KR101566064B1

KR101566064B1 - 연령-관련 황반 변성에서의 유전자 다형성

Info

Publication number: KR101566064B1
Application number: KR1020127012875A
Authority: KR
Inventors: 로버트 그라함
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2009-10-21
Filing date: 2010-10-20
Publication date: 2015-11-04
Also published as: JP2013507963A; LT2491134T; EP2491134B1; DK2491134T3; JP5676623B2; NO2491134T3; MX367621B; HRP20171641T2; RU2012120663A; HUE037152T2; RU2015101034A; CA2859193A1; KR20120089867A; RU2546008C2; MY176035A; AU2010310804B2; CA2859193C; BR112012009408A2; CN102686743A; CN102686743B

Abstract

본원은 환자가 습성 AMD가 발병할 증가된 위험성을 갖는지의 여부, 또는 환자가 고-친화도 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

연령-관련 황반 변성에서의 유전자 다형성 {GENETIC POLYMORPHISMS IN AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 35 USC 119(e) 하에 2009년 10월 21일자로 출원된 가출원 번호 61/253,758 (그 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 대해 우선권을 주장하는, 37 CFR 1.53(b)(1) 하에 출원된 정식 출원이다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 인간 질환의 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 습성 연령-관련 황반 변성 (AMD)에 관한 것이다.

AMD는 고령자들 사이에서 중증의 비가역적인 시력 상실의 주요 원인이다. 문헌 [Bressler (2004) JAMA 291:1900-01]. 이는 광범위한 임상적 및 병리학적 소견, 예컨대 드루젠으로 알려져 있는 연황색 반점, 망막 색소 상피 (RPE)의 파괴, 맥락막 신생혈관형성 (CNV) 및 원반 황반 변성을 특징으로 한다. 본 질환은 2가지 형태로 분류된다: 비-삼출형 (건성) 및 삼출형 (습성 또는 신생혈관). 최근, 습성 AMD의 치료를 위한 여러 요법 - 베르테포르핀 (비수딘(Visudyne)®); VEGF-결합 압타머인 페가프타닙 (마큐젠(Macugen)®); 및 항-VEGF 항체 단편인 라니비주맙 (루센티스(Lucentis)®)을 사용하는 광역학 요법이 개발되었다.

유전자 다형성은 개체군에서 특정 유전자에서의 상이한 대립유전자가 상이한 표현형, 예컨대 질환 발병 또는 진행 및 치료 약물에 대한 반응성을 생성하는 경우에 발생한다. AMD의 발병 또는 진행과 관련된 다중 다형성이 확인되었다 (예를 들어, 문헌 [Despriet et al. (2007) Arch. Ophthalmol. 125:1270-71]; [Seddon et al. (2007) JAMA 297:1793-99, 2585]; [Boon et al. (2008) Am. J. Human Genet. 82:516-23]). 이전의 연구는 보체 인자 H (CFH) 유전자의 아미노산 위치 402에서의 특정 다형성이 AMD에 대한 베르테포르핀으로의 PDT 또는 오프-라벨 베바시주맙 요법에 대한 반응과 관련되어 있다는 것을 보여주었다 (문헌 [Brantley et al. (2008) Eye published online 22 February, pp. 1-6]; [Brantley et al. (2007) Ophthalmology 114:2168-73]). 질환의 발병과 관련되고/거나, 특정 요법의 효능 또는 안전성을 예측할 수 있는 추가적인 다형성의 확인을 이용하여, 요법을 그로부터 최상의 이익을 얻고자 하는 환자들에게 맞출 수 있다.

본 발명은 부분적으로는 AMD 위험성 또는 고-친화도 항-VEGF 항체로의 치료가 AMD를 앓는 환자에게 이익을 줄 증가된 가능성을 예측할 수 있는 유전자 다형성의 확인을 기초로 한다.

한 측면에서, 본 발명은 습성 AMD 환자로부터 단리된 샘플을 rs1064875에 상응하는 매트릭스 메탈로프로테아제 25 유전자 (MMP25) 대립유전자 중의 게놈 다형성에 대해 스크리닝하는 것을 포함하며, 여기서 상응하는 유전자형이 AA 또는 AG를 포함하는 경우에, 상기 환자는 고-친화도 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는 것인, 습성 AMD 환자가 고-친화도 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 예측하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 유전자형은 AA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자형은 AG를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 습성 AMD 환자로부터 단리된 샘플을 rs10917583에 상응하는 디스코이딘 도메인 수용체 패밀리 구성원 2 유전자 (DDR2) 대립유전자 중의 게놈 다형성에 대해 스크리닝하는 것을 포함하며, 여기서 상응하는 유전자형이 AA 또는 AC를 포함하는 경우에, 상기 환자는 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는 것인, 습성 AMD 환자가 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 예측하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 유전자형은 AA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자형은 AC를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 습성 AMD 환자로부터 단리된 샘플을 rs175714에 상응하는 염기성 류신 지퍼 전사 인자, ATF-유사 (BATF) 대립유전자 중의 게놈 다형성에 대해 스크리닝하는 것을 포함하며, 여기서 상응하는 유전자형이 AA 또는 AG를 포함하는 경우에, 상기 환자는 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는 것인, 습성 AMD 환자가 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 예측하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 유전자형은 AA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자형은 AG를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC® HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하기 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열: CDRH1 (GYDFTHYGMN; 서열 1), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; 서열 2) 및 CDRH3 (YPYYYGTSHWYFDV; 서열 3)을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 하기 경쇄 CDR 아미노산 서열: CDRL1 (SASQDISNYLN; 서열 4), CDRL2 (FTSSLHS; 서열 5) 및 CDRL3 (QQYSTVPWT; 서열 6)을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 Y0317의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 라니비주맙이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 rs1064875에 상응하는 MMP25 대립유전자 중의 A/G 다형성에 특이적인 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 습성 AMD 환자가 라니비주맙으로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 예측하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드를 사용하여 rs1064875에 상응하는 MMP25 대립유전자 중의 A/G 다형성을 포함하는 MMP25 유전자의 일부를 증폭시킬 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 rs10917583에 상응하는 DDR2 대립유전자 중의 A/C 다형성에 특이적인 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 습성 AMD 환자가 라니비주맙으로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 예측하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드를 사용하여 rs10917583에 상응하는 DDR2 대립유전자 중의 A/C 다형성을 포함하는 DDR2 유전자의 일부를 증폭시킬 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 rs175714에 상응하는 BATF 대립유전자 중의 A/G 다형성에 특이적인 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 습성 AMD 환자가 라니비주맙으로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 예측하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드를 사용하여 rs175714에 상응하는 BATF 대립유전자 중의 A/G 다형성을 포함하는 BATF 유전자의 일부를 증폭시킬 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 환자로부터 단리된 샘플을 표 4 또는 표 5에 나타낸 대립유전자 변이체 중 하나 이상에 대해 스크리닝하는 것을 포함하며, 여기서 표 4 또는 표 5에 나타낸 대립유전자 변이체 중 하나 이상의 존재는 상기 환자가 습성 AMD가 발병할 증가된 위험성을 갖는다는 것을 나타내는 것인, 상기 환자가 습성 AMD가 발병할 증가된 위험성을 갖는지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.

도 1은 MMP25, DDR2 및 BATF 유전자로부터의 위험 대립유전자의 합계에 의해 계층화된, 루센티스 요법 12개월 후의 시력의 평균 변화를 보여준다.

바람직한 실시양태의 상세한 설명

달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기술을 이용할 것이며, 이들은 당업계의 기술범위 내에 있다. 이러한 기술은, 예컨대 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987], 및 정기 갱신판; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)]과 같은 문헌에 상세히 설명되어 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 학술 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley ＆ Sons (New York, N.Y. 1994)] 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley ＆ Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당업자에게 본 출원에 사용된 수많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공한다.

특허 출원 및 공보를 비롯하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.

정의

본원에 사용된 단수형은 문맥에서 달리 명확히 지시되지 않는 한, 복수형을 포함한다. 예를 들어, "세포"는 "세포들"도 또한 포함할 것이다.

용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소들을 포함하지만 다른 요소들을 배제하지는 않음을 의미하는 것으로 의도된다.

용어 "VEGF" 및 "VEGF-A"는 165-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자 및/또는 관련 121-, 189- 및 206-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자 (문헌 [Leung et al. Science, 246:1306 (1989)] 및 [Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)]에 기재된 바와 같음)를 그의 자연 발생 대립유전자 형태 및 가공된 형태와 함께 지칭하는 데 상호교환적으로 사용된다.

"항-VEGF 항체"는 VEGF에 충분한 친화도 및 특이성으로 결합하는 항체이다. 바람직하게는, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 상태를 표적으로 하고 방해하는 치료제로서 사용될 수 있다. 항-VEGF 항체는 통상적으로 다른 VEGF 상동체, 예컨대 VEGF-B 또는 VEGF-C, 또는 다른 성장 인자, 예컨대 PlGF, PDGF 또는 bFGF에는 결합하지 않을 것이다. 바람직한 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC® HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하고, 고-친화도 항-VEGF 항체인 모노클로날 항체이다. "고-친화도 항-VEGF 항체"는 VEGF에 대해 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1보다 10배 이상 더 우수한 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 항-VEGF 항체는 Y0317의 CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체를 비롯하여 WO 98/45331에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체 단편이다. 보다 바람직하게는, 항-VEGF 항체는 라니비주맙 (루센티스®)으로 알려져 있는 항체 단편이다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 모노클로날 항체 (전장 또는 무손상 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 포함한다.

"치료"는 치유적 치료, 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 장애가 있는 대상뿐만 아니라 장애를 방지하거나 지연시키고자 하는 대상을 포함한다.

용어 "다형성"은 개체군 내에서 변화하는, 유전자 서열 내의 위치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. 이러한 다형성의 위치는 유전자 내의 그의 위치 및 거기서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, Y402H CFH는 CFH 유전자 내의 아미노산 위치 402에 티로신 (Y)과 히스티딘 (H) 사이의 변이가 있음을 나타낸다. 상기 아미노산 변화는 2종의 상이한 대립유전자인, 2종의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 개별 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 임의의 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 상기 예의 경우에, CC, CT 또는 TT). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 NCBI 웹사이트 상에서 이용가능한 뉴클레오티드 서열 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스 (dbSNP)에서 사용되고 있는 고유 식별자 ("참조 SNP", "refSNP" 또는 "rs#")에 할당되어 있다.

용어 "유전자형"은 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특정 대립유전자를 지칭한다. 상기 예에서, CC, CT 또는 TT가 Y402H CFH 다형성에서의 가능한 유전자형이다.

용어 "샘플"은 환자로부터 채취한 세포 또는 조직 샘플을 포함한다. 예를 들어, 샘플은 피부 샘플, 협부 세포 샘플 또는 혈액 세포를 포함할 수 있다.

샘플에서의 특정 유전자형의 확인은 당업자에게 널리 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 다형성의 확인은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 대립유전자를 클로닝하고 그의 서열을 분석함으로써 수행할 수 있다. 대안적으로, 유전자 서열을, 예를 들어 PCR을 이용하여 게놈 DNA로부터 증폭시킬 수 있고, 생성물의 서열을 분석할 수 있다. 환자의 DNA를 주어진 유전자좌에서의 돌연변이에 대해 분석하는 여러 비제한적 방법이 하기 기재되어 있다.

DNA 마이크로어레이 기술, 예를 들어 DNA 칩 장치 및 고-처리량 스크리닝용의 고-밀도 마이크로어레이 및 저-밀도 마이크로어레이가 사용될 수 있다. 마이크로어레이 제작을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 다양한 잉크젯 및 마이크로젯 침착 또는 스폿팅 기술 및 공정, 계내 또는 칩-상 포토리소그래피 올리고뉴클레오티드 합성 공정, 및 전자 DNA 프로브 어드레싱 공정을 포함한다. DNA 마이크로어레이 혼성화 적용은 점 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 및 단연쇄 반복부 (STR)에 대한 유전자 발현 분석 및 유전자형 분석의 분야에 성공적으로 적용되어 왔다. 추가의 방법은 간섭 RNA 마이크로어레이, 및 마이크로어레이 및 다른 방법, 예컨대 레이저 포획 미세절제 (LCM), 비교 게놈 혼성화 (CGH) 및 크로마틴 면역침전 (ChiP)의 조합을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [He et al. (2007) Adv. Exp. Med. Biol. 593:117-133] 및 [Heller (2002) Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129-153])을 참조한다. 다른 방법은 PCR, xMAP, 침입자 검정, 질량 분광측정법 및 파이로시퀀싱을 포함한다 (문헌 [Wang et al. (2007) Microarray Technology and Cancer Gene Profiling Vol 593 of book series Advances in Experimental Medicine and Biology, pub. Springer New York]).

또 다른 검출 방법은 다형성 부위와 중복되며 다형성 영역 주위의 약 5개, 또는 대안적으로 10개, 또는 대안적으로 20개, 또는 대안적으로 25개, 또는 대안적으로 30개의 뉴클레오티드를 갖는 프로브를 사용한 대립유전자 특이적 혼성화이다. 예를 들어, 대립유전자 변이체에 특이적으로 혼성화될 수 있는 여러 프로브를 고체 상 지지체, 예를 들어, "칩"에 부착시킨다. 올리고뉴클레오티드는 리소그래피를 비롯한 다양한 공정에 의해 고체 지지체에 결합될 수 있다. "DNA 프로브 어레이"로도 지칭되는, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이들 칩을 사용한 돌연변이 검출 분석법은, 예를 들어 문헌 [Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244]에 기재되어 있다.

다른 검출 방법에서는, 대립유전자 변이체를 확인하기 전에 먼저 유전자의 적어도 일부분을 증폭시키는 것이 필요하다. 증폭은, 예를 들어 PCR 및/또는 LCR 또는 당업계에 널리 공지된 다른 방법에 의해 수행할 수 있다.

일부 경우에서, 대상체로부터의 DNA 중의 특정 대립유전자의 존재는 제한 효소 분석에 의해 나타날 수 있다. 예를 들어, 특정 뉴클레오티드 다형성은 또 다른 대립유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열에는 존재하지 않는 제한 부위를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다.

추가 실시양태에서, 절단 작용제 (예컨대, 뉴클레아제, 히드록실아민 또는 사산화오스뮴 및 피페리딘)로부터의 보호는 RNA/RNA, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 이종이중체의 미스매치된 염기를 검출하는 데 이용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Myers et al. (1985) Science 230:1242] 참조). 일반적으로, "미스매치 절단" 기술은, 유전자의 대립유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의로 표지된 대조군 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA를 조직 샘플로부터 수득한 샘플 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA와 혼성화시킴으로써 형성된 이종이중체를 제공함으로써 출발한다. 대조군과 샘플 가닥 사이의 염기쌍 미스매치를 기초로 하여 형성된 이중체와 같은 이중체의 단일-가닥 영역을 절단하는 작용제로 이중-가닥 이중체를 처리한다. 예를 들어, RNA/DNA 이중체는 RNase로 처리하고, DNA/DNA 하이브리드는 S1 뉴클레아제로 처리하여, 미스매치된 영역을 효소적으로 분해할 수 있다. 대안적으로, 미스매치된 영역을 분해하기 위해, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 이중체를 히드록실아민 또는 사산화오스뮴 및 피페리딘으로 처리할 수 있다. 미스매치된 영역을 분해시킨 후, 이어서 생성된 물질을 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 크기에 의해 분리하여, 대조군 및 샘플 핵산이 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는지 또는 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는지의 여부를 결정한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,455,249; 문헌 [Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397]; [Saleeba et al. (1992) Meth. Enzymol. 217:286-295]을 참조한다.

또한, 전기영동 이동성의 변화가 특정 대립유전자 변이체를 확인하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 입체형태 다형성 (SSCP)을 이용하여 돌연변이 핵산과 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동성 차이를 검출할 수 있다 (문헌 [Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766]; [Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144] 및 [Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79]). 샘플 및 대조군 핵산의 단일-가닥 DNA 단편을 변성시키고 재생되도록 한다. 단일-가닥 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 달라지며, 이에 따른 전기영동 이동성의 변화를 통해 심지어는 단일 염기 변화도 검출할 수 있다. DNA 단편은 표지된 프로브를 사용하여 표지 또는 검출될 수 있다. 검정의 감도는 (DNA 보다는) RNA (2차 구조가 서열 변화에 더 민감함)를 사용함으로써 증진될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 방법은 전기영동 이동성의 변화를 기초로 하여 이중 가닥 이종이중체 분자를 분리하는 이종이중체 분석을 이용한다 (문헌 [Keen et al. (1991) Trends Genet. 7:5]).

또한 변성제의 구배를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔 중에서의 다형성 영역을 포함하는 핵산의 이동을 분석함으로써 (변성 구배 겔 전기영동 (DGGE)을 이용하여 검정함) 대립유전자 변이체의 정체를 확인할 수 있다 (문헌 [Myers et al. (1985) Nature 313:495]). DGGE가 분석 방법으로서 이용되는 경우에, DNA는 예를 들어 PCR에 의해 대략 40 bp의 고-융점 GC-풍부 DNA의 GC 클램프를 첨가함으로써 완전히 변성되지 않도록 변형될 것이다. 추가 실시양태에서, 대조군 및 샘플 DNA의 이동성의 차이를 확인하기 위해 변성제 구배 대신에 온도 구배가 이용된다 (문헌 [Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:1275]).

2개의 핵산 사이에서 1개 이상의 뉴클레오티드의 차이를 검출하기 위한 기술의 예는 선택적 올리고뉴클레오티드 혼성화, 선택적 증폭, 또는 선택적 프라이머 연장을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 공지된 다형성 뉴클레오티드가 중심에 위치한 올리고뉴클레오티드 프로브 (대립유전자-특이적 프로브)를 제조한 다음, 완벽한 매치가 발견되는 경우에만 혼성화를 허용하는 조건 하에 표적 DNA에 혼성화시킬 수 있다 (문헌 [Saiki et al. (1986) Nature 324:163]; [Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230]). 이러한 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화 기술은 유전자의 다형성 영역에서의 뉴클레오티드 변화를 검출하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 특이적 대립유전자 변이체의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 혼성화 막에 부착시킨 다음, 상기 막을 표지된 샘플 핵산과 혼성화시킨다. 이어서, 혼성화 신호를 분석함으로써 샘플 핵산의 뉴클레오티드의 정체를 나타낼 것이다.

대안적으로, 선택적 PCR 증폭에 의존하는 대립유전자 특이적 증폭 기술을 본 발명과 함께 이용할 수 있다. 특이적 증폭을 위한 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 (증폭이 차별적인 혼성화에 의존하도록) 분자 중심에 관심의 대상이 되는 대립유전자 변이체를 보유할 수 있거나 (문헌 [Gibbs et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:2437-2448]), 또는 적절한 조건 하에 미스매치가 폴리머라제 연장을 방지 또는 감소시킬 수 있는 경우에는 한 프라이머의 극 3' 말단에 관심의 대상이 되는 대립유전자 변이체를 보유할 수 있다 (문헌 [Prossner (1993) Tibtech 11:238] 및 [Newton et al. (1989) Nucl Acids Res. 17:2503]). 상기 기술은 프로브 올리고 염기 연장(PRobe Oligo Base Extension)으로서 "프로브(PROBE)"로도 또한 지칭된다. 또한, 절단에 기초하여 검출할 수 있도록 신규 제한 부위를 돌연변이 영역 내에 도입하는 것이 바람직할 수 있다 (문헌 [Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1]).

또 다른 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 4,998,617 및 문헌 [Laridegren, U. et al. Science 241:1077-1080 (1988)])에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 라이게이션 검정 (OLA)을 이용하여 대립유전자 변이체의 확인을 수행할 수 있다. OLA 프로토콜은 표적 단일 가닥의 인접 서열에 혼성화될 수 있도록 디자인된 2개의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 상기 올리고뉴클레오티드 중 1개는 분리 마커에 연결되고 (예를 들어, 비오티닐화됨), 다른 것은 검출가능하게 표지된다. 정확한 상보성 서열이 표적 분자에서 발견되는 경우에, 올리고뉴클레오티드는 그의 말단이 인접하고 라이게이션 기질을 생성하도록 혼성화될 것이다. 이어서, 라이게이션은 표지된 올리고뉴클레오티드가 아비딘 또는 또 다른 비오틴 리간드를 사용하여 회수될 수 있도록 한다. 닉커슨, 디. 에이.(Nickerson, D. A.) 등은 PCR과 OLA의 특성을 조합한 핵산 검출 검정을 기재하였다 (문헌 [[Nickerson, D. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-8927]). 상기 방법에서는 PCR을 이용하여 표적 DNA를 기하급수적으로 증폭시킨 다음, OLA를 이용하여 표적 DNA를 검출한다.

본 발명은 MMP25, DDR2 및 BATF에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 검출하는 방법을 제공한다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 불변 서열의 영역에 접해 있기 때문에, 그의 분석을 위해서는 단일 변이체 뉴클레오티드의 정체를 결정하는 것 이외에는 어떤 것도 필요하지 않고, 각 환자에 대한 완전한 유전자 서열을 측정하는 것은 불필요하다. SNP의 분석을 용이하게 하는 여러 가지 방법이 개발되었다.

단일 염기 다형성은, 예를 들어 미국 특허 번호 4,656,127에 개시된 바와 같은 특수화된 엑소뉴클레아제 내성 뉴클레오티드를 사용함으로써 검출할 수 있다. 상기 방법에 따라, 다형성 부위의 3' 바로 가까이에 존재하는 대립유전자 서열에 상보적인 프라이머는 특정 동물 또는 인간으로부터 수득된 표적 분자에 혼성화하도록 허용된다. 표적 분자 상의 다형성 부위가, 존재하는 특정 엑소뉴클레아제 내성 뉴클레오티드 유도체에 상보적인 뉴클레오티드를 함유한다면, 그 유도체는 혼성화된 프라이머의 말단부에 혼입될 것이다. 이러한 혼입을 통해 프라이머는 엑소뉴클레아제에 대해 내성을 갖게 되고, 이로써 검출될 수 있다. 샘플의 엑소뉴클레아제 내성 유도체의 정체는 공지되어 있기 때문에, 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대해 내성을 갖는다는 발견은, 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드가 반응에 사용된 뉴클레오티드 유도체의 뉴클레오티드에 상보적이었다는 것을 나타낸다. 상기 방법은 다량의 외부 서열 데이터를 측정할 필요가 없다는 이점을 갖고 있다.

용액에 기초한 방법이 또한 다형성 부위의 뉴클레오티드의 정체를 결정하는 데 사용될 수 있다 (WO 91/02087). 상기와 같이, 다형성 부위의 3' 바로 가까이에 존재하는 대립유전자 서열에 상보적인 프라이머가 사용된다. 상기 방법은, 다형성 부위의 뉴클레오티드에 상보적인 경우에 프라이머의 말단에 혼입될 표지된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 사용하여 다형성 부위의 뉴클레오티드의 정체를 결정한다.

대안적 방법이 WO 92/15712에 기재되어 있다. 상기 방법은 표지된 종결인자 및 다형성 부위의 3' 서열에 상보적인 프라이머의 혼합물을 사용한다. 따라서, 혼입되는 표지된 종결인자는 평가될 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드에 의해 결정되고, 그에 상보적이다. 상기 방법은 통상적으로 프라이머 또는 표적 분자가 고체 상에 고정되어 있는 이종 상 검정이다.

DNA 중의 다형성 부위를 검정하기 위한 다수의 다른 프라이머-유도 뉴클레오티드 혼입 절차가 기재되어 있다 (문헌 [Komher, J. S. et al. (1989) Nucl. Acids. Res. 17:1119-1184]; [Sokolov, B. P. (1990) Nucl. Acids Res. 18:3671]; [Syvanen, A.-C., et al. (1990) Genomics 8:684-692]; [Kuppuswamy, M. N. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1143-1147]; [Prezant, T. R. et al. (1992) Hum. Mutat. 1:159-164]; [Ugozzoli, L. et al. (1992) GATA 9:107-112]; [Nyren, P. et al. (1993) Anal. Biochem. 208:171-175]). 이들 방법은 모두 다형성 부위에서 염기들을 구별하기 위해 표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼입에 의존한다.

또한, 유전자 또는 유전자 생성물 또는 다형성 변이체에서의 변화를 검출하기 위한 상기 방법 중 임의의 방법을 사용하여 치료 또는 요법의 과정을 모니터링할 수 있음을 이해할 것이다.

예를 들어 편리하게 사용될 수 있는 하나 이상의 프로브 또는 프라이머 핵산을 포함하는, 하기 기재되는 것과 같은 사전 포장된 진단용 키트를 이용하여 본원에 기재된 방법을 수행함으로써, 예를 들어 개체가 AMD가 발병할 증가된 가능성을 갖는지 또는 습성 AMD 환자가 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 결정할 수 있다.

상기 기재된 진단 및 예후 방법에서 사용하기 위한 샘플 핵산은 대상체의 임의의 세포 유형 또는 조직으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 대상체의 체액 (예를 들어, 혈액)은 공지된 기술에 의해 수득할 수 있다. 대안적으로, 핵산 시험은 건성 샘플 (예를 들어, 모발 또는 피부) 상에서 수행할 수 있다.

본원에 기재된 발명은 각각 rs1064875, rs10917583 및 rs175714에서 MMP25, DDR2 및 BATF 대립유전자를 비롯한 여러 대립유전자에 존재하는 대립유전자를 결정하고 확인하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 프로브는 샘플의 유전자형을 직접 결정하는 데 사용될 수 있거나, 또는 증폭과 동시에 또는 증폭 이후에 사용될 수 있다. 용어 "프로브"는 자연 발생 또는 재조합 단일- 또는 이중-가닥 핵산 또는 화학적으로 합성된 핵산을 포함한다. 이들은 닉(nick) 번역, 클레노우 필-인(Klenow fill-in) 반응, PCR 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 표지될 수 있다. 본 발명의 프로브, 그의 제조 및/또는 표지는 문헌 [Sambrook et al. (1989)] (상기 문헌)에 기재되어 있다. 프로브는 본 발명의 다형성 영역을 함유하는 핵산에 선택적으로 혼성화하는 데 적합한 임의 길이의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 사용되는 프로브의 길이는 부분적으로는 이용된 검정의 성질 및 사용되는 혼성화 조건에 따라 달라질 것이다.

표지된 프로브는 또한 다형성의 증폭과 함께 사용될 수 있다 (문헌 [Holland et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280]). 미국 특허 번호 5,210,015에는 PCR을 수행하는 동안 증폭 생성물을 실시간으로 측정하는 형광-기반 접근법이 기재되어 있다. 이러한 접근법은 이중-가닥 DNA의 존재량을 나타내기 위해 삽입 염료 (예컨대, 브로민화에티듐)를 사용하거나, 또는 형광-켄처 쌍을 함유하는 프로브를 사용하는데 ("택맨(TaqMan)®" 접근법으로도 또한 지칭됨), 여기서 프로브는 증폭되는 동안 절단되어 형광 분자를 방출하며, 그 분자의 농도는 이중-가닥 DNA의 존재량에 비례한다. 증폭되는 동안, 프로브는 표적 서열에 혼성화될 때 폴리머라제의 뉴클레아제 활성에 의해 분해되어, 형광 분자가 켄처 분자로부터 분리되도록 함으로써, 리포터 분자로부터 형광이 나타나도록 한다. 택맨® 접근법은 다형성을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 영역에 특이적으로 어닐링하는, 리포터 분자-켄처 분자 쌍을 함유하는 프로브를 사용한다.

프로브는 "유전자 칩"으로서 사용하기 위해 표면에 고정될 수 있다. 이러한 유전자 칩은 당업자에게 공지된 다수의 기술에 의해 유전자 변이를 검출하는 데 사용될 수 있다. 한 기술에서, 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 번호 6,025,136 및 6,018,041에 약술된 바와 같은 혼성화 접근법에 의한 서열 분석에 의해 DNA 서열을 결정하기 위해 유전자 칩 상에 정렬된다. 본 발명의 프로브는 또한 유전자 서열의 형광 검출에 사용될 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,968,740 및 5,858,659에 기재되어 있다. 또한, 프로브는 미국 특허 번호 5,952,172 및 문헌 [Kelley, S. O. et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27:4830-4837]에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 전기화학적 검출을 위해 전극 표면에 고정될 수 있다.

추가로, 프로브 또는 프라이머로서 사용되는 단리된 핵산은 보다 안정해지기 위해 변형될 수 있다. 변형된 예시적인 핵산 분자는 DNA의 포스포르아미데이트, 포스포티오에이트 및 메틸포스포네이트 유사체를 포함한다 (또한, 미국 특허 번호 5,176,996, 5,264,564 및 5,256,775 참조).

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 또한 MMP25, DDR2 또는 BATF에 존재하는 다형성 영역의 대립유전자 변이체 유형을 결정하기 위한 진단 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 MMP25, DDR2 또는 BATF의 다형성 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브 또는 프라이머를 사용한다. 따라서, 본 발명은 이들 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 습성 AMD 환자가 고-친화도 항-VEGF 항체를 비롯한 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 결정하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 조성물 및 사용 설명서를 포함한다. 단지 한 예로서, 본 발명은 또한 MMP25 rs1064875 SNP 중의 AG 다형성에 특이적인 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 습성 AMD 환자가 라니비주맙으로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 결정하기 위한 키트를 제공한다. 유전자좌에 "특이적인" 올리고뉴클레오티드는 좌위의 다형성 영역에 결합하거나 또는 좌위의 다형성 영역의 인접부에 결합한다. 증폭을 위한 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드에 대해, 프라이머는 다형성 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 생성하는 데 사용되기에 충분히 근접해 있는 경우에 인접해 있다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 다형성으로부터 약 1-2 kb, 예를 들어 1 kb 미만 이내에 결합하는 경우에 인접해 있다. 특이적 올리고뉴클레오티드는 서열에 혼성화될 수 있으며, 적합한 조건 하에 단일 뉴클레오티드가 상이한 서열에 결합하지 않을 것이다.

키트는 MMP25, DDR2 또는 BATF의 다형성 영역에 특이적으로 혼성화될 수 있는 하나 이상의 프로브 또는 프라이머 및 사용 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 통상적으로 하나 이상의 상기 기재된 핵산을 포함한다. MMP25, DDR2 또는 BATF의 적어도 일부분을 증폭시키기 위한 키트는 일반적으로 2개의 프라이머를 포함하며, 이들 중 적어도 1개는 대립유전자 변이체 서열에 혼성화될 수 있다. 이러한 키트는, 예를 들어 형광 검출, 전기화학 검출 또는 다른 검출에 의한 유전자형의 검출에 적합하다.

키트에 포함되어 있는 올리고뉴클레오티드는 프로브로서 사용되든지 또는 프라이머로서 사용되든지 관계없이 검출가능하게 표지될 수 있다. 표지는 직접적으로 (예를 들어, 형광 표지의 경우) 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 간접적 검출은 당업자에게 공지된 임의의 검출 방법, 예컨대 비오틴-아비딘 상호작용, 항체 결합 등을 포함할 수 있다. 형광 표지된 올리고뉴클레오티드는 또한 켄처 분자를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 표면에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 실리카 또는 유리이다. 일부 실시양태에서, 표면은 금속 전극이다.

본 발명의 또 다른 키트는 검정을 수행하는 데 필요한 하나 이상의 시약을 포함한다. 예를 들어, 키트는 효소를 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트는 완충제 또는 임의의 다른 필요한 시약을 포함할 수 있다.

키트는 MMP25, DDR2 또는 BATF의 다형성 영역에서 대상체의 유전자형을 결정하기 위해, 본원에 기재된 양성 대조군, 음성 대조군, 시약, 프라이머, 서열 분석 마커, 프로브 및 항체 모두 또는 이들 중 일부를 포함할 수 있다.

하기 실시예는 단지 본 발명의 실시를 예시하고자 하는 것이며, 제한하기 위해 제공된 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 유전자 다형성 및 그의 AMD 발생 및 치료 결과와의 연관성

샘플 및 유전자형 분석

HORIZON 연장 시험 중 DAWN 유전자 하위연구(substudy)에 참여한, 루센티스® 핵심 시험 (MARINA, ANCHOR 및 FOCUS)으로부터의 250명의 미확인 대상체로부터 말초 혈액 샘플을 수집하고, 게놈 DNA를 단리하였다. 분석에 사용된 모든 샘플은 "백인"으로서 자가-확인된 인종이었으며, 신생-혈관 AMD로 진단받았음이 확인되었다. 샘플은 104명의 남성 및 146명의 여성으로 구성되었고, 기준선에서의 평균 연령은 75.7세였다. 본 연구에서 개체 모두로부터 서면 사전 동의서를 받고, 연구 프로토콜은 임상시험 심사 위원회로부터 승인을 받았다.

상기 기재된 샘플 외에도, 102개의 샘플을 DAWN 연구의 일부로서 수집하여 총 352개의 샘플이 생성되었다. 352개의 샘플을 일루미나(Illumina)® 550K 인간 HapMap 비드 어레이를 사용하여 유전자형을 분석하였다. 본 발명자들은 고품질 데이터가 최종 분석에 포함되었다는 것을 확실하게 하기 위해 엄중한 품질 관리 (QC) 기준을 이용하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 a) 5％ 초과의 손실 데이터를 갖는 개체를 배제하였고, b) 잠재적 연관성을 기초로 하여 개체를 배제하였고, IBS 상태를 기초로 하여 이중 샘플을 배제하였다 (PI_Hat > 0.15, 이 데이터 세트에서는 검출되지 않음). 본 발명자들은 단지 a) 5％ 미만의 손실 데이터, b) 1x10^-6 초과의 HWE p-값, 및 c) 0.01％ 초과의 MAF를 갖는 SNP만을 포함시켰다. 모든 QC 시험은 PLINK를 이용하여 수행하였다 (문헌 [Purcell et al. (2007) Am. J. Hum. Genet. 81, 559-75]).

루센티스® 요법에의 반응에 대한 게놈-전반 관련성 스캔

DAWN 샘플을 MARINA, ANCHOR 및 FOCUS 시험 동안 처리 상태를 기초로 하여 2개의 군으로 분리하였다. 루센티스® 처리군은 0.3 mg, 0.5 mg 또는 0.5 mg+PDT의 용량을 수용한 개체를 포함하였다 (N=242). SHAM/PDT 군은 모의 주사 (SHAM) 또는 단지 광역학 요법 (PDT)만 수용한 개체로 구성되었다 (N=110). 본 발명자들은 게놈-전반 관련성 스캔을 수행하여, 루센티스® 처리 12개월 후의 시력 (VA, 문자로 측정함) 변화와 유의하게 관련된 유전자 변이체를 확인하였다 (표 1). VA의 평균 변화와 관련된 최상위 좌위의 목록으로부터, 본 발명자들은 상처 복구에서 역할을 할 가능성이 높은 유전자를 함유하는 3개의 좌위를 확인하였고 (표 2), MMP25 (rs1064875), DDR2 (rs10917583) 및 BATF (rs175714) 좌위로부터 각각의 개체가 보유한 위험 대립유전자의 수를 합산하여 "유전자 점수"를 생성하였다 (도 1).

<표 1>

<표 2>

기준선 임상적 표현형에 대한 게놈-전반 관련성 스캔

모든 352개의 DAWN 샘플에서, 본 발명자들은 하기를 비롯한 여러 기준선 표현형과의 관련성에 대한 게놈-전반 시험을 수행하였다: 기준선에서의 시력 (표 3), 비처리된 타안 내 CNV의 존재 (표 4), 및 CNV 분류 (우세 전형적 대 소수 전형적 및 잠복형 분류, 표 5).

<표 3>

<표 4>

<표 5>

Sequence Listing <110> GENENTECH, INC. GRAHAM, Robert <120> GENETIC POLYMORPHISMS IN AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION <130> P4382R1 WO <141> 2010-10-20 <150> US 61/253,758 <151> 2009-10-21 <160> 6 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDRH1 <400> 1 Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDRH2 <400> 2 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 1 5 10 15 Lys Arg <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDRH3 <400> 3 Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDRL1 <400> 4 Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDRL2 <400> 5 Phe Thr Ser Ser Leu His Ser 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> CDRL3 <400> 6 Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 5

Claims

습성 AMD 환자로부터 단리된 샘플을 rs1064875에 상응하는 매트릭스 메탈로프로테아제 25 유전자 (MMP25) 대립유전자 중의 게놈 다형성에 대해 스크리닝하는 것을 포함하고, 여기서 상응하는 유전자형이 AA 또는 AG를 포함하는 경우에, 상기 환자는 고-친화도 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는 것인, 습성 AMD 환자가 고-친화도 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
습성 AMD 환자로부터 단리된 샘플을 rs175714에 상응하는 염기성 류신 지퍼 전사 인자, ATF-유사 (BATF) 대립유전자 중의 게놈 다형성에 대해 스크리닝하는 것을 포함하고, 여기서 상응하는 유전자형이 AA 또는 AG를 포함하는 경우에, 상기 환자는 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는 것인, 습성 AMD 환자가 항-VEGF 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 증가된 가능성을 갖는지의 여부를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-VEGF 항체가 하이브리도마 ATCC® HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 항-VEGF 항체가 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)으로서 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 경쇄 CDR로서 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 항-VEGF 항체가 Y0317의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-VEGF 항체가 라니비주맙인 방법.
제1항에 있어서, 상응하는 유전자형이 AA를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상응하는 유전자형이 AG를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상응하는 유전자형이 AA를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상응하는 유전자형이 AG를 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 항-VEGF 항체가 라니비주맙인 방법.
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