agente ativo. Os implantes específicos para administração do agente terapêutico dependem tanto do tecido ou órgão afetado quanto da natureza da afecção a ser tratada.

A utilização de tais implantes é bem conhecida na técnica.

[0068] Os inibidores descritos nesta invenção podem ser formulados em nanopartículas ou outras formulações de fármacos, a fim de fornecer entrega precisa a tecidos específicos e também fornecer terapia de liberação controlada.

[0069] Os inibidores descritos neste pedido podem ser entregues não apenas como proteínas recombinantes purificadas, mas também por uma abordagem de terapia genética. Os vetores adeno-associados recombinantes (rAAVs) ou outros vetores adequados podem ser utilizados para administrar o inibidor de VEGF por entrega sub-retiniana ou intravítrea*?*.

[0070] Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece um método para o tratamento de um distúrbio neovascular ou relacionado ao VEGF em um sujeito, em que o método envolve a administração ao sujeito: (a) uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão capaz de se ligar à heparina e diminuir ou impedir o desenvolvimento de neovasculatura indesejada. A proteína de fusão pode ser combinada com outros agentes anti-VEGF, incluindo, porém sem limitação: anticorpos ou fragmentos de anticorpos específicos a VEGF;

anticorpos específicos a receptores de VEGF; compostos que inibem, regulam e/ou modulam a transdução de sinal de tirosina quinase; polipeptídeos de VEGF; oligonucleotídeos que inibem a expressão de VEGF no nível de ácido nucleico, por exemplo RNAs anti-sentido; e vários compostos orgânicos e outros agentes com atividade inibidora de angiogênese.

[0071] A invenção fornece ligação à heparina mediada por D3 (ou outro domínio semelhante a Ig) do VEGFR1º?º que, embora seja uma desvantagem para a administração sistêmica, pode conferir vantagens importantes para a administração intravítrea (ou outra local). De fato, a capacidade de ligar o HGPSG, componentes-chave da matriz extracelular?º, promove o acúmulo no vítreo e a penetração da retina”. A invenção fornece uma série de construtos de fusão VEGFR-l Fc com habilidades diferenciais para interagir com HSPGs. Isso permite a escolha de inibidores de VEGF com duração/meia-vida diferentes nos olhos, que são úteis em diferentes condições clínicas.

[0072] As características e outros detalhes da invenção serão agora mais particularmente descritos e apontados nos exemplos a seguir, descrevendo técnicas preferenciais e resultados experimentais. Os exemplos são fornecidos com a finalidade de ilustrar a invenção e não devem ser interpretados como limitativos.

EXEMPLOS

[0073] Em modalidades, a presente invenção divulga, portanto, agentes anti-VEGF que são novos e melhoram os agentes anti-VEGF existentes, incluindo aflibercept, devido à alta potência biológica combinada com fortes características de ligação à heparina. A ligação à heparina é preditiva de meia-vida mais longa e, consequentemente, menor frequência de administração.

[0074] A invenção fornece ligação à heparina mediada por D3 (ou outro domínio semelhante a Ig) do VEGFR1ºº que, embora seja uma desvantagem para a administração sistêmica, pode conferir vantagens importantes para a administração intravítrea (ou outra local). De fato, a capacidade de ligar o HGPSG, componentes-chave da matriz extracelular?º, promove o acúmulo no vítreo bem como a penetração da retina”º. A invenção fornece uma série de construtos de fusão VEGFR-1 Fc com habilidades diferenciais para interagir com HSPGs.

[0075] A Figura 1 fornece uma representação esquemática dos construtos empregados neste documento. A Figura 2 ilustra o vetor empregado e a estratégia de clonagem. As Figuras 3 a

9 mostram as sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos dos construtos gerados.

[0076] Os exemplos mostram que os níveis de expressão da maioria dos construtos eram baixos; Vi-2-3-4, Vi-2-3-3, V2-3-4 E Vi 2-4 eram quase completamente indetectáveis nos meios condicionados. Estudos anteriores haviam mostrado que isoformas de VEGF com alta afinidade por heparina (VEGF189 OU VEGF206) são indetectáveis no meio condicionado das células transfectadas, estando firmemente ligadas à superfície das células ou à matriz extracelular? *?. No entanto, as mesmas poderiam ser liberadas de forma solúvel pela adição de heparina ou heparinase, indicando que o local de ligação consistia em HSPG?*!* 3. Este exemplo procurou determinar se a adição de heparina também pode afetar os níveis de proteínas recombinantes de fusão de VEGFR-l. De fato, a adição de heparina ao meio de células transfectadas em placas de 6 poços resultou em aumentos dependentes da dose nas concentrações de proteína recombinante no meio (Figura 10).

[0077] Na busca de purificar as proteínas recombinantes, a cromatografia de afinidade convencional da proteína A (PA) por si só produziu uma banda principal da massa esperada, mas com numerosas bandas menores, provavelmente refletindo a interação das proteínas recombinantes com HSPGs derivados de células hospedeiras e outras moléculas. Foi desenvolvido um protocolo que removeu essas impurezas, conforme descrito em Métodos. Uma lavagem com pH alto (por exemplo 9,2) na presença de NaCl a 1,2 M enquanto a proteína estava ligada à PA resultou na liberação de numerosos contaminantes. A próxima etapa, a cromatografia de troca aniônica com Hi-Trap Q, foi muito eficaz na remoção da maior parte dos contaminantes e agregados enquanto as proteínas purificadas estavam no fluxo. Os níveis de LPS nas preparações purificadas finais foram <0,1 EU/mg (faixa 0,02 a 0,08), um nível muito baixo compatível com estudos pré-clínicos *º. Como mostrado na Figura 11, a pureza das proteínas recombinantes foi > 95%, avaliada pelo gel SDS/PAGE corado com prata e foi semelhante à do fármaco EYLEA aprovado pela FDA.

[0078] As proteínas recombinantes foram testadas quanto à sua capacidade de inibir a mitogênese estimulada por VEGF (10 ng/ml) em células endoteliais da coroide bovina. As proteínas recombinantes tiveram efeitos inibitórios, com valores de ICso na faixa de aproximadamente 1 nM, exceto Vi-2-4 e V74, que eram menos potentes (Figura 12). Curiosamente, o EYLEA, mesmo na concentração mais alta testada, inibiu não mais que aproximadamente 80% da proliferação estimulada por VEGF (Figura 12). Em contrapartida, os presentes construtos de VEGFR-l1 (exceto V1-214 e V24) bloquearam completamente a proliferação induzida por VEGF (Figura 12). Os ensaios de ligação documentaram a interação entre os receptores solúveis de VEGF e o VEGF biotinilado e a capacidade do VEGF de deslocar a ligação (Figuras 13, 14).

[0079] Para definir adicionalmente as interações terapeuticamente relevantes, buscamos avaliar se as proteínas recombinantes se ligam ao vítreo bovino in vitro. Como ilustrado na Figura 14, embora o EYLEA ou IgG de controle tiveram pouca ou nenhuma ligação, as presentes proteínas apresentaram ligação significativa. Os ligantes mais fortes foram Vi-2-3-37, V2-3-3 E V1i-2-3-1 seguido por Vi-2-3. V2-3 tinha características intermediárias de ligação, entre EYLEA (ou IgG de controle) e V1-2-3-3. O AVASTIN, um anticorpo? monoclonal comumente usado para tratar a neovascularização intraocular, também teve pouca ou nenhuma ligação.

[0080] Para determinar se a fusão de VEGFR-l FC de ligação vítrea pode ser biologicamente ativa, as placas foram revestidas com vítreo bovino. Adição de Vi-2-3-3, mas não EYLEA ou IgG de controle, inibiram a capacidade do VEGF adicionado de modo exógeno para estimular a proliferação de células endoteliais (Figura 15).

[0081] As proteínas recombinantes foram testadas no ensaio de CNV de camundongo e comparadas com o controle de IgG ou EYLEA. Cada proteína foi injetada de modo intravítreo na dose de 2,5 ug um dia antes do tratamento a laser. EYLEA foi testado também em 25 ug. Vi-a-3, Vaca, Vican3n3 e V23-; na dose de 2,5 ug demonstraram um grau de inibição semelhante ou superior ao alcançado com 25 ug de EYLEA. No entanto, nenhum dos construtos contendo D4 demonstrou inibição significativa nas circunstâncias testadas (Figura 16).

[0082] Para determinar se a ligação à heparina pode se traduzir em efeitos terapêuticos duráveis após uma única administração, V1i-2-3-3, EYLEA ou IgG de controle, foram injetados por via intravítrea (2,5 ug) 1 dia, 7 dias ou 14 dias antes da lesão induzida por laser. Conforme mostrado na Figura 17, EYLEA resultou em uma inibição significativa somente quando administrado 1 dia antes da lesão. No entanto, V1-2-3-3 resultou em uma inibição significativa também quando administrado 7 dias ou 14 dias antes da lesão.

[0083] São divulgados vários construtos inovadores de

VEGFR-1-Fc avaliados em uma variedade de ensaios in vitro e in vivo. Para purificar as proteínas recombinantes, foi utilizado um protocolo de várias etapas. Isso foi ditado em grande parte pelos níveis de expressão relativamente baixos na expressão transitória de 293 células, exigindo a adição de heparina ao meio para melhorar a liberação. No entanto, a necessidade de usar heparina pode ser parcial ou totalmente evitada por diferentes células hospedeiras (por exemplo, com uma composição diferente de HSPG ou seus mutantes) ou por níveis de expressão mais altos, como em linhas celulares estáveis e amplificadas.

[0084] Todos os construtos, exceto V2z4a, neutralizaram potentemente a atividade do VEGF e, ao mesmo tempo, apresentavam fortes características de ligação à heparina, o que pode prever uma meia-vida longa após a administração intravítrea. O exemplo documenta que essas proteínas se ligam ao vítreo bovino. Os ligantes mais fortes foram V1-2-3-3, V2-3-37 Vi-2-3-1, Seguido por Vi-2-3. V2;3 teve ligação vítrea significativa, mas menor. A IgG de controle, o EYLEA ou o AVASTIN tiveram uma ligação mínima. Um dos ligantes vítreos mais fortes, V1-2-3-37 foi selecionado para testar a hipótese de que um construto de VEGFR1 Fc ligado à matriz vítrea pode ser biologicamente ativo. Como mostrado na Figura 15, em placas revestidas com vítreo bovino, a adição de Vi1-2-3-3, Mas não o EYLEA ou o IgG de controle, inibiram a capacidade do VEGF adicionado de modo exógeno de estimular a proliferação de células endoteliais.

[0085] Em seguida, as proteínas recombinantes foram testadas no modelo de CNV de camundongo quanto à sua capacidade de inibir a neovascularização induzida por laser. O EYLEA foi usado como controle positivo e a IgGl humana como controle negativo. Uma dose relativamente baixa foi escolhida para testes in vivo, sendo mais adequada para revelar diferenças de potência entre os vários construtos. Além disso, foi relatado que a administração intravítrea de doses relativamente altas de anticorpos do isotipo IgGl pode ter efeitos inibitórios fora do alvo, mediados por FcgRI (CD64) e c-Cbl, quando injetados por via intravítrea *(. A dose utilizada deve evitar esses efeitos fora do alvo e detectar efeitos verdadeiramente específicos.

[0086] Como mostrado na Figura 16, o EYLEA resultou em uma inibição de aproximadamente 30% na dose de 2,5 ug e aproximadamente 50% de inibição a 25 u1ug. Essas constatações são amplamente consistentes com a literatura publicada.

Saishin et al relataram que a injeção intravítrea de aproximadamente 5 ug de aflibercept resultou em aproximadamente 30% de inibição da área de CNV no camundongo 3º. De fato, a dose de 40 ug é comumente usada para obter um efeito máximo no modelo CNV de camundongo **”. Uma constatação inesperada de nosso estudo foi a maior potência de alguns de nossos construtos: V1i-2-3, V2o-3, Vi-2-3-3 € V2-3-3. Administrando o 2,5 ug desses construtos um dia antes da lesão correspondeu ou mesmo excedeu o nível de inibição alcançado com 25 ug de EYLEA. A constatação de que V1-2-337 mas não o EYLEA, tem efeito significativo na prevenção da CNV quando administrado 7 dias ou 14 dias antes da lesão (Figura 17) documenta a durabilidade do efeito e o valor terapêutico.

[0087] Uma constatação inesperada é que nenhum dos construtos que contêm D4 (Vi-2-3-1, V2-3-4, Vi-2-4, Vo-a) resultaram em inibição acentuada in vivo (pelo menos na dose testada), apesar de essas moléculas (com exceção de V2-4) demonstrarem capacidade de bloquear a mitogênese estimulada por VEGF in vitro. No entanto, todos esses construtos demonstraram uma propensão a formar multímeros ou agregados, como avaliado pelo gel SDS/PAGE sob condições não redutoras (Figura 11) ou cromatografia de exclusão de tamanho (não mostrada). Embora trabalhos anteriores *' identificou D4 (juntamente com D7) como um requisito para a dimerização do VEGFR-1, esse efeito é conhecido por ser dependente do ligante. Estudos de estrutura cristalina revelaram um circuito em D4 responsável por essas interações homotípicas *?. É concebível que altas concentrações e/ou a dimerização forçada imposta pelo construto Fc possam resultar em interações independentes do ligante, resultando em agregação. De qualquer forma, os agregados não são produtos farmacêuticos desejáveis, dada a possibilidade de inflamação e imunogenicidade **: ?º?. Portanto, um aspecto da presente invenção é a identificação de construtos tendo VEGFR-1 D2/D3, mas não D4, nas modalidades.

[0088] Vale ressaltar que mutações Fc bem caracterizadas, bem conhecidas pelos especialistas na técnica, que reduzem funções efetoras podem ser adições úteis à invenção, a fim de minimizar a citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC), bem como interações com Clq e o início da cascata de complemento”.

[0089] Em conclusão, o aflibercept foi projetado para eliminar o domínio da heparina de ligação à heparina, a fim de melhorar a meia-vida sistêmica das indicações oncológicas. Os construtos descritos no presente estudo são projetados para promover a ligação e a retenção no vítreo para garantir interações mais sustentadas e terapeuticamente relevantes.

[0090] Métodos

[0091] Para a construção de plasmídeos de expressão VEGFR-lrco-Fc, os fragmentos de ácido nucleico codificaram o peptídeo sinal e uma variedade de domínios extracelulares semelhantes a Ig, um a quatro ?º do VEGRF-1 (Gene ID: 2321) foram sintetizados pela GenScript USA Inc. A variedade dos construtos de domínio extracelular do tipo Ig é a seguinte: V123 contém Dl, 2 e 3; V23, Dl e D2; V1234, Dl, 2, 3 e 4; V1233, Dl, 2, 3 e 3; V234, D 2, 3 e 4; V124, Dl, 2 e 4; V24, D2 e 4; F7 é ECD2, 2 e 3 e F8 é ECD2 e 3. Os fragmentos sintetizados foram inseridos no vetor pPpFUSE-hIgG1-Fc (InvivoGen, tfpfuse-hgifcl) nos locais EcoRI e BgIII, gerando os plasmídeos contendo os vários ECDs de Fltl. Em seguida, usando o kit básico PrineSTAR de mutagênese (Takara, RO46A), os aminoácidos de intervalo R e S (local BgIII) entre os ECDs e o fragmento Fc foram removidos, gerando os plasmídeos (Fl- F8) que expressam as proteínas de fusão dos ECDs Fltl com um IgGl-Fc humano de 227 aminoácidos.

[0092] TRANSFECÇÃO E PREPARAÇÃO DE MEIO CONDICIONADO

[0093] O sistema de expressão Expi293 (Life technologies, Al4524) foi utilizado para gerar o meio condicionado para purificação, de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as células Expi293F" (ThermoFisher) foram cultivadas em suspensão no meio de expressão Expi293"" a 37 ºC em uma atmosfera umidificada com CO: a 8%. Quando a densidade celular chegou a 2,5 milhões/ml, o DNA do plasmídeo e o reagente ExpiFectamine" 293 foram misturados, incubados durante 5 minutos e adicionados às células. A concentração final do DNA e do reagente transfectado foi de 1 ug e 2,7 ul por mililitro respectivamente. Cinco horas após a transfecção, foram adicionadas às células 100 ug/ml de Heparina (Sigma, H3149) e coquetel inibidor de protease, 1: 400 (Sigma, P1860). 16 horas após a transfecção, foram adicionados os reagentes intensificadores 1 e 2. Noventa e seis horas após a transfecção, os meios condicionados foram colhidos. Alíquotas foram testadas para concentrações de proteínas de fusão Fc usando um kit Fc ELISA humano (Syd Labs, EKOO00095-HUFC-2) de acordo com as instruções do fabricante. Inibidores de protease foram adicionados (1:500) ao volume, que foi armazenado a -80 “ºC até uso posterior.

[0094] PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

[0095] Reagentes livres de pirogênio foram empregados.

Antes do uso, as colunas e o equipamento (Akta Explorer System) foram higienizados por exposição a NaOH a 0,5 N por aproximadamente 45 minutos.

O meio condicionado das células transfectadas foi ajustado para PBS, polissorbato (PS) 20 a 0,01%. O PS20 foi adicionado aos tampões em todas as etapas.

Após centrifugação a 20.000 xg por 30 minutos, os sobrenadantes foram submetidos a cromatografia de afinidade com proteína A (PA) Hi-Trap MabSelect SuRe (5 ml, GE Healthcare). Após o carregamento, a coluna foi lavada com dietanolamina a 20 mM, pH 9,2, NaCl a 1,2 M, antes da eluição com ácido cítrico a O0,l M, pH 3,0, que foi imediatamente neutralizado.

O conjunto de eluição de PA foi, então, diluído em dietanolamina a 20 mM, pH 9,2, e aplicado à coluna de troca aniônica Hi-Trap Q (5 ml, GE Healthcare). O material ligado foi eluído com um gradiente de NaCl.

O fluxo, que continha a proteína recombinante purificada, foi imediatamente ajustado para Tris a 20 mM, pH 6,8, e depois concentrado através da ligação à heparina-sefarose (Hi-Trap TM-HS). Após uma lavagem com NaCl a 0,2 a 0,45 M (dependendo do construto), a proteína de fusão VEGFR1 recombinante foi eluída com NaCl a 1 M.

A etapa final de polimento consistiu em cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), usando, por exemplo, Superdex 200 Increase, 10/300 GL ou Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg, GE Healthcare. Finalmente, as proteínas foram trocadas por tampão por diálise em Tris a 10 mM, pH 6,8, histidina a 10 mM, trealose a 1%, NaCl a 40 mM, PS20 a 0,01%. Para determinar os níveis de endotoxina, foi utilizado o Kit de Ensaio de Endotoxina LAL Cromogênico ToxinSensor (GenScript, L00350) de acordo com o protocolo do fabricante.

[0096] ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO CELULAR

[0097] Os ensaios de proliferação de células endoteliais bovinas foram realizados essencialmente como descrito anteriormente *!, Células endoteliais de coroides bovinas cultivadas em fase logarítmica (BCEC) (passagem <10) foram tripsinizadas, ressuspensas e semeadas em placas de 96 poços (sem revestimento) em DMEM de baixa glicose suplementado com soro bovino a 10%, glutamina a 2 mM e antibióticos, a uma densidade de 1.000 células por poço em volume de 200 ul. Foi adicionado rhVEGF:ss (Peprotech) na concentração de 10 ng/ml. O Aflibercept (EYLEA) foi adquirido em uma farmácia. os inibidores foram adicionados à célula em várias concentrações, como indicado nas figuras, antes da adição dos ligantes. Após 5 ou 6 dias, as células foram incubadas com

Alamar Blue por 4 horas. A fluorescência foi medida no comprimento de onda de excitação de 530 nm e no comprimento de onda de emissão de 590 nm.

[0098] ENSAIOS DE LIGAÇÃO DA VARIANTE VEGFR-l EM FASE

SÓLIDA

[0099] Os stripwells EIA/RIA de 96 poços Costar (%42592, Corning Incorporated, Kennebunk, ME) foram revestidos durante a noite a 4 ºC com proteínas receptoras VEGF purificadas (250 ng/poço) em tampão de revestimento (Biolegend, San Diego, CA, tt 421701). Os locais de ligação não específicos foram bloqueados incubando as tiras com BSA a 2% (Sigma, A6003) em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente (RT) após uma única lavagem com tampão de lavagem ELISA (sistemas de pesquisa e desenvolvimento 895003). As tiras foram, então, lavadas 3 vezes, seguidas pela adição de VEGF16s biotinilado humano (G&P Biosciences, Santa Clara, CA) no diluente de ensaio (Biolegend, 4*t421203) sozinho ou em combinação com várias concentrações de VEGF165 humano não biotinilado (sistemas de P&D) a 37 ºC por 2 horas. Depois de três lavagens, vinculado biotinilado de VEGFis humano a VEGFRI foi detectada por incubação com estreptavidina HRP (1:1000, BioLegend, t405210) durante 1 hora à TA. As tiras foram lavadas 5 vezes antes da incubação com solução de substrato de alta sensibilidade TMB (Biolegend, 421501) por 30 minutos, e a absorbância a 450 nm foi medida após adição de igual quantidade de solução de parada (Biolegend, +*77316). Todas as experiências foram realizadas em poços duplicados e repetidas por pelo menos duas vezes.

[00100] LIGAÇÃO IN VITRO AO VÍTREO BOVINO

[00101] O vítreo bovino (InVision BioResource, Seattle, WA) foi descongelado a 4 “C. O material foi primeiro diluído 1:1 com PBS, filtrado através de 0,22 um, aliquotado e armazenado a -80 “C. A concentração proteica total do material vítreo bovino foi medida pelo ensaio da proteína Pierce BCA. Os stripwells de EIA/RIA de 96 poços Costar foram revestidos com vítreo bovino (lug/poço) durante 4 horas à temperatura ambiente, seguido de uma lavagem com tampão de lavagem ELISA. Os locais de ligação não específicos foram bloqueados adicionando BSA a 2% em PBS durante 1 hora à TA, seguido de lavagem três vezes com PBS-T a 0,01%. A cada poço, 50 u1nl de VEGFRI ou proteínas de controle foram adicionados durante a noite a 4 ºC. No dia seguinte, as placas foram lavadas três vezes com PBS-T a 0,01%, seguido de incubação com 100 ul de Fc anti-humano de cabra conjugado com

AP (1:2.000, Invitrogen, $A18832)) durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas ainda cinco vezes com PBS-T a 0,01% antes da adição de 50 1ul de substrato PNPP de uma etapa (Thermo Scientific, Rockford, IL, À 37621) por 15 a 30 minutos à temperatura ambiente. OD foi medido a 405 nm.

[00102] Os efeitos do VEGFRI1 ligado ao vítreo na proliferação de células endoteliais estimuladas por VEGF nos córregos EIA/RIA de 96 poços Costar foram primeiramente esterilizados por UV por 1 hora, seguido de revestimento com lug/poço vítreo bovino, diluído em PBS por 4 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS uma vez, bloqueadas com BSA a 2% a 4 ºC e lavadas duas vezes com PBS em biossegurança. Quantidades iguais de receptores solúveis ou IgG de controle foram adicionadas às placas, diluídas em PBS O/N a 4 “*C (50 ul/poço). As placas foram, então, lavadas uma vez com PBS, seguido de uma lavagem com meio de ensaio contendo BCS a 10%. 100 ul de meio foram adicionados a cada poço, seguido pela adição de VEGF a 5 ng/ml ou PBS apenas como nenhum controle de VEGF. As placas foram incubadas com VEGF ou PBS por 1 hora, seguido pela adição de 100 ul de suspensão de células BCEC (final de 2.500 células/poço). 48 horas depois, a proliferação foi medida adicionando Alamar Blue.

[00103] NEOVASCULARIZAÇÃO DE COROIDE INDUZIDA POR LASER (CNV)

[00104] Os ratos machos C57BL/6J (6 a 8 semanas) foram anestesiados com cetamina/cocktail de xilazina antes do tratamento com laser. As lesões de CNV foram induzidas por fotocoagulação a laser usando um laser de diodo (IRIDEX, Oculight GL) e uma lâmpada de fenda (Zeiss) com tamanho de ponto de 50 um, potência de 180 mW e duração de exposição de 100 ms. ?6º º. Quatro queimaduras a laser foram tipicamente induzidas nas posições de 3, 6, 9 e 12 em torno do disco óptico em cada olho. Diferentes construtos ou controle do isotipo IgG foram injetados de forma intravítrea, na dose de 2,5 pg por olho, em lul volume. O EYLEA foi usado como controle positivo a 2,5 ou 25 pg. Um dia após a injeção, oO tratamento com laser foi realizado e os olhos foram enucleados e fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) por 15 minutos, 7 dias após o tratamento com laser. Em um conjunto separado de estudos, os construtos selecionados foram injetados uma vez 1 dia, 7 dias ou 14 dias antes do tratamento com laser. Os complexos coroide-esclera e retinas foram separados e a imunofluorescência anti-CD3l (IF) foi realizada para evidenciar a vasculatura pela coloração de toda a montagem dos tecidos da retina e da coroide. Para CD31 IF, o anticorpo anti-camundongo de rato BD 550274 foi diluído a 1:100 e incubado durante a noite a 4 “ºC. Após 4 horas de incubação com um anticorpo anti-rato secundário (Life Technologies Al1006), montagens inteiras foram fotografadas a 488 nm. A quantificação da neovascularização na área da lesão e a densidade vascular na retina foram realizadas pela imagem J. Os valores P foram avaliados pelo teste t de Student (alteração significativa, p <0,05).

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Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. Agente anti-VEGF, caracterizado pelo fato de que compreende uma porção de ligação do VEGF operacionalmente ligada a um Fc-IgG, em que a porção de ligação do VEGF compreende pelo menos um domínio de ligação do VEGF que é um domínio semelhante a IgG 2 do VEGFR-l1 e em que o agente anti-VEGF tem uma capacidade de inibição da mitogênese estimulada por VEGF maior que o aflibercept.

2. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo fato de que tem uma capacidade de ligação vítrea maior que o aflibercept.

3. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que tem uma capacidade de inibição da proliferação de células endoteliais estimulada por VEGF de igação vítrea maior que o aflibercept.

4. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o agente tem uma meia- vida in vivo aumentada em comparação com o aflibercept.

5. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação do VEGF consiste essencialmente nos domínios 1, 2 e 3 semelhantes a IgG do VEGFR-1 (V1-2-3).

6. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID No: 1.

7. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação do VEGF consiste essencialmente nos domínios 2 e 3 semelhantes a IgG do VEGFR-1 (V2-3).

8. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente anti-VEGF compreende a sequência de aminoácidos, conforme definida na SEQ ID No: 3.

9. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação do VEGF consiste essencialmente nos domínios 1, 2, 3 e 3 do VEGFR-1 (V1-2-3-3).

10. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos, conforme definida na SEQ ID No: 5.

11. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação do VEGF consiste essencialmente nos domínios 2, 3 e 3 do VEGFR-1 (V2-3-3).

12. Agente anti-VEGF, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos, conforme definida na SEQ ID No: 7.

13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-VEGF, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

14. Método de tratamento de um distúrbio relacionado ao VEGF em um indivíduo em necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-VEGF, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o agente anti-VEGF é diretamente injetado no tecido ou órgão afetado.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito tecido ou órgão afetado é um olho.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao VEGF é selecionado a partir do grupo que compreende degeneração macular relacionada à idade neovascular, neovascularização coroide secundária à miopia, retinopatia diabética proliferativa, edema macular diabético, obstrução vascular da retina, como oclusão da veia da retina, tumores oculares, síndrome de von Hippel Lindau, retinopatia da prematuridade, vasculopatia coroide polipoide, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer do colo do útero, câncer do endométrio, câncer de ovário, câncer de rim, schwannomas, gliomas, ependimomas e distúrbios neoplásicos ou não neoplásicos que se beneficiam da terapia anti-VEGF.

18. Método de tratamento de um distúrbio relacionado ao VEGF em um indivíduo em necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o agente anti-VEGF é diretamente injetado no tecido ou órgão afetado.

20. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito tecido ou órgão afetado é um olho.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao VEGF é selecionado a partir do grupo que compreende degeneração macular relacionada à idade neovascular, neovascularização coroide secundária à miopia, retinopatia diabética proliferativa, edema macular diabético, obstrução vascular da retina, como oclusão da veia da retina, tumores oculares, vasculopatia coroide polipoide, síndrome de von Hippel Lindau, retinopatia da prematuridade, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer do colo do útero, câncer de ovário, câncer do endométrio, câncer de rim, schwannomas, gliomas, ependimomas e distúrbios neoplásicos ou não neoplásicos que se beneficiam da terapia anti-VEGF.