ES2819217T3 - Conjugados de polímeros iónicos dipolares y factor VIII - Google Patents

Conjugados de polímeros iónicos dipolares y factor VIII Download PDF

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D Victor Perlroth
Li Song
Martin Linsell
Wayne To
Didier Benoit
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Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula siguiente: R1-R2-(-R3)s donde s es 1-20; R1 se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH y -SH; R2 se selecciona del grupo que consiste en alquileno, alcoxileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, arilenoxi, amido y una combinación de los mismos; y R3 es **(Ver fórmula** donde R4, R5 y R6 son iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en: **(Ver fórmula)** y donde Z es -NCS, -F, -CI, -Br o -I.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de polímeros iónicos dipolares y factor VIII
ANTECEDENTES
La hemofilia A es un trastorno hereditario de la coagulación de la sangre provocado por deficiencias o mutaciones en el Factor VIII (FVIII). El Factor VIII es un componente crucial en la vía intrínseca de la coagulación sanguínea. Las deficiencias en el Factor VIII provocan el aumento de las hemorragias. La hemofilia A está ligada al cromosoma X y se observa en hombres en aproximadamente 1 de cada 5000.
Los pacientes con hemofilia A se tratan actualmente mediante administración intravenosa de FVIII humano recombinante de longitud completa. El tratamiento puede ser profiláctico o según sea necesario en respuesta a una lesión que provoca hemorragia. La semivida del Factor VIII en los seres humanos es relativamente corta, habitualmente del orden de 11 horas. Por tanto, se requieren dosis frecuentes, del orden de tres veces por semana, para un tratamiento efectivo. Sin embargo, tal administración frecuente, habitualmente mediante infusión, no es deseable, requiere consultas frecuentes a un ambulatorio u otro proveedor de asistencia sanitaria. Asimismo, tal administración frecuente puede reducir el cumplimiento terapéutico del paciente con las pautas posológicas de administración prescritas.
Otro inconveniente del tratamiento actual con Factor VIII es que de 25 a 30 % de los pacientes tratados con Factor VIII desarrollan anticuerpos contra el Factor VIII. Los pacientes con concentraciones altas de anticuerpos anti-Factor VIII circulantes no se pueden tratar satisfactoriamente con los tratamientos de Factor VIII actuales. Tales pacientes requieren una pauta posológica de tratamiento más costosa que implica la terapia con Factor VIIa y de tolerancia inmunitaria.
La eficacia de un agente terapéutico se puede potenciar mejorando su biodisponibilidad y sus propiedades farmacocinéticas.Los documentos WO 2011/130694 y WO 2013/059137 describen polímeros de alto PM de múltiples brazos que contienen grupos hidrófilos y uno o más agentes funcionales.El documento WO 2008/025856 describe un procedimiento para conjugar glucoproteínas por medio de modificación química.El documento US 2013/0045522 describe copolímeros aleatorios que contienen iones dipolares y uno o más agentes funcionales.El documento US 2010/0166700 describe reactivos poliméricos y conjugados de los mismos. Una estrategia para mejorar la biodisponibilidad ha sido la PEGilación. La PEGilación implica la adición de cadenas de polietilenglicol a un fármaco, habitualmente una proteína. A los conjugados de PEG se les ha atribuido una reducción en la inmunogenicidad o antigenicidad, una semivida aumentada, una solubilidad aumentada, una depuración renal reducida y una degradación enzimática reducida. Como resultado de estos atributos, se ha descrito que los conjugados de PEG de ciertos agentes biológicamente activos en ocasiones requieren una administración menos frecuente y pueden permitir el uso de menos agente activo para conseguir un criterio de valoración terapéutico. La administración menos frecuente es generalmente deseable porque reduce el número total de inyecciones, que pueden resultar dolorosas y que requieren consultas inoportunas a los profesionales sanitarios.
Aunque se ha conseguido cierto éxito con la conjugación de PEG, la “PEGilación” de agentes biológicamente activos sigue siendo un reto. A medida que los desarrolladores de fármacos progresan más allá de proteínas agonistas muy potentes, tales como la eritropoyetina y los diversos interferones, los posibles beneficios del polímero hidrófilo de PEG en cuanto a solubilidad, estabilidad y biodisponibilidad aumentadas no compensan suficientemente la viscosidad e inmunogenicidad aumentadas.
No se ha observado que la PEGilación del FVIII aumente significativamente la semivida del conjugado in vivo. Por tanto, sigue existiendo una necesidad de fármacos de FVIII con semivida in vivo aumentada que conserven una actividad biológica suficiente.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN REIVINDICADA
La invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula siguiente:
R1—R2-(-R3)s;
donde s es 1-20;
R1 se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH y -SH;
R2 se selecciona del grupo que consiste en alquileno, alcoxileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, arilenoxi, amido y una combinación de los mismos; y
R4
\-\~R5
R3 es R6 > donde R4, R5 y R6 son ¡guales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en:
Figure imgf000003_0001
y
donde Z es -NCS, -F, -CI, -Br o -I.
La presente invención proporciona además un procedimiento para sintetizar un enlazador-iniciador polimerizado que comprende:
proporcionar un iniciador que tiene la fórmula siguiente
R1—R2-(-R3)s;
donde s es 1-20;
R1 se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH y -SH;
R2 se selecciona del grupo que consiste en alquileno, alcoxileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, arilenoxi, amido y una combinación de los mismos; y
R3 es
Figure imgf000003_0002
donde R4, R5 y R6 son iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en:
Figure imgf000003_0003
y donde Z es -NCS, -F, -CI, -Br o -I; y
combinar el iniciador con uno o más tipos de monómero adecuados para la polimerización donde al menos uno de dichos tipos de monómero comprende un ion dipolar, donde dichos tipos de monómero reaccionan para formar un iniciador polimerizado; y
acoplar un resto de enlazador que comprende un segundo y tercer grupos reactivos al iniciador polimerizado para proporcionar un enlazador-iniciador polimerizado que tiene un grupo reactivo que no ha reaccionado. En esta invención se describe un conjugado que comprende FVIII recombinante (rFVIII) y un polímero iónico dipolar donde el polímero comprende una o más unidades monoméricas y donde al menos una unidad monomérica comprende un grupo iónico dipolar. Opcionalmente, el grupo iónico dipolar comprende fosforilcolina. Opcionalmente, el monómero comprende fosfato de 2-(acriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo). Opcionalmente, el monómero comprende fosfato de 2-(metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo) (HEMA-PC). El rFVIII puede tener una eliminación de parte o la totalidad del dominio B o puede tener un dominio B intacto. Opcionalmente, el polímero tiene 3 o más brazos. Opcionalmente, el polímero tiene 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 brazos. Opcionalmente, el polímero tiene 3, 6 o 9 brazos, preferiblemente el polímero tiene 9 brazos.
Algunos conjugados son tales que la porción polimérica tiene un peso molecular máximo de entre 300000 y 1750 000 Daltons que incluye el rFVIII. Algunos conjugados tienen una porción polimérica con un peso molecular máximo entre 500000 y 1000000 Daltons. Algunos conjugados tienen una porción polimérica con un peso molecular máximo entre 600000 y 800000 Daltons.
En algunos conjugados, el rFVIII está unido covalentemente al polímero. En algunos conjugados, el polímero está unido covalentemente a al menos uno de un grupo amino, un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo y un grupo carboxilo del rFVIII. En algunos conjugados, el grupo sulfhidrilo proviene de un residuo de cisteína del rFVIII. En algunos conjugados, el residuo de cisteína es un residuo de cisteína recombinante. En algunos conjugados, el residuo de cisteína recombinante se selecciona del grupo que consiste en Y81C, F129C, K377C, H378C, K422C, Q468C, L491C, L504C, K556C, K570C, D1795C, Q1796C, R1803C, K1804C, K1808C, K1810C, T1821C, K1813C, N1864C, T1911C, N2118C, Q2091C, F2093C y Q2284C, donde los residuos se numeran a partir de los residuos correspondientes de la SEQ ID NO: 1 (Fig. 1), cuando el Factor VIII recombinante se alinea al máximo con la SEQ ID NO: 1. En algunos conjugados, el residuo de cisteína está presente de manera natural en el rFVIII. En algunos conjugados, el residuo de cisteína está en el dominio B. En algunos conjugados, el residuo de cisteína se selecciona del grupo que consiste en 1293C, 1373C, 1604C y 1636C, preferiblemente 1604C o 1636C.
Un conjugado preferido tiene una porción polimérica con un peso molecular máximo de entre 100000 y 1500000, más preferiblemente 500000 a 1000000 Daltons o 600000 a 850000 Daltons que incluye rFVIII y 3, 6 o 9 brazos, preferiblemente 9 brazos.
En esta invención se describe un conjugado que comprende FVIII recombinante (rFVIII) con al menos una porción de un dominio B y un polímero iónico dipolar donde el polímero comprende una o más unidades monoméricas y donde al menos una unidad monomérica comprende un grupo iónico dipolar y el polímero está conjugado al rFVIII a través de un residuo de cisteína del dominio B, donde se conjuga un polímero ramificado por molécula de rFVIII. Opcionalmente, el polímero es un polímero ramificado, opcionalmente con 9 ramificaciones. Opcionalmente, el polímero se conjuga a través de un residuo de cisteína que es uno de los dos residuos de cisteína más cercanos al extremo carboxilo de la porción del dominio B. Opcionalmente, el conjugado tiene una semivida in vivo en humanos de al menos 20 horas.
En esta invención se describe una composición que comprende moléculas de un conjugado que comprende FVIII recombinante (rFVIII) que incluye una cadena ligera y una cadena pesada que incluye al menos una porción de un dominio B y un polímero iónico dipolar donde el polímero comprende uno o más unidades monoméricas y donde al menos una unidad monomérica comprende un grupo iónico dipolar y el polímero está conjugado al rFVIII a través de un residuo de cisteína del dominio B, donde al menos 80, 90, 95 o 99 % de las moléculas del conjugado en la composición tienen la misma porción del dominio B y se conjuga un polímero por molécula de rFVIII. Opcionalmente, el polímero es ramificado, opcionalmente con 9 ramificaciones. Opcionalmente, la cadena pesada incluye al menos los residuos 1-1604 de la SEQ ID NO: 1, o al menos los residuos 1-1636 de la SEQ ID NO: 1, o al menos los residuos 1-1648 de la SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, la cadena pesada consiste en los residuos 1-1648 de la SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, la al menos una porción del dominio B es un dominio B intacto. Opcionalmente, el polímero está conjugado a través de una cisteína que es una de las dos cisteínas más cercanas al extremo carboxilo del dominio B.
En esta invención se describe una composición farmacéutica que comprende un conjugado como se describió anteriormente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 representa la secuencia de aminoácidos de Factor VIII humano maduro (SEQ ID NO : 1).
La Fig. 2 muestra los dominios del factor VIII humano y la ubicación de los residuos de cisteína (reproducido de Lenting y col., Blood 1998;92:3983-3996)
DESCRIPCIÓN DETALLADA
I. GENERAL
En esta invención se describen polímeros de alto peso molecular (PM) que tienen grupos hidrófilos o iones dipolares, tales como fosforilcolina. También se describen en esta invención procedimientos y materiales de partida novedosos para fabricar los polímeros de alto PM. También se describen en esta invención conjugados de los polímeros de alto PM y agente funcional (como se define en esta invención).
II. DEFINICIONES
“Polímero” se refiere a una serie de grupos monoméricos enlazados entre sí. Los polímeros de alto PM se preparan a partir de monómeros que incluyen acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, estirenos, vinilpiridina, vinilpirrolidona y ásteres de vinilo tales como acetato de vinilo. Monómeros adicionales son útiles en los polímeros de alto PM de la presente invención. Cuando se usan dos monómeros diferentes, los dos monómeros se denominan “comonómeros”, lo que significa que los monómeros diferentes están copolimerizados para formar un único polímero. El polímero puede ser lineal o ramificado. Cuando el polímero es ramificado, cada cadena polimérica se denomina “brazo polimérico”. El extremo del brazo polimérico enlazado al resto de iniciador es el extremo proximal, y el extremo de la cadena en crecimiento del brazo polimérico es el extremo distal. En el extremo de la cadena en crecimiento del brazo polimérico, el grupo terminal del brazo de polímero puede ser antioxidante u otro grupo.
“Iniciador” se refiere a un compuesto capaz de iniciar una polimerización usando los monómeros o comonómeros de la presente invención. La polimerización puede ser una polimerización convencional por radicales libres o preferiblemente una polimerización por radicales controlada/por radicales vivos, tal como polimerización por radicales de transferencia atómica (ATRP), polimerización por adición, fragmentación y transferencia de cadena reversible (RAFT) o polimerización mediada por nitróxido (NMP). La polimerización puede ser una polimerización “pseudo”controlada, tal como la transferencia degenerativa. Cuando el iniciador es adecuado para ATRP, contiene un enlace lábil que se puede escindir homolíticamente para formar un fragmento de iniciador, I, que es un radical capaz de iniciar una polimerización por radicales, y un antioxidante, I ', que reacciona con el radical de la cadena polimérica en crecimiento para terminar reversiblemente la polimerización. El antioxidante I 'es habitualmente un halógeno, pero también puede ser un resto orgánico, tal como un nitrilo.
“Enlazador” se refiere a un resto químico que enlaza dos grupos entre sí. El enlazador puede ser escindible o no escindible. Los enlazadores escindibles pueden ser enlazadores hidrolizables, escindibles enzimáticamente, sensibles al pH, fotolábiles o de disulfuro, entre otros. Otros enlazadores incluyen enlazadores homobifuncionales y heterobifuncionales. Un “grupo enlazador” es un grupo funcional capaz de formar un enlace covalente que consiste en uno o más enlaces a un agente bioactivo. Los ejemplos incluyen los ilustrados en la Tabla 1.
El término “grupo reactivo”, como se emplea en esta invención, se refiere a un grupo que es capaz de reaccionar con otro grupo químico para formar un enlace covalente, es decir, es covalentemente reactivo en condiciones de reacción adecuadas, y generalmente representa un punto de fijación para otra sustancia. El grupo reactivo es un resto, tal como éster de maleimida o succinimidilo, de los compuestos de la presente invención que es capaz de reaccionar químicamente con un grupo funcional de un compuesto diferente para formar un enlace covalente. Los grupos reactivos generalmente incluyen grupos nucleófilos, electrófilos y fotoactivables.
“Agente funcional” se define para incluir un agente bioactivo o un agente de diagnóstico. Un “agente bioactivo” se define para incluir cualquier agente, fármaco, compuesto o mezcla de los mismos que se dirige a una ubicación biológica específica (agente de direccionamiento) y/o proporciona algún efecto fisiológico o farmacológico, local o sistémico, que se puede demostrar in vivo o in vitro.Los ejemplos incluyen fármacos, vacunas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, scFv, diacuerpos, avímeros, vitaminas y cofactores, polisacáridos, carbohidratos, esteroides, lípidos, grasas, proteínas, péptidos, polipéptidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos y ácidos nucleicos (p. ej., ARNm, ARNt, ARNnp, ARNi, AdN, ADNc, construcciones no codificantes, ribozimas, etc.). Un “agente de diagnóstico” se define para incluir cualquier agente que permite la detección o adquisición de imágenes de un tejido o una enfermedad. Los ejemplos de agentes de diagnóstico incluyen radiomarcadores, fluoróforos y colorantes.
“Proteína terapéutica” se refiere a péptidos o proteínas que incluyen una secuencia de aminoácidos que, en su totalidad o en parte, constituye un fármaco y se puede usar en aplicaciones farmacéuticas en seres humanos o animales. Se conocen numerosas proteínas terapéuticas, que incluyen las descritas en esta invención.
“Fosforilcolina”, también designada como “FC”, se refiere a lo siguiente:
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donde * simboliza el punto de fijación. La fosforilcolina es un grupo iónico dipolar e incluye sales (tal como sales internas) y formas protonadas y desprotonadas de las mismas.
“Polímero que contiene fosforilcolina” es un polímero que contiene fosforilcolina. “Polímero que contiene un ion dipolar” se refiere a un polímero que contiene un ion dipolar.
Polímero que contiene poli(acriloiloxietilfosforilcolina) se refiere a un polímero que contiene fosfato de 2-(acriloiloxi)etil-2-(trimetilamonio)etilo como monómero.
Polímero que contiene poli(metacriloiloxietilfosforilcolina) se refiere a un polímero que contiene fosfato de 2(metacriloiloxi)etil-2-(trimetilamonio)etilo como monómero.
El “peso molecular”, en el contexto del polímero, se puede expresar indistintamente como un peso molecular medio numérico o como un peso molecular medio ponderado o un peso molecular máximo. A menos que se indique de otro modo, todas las referencias al peso molecular en este documento se refieren al peso molecular máximo. Estas determinaciones del peso molecular medio numérico (Mn), medio ponderado (Mw) y máximo (Mp), se pueden medir usando cromatografía de exclusión molecular u otras técnicas de cromatografía líquida. También se pueden usar otros procedimientos para medir los valores del peso molecular, tal como el uso de análisis de grupos terminales o la medición de las propiedades coligativas (p. ej., depresión del punto de congelación, elevación del punto de ebullición o presión osmótica) para determinar el peso molecular medio numérico, o el uso de técnicas de dispersión de luz, ultracentrifugación o viscosimetría para determinar el peso molecular medio ponderado. El peso molecular se puede medir mediante SEC-MALS (cromatografía de exclusión molecular-dispersión de luz multiángulo). Los reactivos poliméricos descritos en esta invención son habitualmente polidispersos (es decir, el peso molecular medio numérico y el peso molecular medio ponderado de los polímeros no son iguales), poseyendo preferiblemente valores de polidispersidad bajos de, por ejemplo, menos de 1,5, según se evalúa mediante cromatografía de permeación en gel. Opcionalmente, las polidispersidades (IPD) están más preferiblemente en el intervalo de 1,4 a 1,2, aún más preferiblemente son inferiores a 1,15, e incluso más preferiblemente inferiores a 1,10, todavía más preferiblemente inferiores a 1,05 y lo más preferiblemente inferiores a 1,03.
Las expresiones “un” o “una” entidad, como se emplean en esta invención, se refieren a una entidad se refieren a uno/a o más de esa entidad; por ejemplo, un compuesto se refiere a uno o más compuestos o al menos un compuesto. Como tales, los términos “un” (o “una”), “uno/a o más” y “al menos uno/a” se pueden usar indistintamente en esta invención.
“Protegido/a”, “forma protegida”, “grupo protector” y “grupo de protección” se refieren a la presencia de un grupo (es decir, el grupo protector) que impide o bloquea la reacción de un grupo funcional químicamente reactivo particular de una molécula en ciertas condiciones de reacción. Los grupos protectores varían en función del tipo de grupo químicamente reactivo que se protege, así como de las condiciones de reacción que se van a emplear y de la presencia de grupos reactivos o protectores adicionales en la molécula, si los hubiera. Los grupos protectores adecuados incluyen aquellos tales como los encontrados en el tratado de Greene y col., “Protective Groups In Organic Synthesis”, 3a edición, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, 1999.
“Alquilo” se refiere a un radical alifático saturado, lineal o ramificado, que tiene el número de átomos de carbono indicado. Por ejemplo, alquilo C1-C6 incluye metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, etc. Otros grupos alquilo incluyen heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc. Alquilo puede incluir cualquier número de carbonos, tal como 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2- 3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4­ 5, 4-6 y 5-6. El grupo alquilo es habitualmente monovalente, pero puede ser divalente, tal como cuando el grupo alquilo enlaza dos restos entre sí.
El término “inferior” mencionado anteriormente y en lo sucesivo en relación con radicales o compuestos orgánicos, define respectivamente un radical o compuesto que puede ser ramificado o no ramificado con hasta, e incluso 7, preferiblemente hasta, e incluso 4, y (como no ramificado) uno o dos átomos de carbono.
“Alquileno” se refiere a un grupo alquilo, como se definió anteriormente, que enlaza al menos otros dos grupos, es decir, un radical hidrocarbonado divalente. Los dos restos enlazados al alquileno pueden estar enlazados al mismo átomo o a diferentes átomos del alquileno. Por ejemplo, un alquileno de cadena lineal puede ser el radical bivalente de -(CH2)n, donde n es 1,2, 3, 4, 5 o 6. Los grupos alquileno incluyen metileno, etileno, propileno, isopropileno, butileno, isobutileno, sec-butileno, pentileno y hexileno.
“Alcoxi” se refiere a un grupo alquilo que tiene un átomo de oxígeno que conecta el grupo alcoxi al punto de fijación o está enlazado a dos carbonos del grupo alcoxi. Los grupos alcoxi incluyen, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, 2-butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, pentoxi, hexoxi, etc. Los grupos alcoxi pueden estar sustituidos además con varios sustituyentes descritos en esta invención. Por ejemplo, los grupos alcoxi pueden estar sustituidos con halógenos para formar un grupo “haloalcoxi”.
“Carboxialquilo” significa un grupo alquilo (como se define en esta invención) sustituido con un grupo carboxi. El término “carboxicicloalquilo” significa un grupo cicloalquilo (como se define en esta invención) sustituido con un grupo carboxi. El término “alcoxialquilo” significa un grupo alquilo (como se define en esta invención) sustituido con un grupo alcoxi. El término “carboxi” empleado en esta invención se refiere a ácidos carboxílicos y sus ésteres.
“Haloalquilo” se refiere a un alquilo como se definió anteriormente en el que algunos o la totalidad de los átomos de hidrógeno están sustituidos con átomos de halógeno. Halógeno (halo) representa preferiblemente cloro o flúor, pero también puede ser bromo o yodo. Por ejemplo, haloalquilo incluye trifluorometilo, fluorometilo, 1,2,3,4,5-pentafluorofenilo, etc. El término “perfluoro” define un compuesto o radical que tiene todos los hidrógenos disponibles sustituidos con flúor. Por ejemplo, perfluorofenilo se refiere a 1,2,3,4,5-pentafluorofenilo, perfluorometilo se refiere a 1,1,1 -trifluorometilo y perfluorometoxi se refiere a 1,1,1-trifluorometoxi.
“Alquilo sustituido con flúor” se refiere a un grupo alquilo en el que uno, algunos, o todos los átomos de hidrógeno han sido sustituidos por flúor.
“Citocina” es un miembro de un grupo de moléculas de señalización proteica que pueden participar en la comunicación intercelular en las respuestas inmunitaria e inflamatoria. Las citocinas son habitualmente glucoproteínas hidrosolubles pequeñas que tienen una masa de 8-35 kDa.
“Cicloalquilo” se refiere a un grupo hidrocarbonado cíclico que contiene de 3 a 12, de 3 a 10, o de 3 a 7 átomos de carbono endocíclicos. Los grupos cicloalquilo incluyen estructuras de anillos fusionados, con enlaces de tipo puente y espiro.
“Endocíclico” se refiere a un átomo o grupo de átomos que comprenden parte de una estructura de anillo cíclica. “Exocíclico” se refiere a un átomo o grupo de átomos que están fijados, pero no definen la estructura de anillo cíclica. “Cicloalquil éter” se refiere a un grupo alquilo cíclico de 4 o 5 miembros que tiene 3 o 4 átomos de carbono endocíclicos y 1 átomo de oxígeno o azufre endocíclico (p. ej., oxetano, tietano, tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno); o un grupo alquilo cíclico de 6 a 7 miembros que tiene 1 o 2 átomos de oxígeno o azufre endocíclicos (p. ej., tetrahidropirano, 1,3-dioxano, 1,4-dioxano, tetrahidrotiopirano, 1,3-ditiano, 1,4-ditiano, 1,4-oxatiano).
“Alquenilo” se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada de 2 a 6 átomos de carbono que tiene al menos un doble enlace. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen vinilo, propenilo, isopropenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, isobutenilo, butadienilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, isopentenilo, 1,3-pentadienilo, 1,4-pentadienilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 1,3-hexadienilo, 1,4-hexadienilo, 1,5-hexadienilo, 2,4-hexadienilo o 1,3,5-hexatrienilo. Los grupos alquenilo también pueden tener de 2 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 3 a 4, 3 a 5, 3 a 6, 4 a 5, 4 a 6 y 5 a 6 carbonos. El grupo alquenilo es típicamente monovalente, pero puede ser divalente, como cuando el grupo alquenilo une dos restos. “Alquenileno” se refiere a un grupo alquenilo, como se definió anteriormente, que enlaza al menos otros dos grupos, es decir, un radical hidrocarbonado divalente. Los dos restos enlazados al alquenileno pueden estar enlazados al mismo átomo o a diferentes átomos del alquileno. Los grupos alquenileno incluyen etenileno, propenileno, isopropenileno, butenileno, isobutenileno, sec-butenileno, pentenileno y hexenileno.
“Alquinilo” se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada de 2 a 6 átomos de carbono que tiene al menos un triple enlace. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, isobutinilo, secbutinilo, butadiinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, isopentinilo, 1,3-pentadiinilo, 1,4-pentadiinilo, 1 -hexinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 1,3-hexadiinilo, 1,4-hexadiinilo, 1,5-hexadiinilo, 2,4-hexadiinilo o 1,3,5-hexatriinilo. Los grupos alquinilo también pueden tener de 2 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 3 a 4, 3 a 5, 3 a 6, 4 a 5, 4 a 6 y 5 a 6 carbonos. El grupo alquinilo es habitualmente monovalente, pero puede ser divalente, tal como cuando el grupo alquinilo enlaza dos restos entre sí. “Alquinileno” se refiere a un grupo alquinilo, como se definió anteriormente, que enlaza al menos otros dos grupos, es decir, un radical hidrocarbonado divalente. Los dos restos enlazados al alquinileno pueden estar enlazados al mismo átomo o a diferentes átomos del alquinileno. Los grupos alquinileno incluyen etinileno, propinileno, butinileno, secbutinileno, pentinileno y hexinileno.
“Cicloalquilo” se refiere a una estructura de anillo monocíclico, bicíclico fusionado o policíclico con enlaces de tipo puente, saturado o parcialmente instaurado, que contiene de 3 a 12 átomos en el anillo, o el número de átomos indicado. Los anillos monocíclicos incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y ciclooctilo. Los anillos bicíclicos y policíclicos incluyen, por ejemplo, norbornano, decahidronaftaleno y adamantano. Por ejemplo, cicloalquilo C3-8 incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclooctilo, y norbornano.
“Cicloalquileno” se refiere a un grupo cicloalquilo, como se definió anteriormente, que enlaza al menos otros dos grupos, es decir, un radical hidrocarbonado divalente. Los dos restos enlazados al cicloalquileno pueden estar enlazados al mismo átomo o a diferentes átomos del cicloalquileno. Los grupos cicloalquileno incluyen ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno y ciclooctileno.
“Heterocicloalquilo” se refiere a un sistema de anillo que tiene de 3 miembros en el anillo a 20 miembros en el anillo y de 1 a 5 heteroátomos tales como N, O y S. También pueden ser útiles heteroátomos adicionales, que incluyen B, Al, Si y P. Los heteroátomos también pueden estar oxidados, tal como -S(O)- y -S(O)2-. Por ejemplo, heterociclo incluye tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo, morfolino, pirrolidinilo, pirrolinilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, piperidinilo, indolinilo, quinuclidinilo y 1,4-dioxa-8-azaespiro[4.5]dec-8-ilo.
“Heterocidoalquileno” se refiere a un grupo heterociclalquilo, como se definió anteriormente, que enlaza al menos otros dos grupos. Los dos restos enlazados al heterocicloalquileno pueden estar enlazados al mismo átomo o a diferentes átomos del heterocicloalquileno.
“Arilo” se refiere a una estructura de anillo aromático monocíclico o bicíclico fusionado, tricíclico o superior que contiene 6 a 16 átomos de carbono en el anillo. Por ejemplo, arilo puede ser fenilo, bencilo o naftilo, preferiblemente fenilo. “Arileno” significa un radical divalente derivado de un grupo arilo. Los grupos arilo pueden estar mono-, di- o trisustituidos por uno, dos o tres radicales seleccionados de entre alquilo, alcoxi, arilo, hidroxi, halógeno, ciano, amino, aminoalquilo, trifluorometilo, alquilendioxi y oxi-alquileno C2-C3; todos los cuales están opcionalmente sustituidos además, por ejemplo, como se definió anteriormente en esta invención; o 1- o 2-naftilo; o 1- o 2-fenantrenilo. El alquilendioxi es un sustituto divalente fijado a dos átomos de carbono adyacentes de fenilo, p. ej., metilendioxi o etilendioxi. Oxi-alquileno C2-C3 también es un sustituyente divalente fijado a dos átomos de carbono adyacentes de fenilo, p. ej., oxietileno u oxipropileno. Un ejemplo de oxi-alquilen C2-C3-fenilo es 2,3-dihidrobenzofuran-5-ilo.
Se prefiere como arilo naftilo, fenilo o fenilo mono- o disustituido por alcoxi, fenilo, halógeno, alquilo o trifluorometilo, especialmente fenilo o fenilo mono- o disustituido por alcoxi, halógeno o trifluorometilo, y en particular fenilo.
Los ejemplos de grupos fenilo sustituidos como R son, p. ej., 4-clorofen-1-ilo, 3,4-diclorofen-1-ilo, 4-metoxifen-1-ilo, 4-metilfen-1-ilo, 4-aminometilfen-1-ilo, 4-metoxietilaminometilfen-1-ilo, 4-hidroxietilaminometilfen-1-ilo, 4-hidroxietil(metil)aminometilfen-1-ilo, 3-aminometilfen-1-ilo, 4-N-acetilaminometilfen-1-ilo, 4-aminofen-1-ilo, 3­ aminofen-1-ilo, 2-aminofen-1-ilo, 4-fenilfen-1-ilo, 4-(imidazol-1-il)fenilo, 4-(imidazol-1-ilmetil)fen-1-ilo, 4-(morfolin-1-il)fen-1-ilo, 4-(morfolin-1-ilmetil)fen-1-ilo, 4-(2-metoxietilaminometil)fen-1-ilo y 4-(pirrolidin-1-ilmetil)fen-1-ilo, 4-(tiofenil)fen-1-ilo, 4-(3-tiofenil)fen-1-ilo, 4-(4-metilpiperazin-1-il)fen-1-ilo, y 4-(piperidinil)fenilo y 4-(piridinil)fenilo opcionalmente sustituidos en el anillo heterocíclico.
“Arileno” se refiere a un grupo arilo, como se definió anteriormente, que enlaza al menos otros dos grupos. Los dos restos enlazados al arileno están enlazados a diferentes átomos del arileno. Los grupos arileno incluyen fenileno. “Arilenoxi” se refiere a un grupo arileno, como se definió anteriormente, en el que uno de los restos enlazados al arileno está enlazado a través de un átomo de oxígeno. Los grupos arilenoxi incluyen fenilenoxi.
“Heteroarilo” se refiere a una estructura de anillo aromático monocíclico o bicíclico o tricíclico fusionado que contiene 5 a 16 átomos en el anillo, donde de 1 a 4 de los átomos del anillo son cada uno un heteroátomo de N, O o S. Por ejemplo, heteroarilo incluye piridilo, indolilo, indazolilo, quinoxalinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzotienilo, benzofuranilo, furanilo, pirrolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, imidazolilo, tienilo o cualquier otro radical sustituido, especialmente mono- o disustituido, p. ej., por alquilo, nitro o halógeno. Piridilo representa 2-, 3- o 4-piridilo, ventajosamente 2- o 3-piridilo. Tienilo representa 2- o 3-tienilo. Quinolinilo representa preferiblemente 2-, 3- o 4-quinolinilo. Isoquinolinilo representa preferiblemente 1-, 3- o 4-isoquinolinilo. Benzopiranilo y benzotiopiranilo representan preferiblemente 3-benzopiranilo o 3-benzotiopiranilo, respectivamente. Tiazolilo representa preferiblemente 2- o 4-tiazolilo, y lo más preferido, 4-tiazolilo. El triazolilo es preferiblemente 1-, 2- o 5­ (1,2,4-triazolilo). El tetrazolilo es preferiblemente 5-tetrazolilo.
Preferiblemente, el heteroarilo es piridilo, indolilo, quinolinilo, pirrolilo, tiazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, imidazolilo, tienilo, furanilo, benzotiazolilo, benzofuranilo, isoquinolinilo, benzotienilo, oxazolilo, indazolilo o cualquiera de los radicales sustituidos, especialmente mono- o disustituidos.
Como se emplea en esta invención, el término “heteroalquilo” se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 3 heteroátomos tales como N, O y S. También pueden ser útiles heteroátomos adicionales, que incluyen B, Al, Si y P. Los heteroátomos también pueden estar oxidados, tal como -S(O)- y -S(O)2-. Por ejemplo, heteroalquilo puede incluir éteres, tioéteres, alquilaminas y alquiltioles.
Como se emplea en esta memoria, el término “heteroalquileno” se refiere a un grupo heteroalquilo, como se definió anteriormente, que enlaza al menos otros dos grupos. Los dos restos enlazados al heteroalquileno pueden estar enlazados al mismo átomo o a diferentes átomos del heteroalquileno.
“Electrófilo” se refiere a un ion, un átomo o una colección de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro electrófilo, es decir, un centro que busca electrones capaz de reaccionar con un nucleófilo. Un electrófilo (o reactivo electrófilo) es un reactivo que forma un enlace con su ligando (el nucleófilo) aceptando ambos electrones de unión de ese ligando.
Nucleófilo se refiere a un ion, un átomo o colección de átomos, que pueden ser iónicos, que tienen un centro nucleófilo, es decir, un centro que busca un centro electrófilo o capaz de reaccionar con un electrófilo. Un nucleófilo (o reactivo nucleófilo) es un reactivo que forma un enlace con su ligando (el electrófilo) donando ambos electrones de enlace. Un “grupo nucleófilo” se refiere a un nucleófilo después de que ha reaccionado con un grupo reactivo. Los ejemplos no limitantes incluyen amino, hidroxilo, alcoxi y haloalcoxi.
“Maleimido” se refiere a un grupo pirrol-2,5-diona-1-ilo que tiene la estructura:
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que, tras reacción con un sulfhidrilo (p. ej., un tioalquilo), forma un grupo -S-maleimido que tiene la estructura
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en la que “•” indica el punto de fijación para el grupo maleimido y “
3 >
” indica el punto de fijación del átomo de azufre del tiol al resto del grupo portador de sulfhidrilo original.
A efectos de esta descripción, los “aminoácidos de origen natural” encontrados en las proteínas y los polipéptidos son L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L-glutamina, ácido L-glutámico, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L -tirosina y/o L-valina. Los “aminoácidos de origen no natural” encontrados en las proteínas son cualquier aminoácido distinto de los mencionados como aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen no natural incluyen los isómeros D de los aminoácidos de origen natural y mezclas de isómeros D y L de los aminoácidos de origen natural. Otros aminoácidos, tales como 4-hidroxiprolina, desmosina, isodesmosina, 5-hidroxilisina, épsilon-N-metillisina, 3­ metilhistidina, aunque se encuentran en las proteínas de origen natural, se consideran aminoácidos de origen no natural encontrados en las proteínas a efectos de esta descripción, ya que generalmente se introducen por medios distintos de la traducción ribosómica de ARNm.
“Lineal”, en referencia a la geometría, arquitectura o estructura general de un polímero, se refiere a un polímero que tiene un único brazo polimérico.
“Ramificado”, en referencia a la geometría, arquitectura o estructura general de un polímero, se refiere a un polímero que tiene 2 o más “brazos” poliméricos que se prolongan desde una estructura central contenida en un iniciador. El iniciador se puede emplear en una reacción de polimerización por radicales de transferencia atómica (ATRP). Un polímero ramificado puede poseer 2 cadenas (brazos) poliméricas, 3 brazos poliméricos, 4 brazos poliméricos, 5 brazos poliméricos, 6 brazos poliméricos, 7 brazos poliméricos, 8 brazos poliméricos, 9 brazos poliméricos o más. Cada brazo polimérico se prolonga desde un punto de iniciación del polímero. Cada punto de iniciación del polímero puede ser un punto para el crecimiento de una cadena polimérica mediante la adición de monómeros. Por ejemplo, usando ATRP, el punto de iniciación del polímero en un iniciador es habitualmente un haluro orgánico que experimenta un proceso de oxidorreducción reversible catalizado por un compuesto de metal de transición tal como haluro cuproso. Preferiblemente, el haluro es un bromuro.
Composición “farmacéuticamente aceptable” o “composición farmacéutica” se refiere a una composición que comprende un compuesto de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable o excipientes farmacéuticamente aceptables.
“Excipiente farmacéuticamente aceptable” y “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refieren a un excipiente que se puede incluir en las composiciones descritas en esta invención y que no provoca ningún efecto toxicológico adverso significativo en el paciente y está aprobado o puede ser aprobado por la FDA para uso terapéutico, particularmente en seres humanos. Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen agua, NaCI, soluciones salinas normales, lactato de Ringer, sucrosa normal y glucosa normal.
Los conjugados se proporcionan preferiblemente en forma aislada. Aislado/a significa que una especie objetivo se ha separado al menos parcialmente de los contaminantes con los que está asociada naturalmente o que se usan en su fabricación, pero no excluye necesariamente la presencia de otros componentes destinados a actuar en combinación con una especie aislada, tal como un excipiente farmacéutico. Preferiblemente, un conjugado es la especie macromolecular predominante presente en una muestra (es decir, sobre una base molar en una composición) y habitualmente comprende al menos 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, un conjugado aislado comprende más de 80, 90, 95 o 99 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en una composición. Más preferiblemente, un conjugado se purifica hasta la homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en una composición mediante procedimientos de detección convencionales), de tal manera que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular. Los conjugados que tienen las mismas cadenas pesada y ligera se considera que son la misma especie, aunque puede haber variación en la glucosilación de los restos proteicos y variación en el número de monómeros en los restos poliméricos enlazados a diferentes moléculas del conjugado.
“Cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad de un agente funcional conjugado o de una composición farmacéutica útil para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección identificada, o para presentar un efecto terapéutico o inhibidor detectable. El efecto se puede detectar en un paciente individual con respecto a una medición de referencia antes del tratamiento o determinando una diferencia estadísticamente significativa en el resultado entre poblaciones tratadas y de control.
La “semivida biológica” de una sustancia es un parámetro farmacocinético que especifica el tiempo necesario para que la mitad de la sustancia se elimine de un organismo después de la introducción de la sustancia en el organismo. La identidad de secuencia se puede determinar alineando secuencias usando algoritmos, tales como BESTFIT, FASTA y TFASTA del paquete de software de Wisconsin Genetics versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, usando parámetros de hueco predeterminados o mediante inspección, y la mejor alineación (es decir, la que da como resultado el porcentaje de similitud de secuencia más alto en un intervalo de comparación). El porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando dos secuencias alineadas óptimamente en un intervalo de comparación, determinando el número de posiciones en las que se presentan residuos idénticos en ambas secuencias para generar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en el intervalo de comparación (es decir, el tamaño del intervalo) y multiplicando el resultado por 100 para generar el porcentaje de identidad de secuencia.
III. FACTOR VIII
El factor VIII de la coagulación (FVIII) circula en el plasma en una concentración muy baja y está unido de forma no covalente al factor de von Willebrand (FvW). Durante la hemostasia, el FVIII se separa del vWf y actúa como cofactor para la activación del factor X (FX) mediada por el factor IX activado (FIXa) mejorando la velocidad de activación en presencia de calcio y fosfolípidos o membranas celulares.
El FVIII se sintetiza como un precursor de cadena sencilla de aproximadamente 270-330 kDa con la estructura de dominio A1-A2-B-A3-C1-C2 (Fig. 2). Cuando se purifica a partir de plasma (p. ej., “obtenido de plasma” o “plasmático”), el FVIII está compuesto por una cadena pesada (A1-A2-B) y una cadena ligera (A3-C1-C2). La masa molecular de la cadena ligera es 80 kDa mientras que, debido a la proteólisis en el dominio B, la cadena pesada está en el intervalo de 90-220 kDa. Los dominios se delimitan en la SEQ ID NO: 1 como se indica a continuación, A1, residuos Ala 1-Arg 372; A2, residuos Ser 373-Arg 740; B, residuos Ser 741-Arg 1648; A3, residuos Ser 1690-Ile 2032; C1, residuos Arg 2033-Asn 2172 y C2, residuos Ser 2173-Tyr 2332. La secuencia restante, residuos Glu 1649-Arg 1689, se denomina normalmente péptido de activación de la cadena ligera del factor VIII. El factor VIII es activado proteolíticamente por la trombina o factor Xa, que lo disocia del factor de von Willebrand, lo que forma el factor VIIIa, que tiene función procoagulante. La función biológica del factor VIIIa es aumentar la eficiencia catalítica del factor IXa para la activación del factor X en varios órdenes de magnitud. El factor VIIIa activado por trombina es un A1/A2/A3-C1-C2 de 160 kDa. El Factor VIII maduro está fuertemente glucosilado y proteolizado y circula como un heterodímero que tiene una cadena pesada y una cadena ligera conectadas por iones metálicos. Las cadenas pesadas consisten en los dominios A1 y A2 de regiones relacionadas a nivel de secuencia y una región B conectora, que está fuertemente glucosilada. La cadena ligera consiste en los dominios A3, C1 y c2. En el plasma, el factor VIII circula como un complejo no covalente con el factor de Von Willebrand. Se ha encontrado que el dominio B no es necesario para la actividad de coagulación del factor VIII.
Se han diseñado diversos ensayos in vitro para determinar la posible eficacia del FVIII recombinante (rFVIII) como medicamento terapéutico. Estos ensayos imitan los efectos in vivo del FVIII endógeno.El tratamiento con trombina in vitro del FVIII da como resultado un aumento rápido y la reducción posterior de su actividad procoagulante, según se mide mediante ensayo in vitro. Esta activación e inactivación coincide con la proteólisis limitada específica tanto en las cadenas pesadas como en las ligeras, que alteran la disponibilidad de diferentes epítopos de unión en el FVIII, p. ej., permitiendo que el FVIII se disocie del VWF y se una a una superficie de fosfolípidos o alterando la capacidad de unión a ciertos anticuerpos monoclonales.
Se ha descrito la producción de Factor VIII recombinante mediante técnicas de ingeniería recombinante. Véanse, p. ej., las patentes de EE. UU. n.° 4,757,006, 5,733,873, 5,198,349, 5,250,421, 5,919,766 y la patente europea n.° 306 968. El gen para el Factor VIII está ubicado en la punta del brazo largo del cromosoma X. El gen del Factor VIII humano comprende 26 exones diseminados a lo largo de 186000 pb del ADN genómico y codifica una proteína de 2351 aminoácidos, que incluye una secuencia líder de 19 aminoácidos. El factor VIII es uno de los genes más grandes conocidos. La proteína de Factor VIII maduro es de 2332 aminoácidos (Swiss Prot P00451). La secuencia proteica del Factor VIII se expone en la Fig. 1. El FVIII se considera que es recombinante si se sintetiza como resultado de técnicas genéticas en lugar de ser aislado de una fuente natural, tal como plasma humano. El FVIII recombinante puede estar modificado o no en otros aspectos con respecto al FVIII obtenido de plasma (p. ej., mediante truncamiento o mutación). El FVIII está sometido a numerosos polimorfismos conocidos descritos en la base de datos Swiss Prot. Por tanto, por ejemplo, el residuo de ácido aspártico en la posición 56 puede ser opcionalmente valina. Similarmente, el ácido aspártico en la posición 1141 también puede ser ácido glutámico.
En esta invención, el término “Factor VIII” o “FVIII” se refiere a cualquier molécula de FVIII que presenta la actividad biológica, particularmente el favorecimiento de la coagulación sanguínea, que está asociada al FVIII natural. Se comercializan varios ensayos para determinar la actividad del FVIII (véase Chandler y col., Am J Clin Pathol 2003;120:34-39). El FVIII puede tener al menos una porción o la totalidad del dominio B (p. ej., al menos 100, 200, 500 o 900 residuos que incluyen al menos una cisteína conjugable a un polímero). Preferiblemente, la porción incluye las dos cisteínas más cercanas al extremo carboxilo del dominio B intacto (en las posiciones 1604 y 1636). La molécula de FVIII puede ser el Factor VIII de longitud completa (excepto que se pueda eliminar el péptido señal). La molécula de FVIII es una proteína que está codificada por secuencias de ADN capaces de hibridarse al ADN que codifica el Factor VIII:C en condiciones estrictas (p. ej., 52 °C, 50 % de formamida, 5 x SSC). Tal proteína puede contener eliminaciones de aminoácidos en diversos puntos entre, o dentro de, los dominios A1-A2-B-A3-C1-C2 (véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.° 4,868,112). La molécula de FVIII también puede ser un análogo del FVIII nativo donde se han sustituido uno o más residuos de aminoácidos mediante mutagénesis dirigida.
Las moléculas de FVIII pueden incluir la proteína de longitud completa, precursores de la proteína, subunidades o fragmentos biológicamente activos o funcionales de la proteína y derivados funcionales de la misma, así como variantes de la misma, como se describe más adelante. La referencia al FVIII está destinada a incluir todas las posibles formas de tales proteínas e incluye formas del FVIII que tienen al menos una porción o la totalidad de la secuencia del dominio B natural intacta y formas en las que el dominio B está ausente.
En esta invención se describen restos de FVIII que tienen diversas eliminaciones que también se pueden conjugar a los polímeros descritos en esta invención. Las moléculas de Factor VIII descritas en esta invención son el Factor FVIII con el dominio B truncado donde los dominios restantes tienen la secuencia como se expone en los aminoácidos n.° 1-740 y 1649-2332 de la SEQ ID NO: 1. Las moléculas de factor VIII descritas en esta invención son preferiblemente moléculas recombinantes producidas en células hospedadoras transformadas, preferiblemente de mamífero.
Sin embargo, los dominios restantes (es decir, los tres dominios A y los dos dominios C) pueden diferir ligeramente, p. ej., 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 % de la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 1-740 y 1649-2332). En particular, se pueden introducir modificaciones de aminoácidos (sustituciones, eliminaciones o inserciones) en los dominios restantes, p. ej., con el fin de modificar la capacidad de unión del Factor VIII con varios otros componentes tales como, p. ej., factor vW, LPR, diversos receptores, otros factores de coagulación, superficies celulares, etc. Asimismo, las moléculas de Factor VIII descritas en esta invención pueden comprender otras modificaciones postraduccionales en, p. ej., el dominio B truncado y/o en uno o más de los demás dominios de las moléculas. Estas otras modificaciones postraduccionales pueden ser en forma de diversas moléculas conjugadas a la molécula de Factor VIII descrita en esta invención tales como, p. ej., compuestos poliméricos, compuestos peptídicos y compuestos derivados de ácidos grasos.
Las moléculas de Factor VIII descritas en esta invención, independientemente de si están modificadas fuera del dominio B o no, tienen otras modificaciones postraduccionales o no, todas tienen actividad de Factor VIII, lo que significa la capacidad de actuar en la cascada de coagulación de una manera funcionalmente similar o equivalente al FVIII , inducen la formación de FXa a través de la interacción con el FIXa en una plaqueta activada y ayudan a la formación de un coágulo sanguíneo. La actividad se puede evaluar in vitro mediante técnicas bien conocidas en la técnica (p. ej., Chandler y col., arriba) tales como, p. ej., análisis de coágulos, análisis de potencial de trombina endógena, etc. Las moléculas de Factor VIII descritas en esta invención tienen una actividad de FVIII de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, y 100 % o incluso más de 100 % de la del FVIII humano natural.
El dominio B del factor VIII abarca los aminoácidos 741-1648 de la SEQ ID NO: 1. El dominio B se escinde en varios puntos diferentes, lo que genera una gran heterogeneidad en las moléculas de FVIII del plasma circulante. La función exacta del dominio B fuertemente glucosilado es desconocida. Pero el dominio es prescindible para la actividad del FVIII en la cascada de coagulación. Esta falta evidente de función está respaldada por el hecho de que el FVIII con el dominio B eliminado/truncado parece tener propiedades in vivo idénticas a las observadas para el FVIII natural de longitud completa. Dicho esto, hay indicios de que el dominio B puede reducir la asociación con la membrana celular, al menos en condiciones exentas de suero.
Molécula de Factor VIII con el dominio B truncado/eliminado: el FVIII endógeno de longitud completa se sintetiza como una molécula de precursor de cadena sencilla. Antes de la secreción, el precursor se escinde en la cadena pesada y la cadena ligera. El FVIII recombinante con el dominio B eliminado se puede producir a partir de dos estrategias diferentes. Indistintamente, la cadena pesada sin el dominio B y la cadena ligera se sintetizan individualmente como dos cadenas polipeptídicas diferentes (estrategia de dos cadenas) o el FVIII con el dominio B eliminado se sintetiza como una única cadena polipeptídica de precursor (estrategia de cadena única) que se escinde en las cadenas pesada y ligera de la misma manera que el precursor de FVIII de longitud completa.
En un polipéptido precursor del FVIII con el dominio B eliminado, los restos de la cadena pesada y ligera normalmente están separados por un enlazador. Para minimizar el riesgo de introducir epítopos inmunogénicos en el FVIII con el dominio B eliminado, la secuencia del enlazador se obtiene preferiblemente del dominio B del FVIII. El enlazador debe comprender un punto de reconocimiento para la proteasa que separa el polipéptido precursor del FVIII con el dominio B eliminado en la cadena pesada y ligera. En el dominio B del FVIII de longitud completa, los aminoácidos 1644-1648 constituyen este punto de reconocimiento. El punto de la trombina que conduce a la eliminación del enlazador en la activación del FVIII con el dominio B eliminado está ubicado en la cadena pesada. Por tanto, es improbable que el tamaño y la secuencia de aminoácidos del enlazador influyan en su eliminación de la molécula de FVIII restante por activación de la trombina. La eliminación del dominio B es una ventaja para la producción de FVIII. No obstante, se pueden incluir partes del dominio B en el enlazador sin reducir la productividad. El efecto negativo del dominio B sobre la productividad no se ha atribuido a ningún tamaño o secuencia específicos del dominio B.
Como se emplea en esta invención, el término “Factor VIII recombinante” (rFVIII) puede incluir cualquier rFVIII, heterólogo o de origen natural, obtenido mediante tecnología de ADN recombinante, o un derivado biológicamente activo del mismo. Como se emplea en esta memoria, el término abarca proteínas como se describieron anteriormente y ácidos nucleicos que codifican un rFVIII. Tales ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, genes, pre-ARNm, ARNm, variantes polimórficas, alelos, mutantes sintéticos y de origen natural. Las proteínas abarcadas por el término rFVIII incluyen, por ejemplo, las proteínas y los polipéptidos descritos anteriormente en esta invención, proteínas codificadas por un ácido nucleico descrito anteriormente, homólogos interespecíficos y otros polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene más de 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos, a lo largo de una región de al menos 100, 200, 300, 400 o más aminoácidos, con un polipéptido codificado por un ácido nucleico mencionado o una secuencia de aminoácidos descrita en esta invención. Preferiblemente, el factor VIII presenta al menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia completa de los dominios A1, A2, A3, C1 y C2.
Opcionalmente, la producción de rFVIII incluye cualquier procedimiento conocido en la técnica para (i) la producción de ADN recombinante mediante ingeniería genética, (ii) introducir ADN recombinante en células procariotas o eucariotas mediante, por ejemplo, transfección, electroporación o microinyección, (iii) cultivar dichas células transformadas, (iv) expresar rFVIII, p. ej., constitutivamente o tras inducción y (v) aislar dicho rFVIII, p. ej., del medio de cultivo o recogiendo las células transformadas, con el fin de (vi) obtener rFVIII purificado.
El rFVIII se puede producir mediante expresión en un sistema hospedador procariota o eucariota adecuado caracterizado por producir una molécula de rFVIII farmacológicamente aceptable. Los ejemplos de células eucariotas son células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hip y HepG2.
Se puede usar una amplia gama de vectores para la preparación del rFVIII y se seleccionan de entre vectores de expresión eucariotas y procariotas. Los ejemplos de vectores de expresión procariotas incluyen plásmidos tales como pRESET, pET y pAD, donde los promotores usados en los vectores de expresión procariotas incluyen uno o más de lac, trc, trp, recA o araBAD. Los ejemplos de vectores de expresión eucariotas incluyen: (i) para la expresión en levadura, vectores tales como pAO, pPIC, pYES o pMET, usando promotores tales como AOX1, GAP, GAL1 o AUG1; (ii) para la expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB o pBAC, usando promotores tales como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 o polh, y (iii) para la expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 o pBPV, y vectores obtenidos de, en un aspecto, sistemas víricos tales como virus de la vacuna de la viruela, virus adenoasociados, virus del herpes o retrovirus, usando promotores tales como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV y beta-actina.
Las moléculas de FVIII se pueden acoplar a polímeros, como se describe en esta invención, para otros agentes funcionales, lo que incluye proteínas. Por ejemplo, el polímero se puede conjugar a FVIII a través de grupos amino libres de la proteína usando ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS). Los reactivos que se dirigen a la conjugación a grupos amina pueden reaccionar aleatoriamente frente al grupo £-amina de las lisinas, el grupo a-amina de los aminoácidos del extremo amino y el grupo ó-amina de las histidinas. El FVIII de longitud completa tiene 158 lisinas, 2 extremos amino y 75 histidinas. Los conjugados se pueden formar usando uno o más de estos puntos. Sin embargo, se sabe que se necesita que el FVIII interactúe con múltiples ligandos, tales como el factor de von Willebrand (VWF), el factor de coagulación X (FX) y el factor IX activado (FIXa), para su actividad completa. La conjugación de polímeros a grupos amino libres, por tanto, podría afectar negativamente a la capacidad del FVIII conjugado para influir en la coagulación.
Opcionalmente, los polímeros se pueden acoplar a grupos SH libres usando cualquier química reactiva a tioles apropiada, lo que incluye química de la maleimida, o el acoplamiento de hidrazidas poliméricas o aminas poliméricas a restos de carbohidratos del FVIII después de la oxidación previa. Se prefiere particularmente el uso de acoplamiento de maleimida.
Opcionalmente, los polímeros se pueden acoplar a cualquier residuo de cisteína del FVIII usando acoplamiento de maleimida, siempre que se retenga la suficiente actividad biológica. Alternativamente, se puede usar cualquier resto de amina o carbohidrato adecuado del FVIII para el acoplamiento de los polímeros al FVIII, siempre que se retenga la suficiente actividad.
El FVIII tiene 4 cisteínas en el dominio B y 19 cisteínas en los demás dominios. De las 19 cisteínas del FVIII con el dominio B eliminado (BDD), 16 forman disulfuros y las otras 3 son cisteínas libres. El modelo estructural del BDD-FVIII sugiere que las 3 cisteínas libres no están expuestas y no serían accesibles para la reacción con un polímero (Baisan y col. 116 Blood 270-279 (2010)). Por tanto, los polímeros se fijan preferiblemente de forma covalente a los residuos de cisteína introducidos en el FVIII mediante mutagénesis dirigida (véase la Tabla 1 que se presenta a continuación para conocer los posibles puntos). Véase, p. ej., el documento EP 2363414A2.
Tabla 1. Variante i ín l FVIII r l n i n lím r iónicos dipolares
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Véase, p. ej., Mei, B., y col., (2012) Thrombosis and Hemostasis 116, 270-279.
Los polímeros se acoplan preferiblemente a residuos de cisteína de origen natural en el dominio B. Alternativamente, los residuos de cisteína se pueden añadir al dominio B mediante tecnología de ADN recombinante. El polímero se puede conjugar al rFVIII a través de un único residuo de cisteína, o a través de múltiples cisteínas. Preferiblemente, la una o más cisteínas están en el dominio B, preferiblemente cualquiera de las dos cisteínas más cercanas al extremo carboxilo del dominio B en las posiciones 1604 y 1636 de la SEQ ID NO: 1. (Si solo se usa una porción del dominio B, las dos cisteínas más cercanas al extremo carboxilo son las cisteínas del extremo carboxilo de la porción alineada con las dos cisteínas más cercanas al extremo carboxilo del dominio B intacto). La fijación de un polímero ramificado a través de una única cisteína en cualquier molécula determinada de rFVIII es ventajosa para rodear al rFVIII con polímero y carga iónica dipolar sin alteración sustancial, si es que la hay, de la actividad del rFVIIII. La única cisteína a través de la cual se conjuga el polímero puede ser igual o diferente en diferentes moléculas de rFVNN. Aunque no se requiere una comprensión del mecanismo para la puesta en práctica de la invención, se cree que la carga iónica dipolar en el polímero que rodea al rFVIII virtualmente inmoviliza una capa de moléculas de agua que, por consiguiente, se mueve en tándem con el rFVIII protegiéndolo de los procesos degradativos in vivo.
Una preparación de rFVIII es habitualmente homogénea debido al procesamiento proteolítico en diferentes puntos del dominio B, lo que da como resultado varias bandas de la cadena pesada en un gel. La conjugación de tal preparación de rFVIII a un polímero descrito en esta invención que da como resultado la polimerización a través de una de las dos cisteínas más cercanas al extremo carboxilo forma conjugados solo para moléculas de rFVIII en las que están presentes estas dos cisteínas terminales. Las moléculas de rFVIII en las que el dominio B está más truncado no forman conjugados en un grado significativo. La especificidad de la conjugación a una única forma del dominio B se demuestra comparando las bandas en un gel antes y después de la conjugación y observando la pérdida o reducción sustancial de solo una de las bandas anteriores a la conjugación. El rFVIII conjugado se puede separar fácilmente de las moléculas de rFVIII no conjugadas debido a la gran diferencia en el peso molecular. Por consiguiente, una preparación de rFVIII conjugado puede tener una homogeneidad muy superior a una preparación típica de rFVIII. Por ejemplo, al menos 80, 90, 95 o 99 % de las moléculas en una preparación pueden tener la misma porción del dominio B, por ejemplo, un dominio B intacto y un único polímero (preferiblemente ramificado) fijado por molécula (aunque puede haber diferencias de glucosilación entre proteínas diferentes y diferencias de longitud entre polímeros diferentes). En algunas preparaciones, la porción es al menos los residuos 1-1604 o 1-1636 o 1-1648 de la SEQ ID NO: 1. En algunas preparaciones, las porciones consisten en los residuos 1-1648 de la SEQ ID NO: 1.
El dominio B de un conjugado que incluye el polímero enlazado a él se puede escindir después de la administración a un sujeto mediante el proceso de activación del FVIII endógeno. Sin embargo, el polímero conjugado sigue cumpliendo la función de prolongar la semivida del FVIII enlazado hasta que se presenta una necesidad de actividad. Asimismo, la pérdida de polímero en el curso de la activación tiene la ventaja de que el FVIII se puede degradar más rápidamente (en comparación con el FVIII conjugado de otra manera que no sea a través del dominio B) después de que se ha producido la activación. Por esta razón, el rFVIII conjugado a través del dominio B es ventajoso para la profilaxis en sujetos que tienen hemofilia, pero que se sabe que no experimentan hemorragia (interna o externa) en el momento de la administración. La conjugación al polímero facilita la persistencia del conjugado hasta el momento en que se puede determinar que el sujeto está sufriendo un episodio de hemorragia.
En este momento, el dominio B y el polímero asociado se pueden procesar a partir del rFVIII, y el rFVIII restante puede facilitar la coagulación y, posteriormente, ser inactivado.
La conjugación de rFVIII a un polímero según los presentes procedimientos aumenta la semivida in vivo del rFVIII en seres humanos por encima de 11 horas. Por ejemplo, la semivida puede ser de 12-50 horas. Preferiblemente, la semivida es 20 horas o más larga. Las semividas se miden como medias en una población de sujetos humanos exentos de respuesta anterior de anticuerpos contra el FVIII humano. Tal ser humano puede tener, pero no es necesario que tenga, hemofilia a efectos de determinar la semivida.
En lo que respecta a las cisteínas de origen natural en el dominio B, un dominio B intacto no es esencial para la actividad del FVIII. El dominio B del FVIII comienza en el aminoácido 745 y continúa hasta el aminoácido 1648. El dominio B tiene 4 residuos de cisteína de origen natural: 1293, 1373, 1604 y 1636. Se prefiere el acoplamiento en uno o más de estos residuos. Se prefiere particularmente el acoplamiento de los polímeros de la presente invención a los residuos 1604 y 1636.
Los conjugados de los polímeros de alto PM y FVIII se describen en esta invención. Se presentan conjugados preferidos en los que el FVIII está acoplado a un polímero iónico dipolar donde el polímero está compuesto por una o más unidades monoméricas y donde al menos una unidad monomérica tiene un grupo iónico dipolar. Preferiblemente, el grupo iónico dipolar es fosforilcolina.
Preferiblemente, una de las unidades monoméricas es fosfato de 2-(acriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo) o fosfato de 2-(metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo) (HEMA-PC). Preferiblemente, el polímero se sintetiza a partir de un único monómero que es preferiblemente fosfato de 2-(acriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo) o fosfato de 2-(metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo).
El FVIII o el conjugado pueden ser un FVIII recombinante (rFVIII). El rFVIII puede ser de longitud completa. El rFVIII se puede purificar a partir de una célula hospedadora de mamífero. El FVIII puede comprender una eliminación de parte o la totalidad del dominio B.
Se prefiere que los conjugados de FVIII tengan 2 o más, preferiblemente 3 o más, brazos poliméricos donde el monómero es HEMA-PC. Se prefiere que los conjugados tengan 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 brazos poliméricos donde el monómero es HEMA-PC. Más preferiblemente, los conjugados tienen 3, 6 o 9 brazos. Lo más preferiblemente, el conjugado tiene 9 brazos.
Se prefiere que los conjugados de polímero-FVIII tengan una porción polimérica con un peso molecular de entre 100 000 y 1500000 Daltons. Más preferiblemente, el conjugado tiene una porción polimérica con un peso molecular entre 500 000 y 1000 000 Daltons. Aún más preferiblemente, el conjugado tiene una porción polimérica con un peso molecular entre 600000 y 800000 Daltons. Lo más preferiblemente, el conjugado tiene una porción polimérica con un peso molecular entre 600000 y 850000 Daltons y tiene 9 brazos. Aquí y en alguna otra parte de esta solicitud, el peso molecular total del polímero que incluye el FVIII es en intervalos de 300000 Daltons superior a los proporcionados para la porción polimérica.
Se describen procedimientos para sintetizar un conjugado de polímero iónico dipolar-agente funcional, teniendo el conjugado uno o más agentes funcionales y uno o más brazos poliméricos, donde cada uno de los brazos poliméricos tiene uno o más tipos de monómero donde al menos uno de los tipos tiene un ion dipolar. El procedimiento puede tener las etapas de
a. combinar un iniciador que comprende uno o más restos de iniciador de la síntesis de polímero y un primer grupo reactivo con uno o más tipos de monómero adecuados para la polimerización donde al menos uno de dichos tipos de monómero comprende un ion dipolar; donde dichos tipos de monómero reaccionan para formar uno o más polímeros en el uno o más restos de iniciador de la síntesis de polímero para proporcionar un iniciador polimerizado; b. acoplar un resto de enlazador que comprende un segundo y tercer grupos reactivos al iniciador polimerizado para proporcionar un enlazador-iniciador polimerizado que tiene un grupo reactivo que no ha reaccionado; c. acoplar uno o más agentes funcionales al grupo reactivo que no ha reaccionado del enlazador-iniciador polimerizado para proporcionar el conjugado de polímero-agente funcional.
Antes de la presente invención, la molécula o entidad de iniciador tenía que contener un grupo funcional desprotegible que permitiera el acoplamiento del agente funcional. Un ejemplo de tal iniciador que tiene una maleimida protegida se presenta a continuación:
Figure imgf000015_0001
Después de la síntesis de polímero, la maleimida protegida se desprotege con calor para permitir la generación de maleimida que se podría usar para acoplar el agente funcional. Si se quisiera modificar la naturaleza de la entidad química entre la maleimida y el punto de iniciación del polímero, se tendría que sintetizar un iniciador completamente nuevo.
Teniendo en cuenta la posible realización a mayor escala del procedimiento de síntesis de polímero, cada vez que se cambia o altera el iniciador de alguna manera, se debe desarrollar un nuevo procedimiento de síntesis a mayor escala. Cada cambio en la naturaleza de la molécula de iniciador puede tener una amplia gama de efectos sobre la síntesis de polímero. Sin embargo, según la presente invención, se puede usar un único resto de iniciador para la preparación de polímero a gran escala. Por tanto, se pueden desarrollar condiciones para realizar la síntesis óptima de polímero a mayor escala. Usando la invención actualmente reivindicada, tal polímero se puede adaptar a continuación a diversos tipos de agentes funcionales “insertando” diversos tipos de enlazadores.
Por ejemplo, si se desea conjugar un agente funcional más grande a un polímero de la presente invención, tal como un anticuerpo o incluso un fragmento Fab, se puede insertar una secuencia de enlazador más larga en el polímero. Por el contrario, los agentes funcionales más pequeños pueden requerir secuencias de enlazador relativamente más cortas.
En realizaciones preferidas de los procedimientos, el iniciador tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 puntos para la iniciación del polímero. Preferiblemente, el iniciador tiene 3, 6 o 9 puntos para la iniciación del polímero.
Los restos de iniciador para la síntesis de polímero tienen preferiblemente la estructura siguiente:
Figure imgf000016_0001
donde X es una NCS o un halógeno que permite el inicio de la ATRP o esquemas de síntesis del polímero relacionados y R es el resto del iniciador.
El iniciador tiene la estructura:
R1—R2-(-R3)s
donde R1 tiene un grupo reactivo nucleófilo, R2 comprende un enlazador, R3 es un resto de iniciador de la síntesis de polímero y s es un número entero entre 1 y 20. R1 se selecciona del grupo que consiste en NH2-, OH- y SH. Más preferiblemente, R1 es NH2-.
Más preferiblemente, R2 comprende una estructura que tiene la fórmula:
Figure imgf000016_0002
donde m es 1 a 20. m es preferiblemente 4
Según la presente invención, R3 tiene la fórmula siguiente
R4
------------R5
R6
donde R4, R5 y R6 son iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en
Figure imgf000017_0003
donde X es NCS, F, Cl, Br o I. Preferiblemente X es Br.
En aspectos más preferidos de la presente invención, R4, R5 y R6 son cada uno
Figure imgf000017_0001
Alternativamente, R4, R5 y R6 son cada uno
Figure imgf000017_0002
En otras realizaciones preferidas, R4, R5 y R6 son cada uno
Figure imgf000018_0001
Según este aspecto de la presente invención, el monómero se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en
Figure imgf000018_0002
donde R7 es H o alquilo C1-6, ZW es un ion dipolar y t es 1 a 6. Preferiblemente, el ion dipolar es fosforilcolina.
Aún más preferiblemente, el monómero se selecciona del grupo que consiste en fosfato de 2-(metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo) (HEMA-PC) y fosfato de 2-(acriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo). Lo más preferiblemente, el monómero es fosfato de 2-(metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo).
Según un aspecto de la presente invención, el resto de enlazador de la etapa d es preferiblemente un éster activado que tiene la estructura
Figure imgf000018_0003
donde R8 se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000018_0004
y R9 se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000018_0005
Figure imgf000019_0002
donde p es 1 a 12.
Preferiblemente, el resto de enlazador es
Figure imgf000019_0001
Según un aspecto de la presente invención, el iniciador de la etapa a tiene preferiblemente la estructura siguiente:
Figure imgf000020_0001
donde y es un número entero de 1 a 50, X es un número entero de 0 a 50 y Z es NCS, F, Cl, Br o I. Preferiblemente, Z es Br, X es 4, 8 o 12 e Y es 1 a 10. Más preferiblemente, Y es 4.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se presenta un enlazador-iniciador polimerizado que tiene la fórmula:
Figure imgf000021_0001
donde X es un numero entero de 1 a 50, Y es un numero entero de 1 a 50 y el polímero es cualquier polímero sintetizado con un monómero seleccionado del grupo que consiste en
Figure imgf000021_0002
donde R7 es H o alquilo C1-6, ZW es un ion dipolar y t es 1 a 6. Más preferiblemente Y es 4, X es 4, 8 o 12 y el monómero es HEMA-pc.
Preferiblemente, el agente funcional es una proteína. Más preferiblemente, la proteína comprende FVIII humano. Aún más preferiblemente, el FVIII es un FVIII recombinante (rFVIII) que está purificado preferiblemente a partir de una célula hospedadora humana. Lo más preferiblemente, el FVIII tiene una eliminación de parte o la totalidad del dominio B.
En esta invención se describe un compuesto que tiene la fórmula:
Figure imgf000022_0001
donde y es un número entero de 1 a 50, X es un número entero de 0 a 50 y Z es NCS, F, Cl, Br o I. Preferiblemente, Z es Br, X es 4, 8 o 12 e Y es 1 a 10. Más preferiblemente, Y es 4.
Según otro aspecto de la presente invención, se presenta un polímero que tiene la fórmula:
Figure imgf000023_0001
donde y es un número entero de 1 a 50, X es un número entero de 0 a 50 y MPC es un brazo de poliMPC. El poliMPC se prepara usando fosfato de 2-(metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo) en una reacción de polimerización, p. ej., ATRP. Preferiblemente, el peso molecular total del polímero es 500000 a 1000000 Daltons. Más preferiblemente, el peso molecular total del polímero es 650000 a 850000 Daltons. Aún más preferiblemente, el peso molecular total del polímero es 750000 Daltons.
Según este aspecto de la presente invención, X es preferiblemente 4, 8 o 12 e Y es 1 a 10. Aún más preferiblemente, Y es 4.
Se usará tal iniciador,según la presente invención, como sustrato para la síntesis de polímero. Preferiblemente, la síntesis de polímero se realiza usando ATRP o un procedimiento similar, tal como generado mediante AGET (Woodworth y col., Macromolecules, Vol. 31, n.° 23, 1998) o ARGET (Macromolecules, 2012, 45 (16), páginas 6371­ 6379 (Simakova, A. y col.)). Se puede usar cualquiera de los monómeros descritos en esta invención para la síntesis de polímero.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración oral se pueden presentar como unidades discretas, tales como cápsulas, como soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos o no acuosos; o como espumas o batidos comestibles; o como emulsiones). Los excipientes adecuados para comprimidos o cápsulas de gelatina dura incluyen lactosa, almidón de maíz o derivados del mismo, ácido esteárico o sales del mismo. Los excipientes adecuados para uso con cápsulas de gelatina blanda incluyen, por ejemplo, aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos o líquidos, etc. Para la preparación de soluciones y jarabes, los excipientes que se pueden usar incluyen, por ejemplo, agua, polioles y azúcares. Para la preparación de suspensiones, se pueden usar aceites (p. ej., aceites vegetales) para proporcionar suspensiones de aceite en agua o agua en aceite.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal donde el vehículo es un sólido incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 micrómetros, que se administra de la manera en la que se realiza una inhalación, es decir, mediante inhalación rápida a través de las fosas nasales desde un recipiente con el polvo sostenido cerca de la nariz Las composiciones adecuadas donde el vehículo es un líquido, para administración como un pulverizador nasal o como gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del principio activo. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración por inhalación incluyen polvos o nieblas de partículas finas que se pueden generar por medio de diversos tipos de aerosoles dosificadores presurizados, nebulizadores o insufladores.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea sustancialmente isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Los excipientes que se pueden usar para soluciones inyectables incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar en un estado liofilizado (deshidratado por congelación) que solo requiere la adición del líquido estéril suministrado, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles. Las composiciones farmacéuticas pueden ser sustancialmente isotónicas, lo que implica una osmolalidad de 250-350 mOsm/kg de agua. En general, las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, odorizantes, sales (las sustancias descritas en esta invención se pueden proporcionar ellas mismas en forma de una sal farmacéuticamente aceptable), tampones, agentes de recubrimiento o antioxidantes. También pueden contener agentes terapéuticamente activos además de la sustancia descrita en esta invención. Las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden emplear en combinación con diluyentes, aditivos o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales excipientes pueden incluir solución salina, solución salina tamponada (tal como solución salina tamponada con fosfato), dextrosa, liposomas, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera efectiva y conveniente para tratar la enfermedad de un paciente, lo que incluye, por ejemplo, la administración por vía oral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraósea o intranasal, entre otras. En terapia, o como profiláctico, el agente activo se puede administrar a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.
Para la administración a mamíferos, y particularmente seres humanos, cabe esperar que la dosis diaria del agente activo sea de 0,01 mg/kg de peso corporal, habitualmente alrededor de 1 mg/kg. En cualquier caso, el médico determinará la dosis real que será más adecuada para un individuo, que será dependiente de factores que incluyen la edad, peso, sexo y respuesta del individuo. Las dosis anteriores son ejemplares del caso promedio. Evidentemente, puede haber casos en los que se necesiten dosis superiores o inferiores.
Las dosis de la sustancia descrita en esta invención pueden oscilar entre límites amplios, en función de la enfermedad o trastorno que se va a tratar, la edad y estado del individuo que se va a tratar, etc., y un médico determinará en última instancia las dosis apropiadas que se deben usar.
Esta dosis se puede repetir con tanta frecuencia como sea necesaria. Si se desarrollan efectos secundarios, se puede reducir la cantidad y/o frecuencia de la dosis según el protocolo diagnóstico-terapéutico habitual. Preferiblemente, la composición farmacéutica se puede administrar una vez cada uno a treinta días.
Como se describe en esta invención, se proporciona una composición farmacéutica como se describe en esta invención y otro agente farmacéuticamente activo. El otro agente farmacéuticamente activo puede favorecer o mejorar la actividad del FVIII, por ejemplo, otro factor de la coagulación sanguínea.
Las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden emplear solas o en combinación con otros compuestos, tales como compuestos o moléculas terapéuticos, p. ej., fármacos antinflamatorios, analgésicos o antibióticos. Tal administración con otros compuestos puede ser simultánea, independiente o secuencial. Los componentes se pueden preparar en forma de un kit que puede comprender instrucciones, si procede.
Preferiblemente, la composición farmacéutica descrita en esta invención y el otro compuesto terapéutico se administran directamente a un paciente con necesidad de los mismos.
También se describe en esta invención un kit de partes que comprende una composición farmacéutica como se describe en esta invención y un vehículo de administración que incluye cápsulas para administración oral, inhaladores para administración pulmonar y soluciones inyectables para administración intravenosa.
Las enfermedades de la coagulación sanguínea se pueden caracterizar por una pérdida de la función de un factor de la coagulación sanguínea o por la generación de autoanticuerpos. Los ejemplos de enfermedades de la coagulación sanguínea incluyen la hemofilia A y la hemofilia A adquirida.
Los grupos nucleófilos sobre proteínas, lo que incluye los anticuerpos, que se pueden usar para conjugar un polímero descrito en esta invención incluyen (i) grupos amina del extremo amino, (ii) grupos amina de la cadena lateral, p. ej., lisina, (iii) grupos tiol de la cadena lateral, p. ej., cisteína y (iv) grupos hidroxilo o amino de azúcares cuando la proteína está glucosilada. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos sobre restos de enlazador y reactivos de enlazador fijados al polímero que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehído, cetona, carboxilo y maleimida. Muchas proteínas, lo que incluye los anticuerpos, tienen grupos tiol de cisteína que se pueden usar posiblemente para la conjugación. Muchos residuos de cisteína están en forma de disulfuros intercadena reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los residuos de cisteína en forma de disulfuros generalmente no están disponibles para reaccionar con reactivos tales como la maleimida. Los residuos de cisteína también pueden estar libres o desapareados. Sin embargo, los residuos de cisteína libres se encuentran frecuentemente “protegidos” por uno o más reactivos en diversos medios y tampoco están disponibles para la conjugación. Los residuos de cisteína se pueden hacer reactivos para la conjugación con reactivos de enlazador, tales como maleimida, mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol) o tricarboniletilfosfina (TCEP), de tal manera que la proteína se reduce total o parcialmente. Por tanto, cada puente de cisteína formará, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. En el caso de la cisteína libre, se forma un nucleófilo de tiol mediante reducción. En función de las condiciones empleadas, la reducción mediante TCEP o DTT puede dar como resultado la pérdida del plegamiento proteico adecuado con pérdida simultánea de actividad. Sin embargo, la actividad se puede recuperar permitiendo el replegamiento proteico en las condiciones apropiadas.
Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en anticuerpos mediante modificación de residuos de lisina, p. ej., haciendo reaccionar residuos de lisina con 2-iminotiolano (reactivo de Traut), lo que da como resultado la conversión de una amina en un tiol. Se pueden introducir grupos tiol reactivos en una proteína introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (p. ej., preparando una variante que comprende uno o más residuos aminoacídicos de cisteína no naturales).
IV. EJEMPLOS
Síntesis de iniciadores
Ejemplo 1. Preparación del iniciador “insertable” de 3 brazos
Se sintetizó un iniciador de sal de TFA/amina (Compuesto B) que tiene la estructura siguiente como se indica a continuación.
Figure imgf000025_0001
Primero, se preparó un iniciador de 3 brazos protegido con BOC, Compuesto A, que tiene la estructura siguiente:
Figure imgf000026_0001
como se indica a continuación: en un matraz de fondo redondo de 25 mL, en nitrógeno, se colocó 2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etilcarbamato de tere-butilo (66 mg, 0,26 mmol, 1,2 equiv) y ácido (2,2,2-tri(2-bromo-2-metilpropioniloximetil)etoxi)acético (preparado como se describe en el documento PCT/US2012/060301 para el Producto 4.5, que se incorpora en esta invención por referencia) (142 mg, 0,22 mmol, 1,0 equiv), seguido de N,N-dimetilformamida (2 mL) y a continuación N,N-diisopropiletilamina (0,19 mL, 1,1 mmol, 5,0 equiv). El matraz se enfrió a 0 °C usando un baño de hielo. A esto se añadió solución de anhídrido propilfosfónico (50 % en peso en acetato de etilo, 0,16 mL, 0,26 mmol, 1,2 equiv) a lo largo de 1 minuto. La reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1,5 horas. La reacción se enfrió rápidamente añadiendo agua, a continuación se repartió usando agua y acetato de etilo. Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se extrajo la capa acuosa con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua, bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua, ácido cítrico acuoso 0,5 M, agua, a continuación se secaron (sulfato de sodio), se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se aplicó a una columna de gel de sílice (60 mL) y se eluyó con 70 % de acetato de etilo con 30 % de hexanos. Los tubos que contenían producto se agruparon y se concentraron al vacío, lo que dio como resultado 150 mg (0,17 mmol, 77 %) de Compuesto A.
RMN 1H (400 MHz CDCl3): ó = necesidad de presentar datos 1,44 (s, 9H, OCCH3), 1,96 (s, 18H, CC(CH3)2Br), 3,31 (q, J = 4,8 Hz, 2H, OCNHCH2CH2O), 3,5-3,6 (m, 12H), 3,99 (s, 2H, OCH2C), 4,32 (s, 6H, CCH2OC=O), 5,0 (br s, 1H, CH2NHC=OO), 6,8 (br s, 1H, CH2NHC=OC), CL-EM (ES, m/z): [M+H]+ calc. para C30H51Br3N2O12+H = 871,1; encontrado 871,8.
El Compuesto A se desprotegió para producir Compuesto B como se indica a continuación: en un matraz de fondo redondo de 20 mL, en nitrógeno, se añadió Compuesto A (120 mg, 0,14 mmol, 1 equiv) y diclorometano (2 mL), seguido de ácido trifluoroacético (2 mL, 26,9 mmol, 192 equiv). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se diluyó usando hexanos diclorometano (20 mL) y se concentró al vacío. La reacción se diluyó usando hexanos (50 mL) y se concentró al vacío (dos veces), lo que dio como resultado 2,2 g (2,73 mmol, (con diclorometano residual)) de Compuesto B.
RMN 1H (400 MHz CDCl3): ó = 1,94 (s, 18H, CC(CH3)2Br), 3,2 (br, 2H, OCNHCH2CH2O), 3,5-3,8 (m, 12H), 3,99 (s, 2H, OCH2C), 4,34 (s, 6H, CCH2OC=O), 7,11 (br t, 1H, CH2NHC=O), 7,99 (br, 3H, NH3+).
CL-EM (ES, m/z): [M+H]+ calc. para C25H43Br3N2O10+H = 771,1; encontrado 771,6.
Ejemplo 2. Preparación de iniciador “insertable” de 6 brazos
Se sintetizó un iniciador de sal de TFA/amina (Compuesto F1) que tiene la estructura siguiente como se indica a continuación.
Figure imgf000027_0001
Como primera etapa para preparar F1, se sintetizó Compuesto C, que tiene la estructura siguiente:
Figure imgf000027_0002
en un matraz de fondo redondo de 100 mL, en nitrógeno y usando un condensador de reflujo, se añadió 1 -tosil-11 -(3,4,7-triaza-4,6,10-trifeniladamantan-1-ilmetoxi)-3,6,9-trioxaundecano (preparado como se describe en el documento PCT/US2012/060301 para el Producto 2.2) (4,0 g, 5,5 mmol, 1,0 equiv), imidodicarbonato de di(terc-butilo) (1,43 g, 6,6 mmol, 1,2 equiv), carbonato de potasio (1,9 g, 13,7 mmol, 2,5 equiv) y yoduro de potasio (0,137 g, 0,82 mmol, 0,15 equiv), seguido de acetonitrilo (25 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos, seguido de agitación a 60 °C durante 30 horas. La reacción se enfrió rápidamente añadiendo agua (25 mL) y metil terc-butil éter (125 mL). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se extrajo con metil terc-butil éter (75 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con cloruro de sodio acuoso saturado (20 mL), a continuación se secaron (sulfato de sodio), se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se aplicó a una columna de gel de sílice (195 g, 6,5 cm x 12 cm) y se eluyó con 20 % de metil terc-butil éter en 80 % de hexanos hasta 100 % de metil terc-butil éter. Los tubos que contenían producto se agruparon y se concentraron al vacío, lo que dio como resultado 3,7 g (4,79 mmol, 87 %) de Compuesto C.
RMN 1H (400 MHz DMSO-d6): 5 = 1,42 (s, 18H, C[C(CH3)312). 2,72 (s, 2H, CCH2N, isómero), 2,88 (s, 2H, CCH2N, isómero), 3,2-3,6 (m, 20H), 5,25 (s, 2H, NCHPh, isómero), 5,70 (s, 1H, NCHPh, isómero), 7,3-7,8 (m, 15H, fenilo).
A continuación, se sintetizó Compuesto D que tiene la estructura siguiente:
Figure imgf000027_0003
en un matraz de fondo redondo de 500 mL, en nitrógeno y usando un condensador de reflujo, se añadió Compuesto C (2,7 g, 3,49 mmol, 1,0 equiv), hidróxido de litio monohidratado (0,73 g, 17,5 mmol, 5 equiv), tetrahidrofurano (20 mL) y metanol (8 mL), seguido de agua (8 mL). La reacción se agitó a 60 °C durante 6 horas. La reacción se concentró al vacío y a continuación se repartió añadiendo agua (75 mL) y acetato de etilo (100 mL). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se extrajo acuosa con acetato de etilo (50 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con cloruro de sodio acuoso saturado (30 mL), a continuación se secaron (sulfato de sodio), se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se aplicó a una columna de gel de sílice (110 g, 5,5 cm x 10,5 cm) y se eluyó con 50 % de hexanos en 50 % de metil terc-butil éter hasta 100 % de metil terc-butil éter. Los tubos que contenían producto se agruparon y se concentraron al vacío, lo que dio como resultado 1,38 g (2,05 mmol, 59 %) de Compuesto D.
RMN 1H (400 MHz DMSO-d6): 6 = 1,36 (s, 9H, C[C(CH3)312), 2,72 (s, 2H, CCH2N, isómero), 2,88 (s, 2H, CCH2N, isómero), 3,1-3,4 (m, 20H), 5,25 (s, 2H, NCHPh (isómero)), 5,70 (s, 1H, NCHPh (isómero)), 6,73 (t, J = 6,0 Hz, 1H, O=CNHCH2), 7,3-7,7 (m, 15H, fenilo).
La etapa siguiente para preparar F1 fue la síntesis de Compuesto E que tiene la estructura siguiente:
Figure imgf000028_0001
Compuesto E
en un matraz de fondo redondo de 100 mL se añadió Compuesto D (2,96 g, 4,4 mmol, 1,0 equiv) y dietil éter (20 mL), seguido de agua (16 mL). El matraz se enfrió a 0 °C usando un baño de hielo. A esto, se añadió solución de ácido bromhídrico (48 % en peso en agua) (1,64 mL, 14,5 mmol, 3,3 equiv). La reacción se agitó a 0 °C rápidamente durante 1 hora. Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se devolvió al matraz de reacción a 0 °C, donde se añadió dietil éter (20 mL) y la agitación continuó durante 15 minutos. Se separó de nuevo la capa orgánica y la capa acuosa se devolvió al matraz de reacción a 0 °C, donde se añadió dietil éter (20 mL) y la agitación continuó durante 10 minutos. Se separó la capa orgánica y se ajustó el pH de la capa acuosa a 4,5 mediante adición de hidróxido de sodio acuoso 1 M. El agua se retiró mediante destilación azeotrópica con acetonitrilo al vacío, lo que dio como resultado 2,5 g (3,85 mmol, 87 %) de Compuesto E como un sólido blanco.
RMN 1H (400 MHz DMSO-d6): 6 = 1,36 (s, 9H, OC(CH3)3), 3,05-3,58 (m, 24H, CH2), 6,8 (t, 1H, O=CNHCH2), 8,0 (br s, 9H, CH2NH2*HBr).
CL-EM (ES, m/z): [M+H]+ calc. para C18H40N4O6+H = 409,3; encontrado 409,6.
La siguiente etapa para preparar Compuesto F1 fue la síntesis de Compuesto F, que tiene la estructura siguiente:
Figure imgf000028_0002
en un matraz de fondo redondo de 200 mL, en nitrógeno, se colocó ácido bis-2,2-[(2-bromoisobutiril)hidroximetil]propiónico (preparado como se describe en el ejemplo 7 de la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 13/641,342, que se incorpora en esta invención por referencia) (2,32 g, 5,37 mmol, 3,3 equiv) y Compuesto E (1,06 g, 1,63 mmol, 1,0 equiv), seguido de dimetilformamida (15 mL) y a continuación diisopropiletilamina (3,4 mL, 19,5 mmol, 12 equiv). A esto se añadió solución de anhídrido propilfosfónico (50 % en peso en acetato de etilo, 3,7 mL, 5,87 mmol, 3,5 equiv). La reacción se agitó durante 60 minutos. La reacción se enfrió rápidamente añadiendo agua (1 mL) y se cargó en una columna de CLAR preparativa y se eluyó con 50 % de acetonitrilo en agua (con 0,1 % de ácido trifluoroacético) hasta 95 % de acetonitrilo (con 0,1 % de ácido trifluoroacético). Los tubos que contenían producto se agruparon, se concentraron al vacío, se congelaron y se colocaron en un liofilizador. Esto dio como resultado 640 mg (0,39 mmol, 24 %) de Compuesto F.
Por último, se retiró el grupo protector tBOC para proporcionar el iniciador final, F1, que tiene la estructura mostrada anteriormente. En un matraz de fondo redondo de 50 mL se añadió Producto 174-44 (600 mg, 0,36 mmol) y diclorometano (3,6 mL). El matraz se enfrió a 0 °C usando un baño de hielo. A esto se añadió ácido trifluoroacético (3,6 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos. La reacción se diluyó con hexanos y a continuación se concentró al vacío. La reacción se diluyó usando hexanos y se concentró al vacío. El residuo se disolvió usando acetonitrilo (3 mL), se diluyó con agua (1,5 mL), se congeló y se colocó en un liofilizador. Esto dio como resultado 537 mg (0,32 mmol, 89 %) de Compuesto F1 como un aceite.
Ejemplo 3. Preparación de Compuesto iniciador L “insertable” de 9 brazos
Se sintetizó un iniciador de sal de TFA/amina (Compuesto L) que tiene la estructura siguiente como se indica a continuación.
Figure imgf000029_0001
Primero, se sintetizó Compuesto K, que tiene la estructura siguiente:
Figure imgf000030_0001
en un matraz de fondo redondo de 200 mL, en nitrógeno, se colocó Compuesto J (1,9 g, 2,67 mmol, 3,3 equiv)
Figure imgf000030_0002
y Compuesto E (0,525 g, 0,81 mmol, 1,0 equiv) (véase arriba), seguido de dimetilformamida (10 mL) y a continuación diisopropiletilamina (2,5 mL, 14,6 mmol, 18 equiv). El matraz se enfrió a 0 °C usando un baño de hielo. A esto se añadió solución de anhídrido propilfosfónico (50 % en peso en acetato de etilo, 2,5 mL, 4,04 mmol, 5 equiv) a lo largo de ~6 minutos.
La reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 15 minutos. La reacción se enfrió rápidamente añadiendo agua (20 mL), bicarbonato de sodio acuoso saturado (20 mL) y acetato de etilo (100 mL). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se extrajo acuosa con acetato de etilo (75 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio acuoso saturado (30 mL), ácido cítrico acuoso 0,5 M (40 mL), agua (25 mL) y cloruro de sodio acuoso saturado (40 mL), a continuación se secaron (sulfato de sodio), se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo, que se usó sin purificación adicional, dio como resultado 2,0 g (0,80 mmol, 99 %) de Compuesto K.
RMN 1H (400 MHz DMSO-d6): ó = 1,36 (s, 9H, OCCH3), 1,90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2,31 (t, J = 7,2 Hz, 6H, CCH2CH2NH), 2,98 (d, J = 5,6 Hz, 6H, CCH2NH), 3,04 (q, J = 6,0 Hz, 2H, OCH2CH2NH), 3,18 (s, 2H, OCH2C), 3,3­ 3,37 (m, 8H, CH2), 3,47-3,55 (m, 12H, CH2), 3,58 (s, 6H, OCH2C), 3,87 (s, 6H, O=CCH2O), 4,27 (s, 18H, CCH2OC=O), 6,74 (br t, 1H, CH2NHC=O), 7,69 (t, J = 6,8 Hz, 3H, CH2NHC=O), 7,84 (t, J = 6,0 Hz, 3H, CH2NHC=O).
CL-EM (ES, m/z): [(M+2H-boc)/2]+ calc. para (C84H136Br9N7O33+2H-Boc)/2 = 1196,6; encontrado 1196,6.
A continuación, se sintetizó Compuesto L como se indica a continuación: en un matraz de fondo redondo de 100 mL, en nitrógeno, se añadió Compuesto K (2,0 g, 0,8 mmol) y diclorometano (10 mL), seguido de ácido trifluoroacético (5 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se concentró al vacío. La reacción se diluyó usando diclorometano (10 mL) y se concentró al vacío. El residuo se disolvió usando acetonitrilo (10 mL), se filtró a través de un filtro de jeringa (Acrodisc CR25, PN 4225T), se cargó en una columna de CLAR preparativa y se eluyó con 60 % de acetonitrilo en agua (con 0,1 % de ácido trifluoroacético) hasta 98 % de acetonitrilo (con 0,1 % de ácido trifluoroacético). Los tubos que contenían producto se agruparon, se concentraron al vacío, se congelaron y se colocaron en un liofilizador. Esto dio como resultado 990 mg (0,4 mmol, 50 % a lo largo de 2 etapas) de Compuesto L como un polvo blanco.
RMN 1H (400 MHz DMSO-d6): ó = 1,90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2,31 (t, J = 7,2 Hz, 6H, CCH2CH2NH), 2,97-3,0 (m, 8H, CCH2NH y OCH2CH2NH), 3,17 (s, 2H, OCH2C), 3,3 (q, 6H, CH2CH2NHC=O), 3,4-3,59 (m, 20H, CH2), 3,87 (s, 6H, O=CCH2O), 4,27 (s, 18H, CCH2OC=O), 7,69-7,84 (m, 9H, ambos CH2NHC=O y NH3+).
CL-EM (ES, m/z): [(M+2H)/2]+ calc. para (C84H136Br9N7O33+2H)/2 = 1196,6; encontrado 1197,4.
Ejemplo 4. Preparación de Compuesto iniciador O insertable de 9 brazos más largo
Se sintetizó un iniciador de sal de TFA/amina (Compuesto O) que tiene la estructura siguiente como se indica a continuación:
Figure imgf000031_0001
Primero, se sintetizó Compuesto M, que tiene la estructura siguiente:
Figure imgf000032_0001
en un vial de 20 mL se colocó Compuesto L (410 mg, 0,164 mmol, 1,0 equiv) (véase arriba) y alfa-t-butiloxicarbonilamino-omega-carboxiocta(etilenglicol) (97,5 mg, 0,18 mmol, 1,1 equiv), seguido de N,N-dimetilformamida (2 mL) y a continuación N,N-diisopropiletilamina (0,171 mL, 0,982 mmol, 6 equiv). El matraz se enfrió a 0 °C usando un baño de hielo. A esto se añadió solución de anhídrido propilfosfónico (50 % en peso en acetato de etilo, 0,205 mL, 0,327 mmol, 2 equiv) a lo largo de ~1 minutos. La reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 30 minutos. La reacción se enfrió rápidamente añadiendo agua (10 mL), bicarbonato de sodio acuoso saturado (10 mL) y acetato de etilo (40 mL). Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se extrajo acuosa con acetato de etilo (25 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio acuoso saturado (10 mL), ácido cítrico acuoso 0,5 M (10 mL), agua (10 mL) y cloruro de sodio acuoso saturado (10 mL), a continuación se secaron (sulfato de sodio), se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo, que se usó sin purificación adicional, dio como resultado 0,5 g (0,172 mmol, 105 %) de Compuesto M.
CL-EM (ES, m/z): [(M+2H-boc)/2]+ calc. para (C103H173Br9N8O42+2H-Boc)/2 = 1408,2; encontrado 1408,9. En un matraz de fondo redondo de 100 mL, en nitrógeno, se añadió Compuesto M (0,5 g) y diclorometano (4 mL), seguido de ácido trifluoroacético (3 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La reacción se concentró al vacío. El residuo se disolvió usando acetonitrilo (3 mL), se filtró a través de un filtro de jeringa (Acrodisc CR25, PN 4225T), se cargó en una columna de CLAR preparativa y se eluyó con 50 % de acetonitrilo (con 0,1 % de ácido trifluoroacético) en 50 % de agua (con 0,1 % de ácido trifluoroacético) hasta 90 % de acetonitrilo (con 0,1 % de ácido trifluoroacético). Los tubos que contenían producto se agruparon, se concentraron al vacío, se congelaron y se colocaron en un liofilizador. Esto dio como resultado 101 mg (21 % a lo largo de 2 etapas) de Compuesto O.
RMN 1H (400 MHz DMSO-d6): 5 = 1,90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2,3 (br t, 8H, CCH2CH2NH y CH2CH2C=O), 3,0 (m, 8H, CCH2NH y OCH2CH2NH), 3,1-3,6 (m, 64H, OCH2C), 3,87 (s, 6H, O=CCH2O), 4,27 (s, 18H, CCH2OC=O), 7,6­ 7,8 (m, 10H, ambos CH2NHC=O y NH3+).
CL-EM (ES, m/z): [(M+2H)/2]+ calc. para (C98H165Br9N8O40+2H)/2 = 1408,2; encontrado 1408,3.
Ejemplo 5. Preparación de Compuesto iniciador P “insertable” de 9 brazos más largo
Se sintetizó un iniciador de sal de TFA/amina (Compuesto P) que tiene la estructura siguiente como se indica a continuación:
Figure imgf000033_0001
en un vial de 20 mL se colocó Compuesto L (430 mg, 0,172 mmol, 1,0 equiv) (véase arriba) y alfa-tbutiloxicarbonilamino-omega-carboxidodeca(etilenglicol) (154 mg, 0,215 mmol, 1,25 equiv), seguido de N,N-dimetilformamida (2 mL) y a continuación N,N-diisopropiletilamina (0,18 mL, 1,03 mmol, 6 equiv). El matraz se enfrió a 0 °C usando un baño de hielo. A esto se añadió solución de anhídrido propilfosfónico (50 % en peso en acetato de etilo, 0,215 mL, 0,343 mmol, 2 equiv) a lo largo de 1 minuto. La reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 30 minutos. La reacción se enfrió rápidamente añadiendo agua, bicarbonato de sodio acuoso saturado y acetato de etilo. Se separó la capa orgánica y la capa acuosa se extrajo la capa acuosa con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato de sodio acuoso saturado, ácido cítrico acuoso 0,5 M, agua y cloruro de sodio acuoso saturado, a continuación se secaron (sulfato de sodio), se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo, que se usó sin purificación adicional, dio como resultado 0,6 g (0,194 mmol) de Compuesto N, mostrado a continuación.
CL-EM (ES, m/z): [(M+2H-boc)/2]+ calc. para (C111H189Br9N8O46+2H-Boc)/2 = 1496,3; encontrado 1497,2.
Figure imgf000034_0001
En un matraz de fondo redondo de 100 mL, en nitrógeno, se añadió Compuesto N (0,6 g) y diclorometano (4 mL), seguido de ácido trifluoroacético (3 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La reacción se concentró al vacío. El residuo se disolvió usando acetonitrilo (3 mL), se filtró a través de un filtro de jeringa (Acrodisc CR25, PN 4225T), se cargó en una columna de CLAR preparativa y se eluyó con 50 % de acetonitrilo (con 0,1 % de ácido trifluoroacético) en 50 % de agua (con 0,1 % de ácido trifluoroacético) hasta 90 % de acetonitrilo (con 0,1 % de ácido trifluoroacético). Los tubos que contenían producto se agruparon, se concentraron al vacío, se congelaron y se colocaron en un liofilizador. Esto dio como resultado 200 mg (0,064 mmol, 37 % a lo largo de 2 etapas) de Compuesto P.
RMN 1H (400 MHz DMSO-d6): ó = 1,90 (s, 54H, CC(CH3)2Br), 2,3 (br t, 8H, CCH2CH2NH y CH2CH2C=O), 3,0 (m, 8H, CCH2NH y OCH2CH2NH), 3,1-3,6 (m, 84H, OCH2C), 3,87 (s, 6H, O=CCH2O), 4,27 (s, 18H, CCH2OC=O), 7,6­ 7,8 (m, 10H, ambos CH2NHC=O y NH3+).
CL-EM (ES, m/z): [(M+2H)/2]+ calc. para (C106H181Br9N8O44+2H)/2 = 1496,3; encontrado 1496,6.
Síntesis de polímeros
Ejemplo 6. Preparación de polímeros iónicos dipolares
El iniciador se prepara habitualmente como una solución madre en DMF de aproximadamente 100 mg/mL. El iniciador y el ligando (2,2'-bipiridilo) se introdujeron en un tubo de Schlenk. La solución resultante se enfrió a -78 °C usando una mezcla de hielo seco/acetona y se desgasificó al vacío durante 10 min. El tubo se rellenó con argón y el catalizador (CuBr, a menos que se indique de otro modo), se mantuvo en argón, se introdujo en el tubo de Schlenck (la relación molar de átomo bromo en el iniciador/catalizador (CuBr)/ligando se mantuvo en 1/1/2). La solución se volvió marrón oscura inmediatamente. El tubo de Schlenk se selló y purgó inmediatamente aplicando un ciclo corto de vacío/argón. Se preparó una solución de HEMA-PC mezclando una cantidad definida de monómero, preparada en una cámara anaeróbica con guantes mantenida en nitrógeno, con etanol desgasificado con presión de prueba de 200. La solución de monómero se añadió gota a gota en el tubo de Schlenk (a través de una cánula) (y se homogeneizó mediante agitación ligera: innecesario). La temperatura se mantuvo a -78 °C. Se aplicó un vacío exhaustivo a la mezcla de reacción durante al menos 10 a 15 min hasta que cesó el burbujeo de la solución. El tubo se rellenó a continuación con argón y se calentó a temperatura ambiente. La solución se agitó y, a medida que avanzaba la polimerización, la solución se volvió viscosa. Después de 3 a 8 horas, o simplemente tras dejarla durante la noche, la reacción se enfrió rápidamente mediante exposición directa al aire para oxidar el Cu (I) a Cu (II), la mezcla se volvió de color verde azulado y se pasó a través de una columna de sílice con el fin de retirar el catalizador de cobre. La solución recogida se concentró mediante evaporación rotatoria y la mezcla resultante se precipitó con tetrahidrofurano o se dializó contra agua, seguido de liofilización para producir un polvo blanco en gránulos sueltos. La Tabla 2 expone polímeros ejemplares.
Tabla 2.
Figure imgf000035_0001
Tabla 3.
Figure imgf000035_0002
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Ejemplo 7. Desprotección de maleimida protegida
Se observó que los biopolímeros de maleimida protegidos tienden a desplazar el Mp a valores superiores después de la desprotección térmica cuando el polvo de biopolímero se calienta a 120 °C durante 90 minutos. Esto hace que la fabricación de biopolímeros sea más retadora, ya que la cantidad de desplazamiento del Mp a valores superiores dependía del biopolímero (Mp, arquitectura, etc.). Se necesita un procedimiento de desprotección alternativo.
La experimentación inicial se llevó a cabo en agua en un circuito capilar sellado. Se demostró que se liberaba furano durante la desprotección térmica de la solución acuosa de biopolímero en un horno a 120 °C. No se observó desplazamiento del Mp a valores superiores después de la desprotección térmica en solución acuosa.
El procedimiento también se repitió para biopolímeros disueltos en etanol. Se confirmó que el desplazamiento del Mp a valores superiores se eliminaba completamente cuando la desprotección térmica se llevaba a cabo en solución de etanol. Se ensayaron diferentes procedimientos de calentamiento, tales como un horno o un baño de aceite, y se encontró poca diferencia, siempre que el tiempo de calentamiento y las temperaturas se mantuvieran iguales. La duración del calentamiento se debe optimizar para evitar la degradación del biopolímero, pero al mismo tiempo, garantizar la desprotección de la mayoría de los biopolímeros de maleimida protegidos con furano. El procedimiento se finalizó para usar una solución de etanol de los biopolímeros en un reactor de presión (capaz de mantener una presión de 0,48 MPa (70 PSI).
La operación habitual comienza con un reactor de vidrio limpio y seco. El biopolímero se disuelve en etanol para formar una solución clara y transparente. La concentración del biopolímero es habitualmente de 50 mg/mL a 150 mg/mL, con alrededor de 100 mg/mL la mayoría de las veces. Este es un buen equilibrio entre minimizar el etanol que se va a consumir y evitar la viscosidad alta de la solución de polímero.
La solución de biopolímero clara se debe transferir a un reactor de presión limpio, purgar con N2 durante 3 a 5 minutos y a continuación tapar herméticamente. La masa del reactor más la solución de biopolímero se debe registrar antes y después de la desprotección térmica para que se pueda identificar cualquier fuga.
El reactor de presión que contiene la solución de biopolímero (que se va a desproteger) se coloca en un horno programado a 120 °C durante dos horas. Después de la desprotección, el reactor de presión se saca del horno y se deja enfriar. La solución de biopolímero desprotegido se puede purificar mediante precipitación con disolventes, secado por pulverización o liofilización.
Preparación de polímeros conjugados
Ejemplo 8. Preparación de polímero de 3 brazos conjugable a maleimida
Se preparó un polímero conjugable a maleimida (B3) que tiene la estructura siguiente:
Figure imgf000039_0001
en un vial de 20 mL se colocó polímero con n.° de ID 100 (Tabla 2) (280 mg, 0,00123 mmol, 1,0 equiv) y se disolvió usando agua (2 mL). A esto se añadió fosfato de sodio acuoso dibásico 0,5 M (0,2 mL). En un vial independiente, se disolvió ácido 3-maleimidopropiónico y éster de NHS (1,5 mg, 0,00548 mmol, 4,5 equiv) en tetrahidrofurano (0,6 mL). La solución de éster de n Hs se añadió a la solución de polímero a lo largo de ~2 minutos a temperatura ambiente y la solución resultante se agitó durante 75 minutos. La reacción se diluyó con 4:1 de agua:tetrahidrofurano (4 mL), se colocó en un tubo de membrana de diálisis para centrífuga Amicon (CpM 30000) y el tubo se colocó en la centrífuga (3000 rpm) durante 30 minutos. El filtrado se retira para el análisis, mientras que el retenido se diluye y mezcla con 4:1 de agua:tetrahidrofurano (6 mL) y el tubo se coloca en la centrífuga (3000 rpm) durante 30 minutos. El filtrado se retira para el análisis, mientras que el retenido se diluye y se mezcla con agua (8 mL) y se coloca en la centrífuga (3000 rpm) durante 30 minutos. El filtrado se retira para el análisis, mientras que el retenido se diluye y se mezcla con agua (8 mL). El procedimiento de centrifugación se repitió 3 veces más, después de lo cual se retiró el retenido y se colocó en un vial. El tubo de membrana Amicon se enjuagó con agua (2 x ~2 mL) y esto se combinó con el retenido, que se congeló y se colocó en un liofilizador. Esto dio como resultado 262 mg (93 %) de B3 como un polvo blanco.
Ejemplo 9. Preparación de polímero de 6 brazos conjugable a maleimida
Se sintetizó un polímero de 6 brazos conjugable a maleimida (F4) que tiene la estructura siguiente como se indica a continuación:
Figure imgf000040_0001
en un vial de 20 mL se colocó polímero con n.° de ID 110 (Tabla 2) (502 mg, 0,00205 mmol, 1,0 equiv) y se disolvió usando agua (4 mL). A esto se añadió fosfato de sodio acuoso dibásico 0,5 M (0,4 mL). En un vial independiente, se disolvió ácido 3-maleimidopropiónico y éster de NHS (2,45 mg, 0,0092 mmol, 4,5 equiv) en tetrahidrofurano (1 mL). La solución de éster de NHS se añadió a la solución de polímero a lo largo de 2 minutos a temperatura ambiente y la solución resultante se agitó durante 100 minutos. La reacción se diluyó con 4:1 de agua:tetrahidrofurano (4 mL), se colocó equitativamente en 2 tubos de membrana de diálisis para centrífuga Amicon (CPM 30 000) y los tubos se colocaron en la centrífuga (3000 rpm) durante 30 minutos. El filtrado se retira para el análisis, mientras el retenido se diluye y mezcla con 4:1 de agua:tetrahidrofurano (6 mL) y los tubos se colocan en la centrífuga (3000 rpm) durante 30 minutos. El filtrado se retira para el análisis, mientras que el retenido se diluye y mezcla con agua (8 mL cada uno) y se coloca en la centrífuga (3000 rpm) durante 30 minutos. El filtrado se retira para el análisis, mientras que el retenido se diluye y mezcla con agua (8 mL/tubo). El procedimiento de centrifugación se repitió 3 veces más, después de lo cual se retiró el retenido y se colocó en un vial. Los tubos de membrana Amicon se enjuagaron con agua (2 x ~2 mL cada tubo) y esto se combinó con el retenido, se congeló y se colocó en un liofilizador. Esto dio como resultado 459 mg (91 %) de Polímero F4 como un polvo blanco.
Ejemplo 10. Preparación de polímero conjugable de 6 brazos
Se sintetizó un polímero de 6 brazos conjugable a maleimida (S) que tiene la estructura siguiente como se indica a continuación:
Figure imgf000041_0001
en un vial de 20 mL se colocó polímero con n.° de ID 120 (Tabla 2) (500 mg, 0,00091 mmol, 1,0 equiv) y se disolvió usando etanol (4 mL) después de agitar durante 10 minutos. A esto se añadió solución una solución de 1 % de 4­ metilmorfolina en acetonitrilo (0,030 mL, 0,00273 mmol, 3 equiv). En un vial independiente se disolvió Producto 176­ 55 (2,65 mg, 0,00455 mmol, 5 equiv) en acetonitrilo (1 mL) y esta solución se añadió a la solución de polímero a lo largo de ~1 minuto a temperatura ambiente. Se añadió una alícuota adicional de acetonitrilo (1 mL) y la solución resultante se agitó durante 18 horas. La reacción se diluyó con 0,1 % de ácido trifluoroacético acuoso (2 mL) (pH ~6), seguido de agua (~14 mL), se filtró a través de un filtro de jeringa (Acrodisc Supor, PN 4612) y se colocó equitativamente en 3 tubos de membrana de diálisis para centrífuga Amicon (CPM 30000). Los tubos se diluyeron y mezclaron con agua (~5 mL cada uno) y se colocaron en la centrífuga (3000 rpm) durante 30 minutos. El filtrado se retira para el análisis, mientras que el retenido se diluye y mezcla con agua (~10 mL/tubo). El procedimiento de centrifugación se repitió 5 veces más, después de lo cual se retiró el retenido y se colocó en un vial. Los tubos de membrana Amicon se enjuagaron con agua (2 x ~2 mL cada tubo) y esto se combinó con el retenido. La solución de retenido se filtró a través de un filtro de jeringa (Acrodisc Supor, PN 4612), se congeló y se colocó en un liofilizador. Esto dio como resultado 469 mg (0,00085 mmol, 93 %) de Polímero S como un polvo blanco.
Ejemplo 11. Preparación de polímero de 9 brazos conjugable a maleimida
Se sintetizó un polímero de 9 brazos conjugable a maleimida (Q) que tiene la estructura siguiente como se indica a continuación:
Figure imgf000042_0001
el polímero conjugable Q se preparó como se indica a continuación: en un vial de 20 mL se colocó polímero con n.° de ID 160 (Tabla 2) (540 mg, 0,0007 mmol, 1,0 equiv) y se disolvió usando agua (4 mL). A esto se añadió fosfato de sodio acuoso dibásico 0,5 M (0,4 mL). En un vial independiente, se disolvió ácido 3-maleimidopropiónico y éster de NHS (0,93 mg, 0,0035 mmol, 5 equiv) en tetrahidrofurano (1 mL). La solución de éster de NHS se añadió a la solución de polímero a lo largo de ~2 minutos a temperatura ambiente y la solución resultante se agitó durante 30 minutos. La reacción se diluyó con agua (~15 mL), se filtró a través de un filtro de jeringa (Acrodisc Supor, PN 4612) y se colocó equitativamente en 3 tubos de membrana de diálisis para centrífuga Amicon (CPM 30000). Los tubos se diluyeron y mezclaron con agua (~5 mL cada uno) y se colocaron en la centrífuga (3000 rpm) durante 30 minutos. El filtrado se retira para el análisis, mientras que el retenido se diluye y mezcla con agua (~10 mL/tubo). El procedimiento de centrifugación se repitió 5 veces más, después de lo cual se retiró el retenido y se colocó en un vial. Los tubos de membrana Amicon se enjuagaron con agua (2 x ~2 mL cada tubo) y esto se combinó con el retenido. La solución de retenido se filtró a través de un filtro de jeringa (Acrodisc Supor, PN 4612), se congeló y se colocó en un liofilizador. Esto dio como resultado 508 mg (94 %) de Polímero Q como un polvo blanco.
Ejemplo 12. Preparación de polímero de 9 brazos conjugable a maleimida
Se sintetizó un polímero de 9 brazos conjugable a maleimida (R) que tiene la siguiente estructura como se indica a continuación:
Figure imgf000043_0001
Se preparó usando las mismas técnicas que se describen para el Polímero conjugable Q.
Ejemplo 13. Preparación de factor VIII de tipo natural para conjugación
Se sabe que el Factor VIII de tipo natural (FVIII-WT) expresado en mamíferos tiene todos los residuos de cisteína oxidados para formar enlaces disulfuro o, en el caso de las cisteínas libres presentes en el dominio B, bloqueados (protegidos) por metabolitos del medio que impiden que las cisteínas libres desapareadas estén disponibles para la conjugación usando polímeros reactivos a tioles que contienen grupos reactivos tales como maleimida o yodoacetamida. Estos restos protectores se pueden retirar usando agentes reductores tales como TCEP o DTT, seguido de retirada del agente reductor y replegamiento proteico.
El FVIII-WT se formuló en MOPS 50 mM pH7, CaCl210 mM, NaCl 200 mM, 1 % de sucrosa y 0,01 % de Tween 80 en una concentración de 0,5 mg/mL. Se añadió un equivalente molar en exceso de 150x de solución de TCEP y se incubó a 4 °C durante 1 hora. Se usó una columna de desalación de Sephadex G25 para la retirada de la TCEP. La columna G25 se equilibró con el tampón de formulación, se cargó la muestra reducida de TCEP y las fracciones recogidas se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían proteína se agruparon e incubaron a 4 °C durante la noche para permitir el replegamiento proteico (regeneración de pares disulfuro mediante oxidación), mientras que la cisteína desapareada permaneció en forma de sulfhidrilo libre (desprotegida). Alternativamente, la retirada de la TCEP se logró usando una columna de intercambio aniónico (p. ej.,Q Sepharose FF) en la que la muestra reducida de TCEP se diluyó para reducir la concentración salina y a continuación se cargó en la columna de QFF, seguido de una etapa de lavado usando el tampón MOPS con baja concentración salina y elución con un gradiente escalonado de NaCl. En estas condiciones, la proteína se eluyó en NaCl alrededor de 300 mM. Las fracciones de proteína se agruparon para la conjugación como se describe a continuación. Se prefiere el procedimiento de intercambio iónico para la retirada de TCEP sobre la estrategia de columna de desalación, ya que es más susceptible de ser realizado a mayor escala. El análisis de la forma tratada con TCEP mediante análisis por SDS-PAGE presentó predominantemente dos bandas: (1) una banda de PM superior que migraba a alrededor de 180 kDa que representa la cadena pesada más el dominio B (HC-BD); y (2) una banda de PM inferior que migraba a aproximadamente 80 kDa que representa la cadena ligera (LC). La muestra también se analizó mediante filtración en gel usando una columna de Superose 6. La columna se equilibró en Tris 20 mM pH 7,5, CaCb 10 mM, NaCl 200 mM, 10 % de etanol, 1 % de sucrosa y 0,001 % de Tween 80, seguido de inyección de diferentes muestras de FVIII que incluyen: (1) FVIII-WT tratado con TCEP y replegado y (2) FVIII-WT original para su comparación. El perfil de elución de ambas muestras a 280 nm presentó un único pico predominante en el tiempo de retención esperado.
Ejemplo 14. Conjugación de FVIII-WT a polímeros iónicos dipolares de alto peso molecular
El tiol de cisteína libre descubierto de la forma de FVIII-WT tratada con TCEP se usó para la conjugación a un abanico de polímeros funcionalizados con maleimida y yodoacetamida, diferentes en cuanto a su peso molecular, arquitectura y longitud de enlazador como se muestra en la Tabla 4. Las mezclas de reacción para la conjugación contenían proteína de FVIII-WT a aproximadamente 0,5 mg/mL en MOPS 50 mM pH 7, CaCh 10 mM, NaCl 200 mM, 0,01 % de Tween 80 y exceso molar de 5-100x de polímero de maleimida disuelto en Tris 20 mM pH 8, NaCl 200 mM, CaCb 10 mM y 0,01 % de Tween 80. Las reacciones continuaron a 4 °C durante la noche, seguido de análisis de la eficiencia de conjugación mediante SDS-PAGE en condiciones tanto no reductoras como reductoras. Los resultados demostraron la desaparición de una única banda de dominio B de la cadena pesada (HC-BD), pero no formas truncadas del dominio y la aparición simultánea de una banda de alto peso molecular en la parte superior del gel, lo que indica la presencia de conjugado recién formado. La eficiencia de conjugación (calculada como el porcentaje de la banda de dominio B de la HC restante en comparación con el control sin polímero) de cada reacción se presenta en la Tabla 4.
Tabla 4. n i n lím r f n i n liz FVIII i n r l
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
La Tabla 5 siguiente muestra la actividad de conjugados formados a partir de polímeros de hema-PC de 9 ramificaciones a partir de iniciador O o P de la Tabla 3.
Figure imgf000046_0001

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que tiene la fórmula siguiente:
Figure imgf000054_0004
donde s es 1-20;
R1 se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH y -SH;
R2 se selecciona del grupo que consiste en alquileno, alcoxileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, arilenoxi, amido y una combinación de los mismos; y
R3 es
Figure imgf000054_0003
donde R4, R5 y R6 son iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en:
Figure imgf000054_0001
y
donde Z es -NCS, -F, -CI, -Br o -I.
2. El compuesto de la reivindicación 1, donde R2 comprende una estructura que tiene la fórmula:
Figure imgf000054_0002
donde m es un número entero de 1 a 20.
3. El compuesto de la reivindicación 1, donde Z es -Br.
4. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene la fórmula siguiente:
Figure imgf000055_0001
y
donde X es un número entero de 0 a 50, Y es un número entero de 1 a 50 y Z es -NCS, -F, - Cl, -Br o -I.
5. El compuesto según la reivindicación 4, donde Y es un número entero de 1 a 10; X es 4, 8 o 12; y Z es Br.
6. El compuesto según la reivindicación 5, donde Y es 4.
7. Un procedimiento para sintetizar un enlazador-iniciador polimerizado que comprende:
proporcionar un iniciador que tiene la fórmula siguiente
R1—R2-(-R3)s;
donde s es 1-20;
R1 se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -OH y -SH;
R2 se selecciona del grupo que consiste en alquileno, alcoxileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, arilenoxi, amido y una combinación de los mismos; y
R3 es
R4
h H
donde R4, R5 y R6 son iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en:
Figure imgf000055_0002
y donde Z es -NCS, -F, -CI, -Br o -I; y
combinar el iniciador con uno o más tipos de monómero adecuados para la polimerización donde al menos uno de dichos tipos de monómero comprende un ion dipolar, donde dichos tipos de monómero reaccionan para formar un iniciador polimerizado; y
acoplar un resto de enlazador que comprende un segundo y tercer grupos reactivos al iniciador polimerizado para proporcionar un enlazador-iniciador polimerizado que tiene un grupo reactivo que no ha reaccionado.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, donde el monómero se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000056_0001
donde R7 es H o alquilo C1-6, ZW es un ion dipolar y t es 1 a 6.
9. El procedimiento de la reivindicación 7, donde el ion dipolar es fosforilcolina.
10. El procedimiento de la reivindicación 7, donde el resto de enlazador es
Figure imgf000056_0002
donde:
R8 es
Figure imgf000056_0003
y
R9 se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000056_0004
donde P es un número entero de 1 a 12.
11. El procedimiento de la reivindicación 7, donde el iniciador tiene la fórmula siguiente:
Figure imgf000057_0001
donde y es un número entero de 1 a 50, X es un número entero de 0 a 50.
12. Un enlazador-iniciador polimerizado que tiene la fórmula:
Figure imgf000057_0002
donde X es un número entero de 1 a 50, Y es un número entero de 1 a 50 y el polímero se sintetiza con un monómero seleccionado del grupo que consiste en:
donde R7 es H o alquilo Ci-6, ZW es un ion dipolar y t es 1 a 6.
13. El enlazador-iniciador polimerizado de la reivindicación 12, donde el monómero es fosfato de 2-(metacriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo) (HEMA-PC) o fosfato de 2-(acriloiloxietil)-2'-(trimetilamonioetilo).
14. Un polímero que tiene la fórmula:
Figure imgf000058_0001
donde X es un número entero de 0 a 50, Y es un número entero de 1 a 50 y MPC es un brazo de poliMPC.
15. El polímero según la reivindicación 14, donde el peso molecular total del polímero es 500000 a 1000 000 Daltons.
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