WO2020022438A1

WO2020022438A1 - 網膜線維化を伴う眼疾患の処置剤

Info

Publication number: WO2020022438A1
Application number: PCT/JP2019/029237
Authority: WO
Inventors: 圭一柴垣; ギリース・マーク・シー; シェン・ウェイ・ヨン; チャン・ジンチョン
Original assignee: 参天製薬株式会社
Priority date: 2018-07-26
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2020-01-30
Also published as: TW202019476A; WO2020022438A8

Abstract

本開示の目的は、網膜線維化の抑制方法を提供することである。本発明者らは、抗エンドグリン抗体とＶＥＧＦ阻害剤を併用することにより網膜線維化を抑制し得ることを見出した。従って、ＶＥＧＦ阻害剤と併用される、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む網膜線維化の抑制剤が提供される。これらの抑制剤は、例えば、網膜線維化を伴う眼疾患の処置に使用し得る。

Description

網膜線維化を伴う眼疾患の処置剤

　本特許出願は、米国仮出願番号第６２／７０３,６７６号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本開示は、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントとＶＥＧＦ阻害剤を併用することを特徴とする、網膜線維化の抑制方法に関するものである。

　眼の恒常性は、体内の他の組織と同様に、正常な脈管構造、細胞外基質および多様な細胞の機能により保たれている。感染、炎症、代謝性疾患等により恒常性が乱されると、眼組織の線維化が起こり得る。眼組織の線維化は、物理的に視軸を乱したり、細胞が正常に機能できなくなるまで組織の微小環境を破壊したりすることにより、視覚に破滅的な影響を与え、世界中で失明の原因となっている。例えば、糖尿病性網膜症では、糖尿病に伴う網膜低酸素症の結果、網膜血管が無制御に増殖し、網膜線維化と牽引性網膜剥離を招く。滲出型加齢黄斑変性における網膜下出血の後にも、同様の線維化が起こり得る。現在のところ、利用可能な網膜線維化の治療薬は存在しない。

　加齢黄斑変性は、高齢者の社会的失明の主原因の一つである。加齢黄斑変性は、地図状萎縮（網膜色素上皮、脈絡膜毛細血管の萎縮）を伴う萎縮型加齢黄斑変性と、網膜下または網膜色素上皮下の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ：Choroidal Neovascularization）を特徴とする滲出型加齢黄斑変性に分類される。滲出型加齢黄斑変性の主要な病態であるＣＮＶ形成には、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：Vascular Endothelial Growth Factor）が重要な役割を果たすことが明らかになっており、現在、複数の抗ＶＥＧＦ薬が滲出型加齢黄斑変性治療薬として承認されている（非特許文献１～３）。

　ＣＮＶ膜にはエンドグリンが発現しており（非特許文献４）、血管新生に関与することが知られている。抗エンドグリン抗体は、増殖している血管内皮細胞の表面上のエンドグリンに結合し、ＢＭＰシグナル伝達を阻害し、血管内皮細胞の増殖阻害とアポトーシスを引き起こした。また、抗エンドグリン抗体は、高酸素負荷網膜血管新生モデルマウスにおいて血管新生を抑制し（非特許文献５）、右心室圧負荷モデルマウスにおいて心筋の線維化を抑制した（非特許文献６）。

　特許文献１は、抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体の併用による血管新生関連疾患の治療に言及している。特許文献２は、抗エンドグリン抗体を含む製剤を開示しており、抗ＶＥＧＦ抗体との併用に言及している。特許文献３は、抗エンドグリン抗体による線維症の処置を開示している。しかしながら、抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体の併用による網膜線維化の抑制について具体的に研究した例は、これまで知られていない。

国際公開第２０１１／０２２３３９号国際公開第２０１４／０３９６８２号国際公開第２０１６／０７７４５１号

Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2014;252(4):647-55. N Engl J Med. 2006;355(14):1419-31. Ophthalmology. 2012;119(12):2537-48. Curr Eye Res. 2000;21(6):952-61. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55(10):6490-8. J Am Heart Assoc. 2014;3(4):1-16.

　本開示の目的は、網膜線維化の抑制方法を提供することである。

　本発明者らは、抗エンドグリン抗体とＶＥＧＦ阻害剤を併用することにより網膜線維化を抑制し得ることを見出した。

　従って、ある態様では、本開示は、ＶＥＧＦ阻害剤と併用される、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む網膜線維化の抑制剤を提供する。
　また別の態様では、本開示は、ＶＥＧＦ阻害剤と併用される、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む網膜線維化を伴う眼疾患の処置剤を提供する。

　本開示により、対象における網膜線維化の抑制が可能になる。また、眼疾患に罹患している対象において網膜線維化を抑制することにより、対象の眼疾患を処置し得る。

抗エンドグリン抗体ＴＲＣ１０５の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。Ｒｌｂｐ－ＣｒｅＥＲ－ＤＴＡ１７６マウスにおけるミュラー細胞障害の誘導、硝子体内注射および蛍光眼底造影検査のスケジュールを示す。ミュラー細胞障害を誘導されたＲｌｂｐ－ＣｒｅＥＲ－ＤＴＡ１７６マウス（ＭＣＫＯマウス）における、代表的な蛍光眼底造影検査の画像を示す。ＭＣＫＯマウスの蛍光眼底造影検査に基づく病変スコアを示す。＊＊Ｐ＜０.０１，ｖｓＭＣＫＯ，ＰＢＳ.†Ｐ＜０.０５，ｖｓＭＣＫＯ＋ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ；‡Ｐ＜０.０１，ｖｓＭＣＫＯ＋Ｍ１０４３；Ｎ＝１７～２１／群（one-way ANOVAにより解析）。ＭＣＫＯマウスの網膜ホールマウント標本の抗ＧＦＡＰ抗体による免疫染色の結果を示す。＊＊Ｐ＜０.０１，ｖｓｎｏｒｍａｌ＋ＰＢＳ；†Ｐ＜０.０５および‡Ｐ＜０.０１，ｖｓＭＣＫＯ＋ＰＢＳ；Ｎ＝７～１０／群（one-way ANOVAにより解析）。ＭＣＫＯマウスの網膜ホールマウント標本の抗Ｉｂａ１抗体による免疫染色の結果を示す。＊Ｐ＜０.０５および＊＊Ｐ＜０.０１，ｖｓｎｏｒｍａｌ＋ＰＢＳ；†Ｐ＜０.０５および‡Ｐ＜０.０１，ｖｓＭＣＫＯ＋ＰＢＳ；Ｎ＝７～１０／群（one-way ANOVAにより解析）。ＭＣＫＯマウスの網膜組織における、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｓｍａｄ３およびリン酸化Ｓｍａｄ３のウェスタンブロットの結果を示す。＊Ｐ＜０.０５および＊＊Ｐ＜０.０１，ｖｓｎｏｒｍａｌ＋ＰＢＳ；‡Ｐ＜０.０１，ｖｓＭＣＫＯ＋ＰＢＳ；Ｎ＝６～１０／群（one-way ANOVAにより解析）。

　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。

　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本開示において、一般的な理解に優先する。

　本開示において、「抗体」は、免疫系の抗原結合性タンパク質を意味する。抗原結合性領域を有する完全長の天然に存在する抗体は、ジスルフィド結合により相互に連結された２つの重鎖（Ｈ鎖）および２つの軽鎖（Ｌ鎖）を含む糖タンパク質である。各重鎖には、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）が含まれる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖には、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）が含まれる。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインから構成される。ＶＨおよびＶＬの領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）という超可変性を有する領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）というある程度保存されている領域に細分することができる。ＶＨおよびＶＬでは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲがそれぞれ配列されている。抗原との結合にはＣＤＲ３が重要であることが知られている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。

　抗体には、抗原に特異的に結合する１またはそれ以上の領域が含まれ、抗原結合領域を含む抗体の断片は、完全長抗体と同様に抗原を特異的に認識することが示されている。本開示において、ある抗体の「抗原結合性フラグメント」は、その抗体の抗原に特異的に結合する、抗体の一部の領域、部分またはタンパク質の断片を意味する。抗原結合性フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ＦａｂはＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから構成される一価の抗体フラグメントである。Ｆａｂ’はＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１ドメインおよびヒンジ部から構成される一価の抗体フラグメントである。Ｆ（ａｂ’）_２はヒンジ部のジスルフィド結合により結合した二つのＦａｂ断片を含む二価の抗体フラグメントである。Ｆｖは抗体の単腕のＶＬおよびＶＨから構成される一価の抗体フラグメントである。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされており、遺伝子組換技術によりこれらのドメインをリンカーで連結して１分子のタンパク質であるｓｃＦｖを作製することができる。ｓｃＦｖはＶＨおよびＶＬの間にリンカーを追加的に含む。前記リンカーはＶＨおよびＶＬを人為的に連結し、ｓｃＦｖ抗体の抗原結合能を安定化するために当業界で通常利用されるペプチドである（例えば、ＧＳリンカーは Huston et al., Methods in Enzymology, 203:46-88 (1991)、ＥＫリンカーは、Whitlow, et al., Protein Eng., 6:989(1993) 参照）。前記リンカーは一般にグリシンおよびセリンを含み、その長さは１５～１８アミノ酸である。抗原結合性フラグメントの組合せも使用し得、例えば、Ｆａｂ３、Diabody、Triabody、Tetrabody、Minibody、Bis-scFv、(scFv)₂-Fc、intact-IgG が例示される。これらは、例えば、Holliger et al., Nature Biotechnology, 23(9):1126-36(2005) に詳述されている。

　抗体または抗原結合性フラグメントは、その特性に実質的な影響を及ぼさない限り、１個または数個の、例えば、１～１０個、１～５個、１個～３個、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されていてもよい。例えば、定常領域やＦＲ領域において、アミノ酸が置換、欠失、付加または挿入され得る。このような改変は、例えば、ゲノム編集法、部位特異的変異導入法（点突然変異導入およびカセット式変異導入等）、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、およびＰＣＲ法等の当業者に周知の核酸の改変方法を組み合わせて、容易に実施できる。

　抗体の定常ドメイン（Ｆｃドメイン）は、抗体の抗原に対する結合には直接関与せずに、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用を介して、抗体依存性細胞傷害作用への抗体の関与など、各種のエフェクター機能を呈示する。Ｆｃドメインはまた、患者への投与後に抗体のバイオアベイラビリティーに影響を与える。それらの重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。これらは、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり、これらのうちのいくつかを、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメイン（Ｆｃドメイン）を、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと称する。異なる免疫グロブリンのクラスのサブユニットの構造並びに三次元の立体構造はよく知られている。抗体またはそれらの抗原結合断片を、それらのＣ末端において、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭ、並びに該アイソタイプのサブクラス、特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部に結合させることができる。

　抗体またはその抗原結合性フラグメントは、糖鎖等によりさらに修飾されていてもよい。例えば、修飾により、インビボ（in vivo）における安定性、可溶性、バイオアベイラビリティーまたは半減期などの薬物動態特性を変化させることができる。また、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト化抗体であってもよい。「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。

抗エンドグリン抗体
　「エンドグリン」は、ＣＤ１０５またはｅｄｇ－１としても知られており、増殖している血管内皮細胞において高レベルで発現する、ホモ二量体のＩ型膜糖タンパク質である（Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1623-1634）。正常組織の血管内皮細胞も、ある程度のエンドグリンを発現させる（Burrows et al., 同上；Wang et al., 1993, Int. J. Cancer 54:363-370）。ヒトのエンドグリンは、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）に特異的に結合することが知られており、エンドグリンについて推測されるアミノ酸配列は、ＴＧＦ－β受容体の一種であるβ－グリカンに対する高い相同性を示す。エンドグリンはまた、アクチビンＡおよび骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）－１０、－９、－７および２などの他の成長因子に結合する。エンドグリン、ＢＭＰレセプターＩＩおよびＡＬＫ１からなる複合体へのＢＭＰ－９の結合は、血管内皮細胞の増殖に必要とされるＳＭＡＤ１／５／８リン酸化の過程に重要である。

　エンドグリンはいかなる種のものであってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、特にヒトのエンドグリンである。種々の生物種由来エンドグリンのアミノ酸配列は、公知のデータベースを利用して、容易に入手できる。ヒトエンドグリン遺伝子は染色体９ｑ３４上に位置し、コード領域は１４のエクソンを含有する。ＴＧＦ－βと結合する能力を有する２つの異なるアイソフォーム（ＬおよびＳ）が知られている。ヒトのエンドグリンの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１７８１３（Ｌアイソフォーム）およびＱ５Ｔ９Ｂ９（Ｓアイソフォーム）として登録されている。本開示において、「エンドグリン」は、その天然に存在する対立遺伝子およびプロセッシングを受けた形態を含む。

　「抗エンドグリン抗体」は、十分な親和性および特異性でエンドグリンに結合する抗体である。例えば、出典明示により全体を本明細書の一部とする特許文献１～３；米国特許第５,９２８,６４１号；同第６,２００,５６６号；同第６,１９０,６６０号；および同第７,０９７,８３６号に説明されている抗エンドグリン抗体を使用できる。特に、ＴＲＣ１０５、ＴＲＣ２０５、ＳＮ６、４４Ｇ４、ＭＪ７／１８、Ｔｅｃ－１１などの抗エンドグリン抗体が知られている（特許文献３参照）。これらの抗体の多数について、エクスビボ（ex vivo）およびインビボ（in vivo）における有効性が立証されている。

　ある実施態様では、抗エンドグリン抗体はＴＲＣ１０５（カロツキシマブ（carotuximab）、ＤＥ－１２２とも呼ばれる）である。ＴＲＣ１０５のアミノ酸配列を図１および配列番号１、２に示す。ＴＲＣ１０５は、ヒトのエンドグリンのオーファンドメインに結合し、競合的にＢＭＰ結合を阻害し、その結果ＳＭＡＤ１／５／８リン酸化を阻害し、血管新生を阻害する。ＴＲＣ１０５は、マウスエンドグリンと結合するが、マウスエンドグリンとマウスＢＭＰの結合を妨げない。一方、抗体Ｍ１０４３は、マウスエンドグリンと特異的に結合し、マウスＢＭＰ結合を阻害する。従って、Ｍ１０４３は、マウスモデルにおいて、ヒトでのＴＲＣ１０５の効果を模倣する抗体である。別の実施態様では、抗エンドグリン抗体は特許文献３に記載されるＴＲＣ２０５である。

　ある実施態様では、抗エンドグリン抗体は、アミノ酸配列ＤＡＷＭＤ（配列番号３）からなるＶＨ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＸ_１ＲＳＸ_２ＡＳＮＨＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ（ここで、Ｘ_１はＡまたはＩであり、Ｘ_２は、Ｋ、ＱまたはＲである）（配列番号４）からなるＶＨ－ＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＷＲＲＦＦＤＳ（配列番号５）からなるＶＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖、並びに、アミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号６）からなるＶＬ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＸ_３ＳＮＬＡＳ（ここで、Ｘ_３はＴまたはＳである）（配列番号７）からなるＶＬ－ＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号８）からなるＶＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖からなる。ある実施態様では、Ｘ_１はＩであり、Ｘ_２はＫであり、Ｘ_３はＴである。ある実施態様では、Ｘ_１はＡであり、Ｘ_２はＫであり、Ｘ_３はＴである。

　ある実施態様では、抗エンドグリン抗体は、配列番号９～１４のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または、配列番号１５～２３のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ある実施態様では、抗エンドグリン抗体は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある実施態様では、抗エンドグリン抗体は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および／または、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。これらのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列のうちの相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の配列は、他のアミノ酸配列、例えばヒトまたは他の動物に由来する抗体のフレームワークのアミノ酸配列により置換されていてもよい。

　ある実施態様では、重鎖可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、
（ａ）第４９位におけるグリシン（Ｇ）のアラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）による置換；
（ｂ）第５１位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；
（ｃ）第５４位におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）またはアスパラギン（Ｑ）による置換；および、
（ｄ）第８１位におけるロイシン（Ｌ）のバリン（Ｖ）による置換
からなる群から選択される１または複数の修飾を含んでもよい。

　ある実施態様では、軽鎖可変領域は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、
（ａ）第４位におけるメチオニン（Ｍ）のロイシン（Ｌ）による置換；
（ｂ）第１９位におけるアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）による置換；
（ｃ）第２２位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換；
（ｄ）第４７位におけるアラニン（Ａ）のイソロイシン（Ｉ）による置換；および、
（ｅ）第５０位におけるトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換
からなる群から選択される１または複数の修飾を含んでもよい。

　ある実施態様では、抗エンドグリン抗体は、配列番号２４または２５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域（Ｆｃ）、および／または、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ある実施態様では、抗エンドグリン抗体は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むＦｃ、および／または、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＣＬを含む。ある実施態様では、抗エンドグリン抗体は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＦｃ、および／または、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＣＬを含む。

ＶＥＧＦ阻害剤
　血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、インビトロで内皮細胞の増殖および移動を、インビボで血管透過および血管新生を誘導することが知られている。また、ＶＥＧＦは、新たに形成される血管中で内皮細胞の抗アポトーシス因子としても機能する。ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｆおよび胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）の７つのメンバーを含む。これらは全て、ＶＥＧＦ相同性ドメイン中に８個のシステイン残基の共通構造を有する。ＶＥＧＦ－Ａに関して、６個の異なるアイソフォームが存在し、ＶＥＧＦ－Ａ１６５が主なアイソフォームである。これらのアイソフォームの血管新生における機能は重複している。ＶＥＧＦファミリーの各メンバーは異なる物理的および生物学的性質を有し、それらは特異的チロシンキナーゼ受容体を介して作用する。ＶＥＧＦに関する３つの高親和性受容体、ＶＥＧＦＲ－１／Ｆｌｔ１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ－１）、ＶＥＧＦＲ－２／Ｋｄｒ／Ｆｌｋ－１（受容体／胎児肝臓キナーゼ－１を含有するキナーゼ挿入ドメイン）およびＶＥＧＦＲ－３が知られている。これらの受容体はＰＤＧＦ受容体ファミリーに分類される。ＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２は、高い親和性でＶＥＧＦ－Ａ１６５と結合する。

　ＶＥＧＦはいかなる種のものであってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、特にヒトのＶＥＧＦである。種々の生物種由来ＶＥＧＦのアミノ酸配列は、公知のデータベースを利用して、容易に入手できる。例えば、Leung et al., Science, 246:1306(1989) および Houck et al, Mol. Endocrin., 5:1806(1991) に記載されているように、ヒトＶＥＧＦ－Ａは１６５アミノ酸からなり、関連する１２１、１８９および２０６アミノ酸の形態も存在する。１６５アミノ酸のヒトＶＥＧＦのアミノ酸８～１０９または１～１０９に相当するポリペプチドも、ヒトＶＥＧＦ－Ａに含まれる。ヒトのＶＥＧＦ－Ａの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１５６９２として登録されている。本開示において、「ＶＥＧＦ」は、その天然に存在する対立遺伝子およびプロセッシングを受けた形態を含む。

　本開示において、「ＶＥＧＦ阻害剤」は、ＶＥＧＦもしくは１種もしくは複数のＶＥＧＦ受容体またはそれらをコードする核酸への結合により、ＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減または干渉することができる分子を意味する。好ましくは、ＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に結合する。ＶＥＧＦ阻害剤には、抗ＶＥＧＦ抗体およびそれらの抗原結合性フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に結合し、リガンド－受容体相互作用を遮断するポリペプチド（例えばイムノアドヘシン、ペプチボディ）、抗ＶＥＧＦ受容体抗体およびＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤、ＶＥＧＦに結合するアプタマー、およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体をコードする核酸配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸（例えばＲＮＡｉ）が含まれる。

　抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ阻害剤の１種である。本開示において、「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性および特異性でＶＥＧＦに結合する抗体を意味する。ある実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦ－Ａに特異的な抗体、例えば、ラニビズマブ、ベバシズマブまたはブロルシズマブである。ＶＥＧＦ－Ａに特異的な抗体と共通のＣＤＲを有する抗体およびそれらの抗原結合性フラグメントも使用し得る。

　ＶＥＧＦ阻害剤の他の例としては、アフリベルセプト、コンベルセプト、アビシパーペゴール（Abicipar pegol）、ペガプタニブナトリウム、スニチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ、ペガプタニブ、パゾパニブ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ１１２４８、ＡＧ－０１３７３６、Ｂａｙ４３９００６、ＺＤ－６４７４、ＣＰ６３２、ＣＰ－５４７６３２、ＡＺＤ－２１７１、ＣＤＰ－１７１、ＳＵ－１４８１３、ＣＨＩＲ－２５８、ＡＥＥ－７８８、ＳＢ７８６０３４、ＢＡＹ５７９３５２、ＣＤＰ－７９１、ＥＧ－３３０６、ＧＷ－７８６０３４、ＲＷＪ－４１７９７５／ＣＴ６７５８およびＫＲＮ－６３３などが挙げられる。ある実施態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、アフリベルセプト、コンベルセプトおよびアビシパーペゴールからなる群から選択されるＶＥＧＦ－Ａ阻害剤である。

製造方法
　本開示の抗エンドグリン抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗ＶＥＧＦ阻害剤は、購入してもよく、当業者に公知の方法、例えば、遺伝子工学的手法または化学合成等の各種手段を用いて製造してもよい。遺伝子工学的手法には、例えば、抗エンドグリン抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗ＶＥＧＦ阻害剤をコードする核酸を含有する複製可能なクローニングベクターまたは発現ベクターを作製すること、当業者に公知の適当な方法でこのベクターを宿主細胞に導入すること、宿主細胞を培養して核酸を発現させること、得られたポリペプチドを回収し、精製することが含まれる。核酸が複数の核酸分子からなる場合は、それぞれの核酸分子を含む複数のベクターの組合せ（セット）を宿主細胞に導入してもよく、または、複数の核酸を含む１つのベクターを宿主細胞に導入してもよい。目的のポリペプチドにペプチドタグを連結させ、ペプチドタグを使用してポリペプチドを精製してもよい。

　使用する宿主細胞に適する制御配列を含むベクターを使用し得る。制御配列としては、転写のプロモーター配列、転写を制御するための任意のオペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、および転写や翻訳の終了を制御する配列等が含まれる。ベクターは、さらに、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を含んでもよい。これらの各種配列または部位は、発現させるポリペプチドの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することができる。

　ベクターは、宿主のゲノムに組み込まれるベクター、組み込まれないベクター、細胞質に存在して自律的に複製するエピソーマルベクターのいずれであってもよい。例えば、レトロウイルスベクター（例えば、オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクター）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ＨＳＶベクターなどのウイルスベクターを使用できる。感染した細胞中でウイルスが自己複製できないように、複製能を欠損させたウイルスベクターが好適である。また、リポソームおよび陽イオン脂質などのトランスフェクション試薬を利用して宿主細胞に核酸を導入してもよい。リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメントなどの方法も核酸導入に使用し得る。

　宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができる。例えば、代表的な宿主細胞として、大腸菌等の原核細胞、および、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞を挙げることができる。

　宿主細胞で発現された抗体等のタンパク質は、宿主細胞の培養培地、宿主細胞の抽出物および／または溶解物から精製できる。精製方法は当業者に公知の任意の方法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、遠心分離、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースでのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、およびアフィニティクロマトグラフィーによって精製し得る。

　従って、ある態様では、上記の抗エンドグリン抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたはＶＥＧＦ阻害剤をコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該核酸またはベクターを含む宿主細胞、および／または、当該宿主細胞の抽出物および／または溶解物が提供される。核酸は、コードするアミノ酸配列を変更させずに、宿主細胞に適したコドン（至適コドン）を使用するように改変されていてもよい。このように至適コドンに改変することによって、宿主細胞におけるポリペプチドの発現効率が向上し得る。

使用方法
　後述する実施例により立証される通り、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントとＶＥＧＦ阻害剤を併用することにより、網膜の線維化が抑制される。従って、ある態様では、網膜線維化の抑制を必要としている対象に抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびＶＥＧＦ阻害剤を投与することを含む、網膜線維化の抑制方法が提供される。本開示において、「網膜線維化の抑制」とは、対象の網膜の線維化を防止すること、線維化の進行を遅延、停止もしくは抑制すること、および／または、線維化を改善することを意味する。網膜線維化は、眼疾患、例えば下記に挙げられる眼疾患の症状の１つであってもよい。

　抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントとＶＥＧＦ阻害剤の併用は、その網膜線維化抑制効果により、例えば、網膜線維化を伴う眼疾患の処置および／または予防に有用である。従って、ある態様では、網膜線維化を伴う眼疾患の処置を必要としている対象に抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびＶＥＧＦ阻害剤を投与することを含む、網膜線維化を伴う眼疾患の処置方法が提供される。網膜線維化を伴う眼疾患には、例えば、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、増殖性硝子体網膜症、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、ぶどう膜炎、虚血性視神経症が含まれる。ある実施態様では、網膜線維化を伴う眼疾患は加齢黄斑変性、特に滲出型加齢黄斑変性である。

　本明細書で使用されるとき、「処置する」または「処置」は、網膜線維化を伴う眼疾患に罹患している対象において、眼疾患の進行を遅延、停止もしくは抑制すること、および／または、その症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。

　本明細書で使用されるとき、「予防する」または「予防」は、対象において、特に、網膜線維化を伴う眼疾患に罹患する可能性が高いが、未だ罹患していない対象において、網膜線維化を伴う眼疾患の発症を防止すること、および／または、網膜線維化を伴う眼疾患を発症する可能性を低減することを意味する。網膜線維化を伴う眼疾患に罹る可能性が高いが、未だ罹患していない対象には、例えば、糖尿病、高血圧または喫煙などのリスク因子を有する対象が含まれる。

　網膜線維化の抑制または網膜線維化を伴う眼疾患の処置および／または予防の対象としては、動物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、特にヒトが挙げられる。

　抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメント（第１の成分）とＶＥＧＦ阻害剤（第２の成分）を「併用する」ことは、第１の成分および第２の成分を含有する投与剤形、または、各成分を別個に含有する投与剤形の組合せを対象に投与することを意味する。即ち、第１の成分と第２の成分は、これらを両方とも含む組成物の形態で投与されてもよく、それぞれ別々に含む組成物の組合せとして投与されてもよい。第１の成分と第２の成分は同時に投与されてもよく、連続的に投与されてもよく、あるいは、第１の成分と第２の成分が同じ目的（即ち、網膜線維化の抑制または網膜線維化を伴う眼疾患の処置）のために使用される限り、いずれか一方を遅延して投与してもよい。

　抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびＶＥＧＦ阻害剤の投与方法は特に限定されず、経口投与、非経腸投与、注射、輸液、点眼、前眼房内、硝子体内投与等の一般的な投与経路を経ることができ、硝子体内投与が好ましい。両成分の投与経路は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、両成分を硝子体内投与してもよく、一方を硝子体内投与し、他方を別の投与経路で、例えば静脈内に投与してもよい。

　経口投与の剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。注射による投与の剤形としては、静脈注射用、点滴投与用、眼内注射用、活性物質の放出を延長する製剤などが挙げられる。硝子体内投与用の剤形としては、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。

　これらの剤形は、有効成分を常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択でき、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。

　ある実施態様では、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび／またはＶＥＧＦ阻害剤を硝子体内投与用の注射剤として投与する。硝子体内投与用の注射剤は、塩化ナトリウム等の等張化剤；リン酸ナトリウム等の緩衝化剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等の界面活性剤；メチルセルロース等の増粘剤等を必要に応じて用い、調製することができる。

　抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび／またはＶＥＧＦ阻害剤の投与量および投与回数は、有効量が対象に投与されるように、投与対象の動物種、健康状態、年齢、体重、投与経路、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。例えば、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントとＶＥＧＦ阻害剤の投与量の比は、質量比で、１：１００～１００：１、１：５０～５０：１、１：３０～３０：１、１：２５～２５：１、１：１０～１０：１、１：５～５：１、１：３～３：１または１：２～２：１、例えば、約１：１であり得る。

　１種またはそれ以上の抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと、１種またはそれ以上のＶＥＧＦ阻害剤を併用し得る。また、１種またはそれ以上のさらなる有効成分、特に、眼疾患の処置および／または予防のための有効成分と併用してもよい。併用に適する有効成分には、例えば、抗炎症剤、抗菌剤、抗真菌剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤が含まれる。

　抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントとＶＥＧＦ阻害剤の併用に加えて、薬物療法以外の眼疾患の治療法を実施することもできる。適する治療法には、例えば、外科手術、光線力学療法、遺伝子治療、再生医療、角膜移植、レーザー治療が含まれる。

　ある態様では、網膜線維化の抑制においてＶＥＧＦ阻害剤と共に使用するための抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが提供される。別の態様では、網膜線維化の抑制において抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと共に使用するためのＶＥＧＦ阻害剤が提供される。別の態様では、網膜線維化の抑制における使用のための、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびＶＥＧＦ阻害剤の組合せが提供される。

　ある態様では、ＶＥＧＦ阻害剤と併用される網膜線維化の抑制剤の製造における、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用が提供される。別の態様では、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと併用される網膜線維化の抑制剤の製造における、ＶＥＧＦ阻害剤の使用が提供される。別の態様では、網膜線維化の抑制剤の製造における、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびＶＥＧＦ阻害剤の組合せの使用が提供される。

　ある態様では、網膜線維化を伴う眼疾患の処置においてＶＥＧＦ阻害剤と共に使用するための抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが提供される。別の態様では、網膜線維化を伴う眼疾患の処置において抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと共に使用するためのＶＥＧＦ阻害剤が提供される。別の態様では、網膜線維化を伴う眼疾患の処置における使用のための、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびＶＥＧＦ阻害剤の組合せが提供される。

　ある態様では、ＶＥＧＦ阻害剤と併用される網膜線維化を伴う眼疾患の処置剤の製造における、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用が提供される。別の態様では、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと併用される網膜線維化を伴う眼疾患の処置剤の製造における、ＶＥＧＦ阻害剤の使用が提供される。別の態様では、網膜線維化を伴う眼疾患の処置剤の製造における、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびＶＥＧＦ阻害剤の組合せの使用が提供される。

　ある態様では、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む第１の部分、および、ＶＥＧＦ阻害剤を含む第２の部分を含み、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと、ＶＥＧＦ阻害剤が併用されることを特徴とする、網膜線維化を抑制するためのキットが提供される。

　ある態様では、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む第１の部分、および／または、ＶＥＧＦ阻害剤を含む第２の部分を含み、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと、ＶＥＧＦ阻害剤が併用されることを特徴とする、網膜線維化を伴う眼疾患を処置するためのキットが提供される。

　キットは、さらに、使用のための説明を含む添付文書（例えば、文書、テープ、ＣＤ－ＲＯＭ等）等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含み得る。キットの部分または材料は、ラベルを有する容器に含まれ得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管、プレート、メンブレン等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。

　本開示は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］抗エンドグリン抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、および／または、ＶＥＧＦ阻害剤を含む網膜線維化の抑制剤であって、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと、ＶＥＧＦ阻害剤を併用することを特徴とする、抑制剤。
［２］ＶＥＧＦ阻害剤と併用される、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む網膜線維化の抑制剤。
［３］抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと併用される、ＶＥＧＦ阻害剤を含む網膜線維化の抑制剤。
［４］眼疾患の処置のための、第１項～第３項のいずれかに記載の抑制剤。
［５］抗エンドグリン抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、および／または、ＶＥＧＦ阻害剤を含む網膜線維化を伴う眼疾患の処置剤であって、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと、ＶＥＧＦ阻害剤を併用することを特徴とする、処置剤。
［６］ＶＥＧＦ阻害剤と併用される、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む網膜線維化を伴う眼疾患の処置剤。
［７］抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントと併用される、ＶＥＧＦ阻害剤を含む網膜線維化を伴う眼疾患の処置剤。
［８］眼疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、増殖性硝子体網膜症、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、ぶどう膜炎、虚血性視神経症からなる群から選択される、第４項～第７項のいずれかに記載の処置剤。
［９］眼疾患が加齢黄斑変性である、第４項～第８項のいずれかに記載の処置剤。
［１０］眼疾患が滲出型加齢黄斑変性である、第４項～第９項のいずれかに記載の処置剤。

［１１］抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
　重鎖可変領域が、アミノ酸配列ＤＡＷＭＤ（配列番号３）からなるＶＨ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＸ_１ＲＳＸ_２ＡＳＮＨＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ（ここで、Ｘ_１はＡまたはＩであり、Ｘ_２は、Ｋ、ＱまたはＲである）（配列番号４）からなるＶＨ－ＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＷＲＲＦＦＤＳ（配列番号５）からなるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、かつ、
　軽鎖可変領域が、アミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号６）からなるＶＬ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＸ_３ＳＮＬＡＳ（ここで、Ｘ_３はＴまたはＳである）（配列番号７）からなるＶＬ－ＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号８）からなるＶＬ－ＣＤＲ３を含む、
第１項～第１０項のいずれかに記載の処置剤または抑制剤。
［１２］Ｘ_１がＩであり、Ｘ_２がＫであり、Ｘ_３がＴである、第１１項に記載の処置剤または抑制剤。
［１３］抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第１項～第１２項のいずれかに記載の処置剤または抑制剤。
［１４］抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および／または、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む、第１項～第１３項のいずれかに記載の処置剤または抑制剤。
［１５］抗エンドグリン抗体がＴＲＣ１０５である、第１項～第１４項のいずれかに記載の処置剤または抑制剤。
［１６］ＶＥＧＦ阻害剤がＶＥＧＦ－Ａ阻害剤である、第１項～第１５項のいずれかに記載の処置剤または抑制剤。
［１７］ＶＥＧＦ阻害剤が、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、アフリベルセプト、コンベルセプトおよびアビシパーペゴールからなる群から選択される、第１項～第１６項のいずれかに記載の処置剤または抑制剤。
［１８］ＶＥＧＦ阻害剤が、抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合性フラグメントである、第１項～第１７項のいずれかに記載の処置剤または抑制剤。
［１９］抗ＶＥＧＦ抗体が、ラニビズマブ、ベバシズマブまたはブロルシズマブである、第１８項に記載の処置剤または抑制剤。
［２０］抗ＶＥＧＦ抗体がラニビズマブである、第１８項または第１９項に記載の処置剤または抑制剤。
［２１］硝子体内投与用である、第１項～第２０項のいずれかに記載の処置剤または抑制剤。

　本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。

遺伝子改変マウスにおけるミュラー細胞障害の誘導
　ミュラー細胞は、網膜の恒常性の維持に必須の多数の機能を有するグリア細胞である。ミュラー細胞の障害を誘導できるマウスモデルを構築するために、以前に記載された通りに（Shen W, Fruttiger M, Zhu L, et al., The Journal of neuroscience, 2012;32:15715-27; Shen W, Lee SR, Araujo J, et al. Glia. 2014;62:1110-24; Shen W, Zhu L, Lee SR, et al. Journal of neuroinflammation. 2013;10:137）、Ｒｌｂｐ－ＣｒｅＥＲ－ＤＴＡ１７６遺伝子改変マウスを生成した。簡潔に述べると、ミュラー細胞特異的な遺伝子ターゲティングのために、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ－Ｐアプローチにより、細胞特異的プロモーターとしてレチンアルデヒド結合タンパク質１（Ｒｌｂｐ１）遺伝子の調節領域の一部を使用する誘導可能遺伝子改変モデルを使用した。また、弱毒型のジフテリア毒素断片Ａ（ＤＴＡ１７６）遺伝子を有する遺伝子改変系統のマウスである、Ｒｏｓａ－ＤＴＡ１７６マウスを使用した。Ｒｌｂｐ１－ＣｒｅＥＲマウスとＲｏｓａ－ＤＴＡ１７６マウスを交配し、Ｒｌｂｐ－ＣｒｅＥＲ－ＤＴＡ１７６遺伝子改変マウスを生成した。８～１０週齢のＲｌｂｐ－ＣｒｅＥＲ－ＤＴＡ１７６マウスにおいて、タモキシフェンの腹腔内注射により、弱毒型のジフテリア毒素断片Ａ（ＤＴＡ１７６）をミュラー細胞特異的に発現させ、ミュラー細胞の障害を誘導した。Ｒｌｂｐ－ＣｒｅＥＲ－ＤＴＡ１７６遺伝子改変マウスにおいてミュラー細胞の障害を誘導すると、網膜血管新生、血管の漏出、網膜の線維化などの異常が生じ、一方で光受容体が破壊されることが知られている（Shen W, Fruttiger M, Zhu L, et al. 2012（上述）、Shen W, Zhu L, Lee SR, et al. 2013（上述））。タモキシフェン投与をしないＲｌｂｐ－ＣｒｅＥＲ－ＤＴＡ１７６遺伝子改変マウスを対照として使用した。

被験薬物の硝子体内注射
　以前に記載された通りに（Shen W, Fruttiger M, Zhu L, et al. 2012（上述）、Shen W, Lee SR, Araujo J, et al. 2014（上述）、Shen W, Zhu L, Lee SR, et al. 2013（上述））、マウスをケタミン（４８ｍｇ／ｋｇ）およびメデトミジン（０.６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、１％トロピカミドおよび０.５％フェニレフリンの１～２滴の点眼により瞳孔を散大させた後、３２ゲージ針を装着したハミルトンシリンジを使用して、被験薬物の硝子体内注射を実施した。硝子体内注射は、ミュラー細胞障害誘導の７日前、並びに、ミュラー細胞障害誘導の４週後および８週後に実施した。各眼に、抗マウスエンドグリンモノクローナル抗体（Ｍ１０４３（Nolan-Stevaux O, Zhong W, Culp S, et al. PloS one. 2012;7:e50920 参照）、２.７μｇ／μｌ）、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体である抗マウスＶＥＧＦ１６４抗体（２.５μｇ／μｌ、R&D Systems、#AF-493-NA）または両抗体の混合剤を、２μｌ／eye注射した。なお、両抗体の混合剤は、各抗体の２倍濃縮液をそれぞれ等量混合して調製した。対照として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を同様に注射した。

蛍光眼底造影検査
　網膜の脈管構造の変化をモニターするために、以前に記載された通りに（Shen W, Fruttiger M, Zhu L, et al. 2012（上述）、Shen W, Lee SR, Araujo J, et al. 2014（上述））、ミュラー細胞障害誘導の６週後および１０週後に蛍光眼底造影検査（ＦＦＡ）を実施した。具体的には、各マウスにおいて、１０％フルオレセインナトリウム０.０５ｍｌの腹腔内注射後、２～５分の間に画像を取得した。ミュラー細胞障害の誘導、硝子体内注射およびＦＦＡのスケジュールを図２に示す。

　ミュラー細胞障害誘導の６および１０週後の代表的なＦＦＡ画像を図３に示す。ミュラー細胞障害誘導の６週間後のＦＦＡにおいて、ＰＢＳのみを投与されたＭＣＫＯマウス（Ａ）では強い集中的な血管漏出を伴う病変が多数見られ、抗エンドグリン抗体（Ｃ）または抗ＶＥＧＦ抗体（Ｅ）を投与されたマウスでは病変は少なく、抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体を併用したマウス（Ｇ）では病変は見られなかった。ミュラー細胞障害誘導の１０週間後のＦＦＡにおいて、ＰＢＳのみを投与されたＭＣＫＯマウス（Ｂ）では病変が多数見られ、抗エンドグリン抗体を投与されたマウス（Ｄ）では少数の病変が見られ、抗ＶＥＧＦ抗体を投与されたマウス（Ｆ）では強い病変はなくびまん性の漏出が見られ、抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体を併用したマウス（Ｈ）ではこれらの異常は見られなかった。

　これらの画像に、以下の基準でスコア付けした（図４）。０：血管からの異常漏出のない正常なパターンのフルオレセイン眼底造影像、１：びまん性漏出が見られ、容易に病変を同定できるが、強い集中的な血管漏出はない、２：３個以下の強い集中的な血管漏出を伴う病変が見られる、３：４～６個の強い集中的な血管漏出を伴う病変が見られる、４：７個以上の強い集中的な血管漏出を伴う病変が見られる。スコアの平均値を図４に示す。抗エンドグリン抗体または抗ＶＥＧＦ抗体を投与されたマウスでは、ＰＢＳのみを投与されたマウスよりも有意にスコアが低く、抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体を併用したマウスではさらに低かった。

　ミュラー細胞障害誘導の１２週後に眼球を摘出し、網膜ホールマウント標本の免疫染色のために、眼杯を切開し、４％パラホルムアルデヒド中で１時間固定し、４℃でＰＢＳ中に置いた。翌日、網膜を単離し、グリオーシスを検出するための抗ＧＦＡＰ抗体（ウサギポリクローナル、１：２５０、Dako#Z0334）またはミクログリアを検出するための抗イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ１）抗体（１：４００、Wako#019-19741）を含有する溶液中で、標本をインキュベートした。網膜ホールマウント標本を共焦点レーザー走査顕微鏡にて観察・撮影し、以前に記載された通り（Shen W, Fruttiger M, Zhu L, et al. 2012（上述）、Shen W, Lee SR, Araujo J, et al. 2014（上述）、Shen W, Zhu L, Lee SR, et al. 2013（上述））、顕微鏡像を定量的に分析した。

　結果を図５および６に示す。ＧＦＡＰは、組織の線維化の前段階であるグリア細胞浸潤の指標として知られている。抗エンドグリン抗体または抗ＶＥＧＦ抗体を投与されたマウスでは、ＰＢＳのみを投与されたマウスよりも有意に抗ＧＦＡＰ抗体で染色された面積が小さく、抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体を併用したマウスではさらに小さかった。Ｉｂａ１は炎症に関連するミクログリアのマーカーとして知られている。抗エンドグリン抗体または抗ＶＥＧＦ抗体を投与されたマウスでは、ＰＢＳのみを投与されたマウスよりも有意に抗Ｉｂａ１抗体で染色された面積が小さく、抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体を併用したマウスではさらに小さかった。これらの結果は、抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体の併用により、網膜線維化の進行が抑制されることを示唆する。

ウェスタンブロッティング
　ミュラー細胞障害誘導の１２週後に眼球を摘出して網膜組織を採取し、網膜における標的タンパク質の発現量を評価するためにウェスタンブロッティングを実施した。具体的には、網膜サンプルをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した後、標的タンパク質に対する一次抗体（ＶＥＧＦ－Ａ（Novus Biologicals、Cat# NB100-664）、ＴＧＦβ－ｐａｎ（CST、Cat# 3711）、Ｓｍａｄ３（CST、Cat# 9523）、Ｐ－Ｓｍａｄ３（CST、Cat# 9520））とインキュベートした。その後、一次抗体に対応するホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート２次抗体とインキュベートし、標的タンパク質を G:Box BioImaging system（Syngene）を使用して可視化、定量化した。なお、α／β－チューブリン（CST、Cat# 2148）の発現量を用いて、標的タンパク質の発現量を補正した。

　結果を図７に示す。ＭＣＫＯマウスでは、対照マウスと比較してＴＧＦ－βおよびＶＥＧＦ－Ａの発現が高かった。ＭＣＫＯマウスと対照マウスでＳｍａｄ３の発現量には差が見られなかったが、リン酸化Ｓｍａｄ３の量はＭＣＫＯマウスで有意に高かった。抗エンドグリン抗体または抗ＶＥＧＦ抗体を投与されたマウスでは、ＰＢＳのみを投与されたマウスよりも有意にリン酸化Ｓｍａｄ３の量が少なく、抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体を併用したマウスではさらに少なかった。Ｓｍａｄ３のリン酸化は組織の線維化の指標として知られている。従って、これらの結果は、抗エンドグリン抗体と抗ＶＥＧＦ抗体の併用により、網膜の線維化が抑制されることを示唆する。

　本開示は、網膜線維化の抑制方法を提供するものであり、医療の分野で利用され得る。例えば、網膜線維化を伴う眼疾患の処置および／または予防、特に加齢黄斑変性の処置に利用されることが期待される。

Claims

　ＶＥＧＦ阻害剤と併用される、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む網膜線維化を伴う眼疾患の処置剤。
　抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
　重鎖可変領域が、アミノ酸配列ＤＡＷＭＤ（配列番号３）からなるＶＨ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＸ_１ＲＳＸ_２ＡＳＮＨＡＴＹＹＡＥＳＶＫＧ（ここで、Ｘ_１はＡまたはＩであり、Ｘ_２は、Ｋ、ＱまたはＲである）（配列番号４）からなるＶＨ－ＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＷＲＲＦＦＤＳ（配列番号５）からなるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、かつ、
　軽鎖可変領域が、アミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号６）からなるＶＬ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＸ_３ＳＮＬＡＳ（ここで、Ｘ_３はＴまたはＳである）（配列番号７）からなるＶＬ－ＣＤＲ２およびアミノ酸配列ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号８）からなるＶＬ－ＣＤＲ３を含む、
請求項１に記載の処置剤。
　Ｘ_１がＩであり、Ｘ_２がＫであり、Ｘ_３がＴである、請求項２に記載の処置剤。
　抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～３のいずれかに記載の処置剤。
　抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および／または、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む、請求項１～４のいずれかに記載の処置剤。
　抗エンドグリン抗体がＴＲＣ１０５である、請求項１～５のいずれかに記載の処置剤。
　ＶＥＧＦ阻害剤が抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１～６のいずれかに記載の処置剤。
　抗ＶＥＧＦ抗体が、ラニビズマブ、ベバシズマブまたはブロルシズマブである、請求項７に記載の処置剤。
　抗ＶＥＧＦ抗体がラニビズマブである、請求項７または８に記載の処置剤。
　眼疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、増殖性硝子体網膜症、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、ぶどう膜炎、虚血性視神経症からなる群から選択される、請求項１～９のいずれかに記載の処置剤。
　眼疾患が加齢黄斑変性である、請求項１～１０のいずれかに記載の処置剤。
　眼疾患が滲出型加齢黄斑変性である、請求項１～１１のいずれかに記載の処置剤。
　硝子体内投与用である、請求項１～１２のいずれかに記載の処置剤。
　ＶＥＧＦ阻害剤と併用される網膜線維化を伴う眼疾患の処置用の医薬を製造するための、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用。
　ＶＥＧＦ阻害剤と併用される、抗エンドグリン抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む網膜線維化の抑制剤。