CN106232131A - 生长抑素和其类似物的结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明披露用于控制生长抑素和其类似物的生物学半衰期的载体和水凝胶的结合物。

Description

生长抑素和其类似物的结合物
技术领域
本发明属于用于延长半衰期的药剂的配制领域。
背景技术
生长抑素为调节内分泌系统并且通过与G蛋白偶合受体相互作用导致抑制若干辅助激素释放来影响神经传递和细胞增殖的肽激素，所述辅助激素包括垂体前叶中的生长激素和促甲状腺激素(TSH)；胃肠系统中的胃泌素、胆囊收缩素、蠕动素、升糖素、肠泌素、胰脏多肽、促甲状腺激素(TSH)、胃抑制肽(GIP)、肠高血糖素以及血管活性肠肽(VIP)；以及胰脏中的胰岛素和升糖素。
已知生长抑素的若干合成类似物，包括奥曲肽(octreotide)、兰瑞肽(lanreotide)以及帕瑞肽(pasireotide)。
奥曲肽(D-苯基丙氨酰基-L-半胱氨酰基-L-苯基丙氨酰基-D-色氨酰基-L-赖氨酰基-L-苏氨酰基-N-[2-羟基-1-(羟基甲基)丙基]-L-半胱氨酰胺，环状(2→7)-二硫化物；[R-(R*,R*)])为天然肽生长抑素的合成八肽模拟物。其抑制许多激素的分泌，包括胃泌素、胆囊收缩素、升糖素、生长激素、胰岛素、肠泌素、胰脏多肽、促甲状腺激素(TSH)以及血管活性肠肽(VIP)。其降低胃动力、抑制胆囊收缩、减少肠和胰脏的液体分泌、引起血管收缩并且降低出血性静脉曲张中的门静脉压。其已显示可能通过μ-类鸦片受体的活性产生镇痛作用。乙酸盐在美国已批准用作治疗肢端肥大症、巨人症、促甲状腺素瘤、腹泻和与良性肿瘤综合症有关的潮红，以及患有VIP分泌性肿瘤的患者中的腹泻的可注射储槽式配制品。其已标签外用于治疗许多疾患，包括严重难治愈性腹泻、磺酰脲用药过量后的长期复发性低血糖、患有胰岛细胞增殖症的婴儿中的胰岛素分泌过多、非小细胞肺癌继发的肥大性肺性骨关节病、恶性肠梗阻以及慢性低血压。
奥曲肽已以实验方式用于治疗肥胖症、胰脏炎引起的慢性疼痛、胸腺赘瘤以及特发性颅内高血压。
已经注意到奥曲肽会改变反向调节激素胰岛素、升糖素和生长激素之间的平衡，并且因此可引起低血糖或高血糖。在肢端肥大症患者(分别3％和16％)中观测到这一现象，但在其它患者群体中仅有1.5％。
称为注射剂(诺华(Novartis))的速释配制品通过皮下注射每天自身投予2到4次。各剂量包含与乳酸、甘露糖醇和碳酸氢钠一起在水中配制的50、100或500μg奥曲肽乙酸盐，pH 4.2。可以视需要向上滴定50μg的初始剂量。注射100μg剂量之后，达到5.2ng/mL的峰值浓度。奥曲肽在皮下投予后快速吸附，并且以1.7小时的平均半衰期从血浆消除；作用持续时间可能有变化但是延长到高达12小时。
称为SandostatinDepot的微球体配制品包含囊封于聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)葡萄糖星形聚合物中的奥曲肽乙酸盐和甘露糖醇，奥曲肽乙酸盐的浓度为10、20或30mg。用水性羧甲基纤维素钠和甘露糖醇稀释干燥微球体产生的悬浮液由经过训练的医疗服务人员使用1.5-2"19号针每月臀肌内注射。微球体通过共聚物基质的水解随时间降解，释放奥曲肽。因为微球体在水中不稳定，所以必须小心地制备悬浮液并且在混合之后立即投予。使用每月多次给药，在3次给药后获得稳态含量的游离奥曲肽。给予20mg导致1.2ng/mL的谷值含量和1.6ng/mL的峰值含量；给予30mg导致2.1ng/mL的谷值含量和2.6ng/mL的峰值含量。已报告奥曲肽由于聚合物单元的胺酰化而在Sandostatin中大规模分解(卡西米(Ghassemi)等人,“与PLGA微球体相比奥曲肽的控制释放和聚(D,L-丙交酯-共-羟基甲基乙交酯)引起的肽酰化的评定(Controlled Release of Octreotide andAssessment of Peptide Acylation from Poly(D,L-lactide-co-hydroxymethylglycolide)Compared to PLGA Microspheres)”药物研究(Pharm.Res.)(2012)29:110-120)。PLGA微球体内的低pH环境看起来对肽稳定性不利，并且因此限制其作为肽的长期传递剂的用途。
最近已例如在PCT公开案WO2013/083459 A1和波伊德(Boyd)等人,“从甘油酸酯表面活性剂形成的作为持续释放药物传递系统的溶致液晶相(Lyotropic liquidcrystalline phases formed from glycerate surfactants as sustained releasedrug delivery systems),”国际制药学杂志(Int.J.Pharm.)(2006)309:218-226中报告奥曲肽的液晶相储槽式配制品。也已经披露奥曲肽非共价夹带于水凝胶基质内并且可以通过皮下植入物传递的配制品(例如在美国专利7,803,773和7,960,335中)。
兰瑞肽([3-(2-萘基)-D-丙氨酰基-L-半胱氨酰基-L-酪氨酰基-D-色氨酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-L-半胱氨酰基-L-苏氨酰胺环状(3→7)-二硫化物)在投予后具有较长半衰期，并且适用于两种配制品，即需要每10-14天肌肉内注射的LA和每月一次深层皮下投予的Depot(英国的Autogel)。Depot包含60、90或120mg的在过饱和水性半固体配制品中的兰瑞肽乙酸盐。深层肌肉内注射时，认为形成半衰期为23-30天的缓慢释放兰瑞肽的沉淀药物储存物。在多次给药之后达到稳态时，60、90和120mg给药时的平均谷值浓度为1.8、2.5和3.8ng/mL，并且平均峰值浓度为3.8、5.7和7.7ng/mL。
帕瑞肽((2-氨基乙基)氨基甲酸(2R,5S,8S,11S,14R,17S,19aS)-11-(4-氨基丁基)-5-苯甲基-8-(4-苯甲氧基苯甲基)-14-(1H-吲哚-3-基甲基)-4,7,10,13,16,19-六氧代基-17-苯基十八氢-3a,6,9,12,15,18-六氮杂环戊环十八-2-基酯，二[(S)-2-氨基丁二酸]盐)为美国和欧洲批准用于治疗手术疗法失败或没有资格进行手术治疗的患者的库欣氏病(Cushing's disease)的孤儿药物。与其它生长抑素类似物相比，其对生长抑素受体5的亲和力增加40倍。
帕瑞肽以(诺华(Novartis))，在含有0.3、0.6或0.9mg帕瑞肽二天冬氨酸盐、甘露糖醇、酒石酸和水的配制品(pH 4.2)中的形式出售。当皮下投予时，其显示大体积分布(>100L)和约12小时的有效半衰期。
已用于其它药物并且涉及本发明中解决的问题的配制品已例如在美国专利8,640,315中披露，所述专利描述药物通过式-X-C(O)-D的键结合于用于β-消除的系统的连接基团，其中D为药物，并且连接基团将药物偶合到大分子。
U.S.8,754,190改变将药物偶合到式-O-C(O)-N(B)-CH2-D的配方，其中D同样表示药物并且药物通过β-消除连接基团偶合到大分子。
WO2011/140392描述类似连接基团，其使用上述两种与药物偶合的类型将药物连接到固体支撑物。U.S.8,703,907使用两种类型与药物的键将药物通过连接基团偶合到树形分子。
WO2013/036847描述类似键，其中连接基团偶合到任选交联的水凝胶。这些传递系统都没有专门设计以调适成适当传递有效量的生长抑素或其类似物。
由于经常疼痛性肌肉内或深层皮下注射需要由经过训练的医疗专业人员投予，并且由于肽药物在PLGA微球体中的不稳定性，那么需要投予这些适用治疗剂的改良方法。
发明内容
本发明解决与投予生长抑素和其类似物有关的问题使得可以实现持久投予，所述问题是关于足够剂量、配制品的足够溶解度以及控制释放机制。通常，为了提供足够剂量的生长抑素或其类似物，缓慢释放配制品中需要包括多个药物复本。本发明提供通过提供水凝胶中的生长抑素或其类似物的多个复本(其可以不溶性储存物形式提供)或提供在可溶性多臂大分子上的多个复本来解决这一问题的方式。在两种情况中，生长抑素或类似物通过使用β-消除反应提供控制释放的连接基团偶合到水凝胶或多臂聚合物。
本发明因此提供允许控制释放生长抑素和其类似物以及改良的投予方式的结合物。本发明的结合物可以是可溶性的，用作肽的长期循环源，或者其可以是不溶的，用作非循环储存物。本发明还提供制备这些结合物的方法和其使用方法。预期发现本发明的结合物治疗疾病和病状的效用，其中已知用生长抑素或类似物的治疗适用。
在本发明的一个方面中，提供具有控制释放的生长抑素和其类似物的可溶性结合物。本发明的可溶性结合物具有式(1)
P-(L-D)n (1)
其中P为载体分子或水凝胶，L为能够通过β-消除反应释放D的可释放连接基团，D为生长抑素或其类似物，即生长抑素或其类似物，并且当P为载体分子时n＝1-8，并且当P为水凝胶时，为重数。
更具体来说，本发明针对包括式(1)的衍生水凝胶的结合物
P-(L-D)n (1)
其中P为载体分子或水凝胶；
D为生长抑素或其类似物；
当P为载体分子时n＝1-8，并且当P为水凝胶时为重数；以及
L为式(2)的部分
其中在式(2)中，m＝0或1；
R1和R2中至少一个或两个独立地为CN；或
NO2；或
任选经取代的芳基；或
任选经取代的杂芳基；或
任选经取代的烯基；或
任选经取代的炔基；或
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选经取代的烷基；
各自任选经取代的芳基或芳基烷基；
各自任选经取代的杂芳基或杂芳基烷基；或
OR9或NR9 2，其中各R独立地为H或任选经取代的烷基，或两个R9基团与其所连接的氮一起形成杂环；或
SR4，其中
R4为任选经取代的烷基；
各自任选经取代的芳基或芳基烷基；或
各自任选经取代的杂芳基或杂芳基烷基；或
其中R1和R2接合在一起形成3-8元环；以及
其中R1和R2中的一个并且仅一个可以是H或可以是各自任选经取代的烷基、芳基烷基或杂芳基烷基；以及
各R5独立地为H或各自任选经取代的烷基、烯基烷基、炔基烷基、(CH2CH2O)p，其中p＝1-1000、芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基；并且其中R1、R2或R5中的一个连接到P或所述水凝胶。
当P为水凝胶时，由“n”标注的“重数”通常为大数字，其至少部分由水凝胶中大分子单体的数目决定。在一个实施例中，各携带药物的大分子单体含有所连接生长抑素或类似物的至少4个复本。因为水凝胶可以是多种尺寸，所以指定具体数目的所连接生长抑素或类似物部分实际上无意义。水凝胶的尺寸可以是例如1μl或100μl或更大。一般来说，n因此是大数字。
包括生长抑素或其类似物的具有控制释放的不溶性水凝胶结合物，以及可溶性结合物。本发明还针对用于本发明的药物传递系统的前驱体，包括包含偶合到适合连接基团的生长抑素或其类似物的化合物。水凝胶可以使用相同类型的连接基团交联，所述连接基团可以通过β-消除裂解。
本发明还涉及使用本发明的药物传递系统治疗的方法。因此，本发明还针对治疗受益于生长抑素和其类似物的病状的方法，通过将其以包括水凝胶的本发明结合物的形式投予来进行。
附图说明
图1示出了本发明的可溶性结合物，其中奥曲肽使用DBCO衍生的三唑经α-胺以可释放方式连接到4臂PEG。
图2示出了本发明的可溶性结合物，其中奥曲肽使用DBCO衍生的三唑经ε-胺以可释放方式连接到4臂PEG。
图3示出了本发明的可溶性结合物，其中奥曲肽使用酰胺经α-胺以可释放形式连接到4臂PEG。
图4示出了用于制备连接基团的方法。
图5示出了一种用于制备ε-连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽的方法。
图6示出了一种用于制备α-连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽的方法。
图7示出了一种用于制备本发明的可溶性结合物的方法，其中奥曲肽使用酰胺经α-胺以可释放方式连接到4臂PEG。在所述图中，PEG表示多臂PEG。
图8示出了式(1)的可溶性奥曲肽结合物的结构，其中P为40kDa 4-分支聚乙二醇；L为连接基团，其中R1＝(4-甲基苯基)SO2，R2为H，一个R5为H并且另一个为(CH2)5Z，其中Z为通过BCN环辛炔与叠氮化物的反应形成的三唑；D＝N-α-连接的奥曲肽，并且n＝1。对于40kDa PEG，m为约170(7.5kDa区段)并且p为约114(5kDa区段)。
图9示出了pH 9.4，37℃下奥曲肽从图8的结合物体外释放的动力学。奥曲肽以4小时的一级半衰期从结合物释放，所述一级半衰期对应于pH 7.4下400小时的半衰期。
图10示出了向大鼠静脉内投予之后奥曲肽从图8的结合物释放的药物动力学。
图11示出了一种用于制备释放生长抑素或类似物肽的水凝胶的方法。在这一方法中，8臂PEG-(环辛炔)8大分子单体与≤4当量叠氮基-连接基团-肽反应，以每个8臂PEG大分子单体连接最多4个连接基团-肽。剩余环辛炔单元接着用于通过与含有叠氮化物的交联试剂反应形成水凝胶基质。在这一图中，“C”表示多臂核。
图12示出了用于制备释放生长抑素或类似物肽的水凝胶的第二方法中的第一步骤。在这一方法中，在每个臂上包含两个垂直反应性官能团的四臂PEG大分子单体与连接基团-肽反应，其中连接基团包含与两个大分子单体官能团中的一个反应的官能团。所得负载肽的大分子单体接着与交联试剂反应，所述交联试剂具有与PEG大分子单体上的其余官能团具有反应性的官能团。在所示的第一步骤中，PEG-大分子单体包含用于连接到氨基-连接基团-生长抑素/类似物的丁二酰亚胺基酯和用于随后与包含环辛炔的第二大分子单体交联的叠氮化物。在这一图中，PEG为多臂的。
图13示出了通过将具有叠氮基官能团的携带药物的大分子单体偶合到具有环辛炔官能团的交联大分子单体形成水凝胶。
图14示出了用含有生长抑素或其类似物的叠氮基偶合的树形分子负载所得水凝胶。
具体实施方式
术语“生长抑素类似物”涵盖生长抑素和其肽类似物，包括奥曲肽、兰瑞肽和帕瑞肽。因此，尽管有时为了节省措辞使用“生长抑素类似物”，但这一术语意思是生长抑素或其类似物。
术语“PEG”打算涵盖平均分子量介于10,000到100,000之间的环氧乙烷的直链、分支链或多臂聚合物，其包含至少一个允许共价连接可释放连接基团的官能团Z。适合官能团Z包括胺；烷氧基胺；酮；醛；羧酸酯；活性酯，例如N-羟基丁二酰亚胺酯、硝基苯基酯以及五卤代苯基酯；活性碳酸酯和氨基甲酸酯；硫醇；顺丁烯二酰亚胺；叠氮化物；末端炔烃；变形环辛炔(strained cyclooctyne)；反式-环辛烯；环丙烯；降冰片烯；四嗪；氧化腈；环戊二烯；以及呋喃。
术语“水凝胶”意思是亲水性聚合物链的不溶性交联网状结构。水凝胶可以包含一或多种合成或天然聚合物，包括PEG、聚丙烯酰胺、玻尿酸酯、聚葡萄糖或类似聚合物。
术语“结合物”意思是通过将生长抑素或其类似物共价连接到载体分子或衍生的水凝胶制备的化合物，其中载体分子或水凝胶用以体内延长生长抑素或其类似物的寿命。载体分子关于用结合物治疗的病状或疾病可以不具有生物活性或可以用来将治疗剂定向到与病状或疾病相关的具体目标或组织。
术语“β-消除”意思是通过缺失要素H-X使包含子结构CH-(CH＝CH)m-CX，其中m＝0-1的化合物转化成包含子结构C＝(C-C)m＝C的化合物的反应。
术语“经取代的”意思是包含一或多个取代基代替一或多个氢原子的烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基。取代基一般可选自卤素，包括F、Cl、Br和I；低碳烷基包括直链、分支链和环状；低碳卤烷基包括氟烷基、氯烷基、溴烷基和碘烷基；OH；低碳烷氧基包括直链、分支链和环状；SH；低碳烷硫基包括直链、分支链和环状；氨基、烷基氨基、二烷基氨基、包括烷基硅烷基、烷氧基硅烷基和芳基硅烷基的硅烷基；硝基；氰基；羰基；羧酸、羧酸酯、羧酰胺；氨基羰基；氨酰基；氨基甲酸酯；脲；硫代氨基甲酸酯；硫脲；酮；砜；磺酰胺；包括苯基、萘基和蒽基的芳基；杂芳基，包括5元杂芳基，包括如吡咯、咪唑、呋喃、噻吩、噁唑、噻唑、异噁唑、异噻唑、噻二唑、三唑、噁二唑以及四唑，6元杂芳基，包括吡啶、嘧啶、吡嗪，以及稠合杂芳基，包括苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并咪唑、吲哚、苯并噻唑、苯并异噁唑以及苯并异噻唑。
术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括具有1-8个碳原子或1-6个碳或1-4个碳的直链、分支链或环烃基，其中烷基为饱和烃，烯基包括一或多个碳-碳双键并且炔基包括一或多个碳-碳三键。除非另外规定，否则这些含有1-6个C。
术语“芳基”包括具有6-18个碳，优选6-10个碳的芳香族烃基，包括例如苯基、萘基和蒽基的基团。术语“杂芳基”包括芳香族环，其包含3-15个碳并且含有至少一个N、O或S原子，优选3-7个碳并且含有至少一个牛顿、O或S原子，包括例如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基等基团。
术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
术语“顺丁烯二酰亚胺基”为具有下式的基团
术语“可释放连接基团”意思是将生长抑素或其类似物共价连接到结合物中的载体分子或水凝胶的部分，并且其能够在限定条件下从载体分子或水凝胶释放治疗分子。在本发明的结合物中，可释放连接基团能够通过β-消除反应释放生长抑素或其类似物。因此，本发明的可释放连接基团可以通过式(2)描述
R1和R2独立地为CN；NO2；任选经取代的芳基；任选经取代的杂芳基；任选经取代的烯基；任选经取代的炔基；COR3或SOR3或SO2R3，其中R3为H或任选经取代的烷基；各自任选经取代的芳基或芳基烷基；各自任选经取代的杂芳基或杂芳基烷基；或OR9或NR9 2，其中各R9独立地为H或任选经取代的烷基，或两个R9基团与其所连接的氮一起形成杂环；SR4，其中R4为任选经取代的烷基；各自任选经取代的芳基或芳基烷基；或各自任选经取代的杂芳基或杂芳基烷基；或其中R1和R2可以接合在一起形成3-8元环。R1和R2中的一个并且仅一个可以是H或可以是各自任选经取代的烷基、芳基烷基或杂芳基烷基。
如PCT公开案WO2009/158668 A1中所述，R1和R2的电子特性为从连接基团的释放速率的主要决定因素。R1和R2的特性可以通过任选添加供电子或吸电子取代基来调节。术语“供电子基团”意思是导致R1R2CH的酸性降低的取代基；供电子基团通常与负哈米特s或塔夫脱s*常数(negative Hammett s or Taft s*constant)有关并且为物理有机化学方法技术中众所周知。(哈米特常数指的是芳基/杂芳基取代基，塔夫脱常数指的是非芳香族部分上的取代基。)适合供电子取代基的实例包括(但不限于)低碳烷基、低碳烷氧基、低碳烷硫基、氨基、烷氨基、二烷基氨基以及硅烷基。类似地，“吸电子基团”意思是导致R1R2CH的酸性提高的取代基；吸电子基团通常与正哈米特s或塔夫脱s*常数有关并且为物理有机化学方法技术中众所周知。适合吸电子取代基的实例包括(但不限于)卤素、二氟甲基、三氟甲基、硝基、氰基；C(＝O)-RX，其中RX为H、低碳烷基、低碳烷氧基或氨基；或S(O)mRY，其中m＝1-2并且RY为低碳烷基、芳基或杂芳基。如所属领域中众所周知，取代基的电子影响可视取代基的位置而定。举例来说，芳基环的邻位或对位上的烷氧基取代基是供电子的，并且特征在于负哈米特s常数，而芳基环的间位上的烷氧基取代基为吸电子的并且特征在于正哈米特s常数。下文给出哈米特s和塔夫脱s*常数值的表。
在本发明的实施例中，m＝0-1。在具体实施例中，m＝0。
各R5独立地为H或各自任选经取代的烷基、烯基烷基、炔基烷基、(CH2CH2O)p，其中p＝1-1000、芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基；并且其中一个R5进一步包含允许连接到大分子载体的官能团Z。
在本发明的一个方面中，提供具有控制释放第生长抑素或生长抑素类似物的可溶性结合物。本发明的可溶性结合物具有式(1)
P-(L-D)n (1)
其中P为可溶性载体分子或水凝胶，L为能够如上文所述通过β-消除反应释放D的可释放连接基团，D为生长抑素或其类似物，并且当P为载体分子时n＝1-8。当P为水凝胶时，n视凝胶中大分子单元的数目而定为较大数目。
在本发明的各实施例中，生长抑素或其类似物D通过到D上的胺基的胺基甲酸酯键连接到可释放连接基团L。在本发明的某些实施例中，D通过N端α-NH2基团连接到L。在本发明的其它实施例中，D通过赖氨酸残基的ε-NH2基团连接到L。在本发明的其它实施例中，D通过2-氨基乙基-胺基甲酸酯基的NH2基团连接到L。
在本发明的实施例中，可释放连接基团L使用可释放连接基团的R1、R2或R5中的一个上的官能团Z和P上的同源官能团Z*连接到P。下表1中给出同源官能团对Z/Z*的实例。应了解Z和Z*的位置可以颠倒。
表1
P将包含至少一个允许连接如上文所述的可逆连接基团的官能团Z*(或Z)。Z*(或Z)基团可以天然存在于P中或可以使用结合领域中众所周知的方法通过化学衍生作用添加。
当P为可溶性载体分子时，P可以是合成或天然聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)、聚葡萄糖、玻尿酸或蛋白质，包括白蛋白和抗体。在本发明的一个实施例中，P为平均分子量介于10,000和100,000之间，优选介于20,000和60,000之间，并且最优选约40,000的PEG。P可以是直链、分支链或多臂的。在本发明的一些实施例中，P为具有2-8个臂的多臂PEG，各臂用官能团Z*(或Z)封端。此类多臂PEG的实例为在直链(2臂)的每一端具有Z*(或Z)的PEG以及以季戊四醇(4臂)、六甘油(8臂)、三季戊四醇(8臂)或其它类似分支核心为起始物质合成的PEG。
在本发明的一个具体实施例中，P为4臂PEG，L为式(2)的可释放连接基团，D为生长抑素或其类似物，并且n＝4。在本发明的一个更具体实施例中，P为4臂PEG，L为式(2)的可释放连接基团，其中m＝0，R1＝CN或R3SO2，R2＝H，一个R5＝H并且另一个R5通过官能团Z和Z*连接到P。
图1、图2和图3中示出了当P为载体分子时的式(1)的结合物的具体实施例。图1示出了结合物的结构，其中P为经通过Z＝叠氮化物和Z*＝环辛炔的反应形成的三唑键连接到L的4臂PEG，并且其中L通过到奥曲肽的Nα-氨基的胺基甲酸酯基连接到D。本实例中所用的具体环辛炔为二苯并氮杂环辛炔DBCO，但应了解其它环辛炔将适用，包括双环辛炔(BCN)和氟化环辛炔。为了制备此类结合物，4臂PEG四胺用环辛炔试剂衍生，在这一情形中，DBCO-丁二酸的活性NHS酯，提供4臂PEG-(环辛炔)4。奥曲肽在赖氨酸残基的Ne-胺处最容易酰化，并且连接基团可以通过用叠氮基-连接基团-丁二酰亚胺基碳酸酯处理简单地连接到这一位置(PCT公开案WO2009/158668 A1；桑蒂(Santi)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(2011)109:6211-6216)。为了制备经α-胺连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽，赖氨酸ε-胺基首先通过与容易去除的阻断基团(例如叔丁氧基羰基(BOC))反应经保护(图6)。Ne-BOC-奥曲肽接着与叠氮化物-连接基团-OSu反应以使剩余Na-氨基酰化，并且通过用酸处理去除BOC。所得叠氮基-连接基团-奥曲肽接着与PEG-(环辛炔)4反应产生式(1)的结合物，其中P＝PEG，L＝可释放连接基团，D＝经Na-胺连接的奥曲肽，n＝4，Z＝叠氮化物，并且Z*＝环辛炔。
图2示出了类似结合物，其中L通过到奥曲肽的Nε-氨基的胺基甲酸酯基连接到D。在这一情形中，奥曲肽用叠氮基-连接基团-OSu直接酰化(图5)，并且所得Ne-连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽与PEG-(环辛炔)4反应产生式(1)的结合物，其中P＝PEG，L＝可释放连接基团，D＝经Ne-胺连接的奥曲肽，n＝4，Z＝叠氮化物并且Z*＝环辛炔。
图3示出了结合物的结构，其中P为经通过Z＝叠氮化物和Z*＝羧酸活性酯的反应形成的酰胺键连接到L的4臂PEG，并且其中L通过到奥曲肽的Nα-氨基的胺基甲酸酯基连接到D。这一结合物通过PEG-四(活性酯)，例如PEG-(丁二酰亚胺基丁二酸酯)4或PEG-(丁二酰亚胺基戊二酸酯)4，与在未结合氨基上经适当保护的氨基-连接基团-奥曲肽的反应制备。图7中示出了一种此类氨基-连接基团-奥曲肽结合物的制备。图6的Ne-BOC-奥曲肽与经保护的氨基-连接基团反应，其中保护基可在BOC基团存在下去除。一种此类适合保护基为单甲基三苯甲基(MMT)，如图4中所示制备。MMT-连接基团-奥曲肽(BOC)使用弱酸部分脱除保护基，并且所得氨基-连接基团-奥曲肽与PEG-(活性酯)4反应。接着使用三氟乙酸最终去阻断来制造最终结合物。
应了解，可以使用类似方式通过结合其它生长抑素类似物来制备类似结合物。另外，因为大部分生长抑素类似物为合成肽，所以连接基团的连接位置还可以通过在肽合成期间连接来控制。
在本发明的一个实施例中，P为不溶性水凝胶。具有可控制药物释放和分解的水凝胶的制备已披露于PCT公开案WO2013/036847 A1中。上述连接基团-生长抑素/类似物可使用与上文针对可溶性PEG结合物所述类似的化学物质进一步连接到此类水凝胶。
在特定情形中使用生长抑素/类似物的水凝胶结合物可能比可溶性结合物有利。举例来说，视结合位置而定，生长抑素/类似物在结合时可保留一定程度的生物活性。这可能导致结合物的由受体介导的胞吞作用。一旦在内体隔室内部，结合物可能分解以释放载体分子；当载体分子是PEG时，其进一步分解是稳定的并且截留于内体隔室中。这可能导致液泡形成以及相关毒性。对于像水凝胶一样的非循环结合物，这不成问题。
为了形成水凝胶，使连接基团-生长抑素/类似物(例如上文所述的那些)与第一大分子单体反应形成负载药物的大分子单体。接着使这一负载药物的大分子单体与交联大分子单体反应形成交联聚合凝胶。或者，可以通过首先使两个大分子单体反应，随后连接连接基团-生长抑素/类似物，或者可以混合全部三种组分并且同时进行反应来形成交联聚合凝胶。
在图11中所示的一个实施例中，使8臂PEG-(环辛炔)8与q摩尔当量的叠氮基-连接基团-D反应产生中间体PEG-(连接基团-D)q(环辛炔)8-q，其中q＝每个大分子单体所连接的连接基团-D的平均数目。接着使这一负载药物的大分子单体与高达(8-q)/r摩尔当量r臂PEG-(连接基团-叠氮化物)r反应产生水凝胶。水凝胶形成需要每个大分子单体至少1.6个交联基团，并且因此q将为0.01-6.4，优选0.1-6.0，并且更优选0.1-4.0。因此，在本发明的一个实施例中，使8臂PEG-(环辛炔)8与q摩尔当量叠氮基-连接基团-D反应产生中间体PEG-(连接基团-D)q(环辛炔)8-q。接着使这一负载药物的大分子单体与高达(8-q)/4摩尔当量4臂PEG-(连接基团-叠氮化物)4反应产生水凝胶。在本发明的一个优选实施例中，使q＝0.1-4.0的负载药物的大分子单体与1摩尔当量4臂PEG-(连接基团-叠氮化物)4反应产生每个大分子单体具有平均4个交联基团的水凝胶。
在本发明的另一实施例中，4臂PEG首先用包含两个垂直反应性官能团Z和Y(即选自表1中的不同列但不是同一对的成员)的分子衍生。这一大分子单体接着通过如上文所述的官能团Z结合到Z*-连接基团-D，并且使第二官能团Y与包含与Y互补的官能团Y*的第二大分子单体反应。在这一情形中，每个第一大分子单体可以连接高达4个D分子，并且可以获得每个大分子单体具有4个交联基团的水凝胶。
如PCT公开案WO2013/036847 A1中所述，水凝胶可包含通过β-消除降解的其它连接基团，因此提供对水凝胶的滞留时间的控制。用于制备水凝胶基质的连接基团优选具有比用于将生长抑素或其类似物连接到水凝胶的连接基团短2到10倍，更优选短3到6倍的β-消除速率。
本发明的可溶性结合物的药物配制品可以使用医药技术中已知的药学上可接受的赋形剂配制。在本发明的一个实施例中，药物配制品包含本发明的可溶性结合物和pH值介于4和8之间，优选介于4和7之间并且最优选约pH 5的水性缓冲液。配制品可任选地冻干以提供粉末，其随后可在使用之前用注射用无菌水复原。
本发明的水凝胶可以制备成适于注射的微球体或类似悬浮粒子，或大分子单体可以作为溶液或复原用粉末形式提供，所述粉末在即将使用之前以适当比率混合时，可以后续在所要隔室中形成固体水凝胶的液体形式注射。可经装配有混合尖端的多桶注射器进行混合。
投予和使用
本发明的结合物和其组合物适用于与生长抑素和其类似物，包括包含这些根据本发明制备的类似物的水凝胶目前指示的相同适应症。具体包括本文的[0001]段-[0003]段中阐述的那些病状。
食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)已批准使用这一肽的盐形式(奥曲肽乙酸盐)作为用于治疗生长激素产生的肿瘤(肢端肥大症和巨人症)、分泌促甲状腺激素的垂体肿瘤(促甲状腺素瘤)、腹泻和与良性肿瘤综合症有关的潮红发作，以及患有血管活性肠肽分泌性肿瘤(VIPomas)的患者中的腹泻的可注射储槽式配制品。
剂量水平和投予模式视结合物或水凝胶的种类和释放速率以及与患者有关的病状和参数而定。此类剂量和模式在从业者的判断内。本发明的组合物因此可以通过注射投予，或适当地配制时以经口、局部或栓剂等方式投予。
以下实例旨在说明但不限制本发明。除非另外指示，否则本文引用的全部参考文献以全文引用的方式并入本文中。
实例1
MMT-氨基连接基团醇
向7-叠氮基-1-(4-甲基苯基磺酰基)-2-庚醇(311mg，1.0mmol)和乙酸(0.135mL，2.4mmol)于1.0mL THF中的溶液中添加1.0M三甲基膦于THF中的溶液(2.1mL，2.1mmol)。气体逸出，并且在50分钟后添加水(0.05mL，2.8mmol)。额外30分钟后，将混合物蒸发到干燥，并且残余物用2×10mL乙醚湿磨。残余物与5mL乙酸乙酯和2mL1N HCl混合，并且在添加5mL乙醇之后收集和蒸发水相。将所得粗胺乙酸盐溶解于5mL CH2Cl2中，并且添加三乙胺(0.5mL，3.6mmol)和单甲基三苯甲基氯(450mg，1.5mmol)。15分钟后，将混合物稀释到CH2Cl2中并且用0.1M KPi，pH 6.0，随后盐水洗涤两次，经mgSO4干燥，过滤并且蒸发。粗产物在使用0-50％乙酸乙酯/己烷的不连续梯度的SiO2中进行色谱分析获得呈无色油状的产物(318mg，0.6mmol，60％)。1H-NMR(CDCl3,400MHz)：d 7.80(2H,d,J＝8Hz),7.45(4H,m),7.37(2H,d,J＝8Hz),7.33(2H,d,J＝8Hz),7.25(4H,m),7.16(2H,m),7.07(2H,d,J＝8Hz),4.12(1H,m),3.72(1H,br s),3.18(1H,dd,J＝9,14Hz),3.12(1H,dd,J＝2,14Hz),2.45(3H,s),2.30(3H,s),2.08(2H,t,J＝7Hz),1.7-1.5(8H,m)。
实例2
MMT-氨基连接基团丁二酰亚胺基碳酸酯
搅拌实例1的MMT-氨基连接基团醇(180mg，0.33mmol)、二丁二酰亚胺基碳酸酯(425mg，1.66mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(84mg，0.69mmol)于2mL无水乙腈中的悬浮液16小时。所得澄清溶液稀释到乙酸乙酯中并且用水，随后盐水洗涤，接着经mgSO4干燥，过滤并且蒸发。通过使用乙酸乙酯/己烷的不连续梯度的SiO2色谱纯化产物获得190mg(84％)无色玻璃状物。
实例3
制备N-α-连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽
制备奥曲肽(Boc)。在500μL DMF中组合奥曲肽(10.2mg，10μmol，20mM最终浓度)和二-(叔丁基)二碳酸酯(9.1μmol，18.2mM最终浓度)。4小时后，通过半制备型HPLC在具有20％ACN 0.1％TFA到100％ACN 0.1％TFA梯度的Hi-Q 5u C18柱(50×20mm ID,Peekscientific)上以5mL/min流动速率经15分钟纯化反应物。各500μL洗脱份通过添加15μL饱和NaHCO3中和并且在真空下干燥。
制备N-α-连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽。在0.1mL DMF中合组合奥曲肽(Boc)(360nmol，3.6mM最终浓度)和7-叠氮基-1-(4-甲基苯基磺酰基)-2-庚基丁二酰亚胺基碳酸酯(1.1μmol，11mM最终浓度)。5小时后，反应通过HPLC(峰从7.3分钟移位到9.3分钟)完成并且通过如上文的HPLC纯化。经纯化的洗脱份在真空下干燥并且进入200μL含50％TFA的二氯甲烷中以去除Boc保护基。向经纯化的产物中添加1mL 50％TFA/二氯甲烷。1小时后，通过HPLC分析反应是否完成。在真空下去除DCM/TFA。通过MSMS检验产物N3-(α-胺)奥曲肽。
实例4
制备N-ε-连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽
在0.3mL DMF中组合奥曲肽(6.7μmol，22mM最终浓度)和7-叠氮基-1-(4-甲基苯基磺酰基)-2-庚基丁二酰亚胺基碳酸酯(8μmol，26.4mM最终浓度)。3小时后，通过半制备型HPLC在具有20％ACN 0.1％TFA到100％ACN 0.1％TFA梯度的Hi-Q 5u C18柱(50×20mm ID,Peek scientific)上以5mL/min流动速率经15分钟纯化反应物。洗脱份在真空下干燥并且通过MS和MSMS分析鉴别。如通过MS和MSMS分析所鉴别，奥曲肽在DMF中酰化导致形成单酰基(ε-胺)奥曲肽(HPLC峰面积280nm约91％)以及双酰基奥曲肽(9％)。通过C18柱纯化获得75％最终产率的单酰基(ε-胺)奥曲肽，通过HPLC无明显污染。
实例5
制备可溶性PEG-连接基团-奥曲肽
制备4臂PEG40kDa-(BCN)4。在1mL含有DMF的N,N-二异丙基乙胺(28.8μmol)中组合4臂PEG40kDa胺(NOF PTE400PA)(100mg，2.5μmol)与BCN-OPNP(SynAffix，4mg，12.5μmol)。在室温下2小时后，用H2O将反应物稀释到2.5mL并且针对1L H2O用透析膜透析。4小时后更换透析缓冲液并且保持隔夜。透析缓冲液更换成1L MeOH并且在4小时之后替换。产物通过蒸发干燥并且溶解于1.5mL THF中。通过在搅拌下逐滴添加15mL甲基叔丁基醚使产物沉淀。30分钟后，沉淀物通过离心球粒化，倾析并且用3mL MTBE洗涤两次。在真空下干燥所得粉末。进行TNBS分析法以定量任何剩余游离胺。
制备结合物。在600mL DMF中组合来自实例4的N-ε-连接的叠氮化物-连接基团-奥曲肽(4.4μmol，0.7mM最终浓度)与4臂PEG40kDa-BCN4(4μmol BCN，0.64mM最终浓度)。通过HPLC在尺寸排阻柱(BioSepTM SEC 2000 300×7.8mm HPLC柱(Phenomenex))上追踪反应进展(奥曲肽的消耗)，所述柱使用1mL min-1的50％ACN/H2O 0.01％TFA的等度流量，使用具有二极管阵列检测器的ShimadzuTM Prominence HPLC。19小时后，用5mL 10mM三乙醇胺pH 7.0稀释反应物。在2当量体积中，通过用10mM NaOAc pH 5.0(pI～9)平衡的1mL HiTrap SP FF离子交换柱纯化反应物。柱用6mL 10mM NaOAc pH 5.0(缓冲液)，随后6mL含有50mM NaCl、100mM NaCl、150mM NaCl和500mM NaCl的缓冲液洗涤。测量各洗脱部分的吸收光谱并且通过HPLC SEC分析含有肽吸光度的洗脱份的一致性(参看上文)。组合流经部分和缓冲液洗涤部分并且通过使用10kDa MWCO旋转浓缩器(Millipore)离心浓缩到约500μL，随后用10mM NaOAc pH 5.0稀释到5mL。重复浓缩/稀释4次以完成缓冲液更换。图2中示意性显示产物。
类似地制备R1R2CH不存在的稳定(即不可释放)结合物，将其用作释放动力学实验中的对照组。
实例6
4臂PEG 40kDa (ε-连接)MePhSO2奥曲肽的消除动力学
在37℃下培育含有100mM含有50μM叠氮基-PEG-DNP内标的缓冲液(Na Borate,pH9.4)中的20μM实例5的4臂PEG40kDa(ε-连接)奥曲肽结合物(R1＝4-甲基苯基-SO2)的动力学分析法。以超过五个半衰期的间隔，去除25μL等分试样，用5mL 4M HOAc淬灭并且在-20°下储存直到分析。在Jupiter 5m C18 300A 150×4.6mm HPLC柱上分析样品，所述柱在使用光电二极管阵列检测器的ShimadzuTM Prominence HPLC上使用1mL min-1下20-100％ACN-0.1％TFA的线性梯度。通过拟合反应百分比对比时间与一级速率等式来计算释放速率(kobsd)。结合物在pH 9.4 37℃下的消除t1/2的测量结果为4小时(推断出在pH 7.437℃下为400小时)。参看图9。
实例7
体内药物动力学
对插管史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rat)进行实例5的结合物的PK分析。在10mM NaOAc(pH 5.0)中以每公斤体重1mL 348μM的稳定结合物(13.9mg/kg结合物，0.35mg/kg奥曲肽)或每公斤体重2mL 697μM的可释放结合物(实例6)(56mg/kg结合物，1.4mg/kg奥曲肽)进行IV注射。在0、1、2、4、8、12、24、48、72以及120小时收集血液样品。各时间点时，向30μL 1M柠檬酸盐/0.1％F68溶液(pH 4.5)添加300mL血样，以降低pH并且去除凝血因子获得血浆。
通过添加3份乙腈使血浆样品的一部分沉淀并且在16000×g下离心10分钟。通过HPLC分析样品的PEG-肽结合物和PEG-残余物浓度。通过比较峰面积与标准曲线来计算浓度。
通过LC/MSMS分析可释放血浆样品的一部分的游离奥曲肽(MedPace)。图10中显示游离奥曲肽的血浆样品浓度对比时间数据。
当使用PK溶液软件个别地分析时，计算出稳定结合物的t1/2为35小时，符合稳定PEG-肽结合物的约40小时的前述测量值。分布体积(100mL/kg)也符合前述PEG结合物，其通常使用大鼠的大致血容量(70mL/kg)测量。游离奥曲肽的计算消除t1/2为50小时。
实例8
制备三唑-偶合奥曲肽水凝胶
40-kDa八臂PEG-(BCN)8(参考水凝胶纸)于DMF(250μL，10μmol环辛炔)中的200mg/mL(40mM环辛炔)溶液与ε-连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽(调节剂＝CH3SO2)于DMF中的53.2mM溶液(75.2μL，4.0μmol叠氮化物)和5μL于甲醇中的30mM叠氮基-荧光素(0.15μmol叠氮化物)混合，并且在37℃下静置1小时。添加DMF(544.8μL)，随后20-kDa 4臂PEG-(NH(CO)-O-CH(CH2SO2NEt2)(CH2)5N3于DMF中的200mg/mL(40mM叠氮化物)溶液(125μL，5μmol叠氮化物)。凝胶混合物用移液管快速移取到硅烷化载玻片上的16个圆形橡胶凝胶模具(9mm直径×1mm深度)中，每模具60μL，并且使其沉降1小时。接着从模具去除凝胶并且用1×10mL水洗涤1小时，1×10mL 100mM乙酸盐缓冲液(pH 5.0)洗涤1小时，并且在4℃下最终1×10mL10mM乙酸盐(pH 5.0)、0.1％叠氮化钠洗涤过夜。通过在10mL 70％乙醇中浸泡24小时使凝胶灭菌，接着用3×10mL无菌过滤水洗涤。
通过调整所添加肽(DMF中84.4mM；47.4μL，4.0μmol叠氮化物)和DMF(572.6μL)的体积来解决叠氮基-连接基团-奥曲肽储备液中的浓度差，类似地制备包含ε-连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽(调节剂＝(4-甲基-苯基)-SO2的凝胶。
通过混合200mg/mL 40-kDa PEG-(BCN)8(62.5μL，2.5μmol环辛炔)和α-连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽(调节剂＝4-(甲基苯基)SO2；30μL，0.91μmol叠氮化物)，在37℃下静置30分钟，接着添加DMF(126.2μL)和含200mg/mL 20-kDa PEG(-NH(CO)-O-(CH2)6N3的DMF(31.3μL，1.25μmol叠氮化物)并且用移液管向四个9×1mm圆形橡胶模具中的每一个中移取60μL凝胶混合物，类似地制备包含α-连接的叠氮基-连接基团-奥曲肽(调节剂＝(4-甲基-苯基)-SO2的凝胶。静置隔夜后，如上文所述洗涤凝胶。
图11中示意性显示产物。
实例9
使用分化官能团制备水凝胶大分子单体
N 3 -Glu(OtBu)-OSu.(S)-2-叠氮基-戊二酸5-叔丁酯将(二环己基铵)盐(195mg，474μmol)溶解于20mL乙酸乙酯中，接着依序用6％磷酸(2×10mL)、水(2×10mL)和盐水(10mL)洗涤。有机层经mgSO4干燥，过滤且通过旋转蒸发来浓缩，获得(S)-2-叠氮基-戊二酸5-叔丁酯(100mg，435μmol)。所得无色油状物未经进一步纯化即可使用。N-羟基丁二酰亚胺(75mg，0.65mmol)和EDAC(125mg，0.651mmol)依序添加到(S)-2-叠氮基-戊二酸5-叔丁酯(100mg，435μmol)于2mL乙腈中的溶液中。在环境温度下搅拌反应混合物隔夜，接着分配于40mL 1:1乙酸乙酯:KHSO4(5％水溶液)之间。分离各层，并且有机相用水、NaHCO3(饱和水溶液)、水和盐水(各1×20mL)依序洗涤。有机层接着经mgSO4干燥，过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱(移液管柱)用二氯甲烷:己烷(3:7，接着7:3，各3mL)，随后3mL二氯甲烷并且最终丙酮:二氯甲烷(1:3)溶离纯化粗浓缩物。在硅胶色谱步骤(约10分钟)期间观测到水解。合并含有产物的洗脱份并且用5mL二氯甲烷稀释。通过用NaHCO3(饱和水溶液)、水和盐水(各1×3mL)依序洗涤二氯甲烷溶液去除水解副产物。有机层接着经mgSO4干燥，过滤并且浓缩获得34mg(24％)呈棕褐色油状物的标题化合物。
[N 3 -Glu(OtBu)] 4 -PEG 20kDa .将N 3-Glu(OtBu)-OSu(20mg，61μmol)于0.5mL乙腈中的溶液添加到20kDa PEG胺HCl(275mg，13.8μmol PEG，55.0μmol胺)和N,N-二异丙基乙胺(21μL，0.12mmol)于2.75mL乙腈中的经搅拌溶液中。在环境温度下搅拌1.5小时后，TNBS分析法(LOQ＝0.5％)指示反应混合物中剩余0.8％初始游离胺。接着添加N,N-二异丙基乙胺(21μL，0.12mmol)和乙酸酐(5.2μL，55μmol)来封盖任何未反应的胺。在环境温度下再搅拌反应混合物30分钟，接着浓缩到约1mL。通过逐滴添加到15mL剧烈搅拌的叔丁基甲基醚中使产物沉淀。反应小瓶用0.3mL乙腈洗涤，并且将洗涤液添加到沉淀混合物中。搅拌30分钟后，真空过滤混合物。固体产物用叔丁基甲基醚(3×5mL)湿磨，接着溶解于3mL乙腈中并且用600mL乙腈透析(12-1400MWCO)60小时。浓缩保留物获得238mg(83％)呈白色膜状的标题化合物。
[N 3 -Glu] 4 -PEG 20kDa .向[N3-Glu(OtBu)]4-PEG20kDa(238mg，11.4μmol)于2.4mL二氯甲烷中的溶液中添加三氟乙酸(2.4mL)。在环境温度下搅拌3.5小时后，通过HPLC分析判断反应完成。将反应混合物浓缩到干燥，并且所得油状物用叔丁基甲基醚(15mL)湿磨直到形成白色沉淀物。真空过滤悬浮液。固体用叔丁基甲基醚(3×5mL)洗涤，接着在真空下干燥获得211mg(89％)呈白色粉末状的标题化合物。
所得产物在图12中命名为“结合物”。
[N3-Glu(OSu)]4-PEG20kDa.向[N3-Glu]4-PEG20kDa(211mg，10.2μmol)于2.5mL乙腈中的溶液中依序添加N-羟基丁二酰亚胺(9.2mg，80μmol)和EDAC(15mg，78μmol)。在环境温度下搅拌反应混合物隔夜，接着添加更多N-羟基丁二酰亚胺(9.2mg，80μmol)和EDAC(15mg，78μmol)。再于环境温度下搅拌隔夜(总共44小时)后，用乙腈(800mL，18小时；接着500mL，24小时)透析(12-14000MWCO)反应混合物。将保留物浓缩到约1.5mL，并且通过添加到剧烈搅拌的叔丁基甲基醚(17mL)使产物沉淀。在环境温度下搅拌混合物1小时，接着真空过滤。固体用叔丁基甲基醚(3×3mL)洗涤，接着在真空下干燥获得154mg(72％)呈白色粉末状的标题化合物。所得产物显示于图12中。
实例10
制备氨基-连接基团-奥曲肽(Boc)
制备N-α-连接的MTT-氨基-连接基团-奥曲肽。组合奥曲肽(Boc)的溶液(DMSO中28.5mM；350μL，10μmol)和7-(单甲基-三苯甲基氨基)-1-(4-甲基苯基磺酰基)-2-庚基丁二酰亚胺基碳酸酯(THF中140mM；140μL，19.6μmol)。16小时后，反应通过HPLC(峰从7.1分钟移位到9.5分钟)完成并且通过如上文的HPLC纯化。组合经纯化的洗脱份，用碳酸氢钠中和，并且真空干燥获得氨基-连接基团-奥曲肽(Boc)，其中调节剂基团R1为4-甲基苯基磺酰基。MS显示预期[M+H]+＝1687.2。类似地制备氨基-连接基团-奥曲肽(Boc)，其中调节剂基团R1为CN([M+H]+＝1557.7)并且MeSO2([M+H]+＝1611.2)。使用含1％CF3CO2H的氯仿选择性去除MTT基团。MS分析：R1＝4-甲基苯基磺酰基，[M+H]+＝1430.3；R1＝MeSO2，[M+H]+＝1354.6；R1＝CN，[M+H]+＝1301.6。图7中所示的所得连接基团接着与PEG-(CO2Su)4/TFA反应形成图7的可溶性结合物。
实例11
制备酰胺-连接的水凝胶
使氨基-连接基团-奥曲肽(Boc)(实例10)与[N3-Glu(OSu)]4-PEG溶液(实例9)反应产生酰胺-连接的[N3-Glu(连接基团-奥曲肽(Boc))]4-PEG，其使用CF3COsH脱除保护基获得负载药物的大分子单体[N3-Glu(连接基团-奥曲肽)]4-PEG。这一负载有药物的大分子单体的溶液接着与PEG-(环辛炔)4溶液在类似于Ashley等人,“具有可预测和可调节药物释放和分解速率的水凝胶药物传递系统(Hydrogel drug delivery system with predictableand tunable drug release and degradation rates),”美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(2013)110:2318-2323中所述的条件下混合获得可降解水凝胶，其以控制速率释放奥曲肽。
根据这一通用程序，组合含有[N3-Glu(OSu)]4-PEG20kDa(4.16μmol PEG，16.64μmolN3，15.5μmol NHS，负载有约92％NHS)于1.3mL乙腈中的溶液与Nε5-Boc Nα-氨基-连接基团-奥曲肽，其中R1＝MeSO2(15.8μmol，21.4mg)，于0.7mL乙腈与N,N-二异丙基乙基-胺(31.6μmol)。通过尺寸排阻HPLC追踪反应进展。完成时，HPLC痕迹示出含有奥曲肽：75％PEG-[奥曲肽]4(RV 7.9mL)和25％PEG-[奥曲肽]3的两种PEG物质(RV 7.8mL)。还存在等效于9％总A280的未反应奥曲肽。通过添加16.5μmol乙醇胺封端未反应的NHS。10分钟后，通过在2.5mL含有0.1％TFA的H2O中稀释使反应物pH降到约3.5，以保护基础不稳定连接基团。反应物用MeOH透析，其中一种透析物改变。保留物在真空下干燥并且用4×15mL MTBE湿磨。沉淀的产物在真空下干燥，通过尺寸排阻HPLC获得100.0mg标题化合物，93％产率，>99％纯度(75％[奥曲肽]4和[奥曲肽]3的混合物)。
这一负载药物的大分子单体的溶液与PEG-(BCN)4的溶液混合形成水凝胶。
实例12
制备酰胺-连接的可溶性多价结合物
使氨基-连接基团-奥曲肽(Boc)(实例10)与4-臂PEG-(丁二酰亚胺基酯)4溶液反应产生酰胺-连接的PEG-(连接基团-奥曲肽(Boc))4，其使用CF3COsH脱除保护基获得负载药物的4-臂PEG-(连接基团-奥曲肽)4结合物。
实例13
制备树形连接体
步骤1.Boc-Lys(Boc)-NH-(CH2CH2O)3CH2CH2N3
在环境温度下搅拌Boc-Lys(Boc)-OSu(2.25g，5.1mmol；奥德里奇(Aldrich))和11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺(1.0g，4.6mmol；TCI)于20mL CH2Cl2中的混合物2小时。混合物用CH2Cl2稀释，用水、5％KHSO4、NaHCO3饱和水溶液和盐水洗涤，接着经mgSO4干燥，过滤并且蒸发。在SiO2上使用0-50％丙酮/己烷的梯度进行色谱分析获得呈无色油状的产物(2.3g，4.2mmol，91％)。HPLC(ELSD检测)显示单峰；MS[M+H]+＝547.4。
步骤2.Boc-Lys(Boc)-Lys[Boc-Lys(Boc)]-NH-(CH2CH2O)3CH2CH2N3
将Boc-Lys(Boc)-NH-(CH2CH2O)3CH2CH2N3(550mg，1.0mmol)溶解于5mL 1:1CH2Cl2/CF3CO2H中，搅拌10分钟并且蒸发。油性残余物用2×10mL乙醚洗涤并且在真空下干燥获得呈无色玻璃状的中间物二胺(655mg)。HPLC(ELSD检测)显示单峰；[M+H]+＝347.2。
在环境温度下搅拌二胺(280mg，0.5mmol)、Boc-Lys(Boc)-OSu(480mg，1.1mmol)和三乙胺(0.42mL，3.0mmol)于5mL乙腈中的混合物2小时。混合物用CH2Cl2稀释，用水、5％KHSO4、NaHCO3饱和水溶液和盐水洗涤，接着经mgSO4干燥，过滤并且蒸发。在SiO2上使用0-100％丙酮/己烷的梯度进行色谱分析获得呈白色泡沫状的产物(315mg，0.31mmol，62％)。HPLC(ELSD检测)显示单峰。
步骤3.pyr-Lys(pyr)-Lys(pyr-Lys(pyr))-NH-(CH2CH2O)3CH2CH2N3
搅拌Boc-Lys(Boc)-Lys[Boc-Lys(Boc)]-NH-(CH2CH2O)3CH2CH2N3(100mg，0.1mmol)于2mL 1:1 CH2Cl2/CF3CO2H中的溶液10分钟并且蒸发。油性残余物用2×10mL乙醚洗涤并且在真空下干燥获得呈无色玻璃状的中间物Lys-Lys(Lys)-NH-(CH2CH2O)3CH2CH2N3四(三氟乙酸酯)。LC-MS[M+H]+＝603.4。
在环境温度下，Lys-Lys(Lys)-NH-(CH2CH2O)3CH2CH2N3四(三氟乙酸酯)(0.1mmol)于2mL DMF中的溶液用2,2-二乙氧基丙酸4-硝基苯酯(拉马缇娜(LaMattina)和缪斯(Muse),有机化学杂志(J.Org.Chem.)(1987)52:3479-3481)(150mg，0.53mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.20mL，1.15mmol)处理16小时。混合物用10mL水稀释并且用10mL CH2Cl2萃取四次。合併有机萃取物，用0.5M Na2CO3、水和盐水洗涤，接着经MgSO4干燥，过滤并且蒸发获得透明玻璃状物。将其溶解于2mL CH2Cl2中，并且用1mL 50:50CF3CO2H/H2O处理3小时。混合物接着用CH2Cl2稀释并且用NaHCO3饱和水溶液和盐水洗涤，接着经MgSO4干燥，过滤并且蒸发获得呈透明玻璃状的四丙酮酰胺树形分子，119mg。
实例14
制备氨基-氧基-连接基团-奥曲肽
氨基连接基团醇(实例1)用含2-(Boc-氨氧基)乙酸丁二酰亚胺基酯(1.2当量)和DIPEA(2当量)的CH2Cl2处理获得中间物Boc-氨氧基-乙酰胺基连接基团醇。首先使用三光气/吡啶转化成氯甲酸酯，随后使用N-羟基-丁二酰亚胺/吡啶转化成丁二酰亚胺基碳酸酯，使用标准程序将其转化成丁二酰亚胺基碳酸酯(桑蒂等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(2011)109:6211-6216)。类似于实例3和实例4，使用碳酸酯衍生Boc保护的奥曲肽。首先用1:1 CH2Cl2/CF3CO2H处理，获得呈双(三氟乙酸)盐形式的氨氧基-连接基团-奥曲肽。
实例15
制备树形分子连接体四(奥曲肽)
静置树形分子连接体四-丙酮酰胺(实例13，1当量)和氨氧基-连接基团-奥曲肽(实例14，5当量)于2:1乙腈/0.1M乙酸钠，pH 3.6中的混合物直到完成肟的形成。
实例16
制备负载树形分子-奥曲肽的可降解水凝胶
步骤1.制备大分子单体。使用以下两种化合物说明了制备水凝胶大分子单体的方法。
a.制备[Na-[7-叠氮基-1-(N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基磺酰基)-2-庚氧基]羰基-L-赖氨酰基]4-PEG20kDa：向7-叠氮基-1-(N,N-双(2-甲氧基乙基)-氨基磺酰基)-2-庚醇(1.75g，5.0mmol；根据桑蒂等人,美国国家科学院院刊(2011)109:6211-6216的方法制备)和三光气(2.5g，8.4mmol)于50mL无水THF中的溶液中添加吡啶(0.80mL，10mmol)。10分钟后，通过过滤去除沉淀物并且减压蒸发滤出物。所得油状物溶解于50mL THF中并且用N-羟基丁二酰亚胺(1.15g，10mmol)和吡啶(1.25mL，15mmol)处理。10分钟后，混合物用乙酸乙酯稀释并且用水、5％KHSO4和盐水洗涤，接着经MgSO4干燥，过滤并且蒸发获得呈油状物的粗丁二酰亚胺基碳酸酯。使用乙酸乙酯/己烷的梯度的硅胶色谱法获得经纯化的丁二酰亚胺基碳酸酯(1.76g，71％)。将其溶解于50mL乙腈中并且在剧烈搅拌下添加到Ne-Boc-L-赖氨酸(1.23g，5.0mmol)于50mL 0.5M NaHCO3中的溶液中。30分钟后获得澄清溶液，将其浓缩到一半体积，用水稀释，并且用乙酸乙酯洗涤。水相用6N HCl酸化并且用乙酸乙酯萃取。萃取物用盐水洗涤，接着经MgSO4干燥，过滤并且蒸发获得粗Ne-Boc-Na-[7-叠氮基-1-(N,N-双(2-甲氧基乙基)-氨基磺酰基)-2-庚氧基]羰基-L-赖氨酸。使用丙酮/己烷的梯度的硅胶色谱法获得经纯化的赖氨酸衍生物(1.4g，50％)。将其溶解于25mL THF中并且在4℃下用N-羟基丁二酰亚胺(0.27g，2.35mmol)和二环己基碳二亚胺(0.50g，2.42mmol)处理24小时。过滤所得悬浮液获得NHS酯于THF中的溶液，将其中一部分(12.5mL，1.12mmol)添加到20-kDa 4臂PEG-四胺四盐酸盐(5.00g，1.0mmol胺；键凯技术(JenKem Technologies))和DIPEA(0.35mL，2.0mmol)于40mL乙腈中的溶液中。2小时后，三硝基苯磺酸酯分析法指示剩余<1％游离胺。浓缩混合物，再溶解于THF中并且通过缓慢添加到200mL经搅拌的甲基叔丁基醚中来沉淀。收集沉淀物并且在真空下干燥获得5.46g(98％)Boc保护的大分子单体。将这一材料溶解于25mL CH2Cl2中，在冰上冷却，并且用25mL CF3CO2H处理。升温到环境温度后，混合物再维持30分钟，接着浓缩，用THF稀释并且通过缓慢添加到200mL乙醚中沉淀。收集沉淀物，用乙醚和MTBE洗涤，接着在真空下干燥获得5.2g大分子单体。
b.制备PEG20kDa-(MFCO)4。20-kDa 4臂PEG-四胺四盐酸盐(1.7g，0.34mmol胺；键凯技术)、DIPEA(0.12mL，0.69mmol)和3-氟环辛炔-3-甲酸五氟苯酯(0.40mL 1M乙腈溶液，0.40mmol)于6mL乙腈中的混合物维持20小时。接着通过添加32μL乙酸酐来封端任何未反应的胺。浓缩混合物，再溶解于10mL THF中并且通过缓慢添加100mL经搅拌的甲基叔丁基醚来沉淀。收集沉淀物，用MTBE洗涤，并且在真空下干燥获得第二大分子单体(1.7g)。
步骤2.制备氨基-水凝胶微球体。在10mM乙酸盐，pH 5中，在10mM反应性基团浓度下制备来自上述的两种大分子单体的溶液。流量聚焦微流体装置(白云石微流体)与含有2w/v％FSA(RAN生物技术)表面活性剂的连续不可混溶相HFE-7500(3M诺维克(3M Novec))一起使用，以1:1比率混合两种大分子单体溶液。所得微球体悬浮液通过离心浓缩，并且将所得糊状物分配于含0.1％NaN3的水和10w/v％五氟辛醇于HFE-7500中的溶液之间来去除表面活性剂。通过离心收集微球体。重复这一步骤，接着微球体用HFE-7500洗涤3次，随后用水洗涤4次。
步骤2.胺衍生.将氨基微球体于乙腈中的浆料(31mg干燥微球体/g浆料，675mg浆料，2.0μmol NH2)添加到配衡5mL BD鲁尔锁定注射器(luer lock syringe)中。随后依序添加DIPEA(1.7μL，10μmol)和3-氟环辛炔-1-甲酸五氟苯酯(按质量计乙腈中20mM，0.20mL，4.0μmol)。注射器加盖子，接着在环境温度下在定轨振荡器上搅拌隔夜。添加Ac2O(1.9μL，20μmol)和DIPEA(1.7μL，10μmol)以封端任何未反应的胺。1小时后，将注射器离心(约3000×g，10min)以使衍生得微球体形成团粒，并且使用直插式过滤器用针去除清液层。微球体用4mL乙腈稀释，并且培育悬浮液10分钟。离心注射器，并且去除清液层。如上文所述重复洗涤三次(总共4次洗涤×4mL，每次10分钟)。微球体接着用H2O(4×4mL，每次10分钟)类似地洗涤获得松散装填的MFCO衍生的微球体的浆料。
步骤3.装载.MFCO衍生的PEG微球体和实例15的叠氮基-树形分子的浆料振荡24小时，接着通过离心收集微球体，并且用乙腈洗涤以去除任何未反应的叠氮基-树形分子。

Claims (20)

1.一种式(1)的结合物或衍生水凝胶
P-(L-D)n (1)
其中P为载体分子或水凝胶；
D为生长抑素(somatostatin)或其类似物；
当P为载体分子时n＝1-8，并且当P为水凝胶时为重数；以及
L为式(2)的部分
其中在式(2)中，m＝0或1；
R1和R2中至少一个或两个独立地为CN；或
NO2；或
任选经取代的芳基；或
任选经取代的杂芳基；或
任选经取代的烯基；或
任选经取代的炔基；或
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选经取代的烷基；
各自任选经取代的芳基或芳基烷基；
各自任选经取代的杂芳基或杂芳基烷基；或
OR9或NR9 2，其中各R独立地为H或任选经取代的烷基，或两个R9基团与其所连接的氮一起形成杂环；或
SR4，其中
R4为任选经取代的烷基；
各自任选经取代的芳基或芳基烷基；或
各自任选经取代的杂芳基或杂芳基烷基；或
其中R1和R2接合在一起形成3-8元环；以及
其中R1和R2中的一个并且仅一个可以是H或可以是各自任选经取代的烷基、芳基烷基或杂芳基烷基；以及
各R5独立地为H或各自任选经取代的烷基、烯基烷基、炔基烷基；(CH2CH2O)p，其中p＝1-1000；芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基；并且其中R1、R2或R5中的一个连接到P或所述水凝胶。
2.根据权利要求1所述的结合物或水凝胶，其中D为生长抑素、奥曲肽(octreotide)、兰瑞肽(lanreotide)或帕瑞肽(pasireotide)。
3.根据权利要求1所述的结合物或水凝胶，其中D通过所述生长抑素或其类似物的Nα-氨基或Nε-氨基连接到L。
4.根据权利要求1所述的结合物或水凝胶，其中一个R5连接到P。
5.根据权利要求4所述的结合物或水凝胶，其中一个R5经三唑键连接到P。
6.根据权利要求4所述的结合物或水凝胶，其中一个R5经酰胺键连接到P。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的结合物，其中P为聚乙二醇、聚葡萄糖、玻尿酸、蛋白质、白蛋白或抗体。
8.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的结合物，其为可溶性的并且P为多臂聚乙二醇。
9.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的结合物，其中P为水凝胶。
10.根据权利要求9所述的结合物，其中所述水凝胶进一步包含具有式(2)的交联物
其中m＝0或1；
R1和R2中至少一个或两个独立地为CN；或
NO2；或
任选经取代的芳基；或
任选经取代的杂芳基；或
任选经取代的烯基；或
任选经取代的炔基；或
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选经取代的烷基；
各自任选经取代的芳基或芳基烷基；
各自任选经取代的杂芳基或杂芳基烷基；或
OR9或NR9 2，其中各R独立地为H或任选经取代的烷基，或两个R9基团与其所连接的氮一起形成杂环；或
SR4，其中
R4为任选经取代的烷基；
各自任选经取代的芳基或芳基烷基；或
各自任选经取代的杂芳基或杂芳基烷基；或
其中R1和R2接合在一起形成3-8元环；以及
其中R1和R2中的一个并且仅一个可以是H或可以是各自任选经取代的烷基、芳基烷基或杂芳基烷基；以及
各R5独立地为H或各自任选经取代的烷基、烯基烷基、炔基烷基；(CH2CH2O)p，其中p＝1-1000；芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基；并且其中R1、R2或R5中的一个连接到所述水凝胶单体单元中的一个并且基团连接到所述水凝胶单体单元中的另一个。
11.一种式(3)化合物
其中D为任选经保护的生长抑素或生长抑素类似物；
m＝0或1；
R1和R2中至少一个或两个独立地为CN；或
NO2；或
任选经取代的芳基；或
任选经取代的杂芳基；或
任选经取代的烯基；或
任选经取代的炔基；或
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选经取代的烷基；
各自任选经取代的芳基或芳基烷基；
各自任选经取代的杂芳基或杂芳基烷基；或
OR9或NR9 2，其中各R独立地为H或任选经取代的烷基，或两个R9基团与其所连接的氮一起形成杂环；或
SR4，其中
R4为任选经取代的烷基；
各自任选经取代的芳基或芳基烷基；或
各自任选经取代的杂芳基或杂芳基烷基；或
其中R1和R2接合在一起形成3-8元环；以及
其中R1和R2中的一个并且仅一个可以是H或可以是各自任选经取代的烷基、芳基烷基或杂芳基烷基；以及
各R5独立地为H或各自任选经取代的烷基、烯基烷基、炔基烷基；(CH2CH2O)p，其中p＝1-1000；芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基；并且其中R1、R2或R5中的一个进一步包含允许连接到大分子载体的官能团Z。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中Z为胺、叠氮化物、羧酸、羧酸活性酯、末端炔、环辛炔、反环辛烯、1,2,4,6-四嗪、环丙烯、顺丁烯二酰亚胺、硫醇、1,3-二烯、环戊二烯、呋喃、降冰片烯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基砜或卤素。
13.根据权利要求11所述的化合物，其中Z为叠氮化物或胺。
14.根据权利要求11所述的化合物，其中D通过所述生长抑素或其类似物的Nα-胺连接。
15.根据权利要求11所述的化合物，其中D通过所述生长抑素或其类似物的Nε-胺连接。
16.根据权利要求11所述的化合物，其中一个R5包含所述官能团Z。
17.根据权利要求11所述的化合物，其中R2为H；R1为CN或R3SO2；一个R5为H并且另一个进一步包含官能团Z。
18.根据权利要求9或10所述的结合物，其中所述水凝胶包含多臂聚乙二醇。
19.一种治疗用生长抑素的类似物容易改善的病状的方法，所述方法包含向需要此类改善的个体投予有效量的根据权利要求1到10中任一权利要求所述的结合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述病状与以下有关：生长激素产生的肿瘤(肢端肥大症和巨人症)、分泌促甲状腺激素的垂体肿瘤(促甲状腺素瘤)、腹泻、与良性肿瘤综合症有关的潮红发作或患有血管活性肠肽分泌性肿瘤(VIPomas)的患者中的腹泻。
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