JP7088454B2 - 抗体および抗体複合体 - Google Patents

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Description

優先権出願の参照による援用
本願と共に提出される出願データシート内において国外または国内の優先権主張をしたありとあらゆる出願が米国特許法施行規則第１．５７条に基づき参照により本明細書に援用される。
配列表
本願は電子形式の配列表と共に提出されている。その配列表はサイズが１８，２３１バイトの２０１６年１２月２８日に作成されたＫＤＩＡＫ００４．ｔｘｔというタイトルのファイルとして提供される。その配列表の電子形式の情報は全体が参照により本明細書に援用される。
本発明の分野
本発明は抗体および抗体複合体、ならびに前記抗体、前記抗体複合体、および他のタンパク質複合体の使用方法および製造方法に関する。
糖尿病網膜症は約２０歳から６４歳の間の年齢の人々における失明の主因である。Ｅｎｇｅｌｇａｕ Ｍ， Ｇｅｉｓｓ Ｌ， Ｓａａｄｄｉｎｅ Ｊ， Ｂｏｙｌｅ Ｊ， ｅｔ ａｌ． ２００４． Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｖｉｎｇ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ． Ａｎｎ ｏｆ Ｉｎｔ Ｍｅｄ． １４０ （１１）： ９４５－９５１。米国では糖尿病網膜症は失明の新患者のほぼ１２％を占める。糖尿病網膜症の場合、網膜の血管が膨潤し、眼の奥に体液を漏出することが典型的である。高血糖症により基底膜の壁内肥厚が誘導され、それにより漏出性または透過性の血管が生じる。
糖尿病網膜症では血糖値の変化により網膜の血管に変化が生じる。糖尿病を有する全員にリスクがある。糖尿病が長い人ほど何らかの眼の問題を発生するリスクが高い。糖尿病であると診断された４０パーセントから４５パーセントの間のアメリカ人があるステージの糖尿病網膜症を有する。Ｃａｕｓｅｓ ａｎｄ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒｓ． Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ． Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． １５ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００９。
糖尿病網膜症は最初に網膜内での毛細血管瘤の発生という形で現れる。網膜に栄養供給する毛細管（非常に小さい血管）の膨潤が存在する場合に毛細血管瘤が生じる。比較的に少数の毛細血管瘤の存在は通常では視力に問題を引き起こさない。しかしながら、網膜症がより後期のステージまで進展すると視力喪失の可能性がかなりある。このような早期ステージの網膜症は背景糖尿病網膜症または非増殖糖尿病網膜症（ＮＰＤＲ）と呼ばれる。ＮＰＤＲの患者には症状が無いことが一般的であるが、網膜症がより後期のステージまで進行すると視力喪失の可能性が非常に高いので前記疾患の早期検出が重要である。
糖尿病網膜症の次のステージでは眼の奥で血管新生が起こる（増殖性糖尿病網膜症）。その新生血管は漏出性であり、それらの血管が破け、続いて出血し、結果として視界がかすんだり、ぼやけたりすることがある。眼に酸素が欠乏しているために血管新生がさらに起こる。血管は網膜に沿って、そして硝子体液中に増殖する。これらの血管が破れるとさらに出血し、網膜がひどい損傷を受けるか、またはひどく破損される可能性がある。漏出
性血管に起因する黄斑内での体液の蓄積を糖尿病黄斑浮腫と呼ぶ。糖尿病網膜症の多くの患者が糖尿病黄斑浮腫を発症する。
糖尿病網膜症の患者には通常３種類の治療経路、すなわちレーザー手術、副腎皮質ステロイドの注射、および抗ＶＥＧＦ剤（例えばアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）およびアイリーア（登録商標）（アフリベルセプト））の注射が存在する。レーザー手術は糖尿病網膜症の治療に概ね有効であるが、レーザーにより生じる網膜の損傷が頻出する副作用である。トリアムシノロンアセトニドなどのステロイド調製物は糖尿病網膜症の治療のために硝子体内注射を介して投与されている。しかしながら、糖尿病網膜症を治療するためにはそのステロイド溶液を頻繁に投与することが必要である。また、ステロイドでの硝子体内治療には白内障、ステロイド誘導性緑内障、および眼内炎が関連付けられている。
糖尿病網膜症を治療するための別の方法は抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射である。この点に関し、糖尿病黄斑浮腫の患者における糖尿病網膜症の治療についてルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）およびアイリーア（登録商標）（アフリベルセプト）が最近になって認可された。ＶＥＧＦ指向性治療は糖尿病網膜症だけでなく、血管新生型（湿潤型）ＡＭＤなどの加齢黄斑変性（ＡＭＤ）にも有効である。
抗体の可変領域外にあるシステインにおいてホスホリルコリン含有重合体に結合した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体からなり、前記システインが組換えＤＮＡ技術によって付加されたものである抗体複合体を本明細書において提供する。所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は軽鎖と重鎖を有し、その重鎖はＦｃ領域を含む。所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。所望により前記システインは前記重鎖の前記Ｆｃ領域内にある。所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖はＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を含み、且つ、位置２２１（配列番号３内に見られる配列カウントを介した位置）がＴであり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖はＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）、およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）を含み、且つ、Ｋａｂａｔ位置４がＬである。所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖アイソタイプはヒトＩｇＧ１である。
所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体ＩｇＧ１の重鎖定常ドメインはＩｇＧ１定常ドメインと比べて１つ以上の変異を有することでエフェクター機能を調節する。それらの変異は所望により次のアミノ酸位置、すなわち、Ｘがいずれかの天然アミノ酸または非天然アミノ酸であるＥ２３３Ｘ、Ｌ２３４Ｘ、Ｌ２３５Ｘ、Ｇ２３６Ｘ、Ｇ２３７Ｘ、Ａ３２７Ｘ、Ａ３３０Ｘ、およびＰ３３１Ｘ（ＥＵ式付番）のうちの１つ以上のものである。所望によりそれらの変異はＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ（ＥＵ式付番）からなる群より選択される。所望によりそれらの変異はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）である。幾つかの実施形態では前記エフェクター機能が低下する。幾つかの実施形態ではＣＤＣ、ＡＤＣＣ、および／またはＡＤＣＰが少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、またはそれ以上低下する。幾つかの実施形態ではＣＤＣにはＣ１ｑへのＦｃの結合が介在し、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰには様々なＦｃγ受容体へのＦｃの結合が介在し、これらの結合相互作用の各々が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、またはそれ以上低下する。
前記システイン残基は所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖内にあり、且つ、所望により
Ｑ３４７Ｃ（ＥＵ式付番）またはＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）である。所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖は配列番号１であり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖の配列は配列番号２である。所望により前記システインはＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）である。
所望により前記ホスホリルコリン含有重合体は以下に示されるリン酸２－（メタクリロイルオキシエチル）－２’－（トリメチルアンモニウム）エチル（ＭＰＣ）単量体を含む。
Figure 0007088454000001
 前記重合体は以下の反復単位を含み、
Figure 0007088454000002
 式中、ｎは１から３０００までの整数であり、波線は前記重合体中の単量体単位間の接続点を表す。
前記重合体は所望により３本以上のアームを有し、または３か所以上の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される。所望により前記重合体は２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、もしくは１２本のアームを有し、または２か所、３か所、４か所、５か所、６か所、７か所、８か所、９か所、１０か所、１１か所、もしくは１２か所の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される。所望により前記重合体は２本、３本、６本、もしくは９本のアームを有し、または２か所、３か所、６か所、もしくは９か所の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される。所望により前記重合体は９本のアームを有し、または９か所の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される。
所望により前記重合体はサイズ排除クロマトグラフィー・多角度光散乱法（以後「ＳＥＣ－ＭＡＬＳ」）により測定されると約３００，０００と約１，７５０，０００Ｄａの間の分子量を有する。所望により前記重合体は約５００，０００と約１，０００，０００Ｄａの間の分子量を有する。所望により前記重合体は約６００，０００から約８００，０００Ｄａの間の分子量を有する。
所望により前記抗体複合体は精製され、前記重合体は多分散系である。所望により前記重合体は１．２未満の多分散度（ＰＤＩ）を有する。幾つかの実施形態では本明細書において提供される複合体溶液のうちのいずれも１．８以下、例えば、１．７以下、１．６以下、１．５以下、１．４以下、１．３以下、１．２以下、１．１以下、１以下である多分散度（ＰＤＩ）を有し得る。
所望により、重合体に結合した抗ＶＥＧＦ－Ａ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含む抗体複合体であって、前記重合体がＭＰＣ単量体を含み、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖の配列が配列番号１であり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖の配列が配列番号２であり、前記抗体が配列番号１中のＣ４４９においてのみ前記重合体に結合している前記抗体複合体。所望により前記重合体は９本のアームを有し、且つ前記重合体は約６００，０００から約８００，０００Ｄａの間の分子量を有する。
所望により、重合体に結合した抗ＶＥＧＦ－Ａ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含む抗体複合体であって、前記重合体がＭＰＣ単量体を含み、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖の配列が配列番号１であり、および前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖の配列が配列番号２であり、前記抗体がＣ４４３（ＥＵ式付番）においてのみ前記重合体に結合している前記抗体複合体。所望により前記重合体は９本のアームを有し、且つ前記重合体は約６００，０００から約８００，０００Ｄａの間の分子量を有する。
所望により前記抗体複合体は下記の構造を有し、
Figure 0007088454000003
 式中、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の各重鎖が文字Ｈで表され、且つ、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の各軽鎖が文字Ｌで表され、前記重合体が配列番号１中のＣ４４９のスルフヒドリルを介して前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に結合しており、その結合が前記重鎖のうちの１本の上に示されており、ＰＣが
Figure 0007088454000004
 であり、前記波線が残りの前記重合体の部分への接続点を表し、Ｘはａ）ＲがＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルであるＯＲ、ｂ）Ｈ、またはｃ）Ｂｒをはじめとするいずれかのハライドであり、且つ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８、およびｎ９の合計が２５００±１５％であるようにｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８、およびｎ９が同一または異なる。所望によりｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８、およびｎ９は独立して０から３０００までの整数である。所望によりｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８、およびｎ９は独立して０から５００までの整数である。幾つかの実施形態ではＸはＯＲであり、式中、Ｒは糖、アミノアルキルであるか、次の残基、すなわち飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル、不飽和Ｃ２～Ｃ２４アルケニルまたはＣ２～Ｃ２４アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボ
ニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボイルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノ、およびポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、－ＣＯ－Ｏ－Ｒ７、カルボニル－ＣＣＯ－Ｒ７、－ＣＯ－ＮＲ８Ｒ９、－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＲ７、－ＣＯ－（ＣＨ）ｎ－ＣＯＯＲ７、－（ＣＨ２）ｎ－ＮＲ８Ｒ９、エステル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルの単置換変異体、多重置換変異体、または非置換変異体であり、その中でｎは１から６までの整数であり、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は水素原子、ハロゲン原子、次の残基、すなわち飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル、不飽和Ｃ２～Ｃ２４アルケニルまたはＣ２～Ｃ２４アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボイルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノ、およびポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、５員環、および６員環の単置換変異体、多重置換変異体、または非置換変異体からなる群よりそれぞれ別々に選択される。
所望により前記抗体複合体は下記の構造を有し、
Figure 0007088454000005
 式中、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の各重鎖が文字Ｈで表され、且つ、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の各軽鎖が文字Ｌで表され、前記重合体がＣ４４３（ＥＵ式付番）のスルフヒドリルを介して前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に結合しており、その結合が前記重鎖のうちの１本の上に示されており、ＰＣが
Figure 0007088454000006
 であり、前記波線が残りの前記重合体の部分への接続点を表し、Ｘはａ）ＲがＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルであるＯＲ、ｂ）Ｈ、またはｃ）Ｂｒをはじめとするいずれかのハライドであり、且つ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９の合計が２５００±１５％であるようにｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９が同一または異なる。所望によりｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は独立して０から３０００までの整数である。所望によりｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は独立して０から５００までの整数である。幾つかの実施形態ではＸはＯＲであり、式中、Ｒは糖、アミノアルキルであるか、次の残基、すなわち飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル、不飽和Ｃ２～Ｃ２４アルケニルまたはＣ２～Ｃ２４アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキ
シ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボイルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノ、およびポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、－ＣＯ－Ｏ－Ｒ７、カルボニル－ＣＣＯ－Ｒ７、－ＣＯ－ＮＲ８Ｒ９、－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＲ７、－ＣＯ－（ＣＨ）ｎ－ＣＯＯＲ７、－（ＣＨ２）ｎ－ＮＲ８Ｒ９、エステル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルの単置換変異体、多重置換変異体、または非置換変異体であり、その中でｎは１から６までの整数であり、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は水素原子、ハロゲン原子、次の残基、すなわち飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル、不飽和Ｃ２～Ｃ２４アルケニルまたはＣ２～Ｃ２４アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボイルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノ、およびポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、５員環、および６員環の単置換変異体、多重置換変異体、または非置換変異体からなる群よりそれぞれ別々に選択される。
幾つかの実施形態では液体溶液状の上記のような抗体複合体が提供される。所望により前記液体溶液は薬学的に許容可能な担体を有する。
幾つかの実施形態では重鎖と軽鎖を有する抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が提供される。その重鎖はＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を含み、且つ、位置２２１（配列番号３内に見られる配列カウントを介した位置）がＴであり、その軽鎖はＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）、およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）を含み、且つ、Ｋａｂａｔ位置４がＬである。所望により前記重鎖アイソタイプはＩｇＧ１であり、前記ＩｇＧ１定常ドメインが次の変異、すなわちＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ（ＥＵ式付番）のうちの１つ以上を含むことでエフェクター機能を調節する。所望により前記抗体はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）を有する。所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖の配列は配列番号１であり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖の配列は配列番号２である。
幾つかの実施形態では眼疾患の治療または予防のための方法が提供される。その方法は上記のような抗体複合体、または上記の医薬組成物を投与することを含む。所望により前記眼疾患は糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜中心分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、結膜下出血、および高血圧性網膜症からなる群より選択される。所望により前記疾患は糖尿病網膜症である。
幾つかの実施形態ではホスホリルコリン含有重合体に複合体化された抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体を含む抗体複合体の作製方法が提供される。その方法はホスホリルコリン含有重合体に抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体を複合体化するステップを含み、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は組換えＤＮＡ技術を介して付加されたシステイン残基を含み、前記システインが前記抗体の可変領域外にあり、前記ホスホリルコリン含有重合体がマレイミド、ビニルスルホン、オルトピリジルジスルフィド、およびヨードアセトアミドからなる群より選択されるスルフヒドリ
ル特異的反応基を含み、且つ、前記ホスホリルコリン含有重合体上の前記スルフヒドリル特異的反応基が前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体上の前記システイン残基と反応して前記抗体複合体を形成する。
所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であり、前記システインは前記抗体のＦｃ領域内に存在する。所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は軽鎖と重鎖を有し、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体重鎖はＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を含み、且つ、位置２２１（配列番号３内に見られる配列カウントを介した位置）がＴであり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体軽鎖はＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）、およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）を含み、且つ、Ｋａｂａｔ位置４がＬである。所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体重鎖アイソタイプはＩｇＧ１である。
所望により前記ＩｇＧ１定常ドメインはＩｇＧ１定常ドメインと比べて１つ以上の変異を有することでエフェクター機能を調節する。所望によりそれらの変異は次のアミノ酸位置、すなわち、Ｘがいずれかの天然アミノ酸または非天然アミノ酸であるＥ２３３Ｘ、Ｌ２３４Ｘ、Ｌ２３５Ｘ、Ｇ２３６Ｘ、Ｇ２３７Ｘ、Ｇ２３６Ｘ、Ｄ２７０Ｘ、Ｋ３２２Ｘ、Ａ３２７Ｘ、Ｐ３２９Ｘ、Ａ３３０Ｘ、Ａ３３０Ｘ、Ｐ３３１Ｘ、およびＰ３３１Ｘ（ＥＵ式付番）のうちの１つ以上のものである。所望によりそれらの変異はＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ（ＥＵ式付番）からなる群より選択される。所望によりそれらの変異はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）である。
所望により組換えＤＮＡ技術により付加された前記システイン残基はＱ３４７Ｃ（ＥＵ式付番）およびＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）からなる群より選択される。所望により組換えＤＮＡ技術により付加された前記システイン残基はＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）である。所望により前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖の配列は配列番号１であり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖の配列は配列番号２である。
所望により前記ホスホリルコリン含有重合体は以下に示されるリン酸２－（メタクリロイルオキシエチル）－２’－（トリメチルアンモニウム）エチル（ＭＰＣ）単量体を含む。
Figure 0007088454000007
 前記重合体は以下の反復単位を含み、
Figure 0007088454000008
 式中、ｎは１から３０００までの整数であり、波線は前記重合体中の単量体単位間の接続点を表す。
所望により前記重合体は３本以上のアームを有する。所望により前記重合体は２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、または１２本のアームを有する。所望により前記重合体は２本、３本、６本、または９本のアームを有する。所望により前記重合体は９本のアームを有する。
所望により前記重合体は約３００，０００と１，７５０，０００Ｄａとの間の分子量を有する。所望により前記重合体は約５００，０００と１，０００，０００Ｄａとの間の分子量を有する。所望により前記重合体は約６００，０００から８００，０００Ｄａの間の分子量を有する。
所望により前記方法は還元システインスルフヒドリル基を作製する条件下において前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体をチオール還元剤と接触させて全てのシステイン残基が還元されている還元型抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体を作製することを含む追加のステップを有する。所望により前記チオール還元剤はトリス［２－カルボキシエチル］ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、システイン塩酸塩、およびシステインからなる群より選択される。所望により前記チオール還元剤はＴＣＥＰである。所望により前記チオール還元剤は前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の濃度と比べて１倍と１００倍の間でモル過剰である。所望により前記チオール還元剤は前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の濃度と比べて２０倍と５０倍の間でモル過剰である。
所望により前記方法は前記還元型抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体から前記チオール還元剤を除去するステップ、および前記還元型抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体を酸化剤で処理するステップをさらに含む。所望により前記酸化剤は空気、ＣｕＳＯ４水溶液、またはデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）である。所望により前記方法は前記抗体複合体を精製するステップをさらに含む。
所望により前記抗体複合体はイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびそれらの組合せからなる群より選択される技法を用いて精製される。所望により前記精製済み抗体複合体は非複合体型抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体と比べて少なくとも２０％の生物活性
を保持する。所望により前記精製済み抗体複合体は非複合体型抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体と比べて少なくとも５０％の生物活性を保持する。所望により前記精製済み抗体複合体は非複合体型抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体と比べて少なくとも９０％の生物活性を保持する。所望により前記精製済み抗体複合体は非複合体型抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体と比べて増加した半減期を有する。所望により前記精製済み抗体複合体は非複合体型抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体と比べて少なくとも１．５倍に増加した半減期を有する。
所望により前記方法は重合媒体中のフリーラジカル重合性ホスホリルコリン含有単量体を重合して前記ホスホリルコリン含有重合体を提供するステップをさらに含み、前記媒体は、前記ラジカル重合性ホスホリルコリン含有単量体、Ｍｔが遷移金属であり、ｑが前記金属の最大酸化状態であり、且つ、ｑ－１が前記金属の酸化状態であり、前記金属が触媒として作用し得る遷移金属触媒Ｍｔ （ｑ－１）＋であって、Ｘ’が対イオンまたは基であるＭｔ （ｑ－１）＋Ｘ’（ｑ－１）という形態の塩として供給される前記遷移金属触媒、または前記遷移金属を酸化不活性状態から還元活性状態に還元することが可能である還元剤と共に最高の酸化状態にある前記不活性金属塩Ｍｔ ｑ＋Ｘ’ｑを提供することによりインサイチュで供給される前記遷移金属触媒、リガンド、および開始剤を含む。
所望により前記ラジカル重合性ホスホリルコリン含有単量体は
Figure 0007088454000009
 であり、式中、Ｒ１がＨまたはＣ１～６アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４がそれぞれメチルであり、且つＸおよびＹがそれぞれ２である。
所望によりＭｔはＣｕ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｍｎ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｃｏ、Ｖ、Ｚｎ、Ａｕ、およびＡｇからなる群より選択される。所望により前記金属触媒はＭｔ （ｑ－１）＋Ｘ’（ｑ－１）という形態の塩として供給される。所望によりＭｔ （ｑ－１）＋はＣｕ１＋、Ｆｅ２＋、Ｒｕ２＋、Ｃｒ２＋、Ｍｏ２＋、Ｗ２＋、Ｍｎ３＋、Ｒｈ３＋、Ｒｅ２＋、Ｃｏ＋、Ｖ２＋、Ｚｎ＋、Ａｕ＋、およびＡｇ＋からなる群より選択され、且つ、Ｘ’はハロゲン、Ｃ１～６アルコキシ、（ＳＯ４）１／２、（ＰＯ４）１／３、（Ｒ７ＰＯ４）１／２、（Ｒ７２ＰＯ４）、トリフレート、ヘキサフルオロホスフェート、メタンスルホネート、アリールスルホネート、ＣＮ、およびＲ７がＨまたはハロゲンで１回から５回にわたって置換されてもよい直鎖もしくは分岐Ｃ１～６アルキル基であるＲ７ＣＯ２からなる群より選択される。所望によりＭｔ （ｑ－１）＋はＣｕ１＋であり、Ｘ’はＢｒである。所望によりＭｔ （ｑ－１）＋はインサイチュで供給される。所望によりＭｔ ｑ＋ＸｑはＣｕＢｒ２である。
所望により前記還元剤は無機化合物である。所望により前記無機化合物は低酸化レベルの硫黄化合物、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、金属イオンを含む無機塩、金属、ヒドラジン水和物、およびそのような化合物の誘導体からなる群より選択される。
所望により前記還元剤は金属である。所望により前記還元剤はＣｕ０である。
所望により前記還元剤は有機化合物である。所望により前記有機化合物がアルキルチオール類、メルカプトエタノール、または容易にエノール化され得るカルボニル化合物、アスコルビン酸、アセチルアセトネート、カンファースルホン酸、ヒドロキシアセトン、還元糖、単糖類、グルコース、アルデヒド、およびそのような有機化合物の誘導体からなる群より選択される。
所望により前記リガンドは２，２’－ビピリジン、４，４’－ジ－５－ノニル－２，２’－ビピリジン、４，４－ジノニル－２，２’－ジピリジル、４，４’，４’’－トリス（５－ノニル）－２，２’：６’，２’’－テルピリジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’－ペンタメチルジエチレントリアミン、１，１，４，７，１０，１０－ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、トリス（２－ジメチルアミノエチル）アミン、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ピリジルメチル）オクタデシルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ［（２－ピリダル）メチル］エチレンジアミン、トリス［（２－ピリジル）メチル］アミン、トリス（２－アミノエチル）アミン、トリス（２－ビス（３－ブトキシ－３－オキソプロピル）アミノエチル）アミン、トリス（２－ビス（３－（２－エチルヘキソキシ）－３－オキソプロピル）アミノエチル）アミン、およびトリス（２－ビス（３－ドデコキシ－３－オキソプロピル）アミノエチル）アミンからなる群より選択される。所望により前記リガンドが２，２’－ビピリジンである。
所望により前記開始剤は以下の構造を有し、
Figure 0007088454000010
 式中、Ｒ１が求核性反応基であり、Ｒ２がリンカーを含み、Ｒ３が以下の構造を有する重合体合成開始剤部分を含み、
Figure 0007088454000011
 式中、Ｒ４およびＲ５は同一または異なっており、且つ、アルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アリール、アリレン、アリレンオキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミド、およびそれらのあらゆる組合せからなる群より選択され、ＺがハロゲンまたはＣＮであり、ｓが１と２０の間の整数である。
所望によりＺはＢｒであり、Ｒ４およびＲ５はそれぞれメチルである。所望によりＲ１はＮＨ２－、ＯＨ－、およびＳＨ－からなる群より選択される。所望によりＲ１はＮＨ２－である。所望によりＲ２はアルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘ
テロシクロアルキレン、アリール、アリレン、アリレンオキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミド、およびそれらのあらゆる組合せである。所望によりＲ２は
Figure 0007088454000012
 であり、式中、ＸおよびＹが同一または異なっており、且つ、１から２０までの整数である。
所望によりＸおよびＹはそれぞれ４である。所望によりＲ３は
Figure 0007088454000013
 をさらに含み、式中、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が同一または異なっており、且つ、
Figure 0007088454000014
Figure 0007088454000015
 および
Figure 0007088454000016
 からなる群より選択され、式中、ＺがＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。所望によりＺはＢｒである。所望によりＲ６、Ｒ７、およびＲ８はそれぞれ
Figure 0007088454000017
 である。
所望により前記開始剤は以下の構造を有し、
Figure 0007088454000018
 式中、ＡおよびＢが同一または異なっており、且つ、２から１２までの整数であり、ＺがＢｒなどのいずれかのハライドである。所望によりＡおよびＢはそれぞれ４である。
所望により前記方法は前記重合体をマレイミド試薬と反応させてマレイミド末端を有する重合体を提供するステップをさらに含む。所望により前記マレイミド化合物は
Figure 0007088454000019
 である。
幾つかの実施形態では本明細書において提供される前記選択肢は他の治療方法または治療形態についての１つ以上の問題を回避する。例えば、硝子体内注射は痛みを与えるものであり得、且つ、臨床背景を必要とするため、前記選択肢により１か月に１回未満の硝子体内注射の頻度まで投与頻度を減らすことができる。さらに、視力が比較的に低下していない糖尿病網膜症患者は毎月の硝子体内注射に抵抗を示す可能性があり、したがって他の治療形態の下では治療しないで済ます場合があり得る。したがって、投与頻度が低い糖尿病網膜症治療法の必要性が存在する。この背景で糖尿病網膜症の進行および付随する視力に対する脅威となる事象を防止するために前記疾患の治療法が前記疾患の早期において使用される可能性がある。
幾つかの実施形態では前記抗体複合体は（１）抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体と（２）ホスホリルコリン含有重合体を含む。その重合体はその抗体の可変領域外にあるシステインにおいてその抗体に共有結合しており、そのシステインは組換えＤＮＡ技術によって付加されたものである。
幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体重鎖はＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を含み、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖はＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）、およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）を含む。
幾つかの実施形態では前記抗体に複合体化された前記重合体はサイズ排除クロマトグラフィー・多角度光散乱法（以後「ＳＥＣ－ＭＡＬＳ」）により測定されると約３００，０００と約１，７５０，０００Ｄａの間の分子量を有する。
幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は重鎖と軽鎖を有する。その重鎖はＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を含み、前記軽鎖はＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）、およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）を含み、前記重鎖アイソタイプはＩｇＧ１である。前記ＩｇＧ１定常ドメインはエフェクター機能を低下させるために次の変異、すなわちＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ（ＥＵ式付番）のうちの１つ以上を含む。
幾つかの実施形態では前記方法のうちのいずれも、軽鎖と重鎖を有する抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体であって、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体重鎖がＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を含み、前記抗ＶＥＧＦ－
Ａ抗体軽鎖がＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）、およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）を含む前記抗体を使用し得る。
幾つかの実施形態では前記抗体は配列番号１を含む重鎖アミノ酸可変領域と配列番号２を含む軽鎖アミノ酸可変領域を含む。
幾つかの実施形態では前記抗体はヒトＩｇＧ１であり、前記重鎖定常ドメインは免疫介在性エフェクター機能を低下させる１つ以上の変異を含む。
幾つかの実施形態では前記抗体が重合体にさらに複合体化して生体複合体をさらに形成し、前記生体複合体は約４５０，０００と１，９００，０００ダルトンとの間の分子量を有する。
幾つかの実施形態では多分散度（ＰＤＩ）は１．５以下である。
幾つかの実施形態ではＶＥＧＦ－Ａに結合する前記抗体は配列番号１内のＣＤＲＨ１であるＣＤＲＨ１、配列番号１内のＣＤＲＨ２であるＣＤＲＨ２、配列番号１内のＣＤＲＨ３であるＣＤＲＨ３、配列番号２内のＣＤＲＬ１であるＣＤＲＬ１、配列番号２内のＣＤＲＬ２であるＣＤＲＬ２、配列番号２内のＣＤＲＬ３であるＣＤＲＬ３、次の変異、すなわちＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）のうちの少なくとも１つ、および次の変異のうちの少なくとも１つ、すなわちＱ３４７Ｃ（ＥＵ式付番）またはＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）を含む。
幾つかの実施形態では前記抗体は次の変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）の３変異の全てを含み、且つ、前記抗体はＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）を含む。
幾つかの実施形態では複合体化タンパク質を調製するための製法は、タンパク質内の１つ以上のシステインを還元して溶液中にキャップ除去済みタンパク質を形成すること、前記キャップ除去済みタンパク質を再酸化して前記還元型タンパク質内に少なくとも１つのジスルフィド結合を再建し、一方で前記タンパク質内の改変システイン残基が遊離チオール状態のままであることで前記溶液中に再酸化キャップ除去済みタンパク質を形成すること、および前記溶液に少なくとも１種類の賦形剤を添加し、重合体誘導性タンパク質沈殿を前記賦形剤により減少させることを含む。前記製法は前記溶液に重合体を添加すること、および前記改変システイン残基において前記再酸化キャップ除去済みタンパク質に前記重合体を複合体化して複合体化タンパク質を形成することをさらに含む。幾つかの実施形態では前記タンパク質は抗体、抗体タンパク質融合体、またはその結合性断片である。幾つかの実施形態では前記賦形剤は酸または塩基である。幾つかの実施形態では前記賦形剤は界面活性剤、糖、および荷電アミノ酸のうちの少なくとも１つからなる群より選択される。幾つかの実施形態では前記還元型タンパク質と重合体の反応はｐＨ６．０とｐＨ８．５との間の水性条件下で生じる。幾つかの実施形態では前記還元型タンパク質の量は前記重合体の量よりも少ない。幾つかの実施形態では前記重合体は２～３７セルシウス度で前記タンパク質に複合体化される。幾つかの実施形態では前記製法は前記複合体化タンパク質を含む溶液をイオン交換媒体、または疎水性相互作用クロマトグラフィーもしくはアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させる処理をさらに含む。幾つかの実施形態では前記イオン交換媒体、または疎水性相互作用クロマトグラフィーもしくはアフィニティークロマトグラフィー媒体によって前記遊離重合体および前記再酸化キャップ除去済みタンパク質から前記複合体化タンパク質が分離される。幾つかの実施形態では前記重合体が双性イオンを含む。幾つかの実施形態では前記重合体はホスホリルコリンを含む。幾つか
の実施形態では前記重合体が重合体分岐点の中心を前記マレイミド官能基に架橋するＰＥＧリンカーを含む。
幾つかの実施形態ではＶＥＧＦリガンドとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用の少なくとも９０％を阻害することが可能である抗ＶＥＧＦ抗体複合体が提供される。
幾つかの実施形態ではＶＥＧＦリガンドとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用の少なくとも９５％を阻害する抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。
幾つかの実施形態ではＶＥＧＦリガンドとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用の少なくとも９０％を阻害する抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。
化合物Ｌを示す図である。 化合物Ｋを示す図である。 Ｒ３７０７からのＯＧ１８０２の合成を示す図である。 ＯＧ１７８６を示す図である。 ＯＧ１５５０からのＯＧ１５４６の合成を示す図である。 ＯＧ１５４６およびＯＧ１５６３からのＯＧ１７８４の合成を示す図である。 ＯＧ１７８４からのＯＧ１４０５の合成を示す図である。 ＯＧ１４０５からのＯＧ１７８５の合成を示す図である。 ＯＧ１７８５からのＯＧ１７８６の合成を示す図である。 ＯＧ１８０２を示す図である。 化合物Ｅを示す図である。 ある特定のエフェクター機能変異とＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番で配列番号１内の位置４４９である）を有する抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖の幾つかの実施形態を示す図である。 抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖（配列番号２）の幾つかの実施形態を示す図である。 ベバシズマブ重鎖（配列番号３）の幾つかの実施形態を示す図である。 ベバシズマブ軽鎖（配列番号４）の幾つかの実施形態を示す図である。 ラニビズマブ重鎖（配列番号５）の幾つかの実施形態を示す図である。 ラニビズマブ軽鎖（配列番号６）の幾つかの実施形態を示す図である。 抗体複合体を調製するための方法の幾つかの実施形態を示す図である。 反応Ａから反応Ｇまでのイオン交換体分析（Ａ２８０吸光度）を示す図である。 プレート結合ＶＥＧＦＲ ＥＣＤ－Ｆｃタンパク質へのビオチン－ＶＥＧＦの結合に対する様々な抗ＶＥＧＦ分子の効果、およびそれらの効果のＩＣ５０値を示す図である。 ＢＩＡｃｏｒｅシングルサイクルカイネティクスにより測定されたＶＥＧＦへのＯＧ１９５０結合親和性を示す図である。 Ｆｃγ受容体ＩへのＯＧ１９５０の結合を示す図である。 Ｆｃγ受容体ＩＩＩａへのＯＧ１９５０の結合を示す図である。 ヒト補体タンパク質Ｃ１ｑへのＱＧ１９５０の結合を示す図である。 増殖アッセイの結果（ＩＣ５０値を含む）を示す図である。 抗ＶＥＧＦ剤へのＶＥＧＦ結合のシングルサイクルカイネティクスの結果を示す図である。 重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸配列の幾つかの実施形態を示す図である。 ２～８セルシウス度で２０時間にわたって重合体溶液（ＯＧ１８０２）中で様々な試料（様々な賦形剤）を保温した後でのスクリーニングの結果を示す図である。
抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体を本明細書において提供する。幾つかの実施形態ではこれらの抗体を半減期延長部分に複合体化することができる。幾つかの実施形態ではその複合体は糖尿病網膜症および／または加齢黄斑変性などのある特定の症状の治療のために使用可能である。
抗体（あらゆる種類の抗体）の複合体組成物を調製するための方法が本明細書においてさらに提供される。幾つかの実施形態ではこれらの方法によってその所望の抗体複合体の凝集体形成の低下またはその所望の複合体の作製効率の上昇が可能になる。
これらの実施形態および追加の実施形態を以下に提供する前に定義セクションを提供する。
定義
「血管新生障害」は血管形成の変化、調節不全、または非調節を特徴とする障害または疾患状態である。血管新生障害の例には腫瘍性形質転換（例えば癌）ならびに糖尿病網膜症および加齢黄斑変性をはじめとする眼血管新生障害が挙げられる。
「眼血管新生」障害は患者の眼における血管形成の変化、調節不全、または非調節を特徴とする障害である。そのような障害には視神経乳頭血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、硝子体血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、血管性網膜症、網膜変性、ブドウ膜炎、網膜炎症性疾患、および増殖性硝子体網膜症が含まれる。
抗体という用語には完全抗体およびそれらの結合性断片が含まれる。結合性断片は、完全抗体の一部分を含む完全抗体以外の分子であって、その完全抗体が結合する抗原に結合する前記分子を指す。結合性断片の例にはＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ディアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、および複数の抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体はＨｏｕｓｔｏｎ ＪＳ． １９９１． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３：４６－９６に記載されている。さらに、抗体断片にはＶＨドメインの特徴またはＶＬドメインの特徴を有し、すなわちＶＬドメインと一体になって、またはＶＨドメインと一体になって機能性抗原結合部位になり、それによって全長型抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドが含まれる。
ある抗体の標的抗原への特異的結合は少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ－１の親和性を意味する。特異的結合は少なくとも１種類の非関連標的に対して生じる非特異的結合よりも高い程度で検出可能であり、且つ、その非特異的結合と識別可能である。特異的結合は特定の官能基間での結合の形成または特定の空間的適合（例えば、鍵と鍵穴タイプのもの）の結果であり得、一方で非特異的結合は通常ではファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的結合は抗体または融合タンパク質が１種類且つ唯一の標的に結合することを必ずしも意味しない。
基本的抗体構造単位はサブユニットの四量体である。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、それぞれの対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１本の「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は主に抗原認識に寄与する約１００～１１０アミノ酸またはそれより多くのアミノ酸からなる可変領域を含む。この可変領域は最初に切断可能なシグナルペプチドに連結された状態で発現される。そのシグナルペプ
チドを含まない可変領域は成熟型可変領域と呼ばれることがある。したがって、例えば、軽鎖成熟型可変領域は軽鎖シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域を意味する。しかしながら、可変領域への言及はシグナル配列が必ず存在することを意味せず、実際には抗体または融合タンパク質が発現され、分泌されるとシグナル配列は切断される。一対の重鎖可変領域と軽鎖可変領域によって抗体の結合領域が規定される。軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分はそれぞれ軽鎖定常領域と重鎖定常領域を規定する。重鎖定常領域はエフェクター機能に主に寄与する。ＩｇＧ抗体では重鎖定常領域ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域に分割される。ＣＨ１領域はジスルフィド結合および非共有結合によって軽鎖定常領域に結合する。ヒンジ領域は抗体の結合領域とエフェクター領域との間に柔軟性を提供し、また、四量体サブユニット中の２か所の重鎖定常領域の間での分子間ジスルフィド結合のための部位も提供する。ＣＨ２領域およびＣＨ３領域はエフェクター機能およびＦｃＲ結合のための主要部位である。
軽鎖はκまたはλのどちらかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεとして分類され、抗体のアイソタイプがそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥとして定義される。軽鎖および重鎖内では可変領域と定常領域が約１２アミノ酸以上の「Ｊ」断片によって接続され、重鎖には約１０アミノ酸以上の「Ｄ」断片も含まれる（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ， Ｗ．ら著、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、１９８９年）第７章を参照されたい）（全ての目的のためにその全体が参照により援用される）。
各軽鎖重鎖対の成熟型可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、完全抗体は２つの結合部位を有し、すなわち、二価である。天然抗体ではそれらの結合部位は同じである。しかしながら、２つの結合部位が異なる二特異性抗体を作製することができる。（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ Ｓ， Ｌａｃｈｍａｎｎ ＰＣ． １９９０． Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ： ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９：３１５－３２１； Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ＳＡ， Ｃｏｌｅ ＭＳ， Ｔｓｏ
ＪＹ． １９９２． Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： １５４７－１５５３を参照されたい）。可変領域は全てが、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域が比較的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）に接続した同一の一般的構造を示す。各対の２本の鎖のＣＤＲがフレームワーク領域によって整列し、特定のエピトープに結合することが可能になる。軽鎖と重鎖の両方がＮ末端からＣ末端までにＦＲｌドメイン、ＣＤＲｌドメイン、ＦＲ２ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン、ＦＲ３ドメイン、ＣＤＲ３ドメイン、およびＦＲ４ドメインを含む。便宜上、可変重鎖ＣＤＲをＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と呼ぶことができ、可変軽鎖ＣＤＲをＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と呼ぶことができる。各ドメインへのアミノ酸の割当てはＫａｂａｔ ＥＡら、１９８７年および１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（メリーランド州、ベセスダ、米国国立衛生研究所）またはＣｈｏｔｈｉａ Ｃ， Ｌｅｓｋ ＡＭ． １９８７． Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ， ｅｔ ａｌ． １９８９． Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３の定義に準拠する。Ｋａｂａｔは異なる重鎖可変領域間または異なる軽鎖可変領域間で対応する残基に同じ番号が割り当てられる広く使用される付番法（Ｋａｂａｔ式付番）も提供する。抗体定常領域についてＫａｂａｔ式付番を使用することができるが、本願の場合のようにＥＵ式付番がより一般的に使用される。本明細書において開
示される例となる抗体について特定の配列が挙げられるが、それらの分子の一部または全てにおいてタンパク質鎖の発現後に軽鎖および／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端の１個から数個のアミノ酸、特に重鎖Ｃ末端リシン残基が失われているか、誘導体化されている場合があることが理解される。
「エピトープ」という用語は抗体または細胞外捕捉断片が結合する抗原上の部位を指す。タンパク質上のエピトープは連続アミノ酸、または１つ以上のタンパク質の三次元折り畳みによって並置される非連続アミノ酸から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープ（直鎖状エピトープとしても知られる）は変性溶媒に曝露されても保持されることが典型的である。
一方、三次元折り畳みによって形成されるエピトープ（立体構造エピトープとしても知られる）は変性溶媒で処理されると失われることが典型的である。エピトープは特有の空間的立体構成の中に少なくとも３アミノ酸、および通常ではそれより多くのアミノ酸、少なくとも５アミノ酸または８～１０アミノ酸を含むことが典型的である。エピトープの空間的立体構成を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴法が含まれる。例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇｌｅｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編、（１９９６年）内のＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。
同一のエピトープ、または重複するエピトープを認識する抗体は、１種類の抗体が別の抗体の標的抗原への結合について競合する能力を示す単純な免疫アッセイにおいて特定され得る。抗体のエピトープは接触残基を特定するために抗原に結合したその抗体（またはＦａｂ断片）のＸ線結晶学によっても特定され得る。
あるいは、２種類の抗体は、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原中の全てのアミノ酸変異が他方の抗体の結合も低減または排除する場合に同一のエピトープを有する。２種類の抗体は、一方の抗体の結合を低減または排除する幾つかのアミノ酸変異が他方の抗体の結合も低減または排除する場合に重複性のエピトープを有する。
抗体間の競合は基準抗体の共通抗原への特異的結合が試験中の抗体によって阻害されるアッセイによって決定される（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０： １４９５， １９９０を参照されたい）。過剰量の試験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍）が基準抗体の結合を少なくとも５０％阻害する場合にその試験抗体はその基準抗体と競合する。幾つかの実施形態では試験抗体は競合結合アッセイにおいて測定されると基準抗体の結合を７５％、９０％、または９９％阻害する。競合アッセイによって特定された抗体（競合抗体）には基準抗体と同じエピトープに結合する抗体、および立体障害が生じるほどに基準抗体が結合するエピトープから充分に近傍の隣接するエピトープに結合する抗体が含まれる。
「患者」という用語には予防処置または治療処置のどちらかを受けるヒト対象および他の哺乳類対象が含まれる。
アミノ酸置換を保存的置換または非保存的置換として分類する目的のため、アミノ酸は次のように分類される：グループＩ（疎水性側鎖）：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；グループＶ（鎖の配向に影響する残基）：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。保存的置換には同じクラスのアミノ酸間の置換が関わる。非保存的置換はこれらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラ
スのメンバーについて交換することからなる。
パーセンテージ配列同一性は、可変領域のＫａｂａｔ式付番法または定常領域のＥＵ式付番により最大になるように整列された抗体配列を用いて決定される。整列の後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全成熟型可変領域）が基準抗体の同領域と比較されている場合、その対象抗体領域と基準抗体領域との間のパーセンテージ配列同一性は、その対象抗体領域と基準抗体領域の両方において同じアミノ酸で占められる位置の数を、ギャップを数えないそれらの２つの領域の整列した位置の総数で除算したものに１００を乗算してパーセンテージに変換したものである。他の配列の配列同一性はウィスコンシン州マディソン、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．にあるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
ＧｒｏｕｐのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０内に含まれるＢＥＳＴＦＩＴ、 ＦＡＳＴＡ、 および ＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムと初期ギャップパラメーターを使用して配列を整列させることにより、または目視検査と最良の（すなわち、比較ウィンドウで最も高いパーセンテージの配列類似性になる）整列により決定可能である。配列同一性のパーセンテージは２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウ上で比較し、両方の配列において同一の残基が現れる位置の数を決定してマッチする位置の数を数え、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算し、配列同一性のパーセンテージを得るためにその結果に１００を乗算することにより算出される。
１つ以上の列挙された要素を「含む」組成物または方法には具体的に列挙されていない他の要素が含まれる場合がある。例えば、抗体を含む組成物は抗体を単独で含有してもよく、他の成分と組み合わせて含有してもよい。
「抗体依存性細胞傷害」またはＡＤＣＣという用語は、溶解活性を有する免疫細胞（エフェクター細胞とも呼ばれる）と抗体被覆標的細胞（すなわち、結合抗体を含む細胞）の相互作用に依存する細胞死を誘導するメカニズムである。そのようなエフェクター細胞にはナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ、および好中球が含まれる。細胞に結合した抗体のＦｃ領域と好中球、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞などの免疫エフェクター細胞上のＦｃｙ受容体、特にＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩとの間の相互作用によってＡＤＣＣが引き起こされる。その標的細胞は介在性エフェクター細胞の種類に応じて食作用または溶解によって排除される。抗体被覆標的細胞の死はエフェクター細胞活性の結果として生じる。
オプソニン作用という用語は「抗体依存性細胞貧食作用」またはＡＤＣＰとしても知られており、免疫グロブリンＦｃ領域に結合する食作用性免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球、および樹状細胞）によって抗体被覆細胞が全体的または部分的に内部化される過程を指す。
「補体依存性細胞傷害」またはＣＤＣという用語は、標的結合抗体のＦｃエフェクタードメインが最終的に標的細胞の膜に穴を形成することになる一連の酵素反応を活性化する細胞死を誘導するメカニズムを指す。典型的なことに、抗体被覆標的細胞上の抗原抗体複合体のような抗原抗体複合体は補体成分Ｃｌｑに結合、それを活性化し、その補体成分が次に標的細胞の死につながる補体カスケードを活性化する。補体の活性化は標的細胞表面上への補体成分の沈着を引き起こし、白血球上の補体受容体（例えば、ＣＲ３）への結合によりＡＤＣＣを促進する場合もある。
ヒト化抗体は非ヒト「ドナー」抗体由来のＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体配列に移植されている遺伝子改変抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎの米国特許第５５３０１０１号明細書および第５５８５０８９号明細書、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５２２５５３９号明
細書、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第６４０７２１３号明細書、Ａｄａｉｒの米国特許第５８５９２０５号明細書、第６８８１５５７号明細書、Ｆｏｏｔｅの米国特許第６８８１５５７号明細書を参照されたい）。それらのアクセプター抗体配列は、例えば、成熟型ヒト抗体配列、そのような配列の複合配列、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域配列であり得る。したがって、ヒト化抗体は、完全または実質的にドナー抗体に由来する幾つかまたは全てのＣＤＲ、ならびに存在する場合には完全または実質的にヒト抗体に由来する配列可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。同様にヒト化重鎖は、完全または実質的にドナー抗体重鎖に由来する少なくとも１つ、２つ、および通常は３つ全てのＣＤＲ、ならびに存在する場合には実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域を有する。同様にヒト化軽鎖は、完全または実質的にドナー抗体軽鎖に由来する少なくとも１つ、２つ、および通常は３つ全てのＣＤＲ、ならびに存在する場合には実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域を有する。ナノボディおよびｄＡｂの他、ヒト化抗体はヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を有する。ヒト化抗体内のＣＤＲは、（Ｋａｂａｔにより定義される）対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％がそれぞれのＣＤＲの間で同一であるときに非ヒト抗体中の対応するＣＤＲに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域はＫａｂａｔにより定義される対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％が同一であるときにヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来する。
ヒト化抗体はマウス抗体に由来する６つ全てのＣＤＲ（Ｋａｂａｔにより定義される通りであり得る）を組み込むことが多いが、全てよりも少ない数のＣＤＲ（例えば、マウス抗体に由来する少なくとも３つ、４つ、または５つのＣＤＲ）を用いてヒト化抗体を作製することもできる（例えば、Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓ Ｒ， Ｉｗａｈａｓｈｉ Ｍ， Ｔａｍｕｒａ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ２００２． Ｇｒａｆｔｉｎｇ “Ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ” Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｃｏｎｔａｃｔ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ａ Ｌｅｓｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：３０７６－３０８４、Ｖａｊｄｏｓ ＦＦ， Ａｄａｍｓ ＣＷ， Ｂｒｅｅｃｅ ＴＮ， Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ， ｄｅ Ｖｏｓ ＡＭ， Ｓｉｄｈｕ， ＳＳ． ２００２． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＥｒｂＢ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｓｈｏｔｇｕｎ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｊ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ３２０： ４１５－４２８、Ｉｗａｈａｓｈｉ Ｍ， Ｍｉｌｅｎｉｃ ＤＥ， Ｐａｄｌａｎ ＥＡ， ｅｔ ａｌ． １９９９． ＣＤＲ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＣＣ４９）： Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ
ＣＤＲｓ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３６：１０７９－１０９１、Ｔａｍｕｒａ Ｍ，
Ｍｉｌｅｎｉｃ ＤＥ， Ｉｗａｈａｓｈｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ２０００． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ （ＳＤＲｓ） ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔ ｂｙ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ＳＤＲｓ ｏｎｌｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：１４３２－１４４１）。
キメラ抗体は非ヒト（例えばマウス）抗体の軽鎖および重鎖の成熟型可変領域がヒト軽鎖定常領域および重鎖定常領域と組み合わせられている抗体である。そのような抗体はそのマウス抗体の結合特異性を実質的または完全に保持しており、且つ、その約３分の２がヒト配列である。
ベニヤ型抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲの幾つか、通常は全てと非ヒト可変領域フレームワーク残基の幾つかを保持するが、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば曝露残基（Ｐａｄｌａｎ ＥＡ． １９９１． Ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｈｉｌｅ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９－９８）をヒト抗体配列の対応する位置に由来する残基で置き換えているある種のヒト化抗体である。その結果、ＣＤＲが完全または実質的に非ヒト抗体に由来し、その非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってよりヒト様にされている抗体になる。ヒト抗体はヒトから単離され得るし、そうでなければ（例えば、遺伝子導入マウスにおいて、またはファージディスプレイによってインビトロで）ヒト免疫グロブリン遺伝子の発現から生じ得る。ヒト抗体の作製方法にはＯｓｔｂｅｒｇ Ｌ， Ｐｕｒｓｃｈ Ｅ． １９８３． Ｈｕｍａｎ ｘ （ｍｏｕｓｅ ｘ ｈｕｍａｎ） ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ｓｔａｂｌｙ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１－３６７、Ｏｓｔｂｅｒｇの米国特許第４６３４６６４号明細書、およびＥｎｇｌｅｍａｎらの米国特許第４６３４６６６号明細書のトリオーマ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子導入マウスの使用（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際公開ＷＯ９３／１２２２７号パンフレット（１９９３）、米国特許第５８７７３９７号明細書、米国特許第５８７４２９９号明細書、米国特許第５８１４３１８号明細書、米国特許第５７８９６５０号明細書、米国特許第５７７０４２９号明細書、米国特許第５６６１０１６号明細書、米国特許第５６３３４２５号明細書、米国特許第５６２５１２６号明細書、米国特許第５５６９８２５号明細書、米国特許第５５４５８０６号明細書、Ｎａｔｕｒｅ １４８， １５４７－１５５３ （１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉの国際公開ＷＯ９１／１０７４１号パンフレット（１９９１）を参照されたい）、およびファージディスプレイ法（例えば、Ｄｏｗｅｒらの国際公開ＷＯ９１／１７２７１号パンフレットおよびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開ＷＯ９２／０１０４７号パンフレット、米国特許第５８７７２１８号明細書、米国特許第５８７１９０７号明細書、米国特許第５８５８６５７号明細書、米国特許第５８３７２４２号明細書、米国特許第５７３３７４３号明細書、および米国特許第５５６５３３２号明細書を参照されたい）が挙げられる。
「重合体」は連結された一連の単量体群を指す。重合体は複数の単位の単一の単量体（ホモ重合体）または異なる単量体（ヘテロ単量体）から構成される。高分子量重合体は、限定されないが、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン、ビニルピリジン、ビニルピロリドン、およびビニルアセテートなどのビニルエステルをはじめとする単量体から調製される。追加的な単量体が高分子量重合体に有用である。２種類の異なる単量体が使用されるとき、それらの２種類の単量体は「共単量体」とよばれ、それらの異なる単量体が共重合して単一の重合体を形成することを意味する。前記重合体は直鎖型または分岐型であり得る。前記重合体が分岐型であるとき、それぞれの重合体鎖は「重合体アーム」と呼ばれる。開始剤部分に結合している前記重合体アームの末端は近位末端であり、前記重合体アームの生長鎖末端が遠位末端である。前記重合体アームの生長鎖末端において前記重合体アーム末端基はラジカルスカベンジャーまたは別の基であり得る。
「開始剤」は単量体または共単量体を使用する重合を開始することが可能である化合物を指す。その重合は従来のフリーラジカル重合、または原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂停止（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ａｄｄｉｔｉｏｎ－Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）（ＲＡＦＴ）重合もしくはニトロオキシド介在性重合（ＮＭＰ）などの制御／「リビング」ラジカル重合、であり得る。その重合は退行移動などの「擬似」制御重合であり得る。開始剤がＡＴＲＰに適切であるとき、その開始剤はラジカル重合を開始することが可能であるラジカルである開始剤断片を形成するために均等開裂し得る易変性結合Ｉ、および重合を可逆的に停止するために生長重合体鎖のラジカルと反応するラジカルスカベンジャーＩ’を含む。ラジカルスカベンジャーＩ’はハロゲンであることが典型的であるが、ニトリルなどの有機部分であってもよい。幾つかの実施形態では開始剤はＡＴＲＰによる重合のための部位として１つ以上の２－ブロモイソブチレート基を含有する。
「化学リンカー」は半減期延長部分とタンパク質などの２つのグループを一つに結合する化学部分を指す。そのリンカーは切断可能であっても切断不可能であってもよい。切断可能リンカーは何よりも加水分解可能リンカー、酵素切断可能リンカー、ｐＨ感受性リンカー、光解離性リンカー、またはジスルフィドリンカーであり得る。他のリンカーにはホモ二官能性およびヘテロ二官能性リンカーが挙げられる。「結合基」は生物活性薬剤に対する１つ以上の結合からなる共有結合を形成可能な官能基である。非限定的な例には国際公開ＷＯ２０１３０５９１３７号パンフレット（参照により援用する）の表１に示されるものが挙げられる。
「反応基」という用語は別の化学基と反応して共有結合を形成することが可能である基、すなわち、適切な反応条件下で共有結合反応性である基を指し、別の物質との接続点を一般的に表す。その反応基はマレイミドまたはスクシンイミドエステルなどの部分であり、異なる部分上の官能基と化学反応して共有結合を形成することが可能である。反応基には求核剤、求電子剤、および光活性化基が一般的に挙げられる。
「ホスホリルコリン」は「ＰＣ」とも記され、以下のものを指し、
Figure 0007088454000020
 式中、＊は接続点を示す。そのホスホリルコリンは双性イオン性基であり、その塩（内塩など）およびそのプロトン化形態と脱プロトン化形態を含む。
「ホスホリルコリン含有重合体」はホスホリルコリンを含有する重合体である。「双性イオン含有重合体」は双性イオンを含有する重合体を指す。
ポリ（アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有重合体はリン酸２－（アクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチル（下記実施例６において示されるＨＥＡ－ＰＣ）を単量体として含有する重合体を指す。
ポリ（メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有重合体はリン酸２－（メタクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチル（ＨＥＭＡ－ＰＣま
たはＭＰＣ）を単量体（下記参照）として含有する重合体を指す。
Figure 0007088454000021
本明細書において使用される場合、「ＭＰＣ」および「ＨＥＭＡ－ＰＣ」は相互に置き換え可能である。
前記重合体の文脈の中の「分子量」は数平均分子量、または重量平均分子量またはピーク分子量のいずれかとして表され得る。別段の指示が無い限り、本明細書における分子量への全ての言及はピーク分子量を指す。これらの分子量の決定、すなわち数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）およびピーク分子量（Ｍｐ）はサイズ排除クロマトグラフィーまたは他の液体クロマトグラフィー技法を用いて測定され得る。数平均分子量を決定するための末端基分析の使用もしくは束一的性質（例えば凝固点降下、沸点上昇、または浸透圧）の測定、または重量平均分子量を決定するための光散乱技術、超遠心分離、もしくは粘度測定法の使用などの分子量値を測定するための他の方法を用いることもできる。幾つかの実施形態では分子量はＳＥＣ－ＭＡＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー・多角度光散乱法）により測定される。幾つかの実施形態では前記高分子試薬は多分散系である（すなわち、重合体の数平均分子量および重量平均分子量が等しくない）ことが典型的であり、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ測定に由来するＰＤＩ値などから判断して例えば約１．５未満の低い多分散度を有し得る。幾つかの実施形態では前記多分散度（ＰＤＩ）は約１．４から約１．２の範囲内にある。幾つかの実施形態では前記ＰＤＩは約１．１５未満、１．１０未満、１．０５未満、または１．０３未満である。
「一つ（ａ）の」または「一つ（ａｎ）の」実体という語句は１つ以上のその実体を指し、例えば、一つ（ａ）の化合物は１つ以上の化合物または少なくとも１つの化合物を指す。したがって、「一つ（ａ）の」（または「一つ（ａｎ）の」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は本明細書において互換的に使用され得る。
「約」は様々な機器、試料、および試料調製物の間で採用された測定値に見る可能性のある変動を意味する。
「保護された」、「保護形態」、「保護基」、および「保護性基」はある特定の反応条件下で分子中の特定の化学反応性官能基の反応を妨害または阻害する基（すなわち保護基）の存在を指す。保護基は保護されている化学反応基の種類、ならびに用いられる反応条件および存在する場合は分子中の追加の反応基または保護基の存在に応じて変化する。適切な保護基にはＧｒｅｅｎｅらの論文「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ
社、ニューヨーク、１９９９年に見られるような保護基が挙げられる。
「アルキル」は表示された炭素原子数を有する直鎖型または分岐型の飽和脂肪族ラジカルを指す。例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキルにはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等が含まれるがこれらに限定されない。他のアルキル基にはヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が含まれるがこれらに限定されない。アルキルはあらゆる数の炭素、例えば１～２個、１～３個、１～４個、１～５個、１～６個、１～７個、１～８個、１～９個、１～１０個、２～３個、２～４個、２～５個、２～６個、３～４個、３～５個、３～６個、４～５個、４～６個、および５～６個の炭素を含むことができる。アルキル基は一価であることが典型的であるが、例えばアルキル基は２つの部分を一つに結合すると二価になり得る。
有機ラジカルまたは化合物との関連でこれまでに言及され、且つ、これ以後に言及される「低級」という用語はそれぞれ７個以下または４個以下の炭素原子および（非分岐型のときに）１個または２個の炭素原子を含む分岐型または非分岐型であり得る化合物またはラジカルを規定する。
「アルキレン」は少なくとも２つの他の基を結合する上で規定されたアルキル基、すなわち、二価炭化水素ラジカルを指す。アルキレンに結合された２つの部分はそのアルキレンの同じ原子または異なる原子に結合され得る。例えば、直鎖アルキレンはｎが１、２、３、４、５または６である－（ＣＨ２）ｎという二価のラジカルであり得る。アルキレン基にはメチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ－ブチレン、ペンチレン、およびヘキシレンが含まれるがこれらに限定されない。
アルキルラジカルおよびヘテロアルキルラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれることが多い基を含む）の置換基は、ｍ’がそのようなラジカルの総炭素原子数である場合にゼロから（２ｍ’＋１）までの範囲の数で－ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＳＲ’、－ハロゲン、－ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、－ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、－ＣＮおよび－ＮＯ２から選択される様々な基であり得る。Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’はそれぞれ独立して水素、非置換（Ｃ１～Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル基、非置換アリール基、１～３個のハロゲンで置換されたアリール基、非置換アルキル基、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリール－（Ｃ１～Ｃ４）アルキル基を指す。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に接続しているとき、それらはその窒素原子と組み合わさって５員環、６員環、または７員環を形成し得る。例えば、－ＮＲ’Ｒ’’は１－ピロリジニルおよび４－モルホリニルを含む意味である。「アルキル」という用語はハロアルキル（例えば、－ＣＦ３および－ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３等）のような基を含む。幾つかの実施形態では置換アルキル基および置換ヘテロアルキル基は１～４置換基を有する。幾つかの実施形態では置換アルキル基および置換ヘテロアルキル基は１置換基、２置換基、または３置換基を有する。例外はペルハロアルキル基（例えばペンタフルオロエチル等）である。
アルキルラジカルおよびヘテロアルキルラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シ
クロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれることが多い基を含む）の置換基は、ｍ’がそのようなラジカルの総炭素原子数である場合にゼロから（２ｍ’＋１）までの範囲の数で、限定されないが、－ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＳＲ’、－ハロゲン、－ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲＳＯ２Ｒ’、－ＣＮおよび－ＮＯ２から選択される様々な基のうちの１つ以上であり得る。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’はそれぞれ独立して水素、置換または非置換ヘテロアルキル基、置換または非置換アリール基、例えば、１～３個のハロゲンで置換されたアリール基、置換または非置換アルキル基、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。化合物が１つより多くのＲ基を含むとき、例えば、それらのＲ基の各々は独立して選択され、これはＲ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基、およびＲ’’’’基のうちの１つより多くが存在するときにはこれらの基の各々についても同様である。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に接続しているとき、それらはその窒素原子と組み合わさって５員環、６員環、または７員環を形成し得る。例えば、－ＮＲ’Ｒ’’は、限定されないが、１－ピロリジニルおよび４－モルホリニルを含む意味である。置換基についての上記の考察より、当業者は「アルキル」という用語が水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば－ＣＦ３および－ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３等）を含む意味であることを理解する。
「アルコキシ」はそのアルコキシ基を接続点に接続するか、またはそのアルコキシ基の２個の炭素に結合する酸素原子を有するアルキル基を指す。アルコキシ基には、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、２－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ等が含まれる。それらのアルコキシ基は記載される様々な置換基でさらに置換され得る。例えば、それらのアルコキシ基はハロゲンでさらに置換されて「ハロアルコキシ」基を形成し得る。
「カルボキシアルキル」はカルボキシ基で置換されたアルキル基（本明細書において規定される）を意味する。「カルボキシシクロアルキル」という用語はカルボキシ基で置換されたシクロアルキル基（本明細書において規定される）を意味する。アルコキシアルキルという用語はアルコキシ基で置換されたアルキル基（本明細書において規定される）を意味する。本明細書において使用される「カルボキシ」という用語はカルボン酸およびそれらのエステルを指す。
「ハロアルキル」は水素原子の幾つかまたは全てがハロゲン原子で置換されている上で規定されたようなアルキルを指す。ハロゲン（ハロ）はクロロまたはフルオロを表すが、ブロモまたはヨードであってもよい。例えば、ハロアルキルにはトリフルオロメチル、フルオロメチル、１，２，３，４，５－ペンタフルオロフェニル等が含まれる。「ペルフルオロ」という用語は全ての利用可能な水素がフッ素で置き換えられている化合物またはラジカルを規定する。例えば、ペルフルオロフェニルは１，２，３，４，５－ペンタフルオロフェニルを指し、ペルフルオロメチルは１，１，１－トリフルオロメチルを指し、ペルフルオロメトキシは１，１，１－トリフルオロメトキシを指す。
「フルオロ置換アルキル」は１つの、幾つかの、または全ての水素原子がフッ素によって置き換えられているアルキル基を指す。
「サイトカイン」は免疫応答および炎症性応答における細胞間情報伝達に関与し得る一
群のタンパク質シグナル伝達分子のメンバーである。サイトカインは典型的には約８～３５ｋＤａの質量を有する低分子水溶性糖タンパク質である。
「シクロアルキル」は約３個から１２個まで、３個から１０個まで、または３個から７個までの環内炭素原子を含有する環状炭化水素基を指す。シクロアルキル基には融合環構造、架橋環構造、およびスピロ環構造が含まれる。
「環内」は環構造体の一部を構成する原子または原子群を指す。
「環外」は前記環構造体に結合しているが、その環構造体を規定しない原子または原子群を指す。
「環状アルキルエーテル」は３個または４個の環内炭素原子と１個の環内酸素原子または硫黄原子を有する４員または５員の環状アルキル基（例えば、オキセタン、チエタン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン）、または１個または２個の環内酸素原子もしくは硫黄原子を有する６～７員の環状アルキル基（例えば、テトラヒドロピラン、１，３－ジオキサン、１，４－ジオキサン、テトラヒドロチオピラン、１，３－ジチアン、１，４－ジチアン、１，４－オキサチアン）を指す。
「アルケニル」は２～６個の炭素原子を有し、少なくとも１つの二重結合を有する直鎖型または分岐型のどちらかの炭化水素を指す。アルケニル基の例にはビニル、プロペニル、イソプロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、イソペンテニル、１，３－ペンタジエニル、１，４－ペンタジエニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、１，３－ヘキサジエニル、１，４－ヘキサジエニル、１，５－ヘキサジエニル、２，４－ヘキサジエニル、または１，３，５－ヘキサトリエニルが含まれるがこれらに限定されない。アルケニル基は２～３個、２～４個、２～５個、３～４個、３～５個、３～６個、４～５個、４～６個、および５～６個までの炭素も有し得る。アルケニル基は一価であることが典型的であるが、例えばアルケニル基は２つの部分を一つに結合すると二価になり得る。
「アルケニレン」は少なくとも２つの他の基を結合する上で規定されたアルケニル基、すなわち、二価炭化水素ラジカルを指す。アルケニレンに結合された２つの部分はそのアルケニレンの同じ原子または異なる原子に結合され得る。アルケニレン基にはエテニレン、プロペニレン、イソプロペニレン、ブテニレン、イソブテニレン、ｓｅｃ－ブテニレン、ペンテニレン、およびヘキセニレンが含まれるがこれらに限定されない。
「アルキニル」は２～６個の炭素原子を有し、少なくとも１つの三重結合を有する直鎖型または分岐型のどちらかの炭化水素を指す。アルキニル基の例にはアセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ－ブチニル、ブタジニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、イソペンチニル、１，３－ペンタジニル、１，４－ペンタジニル、１－ヘキシニル、２－ヘキシニル、３－ヘキシニル、１，３－ヘキサジニル、１，４－ヘキサジニル、１，５－ヘキサジニル、２，４－ヘキサジニル、または１，３，５－ヘキサトリニルが含まれるがこれらに限定されない。アルキニル基は２～３個、２～４個、２～５個、３～４個、３～５個、３～６個、４～５個、４～６個、および５～６個までの炭素も有し得る。アルキニル基は一価であることが典型的であるが、例えばアルキニル基は２つの部分を一つに結合すると二価になり得る。
「アルキニレン」は少なくとも２つの他の基を結合する上で規定されたアルキニル基、すなわち、二価炭化水素ラジカルを指す。アルキニレンに結合された２つの部分はそのアルキニレンの同じ原子または異なる原子に結合され得る。アルキニレン基にはエチニレン
、プロピニレン、ブチニレン、ｓｅｃ－ブチニレン、ペンチニレン、およびヘキシニレンが含まれるがこれらに限定されない。
「シクロアルキル」は３個から１２個までの環原子、または表示された数の原子を含む飽和または部分不飽和単環式、融合二環式、または架橋多重環式の環を指す。単環式の環には、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチルが含まれる。二環式および多重環式の環には、例えば、ノルボルナン、デカヒドロナフタレン、およびアダマンタンが含まれる。例えば、Ｃ３～８シクロアルキルにはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、およびノルボルナンが含まれる。
「シクロアルキレン」は少なくとも２つの他の基を結合する上で規定されたシクロアルキル基、すなわち、二価炭化水素ラジカルを指す。シクロアルキレンに結合された２つの部分はそのシクロアルキレンの同じ原子または異なる原子に結合され得る。シクロアルキレン基にはシクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、およびシクロオクチレンが含まれるがこれらに限定されない。
「ヘテロシクロアルキル」は３個から約２０個までのリングメンバーおよびＮ、Ｏ、およびＳなどの１個から約５個までのヘテロ原子を有する環系を指す。その他のヘテロ原子も有用であり得、それらにはＢ、Ａｌ、ＳｉおよびＰが含まれるがこれらに限定されない。それらのヘテロ原子は、限定されないが、－Ｓ（Ｏ）－および－Ｓ（Ｏ）２－のように酸化されてもよい。例えば、複素環にはテトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、インドリニル、キヌクリジニル、および１，４－ジオキサ－８－アザスピロ［４．５］デカ－８－イルが含まれるがこれらに限定されない。
「ヘテロシクロアルキレン」は少なくとも２つの他の基を結合する上で規定されたヘテロシクロアルキル基を指す。ヘテロシクロアルキレンに結合された２つの部分はそのヘテロシクロアルキレンの同じ原子または異なる原子に結合され得る。
「アリール」は６～１６個の環炭素原子を含む単環式、または融合二環式、もしくは三環式以上の芳香族環を指す。例えば、アリールはフェニル、ベンジル、またはナフチルであり得る。「アリレン」はアリール基に由来する二価ラジカルを意味する。アリール基は、アルキル、アルコキシ、アリール、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノアルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシ、および全て所望により例えば先に規定されたようにさらに置換されもよいオキシ－Ｃ２～Ｃ３－アルキレンから選択される１つ、２つ、または３つのラジカル、または１－ナフチルもしくは２－ナフチル、または１－フェナントレニルもしくは２－フェナントレニルによって１置換、２置換、または３置換されてよい。アルキレンジオキシはフェニルの２つの隣接する炭素原子に接続された二価の置換基、例えばメチレンジオキシまたはエチレンジオキシである。オキシ－Ｃ２～Ｃ３－アルキレンもフェニルの２つの隣接する炭素原子に接続された二価の置換基、例えばオキシエチレンまたはオキシプロピレンである。オキシ－Ｃ２～Ｃ３－アルキレン－フェニルの一例は２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イルである。
幾つかの実施形態ではアリールはナフチル、フェニル、またはアルコキシ、フェニル、ハロゲン、アルキル、もしくはトリフルオロメチルにより１置換もしくは２置換されたフェニル、特にフェニル、またはアルコキシ、ハロゲン、もしくはトリフルオロメチルにより１置換もしくは２置換されたフェニル、とりわけフェニルである。
Ｒとしての置換フェニル基の例は、例えば、所望により複素環に置換される４－クロロフェン－１－イル、３，４－ジクロロフェン－１－イル、４－メトキシフェン－１－イル、４－メチルフェン－１－イル、４－アミノメチルフェン－１－イル、４－メトキシエチルアミノメチルフェン－１－イル、４－ヒドロキシエチルアミノメチルフェン－１－イル、４－ヒドロキシエチル－（メチル）－アミノメチルフェン－１－イル、３－アミノメチルフェン－１－イル、４－Ｎ－アセチルアミノメチルフェン－１－イル、４－アミノフェン－１－イル、３－アミノフェン－１－イル、２－アミノフェン－１－イル、４－フェニル－フェン－１－イル、４－（イミダゾール－１－イル）－フェニル、４－（イミダゾール－１－イルメチル）－フェン－１－イル、４－（モルホリン－１－イル）－フェン－１－イル、４－（モルホリン－１－イルメチル）－フェン－１－イル、４－（２－メトキシエチルアミノメチル）－フェン－１－イルおよび４－（ピロリジン－１－イルメチル）－フェン－１－イル、４－（チオフェニル）－フェン－１－イル、４－（３－チオフェニル）－フェン－１－イル、４－（４－メチルピペラジン－１－イル）－フェン－１－イル、および４－（ピペリジニル）－フェニル、および４－（ピリジニル）－フェニルである。
「アリレン」は少なくとも２つの他の基を結合する上で規定されたアリール基を指す。アリレンに結合された２つの部分はそのアリレンの同じ原子または異なる原子に結合され得る。アリレン基にはフェニレンが含まれるがこれらに限定されない。
「アリレンオキシ」はアリレンに結合している部分のうちの１つが酸素原子を介して結合している上で規定されたアリレン基を指す。アリレンオキシ基にはフェニレンオキシが含まれるがこれらに限定されない。
同様に、アリール基およびヘテロアリール基の置換基は変化し、且つ、ゼロからその芳香環系上の開放価数の総数までの範囲の数で－ハロゲン、－ＯＲ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＳＲ’、－Ｒ’、－ＣＮ、－ＮＯ２、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、－ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、－Ｎ３、－ＣＨ（Ｐｈ）２、ペルフルオロ（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、およびペルフルオロ（Ｃ１～Ｃ４）アルキルから選択され、その場合にＲ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は水素、（Ｃ１～Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）－（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、および（非置換アリール）オキシ－（Ｃ１～Ｃ４）アルキルから独立して選択される。
前記アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つはＴおよびＵが独立して－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＨ２－、または単結合であり、ｑが０から２までの整数である式－Ｔ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｑ－Ｕ－という置換基で所望により置き換えられてもよい。あるいは、前記アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つはＡおよびＢが独立して－ＣＨ２－、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’－、または単結合であり、ｒが１から３までの整数である式－Ａ－（ＣＨ２）ｒ－Ｂ－という置換基で所望により置き換えられてもよい。そのように形成された新しい環の単結合のうちの１つは所望により二重結合で置き換えられてもよい。あるいは、前記アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つはｓとｔが独立して０から３までの整数であり、Ｘが－Ｏ－、－ＮＲ’－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、または－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’－である式－（ＣＨ２）ｓ－Ｘ－（ＣＨ２）ｔ－という置換基で所望により置き換えられてもよい。－ＮＲ’－および－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’－中の置換基Ｒ’は水素または非置換（Ｃ１～Ｃ６）アルキルから選択される。
「ヘテロアリール」は、５～１６個の環原子を含み、それらの環原子のうちの１個から４個までがそれぞれヘテロ原子Ｎ、Ｏ、またはＳである単環式、または融合二環式もしくは三環式の環を指す。例えば、ヘテロアリールにはピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、フラニル、ピロリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、または例えばアルキル、ニトロ、もしくはハロゲンで置換された、特に１置換もしくは２置換された他のあらゆるラジカルが含まれる。ピリジルは２－ピリジル、３－ピリジル、または４－ピリジルを表し、有利には２－ピリジルまたは３－ピリジルを表す。チエニルは２－チエニルまたは３－チエニルを表す。幾つかの実施形態ではキノリニルは２－キノリニル、３－キノリニル、または４－キノリニルを表す。幾つかの実施形態ではイソキノリニルは１－イソキノリニル、３－イソキノリニル、または４－イソキノリニルを表す。幾つかの実施形態ではベンゾピラニル、ベンゾチオピラニルはそれぞれ３－ベンゾピラニルまたは３－ベンゾチオピラニルを表し得る。幾つかの実施形態ではチアゾリルは２－チアゾリルまたは４－チアゾリルを表し得る。幾つかの実施形態ではトリアゾリルは１－トリアゾリル、２－トリアゾリル、または５－（１，２，４－トリアゾリル）であり得る。幾つかの実施形態ではテトラゾリルは５－テトラゾリルであり得る。
幾つかの実施形態ではヘテロアリールはピリジル、インドリル、キノリニル、ピロリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、インダゾリル、または置換された、特に１置換もしくは２置換されたそれらのラジカルのうちのいずれかである。
「ヘテロアルキル」という用語は１個から３個までのＮ、Ｏ、およびＳなどのヘテロ原子を有するアルキル基を指す。その他のヘテロ原子も有用であり得、それらにはＢ、Ａｌ、ＳｉおよびＰが含まれるがこれらに限定されない。それらのヘテロ原子は、限定されないが、－Ｓ（Ｏ）－および－Ｓ（Ｏ）２－のように酸化されてもよい。例えば、ヘテロアルキルにはエーテル、チオエーテル、アルキルアミン、およびアルキルチオールが挙げられ得る。
「ヘテロアルキレン」という用語は少なくとも２つの他の基を結合する上で規定されたヘテロアルキル基を指す。ヘテロアルキレンに結合された２つの部分はそのヘテロアルキレンの同じ原子または異なる原子に結合され得る。
「求電子剤」は、イオン性であってよく、求電子中心、すなわち、求電子性である中心を有し、求核剤と反応可能であるイオンまたは原子または原子の集まりを指す。求電子剤（または求電子試薬）はその反応パートナー（求核剤）に対し、その反応パートナーに由来する両方の結合性電子を受容することにより結合を形成する試薬である。
「求核剤」は、イオン性であってよく、求核中心、すなわち、求電子中心を求める中心を有し、または求電子剤と反応可能であるイオンまたは原子または原子の集まりを指す。求核剤（または求核試薬）はその反応パートナー（求電子剤）に対し、両方の結合性電子を供与することにより結合を形成する試薬である。「求核基」は反応基と反応した後の求核剤を指す。非限定的な例にはアミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロアルコキシ等が挙げられる。
「マレイミド」は以下の構造を有するピロール－２，５－ジオン－１－イル基を指し、
Figure 0007088454000022
それはスルフヒドリル（例えばチオアルキル）と反応すると以下の構造を有する－Ｓ－マレイミド基を形成し、
Figure 0007088454000023
 式中、「・」はマレイミド基の接続点を表し、波線は元のスルフヒドリル担持基の残りの部分へのチオール性硫黄原子の接続点を表す。
本開示の目的のため、タンパク質およびポリペプチド内に見られる「天然アミノ酸」はＬ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、およびまたはＬ－バリンである。タンパク質内に見られる「非天然アミノ酸」は天然アミノ酸として列挙されたアミノ酸以外のあらゆるアミノ酸である。非天然アミノ酸には天然アミノ酸のＤ異性体および天然アミノ酸のＤ異性体とＬ異性体の混合物が含まれるがこれらに限定されない。Ｎ－α－メチルアミノ酸（例えばサルコシン）、４－ヒドロキシプロリン、デスモシン、イソデスモシン、５－ヒドロキシリシン、ε－Ｎ－メチルリシン、３－メチルヒスチジンなどの他のアミノ酸は天然タンパク質内に見られるが、それらはｍＲＮＡのリボソームによる翻訳以外の方法により一般に導入されるので、本開示の目的のためにタンパク質内に見られる非天然アミノ酸であると考えられる。
重合体の形状、構成、または全体的構造に関しての「直鎖型」は単一の重合体アームを有する重合体を指す。
重合体の形状、構成、または全体的構造に関しての「分岐型」は開始剤内に含まれるコア構造より伸長する２本以上の重合体「アーム」を有する重合体を指す。その開始剤は原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）反応において使用され得る。分岐型重合体は２本の重合
体鎖（アーム）、３本の重合体アーム、４本の重合体アーム、５本の重合体アーム、６本の重合体アーム、７本の重合体アーム、８本の重合体アーム、９本の重合体アーム、またはそれより多くの重合体アームを有し得る。各重合体アームは重合体開始部位より伸長する。各重合体開始部位は単量体の付加による重合体鎖の生長のための部位であり得る。例えば、限定されないが、ＡＴＲＰ、開始剤上の重合体開始部位は銅ハライドなどの遷移金属化合物により触媒される可逆的酸化還元過程を起こす有機ハライドであることが典型的である。幾つかの実施形態ではそのハライドは臭素である。
「薬学的に許容可能な賦形剤」は、組成物に含めることができ、且つ、患者に対して重大な有害毒性効果を引き起こさず、且つ、特にヒトにおける治療用途についてＦＤＡより認可されている、または認可され得る賦形剤を指す。薬学的に許容可能な賦形剤の非限定的な例には水、ＮａＣｌ、通常生理食塩水溶液、乳酸リンゲル液、通常ショ糖、通常グルコース等が挙げられる。
治療用タンパク質は、障害の発症を遅らせ、障害の重症度を軽減し、障害のさらなる悪化を抑制し、および／または障害の少なくとも１つの兆候もしくは症状を改善する投与量、投与経路、および投与頻度を意味する有効なレジメンで投与される。患者が既に障害を患っている場合、そのレジメンを治療有効レジメンと呼ぶことができる。その患者にその障害のリスクが一般的な集団と比べて高まっているが、まだ症状を示していない場合、そのレジメンを予防有効レジメンと呼ぶことができる。幾つかの例では個々の患者において同じ患者のヒストリカルコントロール（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ）または過去の経験と比較して治療効力または予防効力を観察することができる。他の例では治療患者集団の臨床前試験または臨床試験において未治療の患者の対照集団と比較して治療効力または予防効力を実証することができる。
物質の「生物学的半減期」はその物質の導入後に組織または生物からその物質の半分が除去されるために必要な時間を明示する薬物動態パラメーターである。
「ＯＧ１７８６」は図３０に示される構造を有する重合体合成に使用される９本アームの開始剤であり、その図はトリフルオロ酢酸との塩形態のＯＧ１７８６を示している。ＯＧ１７８６は他の塩として使用されても、遊離塩基として使用されてもよい。
「ＯＧ１８０１」は単量体ＨＥＭＡ－ＰＣを使用するＡＴＲＰ合成の開始剤としてＯＧ１７８６を使用して作製される約（±１５％）７５０ｋＤａ（ＭｎまたはＭｐによる）の重合体である。
「ＯＧ１８０２」はマレイミド官能基が付加されたＯＧ１８０１であり、図３６に示されており、その図の中では前記重合体の総分子量（Ｍｗ）が７５０，０００±１５％ダルトンであるようにｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９の各々が（正の）整数（０から最大で約３０００まで）である。
多角度光散乱（ＭＡＬＳ）はレーザー光が分子に衝突し、その光の振動性電場がその分子の中に振動双極子を誘導してその巨大分子を分析する技術である。この振動双極子は光を再放射し、Ｗｙａｔｔ社のｍｉｎｉＤａｗｎ ＴＲＥＯＳなどのＭＡＬＳ検出器を使用して測定され得る。その放射光の強度はその巨大分子において誘導された双極子の大きさに依存し、それはその巨大分子の分極率に比例し、誘導された双極子が大きいほど散乱光の強度が大きい。したがって、そのような巨大分子の溶液からの散乱を分析するためには周囲の媒体（例えば溶媒）と比較したそれらの分極率を知っている必要がある。これは、Ｗｙａｔｔ社のＯｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ示差屈折率検出器を使用してｄｎ／ｄｃ（＝Δｎ／Δｃ）値を測定することにより、分子濃度変化Δｃに関連したその溶液の屈折率の
変化Δｎの測定から決定され得る。ＭＡＬＳ測定が使用する２つの分子量パラメーターは数平均分子量（Ｍｎ）と重量平均分子量（Ｍｗ）であり、その場合に多分散度（ＰＤＩ）はＭｎで除算されたＭｗに等しい。ＳＥＣは、そのＳＥＣの最も高いピークの分子量として定義されるピーク分子量Ｍｐという別の平均分子量の決定も可能にする。
ＰＤＩは、多分散系生体高分子（例えばＯＧ１８０２）への個々のタンパク質（例えばＯＧ１９５０）の複合体化より得られる重合体および生体複合体の分子量分布の広さの尺度として使用される。タンパク質試料について、そのタンパク質試料は溶液中のタンパク質分子全てがほぼ同じ長さと分子量を有することが期待される翻訳産物であるため、そのタンパク質試料の多分散度は１．０に近い。対照的に、様々な長さの重合体鎖が重合過程の間に合成される場合にその生体高分子は多分散性であるため、その試料の品質特性の１つとしてその試料のＰＤＩを決定することが分子量の狭い分布にとって非常に重要である。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は溶液中の分子をサイズによって分離するクロマトグラフィー技法である。様々な孔径を有する樹脂で充填されたカラムに水溶液を注入して試料を移動させることが典型的である。その樹脂は分析物がそのカラムを通過する際に分析物に対して不活性であることが期待され、分析物はそれらの特有のサイズおよび選択したカラムの特徴である孔径にもとづいて相互より分離する。
ＳＥＣ校正標準物セットに頼ることと対照的に、ＳＥＣのＭＡＬＳとの連結、またはＳＥＣ／ＭＡＬＳにより分子量およびサイズ（平均二乗平方根半径）の正確な分布が与えられる。この種のアレンジメントは伝統的なカラム校正法に対して多くの利点を有する。各溶出画分について光散乱と濃度が測定されるため、溶出位置と無関係に分子量とサイズを決定することができる。このことは生体高分子（ＯＧ１８０２）または生体複合体（ＯＧ１９５３）などの非球形巨大分子である種にとって特に適切であり、そのような種はカラム校正標準物セットが描く可能性がある挙動では溶出しないことが典型的である。
幾つかの実施形態ではＳＥＣ／ＭＡＬＳ分析にはＳｈｏｄｅｘ ＳＥＣ－ＨＰＬＣカラム（７．８×３００ｍｍ）を装着したＡｌｌｉａｎｃｅ ２６９５溶媒送達モジュールとＷａｔｅｒｓ ２９９６フォトダイオードアレイ検出器を含むＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムが含まれる。これをＷｙａｔｔ ｍｉｎｉＤａｗｎ ＴＲＥＯＳおよびＷｙａｔｔ
Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ示差屈折率検出器とオンライン接続する。Ｗａｔｅｒｓ社のＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアを使用してそのＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを制御することができ、Ｗｙａｔｔ社のＡＳＴＲＡ Ｖ６．１．７．１６ソフトウェアを使用してそのＷｙａｔｔ ｍｉｎｉＤａｗｎ ＴＲＥＯＳからＭＡＬＳデータを取得し、そのＴ－ｒＥＸ検出器からｄｎ／ｄｃデータを取得し、且つ、Ｗａｔｅｒｓ ２９９６フォトダイオードアレイ検出器からのＡ２８０吸光度シグナルを使用して質量回復データを取得することができる。ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中、１ｍｌ／分の流速でＳＥＣを実施することができ、試料を注入すると絶対分子量（Ｍｐ、Ｍｗ、Ｍｎ）と多分散度（ＰＤＩ）の決定のためにＭＡＬＳシグナルおよびＲＩシグナルがＡＳＴＲＡソフトウェアによって分析され得る。さらに、その計算にはそれぞれ０．１４２および０．１８３という重合体およびタンパク質の入力ｄｎ／ｄｃ値も関わる。ＯＧ１９５３生体複合体のｄｎ／ｄｃ値について、そのｄｎ／ｄｃは前記重合体および前記タンパク質の測定されたＭＷに基づいて以下の式を用いて約０．１４８であると計算される。
複合体のｄｎ／ｄｃ＝０．１４２×［重合体ＭＷ／（重合体ＭＷ＋タンパク質ＭＷ）］＋０．１８３×［タンパク質ＭＷ／（重合体ＭＷ＋タンパク質ＭＷ）］
式中、ＯＧ１８０２の重合体ＭＷは８００ｋＤａであり、ＯＧ１９５０のタンパク質ＭＷは１４６ｋＤａである。
概要
抗ＶＥＧＦ抗体および抗体複合体を本明細書において提供する。幾つかの実施形態ではそれらの抗体自体が他の抗ＶＥＧＦ剤と異なっており、他の抗ＶＥＧＦ剤よりも優れた結果を提供する。幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ抗体複合体は他の抗体に対して、および／または他の抗体複合体の期待される活性に対して驚くべき優越性を示す。
歴史的にタンパク質への分子の複合体化はそのタンパク質の目的の標的への結合性相互作用を低下させることが多かった。本開示の幾つかの実施形態では、活性部位の外側にある場所へ複合体化されるとき、予期されたものと同レベルの低下が必ず観察されるわけではない。本明細書において提供される証拠から、予期されたものと反対の効果が示されている。幾つかの実施形態では、理論によって制限されるつもりはないが、前記複合体は抗体単独よりも優れている可能性がある。例えば、リガンドとその特異的な受容体の相互作用はそのリガンド上の親水性アミノ酸のその受容体上の親水性アミノ酸との相互作用によって方向づけられるそのリガンドとその受容体の立体特異的相互作用を介して引き起こされることが多く、水分子がそれらの相互作用の前線および中心である。同時にこの親水性立体特異性は、疎水性から疎水性へのアミノ酸によって概ね介在される／形成される可能性がある非特異的疎水性相互作用の強調を抑えること、および／またはその非特異的疎水性相互作用を抑制することによってさらに強化される。
幾つかの実施形態ではＶＥＧＦリガンド（「ＶＥＧＦＬ」）とＶＥＧＦ受容体（「ＶＥＧＦＲ」）との間の相互作用の少なくとも９０％を阻害可能である抗ＶＥＧＦ抗体複合体が提供される。例えば、その抗体複合体はＶＥＧＦＲとＶＥＧＦＬとの間の相互作用の少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または事実上全てを阻害し得る。幾つかの実施形態ではその注目の阻害は飽和濃度で生じる。幾つかの実施形態ではＶＥＧＦリガンドとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用の少なくとも９５％を阻害する抗ＶＥＧＦ抗体複合体が提供される。そのような優越性の一例として、ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）またはアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）よりも、または抗体ＯＧ１９５０（非複合体化）さえよりも高い程度にまで阻害するＯＧ１９５３（および本明細書において提供される抗体複合体）の能力について図２０を参照されたい。実際、（抗体複合体を形成するための）抗体への重合体の付加がその抗体の結合／活性に対して幾らかの有害な影響を有するか、または有害な影響を有しないか予期することは可能であるが、その付加がこの様にその抗体の阻害能力を実際に改善することは予期されなかったのでこの結果は予期せぬものであった。
幾つかの実施形態では前記抗体または抗体複合体はＶＥＧＦＲとＶＥＧＦＬとの間の活性および／または相互作用の少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を阻害する。幾つかの実施形態ではＩＣ５０値は０．１ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または前述の値のうちのいずれか１つ以上よりも小さい値でり得る。幾つかの実施形態ではＫＤは２×１０－１３Ｍ、１×１０－１３Ｍ、１×１０－１２Ｍ、１×１０－１１Ｍ、１×１０－１０Ｍ、または前述の値のうちのいずれか１つよりも小さい値であり得る。幾つかの実施形態ではＩＣ５０値は１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、または前述の値のうちのいずれか１つよりも小さい値であり得る。
幾つかの実施形態ではＶＥＧＦリガンドとＶＥＧＦ－受容体との間の相互作用の少なく
とも９０％を阻害する抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。例えば、その抗体はＶＥＧＦＲとＶＥＧＦＬとの間の相互作用の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または事実上全てを阻害することができる。そのような優越性の一例として、ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）またはアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）よりも高い程度にまで阻害するＯＧ１９５０（および本明細書において提供される抗体）の能力について図２０を参照されたい。
幾つかの実施形態ではルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）またはアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）などの他の抗体を本明細書に記載される製法のうちの１つ以上により本明細書に記載される前記重合体のうちの１つ以上に複合体化することができる。幾つかの実施形態ではあらゆる抗体または抗体断片を本明細書に記載される製法のうちの１つ以上により本明細書に記載される前記重合体のうちの１つ以上に複合体化することができる。
幾つかの実施形態では前記抗体は配列番号１を含む重鎖アミノ酸可変領域と配列番号２を含む軽鎖アミノ酸可変領域を含む。幾つかの実施形態では前記抗体は本明細書において提供される重合体のうちの１つ以上に複合体化される。幾つかの実施形態では前記複合体化抗体は配列番号１および／または２と少なくとも９０％同一である。幾つかの実施形態では前記抗体は配列番号１および配列番号２内の６つのＣＤＲ、並びにＬ４４３Ｃという点変異（ＥＵ式付番、または配列番号１内の４４９Ｃ）を含む。幾つかの実施形態では前記複合体化抗体は配列番号１および／または２と少なくとも９０％同一であり、且つ、次の変異、すなわちＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）、および次の変異のうちの少なくとも１つ、すなわちＱ３４７Ｃ（ＥＵ式付番）またはＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）を含む。
幾つかの実施形態ではＶＥＧＦ－Ａに結合する抗体が提供される。その抗体は配列番号１内のＣＤＲＨ１であるＣＤＲＨ１、配列番号１内のＣＤＲＨ２であるＣＤＲＨ２、配列番号１内のＣＤＲＨ３であるＣＤＲＨ３、配列番号２内のＣＤＲＬ１であるＣＤＲＬ１、配列番号２内のＣＤＲＬ２であるＣＤＲＬ２、配列番号２内のＣＤＲＬ３であるＣＤＲＬ３、次の変異、すなわちＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）のうちの少なくとも１つ、ならびに次の変異のうちの少なくとも１つ、すなわちＱ３４７Ｃ（ＥＵ式付番）またはＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）を含む。
当業者によって理解されるように、本明細書を参照すると、本明細書において提供される抗体のうちのいずれも本明細書において提供される重合体のいずれかに複合体化することができ、且つ／または本明細書において提供されるどの抗体も重合体への部位特異的複合体化を可能にするように付加されたシステインを有することができる。
「ＶＥＧＦ」または「血管内皮細胞増殖因子」は血管形成または血管新生過程に影響するヒト血管内皮細胞増殖因子である。特に、ＶＥＧＦという用語は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１）、ＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１）、またはＶＥＧＦＲ－３（ＦＬＴ－４）などのＶＥＧＦ受容体に結合し、（ｉｉ）ＶＥＧＦ受容体に付随するチロシンキナーゼ活性を活性化し、且つ、（ｉｉｉ）それにより血管形成または血管新生過程に影響する増殖因子クラスのいずれかのメンバーを意味する。
ＶＥＧＦ因子ファミリーは５種類の近縁糖タンパク質であるＶＥＧＦ－Ａ（ＶＰＥとしても知られる）、－Ｂ、－Ｃ、－Ｄ、およびＰＧＦ（胎盤増殖因子）から構成される。これらのうち、ＶＥＧＦ－Ａが最もよく研究されており、それは抗血管新生療法の標的である。Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ， （２００３） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：６６９－６７６．ＶＥＧＦ－Ａは選択的スプライシングとタンパク質分解の両方によって生成され
る多数の様々なアイソタイプ、すなわちＶＥＧＦ－Ａ２０６、ＶＥＧＦ－Ａ１８９、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、およびＶＥＧＦ－Ａ１２１として存在する。それらのアイソフォームはヘパリンとニューロピリンと呼ばれる非シグナル伝達性結合タンパク質に結合する能力の点で異なる。それらのアイソフォームは全てが二量体として生物活性を有する。
ＶＥＧＦの様々な作用にはＶＥＧＦ、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ（Ｐ１５６９２）、－Ｂ（Ｐ４９７６６）、－Ｃ（Ｐ４９７６７）および－Ｄ（Ｑ４３９１５）の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）への結合が介在する。ＶＥＧＦファミリー受容体はクラスＶ ＲＴＫに属し、それぞれが細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に７つのＩｇ様ドメインを担持する。ヒトではＶＥＧＦは３種類のＲＴＫ、すなわちＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１）（Ｐ１７９４８）、ＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ、Ｆｌｋ－１）（Ｐ９３５９６８）、およびＶＥＧＦＲ－３（Ｆｌｔ－４）（Ｐ３５９１６）に結合する。文脈より明らかではない限り、ＶＥＧＦへの言及は天然アイソフォームまたは天然型に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する天然変異体もしく人工変異体のいずれかであるＶＥＧＦ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｄ、およびＰＧＦのうちのどれかを意味する。幾つかの実施形態ではそのようなＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦである。同様に、ＶＥＧＦＲへの言及はいずれかの天然アイソフォームまたは天然配列に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する天然変異体もしくは人工変異体を含むＶＥＧＲ－１、Ｒ－２またはＲ－３のうちのどれかを意味する。
ＶＥＧＦアンタゴニスト療法はある特定の癌および湿潤型ＡＭＤの治療に認可されている。ベバシズマブ（アバスチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社）は、ヒトＶＥＧＦ、とりわけＶＥＧＦ－Ａの全てのアイソフォームとＶＥＧＦ－Ａの生物活性タンパク質分解断片に結合し、それらの効力を無効にするヒト化マウスモノクローナル抗体である。例えば、Ｆｅｒｒａｒａ Ｎ， Ｈｉｌｌａｎ ＫＪ， Ｇｅｒｂｅｒ ＨＰ， Ｎｏｖｏｔｎｙ Ｗ． ２００４． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ， ａｎ ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ
ｔｒｅａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ３（５）：３９１－４００を参照されたい。ベバシズマブはある特定の癌の治療に認可されている。ベバシズマブ（ＤｒｕｇＢａｎｋ ＤＢ００１１２）の重鎖および軽鎖のタンパク質配列が配列番号３（重鎖）および配列番号４（軽鎖）に示されている。
ベバシズマブ可変軽鎖ＣＤＲはＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）である。ベバシズマブ可変重鎖ＣＤＲはＣＤＲＨ１：ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶである。ＣＤＲは複合Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ定義がＣＤＲＨ１に使用されることを例外としてＫａｂａｔにより規定される。幾つかの実施形態ではそのベバシズマブ配列にシステインを付加することができ、前記抗体（および／またはベバシズマブの６ＣＤＲを含む変異体）は本明細書において提供される重合体のうちのいずれか１つ以上に複合体化され得る。
ベバシズマブと同じマウスモノクローナル抗体に由来する別の抗ＶＥＧＦ分子であるラニビズマブ（ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社）が湿潤型ＡＭＤの治療法として認可されている。ラニビズマブは抗体断片またはＦａｂである。ラニビズマブはベバシズマブの可変重鎖および可変軽鎖の親和性成熟により作製された。ラニビズマブの重鎖および軽鎖の（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社により公開された）配列がそれぞれ配列番号５および６に示されている。幾つかの実施形態ではそのラニビズマブ配列にシステインを付加することができ、前記抗体（および／またはラニビズマブの６ＣＤＲを含む変異体）は本明細書において提供される重合体のうちのいずれか１つ以
上に複合体化され得る。
ラニビズマブＣＤＲは親和性成熟の後に改善が加えられたことを除いてベバシズマブと同じであり、ラニビズマブ可変軽鎖ＣＤＲはＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）である。ラニビズマブ可変重鎖ＣＤＲはＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）である。
幾つかの実施形態では抗体の可変領域外にあるシステインにおいてホスホリルコリン含有重合体に結合した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体を有する抗体複合体であって、そのシステインが組換えＤＮＡ技術によって付加されたものである前記抗体複合体が提供される。幾つかの実施形態ではその重合体は単一のシステインに結合している。幾つかの実施形態では「組換えＤＮＡ技術により付加された」は、既知もしくは既存の抗体の配列またはコンセンサス抗体配列の中の同じ位置に存在する非システインアミノ酸にそのシステイン残基が置き換わっていることを意味する。したがって、例えばその抗体がＩｇＧ１であり、その重鎖がＥＵ位置４４３にロイシンを有する場合、そのロイシンは組換えＤＮＡ技術によってシステインに置き換えられる（Ｌ４４３Ｃ、ＥＵ式付番、または配列番号１内の４４９Ｃ）。相応して、ＥＵ位置３４７における天然ＩｇＧ１配列はＱ（グルタミン）であり、そのＱは組換えＤＮＡ技術によってシステインに置き換えられてＱ３４７Ｃを生じる。
幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は軽鎖と重鎖を有し、その重鎖はＦｃ領域を有する。幾つかの実施形態では前記システインはそのＦｃ領域内にあり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖はＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有し、且つ、位置２２１（配列番号３内に見られる配列カウントを介した位置）がＴであり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖はＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）、およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）を有し、且つ、Ｋａｂａｔ位置４がＬである。
幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖アイソタイプはＩｇＧ１である。幾つかの実施形態では前記ＩｇＧ１定常ドメインはＩｇＧ１定常ドメイン（例えば配列番号３の定常領域）と比べて１つ以上の変異を有することでエフェクター機能を調節する。幾つかの実施形態ではそれらのエフェクター機能変異は次のもの、すなわち、Ｘがいずれかの天然アミノ酸または非天然アミノ酸であるＥ２３３Ｘ、Ｌ２３４Ｘ、Ｌ２３５Ｘ、Ｇ２３６Ｘ、Ｇ２３７Ｘ、Ａ３２７Ｘ、Ａ３３０Ｘ、およびＰ３３１Ｘ（ＥＵ式付番）のうちの１つ以上である。幾つかの実施形態では前記変異はＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ（ＥＵ式付番）からなる群より選択される。幾つかの実施形態では抗体複合体次の変異、すなわちＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）を有する。
幾つかの実施形態では前記システイン残基は前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖内にあり、且つ、Ｑ３４７Ｃ（ＥＵ式付番）またはＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）である。幾つかの実施形態では前記システイン残基はＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番、または配列番号１内の４４９Ｃ）である。幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖の配列は配列番号１であり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖の配列は配列番号２である。
幾つかの実施形態では前記ホスホリルコリン含有重合体は以下に示されるリン酸２－（メタクリロイルオキシエチル）－２’－（トリメチルアンモニウム）エチル（ＭＰＣ）単量体を含む。
Figure 0007088454000024
前記重合体は以下の反復単位を含み、
Figure 0007088454000025
 式中、ｎは１から３０００までの整数であり、波線は前記重合体中の単量体単位間の接続点を表す。
幾つかの実施形態では前記重合体は３本以上のアームを有し、または３か所以上の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される。幾つかの実施形態では前記重合体は２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、もしくは１２本のアームを有し、または２か所、３か所、４か所、５か所、６か所、７か所、８か所、９か所、１０か所、１１か所、もしくは１２か所の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される。より好ましくは、前記重合体は３本、６本、もしくは９本のアームを有し、または３か所、６か所、もしくは９か所の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される。幾つかの実施形態では前記重合体は９本のアームを有し、または９か所の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される。
幾つかの実施形態では付加される前記重合体は約３００，０００と約１，７５０，０００Ｄａの間の分子量（ＳＥＣ－ＭＡＬｓ）を有する。幾つかの実施形態では前記重合体は
約５００，０００と約１，０００，０００Ｄａの間の分子量を有する。幾つかの実施形態では前記重合体は約６００，０００から約９００，０００Ｄａの間の分子量を有する。幾つかの実施形態では前記重合体は約７５０，０００から約８５０，０００Ｄａの間の分子量を有する。幾つかの実施形態では前記重合体は約８００，０００から約８５０，０００Ｄａの間の分子量を有する。幾つかの実施形態では前記重合体は約７５０，０００から約８００，０００Ｄａの間の分子量を有する。
幾つかの実施形態では本明細書に記載される抗体のうちのいずれも重合体とさらに複合体化して生体複合体を形成し得る。その生体複合体の分子量（総計、ＳＥＣ－ＭＡＬｓ）は約３５０，０００と２，０００，０００ダルトンの間、例えば、約４５０，０００と１，９００，０００ダルトンの間、約５５０，０００と１，８００，０００ダルトンの間、約６５０，０００と１，７００，０００ダルトンの間、約７５０，０００と１，６００，０００ダルトンの間、約８５０，０００と１，５００，０００ダルトンの間、約９００，０００と１，４００，０００ダルトンの間、約９５０，０００と１，３００，０００ダルトンの間、約９００，０００と１，０００，０００ダルトンの間、約１，０００，０００と１，３００，０００ダルトンの間、約８５０，０００と１，３００，０００ダルトンの間、約８５０，０００と１，０００，０００ダルトンの間、および約１，０００，０００と１，２００，０００ダルトンの間であり得る。
幾つかの実施形態では前記抗体複合体は精製される。幾つかの実施形態では前記重合体は前記抗体複合体の態様は多分散系であり、すなわち前記重合体のＰＤＩは１．０ではない。幾つかの実施形態では前記ＰＤＩは１．５未満である。幾つかの実施形態では前記ＰＤＩは１．４未満である。幾つかの実施形態では前記ＰＤＩは１．３未満である。幾つかの実施形態では前記ＰＤＩは１．２未満である。幾つかの実施形態では前記ＰＤＩは１．１未満である。
幾つかの実施形態では前記抗体複合体は重合体に結合した抗ＶＥＧＦ－Ａ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を有し、その重合体はＭＰＣ単量体を含み、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖の配列は配列番号１であり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖の配列は配列番号２であり、前記抗体は配列番号１中のＣ４４９においてのみ前記重合体に結合している。幾つかの実施形態では前記重合体は９本のアームを有し、且つ、６００，０００から１，０００，０００Ｄａの間の分子量を有する。
幾つかの実施形態では前記抗体複合体は重合体に結合した抗ＶＥＧＦ－Ａ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を有し、その重合体はＭＰＣ単量体を含み、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖の配列は配列番号１であり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖の配列は配列番号２であり、前記抗体はＣ４４３（ＥＵ式付番、または配列番号１内の４４９Ｃ）においてのみ前記重合体に結合している。幾つかの実施形態では前記重合体は９本のアームを有し、且つ、６００，０００から１，０００，０００Ｄａの間の分子量を有する。
幾つかの実施形態では前記抗体複合体は下記の構造を有し、
Figure 0007088454000026
 式中、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の各重鎖が文字Ｈで表され、且つ、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の各軽鎖が文字Ｌで表され、
前記重合体が配列番号１のＣ４４９のスルフヒドリルを介して前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に結合しており、その結合が前記重鎖のうちの１本の上に示されており、ＰＣが
Figure 0007088454000027
 であり、前記波線が残りの前記重合体の部分への接続点を表し、Ｘはａ）ＲがＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルであるＯＲ、ｂ）Ｈ、またはｃ）Ｂｒをはじめとするいずれかのハライドであり、且つ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９の合計が２５００±１０％であるようにｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９が同一または異なる。ある特定の実施形態ではｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は同一または異なり、且つ、０から３０００までの整数である。ある特定の実施形態ではｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は同一または異なり、且つ、０から５００までの整数である。幾つかの実施形態ではＸはＯＲであり、式中、Ｒは糖、アミノアルキルであるか、次の残基、すなわち飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル、不飽和Ｃ２～Ｃ２４アルケニルまたはＣ２～Ｃ２４
アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボイルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノ、およびポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、－ＣＯ－Ｏ－Ｒ７、カルボニル－ＣＣＯ－Ｒ７、－ＣＯ－ＮＲ８Ｒ９、－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＲ７、－ＣＯ－（ＣＨ）ｎ－ＣＯＯＲ７、－（ＣＨ２）ｎ－ＮＲ８Ｒ９、エステル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルの単置換変異体、多重置換変異体、または非置換変異体であり、その中でｎは１から６までの整数であり、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は水素原子、ハロゲン原子、次の残基、すなわち飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル、不飽和Ｃ２～Ｃ２４アルケニルまたはＣ２～Ｃ２４アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボイルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノ、およびポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、５員環、および６員環の単置換変異体、多重置換変異体、または非置換変異体からなる群よりそれぞれ別々に選択される。
幾つかの実施形態では前記抗体複合体は下記の構造を有し、
Figure 0007088454000028
 式中、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の各重鎖が文字Ｈで表され、且つ、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の各軽鎖が文字Ｌで表され、
前記重合体がＣ４４３（ＥＵ式付番、または配列番号１内の４４９Ｃ）のスルフヒドリルを介して前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に複合体化されており、その結合が前記重鎖のうちの１本の上に示されており、ＰＣが
Figure 0007088454000029
 であり、前記波線が残りの前記重合体の部分への接続点を表し、Ｘはａ）ＲがＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルであるＯＲ、ｂ）Ｈ、またはｃ）Ｂｒをはじめとするいずれかのハライドであり、且つ、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９の合計が２５００±１０％であるようにｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９が同一または異なる。ある特定の実施形態ではｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は同一または異なり、且つ、０から３０００までの整数である。ある特定の実施形態ではｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８およびｎ９は同一または異なり、且つ、０から５００までの整数である。幾つかの実施形態ではＸはＯＲであり、式中、Ｒは糖、アミノアルキルであるか、次の残基、
すなわち飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル、不飽和Ｃ２～Ｃ２４アルケニルまたはＣ２～Ｃ２４アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボイルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノ、およびポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、－ＣＯ－Ｏ－Ｒ７、カルボニル－ＣＣＯ－Ｒ７、－ＣＯ－ＮＲ８Ｒ９、－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＲ７、－ＣＯ－（ＣＨ）ｎ－ＣＯＯＲ７、－（ＣＨ２）ｎ－ＮＲ８Ｒ９、エステル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルの単置換変異体、多重置換変異体、または非置換変異体であり、その中でｎは１から６までの整数であり、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は水素原子、ハロゲン原子、次の残基、すなわち飽和Ｃ１～Ｃ２４アルキル、不飽和Ｃ２～Ｃ２４アルケニルまたはＣ２～Ｃ２４アルキニル、アシル、アシルオキシ、アルキルオキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシカルボニル、アルコキシカルボニルアシル、アミノ、アミノカルボニル、アミノカルボイルオキシ、ニトロ、アジド、フェニル、ヒドロキシ、アルキルチオ、アリールチオ、オキシスルホニル、カルボキシ、シアノ、およびポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、５員環、および６員環の単置換変異体、多重置換変異体、または非置換変異体からなる群よりそれぞれ別々に選択される。
幾つかの実施形態では前記抗体複合体は液体製剤中に存在する。幾つかの実施形態では前記抗体複合体は薬学的に許容可能な担体と組み合わせられる。
幾つかの実施形態では抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が提供される。抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体重鎖は少なくとも次のＣＤＲ配列、すなわちＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有する。幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖はそれらのＣＤＲを有し、加えて位置２２１（配列番号３内に見られる配列カウントを介した位置）にトレオニン（Ｔ）を有する。幾つかの実施形態では抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖は少なくとも次のＣＤＲ、すなわちＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）を有する。幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体はそれらのＣＤＲを有し、加えてＫａｂａｔ位置４にロイシン（Ｌ）を有する。幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体重鎖のアイソタイプはＩｇＧ１であり、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。幾つかの実施形態ではその軽鎖アイソタイプはκである。
幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体のＩｇＧ１ドメインは１つ以上の変異を有することでＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣなどのエフェクター機能を調節する。幾つかの実施形態ではそれらのＩｇＧ１変異はエフェクター機能を低下させる。幾つかの実施形態ではエフェクター機能変異のために使用するアミノ酸にはＸがいずれかの天然アミノ酸または非天然アミノ酸であるＥ２３３Ｘ、Ｌ２３４Ｘ、Ｌ２３５Ｘ、Ｇ２３６Ｘ、Ｇ２３７Ｘ、Ｇ２３６Ｘ、Ｄ２７０Ｘ、Ｋ３２２Ｘ、Ａ３２７Ｘ、Ｐ３２９Ｘ、Ａ３３０Ｘ、Ａ３３０Ｘ、Ｐ３３１Ｘ、およびＰ３３１Ｘ（ＥＵ式付番）が挙げられる。幾つかの実施形態では前記変異には次のもの、すなわちＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＥＵ式付番）のうちの１つ以上が挙げられる。幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖は次の変異、すなわちＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）を有する。幾つかの実施形態では天然ヒトＩｇＧ１配列に対するエフェクター機能変異の数は１０未満である。幾
つかの実施形態では天然ヒトＩｇＧ１配列に対するエフェクター機能変異の数は５未満、４未満、３未満、２未満、または１未満である。幾つかの実施形態では前記抗体は、エフェクター機能を引き起こすその抗体の能力が低下するようにＦｃγ結合および／または補体Ｃ１ｑ結合を低下させている。このことは目の適応症／障害にとって特に有利である。
幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は次のアミノ酸変異、すなわちＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ（ＥＵ式付番）のうちの１つ以上、およびＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番、または配列番号１内の４４９Ｃ）を含む。
幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）またはその一部である。
幾つかの実施形態では前記ＶＥＧＦ－Ａ抗体は免疫介在性エフェクター機能を低下させる１つ以上の変異を含む重鎖定常ドメインを有する。
幾つかの実施形態では抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が提供される。その抗ＶＥＧＦ抗体は配列ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）を含むＣＤＲＨ１、配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）を含むＣＤＲＨ２、配列ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を含むＣＤＲＨ３、配列ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）を含むＣＤＲＬ１、配列ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）を含むＣＤＲＬ２、および配列ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）ＣＤＲＬ３を含む重鎖を有する。
あるいは、前記ＩｇＧドメインＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得、またはこれらのアイソタイプのうちの１つより多くから定常領域が形成される複合物（例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＣＨ１領域とＩｇＧ１のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域）であり得る。そのようなドメインはＩｇＧ１について言及されたＥＵ位置のうちの１つ以上にエフェクター機能を低下させるための、および／または改変するための変異を含有し得る。ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４はヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３と比べて低下したエフェクター機能を有する。
前記抗ＶＥＧＦ－Ａ重鎖は、半減期延長部分を複合体化するために使用可能な変異として組換えＤＮＡ技術により付加されたシステイン残基を有する。幾つかの実施形態ではその変異は（ＥＵ式付番）Ｑ３４７Ｃ（ＥＵ式付番）および／またはＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番、または配列番号１内の４４９Ｃ）である。幾つかの実施形態ではその変異はＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番、または配列番号１内の４４９Ｃ）である。幾つかの実施形態では重合体に対する抗体のストイキオメトリーは１：１であり、すなわち、複合体が１分子の重合体に複合体化された１分子の抗体を有する。
前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の半減期は「半減期（「ハーフライフ」）延長部分」または「半減期（「ハーフライフ」）延長基」の接続によって延長可能である。半減期延長部分にはその問題の生物学的製剤とインフレームで発現し得る（または状況に応じては化学的に複合体化され得る）ペプチドおよびタンパク質、ならびに－ＳＨ、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨ２などの１つ以上のアミノ酸側鎖または末端官能基、または１つ以上のＮ－および／もしくはＯ－グリカン構造に接続または複合体化しうる様々な重合体が挙げられる。半減期延長部分は一般的に生物学的製剤のインビボ循環半減期を増加させるように作用する。
ペプチド／タンパク質半減期延長部分の例にはＦｃ融合（Ｃａｐｏｎ ＤＪ， Ｃｈａｍｏｗ ＳＭ， Ｍｏｒｄｅｎｔｉ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ＣＤ４
ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ＡＩＤＳ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔｕｒ
ｅ． １９８９． ３３７：５２５－３１）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）融合（Ｙｅｈ Ｐ， Ｌａｎｄａｉｓ Ｄ， Ｌｅｍａｉｔｒｅ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ－ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｌｂｕｍｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｔｈｅｒａｐｙ： ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ－ＣＤ４ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．
１９９２． ８９：１９０４－０８ ）、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）融合（Ｆａｒｅｓ ＦＡ， Ｓｕｇａｎｕｍａ Ｎ． Ｎｉｓｈｉｍｏｒｉ Ｋ， ｅｔ ａｌ．
Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｌｏｎｇ－ａｃｔｉｎｇ ｆｏｌｌｉｔｒｏｐｉｎ ａｇｏｎｉｓｔ ｂｙ ｆｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｔｏ ｔｈｅ ｆｏｌｌｉｔｒｏｐｉｎ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９９２． ８９：４３０４－０８）、ノンエグサクトリピートペプチド配列（ＸＴＥＮ）融合の遺伝的融合（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｖ， Ｗａｎｇ ＣＷ， Ｇｅｅｔｈｉｎｇ ＮＣ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａ ｔｕｎａｂｌｅ ｍａｎｎｅｒ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００９． ２７：１１８６－９０）、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ化）（ＭＣｐｈｅｒｓｏｎ ＤＴ， Ｍｏｒｒｏｗ Ｃ， Ｍｉｎｅｈａｎ ＤＳ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ， Ｇ（ＶＰＧＶＧ１９－ＶＰＧＶ， ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉａｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． １９９２． ８：３４７－５２）、ヒトトランスフェリン融合（Ｐｒｉｏｒ ＣＰ， Ｌａｉ Ｃ－Ｈ， Ｓａｄｅｈｇｈｉ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．特許国際公開ＷＯ２００４／０２０４０５号パンフレット、２００４年）、プロリン－アラニン－セリン（ＰＡＳ化）（Ｓｋｅｒｒａ Ａ， Ｔｈｅｏｂａｌｄ Ｉ， Ｓｃｈｌａｐｓｋｙ Ｍ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｈａｖｉｎｇ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ／ｏｒ ｖｉｔｒｏ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．特許国際公開ＷＯ２００８／１５５１３４（Ａ１）号パンフレット２００８年）、ホモアミノ酸重合体（ＨＡＰ化）（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ Ｍ， Ｔｈｅｏｂａｌｄ Ｉ， Ｍａｃｋ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｈｏｍｏ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐｌａｓｍａ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．
２００７． ２０：２７３－８４）およびゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）融合（Ｈｕａｎｇ Ｙ－Ｓ， Ｗｅｎ Ｘ－Ｆ， Ｚａｒｏ ＪＬ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｆｏｒｍ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ－ｆａｃｔｏｒ
ｂｙ ｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｅｌａｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒ． Ｅｕｒ Ｊ． Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ２０１０． ７２：４３５－４１）が挙げられる。
重合体半減期延長部分の例にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐型ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社；コベントリー、英国）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル－デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール
（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン・マレイン酸無水物共重合体、ポリスチレン・マレイン酸無水物共重合体、ポリ（１－ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、双性イオン性重合体、ホスホリルコリン含有重合体およびＭＰＣ含有重合体、ポリ（Ｇｌｙｘ－Ｓｅｒｙ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパロサン重合体（ＨＥＰ）、フレキシマー、デキストラン、およびポリシアル酸（ＰＳＡ）が挙げられる。
１つの実施形態では半減期延長部分はＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを使用して抗体に対してそのタンパク質の遊離アミノ基を介して複合体化され得る。アミン基への複合体化を目的とする試薬はリシンのε－アミン基、Ｎ末端アミノ酸のα－アミン基、およびヒスチジンのδ－アミン基にランダムに反応し得る。
しかしながら、本明細書において開示される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は重合体複合体化に利用可能な多数のアミン基を有する。したがって、遊離アミノ基への重合体の複合体化はＶＥＧＦに結合する前記抗体タンパク質の能力に負の影響を与える可能性がある。
幾つかの実施形態では半減期延長部分は、限定されないが、マレイミド化学をはじめとするあらゆる適切なチオール反応化学、または前酸化後の前記抗体の炭水化物部分への重合体ヒドラジドまたは重合体アミンの結合を用いて１つ以上の遊離ＳＨ基に結合される。幾つかの実施形態ではマレイミド結合が使用される。幾つかの実施形態では天然で存在するシステインまたは遺伝子操作により導入されたシステインにおいて結合が起こる。
幾つかの実施形態では重合体は部位特異的変異形成により抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に導入されたシステイン残基に共有結合する。幾つかの実施形態ではそれらのシステイン残基はその抗体のＦｃ部分内で用いられる。幾つかの実施形態ではＦｃ領域にシステイン残を導入する部位は全ての目的のために参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１３／０９３８０９号パンフレット、米国特許第７５２１５４１号明細書、国際公開ＷＯ２００８／０２０８２７号パンフレット、米国特許第８００８４５３号明細書、米国特許第８４５５６２２号明細書、および米国特許出願公開第２０１２／０２１３７０５号明細書の中に提示されている。幾つかの実施形態では前記システイン変異はＱ３４７Ｃ（ＥＵ式付番）およびＥＵ式付番によりヒトＩｇＧ重鎖を参照するＬ４４３Ｃである。
幾つかの実施形態では抗体および半減期延長剤として機能する高分子量重合体の複合体が提供される。幾つかの実施形態では１単位以上の単量体単位から形成される重合体であって、少なくとも１単位の単量体単位が双性イオン性基を有する双性イオン性重合体に結合している抗体を含む複合体が提供される。幾つかの実施形態ではその双性イオン性基はホスホリルコリンである。
幾つかの実施形態ではそれらの単量体単位のうちの１つはＨＥＭＡ－ＰＣである。幾つかの実施形態では重合体はＨＥＭＡ－ＰＣである単一の単量体から合成される。
幾つかの実施形態では幾つかの抗体複合体は前記単量体がＨＥＭＡ－ＰＣである２本、３本、またはそれより多くの重合体アームを有する。幾つかの実施形態では前記複合体は前記単量体がＨＥＭＡ－ＰＣである２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、または１２本の重合体アームを有する。幾つかの実施形態では前記複合体は３本、６本、または９本のアームを有する。幾つかの実施形態では前記複合体は９本のアームを有する。
幾つかの実施形態では重合体抗体複合体は１００，０００と１，５００，０００Ｄａの間の分子量を有する重合体部分を有する。幾つかの実施形態では前記複合体は５００，０００と１，０００，０００Ｄａの間の分子量を有する重合体部分を有する。幾つかの実施形態では前記複合体は６００，０００から８００，０００Ｄａの間の分子量を有する重合体部分を有する。幾つかの実施形態では前記複合体は６００，０００と８５０，０００Ｄａの間の分子量を有する重合体部分を持し、且つ、９本のアームを有する。重合体に複合体化された抗体について分子量が提示されるとき、その分子量はそのタンパク質に付随するあらゆる炭水化物部分を含むそのタンパク質の分子量と前記重合体の分子量の足し算になる。
幾つかの実施形態では約１００ｋＤａと１６５０ｋＤａの間のＭｗで測定された分子量を有するＨＥＭＡ－ＰＣ重合体を有する抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が提供される。幾つかの実施形態ではＭｗで測定される前記重合体の分子量は約５００ｋＤａと１０００ｋＤａの間である。幾つかの実施形態ではＭｗで測定される前記重合体の分子量は約６００ｋＤａから約９００ｋＤａの間である。幾つかの実施形態ではＭｗで測定される前記重合体の分子量は７５０ｋＤａ±１５％である。
幾つかの実施形態では前記重合体は１つ以上の重合体開始部位を有するＡＴＲＰに適切な開始剤から作製される。幾つかの実施形態ではその重合体開始部位は２－ブロモイソブチレート部位を有する。幾つかの実施形態では前記開始剤は３か所以上の重合体開始部位を有する。幾つかの実施形態では前記開始剤は３か所、４か所、５か所、６か所、７か所、８か所、９か所、１０か所、１１か所、または１２か所の重合体開始部位を有する。幾つかの実施形態では前記開始剤は３か所、６か所、または９か所の重合体開始部位を有する。幾つかの実施形態では前記開始剤は９か所の重合体開始部位を有する。幾つかの実施形態では前記開始剤はＯＧ１７８６である。
前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は、（ｉ）遺伝子操作による組換えＤＮＡの作製、（ｉｉ）例えば、限定されないが、形質移入、電気穿孔、またはマイクロインジェクションによる組換えＤＮＡの原核細胞または真核細胞への導入、（ｉｉｉ）形質転換細胞の培養、（ｉｖ）例えば、連続的または誘導時の抗体発現、および（ｖ）精製抗体を（ｖｉ）で得るための、例えば、培養培地からの、または形質転換細胞の回収による抗体の単離を含む組換え発現により作製され得る。
前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は薬理学的に許容可能な抗体分子を作製することを特徴とする適切な原核宿主系または真核宿主系中での発現により作製され得る。真核細胞の例はＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ－Ｈｉｐ、およびＨｅｐＧ２などの哺乳類細胞である。他の適切な発現系は原核生物（例えばｐＥＴ／ＢＬ２１発現系を含む大腸菌）、酵母（出芽酵母系および／またはピキア・パストリス系）、および昆虫細胞である。
多種多様なベクターが本明細書において開示される抗体の調製のために使用可能であり、且つ、真核生物および原核生物の発現ベクターから選択される。原核生物発現のベクターの例には、限定されないが、ｐＲＥＳＥＴ、ｐＥＴ、およびｐＡＤなどのプラスミドが挙げられ、原核生物発現ベクターに使用されるプロモーターには、限定されないが、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、またはａｒａＢＡＤのうちの１つ以上が挙げられる。真核生物発現のベクターの例には（ｉ）酵母での発現には、限定されないが、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、またはＡＵＧ１などのプロモーターを使用する、限定されないが、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴなどのベクター、（ｉｉ）昆虫細胞での発現には、限定されないが、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、またはｐｏｌｈなどのプロモーターを使用する、限定されないが、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣなどのベクター、および（ｉｉｉ）哺乳類細胞での発現には、限定
されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ－アクチンなどのプロモーターを使用する、限定されないが、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶなどのベクター、および１つの態様では、限定されないが、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルス系に由来するベクターが挙げられる。
重合体へのタンパク質の複合体化方法
幾つかの実施形態では治療用タンパク質半減期延長部分複合体の調製方法であって、マレイミド、ビニルスルホン、オルトピリジルジスルフィド、およびヨードアセトアミドからなる群より選択されるスルフヒドリル特異的反応基を有する半減期延長部分に組換えＤＮＡ技術により付加されたシステイン残基を有する治療用タンパク質を複合体化してその治療用タンパク質半減期延長部分複合体を提供するステップを有する前記方法が提供される。
幾つかの実施形態ではＯＧ１９５０からＯＧ１９５３抗体複合体を調製する方法が提供される。図１８に示されるように、その方法は５０倍モル過剰のＴＣＥＰ還元剤でＯＧ１９５０タンパク質を還元することを含む（図１８）。還元後、その抗体を酸化して、その抗体内で天然に生じる軽鎖と重鎖の鎖間および鎖内ジスルフィド結合が形成されているが、重鎖の位置Ｌ４４３Ｃ（ＥＵ式付番、または配列番号１内の４４９Ｃ）上の改変システインはキャップが除去されたままであるキャップ除去済みＯＧ１９５０抗体を形成する（図１８）。次に賦形剤を添加し、そして５～１０倍モル過剰のマレイミド生体高分子を添加することによりそのＯＧ１９５０を複合体化する（図１８）。その生体高分子は共有チオールエーテル結合を介してＯＧ１９５０抗体に結合する（図１８）。複合体化の後、そのＯＧ１９５０３抗体複合体を精製して複合体化されていない抗体と重合体の両方を除去する（図１８）。
上記のタンパク質と製法を変更することも可能である。したがって、幾つかの実施形態では複合体化タンパク質（抗体または抗ＶＥＧＦ抗体である必要は無い）を調製するための製法が提供される。その製法はタンパク質内の１つ以上のシステインを還元して溶液中にキャップ除去済みタンパク質を形成することを含む。前記１つ以上のシステインの還元の後に前記キャップ除去済みタンパク質を再酸化して前記還元型タンパク質内に少なくとも１つのジスルフィド結合を再建し、一方で前記溶液中に再酸化キャップ除去済みタンパク質を形成するために前記タンパク質中の改変システイン残基が遊離チオール型のままであることを確実にする。次に少なくとも１つの賦形剤が前記溶液に添加される。その賦形剤は重合体誘導性タンパク質沈殿を減少させる。その賦形剤を添加した後に前記溶液に重合体を添加し、その重合体が前記改変システイン残基において前記再酸化キャップ除去済みタンパク質に複合体化されて複合体化タンパク質が形成される。
幾つかの実施形態では前記還元剤のモル過剰量は機能するあらゆる量に変更可能である。幾つかの実施形態では１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍モル過剰の前記還元剤（全ての実施形態においてＴＣＥＰである必要は無い）を使用することができる。幾つかの実施形態ではあらゆる抗体（治療用または別のもの）を使用することができる。幾つかの実施形態では１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍モル過剰のマレイミド生体高分子を使用することができる。幾つかの実施形態では重合体に対して過剰なキャップ除去済みタンパク質が存在する。幾つかの実施形態では前記還元型タンパク質の量は前記重合体の量よりも少ない。幾つかの実施形態では前記還元型タンパク質の量は前記重合体の量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％である。幾つかの実施形態ではタンパク質の１０～１５倍多い重合体を使用する。幾つかの実施形態では前記還元型抗体の量は前記重合体の
量よりも多い。幾つかの実施形態では前記重合体の量は前記還元型抗体の量よりも多い。
幾つかの実施形態では前記精製ステップはオプションである。
幾つかの実施形態では抗体複合体の前記作製方法は抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体をホスホリルコリン含有重合体に複合体化することを含む。幾つかの実施形態では前記方法は抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体をホスホリルコリン含有重合体に複合体化するステップを含む。前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は組換えＤＮＡ技術により付加されたアミノ残基を含む。幾つかの実施形態ではその付加されたアミノ酸残基はシステイン残基である。幾つかの実施形態ではそのシステイン残基は前記抗体の可変領域外に付加されている。前記システイン残基は前記抗体の重鎖または軽鎖のどちらかに付加可能である。
幾つかの実施形態では前記重合体はホスホリルコリン含有重合体を含むか、またはホスホリルコリン含有重合体からなる。幾つかの実施形態では前記ホスホリルコリン含有重合体はマレイミド、ビニルスルホン、オルトピリジルジスルフィド、およびヨードアセトアミドからなる群より選択されるスルフヒドリル特異的反応基を含む。幾つかの実施形態では前記ホスホリルコリン含有重合体上の前記スルフヒドリル特異的反応基が前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体上の前記システイン残基と反応して前記抗体複合体を形成する。
幾つかの実施形態では複合体化される前記タンパク質は抗体、抗体タンパク質融合体、またはその結合性断片であり得る。幾つかの実施形態では前記タンパク質は抗体ではなく酵素、リガンド、受容体、または他のタンパク質、またはそれらの変異体もしくは変異体である。幾つかの実施形態ではその天然タンパク質は少なくとも１つのジスルフィド結合と少なくとも１つの非天然システインを含む。
幾つかの実施形態では前記賦形剤は酸または塩基であり得る。幾つかの実施形態では前記賦形剤は界面活性剤、糖、または荷電アミノ酸である。幾つかの実施形態では前記賦形剤は前記重合体への複合体化の間に前記タンパク質を溶液状に保持することに役立つ。幾つかの実施形態では前記タンパク質を含有する前記溶液に前記重合体を添加する前に前記賦形剤が前記タンパク質を含有する前記溶液に添加される。
幾つかの実施形態では前記反応は約ｐＨ５から約ｐＨ９の間の水性条件下で起こる。幾つかの実施形態では前記反応は６．０と８．５の間、６．５と８．０の間、または７．０と７．５の間で起こる。
幾つかの実施形態では前記重合体は２～３７セルシウス度で前記タンパク質に複合体化される。幾つかの実施形態では前記複合体化は０～４０セルシウス度、５～３５セルシウス度、１０～３０セルシウス度、および１５～２５セルシウス度において起こる。
幾つかの実施形態では本明細書に記載される複合体化タンパク質は（複合体化されていないものから複合体化されたものを取り出すための）精製のためにイオン交換媒体、または疎水性相互作用クロマトグラフィーもしくはアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させることができる。幾つかの実施形態では前記イオン交換媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体、および／またはアフィニティークロマトグラフィー媒体は前記遊離重合体から、および前記再酸化キャップ除去済みタンパク質から前記複合体化タンパク質を分離する。
幾つかの実施形態では本明細書に記載され、且つ、図１８に概要がしめされる前記製法には溶解系の促進および／または維持が可能である賦形剤が関与する。幾つかの実施形態では前記製法は前記溶液が２種類の構成性要素の溶解性を維持する、すなわち相互作用す
ることを可能にする。これには前記タンパク質および前記重合体の溶解性、ならびに最終複合体の溶解性も同様に含まれ得る。幾つかの実施形態では、前記賦形剤アプローチが含まれない場合、前記タンパク質は可溶性であるが、前記生体高分子が添加されると前記溶液（例えば、タンパク質）の溶解性が低下し、前記タンパク質が溶液から沈降／沈殿することが問題となり得る。前記タンパク質が沈降すると前記生体高分子と効率的に複合体化することに利用できないことは当然である。したがって、前記生体高分子が存在するなかで前記タンパク質の溶解性を維持するために賦形剤を使用することができ、そうしてそれらの２つのものを結合して前記タンパク質複合体（または図１８に示されているように、抗体複合体）を形成することができる。これは前記複合体の溶解性の維持も可能にする。
幾つかの実施形態では本明細書において開示される重合体は次のもの、すなわち双性イオン、ホスホリルコリン、または重合体分岐点の中心を前記マレイミド官能基に架橋するＰＥＧリンカーのうちの１つ以上を含み得る。幾つかの実施形態では本明細書において提供される重合体のうちのいずれも本明細書において提供される方法によってタンパク質に付加可能である。
幾つかの実施形態では本明細書において提供されるタンパク質のうちのいずれも本明細書において提供される方法のうちの１つ以上により本明細書において提供される重合体のうちのいずれかに複合体化され得る。
幾つかの実施形態では本明細書において提供される製法によりタンパク質および／または抗体複合体を作製および精製するための大規模な処理が可能になる。幾つかの実施形態では使用体積は少なくとも１リットル、例えば１リットル、１０リットル、１００リットル、１，０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットル、またはそれより大きな体積である。幾つかの実施形態では作製および／または精製された前記抗体複合体の量は０．１グラム、１グラム、１０グラム、１００グラム、１０００グラム、またはそれより多くの量であり得る。
幾つかの実施形態では前記治療用タンパク質は組換えＤＮＡ技術により付加されたシステイン残基を有する本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体のうちのいずれかであり得る。幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ抗体重鎖は次のＣＤＲ、すなわちＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を有する。前記重鎖は位置２２１（配列番号３内に見られる配列カウントを介した位置）にトレオニン（Ｔ）も有し得る。幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ軽鎖は次のＣＤＲ、すなわちＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）、およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）を有する。前記抗ＶＥＧＦ－Ａ軽鎖はＫａｂａｔ位置４にロイシン（Ｌ）も有し得る。
幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体はＩｇＧ１である。幾つかの実施形態では前記重鎖は１つ以上の変異を有することでエフェクター機能を調節する。幾つかの実施形態では前記変異は次のアミノ酸位置、すなわちＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０、およびＰ３３１（ＥＵ式付番）の１つ以上のものである。幾つかの実施形態では前記変異はＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＥＵ式付番）からなる群より選択される。幾つかの実施形態では前記変異はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）である。
幾つかの実施形態では組換えＤＮＡ技術により前記治療用タンパク質に付加された前記システイン残基はＣｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド結合に関わってはならない。これに関し、
治療用タンパク質は二量体であってよい。例えば、完全抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が２本の軽鎖と２本の重鎖を有する。Ｃｙｓ残基が例えばその重鎖に導入される場合、その完全抗体は２つのそのような導入されたシステインを同じ位置に有することになり、これらのシステイン残基が鎖内ジスルフィド結合を形成する可能性が存在する。それらの導入されたシステイン残基がＣｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド結合を形成する場合、または相するような傾向を有する場合、その導入されたＣｙｓ残基は複合体化に有用とはならない。鎖内ジスルフィド結合を生じる重鎖および軽鎖内の位置を避ける方法が当技術分野において知られている。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５８９５２号明細書を参照されたい。
幾つかの実施形態では組換えＤＮＡ技術を介して導入された前記システイン残基はＱ３４７ＣおよびＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）からなる群より選択される。幾つかの実施形態では前記システイン残基はＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番、または配列番号１内の４４９Ｃ）である。幾つかの実施形態では前記抗体の重鎖は配列番号１に示されているアミノ酸配列を有し、軽鎖は配列番号２のアミノ酸配列を有する。
幾つかの実施形態では前記スルフヒドリル特異的反応基はマレイミドである。
幾つかの実施形態では前記半減期延長部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐型ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社；コベントリー、英国）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル－デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン・マレイン酸無水物共重合体、ポリスチレン・マレイン酸無水物共重合体、ポリ（１－ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、双性イオン性重合体、ａホスホリルコリン含有重合体、およびリン酸２－メタクリロイルオキシ－２’－エチルトリメチルアンモニウム（ＭＰＣ）含有重合体からなる群より選択される。
幾つかの実施形態では前記半減期延長部分は双性イオン性重合体である。幾つかの実施形態では前記双性イオンはホスホリルコリン、すなわちホスホリルコリン含有重合体である。幾つかの実施形態では前記重合体はＭＰＣ単位から構成される。
幾つかの実施形態では前記ＭＰＣ重合体は３本以上のアームを有する。幾つかの実施形態では前記ＭＰＣ重合体は２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、または１２本のアームを有する。幾つかの実施形態では前記ＭＰＣ重合体は３本、６本、または９本のアームを有する。幾つかの実施形態では前記ＭＰＣ重合体は９本のアームを有する。幾つかの実施形態では前記重合体は２か所、３か所、４か所、５か所、６か所、７か所、８か所、９か所、１０か所、１１か所、１２か所、またはそれより多くの重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される。
幾つかの実施形態では前記ＭＰＣ重合体は約３００，０００と１，７５０，０００Ｄａとの間の分子量を有する。幾つかの実施形態では前記ＭＰＣ重合体は約５００，０００と１，０００，０００Ｄａの間、または約６００，０００から９００，０００Ｄａの間の分子量を有する。
幾つかの実施形態では治療用タンパク質半減期延長部分複合体を調製する前記方法は還元システインスルフヒドリル基を作製する条件下においてその治療用タンパク質をチオー
ル還元剤と接触させる追加のステップを有する。先に考察したように、組換えＤＮＡ技術により付加された前記システイン残基が対合しない、すなわちＣｙｓ－Ｃｙｓ鎖内ジスルフィド結合に関与しないか、またはそのような結合に実質的に関与しないことが好ましい。しかしながら、そのようなＣｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド結合に関与せず、且つ、複合体化のために遊離状態であるＣｙｓ残基は前記媒体中の遊離システインと反応してジスルフィド付加物を形成することが知られている。例えば、国際公開ＷＯ２００９／０５２２４９号パンフレットを参照されたい。そのように誘導体化されたシステインは複合体化に利用可能ではなくなる。その新しく付加されたシステインがそのジスルフィド付加物に成らずに済むようにするため、精製後の前記タンパク質は還元剤、例えば、ジチオトレイトールで処理される。しかしながら、還元剤でのそのような処理は、多くが鎖間および鎖内Ｃｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド結合に関与する固有のシステインを含む前記治療用タンパク質内の前記システイン残基の全てを還元することになる。それらの固有のＣｙｓ－Ｃｙｓジスルフィドは一般的にタンパク質の安定性と活性にとって重要であり、それらは再形成される必要がある。幾つかの実施形態では全ての固有の（例えば、鎖間および鎖内）Ｃｙｓ－Ｃｙｓジスルフィドが再形成される。
固有の鎖間および鎖内ジスルフィド残基を再形成するため、前記システインジスルフィド付加物を除去するための還元の後に前記治療用タンパク質を所定の時間、例えば一晩にわたって酸化条件および／または酸化剤に曝露する。幾つかの実施形態ではそれらの固有のジスルフィド結合の再形成を達成するために一晩にわたる外気への曝露が用いられ得る。幾つかの実施形態ではそれらの固有のジスルフィドを再建するために酸化剤が用いられる。幾つかの実施形態では前記酸化剤はＣｕＳＯ４水溶液およびデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）からなる群より選択される。幾つかの実施形態では前記酸化剤はＤＨＡＡである。幾つかの実施形態では使用されるＤＨＡＡの範囲は５～３０当量の範囲内である。幾つかの実施形態では前記範囲は１０～２０当量である。幾つかの実施形態では前記範囲は１５当量である。
幾つかの実施形態では前記チオール還元剤はトリス［２－カルボキシエチル］ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、システイン塩酸塩、およびシステインからなる群より選択される。幾つかの実施形態では前記チオール還元剤はＴＣＥＰである。
幾つかの実施形態では前記チオール還元剤の濃度は前記治療用タンパク質の濃度と比べて１倍と１００倍の間でモル過剰である。幾つかの実施形態では前記チオール還元剤の濃度は前記治療用タンパク質の濃度と比べて２０倍から５０倍の間でモル過剰である。幾つかの実施形態では前記チオール還元剤は前記治療用タンパク質との保温の後、前記治療用タンパク質の酸化の前に除去される。
幾つかの実施形態では治療用タンパク質を半減期延長部分に複合体化するための前記方法は、複合体化の後に前記治療用タンパク質複合体を精製するステップをさらに有する。幾つかの実施形態ではイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー、またはそれらの組合せからなる群より選択される技法を用いて前記治療用タンパク質複合体が精製される。
幾つかの実施形態では前記治療用タンパク質複合体は非複合体化治療用タンパク質と比べて少なくとも２０％の生物活性を保持する。幾つかの実施形態では前記治療用タンパク質複合体は非複合体化治療用タンパク質と比べて少なくとも５０％の生物活性を保持する
。幾つかの実施形態では前記治療用タンパク質複合体は天然型治療用タンパク質と比べて少なくとも９０％の生物活性を保持する。
幾つかの実施形態では前記治療用タンパク質複合体は非複合体化治療用タンパク質と比べて増加した半減期を有する。幾つかの実施形態では前記治療用タンパク質複合体は非複合体化治療用タンパク質と比べて少なくとも１．５倍に増加した半減期を有する。幾つかの実施形態では前記治療用タンパク質複合体は非複合体化治療用タンパク質と比べて少なくとも５倍に増加した半減期を有する。
幾つかの実施形態では治療用タンパク質を半減期延長部分に複合体化する前記方法の前記双性イオン性重合体は双性イオン基を有するラジカル重合性単量体であり、その方法は重合媒体中のそのフリーラジカル重合性双性イオン性単量体を重合して重合体を提供する追加のステップを有し、前記媒体は、前記ラジカル重合性双性イオン性単量体、Ｍｔが遷移金属であり、ｑが前記金属のより高い酸化状態であり、且つ、ｑ－１が前記金属のより低い酸化状態である遷移金属触媒Ｍｔ （ｑ－１）＋であって、Ｘ’が対イオンまたは基であるＭｔ （ｑ－１）＋Ｘ’（ｑ－１）という形態の塩として供給される前記金属触媒、または前記遷移金属を酸化不活性状態から還元活性状態に還元することが可能である還元剤と共により高い酸化状態にある前記不活性金属塩Ｍｔ ｑ＋Ｘ’ｑを提供することによりインサイチュで供給される前記遷移金属触媒、リガンド、および開始剤を含む。
ＡＴＲＰ遷移金属触媒として機能するために前記遷移金属は１個の電子、より高い酸化状態、およびより低い酸化状態によって分けられる少なくとも２つの容易にアクセス可能な酸化状態を有する必要がある。ＡＴＲＰでは可逆的酸化還元反応によってそのより高い酸化状態とそのより低い酸化状態の間で前記遷移金属触媒が循環することになり、前記重合体鎖は生長鎖末端を有することとドーマント鎖末端を有することとの間で循環する。例えば、米国特許第７８９３１７３号明細書を参照されたい。
幾つかの実施形態では前記ラジカル重合性双性イオン性単量体は
Figure 0007088454000030
 からなる群より選択され、式中、Ｒ１はＨまたはＣ１～６アルキルであり、ＺＷは双性イオンであり、ｎは１から６までの整数である。
幾つかの実施形態では前記ラジカル重合性単量体は
Figure 0007088454000031
 であり、式中、Ｒ１がＨまたはＣ１～６アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４が同一または異なっており、且つ、ＨまたはＣ１～４アルキルであり、ＸおよびＹが同一または異なっており、且つ、１から６までの整数である。幾つかの実施形態ではＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれメチルであり、ＸおよびＹがそれぞれ２である。
幾つかの実施形態では前記ラジカル重合性単量体は
Figure 0007088454000032
 であり、式中、Ｒ１はＨまたはＣ１～６アルキルであり、Ｒ２およびＲ３が同一または異なっており、且つ、ＨまたはＣ１～４アルキルであり、Ｒ４はＰＯ４－、ＳＯ３－、またはＣＯ２－であり、ＸおよびＹが同一または異なっており、且つ、１から６までの整数である。幾つかの実施形態ではＲ１、Ｒ２およびＲ３はメチルであり、Ｒ４はＰＯ４－であり、ＸおよびＹがそれぞれ２である。
幾つかの実施形態では前記単量体は
Figure 0007088454000033
 であり、式中、Ｒ１はＨまたはＣ１～６アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が同一または異なっており、且つ、ＨまたはＣ１～４アルキルであり、Ｒ５はＰＯ４－、ＳＯ３－、またはＣＯ２－であり、ＸおよびＹが同一または異なっており、且つ、１から６までの整数である。幾つかの実施形態ではＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はメチルであり、Ｒ５はＰＯ４－であり、ＸおよびＹが２である。
幾つかの実施形態では前記遷移金属ＭｔはＣｕ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｍｎ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｃｏ、Ｖ、Ｚｎ、Ａｕ、およびＡｇからなる群より選択される。幾つかの実施形態では前記金属触媒はＭｔ （ｑ－１）＋Ｘ’（ｑ－１）という形態の塩として供給される。Ｍｔ （ｑ－１）＋はＣｕ１＋、Ｆｅ２＋、Ｒｕ２＋、Ｃｒ２＋、Ｍｏ２＋、Ｗ２＋、Ｍｎ３＋、Ｒｈ３＋、Ｒｅ２＋、Ｃｏ＋、Ｖ２＋、Ｚｎ＋、Ａｕ＋、およびＡｇ＋からなる群より選択され、Ｘ’はハロゲン、Ｃ１～６アルコキシ、（ＳＯ４）１／２、（ＰＯ４）１／３、（Ｒ７ＰＯ４）１／２、（Ｒ７２ＰＯ４）、トリフレート、ヘキサフルオロホスフェート、メタンスルホネート、アリールスルホネート、ＣＮ、およびＲ７がＨまたはハロゲンで１回から５回にわたって置換されてもよい直鎖もしくは分岐Ｃ１～６アルキル基であるＲ７ＣＯ２からなる群より選択される。幾つかの実施形態ではＭｔ （ｑ－１）＋はＣｕ１＋であり、Ｘ’はＢｒである。
幾つかの実施形態ではＭｔ （ｑ－１）＋はインサイチュで供給される。幾つかの実施形態ではＭｔ ｑ＋ＸｑはＣｕＢｒ２である。幾つかの実施形態では前記還元剤は無機化合物である。幾つかの実施形態では前記還元剤は低酸化レベルの硫黄化合物、亜硫酸水素ナトリウム、金属イオンを含む無機塩、金属、ヒドラジン水和物およびそのような化合物の誘導体からなる群より選択される。幾つかの実施形態では前記還元剤は金属である。幾つかの実施形態では前記還元剤はＣｕ０である。
幾つかの実施形態では前記還元剤は有機化合物である。幾つかの実施形態では前記有機化合物はアルキルチオール類、メルカプトエタノール、または容易にエノール化され得るカルボニル化合物、アスコルビン酸、アセチルアセトネート、カンファースルホン酸、ヒドロキシアセトン、還元糖、単糖類、グルコース、アルデヒド、およびそのような有機化合物の誘導体からなる群より選択される。
幾つかの実施形態では前記リガンドは２，２’－ビピリジン、４，４’－ジ－５－ノニル－２，２’－ビピリジン、４，４－ジノニル－２，２’－ジピリジル、４，４’，４’’－トリス（５－ノニル）－２，２’：６’，２’’－テルピリジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’－ペンタメチルジエチレントリアミン、１，１，４，７，１０，１０－ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、トリス（２－ジメチルアミノエチル）アミン、Ｎ，Ｎ－
ビス（２－ピリジルメチル）オクタデシルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ［（２－ピリダル）メチル］エチレンジアミン、トリス［（２－ピリジル）メチル］アミン、トリス（２－アミノエチル）アミン、トリス（２－ビス（３－ブトキシ－３－オキソプロピル）アミノエチル）アミン、トリス（２－ビス（３－（２－エチルヘキソキシ）－３－オキソプロピル）アミノエチル）アミンおよびトリス（２－ビス（３－ドデコキシ－３－オキソプロピル）アミノエチル）アミンからなる群より選択される。幾つかの実施形態では前記リガンドは２，２’－ビピリジンである。
幾つかの実施形態では前記開始剤は以下の構造を有し、
Figure 0007088454000034
 式中、Ｒ１が求核性反応基であり、Ｒ２がリンカーを含み、Ｒ３が以下の構造を有する重合体合成開始剤部分を含み、
Figure 0007088454000035
 式中、Ｒ４およびＲ５は同一または異なっており、且つ、アルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アリール、アリレン、アリレンオキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミドまたはそれらのあらゆる組合せからなる群より選択され、ＺがハロゲンまたはＣＮであり、ｓが１と２０の間の整数である。
幾つかの実施形態ではＺはＢｒであり、Ｒ４およびＲ５はそれぞれメチルである。幾つかの実施形態ではＲ１はＮＨ２－、ＯＨ－、およびＳＨ－からなる群より選択される。
幾つかの実施形態ではＲ２はアルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アリール、アリレン、アリレンオキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミドまたはそれらのあらゆる組合せである。幾つかの実施形態ではＲ２は
Figure 0007088454000036
 であり、式中、ＸおよびＹが同一または異なっており、且つ、１から２０までの整数である。幾つかの実施形態ではＸおよびＹはそれぞれ４である。
幾つかの実施形態ではＲ３は
Figure 0007088454000037
 であり、式中、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が同一または異なっており、且つ、
Figure 0007088454000038
Figure 0007088454000039
 、および
Figure 0007088454000040
 からなる群より選択され、式中、ＺがＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。幾つかの実施形態ではＺはＢｒであり、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８はそれぞれ
Figure 0007088454000041
 である。
幾つかの実施形態では前記開始剤は以下の構造を有し、
Figure 0007088454000042
 式中、ＡおよびＢが同一または異なっており、且つ、２から１２までの整数であり、およびＺはいずれかのハライド、例えばＢｒである。幾つかの実施形態ではＡおよびＢはそれぞれ４である。
幾つかの実施形態では前記方法は前記重合体をマレイミド試薬と反応させてマレイミド末端を有する重合体を提供するステップをさらに有する。幾つかの実施形態では前記マレイミド化合物は
Figure 0007088454000043
 である。
治療法
幾つかの実施形態では眼疾患の治療または予防のための方法であって、抗ＶＥＧＦ－Ａ
抗体（および抗体複合体）からなる群より選択される治療用タンパク質を投与するステップを有する前記方法が提供される。幾つかの実施形態では本明細書において提供される抗体または抗体複合体のうちのいずれか１つ以上を眼疾患の治療法および／または予防法として使用することができる。その方法は本明細書において提供される抗体または抗体複合体のうちのいずれか１つ以上を対象に投与することを含む。
幾つかの実施形態では眼疾患の治療または予防のための方法が提供される。その方法は必要とする対象に本明細書に記載される抗体および／または抗体複合体のうちのいずれかの有効用量を投与することを含む。幾つかの実施形態では前記疾患は加齢黄斑変性（ＡＭＤ）または糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）であり得る。幾つかの実施形態では前記疾患は湿潤型ＡＭＤであり得る。
幾つかの実施形態では前記眼疾患は糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜中心分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、結膜下出血、および高血圧性網膜症からなる群のうちの１つ以上から選択される。幾つかの実施形態では前記眼疾患は糖尿病網膜症である。
幾つかの実施形態では前記抗体または抗体複合体は１か月に１回よりも高い頻度で投与されない。幾つかの実施形態では前記抗体または抗体複合体は１か月に２回または毎週投与される。幾つかの実施形態では前記抗体または抗体複合体は２か月に１回、３か月に１回、４か月に１回、５か月に１回、６か月に１回、７か月に１回、８か月に１回、９か月に１回、１０か月に１回、１１か月に１回、または１２か月に１回投与される。
幾つかの実施形態では本明細書において提供される組成物のうちの１つ以上により、湿潤型（増殖性）の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の治療のために抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射を用いることによる高い治療負荷という結果を減少させることができる。湿潤型ＡＭＤの患者のリアルワールド（Ｒｅａｌ ｗｏｒｌｄ）での結果はルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）についてのＭＡＲＩＮＡ試験およびＡＮＣＨＯＲ試験、ならびにアイリーア（登録商標）（アフリベルセプト）についてのＶＩＥＷ１試験およびＶＩＥＷ２試験などの第３相臨床試験において示された臨床転帰に遅れる。より低い頻度で投与することができ、したがって患者がより耐えられるプロファイルで投与することができるようにより長い眼内滞在時間を有する抗ＶＥＧＦ治療薬は第３相臨床転帰により近いリアルワールド（Ｒｅａｌ ｗｏｒｌｄ）での結果をより多くの患者にもたらすことができる。
幾つかの実施形態では本明細書に記載される抗体複合体および抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体をはじめとする化合物を使用して背景糖尿病網膜症または非増殖性糖尿病網膜症を有するが、視力低下がほとんど、または全く無い患者を治療する。幾つかの実施形態ではそのような患者は１か月に１回よりも低い頻度で硝子体内注射により投薬される。幾つかの実施形態ではそのような患者は１年に６回投薬される。幾つかの実施形態ではそのような患者は１年に４回よりも多く投薬されることはない。幾つかの実施形態では前記患者は１年に３回よりも多く投薬されることはない。幾つかの実施形態では前記患者は１年に２回よりも多く投薬されることはない。幾つかの実施形態では前記患者は１年に１回よりも多く投薬されることはない。幾つかの実施形態では前記対象は硝子体内注射により前記抗体または抗体複合体を受容する。
本明細書に記載される治療用タンパク質（例えば、抗体と抗体複合体の両方）は患者内でのそのようなポリペプチドのインビボでの発現により、すなわち、遺伝子療法により使用され得る。
患者の細胞内にその核酸（所望によりベクター内に含有される）を入れることについては２つの主要なアプローチ、すなわちインビボアプローチとエクスビボアプローチが存在する。インビボ送達について、その核酸はその患者の中に直接的に、通常は前記治療用タンパク質が必要とされる部位に、すなわち、前記治療用タンパク質の生物活性を必要とする部位に注入される。エクスビボ治療について、その患者の細胞を取り出し、前記核酸をこれらの単離細胞に導入し、そしてそれらの改変細胞をその患者に直接的に投与し、または、例えば、その患者に移植される多孔性膜内に封入して投与する（例えば、米国特許第４８９２５３８号明細書および同５２８３１８７号明細書を参照されたい）。生きている細胞に核酸を導入することに利用可能な様々な技法が存在する。それらの技法はその核酸が培養細胞にインビトロで移入されるのか、または目的の宿主の細胞内にインビボで移入されるのかに応じて変化する。インビトロでの哺乳類細胞への核酸の移入に適切な技法にはリポソームの使用、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等が挙げられる。形質導入は、複製欠損組換えウイルス（レトロウイルスを含む）粒子の細胞受容体との接触とそれに続くその粒子に含まれている核酸のその細胞への導入を含む。遺伝子のエクスビボ送達のために一般的に使用されるベクターはレトロウイルスである。
幾つかの実施形態では前記インビボ核酸移入技法にはウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など）および脂質ベースの系（遺伝子の脂質介在性移入の有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ－Ｃｈｏｌであり、例えば、Ｔｏｎｋｉｎｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， １４（１）： ５４－６５ （１９９６）を参照されたい）を用いる形質移入が含まれる。幾つかの実施形態では遺伝子療法に使用される前記ベクターはウイルスであり、それらにはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、またはレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターは少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは座位規定因子、または選択的スプライシング、核内ＲＮＡ輸送、もしくはメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段によって遺伝子発現を制御する他の因子を含む。さらに、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターは、前記治療用タンパク質をコードする遺伝子が存在するなかで転写されるとき、その遺伝子と機能的に結合しており、且つ、翻訳開始配列として作用する核酸分子を含む。そのようなベクターコンストラクトは使用されるウイルスにとって適切なパッケージングシグナル、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）またはその一部、ならびにポジティブおよびネガティブストランドプライマー結合部位（これらがそのウイルスベクターに前もって存在していない場合）も含む。さらに、そのようなベクターはそのベクターが中に入っている宿主細胞からのＰＲＯポリペプチドの分泌のためのシグナル配列を含んでいることが典型的である。幾つかの実施形態ではこの目的のためのそのシグナル配列は哺乳類シグナル配列である。幾つかの実施形態ではそのシグナルは前記治療用タンパク質に固有のシグナル配列である。所望により前記ベクターコンストラクトはポリアデニル化を指示するシグナル、ならびに１つ以上の制限部位、および翻訳停止配列を含んでもよい。例として、そのようなベクターは５′ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２ストランドＤＮＡ合成起点、および３′ＬＴＲまたはその一部分を含むことが典型的である。カチオン性脂質、ポリリシン、およびデンドリマーなどの非ウイルス性である他のベクターが使用可能である。
幾つかの状況では標的細胞にターゲティングする因子、例えば、細胞表面膜タンパク質またはそれらの標的細胞に特異的な抗体、それらの標的細胞上の受容体のリガンド等を有する核酸源を提供することが望ましい。リポソームを使用する場合、例えば、特定の細胞種を指向するキャプシドタンパク質またはそれらの断片、細胞周期の中で内部化されるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在を標的とし、且つ、細胞内半減期を延長するタ
ンパク質をターゲティングするため、および／またはの取り込みを促進するためにエンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を使用してよい。受容体介在性エンドサイトーシスの技法は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ．，２６２： ４４２９－４４３２ （１９８７）、およびＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７： ３４１０－３４１４（１９９０）によって説明される。現在公知の遺伝子マーキングプロトコルおよび遺伝子療法プロトコルの総説についてはＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５６： ８０８－８１３ （１９９２）を参照されたい。国際公開ＷＯ９３／２５６７３号パンフレットおよびそのパンフレット内で引用されている参照文献も参照されたい。
適切な遺伝子療法ならびにレトロウイルス粒子および構造タンパク質を作製するための方法は、例えば、米国特許第５６８１７４６号明細書に見られる。
幾つかの実施形態では哺乳類動物における眼疾患の治療または予防のための方法であって、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体からなる群より選択される治療用タンパク質をコードする核酸分子が投与される前記方法が提供される。幾つかの実施形態では前記核酸は図２７に示されている。
幾つかの実施形態では前記重鎖は配列番号１に示されており、前記軽鎖は配列番号２に示されている。幾つかの実施形態では前記核酸分子はエクスビボ遺伝子療法を介して投与される。
治療タンパク質は薬学的に許容可能な賦形剤と共に医薬組成物に組み込まれ得る。経口投与向けに改変した医薬組成物はカプセル剤、水剤、シロップ剤、または懸濁剤（水性液体中または非水性液体中、または食用のフォームもしくはホイップとして、または乳剤として）などの個々の単位として提供され得る。錠剤または硬質ゼラチンカプセル剤に適切な賦形剤にはラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリン酸またはその塩が含まれる。軟質ゼラチンカプセル剤との使用に適切な賦形剤には、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体のポリオール、または液体のポリオール等が含まれる。水剤およびシロップ剤の調製のため、使用可能な賦形剤には、例えば、水、ポリオール、および糖が含まれる。懸濁剤の調製のため、油（例えば植物油）を使用して水中油型または油中水型の懸濁剤を提供することができる。
経鼻投与向けに医薬組成物を改変することができ、それらの医薬組成物では前記賦形剤は、鼻から吸い込むようにして投与される、すなわち鼻に近づけた粉体の容器から鼻道を通過する急速吸入により投与される例えば２０～５００ミクロンの粒径を有する粗粉末をはじめとする固形物である。鼻内スプレー剤または点鼻剤として投与するための前記賦形剤が液体である適切な組成物には前記活性成分の水剤または油剤が含まれる。吸入による投与向けに改変された医薬組成物には様々な種類の定量加圧エアロゾル剤、ネブライザ、またはインサフレーターによって生成され得る微粒子の煙霧が含まれる。
非経口投与向けに改変された医薬組成物には抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤の浸透圧を意中の受容者の血液の浸透圧と実質的に等圧にする溶質を含んでよい水性および非水性の無菌注射溶液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでよい水性および非水性の無菌懸濁剤が含まれる。注射溶液に使用され得る賦形剤には水、アルコール、ポリオール、グリセリン、および植物油が例として挙げられる。前記組成物は単位用量容器または多用量容器、例えば密封アンプル瓶およびバイアル瓶中に提供されてよく、且つ、使用直前の無菌液体担体、例えば注射用水の添加を必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で貯蔵されてよい。即時注射溶液および懸濁液は無菌の粉剤、顆粒剤、および錠剤から調製
され得る。医薬組成物は実質的に等張性であり得、それは約２５０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇ水の浸透圧を意味する。
前記医薬組成物は保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、着臭剤、塩（物質は薬学的に許容可能な塩の形態で提供され得る）、緩衝剤、被覆剤、または抗酸化剤を含んでよい。前記医薬組成物は前記物質に加えて治療活性薬剤を含んでもよい。前記医薬組成物は１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて使用され得る。そのような賦形剤には生理食塩水、緩衝生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水）、ブドウ糖、リポソーム、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが含まれ得るがこれらに限定されない。
前記抗体および前記抗体を含有する医薬組成物は、例えば、経口投与、硝子体内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、骨内投与、鼻腔内投与、局所投与、腹腔内投与、および病巣内投与をはじめとする患者の疾患の治療または予防に有効なレジメンで投与され得る。非経口注入にはなによりも筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下の投与または経路が含まれる。治療において、または予防として前記活性薬剤は注射可能組成物として、例えば無菌水性分散剤として個体に投与され得る。幾つかの実施形態では前記薬剤は等張性または実質的に等張性である。
哺乳類動物、および特にヒトへの投与について、前記活性薬剤の投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ体重からであり、典型的には１ｍｇ／ｋｇの辺りである。医師は個体に最も適切な実際の投与量を決定することができ、それはその個体の年齢、体重、性別、および応答、治療される疾患または障害、ならびに治療されるその個体の年齢および症状をはじめとする因子に左右される。上記投与量は平均的な事例の代表的な例である。言うまでもなく、より多い投与量またはより少ない投与量が考慮に値する例が存在し得る。幾つかの実施形態では前記投与量は０．５～２０ｍｇ／眼であり得、例えば、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、または１９ｍｇであり得る。
この投与量を必要に応じた頻度で反復することができる（例えば、週に１回、２週に１回、１か月に１回、２か月に１回、年に４回、年に２回、年に１回）。副作用が生じる場合、その投与量の量および／または頻度を通常の臨床診療に従って減らすことができる。１つの実施形態では前記医薬組成物は１日に１回から３０日に１回の頻度で投与され得る。１つの実施形態では前記医薬組成物は３０日に２回の頻度で投与され得る。１つの実施形態では前記医薬組成物は週に１回の頻度で投与され得る。
前記抗体および医薬組成物は単独で使用されても治療用の化合物または分子、例えば抗炎症薬、鎮痛剤、または抗生物質などの他の化合物と併用されてもよい。他の化合物とのそのような投与は同時、別々、または順次の投与であり得る。それらの構成要素は、必要に応じて指示書を含んでよいキットの形態で用意され得る。
本明細書において開示される抗体および医薬組成物は疾患、特に本明細書に記載される眼の疾患または症状の治療または予防のために使用され得る。
そのように使用されるとき、前記複合体は眼、眼内、および／または硝子体内の注射、および／または強膜近傍注射、および／または網膜下注射、および／またはテノン嚢下注射、および／または脈絡膜上注射および／または結膜下投与および／または局所投与のために点眼薬および／または軟膏の形態で製剤され、且つ、そのように投与されることが典型的である。そのような抗体および組成物は様々な方法で、例えば、Ｉｎｔｒａｏｃｕｌ
ａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｊａｆｆｅ， Ａｓｈｔｏｎ， ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ （Ｍａｒｃｈ ２００６）などの参照文献に記載されているものをはじめとする硝子体への前記化合物の徐放を可能にする装置および／またはデポーとして硝子体内に送達され得る。一例では、装置はミニポンプおよび／またはマトリックスおよび／または受動的拡散システムおよび／または長期間にわたって前記化合物を放出するカプセル化セルの形態であり得る（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｊａｆｆｅ， Ａｓｈｔｏｎ， ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ （Ｍａｒｃｈ ２００６）。
眼、眼内、または硝子体内の投与のための製剤は当技術分野において知られている方法により、当技術分野において知られている成分を使用して調製され得る。効率的な治療に対する主な必要事項は眼への適切な透過である。薬品が局所的に送達され得る眼の前部の疾患と異なり、網膜の疾患はより部位特異的なアプローチを必要とする。点眼薬および軟膏はほとんど眼の奥まで透過せず、血液眼関門が全身投与された薬品の眼組織への透過を妨害する。したがって、ＡＭＤおよびＣＮＶなどの網膜の疾患を治療するために選択される薬品送達の方法は通常では直接的硝子体内注射である。通常、硝子体内注射は患者の症状、および送達される薬品の特性と半減期に依存する間隔で反復される。
治療用抗体および関連の複合体は無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内輸液バッグまたは皮下注射針を突き刺すことができるストッパーを有するバイアル瓶の中に入れられることが一般的である。そのような組成物は充填済み注射筒の形態で供給されてもよい。
「安定」な製剤はその中の前記タンパク質または他の半減期延長部分を有する重合体に複合体化された前記タンパク質が基本的にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物活性を貯蔵時に保持する製剤である。「安定な」という言葉は凝集および／または脱アミド化を含む不安定性の兆候をほとんど、または全く示さない製剤を意味する。例えば、提供される前記製剤は表示されるように５～８℃の温度で貯蔵されると少なくとも２年間にわたって安定なままであり得る。
タンパク質安定性を測定するための様々な分析技法が当技術分野において利用可能であり、例えばＰｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ２４７－３０１（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９１年）およびＪｏｎｅｓ， １９９３ Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．
１０： ２９－９０に総説がまとめられている。安定性は選択された温度において選択された期間にわたって測定され得る。幾つかの実施形態では前記製剤の貯蔵は少なくとも６か月、１２か月、１２～１８か月、または２年以上にわたって安定である。
抗体またはその断片のようなタンパク質は医薬製剤の状態で、色や透明度を肉眼で検査したとき、またはＵＶ光散乱もしくはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したときに凝集、沈殿、脱アミド化および／または変性の兆候を全く示していない場合に「その物理的安定性を保持」している。
タンパク質は医薬製剤の状態で、前記タンパク質がその生物活性をまだ保持していると考えられるような化学的安定性が所与の時間で存在する場合に「その化学的安定性を保持」している。化学的安定性は化学的に変化した形態の前記タンパク質の検出および定量により評価され得る。化学的変化はサイズの変化（例えば、クリッピング）を含む場合があり、それは例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ
／ＴＯＦＭＳ）を用いて評価され得る。他の種類の化学変化には電荷の変化（例えば脱アミド化の結果として生じる）が挙げられ、それは例えばイオン交換クロマトグラフィーにより評価され得る。抗体は医薬製剤の状態で、例えば抗原結合アッセイで決定される場合に所与の時間でのその抗体の生物活性がその医薬製剤が調製された時点で示された生物活性の約１０％以内（アッセイ誤差の範囲内）であるときに「その生物活性を保持」している。
タンパク質重合体複合体は、前記タンパク質と前記重合体との間の化学結合が完全に維持されており、例えば、その化学結合が加水分解されていないか、または他の方法で破壊されていない場合に「その化学的安定性を保持」している。前記複合体のタンパク質部分は上記のようにその化学安定性を維持する。
「等張性」という言葉は目的の前記製剤が基本的にヒトの血液または硝子体液と同じ浸透圧を硝子体内注射のために有することを意味する。等張性製剤は約２５０～４００ｍＯｓｍまでの浸透圧を有することが一般的である。等張性は例えば蒸気圧浸透圧計または氷点浸透圧計を用いて測定され得る。
本明細書において使用される場合、「緩衝剤」はその酸塩基複合成分の作用によりｐＨ変化に抵抗する緩衝溶液を指す。幾つかの実施形態では前記緩衝剤は約３．０～約８．０まで、例えば約４．５～８まで、または約ｐＨ６～約７．５まで、または約６．０～約７．０まで、または約６．５～７．０まで、または約ｐＨ７．０～約７．５まで、または約７．１～約７．４までのｐＨを有する。上記の範囲の間のあらゆる点のｐＨも考えられている。
幾つかの実施形態では「ＰＢＳ」リン酸緩衝生理食塩水、トリスベース緩衝液およびヒスチジンベース緩衝液が使用される。。
幾つかの実施形態では前記ＰＢＳ緩衝液は少なくともＮａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４およびＮａＣｌから構成され、適切なｐＨを提供するように調節される。幾つかの実施形態では前記緩衝液はＫＣｌおよび他の塩、界面活性剤、および／または保存剤のような他の医薬賦形剤を含むことで安定な貯蔵溶液を提供し得る。
「保存剤」は、基本的に内部での細菌の活動を抑え、そうして例えば複数回使用製剤の生産を容易にするために前記製剤に含めることができる化合物である。潜在的な保存剤の例にはオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物）、および塩化ベンゼトニウムが挙げられる。他の種類の保存剤にはフェノール、ブチルアルコール、およびベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾールが挙げられる。
幾つかの実施形態ではヒトでの使用または動物での試験に安全である製剤は充分に低レベルのエンドトキシンを有する必要がある。「エンドトキシン」グラム陰性細菌の細胞膜に由来するリポ多糖（ＬＰＳ）である。エンドトキシンは疎水性脂質部分（リピドＡ）に共有結合した親水性多糖部分から構成される。Ｒａｅｔｚ ＣＲ， Ｕｌｅｖｉｔｃｈ ＲＪ， Ｗｒｉｇｈｔ ＳＤ， Ｓｉｂｌｅｙ ＣＨ， Ｄｉｎｇ Ａ， Ｎａｔｈａｎ
ＣＦ． １９９１． Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ： ａｎ ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｙ ｌｉｐｉｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｆｏｕｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． ５（１２）：２６５２－２６６０。リピドＡはエンドトキシンの生物学的活
性、すなわち、その毒性の大半の原因である。エンドトキシンは細菌細胞が死んだときにに大量に放出され、同様に増殖と分裂の間に大量に放出される。エンドトキシンは非常に熱安定性であり、通常の滅菌条件では破壊されない。極端な熱またはｐＨ、例えば、１８０～２５０℃および０．１Ｍを超える酸または塩基での処理が用いられなければならない（Ｐｅｔｓｃｈ Ｄ， Ａｎｓｐａｃｈ Ｆ． ２０００． Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｒｅｍｏｖａｌ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７６： ９７－１１９）。そのような条件は生物学的製剤にとって非常に有害であることは言うまでもない。
バイオテクノロジーおよび製薬業界において製品生産工程と最終製品の両方においてエンドトキシンを見つけ出すことが可能である。細菌は水、生理食塩水および緩衝剤を含む貧栄養媒体の中で増殖可能であるので予防策が取られない限りエンドトキシンは至る所にある。動物またはヒトへのエンドトキシンの注射はエンドトキシンショック、組織傷害、および死さえも含む多種多様な病態生理学的作用を引き起こす。Ｏｇｉｋｕｂｏ Ｙ， Ｏｇｉｋｕｂｏ Ｙ， Ｎｏｒｉｍａｔｓｕ Ｍ， Ｎｏｄａ Ｋ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｊ， Ｉｎｏｔｓｕｍｅ Ｍ， Ｔｓｕｃｈｉｙａ Ｍ， Ｔａｍｕｒａ Ｙ． ２００４． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ
ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ３２：８８－９３。
発熱反応およびショックが低い濃度（１ｎｇ／ｍＬ）のエンドトキシンの静脈内注射時に哺乳類動物において誘導される（Ｆｉｓｋｅ ＪＭ， Ｒｏｓｓ Ａ， ＶａｎＤｅｒＭｅｉｄ ＲＫ， ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ＪＣ， Ａｒｕｍｕｇｈａｍ． ２００１． Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｉｎ Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＵｓｐＡ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍ Ｂ． ７５３：２６９－２７８）。医薬生物学的製剤の静脈内投与についてエンドトキシンの最大レベルは全ての薬局方によって１時間当たり１ｋｇの体重につき５エンドトキシン単位（ＥＵ）に定められている（Ｄａｎｅｓｈｉａｍ Ｍ， Ｇｕｅｎｔｈｅｒ Ａ， Ｗｅｎｄｅｌ Ａ， Ｈａｒｔｕｎｇ Ｔ， Ｖｏｎ Ａｕｌｏｃｋ Ｓ． ２００６． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｙｒｏｇｅｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｏｘｉｃ ｏｒ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ ３１３：１６９－１７５）。ＥＵはエンドトキシンの生物活性の測定値である。例えば、１００ｐｇの標準的エンドトキシンＥＣ－５および１２０ｐｇの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４由来のエンドトキシンは１ＥＵの活性を有する（Ｈｉｒａｙａｍａ Ｃ， Ｓａｋａｔａ Ｍ． ２００２． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｂｙ
ｐｏｌｙｍｅｒ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍ Ｂ ７８１：４１９－４３２）。この閾値レベルを満足させることは生物学の研究および製薬業界において常に困難なことであった（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｗ， Ｗａｌｔｅｒ Ｊ． １９９４． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２２：１３５－１５０； Ｐｅｔｓｃｈ Ｄ， Ａｎｓｐａｃｈ ＦＢ． ２０００． Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｒｅｍｏｖａｌ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈ ７６：９７－１１９）。
硝子体内注射により送達される薬品の中のエンドトキシンの存在は特に懸念される。薬品（ペニシリン）の硝子体内注射は１９４５年にＲｙｃｒｏｆｔによって初めて実施された。Ｒｙｃｒｏｆｔ ＢＷ． １９４５． Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｄｅｅｐ ｉｎｔｒａ－ｏｃｕｌａｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｂ
ｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２９ （２）： ５７－８７。硝子体は高レベルの薬品を導入し、比較的に長期間にわたって維持することができる小室である。硝子体内注射により達成可能な薬品濃度は局所投与によって、または全身投与（例えば静脈内投与）によって生じ得る濃度をはるかに超える。
硝子体内注射により生じる可能性がある最も危険な合併症のうちの１つが眼内炎である。眼内炎は感染性眼内炎と無菌性眼内炎の２つの分類に分かれる。感染性眼内炎は一般的に細菌、真菌、または寄生生物によって引き起こされる。感染性眼内炎の症状には重症の疼痛、視力喪失、ならびに結膜および下層の上強膜の発赤が挙げられる。感染性眼内炎は至急の診断と治療を必要とする。あり得る治療法には抗生物質の硝子体内注射および幾つかの事例では毛様体扁平部硝子体切除術が挙げられる。見えない眼、および痛そうな眼を取り出すことを眼摘出術と呼ぶ場合がある。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｙ ＮＥ， Ｓｏｍｍｅｒ Ａ． １９７９． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｏｆ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｅｎｄｏｐｈｔｈａｌｍｉｔｉｓ． Ａｎｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １１ （８）： １２６１－１２６５．を参照されたい。
無菌性眼内炎は対照的に感染性因子の関与を持たず、それは硝子体内抗生物質および／または硝子体網膜手術を必要とせずに解決する硝子体腔の急性眼内炎症として定義され得る。硝子体の微生物学的試験が行われている場合、それは無菌性眼内炎の診断を維持することが証明された陰性の培養であることが必要である。Ｍａｒｔｉｃｏｒｅｎａ Ｊ， Ｒｏｍａｎｏ Ｖ， Ｇｏｍｅｚ－Ｕｌｌａ Ｆ． ２０１２ “Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｅｎｄｏｐｈｔｈａｌｍｉｔｉｓ ａｆｔｅｒ Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ” Ｍｅｄ Ｉｎｆｌａｍ． ９２８１２３。
エンドトキシンで汚染された生物学的製剤の硝子体内注射が無菌性眼内炎を引き起こし得ることが観察されている。Ｍａｒｔｉｃｏｒｅｎａ， ｅｔ ａｌ。
ベバシズマブ（アバスチン）は膠芽腫の治療、ならびに転移性大腸癌、進行した非扁平非小細胞肺癌、および転移性腎臓癌の治療について米国食品医薬品局によって認可されている。ベバシズマブは湿潤型ＡＭＤの治療法としても認可外で広く使用されている。ベバシズマブは製造業者から１００ｍｇ／４ｍｌとして供給される。この溶液を硝子体内注射に直接的に使用することはできず、その溶液は薬剤師によって調合される必要がある。無菌性眼内炎のクラスターが観察されており、調合薬剤師による不注意なエンドトキシンによるベバシズマブの汚染によって生じると説明されている。
エンドトキシンの硝子体内注射の悲惨な臨床的帰結を考慮すると、硝子体内投与により患者に与えることができるエンドトキシンの総量は非常に限られている。幾つかの実施形態では５．０ＥＵ／ｍｌを超えないエンドトキシンレベルを有する抗体または抗体複合体を有する溶液が提供される。幾つかの実施形態では前記エンドトキシンレベルは１．０ＥＵ／ｍｌを超えない。幾つかの実施形態では前記エンドトキシンレベルは０．５ＥＵ／ｍｌを超えない。幾つかの実施形態では前記エンドトキシンレベルは０．２ＥＵ／ｍｌを超えない。幾つかの実施形態では前記エンドトキシンレベルは２ＥＵ／ｍｌ、１ＥＵ／ｍｌ、０．５ＥＵ／ｍｌ、０．２ＥＵ／ｍｌ、０．１ＥＵ／ｍｌ、０．０９ＥＵ／ｍｌ、０．０８ＥＵ／ｍｌ、０．０７ＥＵ／ｍｌ、０．０６ＥＵ／ｍｌ、０．０５ＥＵ／ｍｌ、０．０４ＥＵ／ｍｌ、０．０３ＥＵ／ｍｌ、０．０２ＥＵ／ｍｌ、または０．０１ＥＵ／ｍｌを超えない。
ＦＤＡが認可したエンドトキシンの存在についての２種類の一般的に用いられる検査はウサギ発熱性物質検査とカブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）アッセイである（Ｈｏｆｆｍａｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． ２００５． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｙｒｏｇｅｎ ｔｅｓｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｈｕｍａｎ
ｍｏｎｏｃｙｔｏｉｄ ｃｅｌｌｓ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９８：１６１－１７３、Ｄｉｎｇ ＪＬ， Ｈｏ ＢＡ． ２００１． Ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｐｙｒｏｇｅｎ ｔｅｓｔｉｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９：２７７－２８１）。ウサギ発熱性物質検査は１９２０年代に開発され、検査溶液を注射されたウサギにおける温度上昇のモニタリングを含む。しかしながら、ウサギ発熱性物質検査の使用は高価であることと長い所要時間のために年とともに大幅に減少した。ずっと一般的であるのはＬＡＬ検査である。ＬＡＬはアメリカカブトガニの血液に由来し、およびエンドトキシンへ曝露されると凝固する。
最も簡易なＬＡＬアッセイのうちの１つがＬＡＬゲルクロットアッセイである。基本的にＬＡＬ凝固アッセイは問題となっている試料の段階希釈物と組み合わせられる。ゲルの形成はその試料中のエンドトキシン量に比例する。その試料から段階希釈物を調製し、各希釈物のＬＡＬゲル形成能についてその希釈物をアッセイする。陰性反応がある点で含まれる。最初の試料中のエンドトキシン量を希釈物アッセイから推定することができる。
他のＬＡＬ検査も開発されており、それらには比濁法ＬＡＬアッセイ（Ｏｎｇ ＫＧ，
Ｌｅｌａｎ ＪＭ， Ｚｅｎｇ ＫＦ， Ｂａｒｒｅｔｔ Ｇ， Ａｏｕｒｏｂ Ｍ，
Ｇｒｉｍｅｓ ＣＡ． ２００６． Ａ ｒａｐｉｄ ｈｉｇｈｌｙ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２１：２２７０－２２７４）および発色性ＬＡＬアッセイ（Ｈａｉｓｈｉｍａ Ｙ， Ｈａｓｅｇａｗａ Ｃ， Ｙａｇａｍｉ Ｔ， Ｔｓｕｃｈｉｙａ Ｔ， Ｍａｔｓｕｄａ Ｒ， Ｈａｙａｓｈｉ Ｙ． ２００３． Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｉｎ ｋｉｎｅｔｉｃ－ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ． ３２：４９５－５０３）が含まれる。比濁法アッセイおよび発色性アッセイは簡易なゲルクロット希釈物アッセイよりもずっと感度が高く、且つ、定量的である。
幾つかの実施形態では本明細書において開示される抗体を有する組成物中のエンドトキシンの量を減少させる方法が提供される。前記方法は前記抗体に結合するアフィニティークロマトグラフィー樹脂と前記組成物を接触させるステップ、前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂から前記抗体を溶出して前記アンタゴニストを有するアフィニティークロマトグラフィー溶出液を形成するステップ、前記抗体に結合するイオン交換樹脂と前記アフィニティークロマトグラフィー溶出液を接触させるステップ、および前記イオン交換樹脂から前記抗体を溶出するステップを有し、前記イオン交換樹脂から溶出された前記抗体はエンドトキシンを実質的に含まない。
エンドトキシン量を減少させるための上記の方法、または本明細書において列挙される他の方法もしくは過程は上記の工程で説明された順序で実施可能であり、または所望によりそれらの工程の順序を変更して実施可能であり、またはそれらの工程のうちの１つ以上を反復しても実施可能である。１つの実施形態では組成物中のエンドトキシンの量を減少させる前記方法は説明された工程の順序で実施される。幾つかの実施形態では前記のアフィニティークロマトグラフィー樹脂との接触ステップ、洗浄ステップ、および溶出ステップは前記アフィニティークロマトグラフィー溶出液を前記イオン交換樹脂と接触させる前に同じ順序で１回よりも多い回数で反復される。前記方法は、各樹脂結合ステップの後に取り出された前記溶出液のうちのいずれか１つ以上に対して実施され得るフィルター濾過ステップであって、例えば、０．１ミクロン、０．２２ミクロン、または０．４４ミクロンのフィルターを使用するフィルター濾過ステップを含むこともできる。
ある特定の例では前記組成物のアフィニティークロマトグラフィー樹脂との接触ステッ
プ、洗浄ステップ、および前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂からの前記抗体の溶出ステップは最初の溶出液をイオン交換樹脂と接触させる前に１回よりも多い回数で反復可能である。１つの実施形態では前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂は組換え型プロテインＡを含む。
（「ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ」）樹脂。適切な組換え型プロテインＡ樹脂の一例はｒＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（登録商標）樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）である。別の実施形態では適切なアフィニティークロマトグラフィー樹脂はプロテインＧクロマトグラフィー樹脂を含むことになる。他の実施形態では適切なアフィニティークロマトグラフィー樹脂はプロテインＡ／プロテインＧ混合樹脂を含む。他の実施形態では適切なアフィニティークロマトグラフィー樹脂はＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（登録商標）樹脂（ＢｉｏＳｅｐｒａ社、セルジー・サンクリストフ、フランス）などの４－メルカプトエチルピリジンリガンドを含有する疎水性電荷誘導樹脂を含む。
幾つかの実施形態では前記イオン交換樹脂は陰イオン交換樹脂を含む。当業者が知っているように、イオン交換体は結合している荷電基と同様にマトリックスに関しても様々な材料に基づき得る。例えば、言及される材料が概ね可溶されていてよい以下のマトリックス、すなわちＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、アガロースベースマトリックス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（登録商標）、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（登録商標）など）、セルロースベースマトリックス（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌ（登録商標）など）、デキストランベースマトリックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）など）、シリカベースマトリックス、および合成重合体ベースマトリックスを使用してよい。その陰イオン交換樹脂について、前記マトリックスに共有結合している前記荷電基は、例えば、ジエチルアミノエチル、第四級アミノエチル、および／または第四級アンモニウムであり得る。幾つかの実施形態では前記陰イオン交換樹脂は第四級アミン基を含む。前記抗Ｍ－ＣＳＦ抗体を結合するために第四級アミン基を有する例となる陰イオン交換樹脂はＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）である。
他の態様では、前記組成物を前述の陰イオン交換クロマトグラフィーステップにかけた後にエンドトキシンレベルが所望のレベルよりも高い場合、別の方法において前記組成物を陽イオン交換樹脂の対象としてよい。幾つかの実施形態では前記組成物中のどんなエンドトキシンも、前記エンドトキシンからの問題となっている前記タンパク質の精製を可能にする、前記タンパク質とは特異な前記イオン交換樹脂への結合を有しているはずである。これに関し、エンドトキシンは負に帯電しており、一般的に陰イオン交換樹脂に結合する。前記タンパク質と前記エンドトキシンの両方が陰イオン交換樹脂に結合する場合、他方のものからの一方の精製はそれらの２つのものを異なる画分に溶出する塩濃度勾配を用いることで実施され得る。特定の樹脂への前記タンパク質の相対的結合は前記タンパク質のｐＩに対して前記緩衝液のｐＨを変更することによっても実行され得る。幾つかの実施形態では陽イオン交換クロマトグラフィーが採用される唯一のイオン交換クロマトグラフィーである。
幾つかの実施形態では、前記陰イオン交換樹脂の後にエンドトキシンレベルがあまりにも高い場合、さらに前記組成物を、例えば、前記組成物を陽イオン交換樹脂と接触させることによる２回目のイオン交換ステップ、その後の洗浄ステップ、その後の前記イオン交換樹脂からの溶出の対象とすることができる。幾つかの実施形態では前記陽イオン交換樹脂は結合のためにスルホン基を含む。例となる陽イオン交換樹脂はＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州
）、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ（ＣＥＸ）（ライフテクノロジー社、グランドアイランド、ニューヨーク州）である。
幾つかの実施形態では明示されたレベルのエンドトキシンを有する前記抗体タンパク質溶液を作製した後、前記タンパク質の最終的製剤の前に多数の工程が存在する。幾つかの実施形態では半減期延長部分が前記タンパク質に複合体化される。その複合体を次に患者に注射される最終的な製剤に製剤する。幾つかの実施形態では前記複合体を陽イオン交換樹脂であり得るイオン交換樹脂で再び精製する。他の実施形態では前記タンパク質を製剤する。全ての場合で前記タンパク質試料または前記タンパク質重合体複合体へのエンドトキシン汚染物質の混入を防止するために通常の検査法が採用されるべきである。
実施例１．経路１：ＯＧ１８０２の合成
ＯＧ１８０２の合成のための第１経路は以下の通りである。まず、図１に示されている構造を有するＴＦＡ／アミン塩開始剤（化合物Ｌ）を以下のように合成した。
まず、図２に示されている構造を有する化合物Ｋを以下のように合成した。窒素下で２００ｍＬの丸底フラスコに化合物Ｊ（ＯＧ１５６３）（１．９ｇ、２．６７ｍｍｏｌ、３．３当量）
Figure 0007088454000044
 と化合物Ｅ（０．５２５ｇ、０．８１ｍｍｏｌ、１．０当量）（図１１参照）を入れ、続いてジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）、後にジイソプロピルエチルアミン（２．５ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ、１８当量）を入れた。氷浴を使用してそのフラスコを０℃まで冷却した。これにプロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中に５０重量％、２．５ｍＬ、４．０４ｍｍｏｌ、５当量）を約６分にわたって添加した。
その反応物を室温まで温め、１５分間にわたって撹拌した。その反応物の反応を水（２０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）および酢酸エチル（１００ｍＬ）の添加により停止した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（７５ｍＬ）で抽出した。混
合した有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）、０．５Ｍクエン酸水溶液（４０ｍＬ）、水（２５ｍＬ）、および飽和塩化ナトリウム水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した後に乾燥し（硫酸ナトリウム）、濾過し、そして真空下で濃縮した。さらに精製することなく使用される残留物に２．０ｇ（０．８０ｍｍｏｌ、９９％）の化合物Ｋが生じた。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ＝ １．３６ （ｓ， ９Ｈ， ＯＣＣＨ３）， １．９０ （ｓ， ５４Ｈ， ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ）， ２．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ６Ｈ， ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）， ２．９８ （ｄ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， ６Ｈ， ＣＣＨ２ＮＨ）， ３．０４ （ｑ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ， ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）， ３．１８ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ２Ｃ）， ３．３－３．３７ （ｍ， ８Ｈ， ＣＨ２）， ３．４７－３．５５ （ｍ， １２Ｈ， ＣＨ２）， ３．５８ （ｓ， ６Ｈ， ＯＣＨ２Ｃ）， ３．８７
（ｓ， ６Ｈ， Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ）， ４．２７ （ｓ， １８Ｈ， ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ）， ６．７４ （ｂｒ ｔ， １Ｈ， ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ）， ７．６９ （ｔ，
Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ， ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ）， ７．８４ （ｔ， Ｊ ＝
６．０ Ｈｚ， ３Ｈ， ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ）．
ＬＣ－ＭＳ （ＥＳ， ｍ／ｚ）： ［（Ｍ＋２Ｈ－ｂｏｃ）／２］＋ （Ｃ８４Ｈ１３６Ｂｒ９Ｎ７Ｏ３３＋２Ｈ－Ｂｏｃ）／２の計算値：１１９６．６； 実測値：１１９６．６。
次に化合物Ｌ（図１）を以下の通りに合成した。窒素下で１００ｍＬの丸底に化合物Ｋ（２．０ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、その後にトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加えた。その反応物を室温で３０分間にわたって撹拌した。その反応物を真空下で濃縮した。ジクロロメタン（１０ｍＬ）を使用してその反応物を希釈し、それを真空下で濃縮した。アセトニトリル（１０ｍＬ）を使用してその残留物を溶解し、シリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ ＣＲ２５、ＰＮ ４２２５Ｔ）に通して濾過し、分取ＨＰＬＣカラムに負荷し、そして６０％アセトニトリル水溶液（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）から最大で９８％のアセトニトリル水溶液（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）で溶出した。生成物を含むチューブをプールし、真空下で濃縮し、凍結し、そして凍結乾燥機に設置した。これにより白色の粉末として９９０ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ、２ステップで５０％）の化合物Ｌが生じた。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ＝ １．９０ （ｓ， ５４Ｈ， ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ）， ２．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ６Ｈ， ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）， ２．９７－３．０ （ｍ， ８Ｈ， ＣＣＨ２ＮＨ および ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）， ３．１７ （ｓ， ２Ｈ， ＯＣＨ２Ｃ）， ３．３ （ｑ， ６Ｈ， ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ）， ３．４－３．５９ （ｍ， ２０Ｈ， ＣＨ２）， ３．８７ （ｓ， ６Ｈ， Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ）， ４．２７ （ｓ， １８Ｈ， ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ）， ７．６９－７．８４ （ｍ， ９Ｈ， ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ
とＮＨ３＋の両方）．
ＬＣ－ＭＳ （ＥＳ， ｍ／ｚ）： ［（Ｍ＋２Ｈ）／２］＋ （Ｃ８４Ｈ１３６Ｂｒ９Ｎ７Ｏ３３＋２Ｈ）／２の計算値：＝ １１９６．６； 実測値：１１９７．４。
次に、化合物Ｌを開始剤として使用してＭＰＣ重合体を合成した。開始剤をＤＭＦ中に約１００ｍｇ／ｍＬの原液として調製することが典型的である。その開始剤とリガンド（２，２’－ビピリジル）をシュレンクチューブに入れた。それにより生じた溶液を、ドライアイス／アセトン混合物を使用して－７８℃まで冷却し、そして真空下で１０分間にわたって脱気した。そのチューブをアルゴン下で再充填し、アルゴン下に保たれた触媒（別段の指示が無い限りＣｕＢｒ）をそのシュレンクチューブの中に入れた（開始剤／触媒（ＣｕＢｒ）／リガンド上の臭素原子のモル比を１／１／２に保持した）。その溶液はすぐに濃褐色になった。そのシュレンクチューブを密封し、短いサイクルの真空／アルゴンを適用することによりすぐにそのチューブをパージした。窒素下に保ってグローブボックス
内で調製された所定量の単量体を２００プルーフの脱気済みエタノールと混合することによりＨＥＭＡ－ＰＣ溶液を調製した。その単量体溶液を前記シュレンクチューブに（カニューレを介して）滴下（および軽い撹拌によりホモジナイズ）した。温度を－７８℃に維持した。完全な真空を前記反応混合物に少なくとも１０～１５分間にわたって前記溶液からの泡立ちが止むまで適用した。次にそのチューブにアルゴンを再充填し、室温まで温めた。その溶液を撹拌し、重合が進行するにつれ、前記溶液が粘体状になった。３～８時間後、または単に一晩放置した後、Ｃｕ（Ｉ）をＣｕ（ＩＩ）に酸化するために空気に直接曝露することで前記反応物の反応を停止し、その混合物の色が青緑色になり、前記銅触媒を除去するためにその混合物をシリカカラムに通した。集められた溶液を回転蒸発により濃縮し、それにより生じた混合物をテトラヒドロフランで沈殿させるか、または水に対して透析し、続いて凍結乾燥してさらさらの白色粉末を得た。下の表１．１は化合物Ｌを開始剤として使用した重合体についての重合体データを示している。
Figure 0007088454000045
次に、ＯＧ１８０２を提供するために上で言及された前記７５０ｋＤａ重合体にマレイミドＭａｌ－ＰＥＧ４－ＰＦＰエステルを（図２９に示されるように）結合した。２０ｍＬのバイアル瓶に重合体Ｒ３７０７（開始剤としてＬを使用して作製された７５０ｋＤａの重合体、５１５ｍｇ）を入れ、エタノール（４．０ｍＬ）を使用して４０分間にわたって撹拌したあとにそれを溶解した。これにアセトニトリル中に１％の４－メチルモルホリン溶液（２２μＬ）を添加した。別のバイアル瓶の中でアセトニトリル（１．０ｍＬ）中にＭａｌ－ＰＥＧ４－ＰＦＰ（１．９７ｍｇ）を溶解し、前記重合体溶液にこの溶液を室温で約２分にわたって添加し、それにより生じた溶液を終夜撹拌した。その反応物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（２ｍＬ）（ｐＨ約５）、続いて水（約１２ｍＬ）で希釈し、シリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ４６１２）に通して濾過し、そして３本のＡｍｉｃｏｎ遠心膜透析チューブ（３０，０００ｍｗｃｏ）に均一に入れた。それらのチューブを水（約５ｍＬずつ）と希釈および混合し、２５分間にわたって遠心分離（３２００ｒｐｍ）にかけた。濾液を分析のために取り除き、一方で残余物を水（約１０ｍＬ／チューブ）と希釈および混合する。その遠心分離手順をさらに５回繰り返し、その後に残余分を取り除き、バイアル瓶に入れた。それらのＡｍｉｃｏｎ膜チューブを水（各チューブ約２ｍＬ×２回）で洗浄し、これを前記残余分と混合した。その残余分溶液をシリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ４６１２）に通して濾過し、凍結し、そして凍結乾燥機に設置した。これにより４８５ｍｇが白色の粉末として生じた。
実施例２．開始剤ＯＧ１７８６の合成
ＯＧ１７８６はＯＧ１８０２合成の前駆体として使用される重合体合成用の９本のアームを有する開始剤である。各アームはＡＴＲＰにより重合を開始することが可能である２－ブロモイソブチレートで封止されている。ＯＧ１７８６は図３０に示されているようにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩である。ＯＧ１７８６は以下のように調製される。まず、図３１に示されているようにＯＧ１５５０をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）と反応させてＯ
Ｇ１５４６を作製する。
磁気撹拌子と滴下漏斗を装備した１Ｌの丸底フラスコの中にＯＧ１５５０（１４．８ｇ）、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（３５０ｍｌ）および水（３０ｍｌ）を加えた。その混合物を撹拌してそのＯＧ１５５０を溶解した後に氷浴中で冷却した。この混合物に水（９０ｍｌ）の中のトリフルオロ酢酸の溶液（４．９ｍｌ）を滴下しながら９０分にわたって添加した。添加完了後に混合物をさらに１５分間撹拌し、次に氷浴から取り出して室温まで温めた。その混合物を（氷浴から取り出した後に）さらに４～５時間にわたり、約５％の出発物質が残っていることがＴＬＣにより示され、且つ、その水溶液のｐＨが３と４の間になる（ｐＨペーパー）まで撹拌した。
前記混合物を分配した。ＭＴＢＥ層を水（３０ｍｌ）で洗浄した。水層を混合した後にその水層をＭＴＢＥ（１５０ｍｌ）で抽出した。この第２のＭＴＢＥ相を水（３０ｍｌ）で洗浄した。その混合した水層を３回目のＭＴＢＥ（１００ｍｌ）で洗浄した。その第３のＭＢＴＥ相を水（２５ｍｌ）で洗浄した。それらの水層を再度混合した（約２５０ｍｌ、ｐＨ約４、ｐＨペーパーによる）。
その生成物を凍結乾燥により収集した。１１．５ｇの白色の固形物が得られた。この物質は極めて吸湿性であるので窒素下で取り扱うことが最も良い。その生成物をＬＣＭＳにより確認した。
調製したＯＧ１５４６を次に（図３２に示されているように）ＯＧ１５６３と反応させてＯＧ１７８４を得た。
撹拌子を装備した窒素下にある２５０ｍｌのフラスコの中にＯＧ１５４６（吸湿性，９．０ｇ）を加え、続いてＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１１０ｍｌ）を加えた。その混合物を全てのＯＧ１５４６が溶解するまで（約１５分）室温で撹拌し、次にＯＧ１５６３（２９．９ｇ）を添加し、そのＯＧ１５６３も溶解されるまでその混合物をさらに３分間撹拌した。それにより生じた溶液を氷浴中で冷却し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３７．６ｍｌ）を３分にわたって添加し、続いて酢酸エチル（３４．５ｍｌ）中の５０％プロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）を滴下しながら５分にわたって添加した（Ｔ３Ｐの添加は発熱性である）。Ｔ３Ｐ添加の完了後、そのフラスコを冷却浴から取り出して室温まで到達させた。その後、ＬＣＭＳ分析のために５分間隔で試料を採取した。その反応物は非常に明るい黄色／黄褐色を示した。
２０分後、前記反応物を氷浴中で再度冷却し、そして５ｍｌの水を添加した。その後、その混合物をその冷却浴から取り出し、さらに５０ｍｌの水を添加し、続いて５０ｍｌの０．５Ｍクエン酸、次に酢酸イソプロピル（３００ｍｌ）を添加した。その混合物を分配した。水相（約３００ｍｌ）を追加の酢酸イソプロピル（１５０ｍＬ）で抽出した。その水相はＨＰＬＣ検査のＡＱ１であった。混合した有機質をクエン酸水溶液（１１５ｍｌ、６５ｍＭ、１５ｍｌの０．５Ｍクエン酸と１００ｍｌの水の混合物であった）で洗浄した。その水相がＡＱ２（ｐＨ約３）であった。その有機相を水／飽和塩化ナトリウム（１００ｍｌ／２５ｍｌ）で洗浄した。その水相がＡＱ３（ｐＨ約３）であった。その有機相を最後に飽和塩化ナトリウム（１００ｍｌ）で洗浄した。その水相がＡＱ４であった。それらのＡＱ画分の中にはいくらかでも生成物を含むものは無かった（データを示さず）。ＬＣＭＳによりその有機相に生成物が認められた。その生成物を硫酸ナトリウム（８０ｇ）上で乾燥し、濾過し、酢酸イソプロピル（７５ｍｌ）で洗浄し、そして黄褐色の油（３３．２ｇ）になるまでロータリーエバポレーター上で濃縮した。その粗生成物を窒素下で一晩にわたって貯蔵した。
翌日、前記粗生成物を室温にした後にアセトニトリル／水（４６ｍｌ／１２ｍｌ）中に溶解し、そしてＨＰＬＣフィルターディスク（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ ＰＴＦＥ ０．２μｍ、製品番号０２９１５－２０）を使用して濾過した。濾液を等量で３分割し、３回の操作で精製した。
前記濾液を５０％アセトニトリル／水で平衡化したＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ Ｃ１８カラム（２７５ｇ、ＳＮ６９－２２０３－３３９、ロット番号２４１２６－６１１Ｙ）に負荷した。以下の濃度勾配（溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：アセトニトリル）を使用して１００ｍｌ／分の速度でその物質を溶出した。ＨＰＬＣにより全ての適切な画分をチェックした。充分に純粋であると判断された（３回全ての操作の）画分をプールし、ロータリーエバポレーター上で濃縮し（水浴温度を約２０℃に保持した）、その後にジクロロメタン（１００ｍｌ）と水（５ｍｌ）／飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）の間で分配した。水相をさらに２回、ジクロロメタン（３０ｍｌ×２回）で抽出した。混合した有機質を硫酸ナトリウム（３５ｇ）上で乾燥し、濾過し、ＤＣＭ（３０ｍｌ）で洗浄し、そして濃縮した。ＬＣＭＳ法により生成物と純度を確認した。Ｒ５１７２ロットおよびＲ５２２８ロットの単離収率と純度が表２．１に示されている。
Figure 0007088454000046
次に、図３３に示されているようにＯＧ１７８４からＯＧ１４０５を調製した。磁気撹拌子を装備した５００ｍｌの丸底フラスコの中にＯＧ１７８４（２０．９ｇ）を加え、続いてジクロロメタン（５０ｍｌ）、次にトリフルオロ酢酸（２０ｍｌ）を加えた。その混合物を室温で撹拌し、完全な脱保護がＨＰＬＣ分析により２３分の間に示された。その混合物をロータリーエバポレーター上で濃縮し、ジクロロメタン（２５ｍｌ）中に再溶解し、再濃縮した後にアセトニトリル（２５ｍｌ）中に再溶解し、そして再濃縮した。その生成物をＬＣＭＳにより確認した。上記の物質（ＯＧ１４０５、３４．５ｇ、定量的収率として２１．０ｇを想定）を次のステップの粗油として使用した。精製は必要ではない。
次に、図３４に示されるようにＯＧ１４０５をＯＧ１４０２と反応させてＯＧ１７８５を調製した。撹拌子を装備した窒素下にある５００ｍｌのフラスコの中にＯＧ１４０２（５．５ｇ）を入れ、続いてアセトニトリル（７０ｍｌ）、次にＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２６．３ｍｌ）およびＴ３Ｐ溶液（上記参照）（７．９ｍｌ）を入れた。その溶液を室温で３０分間にわたって撹拌した後に氷冷水浴中で冷却し、そしてアセトニトリル（７０ｍｌ）中のＯＧ１４０５（上記の粗油、３４．５ｇ）の溶液を添加した。その混合物を室温まで温めた。２０分後、前記反応物を氷冷水浴中で冷却し、反応を水（５ｍｌ）で停止した。その後、ロータリーエバポレーターを使用してその混合物を真空下で濃縮して半分の体積にした。ＬＣＭＳ向けに試料を採取した。
さらに水（５０ｍｌ）、続いて０．５Ｍクエン酸（７５ｍｌ）および酢酸イソプロピル（１７５ｍｌ）を添加した。その混合物を５分の間に分配した。水相を追加の酢酸イソプロピル（５０ｍＬ）で抽出した。混合した有機質をクエン酸水溶液（０．１３Ｍ、３０ｍ
ｌ、１０ｍｌの０．５Ｍクエン酸と２０ｍｌの水からなる）で洗浄した。その後、それらの有機質を飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）と水（２５ｍｌ）の混合物で洗浄し、次に飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）で最終的に洗浄した。その後、それらの有機質を硫酸ナトリウム（１２４ｇ）上で乾燥し、濾過し、酢酸イソプロピル（３０ｍｌ）で洗浄し、そしてロータリーエバポレーター下で黄褐色の油（２７．３ｇ）に濃縮した。ＬＣＭＳ分析のために試料を採取した。
前記油をアセトニトリル／水（３：１、１５ｍｌ／５ｍｌ）中に溶解し、ＨＰＬＣフィルターディスク（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ ＰＴＦＥ膜 ０．２μｍ、製品番号０２９１５－２０）に通して濾過し、そして等量で３分割し、それらのそれぞれを個別に以下のように精製した。
分割したものを５０％溶媒Ｂ（アセトニトリル）／５０％溶媒Ａ（水）で平衡化したＲｅｄｉ－Ｓｅｐ Ｇｏｌｄ Ｃ１８カラム（２７５ｇ、ＳＮ－６９－２２０３－３３９、ロット２４１２３４－６１１Ｗ）に負荷した。その後、溶媒Ａ：水／溶媒Ｂ：アセトニトリルの濃度勾配を用いる逆相ＨＰＬＣによりその物質を精製した。適切な画分をプールし、ジクロロメタン（１５０ｍｌ）と水（５ｍｌ）／飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）の間で分配した。水相を２回、ジクロロメタン（５０ｍｌ×２回）で抽出した。混合した有機質を硫酸ナトリウム（６０ｇ）上で乾燥し、濾過し、ジクロロメタン（４０ｍｌ）で洗浄し、そして濃縮した。ＬＣＭＳを含む様々な分析論により構造と純度を確認した。ＯＧ１７８５を泡立つ固形物（Ｒ５３２９、１９．０ｇ、８３％の収率、９５．１％の純度（吸光度２１０ｎｍ）として単離し、窒素下において４℃で貯蔵した。
次に、図３５に示されているようにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してＯＧ１７８５上のｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル保護基を除去してＯＧ１７８６を作製した。
実施例３．重合体ＯＧ１８０１の合成
重合体ＯＧ１８０１は最初に開始剤ＯＧ１７８６から作製される。ＯＧ１８０１はアミン官能基であり、それは重合体合成の間に（マレイミドよりも）安定である。重合体ＯＧ１８０１を合成するため、Ｃｕ（ＩＩ）に金属銅を加えることによりインサイチュで銅化学種（Ｃｕ（Ｉ））が生成される改変型のＡＴＲＰを用いた。前記反応に必要な出発物質および試薬は単量体（ＨＥＭＡ－ＰＣ）ＯＧ４７のバッチ投入量、ならびに標的分子量（ＭＷ）に基づいて計算される。
グローブボックスの中で５０ｇの単量体ＯＧ４７を量り、２００ｍＬの脱気済みＥｔＯＨを添加してその単量体を室温で溶解し、単量体濃度検査のために試料抽出した。５００ｍＬのフラスコ中でＣｕ（ＩＩ）、Ｂｐｙ、Ｃｕ（０）を量り、アルゴンでパージし、一方で単量体溶液をそのフラスコに添加し、そのフラスコをストッパーで密封し、そして泡が無くなるまで２５分間にわたって真空吸引した。その反応物は色が徐々に明緑色から濃緑色に変化し、その後で明褐色に変化した。グローブボックスの中で約２００ｍｇの開始剤ＯＧ１７８６を量り、室温で約２０００μＬのＤＭＦに溶解して１００ｍｇ／ｍＬの原液を作製した。開始剤の濃度および純度の検査のために試料抽出を行い、その開始剤溶液をアルゴン下で前記フラスコに添加した。その反応溶液は濃褐色になり、時間と共に粘性を持ち始めた。その系を密封し、２日間にわたって反応させた。
その後、以下のように前記マレイミドの添加のためにＯＧ１８０１を調製し、および触媒（銅）を除去した。充填済みＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｒｆ順相シリカカラムを使用して前記触媒を除去する。そのカラムのサイズは前記反応混合物中の銅の量に基づいて選択される。例えば、３３０ｇカラム（カタログ番号６９－２２０３－３３０、カラムサイズ３３０ｇ、ＣＶ＝４４３ｍＬ）を５０ｇバッチのＯＧ１８０１に使用した。ＥｔＯＨが
溶出溶媒であるので全ての接続にテフロンチューブを使用する。
銅の除去後、バッチ毎に全ての画分を丸底フラスコに移し、減圧して４５～５０℃でロータリーエバポレーターにより乾燥するまでＥｔＯＨを蒸発させた。このステップで凝縮して集められたＥｔＯＨの体積をモニターしてＥｔＯＨの除去が９０％を超えることを確認した。前記重合体を２５０ｍＬのＷＦＩに溶解し、そして０．２μｍフィルターを使用して濾過した。それにより透明から明黄色の重合体溶液が約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で生じた。その溶液は使用前に最大で３か月まで２～８℃で貯蔵可能であった。
実施例４．重合体ＯＧ１８０２の合成
前記反応において必要な出発物質および試薬はＯＧ１８０１のバッチ投入量に基づいて計算される。リンカーは３－マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステルである。３０ｍｌの０．５Ｍリン酸ナトリウム（ＷＦＩ中、ｐＨ８）を５０ｇ重合体溶液（約１５０ｍｇ／ｍＬ）に添加した。１分間にわたって撹拌した。ｐＨはｐＨペーパーにより８．０であった。２０４．８ｍｇのリンカーを量り、４．１ｍＬのＤＭＦ中に溶解して５０ｍｇ／ｍＬの原液を作製した。リンカー溶液を毎分８１５μＬで滴下して強く撹拌しながら前記重合体溶液に添加した。５分をかけて４０９５μＬのリンカー溶液を添加した。室温で３０分間にわたって反応させた。ｐＨを最終的に５にするための２０ｍＬの５％酢酸で反応を停止した。１Ｌのバキュームフィルター（０．２μｍ）を使用してその溶液を濾過した。
次に以下のようにＯＧ１８０２（図３６参照）を精製する。Ｍｉｌｉｐｏｒｅクロスフローカセットを水系での重合体精製に使用する。前記重合体溶液を２５０ｍＬ（約２００ｍｇ／ｍＬ）まで濃縮することから始まった。貯留槽から新しいＷＦＩを加え、その新しいＷＦＩを供給する流速を透過水と同じ（約２ｍＬ／分）に調節した。ＵＦ／ＤＦを一晩にわたって２～８℃で行った。典型的なことに、２．５ＬのＷＦＩを使用した（前記重合体溶液に対して１０倍量の割合）。残余分の試料を純度検査のために収集した。目的の純度は９８％超であった。１Ｌの０．２μｍフィルターボトルにより前記重合体溶液を濾過した。その重合体溶液は複合体化の前に最大で３か月まで２～８℃で貯蔵可能であった。
実施例５．別のホスホリルコリン重合体
以下に記載されるようにＨＥＡ－ＰＣ重合体を合成した。ＨＥＡ－ＰＣ（リン酸２－（アクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチル）は上記のメタクリレートＨＥＭＡ－ＰＣと対照的にアクリレートであり、下記の構造を有する。
Figure 0007088454000047
化合物Ｌとして実施例１に示される開始剤にＨＥＡ－ＰＣを重合した。
Figure 0007088454000048
２．２ｍｇの開始剤を１１μｌの乾燥ＤＭＦに溶解することで２００ｍｇ／ｍＬの開始剤の原液を調製し、４．６ｍｇのＭｅ６ＴＲＥＮを２３μＬの乾燥ＤＭＦに溶解することにより２００ｍｇ／ｍｌのリガンド溶液を調製した。８．２５μｌのその開始剤の原液と１３．６μｌのそのリガンドをチューブに分注する。５分間にわたって－７８℃で脱気を行った後にアルゴンを再充填し、そして１．２ｍｇのＣｕＢｒを添加する。脱気を行い、そしてアルゴンを再充填する。メタノール中のＨＥＡ－ＰＣの原液（０．４６１ｇのＨＥＡ－ＰＣを量り、０．５ｍＬのメタノール中に溶解する）を－７８℃でその反応容器内の前記溶液に添加する。バイアル瓶を２００μｌのメタノールで洗浄し、－７８℃のその反応容器内の前記溶液を加え、次に０．５ｍＬの蒸留水、その次に別の２００μｌの水を加える。泡立ちが見られなくなり、あらゆる不均一性が消失する（固形微粒子が溶解または消失する）まで徹底的に脱気を行う。４ｐｓｉのアルゴンを再充填し、そして室温で一時間にわたって反応を進行させる。その反応物は既に粘体状であった。約一時間にわたって反応を進行させた。メタノール中のビピリジンの溶液（０．５μＬ中に５ｍｇ）を添加した。別の２～３ｍｌのメタノールを添加し、一晩にわたって４℃で触媒に酸化を行わせた。１Ｈ ＮＭＲによって決定された転換度は９４％であると推定された。
翌日、前記重合体を透析し、１ｍｌ／分の流速の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＳｈｏｄｅｘ ＳＢ８０６Ｍ＿ＨＱカラム（７．８×３００ｍｍ）を使用するＳＥＣ／ＭＡＬＳ分析の対象とし、１．１５７のＰＤＩ、７２３．５ｋＤａのＭｎ、８２０．４ｋＤａのＭｐ、および８３７．２ｋＤａのＭｗを得た（透析前ではＰＤＩは１．１２であり、Ｍｎは６９５ｋＤａであり、Ｍｐは７７８ｋＤａであった）。次に、前記重合体がタンパク質に複合体化可能であるようにマレイミド官能基を前記重合体に付加した。
次に、マレイミドＭａｌ－ＰＥＧ４－ＰＦＰエステル（上の実施例１参照）を実施例１に示されているようにＨＥＡ－ＰＣ重合体に結合した。それにより生じたマレイミド官能基化ＨＥＡ－ＰＣ重合体を次にＨＥＭＡ－ＰＣ重合体について本明細書において考察されたようにスルフヒドリル基に結合することができる。
下記の構造を有する単量体リン酸２－（アクリルアミル）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチル（Ａｍ－ＰＣ）を使用してアクリルアミドＰＣ重合体も作製した。
Figure 0007088454000049
以下の構造を有する３アーム性開始剤（ＴＦＡ塩）を使用する重合にそのＡｍ－ＰＣを使用した。
Figure 0007088454000050
Ａｍ－ＰＣ重合体の合成を以下のように実施した。
Figure 0007088454000051
９ｍｇのＭｅ６ＴＲＥＮを４５μＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解することにより２００ｍｇ／
ｍＬのリガンドの原液を調製した。１９．７μＬのその原液を反応容器に添加する。６．５ｍｇの材料を３２．５μＬのＤＭＦに溶解することにより２００ｍｇ／ｍＬの開始剤の原液を調製する。１１μＬのその開始剤原液を上記のリガンドに添加する。５分間にわたって脱気を行う。１ｍｇのＣｕＢｒを添加する。４ｍｇのＣｕＢｒ２を２０μＬのＤＭＦに溶解することにより２００ｍｇ／ｍＬのＣｕＢｒ２の原液を調製した。０．５ｇの単量体（ＡｍＰＣ）を１ｍＬのメタノールに添加し（遅延溶解（ｓｌｏｗ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）／粘性溶液）、続いて１μＬのそのＣｕＢｒ２の原液を添加する。その単量体溶液を滴下しながら上記反応混合物に添加する。１ｍＬの水で洗浄する。徹底的に前記反応混合物の脱気（凍結融解）を行う。反応を２４時間にわたって進行させる。
その後、前記Ａｍ－ＰＣ重合体を透析してもよい。上記重合体の分子量はＳＥＣ／ＭＡＬＳにより決定された。Ｍｎは２１５ｋＤａであり、Ｍｐは２５０ｋＤａであり、ＰＤＩは１．１７である。１Ｈ ＮＭＲによって転換度は９４％であると推定された。マレイミド官能基をＨＥＭＡ－ＰＣおよびＨＥＡ－ＰＣについて上で考察されたようにそのＡｍ－ＰＣ重合体に付加することができる。マレイミド官能基化Ａｍ－ＰＣ重合体を上記のようにタンパク質に結合することができる。
実施例６．化合物中の遊離マレイミドを計算するための逆エルマンアッセイ
ＯＧ１８０２を形成するための重合体ＯＧ１８０１へのマレイミド官能基の付加（上記参照）の後、エルマンアッセイを用いて試料中の機能性（すなわち結合可能）マレイミドの量を決定した。チオールは中性およびアルカリ性のｐＨの水中でエルマン試薬（ＤＴＮＢ）をＴＮＢに、次にＴＮＢ２に変換し、それが黄色を発した（４１２ｎｍで測定）。システインを使用して検量線を確立した。マレイミドがチオールと反応するのでこのアッセイは実際には残っているチオール（システイン）を測定した。阻害率は（最初のチオール－マレイミド重合体付加の後に残っているチオール）／（最初のチオール）として計算され、パーセンテージとして表される。
アッセイに使用された試薬：６２．５μＭから２μＭまでのシステインを使用して検量線を作成した。前記粉末をｐＨ７．４の１×ＰＢＳ（反応緩衝剤）中に溶解し、徹底的に混合することで重合体原液を調製した。等モルの重合体溶液とシステイン溶液を混合し、２７℃で３０分間にわたって反応させた。１５０μＭのＤＴＮＢ溶液を前記システイン標準物および重合体／システイン反応物に添加し、２７℃で５分間にわたって発色させた。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー上において４１２ｎｍでのＯＤを読み、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェアおよび前記システイン検量線を用いてパーセント阻害率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を計算した。
実施例７．Ｌ４４３Ｃ（ＥＵ式付番，または配列番号１内の４４９Ｃ）変異を有する抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体重鎖と抗ＶＥＧＦＡ－抗体軽鎖を含む抗体（ＯＧ１９５０）のタンパク質配列
下の配列番号１（図１２）（重鎖）に示される配列を有するＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）変異を含む抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体をクローン化した。下の配列番号２（図１３）に示される配列を有する抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体軽鎖をクローン化した。
実施例８ａ．ＯＧ１９５０の精製とキャップ除去
ＯＧ１９５０の重鎖および軽鎖は発現プラスミドにクローン化され、ＣＨＯ細胞に形質移入されてよい。適切な培地中で細胞を培養し、それらの細胞を回収することができる。ＯＧ１９５０は上記の技法を用いて精製され得る。ＯＧ１９５０の位置４４３のシステイン残基（Ｌ４４３Ｃ（ＥＵ式付番））は前記細胞培養培地中で化学薬品によって「キャップ付加」または酸化され、複合体化に利用可能ではないことが典型的である。これに関し、精製されたＯＧ１９５０はそのキャップを除去するためのキャップ除去（すなわち還元
）法の対象とされてよく、且つ、遊離（すなわち、Ｃｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド結合に関与していない）システイン残基が重合体のマレイミド官能基に結合することを可能にし得る。キャップ除去は精製されたＯＧ１９５０を３０倍モル過剰の還元剤ＴＣＥＰ（３，３′，３′′－ホスファントリイルトリプロパン酸）と２５℃で１時間にわたって混合することにより行われ得る。ＴＣＥＰを使用する還元反応はＳＤＳ－ＰＡＧＥによってモニターされ得る。変性後、そのキャップを除去するためにＰｅｌｌｉｏｎ ＸＬ限外濾過カセットと２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰからなる緩衝液を使用するＵＦｄＦによりそのＯＧ１９５０タンパク質を洗浄してよい。その後、２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む同じＵＦｄＦ構成においてそのＴＣＥＰ試薬が除去され得る。その後、空気（外気中酸素）を使用して還元型ＯＧ１９５０をリフォールディングさせてよく、その後にアッセイとしてＳＤＳ－ＰＡＧＥが再び続く。
実施例８ｂ．ＯＧ１９５０の精製とキャップ除去
ＯＧ１９５０の重鎖および軽鎖は発現プラスミドにクローン化され、ＣＨＯ細胞に形質移入されてよい。適切な培地中で細胞を培養し、それらの細胞を回収することができる。ＯＧ１９５０は上記の技法を用いて精製され得る。ＯＧ１９５０の位置４４３のシステイン残基（Ｌ４４３Ｃ（ＥＵ式付番））は前記細胞培養培地中で化学薬品によって「キャップ付加」または酸化され、複合体化に利用可能ではないことが典型的である。これに関し、精製されたＯＧ１９５０はそのキャップを除去するためのキャップ除去（すなわち還元）法の対象とされてよく、且つ、遊離（すなわち、Ｃｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド結合に関与していない）システイン残基が重合体のマレイミド官能基に結合することを可能にし得る。キャップ除去は精製されたＯＧ１９５０を３０倍モル過剰の還元剤ＴＣＥＰ（３，３′，３′′－ホスファントリイルトリプロパン酸）と２５℃で１時間にわたって混合することにより行われ得る。ＴＣＥＰを使用する還元反応はＳＤＳ－ＰＡＧＥによってモニターされ得る。還元後、そのキャップおよびその過剰なＴＣＥＰを除去するためにＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の３０ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ限外濾過カセットと２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰからなる緩衝液を使用する限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）系によりそのＯＧ１９５０タンパク質を洗浄することができる。その後、２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む同じＵＦ／ＤＦ構成において残りのＴＣＥＰ試薬が除去され得る。その後、外界温度で１時間にわたってｄＨＡＡを使用して還元型ＯＧ１９５０を再酸化させることができ、その後にｄＨＡＡの除去のためのＵＦ／ＤＦが続くことでキャップ除去済みＯＧ１９５０を形成する。そのキャップ除去済み状態はＳＤＳ－ＰＡＧＥアッセイによりモニターされる。
実施例９．ＭＰＣ重合体へのＯＧ１９５０の複合体化
キャップ除去済みＯＧ１９５０を重合体ＯＧ１８０２に複合体化してよい。過剰なＯＧ１８０２を使用する（１０～２０倍モル過剰）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより複合体化をモニターすることができ、完全な複合体化近くまで反応を起こさせることができる。ＯＧ１９５０複合体は陽イオン交換体クロマトグラフィーにより精製可能であり、ＵＦ／ＤＦにより前記製剤緩衝液に緩衝液交換可能である。重合体ＯＧ１９５０複合体は上記のようにクロマトグラフィーにより精製可能である。
実施例１０．ＯＧ１９５０のＳＰＲ結合カイネティクス
この実施例はシングルサイクルカイネティクスＢＩＡｃｏｒｅ（商標）実験におけるＶＥＧＦ－１６５に対するＯＧ１９５０の結合を例示する。
プロテインＡチップ（ＧＥヘルスケア社）を装備したＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００システム（ＧＥヘルスケア社）上でヒトＶＥＧＦ－１６５に対するＯＧ１９５０のＳＰＲ
相互作用分析を実施した。シングルサイクルカイネティクス法を実施した。抗体の捕捉をＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（０．０１Ｍの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、および０．０５％のポリソルベート２０）中に２５μｇ／ｍＬの濃度、２５秒のパルス、１０μｌ／分の流速で行った。その後、６０秒のパルス、３０μｌ／分の流速、および１０００秒の最終解離時間で様々な濃度の組換えヒトＶＥＧＦ－１６５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加した。その実験を２５℃で行った。５０μＬ／分の流速で１分間にわたって１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７を使用してその表面を再生した。全体的に１：１の相互作用にフィットする応答についてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して結合カイネティクス分析を実施した。結果が表１０．１および図２１にまとめられている。
Figure 0007088454000052
 ＯＧ１９５０は１：１結合フィットモデルにおいて（機器感度を超える）１ｐＭ未満のＫＤを示す。
実施例１１．ＯＧ１９５３の複合体化と陽イオン交換体クロマトグラフィーを用いる精製
ＯＧ１９５０タンパク質発現およびタンパク質調製：ＯＧ１９５０タンパク質を哺乳類ＧＳＣＨＯＫ１発現系内で発現し、続いてプロテインＡアフィニティーカラムを使用して精製した。前記プロテインＡカラム精製ＯＧ１９５０の純度はサイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥに基づくと９０％を超えた。ＯＧ１９５０の改変特異的システイン残基はＯＧ１８０２生体高分子へのチオール複合体化に利用可能であった。ＯＧ１８０２のチオール反応化学基はＯＧ１９５３生体複合体を形成する安定な共有結合を形成するように反応するものであった。これを達成するためにトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）還元剤で１ｍｇのＯＧ１９５０を完全に還元し、その後に３０ＫＤａ遠心濃縮器を使用する緩衝液交換によりＴＣＥＰを除去した。その後、その完全還元型ＯＧ１９５０タンパク質を再酸化させ、チオール特異的複合体化化学による前記生体高分子への複合体化のために還元状態のままである改変システイン残基を除いて全ての予期されるタンパク質ジスルフィド結合が形成されることを確実にした（キャップ除去済みＯＧ１９５０）。
複合体化反応：トリス緩衝液（２０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中に２ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度になるように１００μｇのキャップ除去済みＯＧ１９５０を１５倍モル過剰のＯＧ１８０２生体高分子と混合することにより前記複合体化反応を実施した。複合体化効率に対する影響を比較するために表１１．１に示されているような異なる複合体化反応において様々な添加物を評価した。全ての反応は固定された体積で構成され、４℃で２０時間にわたって保温された。表１１．１および図１９はイオン交換体分析（Ａ２８０吸光度）および複合体化反応Ａ～Ｇの分画を示している。反応Ａ緩衝液のみを含み、反応ＢはＯＧ１９５０抗体のみを含んだ。反応ＣはＯＧ１９５０抗体とＯＧ１８０２重合体を含み、反応ＤはＯＧ１９５０抗体とＯＧ１８０２重合体とショ糖を含んだ。反応ＥはＯＧ１９５０抗体とＯＧ１８０２重合体とトレハロースを含み、反応ＦはＯＧ１９５０抗体＋ＯＧ１８０２重合体とグルタミン酸を含み、反応ＧはＯＧ１９５０抗体とＯＧ１８０２重合体とアスパラギン酸を含んだ。反応Ｂ～Ｇは固定された総反応体積について１００μｇのＯＧ１９５０タンパク質の投入で開始された。反応完了時に等体積のＢ～Ｇ反応物をＩＥＸ分析に注入した。複合体化効率の比較が図１９に示されている。ピーク１（Ｐ１）は各反応において前記タンパク質に複合体化されず、前記イオン交
換体カラムに結合できず、したがって未結合画分として溶出した過剰な生体高分子（ＯＧ１８０２）を表しており、ピーク２（Ｐ２）は各反応において前記抗体重合体生体複合体を表しており、ピーク３（Ｐ３）は各反応において前記重合体に複合体化されなかった遊離抗体を表す。
Figure 0007088454000053
上の結果から理解できるように、様々な賦形剤によって著しく高い複合体化効率が可能になった。理論によって制限されるつもりはないが、成分の溶解性の維持を支援するそのような賦形剤が複合体化効率に役立っている。
ＯＧ１９５３複合体化反応の陽イオン交換体分析：複合体化反応の完了時にＳｈｏｄｅｘ ＳＰ－８２５ＨＰＬＣカラムを使用する陽イオン交換体クロマトグラフィー（ＩＥＸ）分析と分離のために５μｌの各反応混合物をカラム平衡化緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．５）で３倍に希釈した。前記反応混合物が最初により低い塩濃度まで希釈されることで複合体と未反応タンパク質の両方がカラムに結合し、続いてＮａＣｌ濃度が上昇する塩濃度勾配溶出により電荷変化の相違（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｈａｒｇｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）に起因して異なる滞留時間で前記複合体（ＯＧ１９５３）と非複合体化遊離タンパク質（ＯＧ１９５０）が溶出される結合溶出モードでＩＥＸを実施した。図１９に示されているようにＩＥＸ分析の結果はＯＧ１９５３複合体（ピークＰ２）がピークＰ１に示されている非複合体化遊離重合体（ＯＧ１８０２）およびＰ３に示されている非複合体化遊離タンパク質（ＯＧ１９５０）から非常によく分離したことを示している。
活性分析のためのＯＧ１９５３複合体の大規模精製：複合体化反応物ＤおよびＥをプールし、ＩＥＸでさらに分離し、前記複合体ピーク（Ｐ２）溶出画分を収集し、そして活性
分析のために濃縮した。
実施例１２．ＥＬＩＳＡを用いるＶＥＧＦＲに対するビオチン－ＶＥＧＦに対する抗ＶＥＧＦ分子の効果
ＶＥＧＦＲに対するビオチン－ＶＥＧＦ－１６５の結合を阻害するＯＧ１９５０，ＯＧ１９５３および他の抗ＶＥＧＦ分子の能力をＥＬＩＳＡアッセイで検査した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍＬの組換えＶＥＧＦ Ｒ１－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓ社、品番３２１－ＦＬ－０５０）で被覆した。プレートを室温で一晩にわたって保温した。その後、プレートを洗浄し、穏やかに振盪しながら９０分以上にわたってブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ、ｐＨ７．４）でブロックした。検査試料の３倍希釈シリーズを作製した。４００ｎＭから開始し、試料をビオチン－ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、品番ｃｕｓｔｏｍ０６）と混合した。ビオチン－ＶＥＧＦの終濃度は４ｎｇ／ｍＬ（１００ｐＭ）であった。試料希釈シリーズの最高濃度は８５μｇ／ｍＬであった。希釈物の作製後、試料を室温で３０分以上にわたって保温し、その後で３回洗浄した。洗浄後、１００μＬの試料／ビオチン－ＶＥＧＦ混合物を各ウェルに移した。穏やかに振盪しながらプレートを９０分以上にわたって室温で保温した。保温後に１００μｌの１：１５００希釈ＳＡ－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、品番Ａ７９０６）を各ウェルに添加した。保温したプレートを約２０分間にわたって遮光した。その後、プレートを３回洗浄した。洗浄後、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、品番ＤＹ９９８）を添加した。約３０分間にわたってプレートを保温し、且つ、遮光した。発色をモニターした。５０μｌの停止溶液を添加することで発色を停止した。プレートを４５０ｎｍで読んだ。結果が図２０に示されている。
これらの結果は、ＯＧ１９５０（非複合体化抗体）ならびに市販のＶＥＧＦ阻害剤であるルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）およびアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）と比較するとＯＧ１９５３抗体／複合体がより高いＶＥＧＦＲに対するビオチン－ＶＥＧＦ結合の最大阻害率に到達したことを示している。典型的なＶＥＧＦリガンドＶＥＧＦ受容体結合アッセイではＯＧ１９５３の添加によりＶＥＧＦ受容体に対するＶＥＧＦリガンド結合の９７～９８％が阻害される。これはＶＥＧＦリガンド／受容体結合の７５～８７％が阻害されるＯＧ１９５０添加、およびそれぞれＶＥＧＦリガンド／受容体結合の６８～７８％が阻害されるだけであるルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）またはアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）の添加に対比される。さらに、以前の研究は４００ｎＭの濃度のＯＧ１９５０、ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）、またはアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）のいずれかの添加ではＶＥＧＦ受容体に対するＶＥＧＦリガンドの結合の１００％阻害が生じないことを示している。
図２０は、前記抗体単独（抗ＶＥＧＦ）と比較すると、他の抗体複合体である抗ＶＥＧＦ生体複合体（抗ＶＥＧＦ ＢＣ）がより高いＶＥＧＦ受容体に対するＶＥＧＦの結合の最大阻害率に到達したことも示している。まとめると、これらの結果は、（ｉ）現在利用可能なＶＥＧＦ阻害剤と比較するとＯＧ１９５３抗体複合体はＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦリガンド結合の阻害により有効であること、および（ｉｉ）活性部位領域の外側にある部位でのＶＥＧＦ抗体の複合体化によりＶＥＧＦ受容体に対するＶＥＧＦリガンド結合の阻害が増加し得ることを示している。
幾つかの実施形態では前記抗ＶＥＧＦ抗体単独と比較して上昇したレベル（または少なくとも同レベル）の阻害能力を示す抗ＶＥＧＦ抗体複合体が本明細書において提供される。
実施例１３．Ｆｃγ受容体ＩおよびＩＩＩａへのＯＧ１９５０の結合の測定方法
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００を使用して２５℃で結合カイネティクス実験を実施した。抗
Ｈｉｓ抗体をＣＭ５チップ上に固定した。アクティブフローセルの中にだけ５μＬ／分の流速を使用し、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のツイーン－２０）中に調製した０．５μｇ／ｍＬの濃度のヒスチジンタグ付加ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩａを６０秒間にわたって個別に注入した。次にシングルサイクルカイネティクス法を適用して３０μＬ／ｍＬでの６０秒間の注入を用いて抗体候補および正の対照として使用されるアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）を基準フローセルとアクティブフローセルに注入した。０．４８～３００ｎＭの範囲内の抗体濃度をＦｃγＲＩに使用し、７．８ｎＭ～２０００ｎＭの範囲内の抗体濃度をＦｃγＲＩＩＩａに使用した。各測定の後に５０μ／ｍＬの流速を用いる１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７の６０秒間の注入によりフローセルを再生した。基準フローセルとブランクサイクルの両方の差し引きを用いることでデータを二重に参照した。ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して分析を実行した。結果が図２２および２３に示されている。このアッセイではＯＧ１９５０がＦｃγ受容体ＩおよびＩＩＩａのどちらにも有意な結合を示さなかったことが結果より示されている。
実施例１４．ヒト補体タンパク質Ｃ１ｑへのＯＧ１９５０の結合の測定方法
Ｃ１ｑのＥＬＩＳＡ結合により補体の結合特性を評価した。一晩にわたる４℃での被覆のために前記抗体パネルを１０μｇ／ｍＬの最高濃度から１：２の比率で１×ＰＢＳ中に滴定した。次に１％ＢＳＡ中に２時間のブロッキングステップの後にプレートがブロックされた。その後、精製ヒトＣ１ｑを１％ＢＳＡ中に５μｇ／ｍＬの濃度で室温において２時間にわたって適用し、その後でＨＲＰ複合体化抗ヒトＣ１ｑ抗体による検出およびＴＭＢ発色を行った。結果が図２４に示されている。Ｃ１ｑは１０μｇ／ｍＬと０．６２５μｇ／ｍＬの間の抗体濃度ではＯＧ１９５０と比べてアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）に対して高い結合親和性を有することが結果より示されている。
幾つかの実施形態ではＯＧ１９５０はアバスチンの結合の１０％未満を有する。幾つかの実施形態ではＯＧ１９５０はアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）よりも少ないＣ１ｑへの結合を有する。
実施例１５．ＶＥＧＦ刺激ＨＲＭＶＥＣ増殖への抗ＶＥＧＦ剤の効果
ヒト網膜微小血管性内皮細胞（ＨｕＲＭＶＥＣ）増殖アッセイを以下のように実施した。２％のＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、品番４ＣＢ－５００）および０．２％のＢａｃ－ｏｆｆ（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、品番４ＺＯ－６４３）を添加したＣＳＣ完全培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、品番４Ｚｏ－５００）中に細胞を維持し、９６ウェルのプレートのアッセイ培地（血清遊離培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、品番４Ｚ３－５００－Ｓ）と５％のＦＢＳ）の中にウェル当たり１０，０００細胞の密度で播種した。ＶＥＧＦ阻害剤を最初に表示の濃度で各ウェルに添加した。３０分後にＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、品番２９３－ＶＥ－５００／ＣＦ）を１．３ｎＭの終濃度になるまで添加した。３日後にＷＳＴ－１細胞増殖アッセイ試薬と共に細胞を培養し、そしてＯＤ４５０ｎｍで測定した。
ＯＧ１９５３の２つの独立した調製物（ＯＧ１９５３ＡおよびＯＧ１９５３Ｂ）の両方がＨｕＲＮＶＥＣの増殖に対して強力な阻害を示すことが結果より示された。このアッセイではＯＧ１９５３の最大阻害率とＩＣ５０の両方が抗体単独であるＯＧ１９５０のものと同等である。ＯＧ１９５３の最大阻害率はまたアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）およびアイリーア（登録商標）（アフリベルセプト）の最大阻害率よりもはるかに良好である。それらの結果（ＩＣ５０値ならびにそれらの値のルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）、アイリーア（登録商標）（アフリベルセプト）、およびアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）との比較を含む）が図２５に示されている。
実施例１６．プロテインＡチップ上に捕捉された抗ＶＥＧＦ剤へのＶＥＧＦ結合の２５度におけるシングルサイクルカイネティクス（ＳＣＫ）
アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、ＯＧ１９５０、およびＯＧ１９５３に対してＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００を使用して結合カイネティクスを２５℃で実施した。簡単に説明すると、抗ＶＥＧＦ剤をプロテインＡチップ（ＧＥ）上に捕捉した。１μｇ／ｍｌのＯＧ１９５０およびアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）を２５μｌ／分で２分間にわたって流した。１０μｇ／ｍｌのＯＧ１９５３についてはそれを１０μｌ／分で１０分間にわたって流した。シングルサイクルカイネティクスのために０．５６ｎＭ、１．６７ｎＭ、５ｎＭ、１５ｎＭ、および４５ｎＭのそれぞれでＶＥＧＦ（組換え型；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を捕捉された抗体上に２４０秒間の接触時間にわたって流し、そして３０分間にわたって解離させた。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ）を使用して分析を実行した。全てのセンサーグラムを二重の基準で差し引き、ラングミュア結合モデルを使用して１：１にフィットさせた。これらの抗ＶＥＧＦ剤の解離速度はこの実験では抗ＶＥＧＦ剤とプロテインＡ捕捉体の間の解離が原因で過小評価されている可能性がある。
計算されたＫＤ値、ｋａ値、およびｋｄ値を含む結果が図２６に提示されている。
実施例１７．ＯＧ１８０２重合体誘導性ＩｇＧ１沈殿の防止のための賦形剤スクリーニング実験
標準的複合体化反応過程構成を用いるとＯＧ１９５０複合体化反応混合物は混合時にすぐに沈殿を伴って濁ることがわかった。さらに研究を重ね、その沈殿は前記タンパク質それ自体であり、前記タンパク質が複合体化反応に関係する代わりに沈殿によって失われるため、低い複合体化効率がＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはイオン交換体分析により観察されることが明らかになった。
実施された最初のトラブル解決実験により、透明な反応溶液にならない条件には（１）重合体モル過剰比率の１０超から５未満への低下、（２）前記反応溶液ｐＨの標準的な中性ｐＨ範囲（例えばｐＨ６．５～７．５）からより酸性側（例えばｐＨ５）または塩基性側（例えばｐＨ８．５）への事前調節、（３）ＯＧ１９５０と同様の、または異なる等電点（ｐＩ）を有する他のＩｇＧ１タンパク質試料の検査、（４）試料貯蔵緩衝液のｐＨ７．４の１×ＰＢＳまたはｐＨ７．４の２０ｍＭトリス緩衝液、１００ｍＭ ＮａＣｌへの緩衝液交換、および（５）２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４でのＯＧ１８０２溶液の事前調節が含まれることが明らかになった。
タンパク質は水溶液中でタンパク質の溶解を助ける正味の表面電荷を持つことが知られている。それらのアミノ酸は親水性アミノ酸と呼ばれ、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸を含む。中性のｐＨ７ではこれらのアミノ酸の側鎖はアルギニンとリシンについては正の電荷を有し、アスパラギン酸とグルタミン酸については負の電荷を有する。前記溶液ｐＨの変化は本来のタンパク質溶解性を改変する可能性があり、したがって（２）などの上で言及されたトラブル解決実験のうちの中にはこのアプローチが適用されたものもある。理論的には水溶液中のタンパク質の溶解性は表面の疎水性または親水性のレベルに応じて異なる。より高い疎水性を有する表面を持つタンパク質は容易に沈殿することになる。イオン（例えばＮａＣｌまたは他の塩）の添加は、水粒子と前記タンパク質との間のある活動を無効にし、前記タンパク質が互いに結合し、凝集し始めて溶解性を減少させる電子遮蔽効果をもたらす。現状では前記生体高分子がタンパク質沈殿を引き起こす分子間疎水性相互作用を促進するように前記タンパク質表面電荷および／または曝露表面を直接的または間接的に調整することが仮定された。
タンパク質溶解性を調整すると判断された賦形剤には次のカテゴリーが含まれる。（ｉ
）中性界面活性剤（例えば０．１～１％ポリソルベート２０またはツイーン２０）または荷電界面活性剤（例えば０．１～１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を含む界面活性剤、（ｉｉ）糖（例えば６％トレハロースまたは６％ショ糖）、（ｉｉｉ）負荷電アミノ酸（例えば０．０３～１ｍＭグルタミン酸または０．０３～１ｍＭアスパラギン酸）または正荷電アミノ酸（例えば１～１００ｍＭリシンまたはアルギニン）、（ｉｖ）カオトロピック剤または変性剤（例えば１～１００ｍＭ尿素、グアニジン塩酸類似体、または１～１００ｍＭアルギニン）、（ｖ）ポリエチレングリコール（例えば０．０３～１ｍＭ ＰＥＧ８０００）、および（ｖｉ）有機溶媒（例えば２０％エタノール）。
追加の実験計画法（ＤＯＥ）試験において上述の各カテゴリーの様々な賦形剤をヒト注射用途に適した製剤加工に対する適合性に基づいて選択した。さらに、ｐＨ４という極端な酸性およびｐＨ９という極端な塩基性もそのような評価に含めた。沈殿観察を複雑にする非対合性システイン残基の干渉の可能性を最小にするために改変システインを含まない標準的ＩｇＧ１タンパク質試料をそのような評価に選択した。表１７．１によりそのようなマトリクスが示された。影が付いているコード／行は透明な溶液が生じる条件であり、影が付いていない行は様々な程度の濁りまたは沈殿が生じる条件である。
Figure 0007088454000054
その結果生じた沈殿溶液（または非沈殿溶液）が図２８に示されている。
これまでに引用された、またはこれ以降に引用される全ての特許出願、ウェッブサイト、他の刊行物、受託番号等は、それぞれ個々の項目が参照により援用すると具体的および個別に示された場合と同じ程度にまで全ての目的のために全体が参照により援用される。ある配列の異なるバージョンが異なる時点である受託番号に関連付けられている場合、この願書の有効な出願日においてその受託番号に関連付けられているバージョンを意味する。有効な出願日は実際の出願日、または該当する場合はその受託番号を参照する先行出願の出願日の早い方を意味する。同様に、刊行物、ウェッブサイト、またなそのようなものの異なるバージョンが異なる時点で公開されている場合、別段の指示が無い限りこの願書
の有効な出願日の時点で最も新しく公開されたバージョンを意味する。本明細書において開示されるどの特徴、工程、要素、実施形態、または態様も、別途具体的に指示されない限り、他のあらゆるものと組み合わせて用いられ得る。幾つかの実施形態は明瞭性および理解のために図解と実例によりいくらか詳細に説明されているが、添付されている特許請求項の範囲内である特定の変更および改変を実施してもよいことが理解される。

Claims (14)

  1. 抗体複合体であって、
    （１）抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体であって、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が軽鎖と重鎖を有し、前記重鎖がＦｃ領域を含み、並びに前記重鎖がＣＤＲＨ１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ（配列番号９）、ＣＤＲＨ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号１０）、およびＣＤＲＨ３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号１１）を含み、並びに位置２３１（配列番号１内に見られる配列カウントを介した位置）がＴであり、並びに前記軽鎖がＣＤＲＬ１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２：ＦＴＳＳＬＨＳ（配列番号１３）、およびＣＤＲＬ３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号１４）を含み、並びにＫａｂａｔ位置４がＬである、抗体と
    （２）ホスホリルコリン含有重合体であって、前記重合体が前記抗体の可変領域外にある非天然システインにおいて前記抗体に共有結合しており、前記非天然システインが前記重鎖の前記Ｆｃ領域内にあり、前記ホスホリルコリン含有重合体がリン酸２－（メタクリロイルオキシエチル）－２’－（トリメチルアンモニウム）エチル（ＭＰＣ）単量体を含む重合体を含み、
    前記重合体が３００，０００と１，７５０，０００Ｄａの間の分子量を有し、前記抗体複合体が４５０，０００と１，９００，０００Ｄａの間の分子量を有する、前記抗体複合体。
  2. 前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体がヒトＩｇＧ１であり、および前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の重鎖定常ドメインがヒトＩｇＧ１の定常ドメインと比べて１つ以上の変異を有することでエフェクター機能を調節する、請求項１に記載の抗体複合体。
  3. 前記１つ以上の変異が、次の変異、すなわちＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ（ＥＵ式付番）を含む、請求項２に記載の抗体複合体。
  4. 前記非天然システインがＱ３４７Ｃ（ＥＵ式付番）またはＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）である、請求項３に記載の抗体複合体。
  5. 前記非天然システインがＬ４４３Ｃ（ＥＵ式付番）である、請求項４に記載の抗体複合
    体。
  6. 前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の重鎖の配列が配列番号１であり、および前記抗ＶＥＧＦ－Ａの軽鎖の配列が配列番号２である、請求項４に記載の抗体複合体。
  7. 前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が抗ＶＥＧＦ－Ａ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の重鎖の配列が配列番号１であり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の軽鎖の配列が配列番号２であり、前記抗体が配列番号１中のＣ４４９において前記重合体に結合している、請求項１に記載の抗体複合体。
  8. 前記重合体が９本のアームを有し、且つ前記重合体が６００，０００から９００，０００Ｄａの間の分子量を有する、請求項７に記載の抗体複合体。
  9. 下記の構造を有し、
    Figure 0007088454000055
     式中、
    前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の各重鎖が文字Ｈで表され、且つ、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の各軽鎖が文字Ｌで表され、
    前記重合体がＣ４４３（ＥＵ式付番）のスルフヒドリルを介して前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に結合しており、その結合が前記重鎖のうちの１本の上に示されており、
    ＰＣが
    Figure 0007088454000056
     であり、前記波線が残りの前記重合体の部分への接続点を表し、Ｘはａ）ＲがＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルであるＯＲ、ｂ）Ｈ、またはｃ）Ｂｒをはじめとするいずれかのハライドであり、且つ、
    ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ６、ｎ７、ｎ８、およびｎ９の合計が２５００±１５％であるようにｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、ｎ８、およびｎ９が同一または異なる、請求項７に記載の抗体複合体。
  10. 請求項１に記載の抗体複合体であって：
    （ａ１）精製されている抗体複合体；
    （ｂ１）前記重合体について多分散系である、（ａ１）に記載の抗体複合体；または
    （ｃ１）前記重合体が１．２未満の多分散度（ＰＤＩ）を有する、（ｂ１）に記載の抗体複合体。
  11. 下記（ａ２）～（ｆ２）のいずれかである、請求項１～７及び１０のいずれか一項に記載の抗体複合体。
    （ａ２）前記重合体が３本以上のアームを有し、または３か所以上の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される、抗体複合体
    （ｂ２）前記重合体が３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、もしくは１２本のアームを有し、または３か所、４か所、５か所、６か所、７か所、８か所、９か所、１０か所、１１か所、もしくは１２か所の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される、（ａ２）に記載の抗体複合体
    （ｃ２）前記重合体が３本、６本、もしくは９本のアームを有し、または３か所、６か所、もしくは９か所の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される、（ｂ２）に記載の抗体複合体
    （ｄ２）前記重合体が９本のアームを有し、または９か所の重合体開始部位を有する開始剤を用いて合成される、（ｃ２）に記載の抗体複合体
    （ｅ２）前記重合体が５００，０００と１，０００，０００Ｄａの間の分子量を有する、（ｄ２）に記載の抗体複合体
    （ｆ２） 前記重合体が７５０，０００と８５０，０００Ｄａの間の分子量を有する、（ｅ２）に記載の抗体複合体
  12. 下記（ａ３）又は（ｂ３）を含む、医薬組成物。
    （ａ３）液体溶液状の請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体複合体
    （ｂ３）請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体複合体、および薬学的に許容可能な担体
  13. 眼疾患の治療または予防のための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体複合体、または請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 下記（ａ５）又は（ｂ５）の治療または予防のための、請求項１３に記載の抗体複合体、または医薬組成物。
    （ａ５）糖尿病網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜中心分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、結膜下出血、および高血圧性網膜症からなる
    群より選択される前記眼疾患
    （ｂ５）糖尿病網膜症である前記眼疾患
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