CN114630818A - 蛋白-大分子偶联物及其使用方法 - Google Patents

蛋白-大分子偶联物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了如本文所定义的蛋白‑大分子偶联物、可释放接头和大分子。公开的偶联物提供了至少基于接头的性质和接头‑大分子部分的数目的独特性质。本文还提供了该偶联物的合成方法和其在治疗疾病和病症中的用途。

Description

蛋白-大分子偶联物及其使用方法
相关申请的引证
本发明申请要求2019年9月30日提交的美国临时专利申请号62/908,435的优先权益，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
序列表
本发明申请以电子形式提交，并且包括以.txt格式电子提交的序列表。所述.txt文件包含2020年9月29日创建并且大小为～3.71千字节的标题为“CSPL_008_01TW_SeqList_ST25.txt”的序列表。包含在该.txt文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全部内容作为参考并入本文。
技术领域
本发明公开涉及通过利用双官能接头制备蛋白-大分子偶联物的方法。另外，本发明公开涉及设计用于递送具有生物学功能的蛋白的药物动力学控制的新型偶联物。具体地，本发明公开涉及具有预期蛋白释放速率的蛋白-大分子偶联物。更具体地，本发明公开涉及具有IL-2部分(即具有类似于人IL-2的至少一些活性的部分)和大分子以及一个或多个接头的偶联物。另外，本发明公开涉及偶联物组合物，制备偶联物的方法，施用偶联物的方法和在癌症疗法领域使用所述偶联物的方法。
背景技术
多种药物的有效性受限制于它们的不良药物动力学参数。这些药物从生理学隔室内通过代谢或排泄的快速清除导致了短寿命和对靶标的暴露减少。例如，基于天然蛋白的治疗激动剂是可以帮助建立有效、持久的抗肿瘤反应的有吸引力的免疫调节剂；然而，由于不良的药物动力学(PK)、不良的耐受性和可以通过频繁剂量施用而加剧的多效性活性，它们不是理想的药剂。
细胞因子白介素-2(IL-2)是IL-2途径的内源激动剂并且是已详细描述的CD8+ T细胞(CD8T)和NK细胞的刺激剂。在1990年代，美国食品和药物管理局批准使用被称为“阿地白介素”的IL-2变体，在医院环境中每8小时施用高剂量IL-2方案来治疗转移性黑素瘤和肾细胞癌，从而提供了高达25％的持久反应。需要使用高剂量的IL-2来激活CD8T细胞和NK细胞，其往往表达低亲合力的IL-2受体βγ亚基(IL-2Rβγ)。该蛋白较差的PK加剧了对于高剂量IL-2的需求。由于与免疫系统过度激活有关的严重毒性，高剂量阿地白介素并未广泛使用。除这些毒性外，IL-2还刺激调节性T细胞(Tregs)的增殖和激活。这些细胞组成性地表达高亲合力的异源三聚体IL-2受体αβγ亚基(IL-2Rαβγ)。Treg激活可以加剧免疫抑制，从而潜在地损害预期的抗肿瘤反应。
聚合物前药和聚合物-药物偶联物可以改善药物对于治疗应用的有效性。聚合物偶联的药物通常显示出延长的半衰期，较高的稳定性、水溶性、较低的免疫原性和抗原性以及对组织或细胞的特异性靶向。聚合物在聚合物前药/大分子前药中用作递送药物、蛋白、靶向部分和成像剂的载体。可以将聚合物前药视为通过在一段持续时间内从聚合物链分子释放较小的治疗药物分子来显示其治疗活性的药物递送系统，其通过提高半衰期、生物利用度和因此延长药理作用来提高药物动力学行为。
为了解决IL-2的毒性问题以及不良的PK性质，已提议了某些IL-2偶联物。参见，例如，美国专利号4,766,106、5,206,344、5,089,261、4,902,502、9,861,705和WO 2019/028419。
除了延长血浆半衰期和降低免疫原性外，PEG化提供了控制蛋白结合的选择性的机会。举例来说，作为PEG化的IL-2的临床候选的NKTR-214由于在IL-2-IL-2Rα界面的赖氨酸残基处具有可释放接头的位点-特异的PEG化而显示出与IL-2受体α-亚基(IL-2Rα)结合的降低。最小程度地影响了与IL-2受体β-亚基(IL-2Rβ)的结合。因此，在临床前评价中，相对于IL-2，NKTR-214提供了升高的CD8+肿瘤-杀伤记忆性效应T细胞增殖，降低的免疫抑制性调节性T细胞增殖和升高的抗肿瘤效力。参见，例如，U.S.9,861,705，Clin.CancerRes.22,680–690(2016)；PLOS ONE 12,e0179431(2017)。
接头化学的选择在聚合物-药物偶联物治疗剂的设计中是重要的，因为它赋予了对活性剂的切割以及后续释放的时空控制。在没有充分的接头稳定性的情况下，偶联的药物可以显示出提前释放，从而消除了其大分子载体的优势。然而，就无活性的聚合物前药来说，药物释放不足可能导致药物治疗水平降低，并因此导致次优的治疗效力。因此，提供能够延长治疗效力的持续药物释放是大家非常期望的。
一些前药分子在生理条件下由于pH-依赖的β消除而释放活性药物。这种方法利用了药物从PEG载体的自发、一级速率切割，该切割是当偶联物暴露于生理学pH时引发的。通过接头上C-H键的酸性预先确定它们的切割速率；反过来，通过连接至可电离的C-H的吸电子基团控制酸度。参见，例如，美国专利号6,504,005、8,680,315和WO 2004/089279。
尽管其广泛应用，但是PEG及其在治疗中的后续应用的明显限制在于它不是生物可降解的。目前，已批准的PEG化蛋白治疗剂使用≤40kDa分子量的PEG，这接近于约50kDa的肾小球过滤阈值。尽管提高分子量通常将提供延长的循环时间，但是与非生物可降解的PEG的积累有关的问题限制了聚合物分子量的优化以及所产生的药物动力学。
发明内容
本文描述了具有多个接头的蛋白-[大分子]z偶联物的一般设计。本发明公开的独特接头使得能够构建具有可预测、可调节释放动力学的药物偶联物。另外，可以将每个大分子的分子量控制在对于肾清除所期望的分子量下，在一些实施方式中，所述分子量为小于40-50kDa。通过提高蛋白上大分子的数目(z)，偶联物的总分子量可以升高，并随后可以延长偶联物的循环时间。除了使用可释放接头上的可调节的吸电子基团之外，还可以通过改变蛋白上的大分子的数目(z)来控制和优化活性蛋白的释放速率。
通常，多个大分子对一个蛋白的偶联是困难且低效的。我们设想了用多个双官能接头对蛋白进行偶联，然后使所述接头与大分子反应以提供蛋白-[大分子]z偶联物的一般方法。该技术提供了使空间位阻最小的优势，并因此改善了反应效率。此外，合成和纯化步骤简单且成本更低。因此，该技术提供了用于聚合物-蛋白治疗剂的大规模生产和制造的显著优势。
本发明公开描述了用于提供具有可预测和可控制释放速率的可释放接头的蛋白-[大分子]z偶联物的这种一般策略。具有可控释放速率的这些偶联物可以为疾病治疗提供有价值的治疗工具。在一些实施方式中，本发明公开描述了具有非可释放接头和可释放接头的蛋白-[大分子]z偶联物。因此，本发明公开的实施方式涉及制备这些偶联物的方法，包含所述偶联物的组合物及其使用方法，这对于本领域来说是新颖且完全未提出的。
因此，在本发明公开的一个或多个实施方式中，本发明公开涉及用于制备具有通过接头连接的具有相关生物学功能的蛋白和多个大分子的偶联物的偶联方法。在一些实施方式中，所述偶联方法包括通过双官能接头对蛋白的官能化，以及随后与大分子的偶联。在一些实施方式中，所述蛋白包括(但不限于)细胞因子、趋化因子、抗体和肽。在一些实施方式中，所述大分子包括(但不限于)水溶性聚合物、PEG、脂质、聚唾液酸、白蛋白和Fc。
本发明公开还涉及新型双官能可释放接头及其组合物，新型双官能可释放接头在治疗应用中的利用以及制备方法。其中，所公开的技术的优势在于通过本文所提供的多个双官能可释放接头有效官能化蛋白的能力。然后，可以使用对大分子的偶联以改善高度官能化的蛋白的药物动力学性质。
在本发明公开的一个或多个实施方式中，提供了偶联物，所述偶联物包含通过可释放接头共价连接至一个或多个水溶性聚合物的IL-2部分的残基。
在本发明公开的一个或多个实施方式中，提供了偶联物，所述偶联物包含通过非可释放接头共价连接至一个或多个水溶性聚合物的IL-2部分的残基。
在本发明公开的一个或多个实施方式中，提供了偶联物，所述偶联物包含通过非可释放和可释放接头共价连接至一个或多个水溶性聚合物的IL-2部分的残基。
在本发明公开的一个或多个实施方式中，提供了递送偶联物的方法，所述方法包括向患者静脉内或皮下施用由IL-2的残基和水溶性聚合物的偶联物所组成的组合物的步骤。
在本发明公开的一个或多个实施方式中，提供了递送偶联物的方法，所述方法包括向癌症患者施用：(a)包含IL-2的残基和一个或多个水溶性聚合物的偶联物的组合物；和(b)有效量的抗-CTLA-4抗体或有效量的抗-PD-1/PD-L1抗体的步骤。在一些实施方式中，有效量的抗-CTLA-4抗体为抑制CTLA-4途径的量。在一些实施方式中，有效量的抗-PD-1/PD-L1抗体为抑制PD-1/PD-L1途径的量。为了清楚起见，对于根据该方法的步骤顺序，除非另外说明，否则所述方法不局限于所述步骤顺序，并且可以在实施步骤(b)之前、之后或同时实施步骤(a)。
本发明公开提供了如本文所定义的蛋白-大分子偶联物、可释放接头和大分子。所公开的偶联物提供了至少基于接头性质和接头-大分子部分数目的独特性质。本文还提供了独特的合成方法和偶联物在治疗疾病和病症中的使用。
在以下描述和权利要求中说明了本发明公开的其它实施方式。
附图说明
图1显示了rIL-2的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：1-3)。
图2显示了通过LC-MS测试的实施例14、实施例16、实施例18和实施例22所确定的IL-2-(N3)z的分布。
图3显示了实施例15、实施例17、实施例19和实施例22的点击-PEG化产物rIL-2-(PEG)z的SDS-PAGE(Tris-乙酸盐)分析。
图4显示了比较IL-2、来自实施例15(4A)、实施例17(4B)、实施例19(4C)、实施例22(4D)和实施例27(4E)的未释放的偶联物和释放的偶联物的CTLL-2细胞增殖测定的剂量反应曲线。
图5、图6、图7、图8和图9显示了以不同施用方案施用rIL-2和rIL-2-聚合物偶联物后的肿瘤生长抑制情况。
具体实施方式
定义：
在描述和主张本发明公开的一个或多个实施方式中，将根据如下所述的定义使用以下术语。
应理解本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，并且其不意欲进行限制。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明申请所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本发明申请的实践或测试中使用与本文所述的那些类似或等价的任何方法和材料，但是在本文中描述了代表性的方法和材料。
按照长期存在的专利法惯例，当在本发明申请，包括权利要求中使用时，术语“一个”和“所述”表示“一个或多个”。因此，例如，对“载体”的提及包括了一个或多个载体，两个或更多个载体的混合物等。
除非另外说明，否则在本说明书和权利要求中所使用的表示成分、反应条件等的量的所有数值将被理解为在一切情况下被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在本发明的说明书中和在所附权利要求中所述的数值参数是可以基于通过本发明申请所设法获得的所期望的性质而不同的近似值。
术语“本发明公开的化合物”或“本发明公开的化合物”是指本文所公开的式所表示的化合物或者如本文所公开的，其任何亚类或其药用盐、立体异构体、溶剂化物或水合物。在某些实施方式中，将中间体考虑作为本发明公开的化合物。
本发明公开的化合物或它们的药用盐可以含有一个或多个不对称中心并因此可以产生对映异构体、非对映体和其它立体异构化形式，就绝对立体化学来说，可以将它们定义为(R)-或(S)-或者对于氨基酸定义为(D)-或(L)-。无论它们是否在本文中具体显示，本发明公开意味着包括所有这些可能的异构体以及它们的外消旋和光学纯形式。可以使用手性合成单体或手性试剂制备或者使用常规方法，例如，色谱法和分级结晶分离光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或者(D)-和(L)-异构体。用于单个对映异构体的制备/分离的常规方法包括从适合的光学纯的前体手性合成或使用，例如，手性高压液相色谱法(HPLC)的外消旋物(或者盐或衍生物的外消旋物)的分离。当本文所述的化合物含有烯烃双键或其它几何不对称性中心时，并且除非另外说明，否则所述化合物旨在包括E和Z几何异构体两者。同样地，还旨在包括所有互变异构形式。
“立体异构体”是指由通过相同键键合的相同原子组成，但是具有不可互换的不同立体结构的化合物。本发明公开考虑了多种立体异构体及其混合物。在一些实施方式中，如本文所使用的“立体异构体”是指对映异构体、对映异构体的混合物、非对映体或两种或更多种非对映体的混合物。
“对映异构体”表示彼此是不能重叠的镜像的化合物的两种立体异构体。这些异构体的混合物可以称为对映体混合物。
将对映异构体的50:50的混合物称为外消旋混合物或外消旋物，它可以在化学反应或过程中没有立体选择或立体专一性的情况下发生。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”表示两种对映体物质的等摩尔混合物，其缺少光学活性。本发明公开包括本文所述的化合物的所有立体异构体。
“非对映体”是指具有两个或更多个手性中心的立体异构体并且它们的分子彼此不为镜象。非对映体具有不同的物理性质，例如，熔点、沸点、光谱性质和反应性。可以通过高分辨分析方法，如电泳和色谱法分离非对映体混合物。
术语“位置异构体”是本领域承认的并且表示具有相同分子式，但是原子连接性程度不同的化合物。因此，“位置选择性过程”是其中相对于其它位置异构体，优选特定位置异构体的形成的过程，例如，显著提高特定位置异构体的产率的反应。如本文所使用的，“位置异构体”可以表示单一位置异构体或两个或更多个位置异构体的混合物。
“互变异构体”是指分子的一个原子向相同分子的另一个原子的质子移动。本发明公开包括任何所述化合物的互变异构体。
如本文所使用的术语“药物组合”、“治疗组合”或“组合”表示包含至少两种治疗活性剂的单一剂量形式，或者一起包含至少两种治疗活性剂并且在组合疗法中单独使用的单独的剂量形式。例如，可以将一种治疗活性剂配制成一种剂量形式并且可以将另一种治疗活性剂配制成单一或不同的剂量形式。例如，可以将一种治疗活性剂配制成固体口服剂量形式，而将第二治疗活性剂配制成用于肠胃外施用的溶液剂量形式。
本文所使用的化学命名规程和结构图是使用ACD/Name 9.07版软件程序、ChemDraw Ultra 11.0.1版和/或ChemDraw Ultra 14.0版软件命名程序(CambridgeSoft)的I.U.P.A.C.命名系统的修改形式。对于本文所使用的复杂化学名称，在它所连接的基团之前命名取代基团。例如，环丙基乙基包含具有环丙基取代基的乙基主链。除如下所述，除一些碳原子外，在本文中的化学结构图中标出了所有的键，其假定键合至足够的氢原子以达到化合价。
术语“组合物”或“制剂”表示处于物理形式，如固体、液体、气体或其混合物的一种或多种物质。组合物的一个实例是药物组合物，即与医疗有关、制备用于医疗或者在医疗中使用的组合物。
如本文所使用的，“药用”表示适合于与人和动物的组织接触的使用而无过度毒性、刺激、过敏反应等，具有合理的效益/风险比并且对于它们在合理医学判断范围内的预期使用有效。
“盐”包括活性剂的衍生物，其中通过制备酸或碱加成盐来修饰所述活性剂。优选地，这些盐是药学上可接受的盐。这些盐包括(但不限于)药用酸加成盐、药用碱加成盐、药用金属盐、铵和烷基化铵盐。酸加成盐包括无机酸和有机酸的盐。适合的无机酸的代表性实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。适合的有机酸的代表性实例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、柠檬酸、反丁烯二酸、乙醇酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、焦葡萄酸、水杨酸、琥珀酸、甲磺酸、乙烷磺基天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、EDTA、乙醇酸、p-氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、硼酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、羟基萘甲酸盐、甘油磷酸盐、酮戊二酸盐等。碱加成盐包括(但不限于)乙二胺、N-甲基-葡糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙基胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、氢氧化四甲铵、三乙胺、二苄基胺、二苯羟甲胺、脱氢枞胺、N-乙基哌啶、苯甲基胺、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、碱性氨基酸，例如，赖氨酸和精氨酸、二环己基胺等。金属盐的实例包括锂、钠、钾、镁盐等。铵和烷基化铵盐的实例包括铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、乙基铵、羟乙基铵、二乙基、丁基铵、四甲铵盐等。有机碱的实例包括赖氨酸、精氨酸、胍、二乙醇胺、胆碱等。用于药用盐以及它们的制剂的制备的标准方法在本领域中是熟知的并且在多种参考文献中公开，所述参考文献包括，例如，“Remington:TheScience and Practice of Pharmacy”,A.Gennaro主编,第20版,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。
如本文所使用的，“溶剂化物”表示通过溶剂化所形成的复合物(溶剂分子与本发明公开的活性剂的分子或离子的组合)或者由溶质离子或分子(本发明公开的活性剂)与一种或多种溶剂分子所组成的聚集体。在本发明公开中，优选的溶剂化物是水合物。水合物的实例包括(但不限于)半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、六水合物等。本领域的技术人员应理解本发明的化合物的药用盐还可以以溶剂化物的形式存在。通常通过水合形成溶剂化物，水合是本发明的化合物的制备的一部分或者是通过本发明公开的无水化合物的天然吸湿。包括水合物的溶剂化物可以以化学计量比存在，例如，以每个溶剂化物或每个水合物分子2、3、4个盐分子。存在另一种可能性，例如，相对于3、5、7个溶剂或水合物分子，两个盐分子是化学计量的。用于结晶的溶剂，如醇，特别是甲醇和乙醇；醛；酮，特别是丙酮；酯，例如，乙酸乙酯可以嵌入在晶格中。优选药用溶剂。
术语“赋形剂”、“载体”和“媒介物”在整个本发明申请中是可互换使用的并且表示与之一起施用本发明公开的化合物的物质。
“治疗有效量”表示当施用于患者用于治疗疾病或其它不希望的医学病况时，相对于该疾病或病况足以具有有益效果的化合物或治疗活性剂的量。所述治疗有效量将基于所选化合物或治疗活性剂的类型、疾病或病况及其严重程度以及要治疗的患者的年龄、体重等而不同。确定给定化合物或治疗活性剂的治疗有效量在本领域常规技术范围内并且不要求超常规实验。
如本文所使用的“治疗”涵盖了在患有所关心的疾病或病况的哺乳动物，优选人，中对于所关心的疾病或病况的治疗：预防哺乳动物中所述疾病或病况的发生，具体地，当该哺乳动物对所述病况易感，但尚未诊断为患有所述病况时；抑制所述疾病或病况，即终止其发展；减轻所述疾病或病况，即导致所述疾病或病况消退；或者减轻由所述疾病或病况所造成的症状，即缓解疼痛而不针对潜在的疾病或病况。
如本文所使用的“疾病”和“病况”可以互换使用或者可以在具体疾病或病况不可以具有已知病因(从而尚未获得病原学)时是不同的，并因此尚未将其认为是疾病，而仅视为不希望的病况或综合征，其中已通过临床医师鉴别了大致特异的一类症状。
本发明公开还意味着涵盖了所公开的化合物的体内代谢产物。这些产物可以由(例如)所施用的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等产生，其主要是由于酶促过程而发生。因此，本发明公开包括通过以下方法所产生的化合物，所述方法包括向哺乳动物施用足以获得其代谢产物的一段时间的本发明公开的化合物。通常，通过以可检测的剂量向动物，如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或向人施用放射性标记的本发明公开所述的化合物，进行足以发生代谢的时间并从尿液、血液或其它生物样品中分离其转化产物来鉴别这些产物。
如本文所使用的，“受试者”可以是人、非人灵长类动物、哺乳动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用以表示(例如)哺乳动物受试者，如人受试者。
受试者可以被怀疑患有癌症或具有患癌风险，所述癌症如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、唾液腺癌或子宫内膜癌，或者怀疑其患有痤疮、多毛症、脱发、良性前列腺肥大、卵巢囊肿、多囊卵巢病、早熟青春期、脊髓延髓肌肉萎缩症或年龄相关性黄斑变性或具有患病风险。多种癌症，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、肝细胞癌、唾液腺癌或子宫内膜癌的诊断方法和痤疮、多毛症、脱发、良性前列腺肥大、卵巢囊肿、多囊卵巢病、早熟青春期、脊髓延髓肌肉萎缩症或年龄相关性黄斑变性的诊断方法，以及癌症，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、肝细胞癌、唾液腺癌或子宫内膜癌的临床描述，痤疮、多毛症、脱发、良性前列腺肥大、卵巢囊肿、多囊卵巢病、早熟青春期、脊髓延髓肌肉萎缩症或年龄相关性黄斑变性的诊断和临床描述是本领域那些技术人员已知的。
“哺乳动物”包括人和家畜，如实验动物和家庭宠物(例如，猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔)和非家畜，如野生生物两者等。
“可选的”或“可选地”表示随后所述的事件或状况可以或可以不发生，并且描述包括其中所述事件或状况发生的情况和其中它不发生的情况。例如，“可选地取代的芳基”表示所述芳基可以被取代或可以不被取代，并且描述包括取代的芳基和未取代的芳基两者。
如本文所使用的“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”是可互换的并且涵盖了任何非肽水溶性聚(环氧乙烷)。通常，根据本发明公开所使用的PEG包括以下结构“-(OCH2CH2)n-”，其中(n)为2至4000。如本文所使用的，基于(例如)合成转化期间，末端氧是否被替换，PEG还包括“-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-”和“-(OCH2CH2)nO-”。在整个说明书和权利要求中，应记住术语“PEG”包括具有多种末端或“封端”基团等的结构。术语“PEG”还表示含有大部分(也就是大于50％)的-OCH2CH2-重复亚单元的聚合物。对于具体形式，PEG可以采取任何数目的多种分子量以及以下将更详细描述的结构或几何形状，如“支链”、“直链”、“叉状”、“多官能”等。
术语“封端”和“末端封端”在本文中可互换使用以表示具有封端部分的聚合物的末端或端点。通常，尽管不一定，所述封端部分包含羟基或C1-20烷氧基，更优选地C1-10烷氧基，并且更优选地C1-5烷氧基。因此，封端部分的实例包括烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基和苄氧基)以及芳基、杂芳基、环、杂环等。必须记住所述封端部分可以包括聚合物中末端单体的一个或多个原子[例如，CH3O(CH2CH2O)n-和CH3(OCH2CH2)n-中的封端部分“甲氧基”]。另外，设想了以上每一个的饱和、不饱和、取代和未取代形式。此外，所述封端基团还可以是硅烷。所述封端基团还可以有利地包含可检测标记物。当所述聚合物具有包含可检测标记物的封端基团时，可以通过使用适合的检测器确定所述聚合物和/或所述聚合物所偶联至的部分(例如，活性剂)的量或位置。这些标记物无限制地包括荧光剂、化学发光剂、酶标记中使用的部分、比色剂(例如，染料)、金属离子、放射性部分等。适合的检测器包括光度计、胶片、光谱仪等。所述封端基团还可以有利地包含磷脂。当所述聚合物具有包含磷脂的封端基团时，将赋予所述聚合物和所得偶联物独特的性质。示例性的磷脂无限制地包括选自称为磷脂酰胆碱的磷脂类的那些。具体的磷脂无限制地包括选自二月桂酰基磷脂酰胆碱、二油烯基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二十二酰基磷脂酰胆碱、二十烷酰基磷脂酰胆碱和卵磷脂的那些。所述封端基团还可以包括靶标部分，从而所述聚合物—以及与之连接的任何物质，例如，IL-2部分—可以优先定位在所关心的区域中。
相对于如本文所述的聚合物，“非天然存在的”表示其在自然界中不存在其整体的聚合物。然而，非天然存在的聚合物可以含有天然存在的一个或多个单体或单体部分，只是整体聚合物结构在自然界中不存在。
如“水溶性聚合物”中的术语“水溶性”聚合物是在室温下可溶于水的任何聚合物。通常，水溶性聚合物将透过至少约75％，更优选地至少约95％的在过滤后通过相同溶液所透过的光。基于重量，水溶性聚合物将优选地为至少约35％(按重量计)可溶于水，更优选地至少约50％(按重量计)可溶于水，更优选地约70％(按重量计)可溶于水，并且更优选地约85％(按重量计)可溶于水。然而，最优选地，水溶性聚合物为约95％(按重量计)可溶于水或完全可溶于水。
在水溶性聚合物如PEG的背景下，分子量可以表示为数均分子量或重均分子量。除非另外说明，否则在本文中所有对分子量的提及均表示重均分子量。可以使用凝胶渗透色谱或其它液相色谱技术测量数均和重均分子量两者。还可以使用其它测量分子量值的方法，如使用末端基团分析或测量依数性(例如，凝固点降低、沸点升高或渗透压)来确定数均分子量，或者使用光散射技术、超速离心法或粘度测定法来确定重均分子量。本发明公开的聚合物通常是多分散的(即聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，优选地，其低多分散性值小于约1.2，更优选地小于约1.15，更优选地小于约1.10，更优选地小于约1.05并且最优选地小于约1.03。
当结合特定官能团使用时，术语“活性”、“反应性”或“激活的”表示容易与另一种分子上的亲电体或亲核体反应的反应性官能团。这与需要强催化剂或特别不实用的反应条件来进行反应的那些基团相反(即“非反应性”或“惰性”基团)。
如本文所使用的，术语“官能团”或其任何同义词表示涵盖了其受保护的形式以及未受保护的形式。
如本文所使用的，术语“电子改变基团”表示包括改变它所连接的部分的电子密度的任何原子或官能团。电子改变基团包括提供电子密度的供电子基团(例如，胺、羟基、烷氧基、烷基)和抽出电子密度的吸电子基团(例如，硝基、氰基、三氟甲基)。
术语“间隔子(spacer)部分”、“键”和“接头”在本文中用于表示可选地用于连接互相连接部分，如大分子部分和蛋白的末端或蛋白的亲电试剂或亲核试剂的键或原子或一系列原子。所述间隔子部分可以是水解稳定的或者可以包括生理学可水解的或酶促可降解的键。除非上下文明确规定，否则间隔子部分可选地存在于化合物的任何两个元素之间(例如，可以直接或通过间隔子部分间接连接所提供的包含蛋白残基和大分子的偶联物)。
本发明公开的适合的间隔子包括含有一个或多个碳原子、氮原子、硫原子、磷原子、氧原子及其组合的接头的间隔子。适合的间隔子部分可以包含酰胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚、磷酸酯、硫代磷酯、二硫基和/或点击化学基团。具体的间隔子部分的非限制性实例包括选自下列组的那些：-O-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-OP(O)(OH)-、-OP(S)(OH)-、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH2-、-CH2-C(O)-O-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-、-C(O)-O-CH2-CH2-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-[CH2]l-(OCH2CH2)m-、二价环烷基、二价芳基、-O-、-S-、二价氨基酸残基、-N(R3)-、以及任何上述基团中的两种或更多种的组合，其中R3是H或选自下列的有机基：取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的芳基，(l)是0至6，并且(m)是0至20。其它具体的间隔子部分具有以下结构：-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-和-O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，其中每个亚甲基后的下标值表示所述结构中所含的亚甲基的数目，例如，(CH2)1-6表示所述结构可以含有1、2、3、4、5或6个亚甲基。
术语“双官能接头”是指如上定义的具有两个反应性原子或官能团的接头。在某些实施方式中，所述两个反应基团是具有不同反应模式的互不相关的官能团，从而如果需要，则每个官能团能够独立于另一个并且以具体顺序反应。如本领域技术人员将理解的，本文所公开的双官能接头可以用于实施位点-特异的反应以组装蛋白-大分子偶联物。
“酰基”是指–C(＝O)-烷基。
“氨基”是指-NH2基团。
“氰基”是指-CN基团。
“卤代”、“卤化物”或“卤素”是指溴代、氯代、氟代或碘代基团。
“羟基”是指-OH基团。
“亚氨基”是指＝NH取代基。
“硝基”是指-NO2基团。
“氧”是指＝O取代基。
“硫代”是指＝S取代基。
“巯基”是指-SH基团。
氢是H或D。
“烷基”或“烷基基团”是指具有1至20个碳原子的完全饱和的直链(线性)或支链的烃链基团，并且其通过单键连接至所述分子的其余部分。包括了包含1至20的任意数目的碳原子的烷基。包含多至20个碳原子的烷基是C1-C20烷基，包含多至10个碳原子的烷基是C1-C10烷基，包含多至6个碳原子的烷基是C1-C6烷基并且包含多至5个碳原子的烷基是C1-C5烷基。C1-C5烷基包括C5烷基、C4烷基、C3烷基、C2烷基和C1烷基(即甲基)。C1-C6烷基包括以上对于C1-C5烷基所述的所有部分，但是还包括C6烷基。C1-C10烷基包括以上对于C1-C5烷基和C1-C6烷基所述的所有部分，但是还包括C7、C8、C9和C10烷基。类似地，C1-C12烷基包括所有上述部分，但是还包括C11和C12烷基。C1-C12烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、仲丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、叔戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一基和正十二基。除非在说明书另有具体说明，否则烷基可以是可选地取代的。术语“低级烷基”是指C1-C6烷基，它可以是直链或支链的，例如，包括支链C3-C6烷基。示例性的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等。如本文所使用的，“烷基”包括环烷基和含环亚烷基的烷基。
“亚烷基”、“-烷基-”或“亚烷基链”是指具有1至20个碳原子的完全饱和的直链或支链二价烃链基团。C1-C20亚烷基的非限制性实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。亚烷基链通过单键连接至所述分子的其余部分并且通过单键连接至基团。亚烷基链与所述分子的其余部分以及与基团的连结点可以通过所述链内的一个碳或任意两个碳。除非在说明书中另有具体说明，否则亚烷基链可以是可选地取代的。
“烯基”或“烯基基团”是指具有2至20个碳原子并且具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃链基团。每个烯基基团通过单键连接至所述分子的其余部分。包括了包含2至20的任意数目的碳原子的烯基基团。包含多至20个碳原子的烯基基团是C2-C20烯基基团，包含多至10个碳原子的烯基是C2-C10烯基基团，包含多至6个碳原子的烯基基团是C2-C6烯基并且包含多至5个碳原子的烯基是C2-C5烯基。C2-C5烯基包括C5烯基、C4烯基、C3烯基和C2烯基。C2-C6烯基包括以上对于C2-C5烯基所述的所有部分，但是还包括C6烯基。C2-C10烯基包括以上对于C2-C5烯基和C2-C6烯基所述的所有部分，但是还包括C7、C8、C9和C10烯基。类似地，C2-C12烯基包括所有上述部分，但是还包括C11和C12烯基。C2-C12烯基的非限制性实例包括乙烯基(乙烯基)、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、异丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基、8-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基、9-癸烯基、1-十一碳烯基、2-十一碳烯基、3-十一碳烯基、4-十一碳烯基、5-十一碳烯基、6-十一碳烯基、7-十一碳烯基、8-十一碳烯基、9-十一碳烯基、10-十一碳烯基、1-十二碳烯基、2-十二碳烯基、3-十二碳烯基、4-十二碳烯基、5-十二碳烯基、6-十二碳烯基、7-十二碳烯基、8-十二碳烯基、9-十二碳烯基、10-十二碳烯基和11-十二碳烯基。除非在说明书另有具体说明，否则烷基可以是可选地取代的。
“亚烯基”或“亚烯基链”是指具有2至20个碳原子并且具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链二价烃链基团。C2-C20亚烯基的非限制性实例包括亚乙烯基、亚丙烯基、亚丁烯基等。亚烯基链通过单键连接至所述分子的其余部分并且通过单键连接至基团。亚烯基链与所述分子的其余部分以及与基团的连结点可以通过所述链内的一个碳或任意两个碳。除非在说明书中另有具体说明，否则亚烯基链可以是可选地取代的。
“炔基”或“炔基基团”是指具有2至20个碳原子并且具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链烃链基团。每个炔基基团通过单键连接至所述分子的其余部分。包括了包含2至20的任意数目的碳原子的炔基基团。包含多至20个碳原子的炔基基团是C2-C20炔基，包含多至10个碳原子的炔基是C2-C10炔基，包含多至6个碳原子的炔基基团是C2-C6炔基并且包含多至5个碳原子的炔基是C2-C5炔基。C2-C5炔基包括C5炔基、C4炔基、C3炔基和C2炔基。C2-C6炔基包括以上对于C2-C5炔基所述的所有部分，但是还包括C6炔基。C2-C10炔基包括以上对于C2-C5炔基和C2-C6炔基所述的所有部分，但是还包括C7、C8、C9和C10炔基。类似地，C2-C12炔基包括所有上述部分，但是还包括C11和C12炔基。C2-C12炔基的非限制性实例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等。除非在说明书另有具体说明，否则烷基可以是可选地取代的。
“亚炔基”或“亚炔基链”是指具有2至20个碳原子并且具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链二价烃链基团。C2-C20亚炔基的非限制性实例包括亚乙炔基、亚丙炔基等。亚炔基链通过单键连接至所述分子的其余部分并且通过单键连接至基团。亚炔基链与所述分子的其余部分以及与基团的连结点可以通过所述链内的一个碳或任意两个碳。除非在说明书中另有具体说明，否则亚炔基链可以是可选地取代的。
“烷氧基”或“-O-烷基”是指式ORa所示的基团，其中Ra是如上定义的含有1至20个碳原子的烷基、烯基或炔基基团。除非在说明书另有具体说明，否则烷氧基可以是可选地取代的。
“烷基氨基”是指式-NHRa或-NRaRa所示的基团，其中每个Ra独立地为如上定义的含有1至12个碳原子的烷基、烯基或炔基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基氨基基团可以是可选地取代的。
“烷基羰基”是指-C(＝O)Ra部分，其中Ra是如上定义的烷基、烯基或炔基基团。烷基羰基的非限制性实例是甲基羰基(“乙缩醛”)部分。还可以将烷基羰基基团称为“Cw-Cz酰基”，其中w和z表示如上定义的，Ra中碳的数目范围。例如，“C1-C10酰基”是指如上定义的烷基羰基基团，其中Ra是如上定义的C1-C10烷基、C1-C10烯基或C1-C10炔基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基羰基可以是可选地取代的。
术语“氨烷基”是指被一个或多个-NH2基团取代的烷基。在某些实施方式中，氨烷基基团被1、2、3、4、5或更多个-NH2基团取代。氨烷基基团可以可选地被如本文所述的一个或多个其它取代基取代。
“芳基”是指包含氢、6至18个碳原子和至少一个芳环的烃环系统基团。出于本发明公开的目的，芳基可以是单环、双环、三环或四环的环系统，其可以包括稠合或桥连的环系统。芳基包括(但不限于)衍生自醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、屈、萤蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、非那烯、菲、七曜烯、芘和苯并菲的芳基。除非在说明书中另有具体说明，否则术语“芳基”表示包括可选地取代的芳基。芳基包括可以稠合(如在萘基中)或非稠合(如在联苯基中)的多个芳基环。芳基环还可以与一个或多个环烃、杂芳基或杂环稠合或非稠合。如本文所使用的，“芳基”包括杂芳基。
“芳烷基”、“芳基烷基”或“-烷基芳基”是指式-Rb-Rc所示的基团，其中Rb是如上定义的亚烷基、亚烯基或亚炔基基团，Rc是如上定义的一个或多个芳基，例如，苄基、二苯甲基等。除非在说明书另有具体说明，否则芳烷基可以是可选地取代的。
“烷氧基”是指-OR基团，其中R是烷基或取代的烷基，优选地C1-6烷基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。
“碳环基”、“碳环”或“碳环”是指环状结构，其中形成所述环的原子均为碳。碳环可以在所述环中包含3至20个碳原子。碳环包括芳基和环烷基。环烯基和环炔基如本文所定义。除非在说明书中另有具体说明，否则碳环基基团可以是可选地取代的。
“环烷基”是指仅由碳和氢原子组成的稳定、非芳族单环或多环完全饱和的烃基团，其可以包括稠合或桥连的环系统，其具有3至20个碳原子，优选地具有3至约12个碳原子，更优选地3至约8个碳原子，并且其通过单键连接至所述分子的其余部分。单环环烷基基团包括(例如)环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环环烷基基团包括(例如)金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚基、双环[3.1.0]己烷、八氢戊搭烯，双环[1.1.1]戊烷、立方烷等。除非在说明书中另有具体说明，否则环烷基基团可以是可选地取代的。“环亚烷基”是指通过在所述环系统中的任何两个碳处键合所述链而插入烷基链的环烷基基团。
“环烯基”是指仅由碳和氢原子组成，具有一个或多个碳-碳双键的稳定、非芳族单环或多环烃基团，其可以包括稠合或桥连的环系统，其具有3至20个碳原子，优选地具有3至10个碳原子并且其通过单键连接至所述分子的其余部分。单环环烯基基团包括(例如)环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基等。多环环烯基基团包括(例如)双环[2.2.1]庚-2-烯基等。除非在说明书中另有具体说明，否则环烯基可以是可选地取代的。
“环炔基”是指仅由碳和氢原子组成，具有一个或多个碳-碳三键的稳定、非芳族单环或多环烃基团，其可以包括稠合或桥连的环系统，其具有3至20个碳原子，优选地具有3至10个碳原子并且其通过单键连接至所述分子的其余部分。单环环炔基基团包括(例如)环庚炔基、环辛炔基等。除非在说明书中另有具体说明，否则环炔基可以是可选地取代的。
“环烷基烷基”或“-烷基环烷基”是指式Rb-Rd所示的基团，其中Rb是如上定义的亚烷基、亚烯基或亚炔基基团，并且Rd是如上定义的环烷基、环烯基、环炔基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则环烷基烷基基团可以是可选地取代的。
“卤代烷基”是指被1、2、3、4、5、6或更多个如上定义的卤代基团取代的如上定义的烷基，例如，三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴甲基等。除非在说明书中另有具体说明，否则卤代烷基基团可以是可选地取代的。
“卤代烯基”是指被1、2、3、4、5、6或更多个如上定义的卤代基团取代的如上定义的烯基，例如，1-氟代丙烯基、1,1-二氟丁烯基等。除非在说明书中另有具体说明，否则卤代烯基基团可以是可选地取代的。
“卤代炔基”是指被1、2、3、4、5、6或更多个如上定义的卤代基团取代的如上定义的炔基，例如，1-氟代丙炔基、1-氟代丁炔基等。除非在说明书中另有具体说明，否则卤代烯基基团可以是可选地取代的。
如(例如)“取代的烷基”中的术语“取代的”是指被一个或多个互不干扰的取代基取代的部分(例如，烷基)，所述取代基如(但不限于)：烷基、C3-8环烷基，例如，环丙基、环丁基等；卤代，例如，氟代、氯代、溴代和碘代；氰基；硝基；烷氧基，低级苯基；取代的苯基；等。“取代的芳基”是具有一个或多个互不干扰的基团作为取代基的芳基。对于苯环上的取代，所述取代基可以处于任何定位(即邻位、间位或对位)。
“互不干扰的取代基”是当存在于分子中时，通常与包含在所述分子中的其它官能团不起反应的那些基团。非限制性实例包括卤素(F、Br、Cl、I)，烷基(例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、s-丁基、戊基、新戊基、己基、异戊基等)、卤代烷基(例如，CF3、CHF2、CH2F等)、环烷基(环丙基、环丁基、环戊基、环己基等)、烷氧基(-OR)、卤代烷氧基(例如，-OCF3、-OCHF2、-OCH2F等)、氨基(例如，-N(H)烷基、-N(烷基)2、-NH(环烷基)、-NH(芳基)等)、酰胺基(例如，-NH(COR)、磺酰基(例如，-SO2R)，酰基(例如，-C(O)R)、氰基、硝基、苯基和杂芳基(例如，噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基等)，其中R独立地为H、烷基、烷氧基、氨基或芳基(例如，苯基)。
“杂环基”、“杂环”或“杂环”是指由2至12个碳原子和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子所组成的稳定3-至20-元非芳族环基团。杂环基或杂环包括如以下所定义的杂芳基。除非在说明书中另有具体说明，否则杂环基基团可以是单环、双环、三环或四环的环系统，其可以包括稠合或桥连的环系统；并且杂环基基团中的氮、碳或硫原子可以可选地被氧化；所述氮原子可以可选地季铵化；并且所述杂环基基团可以是部分或完全饱和的。这些杂环基基团的实例包括(但不限于)二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧哌嗪基、2-氧哌啶基、2-氧吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫吗啉基、1-氧-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。除非在说明书中另有具体说明，否则杂环基基团可以是可选地取代的。在一些实施方式中，“取代的杂环”是具有由互不干扰的取代基所形成的一个或多个侧链的杂环。
术语“羟烷基”或“羟基烷基”是指被一个或多个羟基(-OH)基团取代的烷基。在某些实施方式中，羟烷基基团被1、2、3、4、5或更多个-OH基团取代。羟烷基基团可以可选地被如本文所述的一个或多个其它取代基取代。
术语“烃基”是指一价烃基，不论它是脂族的、部分或完全不饱和的、非环、环或芳族的，或任何上述的组合。在某些实施方式中，烃基基团具有1至40个或更多个，1至30个或更多个，1至20个或更多个或者1至10个或更多个碳原子。术语“亚烃基”是指二价烃基基团。烃基或亚烃基基团可以可选地被如本文所述的一个或多个取代基取代。
术语“杂烃基”是指其中一个或多个碳原子各自独立地被选自氧、硫、氮和磷的杂原子替换的烃基基团。在某些实施方式中，杂烃基基团具有1至40个或更多个，1至30个或更多个，1至20个或更多个或者1至10个或更多个碳原子，和1至10个或更多个或1至5个或更多个杂原子。术语“杂亚烃基”是指二价烃基基团。杂烃基和杂亚烃基基团的实例无限制地包括乙二醇和聚乙二醇部分，如(-CH2CH2O-)nH(一价杂烃基基团)和(-CH2CH2O-)n(二价杂亚烃基基团)，其中n是1至12或以上的整数，以及丙二醇和聚丙二醇部分，如(-CH2CH2CH2O-)nH和(-CH2CH(CH3)O-)nH(一价杂烃基基团)以及(-CH2CH2CH2O-)n和(-CH2CH(CH3)O-)n(二价杂亚烃基基团)，其中n是1至12或以上的整数。杂烃基或杂亚烃基基团可以可选地被如本文所述的一个或多个取代基取代。
“N-杂环基”是指含有至少一个氮并且其中杂环基基团与所述分子的其余部分的连结点是通过所述杂环基基团中的氮原子的如上定义的杂环基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则N-杂环基基团可以是可选地取代的。
“杂环基烷基”或“-烷基杂环基”是指式-Rb-Re所示的基团，其中Rb是如上定义的亚烷基、亚烯基或亚炔基链，并且Re是如上定义的杂环基基团，并且如果所述杂环基是含氮杂环基，则所述杂环基可以在所述氮原子处连接至烷基、烯基、炔基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则杂环基烷基基团可以是可选地取代的。
“杂芳基”是指包含氢原子、1至13个碳原子、1至6个杂原子，优选地选自氮、氧和硫和至少一个芳环的5-至20-元环系统基团。出于本发明公开的目的，所述杂芳基基团可以是单环、双环、三环或四环的环系统，其可以包括稠合或桥连的环系统；并且杂芳基基团中的氮、碳或硫原子可以可选地被氧化；所述氮原子可以可选地季铵化。实例包括(但不限于)氮杂卓基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二噁茂基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚三烯基、1,4-苯并二噁烷、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并二噁茂基、苯并二氧杂环己烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并噻吩基)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并苯硫基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异氮茚基、二氢吲哚基、异二氢氮茚基、异喹啉基、吲哚嗪基、异噁唑基、萘啶基、氧杂二唑基、2-氧代氮杂基、噁唑基、环氧乙烷基、1-氧代吡啶基、1-氧代嘧啶基、1-氧代吡嗪基、1-氧代哒嗪基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、啡噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹唑基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和苯硫基(即噻吩基)。除非在说明书中另有具体说明，否则杂芳基基团可以是可选地取代的。在一些实施方式中，“取代的杂芳基”是具有一个或多个互不干扰的基团作为取代基的杂芳基。
“N-杂芳基”是指含有至少一个氮并且其中杂芳基基团与所述分子的其余部分的连结点是通过所述杂芳基基团中的氮原子的如上定义的杂芳基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则N-杂芳基基团可以是可选地取代的。
“杂芳基烷基”或“-烷基杂芳基”是指式-Rb-Rf所示的基团，其中Rb是如上定义的亚烷基、亚烯基或亚炔基链，并且Rf是如上定义的杂芳基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则杂芳基烷基基团可以是可选地取代的。
本文所使用的术语“取代的”表示任何上述基团(即烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基羰基、硫烷基、芳基、芳烷基、碳环基、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳烷基)，其中至少一个氢原子被本文所提供的列表中的非氢原子的键替换。如果未包括取代基列表，则取代基可以是(但不限于)：卤素原子，如F、Cl、Br和I；氧原子基团，如羟基、烷氧基和酯基中的氧原子；硫原子基团如硫醇基、硫烷基、砜基、磺酰基和亚砜基中的硫原子；氮原子基团如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基氨基、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、亚酰胺和烯胺中的氮原子；硅原子基团如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和多种其它基团中的其它杂原子。“取代的”还表示其中一个或多个氢原子被高键级的键(例如，双-或三-键)替换为杂原子，如以氧(oxo)表示的氧(oxygen)、羰基、羧基和酯基；和基团如亚胺、肟、腙和腈中的氮的任何上述基团。例如，“取代的”包括任何上述基团，其中一个或多个氢原子被卤化物、氰基、硝基、羟基、巯基、氨基、-ORg、-SRg、-NRhRi、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、羟烷基、氨烷基、-烷基环烷基、-烷基杂环基、-烷基芳基、-烷基杂芳基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-C(＝O)Rg、-C(＝NRj)Rg、-S(＝O)Rg、-S(＝O)2Rg、-S(＝O)2ORk、-C(＝O)ORk、-OC(＝O)Rg、-C(＝O)NRhRi、-NRgC(＝O)Rg、-S(＝O)2NRhRi、-NRgS(＝O)2Rg、-OC(＝O)ORg、-OC(＝O)NRhRi、-NRgC(＝O)ORg、-NRgC(＝O)NRhRi、-NRgC(＝NRj)NRhRi、-P(＝O)(Rg)2、-P(＝O)(ORk)Rg、-P(＝O)(ORk)2、-OP(＝O)(Rg)2、-OP(＝O)(ORk)Rg和-OP(＝O)(ORk)2替换，其中：每次出现的Rg独立地选自氢、烷基、卤代烷基、羟烷基、氨烷基、-烷基环烷基、-烷基杂环基、-烷基芳基、-烷基杂芳基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；每次出现的Rh和Ri独立地选自氢、烷基、卤代烷基、羟烷基、氨烷基、-烷基环烷基、-烷基杂环基、-烷基芳基、-烷基杂芳基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，或者Rh和Ri与它们所连接的氮原子一起形成杂环或杂芳基环；每次出现的Rj独立地为氢、-ORg、烷基、卤代烷基、羟烷基、氨烷基、-烷基环烷基、-烷基杂环基、-烷基芳基、-烷基杂芳基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；并且每次出现的Rk独立地为氢、W、烷基、卤代烷基、羟烷基、氨烷基、-烷基环烷基、-烷基杂环基、-烷基芳基、-烷基杂芳基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每次出现的W独立地为H+、Li+、Na+、K+、Cs+、Mg2+、Ca2+或-+N(Rg)2RhRi。
“硫烷基”是指式-SRa所示的基团，其中Ra为如上定义的含有1至12个碳原子的烷基、烯基或炔基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则硫烷基基团可以是可选地取代的。
如本文所使用的“有机基”应包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。
如本文所使用的，符号
Figure BDA0003571026660000231
(在下文中可以称为“连接键点”)表示两个化学实体之间的连接点的键，其中将一个化学实体描述为连接至连接键点，而不将另一个描述为连接至连接键点。例如，
Figure BDA0003571026660000232
表示化学实体“XY”通过连结键点键合至另一个化学实体。此外，可以通过推断指明对未显示的化学实体的具体连结点。例如，化合物CH3-R3，其中R3是H或
Figure BDA0003571026660000233
表示当R3是“XY”时，则连结键点是与将R3描述为键合至CH3的键相同的键。
“稠合的”是指稠合至本发明公开所述的化合物中已有的环状结构的任何本文所述的环状结构。当所述稠环是杂环基环或杂芳基环时，成为稠合杂环基环或稠合杂芳基环的一部分的已有的环状结构上的任何碳原子可以被氮原子替换。
“亲电试剂”和“亲电基团”表示具有能够与亲核试剂反应的亲电中心(即寻求电子的中心)的离子或可以为离子的原子或原子集合。
“亲核试剂”和“亲核基团”是指具有能够与亲电试剂反应的亲核中心(即寻求亲电中心或亲电试剂的中心)的离子或可以为离子的原子或原子集合。
“生理学可切割的”或“可水解的”或“可降解的”键是在生理条件下与水反应(即被水解)的键。在水中水解的键的倾向不仅将取决于连接两个中心原子的键的一般类型，而且还取决于连接至这些中心原子的取代基。适当的水解不稳定键或弱键包括(但不限于)氨基甲酸酯、羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。
“可释放接头”是指将蛋白与大分子连接的接头。通过水解、酶促过程、催化过程或其它方法，释放大分子，借此导致产生了非偶联的蛋白质部分。在某些实施方式中，所述可释放接头通过体内发生的上述过程释放大分子。
“酶促可降解的键”表示经受一种或多种酶的降解的键。
“水解稳定的”键是指化学键，通常共价键，其在水中基本是稳定的，也就是在生理条件下，在长时间内不经历任何明显程度的水解。水解稳定的键的实例包括(但不限于)以下：碳-碳键(例如，脂肪链中)、碳-硫键、醚、酰胺、氨基甲酸酯等。通常，水解稳定的键是在生理条件下，显示出每天小于约1-2％的水解速率的键。代表性的化学键的水解速率可见于大部分标准化学教科书。
“药用赋形剂或载体”是指可以可选地包含在本发明公开所述的组合物中并且不对患者造成明显不利的毒理学作用的赋形剂。“药理学有效量”、“生理学有效量”和“治疗有效量”在本文中可互换使用以表示在血流或在靶组织中提供所期望的偶联物(或相应非偶联蛋白)水平所需的蛋白-大分子偶联物的量。准确的量将基于多种因素，例如，具体的蛋白、治疗性组合物的组分和物理性质、预期患者群体、个体患者的考虑等，并且基于本文所提供的信息，本领域技术人员可以容易地确定所述量。
如本文所使用的术语“IL-2部分”是指具有人IL-2活性的部分。IL-2部分还将具有适合于与聚合试剂反应的至少一个亲电基团或亲核基团。另外，术语“IL-2部分”涵盖了偶联前的IL-2部分和偶联后的IL-2部分残基两者。如以下将进一步详细解释的，本领域的技术人员可以确定任何给定部分是否具有IL-2活性。包含对应于图1中序列的氨基酸序列的蛋白是IL-2部分以及与之基本同源的任何蛋白或多肽。如本文所使用的，术语“IL-2部分”包括有意修饰(例如，通过定点突变)或通过突变偶然修饰的这些蛋白。这些术语还包括具有1至6个额外的糖基化位点的类似物，在蛋白的羧基末端具有至少一个额外的氨基酸的类似物，其中所述额外的氨基酸包括至少一个糖基化位点，和具有包括至少一个糖基化位点的氨基酸序列的类似物。该术语包括天然和重组产生的部分两者。
术语“基本同源”是指特定主题序列，例如，突变体序列与参考序列相差一个或多个替换、缺失或添加，其净效果不会在参考和主题序列之间造成不利的功能差异。出于本发明公开的目的，将具有大于80％(更优选地大于85％，更优选地大于90％，最优选大于95％)的同源等价生物活性(尽管不必需等价的生物活性强度)和等价表达特征的序列认为是基本同源的。出于确定同源性的目的，应忽略成熟序列的截短。
术语“片段”表示具有IL-2部分的部分或片段的氨基酸序列并且具有IL-2的生物活性的任何蛋白或多肽。片段包括通过IL-2部分的蛋白水解降解所产生的蛋白或多肽以及通过本领域中常规方法，通过化学合成所产生的蛋白或多肽。
术语“患者”是指患有或易患通过施用活性剂(例如，偶联物)可以预防或治疗的病况的生物体，并且包括人和动物两者。
“可选的”或“可选地”表示随后所述的状况可以发生或可以不发生，从而该描述包括其中所述状况发生的情况和其中它不发生的情况。
“基本上”表示接近全部或完全，例如，满足以下中的一种或多种：大于所述条件的50％、51％或以上，75％或以上，80％或以上，90％或以上或95％或以上。
如下所示缩写肽中的氨基酸残基：苯丙氨酸为Phe或F；亮氨酸为Leu或L；异亮氨酸为lie或I；蛋氨酸为Met或M；缬氨酸为Val或V；丝氨酸为Ser或S；脯氨酸为Pro或P；苏氨酸为Thr或T；丙氨酸为Ala或A；酪氨酸为Tyr或Y；组氨酸为His或H；谷氨酰胺为Gln或Q；天冬酰胺是Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸是Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸为Cys或C；色氨酸为Trp或W；精氨酸为Arg或R；和甘氨酸为Gly或G。
本发明公开包括本发明公开的所有药用同位素标记化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数，但是原子量或质量数不同于自然界中常见的原子量或质量数的原子替换。适合于在本发明公开所述的化合物中包括的同位素的实例包括氢的同位素，如2H和3H、碳的同位素，如11C、13C和14C、氯的同位素，如36Cl、氟的同位素，如18F、碘的同位素，如123I和125I、氮的同位素，如13N和15N、氧的同位素，如15O、17O和18O、磷的同位素，如32P和硫的同位素，如35S。
本发明公开的某些同位素-标记的化合物，例如，引入放射性同位素的那些在药物和/或底物组织分布研究中是有用的。考虑到它们易于掺入和方便的检测方式，对于该目的，放射性同位素氚，即3H，和碳-14，即14C是特别有用的。
用重同位素，如氘，即2H替换可以由于更大的代谢稳定性而提供某些治疗优势，例如，提高体内半衰期或降低剂量要求，并因此在一些情况下可以是优选的。
通过发射正电子的同位素，如11C、18F、15O和13N的取代可以在用于检查底物受体占用的正电子发射断层扫描(PET)研究中是有用的。
通常可以通过本领域技术人员已知的常规方法制备本发明公开的同位素-标记的化合物。
短语“其对映异构体、对映异构体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、互变异构体、两种或更多种互变异构体的混合物、位置异构体、两种或更多种位置异构体的混合物或同位素变体；或其药用盐、溶剂化物、水合物或前药”具有与短语“(i)其中提及的化合物的对映异构体、对映异构体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、互变异构体、两种或更多种互变异构体的混合物、位置异构体、两种或更多种位置异构体的混合物或同位素变体；(ii)其中提及的化合物的药用盐、溶剂化物、水合物或前药；或者(iii)其中提及的化合物的对映异构体、对映异构体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、互变异构体、两种或更多种互变异构体的混合物、位置异构体、两种或更多种位置异构体的混合物或同位素变体的药用盐、溶剂化物、水合物或前药”具有相同含义。
制备方法
本发明公开提供了制备用于控制释放治疗蛋白剂在施用于需要用该治疗剂治疗的患者时的递送速率的蛋白-[大分子]z偶联物的方法。通过本发明公开的方法制备的偶联物,提供了通过接头的可释放速率和大分子数目控制的、在一段持续时间内递送治疗剂的方式。
在一个方面，本发明公开涉及使用方案(I)制备蛋白-大分子偶联物的方法：
Figure BDA0003571026660000271
其中x是1-25的整数；
y是0-24的整数；
z是1-25的整数；
x＝y+z；
L是接头；
FG0是能够与活性蛋白剂的亲核基团反应以形成键，包括氨基甲酸酯键、硫醇桥等的官能团；
FG2是能够通过点击化学与FG3反应的官能团，其包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基基团(例如，二苯并环辛炔(DBCO))；
FG3是能够通过点击化学与FG2反应的官能团，其包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团；
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽；
所述细胞因子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α或TNF-β。
在某些实施方式中，所述细胞因子是IL-2。
在某些实施方式中，所述IL-2包含与SEQ ID NO:1约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
所述趋化因子包括MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309(CCL1)、BCA1(CXCL13)、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子-1、嗜酸细胞活化趋化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC(CCL20)、ELC(CCL19)、SLC(CCL21)、ENA-78、PBP、TECK(CCL25)、CTACK(CCL27)、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
所述抗体靶向以下中的一种或多种：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受体样激酶1、淀粉状蛋白A蛋白、β–淀粉状蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125(模拟)、C5、CA-125、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C24抗原、CD276、CD278、CD319、艰难梭菌(clostridium difficile)、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、达比加群(Dabigatran)、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、内皮糖蛋白(Endoglin)、上皮唾蛋白(episialin)、EPHA3、c-Met、FGFR2、纤维蛋白IIβ链、FGF 23、叶酸受体1、GMCSF、GD2神经节糖苷、GDF-8、GCGR、明胶酶B、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受体α-链、激肽释放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受体、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干扰素α/β受体、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、乙型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-选择素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、间皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、连接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂酰丝氨酸、RANKL、RTN4、猕猴因子、ROR1、SLAMF7、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)α毒素、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)双组分杀白细胞素、SOST、选择素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受体、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
肽包括(但不限于)：高血糖素样肽1(GLP-1)、艾塞那肽-2、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、心房利钠因子(ANF)、胃饥饿素、加压素、生长激素、生长激素-释放激素(GHRH)、RC-3095、生长抑素、铃蟾肽、PCK-3145、Phe-His-Ser-Cys-Asn(PHSCN)、IGFl、B-型利尿钠肽、肽YY(PYY)、干扰素、血小板反应蛋白、血管生成素、降钙素、促性腺激素释放激素、水蛭素、高血糖素、抗-TNF-α、成纤维细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、奥尼匹肽、垂体甲状腺激素(PTH)、亮脯利特、舍莫瑞林、pramorelin、奈西立肽、罗替加肽、西仑吉肽、MBP-8298、AL-108、恩夫韦地、胸腺法新、daptamycin、HLFI-II、乳铁传递蛋白、地米肽、谷胱甘肽、T细胞表位PR1、蛋白酶-3肽1-11、B细胞表位P3、促黄体激素-释放激素(LHRH)、P物质、神经激肽A、神经激肽B、CCK-8、脑啡肽，包括亮氨酸脑啡肽和蛋氨酸脑啡肽、皮抑菌肽、[des-Ala20,Gln34]-皮抑菌肽、表面活性剂-相关抗微生物阴离子肽、蜜蜂抗菌肽IA；蜜蜂抗菌肽IB；OV-2；1025，乙酰基-粘附素肽(1025-1044)酰胺；Theroma-cin(49-63)；培西加南(MSI-78)；吲哚青霉素；爱帕琳肽-15(63-77)；CFPlO(71-85)；炭疽相关的致死因子(LF)抑制剂；牛抗菌肽；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制剂2；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制剂3；肝炎病毒NS3蛋白酶抑制剂4；NS4A-NS4B丙型肝炎病毒(NS3蛋白酶抑制剂I)；HIV-1、HIV-2蛋白酶底物；抗-FM肽；Bak-BH3；Bax BH3肽(55-74)(野生型)；Bid BH3-r8；CTT(明胶酶抑制剂)；E75(Her-2/neu)(369-377)；GRP78结合嵌合肽基序；p53(17-26)；EGFR2/KDR拮抗剂；Colivelin AGA-(C8R)HNGl 7(人体肽衍生物)；活性-依赖性神经营养性因子(ADNF)；β-分泌酶抑制剂1；β-分泌酶抑制剂2；ch[β]-淀粉状蛋白(30-16)；Humanun(HN)sHNG、[Glyl4]-HN、[Glyl 4]-人体肽；血管紧张素转化酶抑制剂(BPP)；肾素抑制剂III；膜联蛋白I(ANXA-I；Ac2-12)；抗炎肽I；抗炎肽2；抗炎爱帕琳肽12；[D-Phel2,Leul4]-铃蟾肽；黑腹果蝇触足肽(酸)(穿透肽)；黑腹果蝇触足前导肽(CT)；肥硕脱粒肽；硫酸酯化的[Thr28,Nle31]-缩胆囊肽(25-33)；痛敏肽(1-13)(酰胺)；纤维蛋白溶解抑制因子；Γ-纤维蛋白原(377-395)；类爪蟾肽；肥胖抑制素(人)；[Hisl,Lys6]-GHRP(GHRP-6)；[Ala5,[β]-Ala8]-神经激肽A(4-10)；神经调节肽B；神经调节肽C；神经调节肽N；活性-依赖性神经营养性因子(ADNF-14)；Acetalin I(阿片样物质受体拮抗剂1)；Acetalin 2(阿片样物质受体拮抗剂2)；Acetalin 3(阿片样物质受体拮抗剂3)；ACTH(1-39)(人)；ACTH(7-38)(人)；蛙皮降压肽；脂动激素(东亚飞蝗(LocustaMigratoria))；十八烷基化的ADP-核糖基化因子6、myr-ARF6(2-13)；PAMP(1-20)(肾上腺髓质素前体(1-20)人)；AGRP(25-51)；胰淀素(8-37)(人)；血管紧张素I(人)；血管紧张素II(人)；Apstatin(氨肽酶P抑制剂)；沼水蛙抗菌肽-I；蛙皮素I；RL-37；LL-37(抗微生物肽)(人)；天蚕抗菌肽A；抗氧化肽A；抗氧化肽B；L-肌肽；BcI 9-2；NPVF；神经肽AF(hNPAF)(人)；Bax BH3肽(55-74)；bFGF抑制肽；bFGF抑制肽II；血管舒缓激肽；[Des-Argl OJ-HOE 140；半胱天冬氨酸酶I抑制剂II；半胱天冬氨酸酶I抑制剂VIII；Smac N7蛋白(MEKl衍生肽抑制剂I；hBD-1([β]-防御素-1)(人)；hBD-3([β]-防御素-3)(人)；hBD-4([β]-防御素-4)(人)；HNP-I(防御素人嗜中性白细胞肽I)；HNP-2(防御素人嗜中性白细胞肽-2强啡肽A(1-17))；内吗啡肽-I；[β]-内啡肽(人、猪)；内皮素2(人)；纤维蛋白原结合抑制肽；环(-GRGDSP)；TP508(凝血酶-衍生肽)；甘丙肽(人)；GIP(人)；促胃液素释放肽(人)；促胃液素-1(人)；胃饥饿素(人)；PDGF-BB肽；[D-Lys3]-GHRP-6；HCV核心蛋白(1-20)；a3Bl整合素肽片段(325)(酰胺)；层粘连蛋白五肽(酰胺)Mel-anotropin-强化因子(MPF)；VA-[β]-MSH、促脂素-Y(阿黑皮素原-衍生的)；心房钠尿肽(1-28)(人)；血管钠肽(1-27)；[Ala5,B-Ala8]-神经激肽A(4-10)；神经调节肽L(NKA)；Ac-(Leu28,31)-神经肽Y(24-26)；阿利特辛；脑神经肽II；[D-tyrll]-神经降压素；IKKy NEMO结合域(NBD)抑制肽；PTD-p50(NLS)抑制肽；食欲肽A(牛、人、小鼠、大鼠)；食欲肽B(人)；水通道蛋白-2(254-267)(人胰抑素)(37-52)；胰多肽(人)；神经肽；肽YY(3-36)(人)；羟甲基-植物螯合肽2；PACAP(1-27)(酰胺，人、牛、大鼠)；促乳激素释放肽(1-31)(人)；salusin-α；salusin-β；鞘脂活化蛋白C22；胰泌素(人)；L-选择素；Endokinin A/B；Endokinin C(人)；Endokinin D(人)；凝血酶受体(42-48)激动剂(人)；LSKL(血小板反应蛋白的抑制剂)；促甲状腺素释放激素(TRH)；P55-TNFR片段；尿紧张素II(人)；VIP(人、猪、大鼠)；VIP拮抗剂；毒蜥素；艾塞那肽；ZPlO(AVEOOIOO)；普兰林肽；AC162352(PYY)(3-36)；PYY；奥尼匹肽；高血糖素；GRP；胃饥饿素(GHRP6)；亮脯利特；组氨瑞林；缩宫素；阿托西班(RWJ22164)；舍莫瑞林；奈西立肽；比伐卢定(水蛭肽)；艾替班特；Aviptadin；罗替加肽(ZP123、GAP486)；西仑吉肽(EMD-121924、RGD肽)；AlbuBNP；BN-054；血管紧张素II；MBP-8298；肽亮氨酸精氨酸；齐考诺肽；AL-208；AL-108；Carbeticon；三肽；SAL；Coliven；人体肽；ADNF-14；VIP(血管活性肠肽)；胸腺法新；杆菌肽；短杆菌肽；培西加南(MSI-78)；Pl 13；PAC-113；SCV-07；HLFl-Il(乳铁传递蛋白)；DAPTA；TRI-1144；Tritrpticin；抗炎素2；Gattex(替度鲁肽，ALX-0600)；Stimuvax(L-BLP25)；Chrysalin(TP508)；Melanonan II；Spantide II；蓝肽；辛卡利特；五肽胃泌素；胰泌素；内皮抑素肽；E-选择素；HER2；IL-6；IL-8；IL-10；PDGF；血小板反应蛋白；uPA(I)；uPA(2)；VEGF；VEGF(2)；五肽-3；XXLRR；β-淀粉状蛋白原纤维形成；内吗啡肽-2；TIP 39(结节漏斗部神经肽)；PACAP(1-38)(酰胺，人、牛、大鼠)；TGFB激活肽；胰岛素敏化因子(ISF402)；转化生长因子BI肽(TGF-B1)；雨蛙素释放因子；IELLQAR(8-branchMAPS)；替加泊肽PK3145；戈舍瑞林；阿巴瑞克；西曲瑞克；加尼瑞克；地加瑞克(曲普瑞林)；巴芦西班(FE 200440)；促生长激素释放肽；奥曲肽；依替巴肽；Netamiftide(INN-00835)；Daptamycin；Spantide II；地米肽(RDP-58)；AL-209；恩夫韦地；IDR-I；六胜肽-6；胰岛素-A链；兰瑞肽；六[ρ]肽-3；胰岛素B-链；甘精胰岛素-A链；甘精胰岛素-B链；胰岛素-赖脯人胰岛素B-链类似物；胰岛素-天冬胰岛素B-链类似物；胰岛素-赖谷胰岛素B链类似物；胰岛素-地特胰岛素B链类似物；生长抑素肿瘤抑制类似物；胰抑素(37-52)；血管活性肠肽片段(KKYL-NH2)；和强啡肽A。适合于在本发明公开中使用的蛋白的实例包括(但不限于)：免疫毒素SSlP、腺苷脱氨酶、精氨酸酶等。
所述大分子可以是水溶性聚合物、脂质、蛋白或多肽。在一些实施方式中，所述大分子包括包含约6至约26个碳原子的脂肪酸，选自下列的聚合物：2-甲丙烯酰-氧乙基磷酰胆碱、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸脂)、聚(丙烯酰胺)、聚(N-丙烯酰吗啉)、聚(烷氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(磷酸三乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(a-羟酸)、聚(羟乙基丙烯酸脂)、聚(羟乙基噁唑啉)、聚(羟基甲基丙烯酸酯)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(羟丙基噁唑啉)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有机磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚磷腈、聚(丙二醇)、聚(糖)、聚(硅氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲醚)、聚(乙烯吡硌烷酮)、硅酮、直链淀粉、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、壳多糖、壳聚糖、葡聚糖、糊精、明胶、透明质酸(HA)和衍生物、官能化透明质酸、甘露聚糖、果胶、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、鼠李聚糖半乳糖醛酸、淀粉、羟烷基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸(PSA)及其它碳水化合物-基聚合物、木聚糖和共聚物。
所述大分子还可以是选自下列的蛋白或多肽：白蛋白、转铁蛋白、甲状腺素运载蛋白、免疫球蛋白、XTEN肽、富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白-样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。
在某些实施方式中，接头L是可释放接头(RL)的残基。
在某些实施方式中，x或z是2或更大。在某些实施方式中，x或z是3或更大。在某些实施方式中，x或z是4或更大。在某些实施方式中，x或z是5或更大。在某些实施方式中，x或z是6或更大。在某些实施方式中，x或z大于6。
在某些实施方式中，本文所述的制备方法涉及包括蛋白与多个双官能接头的偶联的第一步。预计由于接头较小的尺寸，与蛋白和大分子的直接偶联相比，上述偶联过程更有效并且可以实现更高的偶联程度。还如本文所述的，所公开的方法的第二步可采用能够将接头与大分子高效率连接的点击化学。不受任何具体理论的束缚，据信该方法提供了采用空间位阻减小的优势，因此这可以改善反应效率。此外，所述合成和纯化步骤是简化且成本较低的，因此该方法提供了用于聚合物-蛋白治疗剂的大规模生产和制造的显著优势。
双官能可释放接头
本发明公开所述的偶联物可以衍生自双官能可释放接头。
在一些方面，本发明公开涉及式(I)所示的双官能可释放接头：
Figure BDA0003571026660000331
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
X1是第一间隔子部分；
X2是第二间隔子部分；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
Re是电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；
a是0至4的整数；
b是1至3的整数；
c是0至1的整数；
FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放键，如氨基甲酸酯键的官能团；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团。
在式(I)的一些实施方式中，R1和R2各自独立地为C1-5烷基、取代的C1-5烷基、C2-6烯基，取代的C2-6烯基、C2-6炔基，取代的C2-6炔基、苯基或取代的苯基。在某些实施方式中，R1和R2各自独立地为C1-5烷基或取代的C1-5烷基。
在式(I)的一些实施方式中，Re是硝基、氰基、卤素、-CONH(C1-5烷基)或-CONH(苯基)、取代的-CONH(C1-5烷基)或-CONH(苯基)、-SO2NH(C1-5烷基)或-SO2NH(苯基)、取代的-SO2NH(C1-5烷基)或-SO2NH(苯基)、-SO2(C1-5烷基)或-SO2(苯基)、取代的-SO2(C1-5烷基)或-SO2(苯基)、C1-5烷氧基、取代的C1-5烷氧基、C1-5烷基或C3-6环烷基、取代的C1-5烷基或C3-6环烷基、苯基或5-至6-元杂芳基或取代的苯基或5-至6-元杂芳基。
在式(I)的一些实施方式中，a是0至3的整数。在一些实施方式中，a是0至2的整数。在一些实施方式中，a是0。在一些实施方式中，a是1。在一些实施方式中，a是2。在一些实施方式中，a是3。在一些实施方式中，a是4。
在式(I)的一些实施方式中，b是1或2的整数。在一些实施方式中，b是1。在一些实施方式中，b是2。在一些实施方式中，b是3。
在式(I)的一些实施方式中，在一些实施方式中，c是0。在一些实施方式中，c是1。
在式(I)的一些实施方式中，X1和X2各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是不同的间隔子部分。
在式(I)内，提供了具有更限定的结构的双官能可释放接头：
Figure BDA0003571026660000351
其中每一个X1是第一间隔子部分；X2是第二间隔子部分；R1、R2、[Re]a、FG1和FG2如先前所定义的。
在式(I)、(I-B)或(I-C)的某些实施方式中，a是0至2的整数；R1和R2各自独立地为H、Me或Et；并且Re为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
在式(I)、(I-B)或(I-C)的某些实施方式中，所述双官能可释放接头具有以下结构：
Figure BDA0003571026660000352
在另一个方面，本发明公开涉及式(XVIII)所示的双官能可释放接头：
Figure BDA0003571026660000361
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
X1是间隔子部分；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
Re是电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；
a是0至4的整数；
c是2；
FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放键的官能团；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团。
在式(XVIII)的某些实施方式中，a是0至2的整数；R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且Re为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
在式(XVIII)的某些实施方式中，所述双官能可释放接头具有以下结构之一：
Figure BDA0003571026660000371
在另一个方面，本发明公开涉及式(II)所示的双官能可释放接头：
Figure BDA0003571026660000372
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
X2，当存在时，是第二间隔子部分；
X3，当存在时，是第三间隔子部分；
FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放键，如氨基甲酸酯键的官能团；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团。
在式(II)的一些实施方式中，R1和R2各自独立地为C1-5烷基、取代的C1-5烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C2-6炔基、苯基或取代的苯基。在某些实施方式中，R1和R2各自独立地为C1-5烷基或取代的C1-5烷基。
在式(II)的一些实施方式中，Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、卤代烷基(例如，-CF3、-CHF2、-CH2F、-CH2F)、-OC1-5烷基、-O-卤代烷基(例如，-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCH2F)、-NH(C1-5烷基)、-NHCO(C1-5烷基)、-NHSO2(C1-5烷基)、-CONH(C1-5烷基)或-SO2NH(C1-5烷基)。在某些实施方式中，Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
在式(II)的一些实施方式中，X2和X3各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是不同的间隔子部分。
在式(II)的某些实施方式中，a1和a2各自独立地为0至2的整数；R1和R2各自独立地为H、Me或Et；并且Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
其它示例性双官能接头属于以下式(II-A)或(II-B)：
Figure BDA0003571026660000391
其中Re是氢或电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基。在某些实施方式中，Re是氢或氟代。
Figure BDA0003571026660000392
可以根据US20060293499A1中所述的程序制备这些提供可释放键的试剂。
在另一个方面，本发明公开涉及式(III)所示的双官能可释放接头：
Figure BDA0003571026660000393
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rp是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团；和
FG4是能够与活性剂的氨基反应以形成酰胺键的官能团。
在式(III)的一些实施方式中，R1、R2和Rp各自独立地为C1-5烷基、取代的C1-5烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C2-6炔基、苯基或取代的苯基。在某些实施方式中，R1和R2各自独立地为C1-5烷基或取代的C1-5烷基。
在式(III)的一些实施方式中，Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、卤代烷基(例如，-CF3、-CHF2、-CH2F、-CH2F)、-OC1-5烷基、-O-卤代烷基(例如，-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCH2F)、-NH(C1-5烷基)、-NHCO(C1-5烷基)、-NHSO2(C1-5烷基)、-CONH(C1-5烷基)或-SO2NH(C1-5烷基)。在某些实施方式中，Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
在式(III)的一些实施方式中，X2和X3各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是不同的间隔子部分。
在式(III)的某些实施方式中，a1和a2各自独立地为0至2的整数；R1和R2各自独立地为H、Me或Et；并且Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
示例性的双官能可释放接头属于以下式(III-A)：
Figure BDA0003571026660000411
在另一个方面，本发明公开涉及式(IV)所示的双官能可释放接头：
Figure BDA0003571026660000412
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R3是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R4是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
c是0至4的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rd是硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或环烷基、取代的烷基或环烷基、芳基或杂芳基或者取代的芳基或杂芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放键，如氨基甲酸酯键的官能团；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团。
在式(IV)的一些实施方式中，R1、R2、R3和R4各自独立地为C1-5烷基、取代的C1-5烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C2-6炔基、苯基或取代的苯基。在某些实施方式中，R1、R2、R3和R4各自独立地为C1-5烷基或取代的C1-5烷基。
在式(IV)的一些实施方式中，Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、卤代烷基(例如，-CF3、-CHF2、-CH2F、-CH2F)、-OC1-5烷基、-O-卤代烷基(例如，-OCF3、-OCHF2、-OCH2F、-OCH2F)、-NH(C1-5烷基)、-NHCO(C1-5烷基)、-NHSO2(C1-5烷基)、-CONH(C1-5烷基)或-SO2NH(C1-5烷基)。在某些实施方式中，Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
在式(IV)的一些实施方式中，Rd是硝基、氰基、卤素、-CONH(C1-5烷基)或-CONH(苯基)、取代的-CONH(C1-5烷基)或-CONH(苯基)、-SO2NH(C1-5烷基)或-SO2NH(苯基)、取代的-SO2NH(C1-5烷基)或-SO2NH(苯基)、-SO2(C1-5烷基)或-SO2(苯基)、取代的-SO2(C1-5烷基)或-SO2(苯基)、C1-5烷氧基、取代的C1-5烷氧基、C1-5烷基或C3-6环烷基、取代的C1-5烷基或C3-6环烷基、苯基或5-至6-元杂芳基或取代的苯基或5-至6-元杂芳基。
在式(IV)的一些实施方式中，X2和X3各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是不同的间隔子部分。
使用可释放接头，如式(III)和式(IV)所示的，其优势在于具备改善稳定性的潜力，其提供了持续药物释放并最终延长了治疗效力。因此，本发明公开所述的接头提供了优于现有技术的那些的聚合物-蛋白治疗剂的稳定性和储存优势。
具有可释放接头的聚合试剂
本发明公开还涉及可以衍生自具有可释放接头的聚合试剂的偶联物。
在一些方面，本发明公开涉及式(V)所示的具有可释放接头的聚合试剂：
Figure BDA0003571026660000441
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔子部分；
X2是第二间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R3是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R4是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1是0至3的整数；
a2是0至3的整数；
c是0至4的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rd是硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或环烷基、取代的烷基或环烷基、芳基或杂芳基、取代的芳基或杂芳基；和
FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放的键，如氨基甲酸酯键的官能团。
在一些实施方式中，R1、R2、R3、R4、Re1、Re2和Rd如以上式(IV)中所定义。
在式(V)的一些实施方式中，Re1和Re2是相同的电子改变基团。在一些实施方式中，Re1和Re2是不同的电子改变基团。
在式(V)的一些实施方式中，POLY1和POLY2各自独立地选自本文所述的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY1和POLY2是相同的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY1和POLY2是不同的水溶性聚合物。
在式(V)的一些实施方式中，X1和X2各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是不同的间隔子部分。示例性的聚合试剂属于以下式(V-A)：
Figure BDA0003571026660000451
其中n独立地为4至1500的整数，例如，4、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500，包括它们之间的所有范围和数值。
具有两个可释放键的其它聚合试剂涵盖了以下式(VI)：
Figure BDA0003571026660000461
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔子部分；
X2是第二间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1是0-3的整数；
a2是0-3的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rp是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；和
FG4是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放的键，如酰胺键的官能团。
在式(VI)的一些实施方式中，R1、R2和Rp各自独立地为C1-5烷基、取代的C1-5烷基、C2-6烯基、取代的C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C2-6炔基、苯基或取代的苯基。在某些实施方式中，R1、R2、R3和R4各自独立地为C1-5烷基或取代的C1-5烷基。
在式(VI)的一些实施方式中，Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CONH(C1-5烷基)或-CONH(苯基)、取代的-CONH(C1-5烷基)或-CONH(苯基)、-SO2NH(C1-5烷基)或-SO2NH(苯基)、取代的-SO2NH(C1-5烷基)或-SO2NH(苯基)、-SO2(C1-5烷基)或-SO2(苯基)、取代的-SO2(C1-5烷基)或-SO2(苯基)、C1-5烷氧基、取代的C1-5烷氧基、C1-5烷基或C3-6环烷基、取代的C1-5烷基或C3-6环烷基、苯基或5-至6-元杂芳基或取代的苯基或5-至6-元杂芳基。
在式(VI)的一些实施方式中，POLY1和POLY2各自独立地选自本文所述的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY1和POLY2是相同的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY1和POLY2是不同的水溶性聚合物。
在式(VI)的一些实施方式中，X1和X2各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是不同的间隔子部分。
示例性的聚合试剂属于以下式(VI-A)：
Figure BDA0003571026660000481
其中n独立地为4至1500的整数，例如，4、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500，包括它们之间的所有范围和数值。
蛋白-接头偶联物
在一些实施方式中，本发明公开提供了偶联物，所述偶联物包含与一个或多个接头共价连接的蛋白的残基，其中所述偶联物包含根据式(XIX)的结构：
蛋白-(L)z
(XIX)
或其立体异构体、位置异构体、互变异构体或它们的混合物，或它们的同位素变体；或其药用盐、溶剂化物、水合物或前药；
其中：
z是1至25的整数；
L是接头；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
本文所述的偶联物是来自方案(I)的步骤1合成的产物。在某些实施方式中，所述接头是非可释放接头。在某些实施方式中，所述接头是可释放接头。在一些实施方式中，所述可释放接头是本文所公开的双官能可释放接头(例如，式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示的接头)的衍生物。
在某些实施方式中，所述接头共价连接至所述蛋白内的残基的胺基。在某些实施方式中，所述残基是赖氨酸。在某些实施方式中，提供了包含含有不同数目的连接至蛋白的接头的偶联物的混合物的组合物。
使用与蛋白缀合的提供双官能可释放键的试剂所形成的示例性偶联物包括式(VII)所示的那些：
Figure BDA0003571026660000491
其中：
X1是第一间隔子部分；
X2，当存在时，是第二间隔子部分；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
Re是电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；
a是0至5的整数；
b是0至3的整数；
c是0至2的整数；
z是1至25的整数；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团；
-NH-是所述蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，R1、R2、和Re如以上式(I)中所定义的。
在式(VII)的一些实施方式中，a是0至4的整数。在一些实施方式中，a是0至3的整数。在一些实施方式中，a是0至2的整数。在一些实施方式中，a是0。在一些实施方式中，a是1。在一些实施方式中，a是2。在一些实施方式中，a是3。在一些实施方式中，a是4。在一些实施方式中，a是5。
在式(VII)的一些实施方式中，b是0至2的整数。在一些实施方式中，b是0。在一些实施方式中，b是1。在一些实施方式中，b是2。在一些实施方式中，b是3。
在式(VII)的一些实施方式中，c是0或1。在一些实施方式中，c是0。在一些实施方式中，c是1。在一些实施方式中，c是2。
在式(VII)的一些实施方式中，z是1至20的整数。在一些实施方式中，z是1至15的整数。在一些实施方式中，z是1至10的整数。在一些实施方式中，z是1至8的整数。在一些实施方式中，z是1至5的整数。
常规技术人员将认识到本文所述的a、b、c和z的值和范围可以以任何方式组合以提供本发明公开的偶联物。例如，在一些实施方式中，a是0至2的整数，b是0或1，c是0或1，并且z是1至25的整数。在一些实施方式中，a是1，b是1，c是1，并且z是1至25的整数。在一些实施方式中，a是1，b是0，c是1，并且z是1至25的整数。在一些实施方式中，a是1，b是1，c是0，并且z是1至25的整数。在本发明公开中考虑了这些和多种其它组合。在一些实施方式中，X1和X2各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是不同的间隔子部分。
在式(VII)内，将具有更限定的结构的偶联物考虑为式(VII-A)、(VII-B)、(VII-C)或(VII-D)：
Figure BDA0003571026660000511
其中X1是第一间隔子部分；X2是第二间隔子部分；R1、R2、Re、a、z、Y1、Y2、FG2和蛋白如以上式(VII)中所定义。
在式(VII)、(VII-A)、(VII-B)、(VII-C)或(VII-D)的某些实施方式中，a是0至2的整数；R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且Re为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
其它示例性偶联物具有以下结构(VII-A1)：
Figure BDA0003571026660000521
其中，Re是电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；z是1-25的整数；“-NH-”代表一种或多种接头单独连接至的蛋白质部分。在某些实施方式中，其中a是1至2的整数；并且Re为4-F、4-Cl、4-CF3、2,4-二氟或2-CF3-4-F取代基。
其它示例性偶联物具有以下结构：
Figure BDA0003571026660000522
Figure BDA0003571026660000531
使用提供双官能可释放键的试剂所形成的其它示例性偶联物包括以下式(VIII)所示的那些：
Figure BDA0003571026660000532
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团；
-NH-是蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，R1、R2、Re1和Re2如以上式(VI)中所定义。
在式(VIII)的某些实施方式中，a1和a2各自独立地为0至2的整数；R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
在式(VIII)内，具有更限定的结构的偶联物为式(VIII-A)：
Figure BDA0003571026660000541
使用提供两种可释放键的试剂所形成的其它示例性偶联物包括以下式(IX)所示的那些：
Figure BDA0003571026660000551
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rp是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团；
-NH-是蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，R1、R2、Rp、Re1和Re2如以上式(VI)中所定义。
在式(IX)的某些实施方式中，其中a1和a2各自独立地为0至2的整数；R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
在式(IX)内，具有更限定的结构的偶联物如以下式(IX-A)所示：
Figure BDA0003571026660000561
使用提供两种可释放键的试剂所形成的其它示例性偶联物包括以下式(X)所示：
Figure BDA0003571026660000562
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R3是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R4是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
c是0至4的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rd是硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或环烷基、取代的烷基或环烷基、芳基或杂芳基、取代的芳基或杂芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
Y4是O或S；
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团；
-NH-是蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，R1、R2、R3、R4、Rd、Re1和Re2如以上式(IV)中所定义。
在本文所公开的式的某些实施方式中，z是1至22，1至20，1至18，1至15，1至12，1至10，1至8，1至5或1至3的整数，其中z代表缀合至蛋白的可释放接头的数目。
蛋白-大分子偶联物
在本发明公开的一个或多个实施方式中，提供了蛋白-大分子偶联物，所述偶联物包含蛋白、至少一种接头和至少一种水溶性聚合物，其中所述蛋白通过接头共价连接至每个水溶性聚合物，其中所述大分子是直链或支链水溶性聚合物。在某些实施方式中，所述至少一种接头是两种或更多种接头。在某些实施方式中，所述两种或更多种接头包含至少一种非可释放接头。在某些实施方式中，所述两种或更多种接头包含至少一种可释放接头。在某些实施方式中，所述两种或更多种接头包含至少一种非可释放接头和一种可释放接头。在某些实施方式中，所述两种或更多种接头包含至少一种非可释放接头和1至8种可释放接头。
在某些实施方式中，所述至少一种接头是非可释放接头。在某些实施方式中，所述至少一种接头是可释放接头。在某些实施方式中，每个所述接头是可释放接头。在某些实施方式中，一个或多个大分子通过一个或多个接头共价连接至所述蛋白。在某些实施方式中，8个或更多个大分子通过8个或更多个接头共价连接至所述蛋白。
在某些实施方式中，所述大分子通过接头共价连接至所述蛋白内的残基的胺基。在某些实施方式中，所述残基是赖氨酸。在某些实施方式中，所述偶联物是包含不同数目的连接至所述蛋白的大分子的偶联物的混合物。
在多个实施方式中，所述大分子是水溶性聚合物、脂质、蛋白或多肽。它可以包括任何以下化合物：包含约6至约26个碳原子的脂肪酸，选自下列的聚合物之一：2-甲丙烯酰-氧乙基磷酰胆碱、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸脂)、聚(丙烯酰胺)、聚(N-丙烯酰吗啉)、聚(烷氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(磷酸三乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(a-羟酸)、聚(羟乙基丙烯酸脂)、聚(羟乙基噁唑啉)、聚(羟基甲基丙烯酸酯)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(羟丙基噁唑啉)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有机磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚磷腈、聚(丙二醇)、聚(糖)、聚(硅氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲醚)、聚(乙烯吡硌烷酮)、硅酮、直链淀粉、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、壳多糖、壳聚糖、葡聚糖、糊精、明胶、透明质酸(HA)和衍生物、官能化透明质酸、甘露聚糖、果胶、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、鼠李聚糖半乳糖醛酸、淀粉、羟烷基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸(PSA)及其它碳水化合物-基聚合物、木聚糖，以及白蛋白、转铁蛋白、甲状腺素运载蛋白、免疫球蛋白、XTEN肽的共聚物、富甘氨酸高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白-样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。
在某些实施方式中，所述大分子是水溶性聚合物。在某些实施方式中，所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。在某些实施方式中，用选自下列的封端部分对聚(乙二醇)封端：羟基、烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基。
对于所述水溶性聚合物，所述水溶性聚合物是无毒的、非天然存在的和生物相容的。对于生物相容性，如果通过临床医师，例如，医师，的评价，与所述物质单独或与另一种与生命组织有关的物质(例如，活性剂，如IL-2部分)一起的使用(例如，向患者施用)有关的有益作用大于任何有害作用，则认为该物质是生物相容的。对于非免疫原性，如果所述物质在预期体内的使用不产生不期望的免疫应答(例如，抗体的形成)，或者如果产生免疫应答，但如临床医师所评价的，不认为这种应答是临床显著的或重要的，则认为该物质是非免疫原性的。特别优选地，非肽水溶性聚合物是生物相容的和非免疫原性的。
此外，所述聚合物的特征通常在于具有2至约300个末端。这些聚合物的实例包括(但不限于)聚(烷撑二醇)，如聚乙二醇(“PEG”)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚乙烯吡咯烷酮、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(a-羟酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(“POZ”)(其在WO 2008/106186中有描述)、聚(N-丙烯酰吗啉)和任何上述的组合。
所述水溶性聚合物不局限于特定结构并且可以是直链的(例如，封端的，例如，烷氧基PEG或双官能PEG)、支链或多臂的(例如，叉状PEG或连接至多元醇芯的PEG)、树枝状(或星形)结构，其每个具有或不具有一个或多个可降解键。此外，可以以任意数目的不同的重复模式组织所述水溶性聚合物的内部结构并且所述内部结构可以选自均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚体、无规三聚体和嵌段三聚体。
活化的PEG及其它活化的水溶性聚合物(即聚合试剂)用适合于偶联至所述蛋白上所期望的位点的适合的活化基团来活化。因此，聚合试剂将具有用于与蛋白质部分反应的反应基团。用于将这些聚合物偶联至活性部分的代表性聚合试剂和方法在本领域中是已知的并且进一步描述于Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and BiomedicalApplications,J.M.Harris,Plenus Press,New York(1992)Zalipsky,S.等人,“Use ofFunctionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides”和Zalipsky(1995)Advanced Drug Reviews 16:157-182中。适合于偶联至蛋白质部分的示例性激活基团包括羟基、马来酰亚胺、酯、乙缩醛、缩酮、胺、羧基、醛、醛合水、酮、烯基酮、硫酮、硫醇、乙烯砜、肼等。
通常，所述偶联物中的所述水溶性聚合物的重均分子量为约100道尔顿至约150,000道尔顿。然而，示例性范围包括约500道尔顿至小于20,000道尔顿的范围内，约20,000道尔顿至小于85,000道尔顿的范围内，约85,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围内，大于5,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围内，约6,000道尔顿至约90,000道尔顿的范围内，约10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内，大于10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内，约20,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内，约53,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内，约25,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内，约29,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内，约35,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内和约40,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内的重均分子量。对于任何给定水溶性聚合物，PEG的优选分子量在这些范围中的一个或多个中。
示例性的水溶性聚合物的重均分子量包括约100道尔顿，约200道尔顿，约300道尔顿，约400道尔顿，约500道尔顿，约600道尔顿，约700道尔顿，约750道尔顿，约800道尔顿，约900道尔顿，约1,000道尔顿，约1,500道尔顿，约2,000道尔顿，约2,200道尔顿，约2,500道尔顿，约3,000道尔顿，约4,000道尔顿，约4,400道尔顿，约4,500道尔顿，约5,000道尔顿，约5,500道尔顿，约6,000道尔顿，约7,000道尔顿，约7,500道尔顿，约8,000道尔顿，约9,000道尔顿，约10,000道尔顿，约11,000道尔顿，约12,000道尔顿，约13,000道尔顿，约14,000道尔顿，约15,000道尔顿，约16,000道尔顿，约18,000道尔顿，约20,000道尔顿，约22,500道尔顿，约25,000道尔顿，约30,000道尔顿，约35,000道尔顿，约40,000道尔顿，约45,000道尔顿，约50,000道尔顿，约55,000道尔顿，约60,000道尔顿，约65,000道尔顿，约70,000道尔顿和约75,000道尔顿。还可以使用具有任何上述总分子量的水溶性聚合物的支链形式(例如，由两个20,000道尔顿聚合物组成的支链40,000道尔顿水溶性聚合物)。
当用作所述聚合物时，PEG通常将包含一定数目的(OCH2CH2)单体[或(CH2CH2O)单体，取决于如何定义PEG]。如在整个描述中所使用的，通过“(OCH2CH2)n”中的下标“n”来表示重复单元的数目。因此，(n)值通常在以下范围中的一个或多个内：2至约3400，约100至约2300，约100至约2270，约136至约2050，约225至约1930，约450至约1930，约1200至约1930，约568至约2727，约660至约2730，约795至约2730，约795至约2730，约909至约2730和约1,200至约1,900。对于其中分子量已知的任何给定聚合物，可以通过将所述聚合物的总重均分子量除以重复单体的分子量来确定重复单元的数目(即“n”)。
用于在本发明公开中使用的一个特别优选的聚合物是封端聚合物，即具有至少一个用相对惰性的基团，如低级C1-6烷氧基(尽管还可以使用羟基)封端的末端的聚合物。当所述聚合物是PEG时，例如，优选地使用甲氧基-PEG(通常称为mPEG)，它是其中所述聚合物的一个末端为甲氧基(-OCH3)，而另一个末端是羟基或可以可选地化学修饰的其它官能团的PEG的直链形式。
在本发明公开的一个或多个实施方式中有用的一种形式中，游离或结合的PEG是在每个末端用羟基封端的直链聚合物。
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，
其中(n)通常在0至约4,000的范围内。
可以用简明形式，如HO-PEG-OH表示上述聚合物，α-,ω-二羟基聚(乙二醇)，其中应理解-PEG-符号可以表示以下结构单元：
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，
其中(n)如以上定义。
在本发明公开的一个或多个实施方式中有用的另一种类型的PEG是甲氧基-PEG-OH或mPEG-OH，简要地，其中一个末端是相对惰性的甲氧基，而另一个末端是羟基。以下提供了mPEG-OH的结构。
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
其中(n)如以上定义。
在本发明公开的一个或多个实施方式中有用的另一种类型的PEG是甲氧基-PEG-NH2或mPEG-NH2，简要地，其中一个末端是相对惰性的甲氧基，而另一个末端是氨基。以下提供了mPEG-NH2的结构。
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH2
其中(n)如以上定义。
在本发明公开的一个或多个实施方式中有用的另一种类型的PEG是甲氧基-PEG-CO2H或mPEG-CO2H，简要地，其中一个末端是相对惰性的甲氧基，而另一个末端是羧基。以下提供了mPEG-CO2H的结构。
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-CO2H
其中(n)如以上定义。
在本发明公开的一个或多个实施方式中有用的另一种类型的PEG是甲氧基-PEG-N3或mPEG-N3，简要地，其中一个末端是相对惰性的甲氧基，而另一个末端是叠氮基。以下提供了mPEG-N3的结构。
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-N3
其中(n)如以上定义。
在本发明公开的一个或多个实施方式中有用的另一种类型的PEG是甲氧基-PEG-DBCO或mPEG-DBCO，简要地，其中一个末端是相对惰性的甲氧基，而另一个末端是二苯并环辛炔(DBCO)基团。以下提供了mPEG-DBCO的结构的一个实例。
Figure BDA0003571026660000631
其中(n)如以上定义。
多臂或支链PEG分子，如美国专利号5,932,462中所述的那些也可以用作PEG聚合物。例如，PEG可以具有以下结构：
Figure BDA0003571026660000632
其中：
polya和polyb是PEG主链(相同或不同的)，如甲氧基聚(乙二醇)；R'是非反应性部分，如H、甲基或PEG主链；并且P和Q是非反应性键。
另外，PEG可以包含叉状PEG。通过以下结构表示叉状PEG的实例：
Figure BDA0003571026660000633
其中：X是一个或多个原子的间隔子部分并且每个Z是通过限定长度的原子链连接至CH的激活的末端基团。国际专利申请公开WO 99/45964公开了能够在本发明公开的一个或多个实施方式中使用的多种叉状PEG结构。将Z官能团连接至支链碳原子的原子链用作连接基团，并且可以包括(例如)烷基链、醚链、酯链、酰胺链及其组合。
PEG聚合物可以包含具有沿PEG长度，而不是在PEG链末端共价连接的反应基团，如羧基,的侧基PEG分子。侧基反应基团可以直接或通过间隔子部分，如亚烷基基团连接至PEG。
作为聚合物骨架内的可降解键和/或作为与蛋白质部分连接的可降解键有用的一些水解可降解键包括：酯键、碳酸酯键；从(例如)胺和醛的反应获得的亚胺键(参见，例如，Ouchi等人(1997)Polymer Preprints38(1):582-3)；例如，通过醇与磷酸基的反应所形成的磷酸酯键；通常通过酰肼和醛的反应所形成的腙键；通常通过醛和醇之间的反应所形成的乙缩醛键；例如，通过甲酸酯和醇之间的反应所形成的原酸酯键；通过(例如)聚合物(如PEG)末端的胺基与另一个PEG链的羧基所形成的酰胺键；由(例如)具有末端异氰酸酯基的PEG和PEG醇的反应所形成的氨基甲酸酯键；通过(例如)聚合物(如PEG)末端的胺基和肽的羧基所形成的肽键；和通过(例如)位于(例如)聚合物末端的亚磷酰胺基与寡核苷酸的5'羟基所形成的寡核苷酸键。
通过施用偶联物的这些可选的特征，即一个或多个可降解键向聚合物链或向蛋白质部分的引入，可以对偶联物最终所期望的药理学性质提供额外的控制。例如，可以施用大且相对惰性的偶联物(即，具有一个或多个与之连接的高分子量PEG链，例如，一个或多个分子量大于约10,000的PEG链，其中所述偶联物基本上不具有生物活性)，以其释放而产生具有部分原始PEG链的有生物活性的偶联物。以这种方式，可以更有效地调节所述偶联物的性质以平衡所述偶联物随时间的生物活性。
与偶联物结合的水溶性聚合物可以是“可释放的”。即，释放水溶性聚合物(通过水解、酶促过程、催化过程或其它方法)，借此导致产生了非偶联的蛋白质部分。在一些情况下，可释放聚合物在体内与蛋白质部分分离，从而不会留下任何水溶性聚合物片段。在其它实例中，可释放聚合物在体内与蛋白质部分分离，从而留下来自水溶性聚合物的相对小的片段(例如，琥珀酸酯标签)。示例性的可切割聚合物包括通过氨基甲酸酯键连接至蛋白质部分的聚合物。
本领域那些技术人员将认识到以上有关水溶性聚合物的讨论决不是穷举的并且仅是说明性的，并且考虑了具有如上所述的质量的所有聚合物材料。如本文所使用的，术语“聚合试剂”一般地表示整个分子，其可以包含水溶性聚合物部分和官能团。
如上所述，本发明公开的偶联物可以包含共价连接至蛋白质部分的多个水溶性聚合物。在一些实施方式中，共价连接至蛋白质部分的多个水溶性聚合物是相同的。在一些实施方式中，共价连接至蛋白质部分的多个水溶性聚合物中的至少一个是不同的。通常，对于任何给定偶联物，将存在共价连接至一个或多个具有蛋白活性的部分的一个或多个水溶性聚合物。在一些情况下，所述偶联物可以具有单独连接至蛋白质部分的1、2、3、4、5、6、7、8或更多个水溶性聚合物。可以将任何给定水溶性聚合物共价连接至蛋白质部分的氨基酸，或者当所述蛋白质部分是(例如)糖蛋白时，连接至所述蛋白质部分的碳水化合物。可以(例如)使用利用唾液酸-叠氮化物化学的代谢官能化[Luchansky等人(2004)Biochemistry 43(38):12358-123661]或其它适合的方法，如使用缩水甘油以有利于醛基的引入[Heldt等人(2007)European Journal of Organic Chemistry 32:5429-5433]来实现与碳水化合物的连接。
所述蛋白质部分和所述聚合物内具体的键取决于一些因素。这些因素包括(例如)所使用的具体的键的化学、具体的蛋白质部分、所述蛋白质部分内可用的官能团(对于与接头、聚合物的连接或向适合连接位点的转化)、所述蛋白质部分内其它反应性官能团的存在等。
本发明公开所述的偶联物可以是前药，这表示所述聚合物和所述蛋白质部分之间的键是可释放的以允许母体部分的释放。除了本发明公开中所述的可释放接头之外，其它示例性可释放键可以包括羧酸酯、磷酸酯、硫酯、酸酐、乙缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。可以通过蛋白质部分(例如，蛋白的羧基C末端或者蛋白内所含的氨基酸，如丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基，或者碳水化合物内的类似官能性)的适当修饰和/或使用本领域中常用的偶联方法的聚合试剂来容易地制备这些键。然而，最优选的可释放键是通过适当激活的聚合物与蛋白质部分内所含的未修饰的官能团的反应所容易形成的可释放键。
作为另外一种选择，还可以将水解稳定的键，如酰胺、氨基甲酸酯(urethane)(也称为氨基甲酸酯(carbamate))、胺、硫醚(thioether)(也称为硫醚(sulfide))或脲(也称为尿素)键用作用于偶联蛋白质部分的键。优选的水解稳定的键是酰胺。在一种方法中，具有激活的酯的水溶性聚合物可以与蛋白质部分上的胺基反应，借此导致产生酰胺键。另一种优选的水解稳定的键是硫醇桥。
所述偶联物(与非偶联的蛋白质部分相反)可以具有或可以不具有可测量程度的蛋白活性。也就是，根据本发明公开的聚合物-蛋白偶联物将具有约0.1％至约100％，包括约0.1％，约0.5％，约1％，约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约55％或约100％中任何数量的未修饰的母体蛋白质部分的生物活性。在一些情况下，所述聚合物-蛋白偶联物可以具有大于100％的未修饰的母体蛋白质部分的生物活性。优选地，几乎不或不具有蛋白活性的偶联物含有将聚合物连接至蛋白的可水解键，从而不考虑所述偶联物中活性的缺乏(或相对缺乏)，通过所述可水解键的水解引起的切割释放活性母体分子(或其衍生物)。基于具体蛋白的已知活性，可以使用适合的体内或体外模型确定这种活性。
对于具有将蛋白偶联至聚合物的水解稳定的键的偶联物，所述偶联物通常将具有可测量程度的生物活性。例如，这些偶联物的特征通常在于相对于非缀合蛋白，具有满足以下百分比中的一种或多种的生物活性：至少约2％，至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％，至少约100％和大于105％(当在适合的模型中测量时，如在本领域中熟知的那些)。优选地，具有水解稳定的键(例如，酰胺键、硫醇桥)的偶联物将具有至少一定程度的未修饰的母体蛋白的生物活性。
蛋白和水溶性聚合物之间通过接头的连接可以是直接的，其中在所述接头和所述聚合物之间不存在间隔原子，或者是间接的，其中在所述键和所述聚合物之间存在一个或多个原子。对于间接连接，“间隔子部分”可以用作键的残基和水溶性聚合物之间的接头。构成间隔子部分的一个或多个原子可以包括碳原子、氮原子、硫原子、氧原子中的一个或多个及其组合。间隔子部分可以包含酰胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚、二硫基和/或点击化学产物组。具体的间隔子部分的非限制性实例包括选自下列中的那些：-O-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH2-、-CH2-C(O)-O-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-、-C(O)-O-CH2-CH2-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-[CH2]l-(OCH2CH2)m-、二价环烷基、-O-、-S-、氨基酸、-N(R3)-，以及任何上述基团中的两种或更多种的组合，其中R3是H或选自下列的有机基：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基，(l)是0至6，并且(m)是0至20。其它具体的间隔子部分具有以下结构：-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-和-O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-，其中每个亚甲基后的下标值表示所述结构中所含的亚甲基的数目，例如，(CH2)1-6表示所述结构可以含有1、2、3、4、5或6个亚甲基。另外，任何上述间隔子部分还可以包含含有1至20个环氧乙烷单体单元的环氧乙烷寡聚物链[即-(CH2CH2O)1-20]。也就是说，所述环氧乙烷寡聚物链可以出现在所述间隔子部分之前或之后，并且可选地在由两个或更多个原子组成的间隔子部分的任何两个原子之间。另外，如果所述寡聚物邻近于聚合物部分，则寡聚物链将不会被认为是所述间隔子部分的一部分，并且仅表示所述聚合物部分的扩展。
一般的蛋白-大分子偶联物包含根据式(XX)的结构：
蛋白-(L-大分子)z
(XX)
或其立体异构体、位置异构体、互变异构体或它们的混合物，或它们的同位素变体；或其药用盐、溶剂化物、水合物或前药；
其中：
z是1至25的整数；
L是接头；
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽；和
大分子是水溶性聚合物、脂质、蛋白或多肽。
在一些实施方式中，接头L是本发明公开所述的接头。在一些实施方式中，L是一种或多种非可释放接头和/或一种或多种可释放接头。在一些实施方式中，所述一种或多种可释放接头衍生自本发明公开所述的双官能可释放接头(例如，式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示的接头)和/或具有可释放接头的聚合试剂(例如，式(V)或式(VI))。
在一些实施方式中，z是1至20的整数。在一些实施方式中，z是1至15的整数。在一些实施方式中，z是1至10的整数。在一些实施方式中，z是1至8的整数。在一些实施方式中，z是1至5的整数。
在一些实施方式中，当z为2或以上时，连接至所述蛋白的每个L-大分子是相同的。在一些实施方式中，当z为2或以上时，连接至所述蛋白的至少一个L-大分子是不同的。在一些实施方式中，当z为2或以上时，连接至所述蛋白的每个L-大分子是不同的。
结构式XX所示的示例性蛋白-大分子偶联物涵盖了以下结构：
Figure BDA0003571026660000691
其中：
n为2至4000的整数；
X是间隔子部分；
RL是可释放接头；
z是1至25的整数；
-NH-是所述蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，RL是本发明公开所述的可释放接头。在一些实施方式中，所述可释放接头衍生自本文所公开的双官能可释放接头(例如，式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示的接头)和具有可释放接头的聚合试剂(例如，式(V)或式(VI))。
在另一个方面，式XX所示的示例性蛋白-大分子偶联物涵盖了以下结构：
Figure BDA0003571026660000692
其中：
n为2至4000的整数；
X是间隔子部分；
RL1是第一可释放接头；
RL2是第二可释放接头；
z是1至25的整数；
-NH-是所述蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
本发明公开的示例性偶联物其中那些所述水溶性聚合物中具有支链结构的涵盖了包括以下所述水溶性聚合物的结构：
Figure BDA0003571026660000701
其中Y＝O和NH；每个(n)独立地为具有2至4000的值的整数，例如，2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000，包括它们之间的所有值和范围。
本发明公开的示例性偶联物其中那些所述水溶性聚合物中具有支链结构的涵盖了包括以下所述水溶性聚合物的结构：
Figure BDA0003571026660000702
其中每个(n)独立地为具有2至4000的值的整数，例如，2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000，包括它们之间的所有值和范围。
使用可提供两个释放键的聚合试剂所形成的示例性蛋白-大分子偶联物包括以下式(XI)所示的那些：
Figure BDA0003571026660000703
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔子部分；
X2是第二间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
Y4是O或S；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R3是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R4是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1是0至3的整数；
a2是0至3的整数；
c是0至4的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rd是硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或环烷基、取代的烷基或环烷基、芳基或杂芳基、取代的芳基或杂芳基；
-NH-是所述蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，R1、R2、R3、R4、Re1、Re2和Rd如以上式(IV)中所定义。
在式(XI)的一些实施方式中，POLY1和POLY2各自独立地选自本文所述的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY1和POLY2是相同的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY1和POLY2是不同的水溶性聚合物。
在式(XI)的一些实施方式中，X1和X2各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是不同的间隔子部分。
示例性偶联物具有以下结构(XI-A)：
Figure BDA0003571026660000721
其中n独立地为4至1500的整数并且z是1至25的整数。
使用可提供两个释放键的聚合试剂所形成的其它示例性偶联物包括以下式(XII)所示的那些：
Figure BDA0003571026660000731
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔子部分；
X2是第二间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1是0-3的整数；
a2是0-3的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rp是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；和
-NH-是所述蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，R1、R2、Re1、Re2和Rp如以上式(VI)中所定义。
在式(XII)的一些实施方式中，POLY1和POLY2各自独立地选自本文所述的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY1和POLY2是相同的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY1和POLY2是不同的水溶性聚合物。
在式(XII)的一些实施方式中，X1和X2各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是不同的间隔子部分。
示例性偶联物具有以下结构(XII-A)：
Figure BDA0003571026660000741
其中n独立地为4至1500的整数并且z是1至25的整数。
使用适合的聚合试剂通过点击化学所形成的示例性偶联物包括以下式(XIII)所示的那些：
Figure BDA0003571026660000751
其中：
POLY1是第一直链或支链水溶性聚合物；
POLY2是第二直链或支链水溶性聚合物；
X1是第一间隔子部分；或-X-FG2；
X2，当存在时，是第二间隔子部分；
T1是第一三唑官能团；
T2是第二三唑官能团；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
Re是电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；和-X-FG2；
其中：
X是间隔子部分；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团。
a是0至5的整数；
b是0至3的整数；
c是0至2的整数；
z是1至25的整数；
Y1是O或S；
Y2是O或S；和
-NH-是蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，R1、R2、Re、a、b、c和z如以上式(I)中所定义的。
在式(XIII)的一些实施方式中，POLY1和POLY2各自独立地选自本文所述的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY1和POLY2是相同的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY1和POLY2是不同的水溶性聚合物。
在式(XIII)的一些实施方式中，X1和X2各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X1和X2是不同的间隔子部分。
在式(XIII)内，具有更限定的结构的偶联物可考虑为式(XIII-A)、(XIII-B)、(XIII-C)或(XIII-D)：
Figure BDA0003571026660000761
Figure BDA0003571026660000771
其中每个X1是第一间隔子部分；X2是第二间隔子部分；POLY1、POLY2、T1、T2、R1、R2、Re、a、z、Y1、Y2和蛋白如以上所定义。
在式(XIII)、(XIII-A)、(XIII-B)、(XIII-C)或(XIII-D)的某些实施方式中，a是0至2的整数；R1和R2各自独立地为氢，Me或Et；并且Re为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
进一步的示例性偶联物具有以下结构(XIII-A1)：
Figure BDA0003571026660000772
其中，Re是电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；n独立地为4至1500的整数；z是1至25的整数；并且“-NH-”是所述蛋白内的残基的胺基并且表示所述蛋白单独连接一个或多个聚合物。在某些实施方式中，a是1至2的整数；Re是4-F、4-Cl、4-CF3、2,4-二氟代或2-CF3-4-F取代基。
其它示例性偶联物具有以下作为(XIII-B1)、(XIII-C1)、(XIII-D1)或(XIII-D2)的结构：
Figure BDA0003571026660000781
Figure BDA0003571026660000791
其中：
n独立地为4至1500的整数；
z是1至25的整数；和
-NH-是所述蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
通过点击化学，使用适合的聚合试剂所形成的其它示例性偶联物包括以下式(XIV)所示的那些：
Figure BDA0003571026660000801
其中：
POLY2是直链或支链水溶性聚合物；
POLY3是直链或支链水溶性聚合物；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；或-X-FG2；
其中
X是间隔子部分；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团。
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
T2是三唑官能团；
T3是三唑官能团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；和
-NH-是所述蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，R1、R2、Re1和Re2如以上式(VI)中所定义。
在式(XIV)的一些实施方式中，POLY2和POLY3各自独立地选自本文所述的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY2和POLY3是相同的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY2和POLY3是不同的水溶性聚合物。
在式(XIV)的一些实施方式中，X2和X3各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是不同的间隔子部分。
在式(XIV)的某些实施方式中，a1和a2各自独立地为0至2的整数；R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
在式(XIV)内，将具有更限定的结构的偶联物考虑为式(XIV-A)：
Figure BDA0003571026660000811
其中n独立地为4至1500的整数；z是1至25的整数；并且-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
通过点击化学，使用适合的聚合试剂所形成的其它示例性偶联物包括以下式(XV)所示的那些：
Figure BDA0003571026660000821
其中：
POLY2是直链或支链水溶性聚合物；
POLY3是直链或支链水溶性聚合物；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；或-X-FG2；
其中
X是间隔子部分；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团。
Rp是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
T2是三唑官能团；
T3是三唑官能团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；和
-NH-是所述蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，R1、R2、Rp、Re1和Re2如以上式(VI)中所定义。
在式(XV)的一些实施方式中，POLY2和POLY3各自独立地选自本文所述的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY2和POLY3是相同的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY2和POLY3是不同的水溶性聚合物。
在式(XV)的一些实施方式中，X2和X3各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是不同的间隔子部分。
在式(XV)的某些实施方式中，a1和a2各自独立地为0至2的整数；R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
在式(XV)内，具有更限定的结构的偶联物如以下式(XV-A)所示：
Figure BDA0003571026660000831
其中n独立地为4至1500的整数；z是1至25的整数，并且-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
通过点击化学，使用适合的聚合试剂所形成的其它示例性偶联物包括以下式(XVI)所示的那些：
Figure BDA0003571026660000841
其中：
POLY2是直链或支链水溶性聚合物；
POLY3是直链或支链水溶性聚合物；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R3是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R4是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
c是0至4的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；或-X-FG2；
其中
X是间隔子部分；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其独立地包括(但不限于)叠氮化物、炔基和环炔基(例如，二苯并环辛炔(DBCO))基团。
Rd是硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或环烷基、取代的烷基或环烷基、芳基或杂芳基、取代的芳基或杂芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
T2是三唑官能团；
T3是三唑官能团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
Y4是O或S；和
-NH-是所述蛋白内残基的胺基；和
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
在一些实施方式中，R1、R2、R3、R4、Rd、Re1和Re2如以上式(IV)中所定义。
在式(XVI)的一些实施方式中，POLY2和POLY3各自独立地选自本文所述的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY2和POLY3是相同的水溶性聚合物。在一些实施方式中，POLY2和POLY3是不同的水溶性聚合物。
在式(XVI)的一些实施方式中，X2和X3各自独立地选自本文所述的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是相同的间隔子部分。在一些实施方式中，X2和X3是不同的间隔子部分。
在一些实施方式中，所述蛋白是细胞因子。所述细胞因子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α或TNF-β。在某些实施方式中，所述细胞因子是IL-2。在某些实施方式中，所述IL-2包含与SEQ ID NO:1约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方式中，所述蛋白是趋化因子。所述趋化因子包括MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309(CCL1)、BCA1(CXCL13)、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子-1、嗜酸细胞活化趋化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC(CCL20)、ELC(CCL19)、SLC(CCL21)、ENA-78、PBP、TECK(CCL25)、CTACK(CCL27)、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
在一些实施方式中，所述蛋白是抗体。所述抗体可以靶向以下中的一种或多种：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受体样激酶1、淀粉状蛋白A蛋白、β-淀粉状蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125(模拟)、C5、CA-125、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C242抗原、CD276、CD278、CD319、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、达比加群(Dabigatran)、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、内皮糖蛋白(Endoglin)、上皮唾蛋白(episialin)、EPHA3、c-Met、FGFR2、纤维蛋白IIβ链、FGF 23、叶酸受体1、GMCSF、GD2神经节糖苷、GDF-8、GCGR、明胶酶B、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受体α-链、激肽释放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受体、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干扰素α/β受体、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、乙型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-选择素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、间皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、连接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂酰丝氨酸、RANKL、RTN4、猕猴因子、ROR1、SLAMF7、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)α毒素、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)双组分杀白细胞素、SOST、选择素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受体、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
在一些实施方式中，所述蛋白是治疗性肽。肽包括(但不限于)：高血糖素样肽1(GLP-1)、艾塞那肽-2、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、心房利钠因子(ANF)、胃饥饿素、加压素、生长激素、生长激素-释放激素(GHRH)、RC-3095、生长抑素、铃蟾肽、PCK-3145、Phe-His-Ser-Cys-Asn(PHSCN)、IGFl、B-型利尿钠肽、肽YY(PYY)、干扰素、血小板反应蛋白、血管生成素、降钙素、促性腺激素释放激素、水蛭素、高血糖素、抗-TNF-α、成纤维细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、奥尼匹肽、垂体甲状腺激素(PTH)、亮脯利特、舍莫瑞林、pramorelin、奈西立肽、罗替加肽、西仑吉肽、MBP-8298、AL-108、恩夫韦地、胸腺法新、daptamycin、HLFI-II、乳铁传递蛋白、地米肽、谷胱甘肽、T细胞表位PR1、蛋白酶-3肽1-11、B细胞表位P3、促黄体激素-释放激素(LHRH)、P物质、神经激肽A、神经激肽B、CCK-8、脑啡肽，包括亮氨酸脑啡肽和蛋氨酸脑啡肽、皮抑菌肽、[des-Ala20,Gln34]-皮抑菌肽、表面活性剂-相关抗微生物阴离子肽、蜜蜂抗菌肽IA；蜜蜂抗菌肽IB；OV-2；1025，乙酰基-粘附素肽(1025-1044)酰胺；Theroma-cin(49-63)；培西加南(MSI-78)；吲哚青霉素；爱帕琳肽-15(63-77)；CFPlO(71-85)；炭疽相关的致死因子(LF)抑制剂；牛抗菌肽；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制剂2；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制剂3；肝炎病毒NS3蛋白酶抑制剂4；NS4A-NS4B丙型肝炎病毒(NS3蛋白酶抑制剂I)；HIV-1、HIV-2蛋白酶底物；抗-FM肽；Bak-BH3；Bax BH3肽(55-74)(野生型)；BidBH3-r8；CTT(明胶酶抑制剂)；E75(Her-2/neu)(369-377)；GRP78结合嵌合肽基序；p53(17-26)；EGFR2/KDR拮抗剂；Colivelin AGA-(C8R)HNGl 7(人体肽衍生物)；活性-依赖性神经营养性因子(ADNF)；β-分泌酶抑制剂1；β-分泌酶抑制剂2；ch[β]-淀粉状蛋白(30-16)；Humanun(HN)sHNG、[Glyl4]-HN、[Glyl 4]-人体肽；血管紧张素转化酶抑制剂(BPP)；肾素抑制剂III；膜联蛋白I(ANXA-I；Ac2-12)；抗炎肽I；抗炎肽2；抗炎爱帕琳肽12；[D-Phel2,Leul4]-铃蟾肽；黑腹果蝇触足肽(酸)(穿透肽)；黑腹果蝇触足前导肽(CT)；肥硕脱粒肽；硫酸酯化的[Thr28,Nle31]-缩胆囊肽(25-33)；痛敏肽(1-13)(酰胺)；纤维蛋白溶解抑制因子；Γ-纤维蛋白原(377-395)；类爪蟾肽；肥胖抑制素(人)；[Hisl,Lys6]-GHRP(GHRP-6)；[Ala5,[β]-Ala8]-神经激肽A(4-10)；神经调节肽B；神经调节肽C；神经调节肽N；活性-依赖性神经营养性因子(ADNF-14)；Acetalin I(阿片样物质受体拮抗剂1)；Acetalin 2(阿片样物质受体拮抗剂2)；Acetalin 3(阿片样物质受体拮抗剂3)；ACTH(1-39)(人)；ACTH(7-38)(人)；蛙皮降压肽；脂动激素(东亚飞蝗(Locusta Migratoria))；十八烷基化的ADP-核糖基化因子6、myr-ARF6(2-13)；PAMP(1-20)(肾上腺髓质素前体(1-20)人)；AGRP(25-51)；胰淀素(8-37)(人)；血管紧张素I(人)；血管紧张素II(人)；Apstatin(氨肽酶P抑制剂)；沼水蛙抗菌肽-I；蛙皮素I；RL-37；LL-37(抗微生物肽)(人)；天蚕抗菌肽A；抗氧化肽A；抗氧化肽B；L-肌肽；BcI 9-2；NPVF；神经肽AF(hNPAF)(人)；Bax BH3肽(55-74)；bFGF抑制肽；bFGF抑制肽II；血管舒缓激肽；[Des-Argl OJ-HOE 140；半胱天冬氨酸酶I抑制剂II；半胱天冬氨酸酶I抑制剂VIII；Smac N7蛋白(MEKl衍生肽抑制剂I；hBD-1([β]-防御素-1)(人)；hBD-3([β]-防御素-3)(人)；hBD-4([β]-防御素-4)(人)；HNP-I(防御素人嗜中性白细胞肽I)；HNP-2(防御素人嗜中性白细胞肽-2强啡肽A(1-17))；内吗啡肽-I；[β]-内啡肽(人、猪)；内皮素2(人)；纤维蛋白原结合抑制肽；环(-GRGDSP)；TP508(凝血酶-衍生肽)；甘丙肽(人)；GIP(人)；促胃液素释放肽(人)；促胃液素-1(人)；胃饥饿素(人)；PDGF-BB肽；[D-Lys3]-GHRP-6；HCV核心蛋白(1-20)；a3Bl整合素肽片段(325)(酰胺)；层粘连蛋白五肽(酰胺)Mel-anotropin-强化因子(MPF)；VA-[β]-MSH、促脂素-Y(阿黑皮素原-衍生的)；心房钠尿肽(1-28)(人)；血管钠肽(1-27)；[Ala5,B-Ala8]-神经激肽A(4-10)；神经调节肽L(NKA)；Ac-(Leu28,31)-神经肽Y(24-26)；阿利特辛；脑神经肽II；[D-tyrll]-神经降压素；IKKy NEMO结合域(NBD)抑制肽；PTD-p50(NLS)抑制肽；食欲肽A(牛、人、小鼠、大鼠)；食欲肽B(人)；水通道蛋白-2(254-267)(人胰抑素)(37-52)；胰多肽(人)；神经肽；肽YY(3-36)(人)；羟甲基-植物螯合肽2；PACAP(1-27)(酰胺，人、牛、大鼠)；促乳激素释放肽(1-31)(人)；salusin-α；salusin-β；鞘脂活化蛋白C22；胰泌素(人)；L-选择素；Endokinin A/B；Endokinin C(人)；Endokinin D(人)；凝血酶受体(42-48)激动剂(人)；LSKL(血小板反应蛋白的抑制剂)；促甲状腺素释放激素(TRH)；P55-TNFR片段；尿紧张素II(人)；VIP(人、猪、大鼠)；VIP拮抗剂；毒蜥素；艾塞那肽；ZPlO(AVEOOIOO)；普兰林肽；AC162352(PYY)(3-36)；PYY；奥尼匹肽；高血糖素；GRP；胃饥饿素(GHRP6)；亮脯利特；组氨瑞林；缩宫素；阿托西班(RWJ22164)；舍莫瑞林；奈西立肽；比伐卢定(水蛭肽)；艾替班特；Aviptadin；罗替加肽(ZP123、GAP486)；西仑吉肽(EMD-121924、RGD肽)；AlbuBNP；BN-054；血管紧张素II；MBP-8298；肽亮氨酸精氨酸；齐考诺肽；AL-208；AL-108；Carbeticon；三肽；SAL；Coliven；人体肽；ADNF-14；VIP(血管活性肠肽)；胸腺法新；杆菌肽；短杆菌肽；培西加南(MSI-78)；Pl 13；PAC-113；SCV-07；HLFl-Il(乳铁传递蛋白)；DAPTA；TRI-1144；Tritrpticin；抗炎素2；Gattex(替度鲁肽，ALX-0600)；Stimuvax(L-BLP25)；Chrysalin(TP508)；Melanonan II；Spantide II；蓝肽；辛卡利特；五肽胃泌素；胰泌素；内皮抑素肽；E-选择素；HER2；IL-6；IL-8；IL-10；PDGF；血小板反应蛋白；uPA(I)；uPA(2)；VEGF；VEGF(2)；五肽-3；XXLRR；β-淀粉状蛋白原纤维形成；内吗啡肽-2；TIP39(结节漏斗部神经肽)；PACAP(1-38)(酰胺，人、牛、大鼠)；TGFB激活肽；胰岛素敏化因子(ISF402)；转化生长因子BI肽(TGF-B1)；雨蛙素释放因子；IELLQAR(8-branchMAPS)；替加泊肽PK3145；戈舍瑞林；阿巴瑞克；西曲瑞克；加尼瑞克；地加瑞克(曲普瑞林)；巴芦西班(FE200440)；促生长激素释放肽；奥曲肽；依替巴肽；Netamiftide(INN-00835)；Daptamycin；Spantide II；地米肽(RDP-58)；AL-209；恩夫韦地；IDR-I；六胜肽-6；胰岛素-A链；兰瑞肽；六[ρ]肽-3；胰岛素B-链；甘精胰岛素-A链；甘精胰岛素-B链；胰岛素-赖脯人胰岛素B-链类似物；胰岛素-天冬胰岛素B-链类似物；胰岛素-赖谷胰岛素B链类似物；胰岛素-地特胰岛素B链类似物；生长抑素肿瘤抑制类似物；胰抑素(37-52)；血管活性肠肽片段(KKYL-NH2)；和强啡肽A。适合于在本发明公开中使用的蛋白的实例包括(但不限于)：免疫毒素SSlP、腺苷脱氨酶、精氨酸酶等。
IL-2-大分子偶联物
转向本发明公开的一个或多个实施方式，提供了更具体的蛋白质-大分子偶联物，所述偶联物包含通过接头共价连接至水溶性聚合物的IL-2部分残基。本发明公开的偶联物将具有以下特征中的一种或多种。
IL-2部分
如上所述，所述偶联物通常包含通过可释放或非可释放接头共价连接至一个或多个水溶性聚合物的IL-2部分残基。如本文所使用的，术语“IL-2部分”应表示偶联前的IL-2部分以及连接至水溶性聚合物之后的IL-2部分。然而，将理解当原始IL-2部分连接至水溶性聚合物时，IL-2部分由于与和所述聚合物的连接有关的一个或多个共价键的存在而轻微改变。通常，连接至另一种分子的IL-2部分的这种轻微改变形式被称为IL-2部分的“残基”。
所述IL-2部分可以来源于非重组方法和重组方法，并且本发明公开就此不受限制。另外，IL-2部分可以来源于人来源、动物来源和植物来源。
非重组和重组方法获得的任何IL-2部分可以在制备本文所述的偶联物中用作IL-2部分。
基于用于表达具有IL-2活性的蛋白的系统，IL-2部分可以是未糖基化的或糖基化的并且可以使用任一种。即IL-2部分可以是未糖基化的或IL-2部分可以是糖基化的。在本发明公开的一个或多个实施方式中，IL-2部分是未糖基化的。
IL-2部分可以被有利地修改，来包括和/或替换一个或多个氨基酸残基，(例如)赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸和/或精氨酸，从而使聚合物与氨基酸侧链内原子之间更容易连接。在美国专利号5,206,344中描述了IL-2部分的替换实例。另外，可以修饰IL-2部分以包括非天然存在的氨基酸残基。在WO 2019/028419中描述了有非天然存在的氨基酸残基取代的IL-2部分的实例。用于添加氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基的技术对于本领域那些技术人员是熟知的。参考J.March,Advanced Organic IL-2mistry:Reactions Mechanismsand Structure,第4版.(New York:Wiley-Interscience,1992)。
另外，官能团的连接也可以有利地修饰IL-2部分(除通过含有官能团的氨基酸残基的添加外)。例如，可以修饰IL-2部分以包括硫醇基团。另外，可以修饰IL-2部分以包括N末端α碳。另外，可以修饰IL-2部分以包括一个或多个碳水化合物部分。另外，可以修饰IL-2部分以包括醛基。另外，可以修饰IL-2部分以包括酮基。在本发明公开的某些实施方式中，优选地IL-2部分是未被一个或多个包括硫醇基团、N末端α碳、碳水化合物、醛基和酮基修饰的。
在文献和(例如)美国专利号5,116,943、5,153,310、5,635,597、7,101,965和7,567,215以及美国专利申请公开号2010/0036097和2004/0175337中描述了示例性IL-2部分。优选的IL-2部分具有对应于图1的氨基酸序列。
在一些情况下，IL-2部分可以处于“单体”形式，其中，相应肽的单一表达被组织成单独的单元。在其它情况下，IL-2部分可以处于“二聚体”的形式(例如，重组IL-2的二聚体)，其中所述蛋白的两个单体彼此结合(例如，通过二硫键)。例如，在重组人IL-2二聚体的背景中，所述二聚体可以处于通过由每个单体的Cys 125残基所形成的二硫键彼此结合的两个单体的形式。
另外，IL-2的前体形式可以用作IL-2部分。任何上述序列的截短形式、杂交变体和肽模拟物也可以用作IL-2部分。维持至少一些IL-2活性的任何上述形式的生物活性片段、缺失变体、替换变体或添加变体也可以用作IL-2部分。
对于任何给定肽或蛋白质部分，是可能确定该部分是否具有IL-2活性的。在本领域中描述了用于确定体外IL-2活性的多种方法。示例性方法是以下实验中所述的CTLL-2细胞增殖测定。在Moreau等人(1995)Mol.Immunol.32:1047-1056)中描述了示例性方法。本领域中已知的其它方法也可以用于评价IL-2功能，包括量电法、分光光度法、色谱法和放射性测量法。
现在，将描述根据本发明公开的更具体的示例性偶联物。通常，预期该IL-2部分(至少部分)具有与图1中所提供的序列类似的氨基酸序列。因此，尽管参考了图1序列内的具体位置或原子，但是该参考仅是为了方便并且本领域常规技术人员将能够容易地确定具有IL-2活性的其它部分中的相应位置或原子。具体地，本文对于天然人IL-2所提供的描述通常适用于任何上述的片段、缺失变体、替换变体或添加变体。
偶联物组装
IL-2部分上的氨基提供了IL-2部分和水溶性聚合物之间的连结点。使用图1中所提供的氨基酸序列，显然存在几个赖氨酸残基，在每个赖氨酸残基中具有可以对于偶联可用的ε-氨基酸。此外，任何蛋白的N末端胺也可以用作连结点。
有一些适合的试剂，能够用于与IL-2部分的可用的胺形成共价可释放键。在下表1中提供了与相应偶联物一起的非限制性具体实例。在表中，变量“n”代表重复单体单元的数目，z是1至25的整数，并且“-NH-IL-2”代表缀合至聚合物试剂或接头的IL-2部分的残基，并且形成单独连接至一个或多个水溶性聚合物或者连接至一个或多个接头后的IL-2部分。尽管表1所提供的每个聚合物部分[例如，(OCH2CH2)n或(CH2CH2O)n]的末端为“CH3”基，但是也可以替换成其它基团(如H和苄基)。
表1
胺选择性偶联剂的实例和由此所形成的IL-2部分偶联物
Figure BDA0003571026660000921
Figure BDA0003571026660000931
Figure BDA0003571026660000941
可以通过多种技术实现试剂与IL-2部分的氨基的偶联。在一个方法中，IL-2部分可以偶联至通过琥珀酰亚胺基衍生物(或其它激活的酯基，其中可以使用与对于这些替代的含有激活的酯基的试剂所述的那些类似的方法)官能化的偶联剂。在该方法中，具有琥珀酰亚胺基衍生物的试剂可以在pH 7至9.0的水媒介中连接至IL-2部分，尽管使用不同的反应条件(例如，更低的pH，如6至7或者不同温度和/或小于15℃的温度)可以导致试剂连接至IL-2部分的不同位置。
由于在IL-2上存在多个氨基位点，因此可以使用过量当量的试剂实现所公开的偶联剂对IL-2部分的不止一个的官能化。与IL-2部分的多个氨基的缀合需要非常高当量的聚合物试剂(例如，100eq)。双官能接头试剂的使用可以更有效地实现IL-2部分的高官能化。
通常，双官能接头试剂可以具有琥珀酰亚胺基衍生物和适合于点击化学的反应基团。双官能试剂与IL-2部分的氨基通过NHS偶联的缀合可以实现IL-2部分的多个官能化。随后，使用与适合的聚合物试剂的点击化学反应可以提供高聚合衍生化的IL-2。下表2提供了一些非限制性具体实例与相应偶联物。在下表中，变量(n)表示重复单体单元的数目，z是1至25的整数，并且“-NH-IL-2”代表具有单独连接的一个或多个水溶性聚合物的IL-2部分。尽管表2所提供的每个聚合物部分[例如，(OCH2CH2)n或(CH2CH2O)n]的末端为“CH3”基，但是可以替换其它基团(如H和苄基)。
表2
IL-2接头偶联物和由此所形成的IL-2聚合物偶联物
Figure BDA0003571026660000951
Figure BDA0003571026660000961
点击化学可用于位点特定的PEG化。通过将含有叠氮化物的非天然氨基酸，即高叠氮基丙氨酸加入重组蛋白，经过与炔烃-PEG分子进行位点特定的偶联来实现位点特定的PEG化。
Cu-催化的点击反应的一个主要缺点在于需要高毒性的铜(I)以及Cu(II)。甚至少量的铜可以损害蛋白，特别是荧光蛋白，如GFP。另外，可能需要还原剂、配体和无氧条件的存在。
一种可以达到与Cu-催化的点击反应类似的效率，同时维持蛋白存活力来实现位点特定的PEG化的方法是环辛炔的引入，其中八元环中的张力使得能够在不存在催化剂的情况下，在4℃或在室温下与叠氮化物发生反应。二苄基环辛炔(所谓的DBCO)属于这类反应性环辛炔。
DBCO-PEG分子使得能够在温和反应条件下进行与含有叠氮化物的蛋白的无Cu-PEG化。相应的，由于点击化学的固有选择性，PEG分子与叠氮化物残基的共价连接是高效且高度位点特定的。
使用点击-PEG化将多个叠氮化物官能化的IL-2(IL-2-接头偶联物)以高效率转化成多个PEG化的偶联物(IL-2-聚合物偶联物)。当叠氮化物和非对称的1,2-二取代的炔烃，如DBCO，之间发生点击反应时，本领域技术人员将理解作为产物可以获得两种位置异构化合物。位置异构体的差异在于所形成的C-N键的位置。
IL-2部分内所含的硫醇基团可以用作水溶性聚合物的有效连接位点。在IL-2部分内存在一个溶剂可接近的二硫化物。通常，它有助于蛋白的稳定性而不是其结构或其功能。如Bioconjugate Chem.2007,18,61-76中所报道的，温和还原可接近的天然二硫键之后所释放的半胱氨酸硫醇可以用与双(硫醇)-特异性试剂PEG化。这导致两个半胱氨酸硫醇通过PEG的桥连。
根据本发明公开，使用硫醇桥PEG化的代表性偶联物可以包括以下式(XVII)：
Figure BDA0003571026660000971
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物、其位置异构体或混合物，或它们的同位素变体；或其药用盐，溶剂化物，水合物或前药；
其中X为间隔子部分，POLY为直链或支链水溶性聚合物，并且“-S-”为IL-2部分内的残基的硫基。在某些实施方式中，所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
在本文中和其它处所述的那些聚合试剂，可以购自商业来源或从可商购的起始材料制备。另外，文献中描述了用于制备聚合试剂的方法。
点击化学
在偶联物的某些实施方式中，本文所公开的接头和式包含能够通过点击化学反应的官能团。如本文所使用的，点击化学是指叠氮化物和炔烃之间形成1,2,3-三唑的1,3-偶极环化加成或[3+2]环化加成。术语“1,3-偶极环化加成”和“[3+2]环化加成”还涵盖了叠氮化物和环辛炔之间的“无铜”1,3-偶极环化加成。
因此，除非另有说明，否则在本文中对任何三唑化合物的描述意味着包括化合物的位置异构体及其混合物。
例如，叠氮化物和炔烃的[3+2]环化加成可以产生如下所示的两种位置异构的三唑：
Figure BDA0003571026660000972
在某些实施方式中，所述炔烃是应变的环炔基或杂环炔基，并且可以在存在或不存在催化剂的情况下实施所述环化加成反应。在某些实施方式中，例如，可以通过被称为应变-促进的叠氮化物-炔烃环化加成(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC)的反应自发发生所述环化加成反应，这在本领域中作为“无金属点击化学”所已知的。在某些实施方式中，应变的环炔基或杂环炔基如本文所述。
可以在本文所述的方法中使用这些无催化剂的[3+2]环化加成以形成本发明公开的偶联物。可以通过环应变，如(仅通过举例)将吸电子基团附加至这些炔烃环的8元环状结构激活炔烃，或者可以通过添加路易斯酸，如Au(l)或Au(lll)激活炔烃。通过环应变激活的炔烃已经被描述了。例如，Agard等人,J.Am.Chem.Soc,2004,126(46):15046-15047所述的环辛炔和二氟环辛炔，Boon等人,WO2009/067663A1(2009)所述的二苯并环辛炔和Debets等人,Chem.Comm.,2010,46:97-99所述的氮杂-二苯并环辛炔。
在某些实施方式中，如本文所述，可以通过将包含炔烃基团的官能化大分子与包含叠氮基的官能化蛋白反应以形成偶联物来获得本发明公开的偶联物。在其它实施方式中，官能化蛋白可以具有激活的炔烃部分，并且官能化大分子具有叠氮化物部分。
在某些实施方式中，所述官能化大分子是官能化PEG。在某些实施方式中，所述官能化蛋白是官能化IL-2。在某些实施方式中，官能化IL-2中的叠氮化物与官能化PEG中的炔烃反应以形成三唑部分(例如，通过1,3-偶极环化加成)。在某些实施方式中，官能化PEG中的叠氮化物与官能化IL-2中的炔烃反应以形成三唑部分。
在某些实施方式中，本发明公开所述的点击化学产物基团包含三唑基团。
在某些实施方式中，点击化学产物基团选自：
Figure BDA0003571026660000981
Figure BDA0003571026660000982
在本文所公开的化合物、偶联物和式的某些实施方式中，T选自：
Figure BDA0003571026660000991
在本文所公开的包含三唑官能团(T)的化合物、偶联物和式的某些实施方式中，所述三唑官能团可以作为位置异构体的混合物存在，导致所产生的化合物或偶联物以位置异构体的混合物存在。
如本文所使用的，
Figure BDA0003571026660000992
的结构表示具有以下结构的位置异构体的混合物：
Figure BDA0003571026660000993
当本文所提供的偶联物含有酸性或碱性部分时，它还可以用做作为药用盐。参见，Berge等人,J.Pharm.Sci.1977,66,1-19；Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,第2版；Stahl and Wermuth Eds.；John Wiley&Sons,2011。在某些实施方式中，本文所提供的化合物的药用盐是溶剂化物。在某些实施方式中，本文所提供的化合物的药用盐是水合物。
适合在本文所提供的化合物的药用盐的制备中使用的酸包括(但不限于)乙酸、2,2-二氯乙酸、酰化氨基酸、肥酸、海藻酸、抗坏血酸、L-门冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、硼酸、(+)-樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、环己基氨基磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基-乙磺酸、甲酸、延胡索酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、L-谷氨酸、α-酮戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、(+)-左旋乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、高氯酸、磷酸、L-焦谷氨酸、糖二酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、p-甲苯磺酸、十一烯酸和戊酸。
适合在本文所提供的化合物的药用盐的制备中使用的碱包括(但不限于)无机碱、如氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化锌或氢氧化钠；和有机碱，如伯、仲、叔和季脂族和芳香胺，包括(但不限于)L-精氨酸、苯乙苄胺、苄星青霉素、胆碱、地阿诺、二乙醇胺、二乙胺、二甲胺、二丙胺、二异丙胺、2-(二乙基氨)-乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、异丙胺、N-甲基-葡糖胺、哈胺、1H-咪唑、L-赖氨酸、吗啉、4-(2-羟乙基)-吗啉、甲胺、哌啶、哌嗪、丙胺、四氢吡咯、1-(2-羟乙基)-四氢吡咯、吡啶、奎宁环、喹啉、异喹啉、三乙醇胺、三甲胺、三乙胺、N-甲基-D-葡糖胺、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇和氨丁三醇。
本文所提供的偶联物还可以用做为前药，它是化合物的功能衍生物并且易于在体内转化为母体化合物。前药通常是有用的，因为在一些情况下，它们可以比母体化合物更易于施用。例如，它们可以是通过口服生物可用的，然而母体化合物不是。前药还可以在药物组合物中具有比母体化合物提高的溶解度。前药可以通过多种机制转化为母体药物，包括酶促过程和代谢水解。
药物组合物
所述偶联物通常是组合物的一部分。通常，所述组合物包含多种偶联物。在某些实施方式中，每种偶联物由相同蛋白组成(即在整个组合物内，仅存在一种类型的蛋白)。另外，所述组合物可以包含多种偶联物，其中任何给定的偶联物由选自两种或更多种不同的蛋白的部分组成(即在整个组合物内，存在两种或更多种不同的蛋白)。在其它实施方式中，所述组合物中基本所有的偶联物(例如，所述组合物中的多种偶联物的85％或以上)分别包含相同的蛋白。更具体地，所述蛋白是IL-2。
所述组合物可以包含单一偶联物物质(例如，单PEG化的偶联物，其中对于所述组合物中的基本所有偶联物，在相同位置连接单个聚合物)或偶联物物质的混合物(例如，其中聚合物的连接发生在不同位点的单PEG化的偶联物的混合物和/或单PEG化、二PEG化、三PEG化和多PEG化偶联物的混合物)。所述组合物也可以包含具有4、5、6、7、8或更多个连接至任何给定蛋白的聚合物的其它偶联物。另外，本发明公开包括其中所述组合物包含多种偶联物的实例，每种偶联物包含共价连接至一种蛋白的一种水溶性聚合物，以及包含共价连接至一种蛋白的2、3、4、5、6、7、8或更多种水溶性聚合物的组合物。更具体地，所述蛋白是IL-2。
相对于所述组合物中的偶联物，所述组合物通常将满足以下特征中的一种或多种：所述组合物中的至少约85％的偶联物将具有1至10种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约85％的偶联物将具有1至9种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约85％的偶联物将具有1至8种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约85％的偶联物将具有1至7种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约85％的偶联物将具有1至6种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约85％的偶联物将具有1至5种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约85％的偶联物将具有1至4种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约85％的偶联物将具有1至3种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约85％的偶联物将具有1至2种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约85％的偶联物将具有1种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约95％的偶联物将具有1至10种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约95％的偶联物将具有1至9种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约95％的偶联物将具有1至8种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约95％的偶联物将具有1至7种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约95％的偶联物将具有1至6种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约95％的偶联物将具有1至5种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约95％的偶联物将具有1至4种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约95％的偶联物将具有1至3种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约95％的偶联物将具有1至2种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约95％的偶联物将具有1种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约99％的偶联物将具有1至10种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约99％的偶联物将具有1至9种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约99％的偶联物将具有1至8种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约99％的偶联物将具有1至7种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约99％的偶联物将具有1至6种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约99％的偶联物将具有1至5种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约99％的偶联物将具有1至4种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约99％的偶联物将具有1至3种连接至所述蛋白的聚合物；所述组合物中的至少约99％的偶联物将具有1至2种连接至所述蛋白的聚合物；和所述组合物中的至少约99％的偶联物将具有1种连接至所述蛋白的聚合物。应理解对聚合物范围的提及，例如，“x至y种聚合物”,考虑了x至y(包括x和y)的多种聚合物(也就是说，例如，“1至3种聚合物”考虑了1种聚合物、2种聚合物和3种聚合物，“1至2种聚合物”考虑了1种聚合物和2种聚合物等)。更具体地，所述蛋白是IL-2。
对于任何给定部分，可以通过选择适当的聚合试剂、聚合试剂与蛋白的比例、温度、pH条件以及缀合反应的其它方面来实现对所期望的聚合物数目的控制。另外，可以通过纯化方式减少或除去不期望的偶联物。
例如，可以纯化聚合物-蛋白质偶联物以获得/分离不同的偶联物质。具体地，可以纯化产物混合物以获得每个IL-2部分平均有1、2、3、4、5或更多个的PEG。最终偶联物反应混合物的纯化策略将取决于许多因素，包括(例如)所使用的聚合试剂的分子量、具体的蛋白、所需的给药方案和各个偶联物的残留活性和体内活性。
如果需要，可以使用凝胶过滤色谱法和/或离子交换色谱法分离具有不同分子量的偶联物。也就是说，基于它们不同的分子量(其中差异基本上对应于水溶性聚合物部分的平均分子量)，将凝胶过滤色谱法用于分离不同数目的聚合物-与-蛋白质部分的比例(例如，1-聚体、2-聚体、3-聚体等，其中“1-聚体”表示每个蛋白质部分有1个聚合物，“2-聚体”表示每个蛋白质部分有2个聚合物等)。例如，在其中15,000道尔顿蛋白随机偶联至分子量约20,000道尔顿的聚合试剂的示例性反应中，所得反应混合物可以含有未修饰的蛋白(具有约15,000道尔顿的分子量)、单PEG化的蛋白(具有约35,000道尔顿的分子量)、二PEG化的蛋白(具有约55,000道尔顿的分子量)等。
尽管这种方法可以用于分离具有不同分子量的PEG及其它聚合物-蛋白偶联物，但是这种方法对于分离在蛋白内具有不同聚合物连接位点的位置异构体来说通常是无效的。例如，凝胶过滤色谱法可以用于将PEG 1-聚体、2-聚体、3-聚体等的混合物彼此分离，尽管每种所分离的偶联物的组成可以含有在蛋白内连接至不同反应基团(例如，赖氨酸残基))的PEG。
具体的凝胶过滤柱的选择将取决于所期望的分离范围。通常使用适合的缓冲液，如磷酸盐、乙酸盐等进行洗脱。可以通过多种不同的方法分析收集的馏分，例如，(i)对于蛋白质含量，在280nm的吸光值，(ii)使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品的染料-基蛋白质分析，(iii)用于PEG含量的碘测试(Sims等人(1980)Anal.BioIL-2m,107:60-63)，(iv)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)，随后用碘化钡染色和(v)高效液相色谱法(HPLC)。
位置异构体的分离可以通过反相色谱法使用反相-高效液相色谱(RP-HPLC)，使用适合的柱(例如，C18柱或C3柱)，或者通过离子交换色谱法使用离子交换柱，获得。可以使用任一种方法来分离具有相同分子量的聚合物-活性剂异构体(即位置异构体)。
对于IL-2-聚合物偶联物，所述组合物优选地基本不含不具有IL-2活性的蛋白。另外，所述组合物优选地基本不含所有其它非共价连接的水溶性聚合物。然而，在一些情况下，所述组合物可以含有聚合物-IL-2偶联物和非偶联IL-2的混合物。
可选地，本发明公开所述的组合物还包含一种或多种药用载体或赋形剂。如果需要，可以将药用赋形剂添加至偶联物以形成组合物。
示例性的赋形剂无限制地包括选自碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱、氨基酸及其组合的那些。
碳水化合物，如糖、衍生的糖，如醛醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物可以作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括(例如)单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉等；和醛醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇、环糊精等。
赋形剂还可以包括无机盐或缓冲液，如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸二钠及其组合。
所述组合物还可以包括用于防止或阻止微生物生长的抗微生物剂。适合于本发明公开的一个或多个实施方式的抗微生物剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、氯化十六烷吡啶、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞及其组合。
抗氧化剂也可以存在于所述组合物中。抗氧化剂用于防止氧化，借此防止偶联物或制剂的其它组分的破坏。适合在本发明公开的一个或多个实施方式中使用的抗氧化剂包括(例如)抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠及其组合。
表面活性剂可以作为赋形剂存在。示例性的表面活性剂包括：聚山梨醇酯，如“吐温20”和“吐温80”以及普卢兰尼克，如F68和F88；脱水山梨糖醇酯；脂质，如磷脂，如卵磷脂及其它磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(尽管优选地不处于脂质体的形式)、脂肪酸和脂肪酸酯；类固醇，如胆固醇；和IL-2化剂(IL-2lating agents)，如EDTA、锌及其它这些适合的阳离子。
酸和碱可以作为所述组合物中的赋形剂存在。可以使用的酸的非限制性实例包括选自下列中的那些酸：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、延胡索酸及其组合。适合的碱的实例无限制地包括选自下列的碱：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、延胡索酸钾及其组合。
一种或多种氨基酸可以作为本文所述的组合物中的赋形剂存在。在这方面，示例性的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和甘氨酸。
所述组合物中的偶联物(即活性剂和聚合试剂之间形成的偶联物)的量将基于许多因素而改变，但当所述组合物储存在单位剂量容器(例如，小瓶)中时，所述量将最佳地为治疗有效剂量。另外，可以将药物制剂放在注射器中。可以通过实验确定治疗有效剂量,通过反复施用剂量升高的偶联物，以确定哪个量产生了临床所期望的终点。
所述组合物中任何单个赋形剂的剂量将基于赋形剂的活性和所述组合物的具体需要而改变。通常，通过常规实验，即通过制备含有不同的剂量的赋形剂(从低到高)的组合物，检查稳定性及其它参数，然后确定获得最佳表现且无明显副作用的范围，从而确定任何单个赋形剂的最佳的剂量。
然而，通常，赋形剂在组合物中的存在量为按重量计约1％至约99％，优选地按重量计约5％至约98％，更优选地按重量计约15至约95％，其中浓度小于按重量计30％是最优选的。
以上这些药物赋形剂与其它赋形剂一起描述于“Remington:The Science&Practice of Pharmacy”,第19版,Williams&Williams,(1995)，“Physician’s DeskReference”,第52版,Medical Economics,Montvale,NJ(1998)和Kibbe,A.H.,Handbook ofPharmaceutical Excipients,第3版,American Pharmaceutical Association,Washington,D.C.,2000中。
治疗方法
所述偶联物及其组合物可以用于治疗可以通过施用所述偶联物医冶或预防的任何病况。本领域那些技术人员将理解具体偶联物可以有效治疗哪些病况。例如，所述偶联物可以单独使用或与其它药物疗法组合以治疗癌症、传染性疾病(例如，病毒)和/或自体免疫疾病。
在一些实施方式中，本发明公开提供了治疗对其有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开的偶联物。在一些实施方式中，所述癌症是血癌。在一些实施方式中，所述血癌是多发性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。在一些实施方式中，所述血癌是急性髓细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤。在一些实施方式中，所述癌症是实体瘤癌症。在一些实施方式中，所述实体瘤癌症是肾细胞癌、黑素瘤、乳腺癌或膀胱癌。在一些实施方式中，所述黑素瘤是转移性黑素瘤。在一些实施方式中，所述癌症是可以用IL-2治疗的癌症，其选自肉瘤、脊索瘤、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚癌、威尔姆氏瘤、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、尿路上皮癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、急性髓细胞性白血病和白血病。
在一些实施方式中，本发明公开提供了治疗对其有需要的受试者中的传染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开的偶联物。在一些实施方式中，所述传染性疾病是病毒性疾病。在一些实施方式中，所述病毒性疾病是人类免疫缺陷性病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)。在一些实施方式中，所述传染性疾病是HIV。在一些实施方式中，所述传染性疾病是HCV。
在一些实施方式中，本发明公开提供了治疗对其有需要的受试者中的自体免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开的偶联物。在一些实施方式中，所述自体免疫疾病是类风湿性关节炎、红斑狼疮、炎症性肠病(IBD)或特应性皮炎。在一些实施方式中，所述类风湿性关节炎是儿童类风湿性关节炎。
在某些实施方式中，患者患有选自下列的疾病：肾细胞癌、转移性黑素瘤、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷性病毒(HIV)、急性髓细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、儿童类风湿性关节炎、特应性皮炎、乳腺癌和膀胱癌。
有利地，可以在另一种活性剂的施用之前、同时或之后向患者施用所述偶联物。在一些实施方式中，所述偶联物可以与抗肿瘤抗原抗体组合以产生协同的先天性和适应性免疫应答。在一些实施方式中，所述偶联物可以与通过抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)功能具有它们的抗肿瘤活性的抗肿瘤抗体组合。本发明公开中所述的PEG-IL-2偶联物可以刺激CD8+ T细胞。CD8+ T细胞的刺激不仅提供了直接杀死肿瘤的益处，而且还可以调节多形核白细胞(PMNs)以提供抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)，如通过释放已知促进嗜中性白细胞活性的细胞因子，如IFNγ的释放(Pelletier等人,J.Leukoc.Biol.2010；88:1163–1170)。PEG-IL-2偶联物与具有ADCC功能的抗肿瘤抗体的组合疗法可以潜在地提高这些抗体的抗肿瘤活性。
制剂/施用
本文所公开的施用于对其有需要的患者的偶联物和组合物意味着涵盖了所有制剂类型，具体地，适合于注射的那些类型，例如，可以复原的粉剂或冻干粉剂(lyophilates)以及液体剂。适合于在注射前复原固体组合物的稀释剂的实例包括抑菌注射用水、5％葡萄糖水溶液、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、盐水、无菌水、去离子水及其组合。对于液体药物组合物，考虑了溶液和混悬液。
通常，尽管不一定，本发明公开的一个或多个实施方式的组合物是通过注射施用并因此所述组合物通常在马上要施用前是液体溶液或混悬液。所述药物制剂还可以采取其它形式，如糖浆、乳膏剂、软膏剂、片剂、粉末剂等。还包括了其它施用模式，如肺部、直肠、透皮、经粘膜、口服、鞘内、瘤内、癌周、腹膜内、皮下、动脉内施用等。
本发明公开还提供了用于将如本文所提供的偶联物施用于患有对用偶联物的治疗起反应的病况的患者的方法。所述方法包括通常通过注射，向患者施用治疗有效量的偶联物(优选地作为药物组合物的一部分提供)。如前所述，可以注射(例如，肌内、皮下和肠胃外注射)所述偶联物。适合于肠胃外施用的制剂类型包括随时可注射的溶液、在使用前用于与溶剂混合的干粉、随时可注射的混悬液、用于在使用前与媒介物混合的干燥不溶组合物和在施用前稀释的乳液和液体浓缩剂等。
可以可选地实施施用所述偶联物(优选地作为药物组合物的一部分提供)的方法以将所述偶联物定位至特定区域。例如，可以通过手术将包含所述偶联物的液体、凝胶和固体制剂植入患病区域(如肿瘤中、肿瘤附近、发炎区域中和发炎区域附近)。方便地，还可以对器官和组织成象以确保将所期望的位置更好地暴露于所述偶联物。
要施用的实际剂量将基于受试者的年龄、体重和一般状况以及要治疗的病况的严重程度、专业医护人员的判断和要施用的偶联物而不同。治疗有效量是本领域技术人员已知的和/或在相关参考教科书和文献中描述的。通常，治疗有效量将在约0.001mg至100mg的范围内，优选地处于0.01mg/天至75mg/天的剂量，并且更优选地0.10mg/天至50mg/天的剂量。可以定期施用给定剂量直至(例如)疾病症状减轻和/或完全消除。
基于临床医师的判断、患者的需要等，可以以多种给药方案来施用任何给定的偶联物(同样，优选地作为药物制剂的一部分提供)的单位剂量。具体的给药方案将是本领域那些技术人员已知的或者可以使用常规方法通过实验确定的。示例性的给药方案无限制地包括每天施用一次、每周三次、每周两次、每周一次、每三周1次、每月两次、每月一次或其任意组合。一旦实现临床终点，则停止所述组合物的剂量施用。
应理解尽管已结合其优选的具体实施方式描述了本发明公开，但是以上描述以及随后的实施例旨在描述而非限制本发明公开的范围。本发明公开的范围内的其它方面、优势和改变将对本发明公开所属领域内的技术人员是显而易见的。
在本文中参考的所有文章、书籍、专利及其它出版物以其全部内容作为参考并入本文。
实验
除非另外说明，否则本发明公开的实践将使用有机合成、生物化学、蛋白纯化等的常规方法，它们均在本领域的技术范围内。在文献中充分解释了这些技术。参见，例如，J.March,Advanced Organic Chemistry:Reactions Mechanisms and Structure,第4版(New York:Wiley-Interscience,1992)，如上。
在以下实施例中，已努力确保所用数值的准确度(例如，数量、温度等)，但是应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外说明，否则以摄氏度表示温度并且压力为或接近海平线处的大气压力。除非另外说明，否则所有试剂购自Sigma-Aldrich或Thermo FisherScientific。所有产生的NMR得自300或400MHz NMR光谱仪。所有处理是在玻璃或玻璃衬里的容器中进行的并且避免与含金属容器或设备接触。
材料：除非另作说明，否则所有有机溶剂和试剂(无水CH2Cl2、2-丙醇、丙酮、NMM和DBCO-胺)均购自Sigma Aldrich并直接使用。PyClocK购自
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15kDa、17kDa和20kDa Y-PEG-NHS试剂购自JenKem Technology USA并直接使用。使用根据发表的方法所修改的方法制备5kDa、10kDa和20kDa TheraPEGTM试剂(Brocchini等人,Nat.Protoc.2006,1:5,2241-2252)。DL-二硫苏糖醇(DTT)购自Melford并且在使用前在细胞培养级水(GEHealthcare)中制备0.1M溶液。用于缓冲液制备的材料来源于Thermo Fisher Scientific、Merck和Sigma-Aldrich并且直接使用。通过使用2M NaOH(VWR)调节pH，从DPBS(Sigma-Aldrich)制备PBS，pH 7.4。所有其它材料购自VWR、Sigma-Aldrich、GE Healthcare、ThermoFisher Scientific和Merck并直接使用。
除非另外说明，否则在这些实施例中提及的所有前体聚合试剂是可商购的。IL-2(“rIL-2”)的冻干粉末对应于图1的氨基酸序列。
基于IL-2的量计算IL-2-PEG偶联物的质量和摩尔量。
SDS-PAGE分析
通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析样品。制备样品，加样至凝胶并如生产商所述，实施电泳。
尺寸排阻色谱
将尺寸排阻色谱法用于纯化所制备的PEG-rIL-2偶联物。纯化方法的详细情况如下所述。
RP-HPLC分析
通过在HPLC系统上实施的反相色谱法(RP-HPLC)分析来分析样品。使用ACE Excel2superC18柱(尺寸：75×2.1mm id，颗粒尺寸2μm)，在Dionex 2UPLC系统上实施分析型RP-HPLC分析。使用在10min内0-100％缓冲液B(99.95％MeCN，0.05％TFA)在缓冲液A(94.95％H2O，5.0％MeCN，0.05％TFA)中的线性梯度，流速0.8mL/min。样品加载量为10μg。
实施例1
7-叠氮基-1-((4-氟苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯 (8)
Figure BDA0003571026660001101
6-叠氮基己-1-醇(2)的制备：
向6-氯代己-1-醇(75g，0.549mol，1.0eq)在H2O(750mL)中的溶液中添加NaN3(97.5g，1.50mol，2.73eq)。将混合物在105℃搅拌16h。反应混合物的LCMS分析显示了向所期望的产物的完全转化。然后，用乙酸乙酯萃取混合物。用无水Na2SO4干燥有机层并减压浓缩以提供粗化合物2(75g，95％)。
6-叠氮基己醛(3)的制备：
在0℃，分3个部分向化合物2(75g，0.523mol，1.0eq)、TEMPO(817mg，5.23mmol，0.01eq)和NaHCO3(52.7g，0.628mol，1.2eq)在DCM/H2O(750ml/75ml)中的溶液中添加TCCA(45g，0.194mol，0.37eq)。将混合物在0℃搅拌0.5h。反应混合物的LCMS分析显示了向所期望的产物的完全转化。然后，过滤混合物并用水稀释。用无水Na2SO4干燥有机层并减压浓缩以提供粗化合物3(70g，94％)。
(4-氟苯基)(甲基)硫烷(5)的制备：
在室温下，在氮气氛下，向化合物4(30g，0.234mol，1.0eq)在DMF(250ml)中的溶液中添加MeI(40g，0.281mol，1.2eq)和K2CO3(97g，0.702mol，3.0eq)。将混合物在室温下搅拌4h。反应混合物的TLC分析显示了向所期望的产物的完全转化。然后，用水稀释混合物并用乙酸乙酯萃取。用5％LiCl(aq.)清洗有机层，用无水Na2SO4干燥并减压浓缩以提供粗化合物5(45g，100％)。
1-氟-4-(甲基磺酰基)苯(6)的制备：
在室温下，在氮气氛下，向化合物5(45g，0.317mol，1.0eq)在THF/H2O(450ml/450ml)中的溶液中添加过硫酸氢钾制剂(oxone)(487g，0.792mol，2.5eq)。将混合物在室温下搅拌16h。反应混合物的LCMS分析显示了向所期望的产物的完全转化。然后，过滤混合物，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。用盐水清洗有机层，用无水Na2SO4干燥并减压浓缩以提供粗化合物6(35g，63％)。
7-叠氮基-1-((4-氟苯基)磺酰基)庚烷-2-醇(7)的制备：
在-78℃，向化合物6(20g，0.115mol，1.0eq)在无水THF(200mL)中的溶液中滴加n-BuLi(2.5M在己烷中的溶液，60ml，0.149mol，1.3eq)。除去冷却浴并使混合物加热至0℃。在搅拌30min后，在-78℃添加化合物3(21g，0.149mol，1.3eq)。在搅拌15min后，使所述混合物加热。然后，将所述混合物添加至NH4Cl的饱和水溶液(混合物变透明)并用乙酸乙酯萃取。用无水Na2SO4干燥有机层并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物以提供化合物7(26g，71％)。
7-叠氮基-1-((4-氟苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(8)的制备
在室温下，在氮气氛下，向化合物7(15g，47.62mmol，1.0eq)和三光气(24g，80.95mmol，1.7eq)在无水THF(200mL)中的搅拌溶液中滴加吡啶(7.5g，95.24mmol，2.0eq)。在搅拌10min后，过滤混合物并减压浓缩。将残余物溶于无水THF(100mL)并依次用NHS(16.4g，0.143mol，3.0eq)和吡啶(11.3g，0.143mmol，3.0eq)处理。在搅拌10min后，减压浓缩混合物。将残余物溶于乙酸乙酯(100mL)并用0.1N HCl、水、饱和的NaHCO3水溶液和盐水清洗。用无水Na2SO4干燥有机层并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物以提供固体状的化合物8(12g，55％)。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.95-7.92(m,2H),7.46(t,J＝8.8Hz,2H),5.10-5.09(m,1H),4.04-3.97(m,1H),3.84(dd,J＝15.2,2.0Hz,1H),3.27-3.24(m,2H),2.77(s,4H),1.65-1.64(m,2H),1.44-1.42(m,2H),1.23-1.22(m,4H)。
实施例2
7-叠氮基-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基) 碳酸酯(13)
Figure BDA0003571026660001121
甲基(4-(三氟甲基)苯基)硫烷(10)的制备：
在室温下，在氮气氛下，向化合物9(24.5g，0.138mol，1.0eq)在DMF(200mL)中的溶液中添加MeI(23.4g，0.165mol，1.2eq)和K2CO3(57g，0.413mol，3.0eq)。将混合物在室温下搅拌4h。反应混合物的TLC分析显示了向所期望的产物的完全转化。然后，用水稀释混合物并用乙酸乙酯萃取。用5％LiCl(aq.)清洗有机层，用无水Na2SO4干燥并减压浓缩以提供粗化合物10(24g，90％)。
1-(甲基磺酰基)-4-(三氟甲基)苯(11)的制备：
在室温下，在氮气氛下，向化合物10(24g，0.125mol，1.0eq)在THF/H2O(200ml/200ml)中的溶液中添加过硫酸氢钾制剂(171g，0.264mol，2.1eq)。将混合物在室温下搅拌16h。反应混合物的LCMS分析显示了向所期望的产物的完全转化。然后，过滤混合物，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。用盐水清洗有机层，用无水Na2SO4干燥并减压浓缩以提供粗化合物11(30.6g，100％)。
7-叠氮基-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)庚烷-2-醇(12)的制备：
在-78℃，向化合物11(15g，66.96mmol，1.0eq)在无水THF(150ml)中的溶液中滴加n-BuLi(2.5M在己烷中的溶液，35ml，87.05mmol，1.3eq)。除去冷却浴并使混合物加热至0℃。在搅拌30min后，在-78℃添加化合物3(12.5g，87.05mmol，1.3eq)。在搅拌15min后，使所述混合物加热。然后，将所述混合物添加至NH4Cl的饱和水溶液(混合物变透明)并用乙酸乙酯萃取。用无水Na2SO4干燥有机层并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物以提供不纯的化合物12(19g，77％)。
7-叠氮基-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(13)的制备
在室温下，在氮气氛下，向化合物12(19g，52.05mmol，1.0eq)和三光气(26.3g，88.49mmol，1.7eq)在无水THF(200mL)中的搅拌溶液中滴加吡啶(8ml，0.104mol，2.0eq)。在搅拌10min后，过滤混合物并减压浓缩。将残余物溶于无水THF(100mL)并依次用NHS(17.95g，0.156mol，3.0eq)和吡啶(12.5mL，0.156mmol，3.0eq)处理。在搅拌10min后，减压浓缩混合物。将残余物溶于乙酸乙酯(100mL)并用0.1N HCl、水、饱和的NaHCO3水溶液和盐水清洗。用无水Na2SO4干燥有机层并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物以提供固体状的化合物13(12.5g，47％)。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ8.10(d,J＝8.4Hz,2H),8.01(d,J＝8.4Hz,2H),5.16-5.15(m,1H),4.16-4.09(m,1H),3.95-3.92(m,1H),3.26(t,J＝6.8Hz,2H),2.77(s,4H),1.66-1.65(m,2H),1.44-1.42(m,2H),1.24-1.23(m,4H)。
实施例3
7-叠氮基-1-((4-氯苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯 (18)
Figure BDA0003571026660001141
(4-氯苯基)(甲基)硫烷(15)的制备：
在室温下，在氮气氛下，向化合物14(30g，0.207mol，1.0eq)在DMF(250ml)中的溶液中添加MeI(35.3g，0.249mol，1.2eq)和K2CO3(85.8g，0.622mol，3.0eq)。将混合物在室温下搅拌4h。反应混合物的TLC分析显示了向所期望的产物的完全转化。然后，用水稀释混合物并用乙酸乙酯萃取。用5％LiCl(aq.)清洗有机层，用无水Na2SO4干燥并减压浓缩以提供橙色油状的粗化合物15(44g，100％)。TLC:PE:EA＝10:1，Rf(14)＝0.5，Rf(15)＝0.7。
1-氯-4-(甲基磺酰基)苯(16)的制备：
在室温下，在氮气氛下，向化合物15(60g，0.380mol，1.0eq)在THF/H2O(400mL/400mL)中的溶液中添加过硫酸氢钾制剂(583g，0.948mol，2.5eq)。将混合物在室温下搅拌16h。反应混合物的LCMS分析显示了向所期望的产物的完全转化。然后，过滤混合物，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。用盐水清洗有机层，用无水Na2SO4干燥并减压浓缩以提供白色固体状的粗化合物16(57.8g，80％)。
7-叠氮基-1-((4-氯苯基)磺酰基)庚烷-2-醇(17)的制备：
在-78℃，向化合物16(20g，0.105mol，1.0eq)在无水THF(300mL)中的溶液中滴加n-BuLi(2.5M在己烷中的溶液，55mL，0.137mol，1.3eq)。除去冷却浴并使混合物加热至0℃。在搅拌30min后，在-78℃添加化合物3(19g，0.137mol，1.3eq)。在搅拌15min后，使所述混合物加热。然后，将所述混合物添加至NH4Cl的饱和水溶液(混合物变透明)并用乙酸乙酯萃取。用无水Na2SO4干燥有机层并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物以提供黄色固体状的化合物17(26g，74％)。
7-叠氮基-1-((4-氯苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(18)的制备：
在室温下，在氮气氛下，向化合物17(31g，93.42mmol，1.0eq)和三光气(47g，0.159mol，1.7eq)在无水THF(500mL)中的搅拌溶液中滴加吡啶(15mL，0.187mol，2.0eq)。在搅拌10min后，过滤混合物并减压浓缩。将残余物溶于无水THF(500mL)并依次用NHS(32g，0.280mol，3.0eq)和吡啶(22mL，0.280mmol，3.0eq)处理。在搅拌10min后，减压浓缩混合物。将残余物溶于乙酸乙酯(300mL)并用0.1N HCl、水、饱和的NaHCO3水溶液和盐水清洗。用无水Na2SO4干燥有机层并减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物以提供固体状的化合物18(26g，59％)。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.87(d,J＝8.8Hz,2H),7.69(d,J＝8.8Hz,2H),5.11-5.10(m,1H),4.06-4.00(m,1H),3.86(dd,J＝15.6,2.4Hz,1H),3.26(t,J＝6.8Hz,2H),2.77(s,4H),1.66-1.62(m,2H),1.45-1.42(m,2H),1.23-1.22(m,4H)。
实施例4
7-叠氮基-1-((2,4-二氟苯)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯 (19)
Figure BDA0003571026660001151
以与实施例1类似的制备程序，使用2,4-二氟苯硫酚制备实施例4。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01–7.94(m,1H),7.12–7.05(m,1H),7.05–6.97(m,1H),5.24(d,J＝6.6Hz,1H),3.78(dd,J＝15.2,8.4Hz,1H),3.46(dd,J＝15.2,3.4Hz,1H),3.26(t,J＝6.8Hz,2H),2.80(s,4H),1.79(s,2H),1.63–1.56(m,2H),1.43–1.33(m,4H)。
实施例5
7-叠氮基-1-((4-氟-2-(三氟甲基)苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷- 1-基)碳酸酯(20)
Figure BDA0003571026660001161
以与实施例1类似的制备程序，使用4-氟-2-(三氟甲基)苯硫酚制备实施例5。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.31(dd,J＝8.8,5.2Hz,1H),7.60(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),7.54–7.46(m,1H),5.36–5.26(m,1H),3.79(dd,J＝15.2,8.8Hz,1H),3.47(dd,J＝15.2,3.2Hz,1H),3.25(t,J＝6.8Hz,2H),2.81(s,4H),1.83–1.70(m,2H),1.61–1.52(m,2H),1.45–1.34(m,4H)。
实施例6
(2,7-双((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-9H- 芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(24)
Figure BDA0003571026660001162
N2,N7-双(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9-(羟甲基)-9H-芴-2,7-二甲酰胺(23)的制备：
将9-(羟甲基)-9H-芴-2,7-二羧酸(82.5mg，0.24mmol)溶于无水吡啶(1.0ml)并在室温下向所述溶液中添加HATU(273.8mg，0.72mmol)和2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(117.1mg，0.54mmol)。然后，将反应搅拌2hr。用HPLC，以0-70％MeCN/H2O(具有0.1％甲酸)纯化产物以提供化合物23(47.4mg，30％)。LCMS：m/z 685(M+1)+。
(2,7-双((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(24)的制备：
在室温下，在N2下，将化合物23(47.4mg，0.069mmol)溶于DCM(0.2ml)，并用DSC(35.47mg，0.14mmol)和吡啶(16.7μL，0.21mmol)处理。将反应搅拌1.5hr，然后用DCM稀释并用1N HCl和盐水清洗。用Na2SO4干燥有机相并浓缩。用HPLC，以MeCN/H2O(具有0.1％TFA)纯化残余物以提供所期望的产物24(31.7mg，56％，浅黄色油)。LCMS：m/z 826(M+1)+。
实施例7
(2-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-9H-芴-9- 基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(31)
Figure BDA0003571026660001171
甲基9H-芴-2-羧酸酯(26)的制备：
将化合物25、2-溴-9H-芴(128g，522mmol)、三乙胺TEA(106g，1.04mol，145ml)和Pd(dppf)Cl2(38.2g，52.2mmol)在MeOH(890ml)中的混合物脱气并用CO(50Psi)吹扫3次，然后在80℃，在N2气氛下，将混合物搅拌5hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)显示形成新的斑点(Rf＝0.42)。通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝100/1至10/1)纯化残余物以提供白色固体状的化合物26(120g，粗产物)。
9H-芴-2-羧酸(27)的制备：
向化合物26(120g，535mmol)在MeOH(840ml)中的混合物中添加NaOH(2M)，然后将混合物在20℃，在N2气氛下搅拌5hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)显示起始材料完全消耗并且形成新的斑点(Rf＝0.01)。向所述溶液中加入水(50mL)，然后将其用EtOAc(100mL)萃取。用3M HCl将水相调节至pH 3，然后将其用EtOAc(100mL)萃取。减压浓缩有机相以提供黄色固体状的化合物27(40.0g，190mmol，35.6％得率)。
9-甲酰基-9H-芴-2-羧酸(28)的制备：
向化合物27(6.00g，28.5mmol)在DMF(196ml)中的混合物中缓慢添加甲酸乙酯(276g，3.73mol)和t-BuOK(25.6g，228mmol)。将混合物在45℃搅拌0.5hr，然后使其冷却至25℃，2.5小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝0/1)显示起始材料完全消耗并且形成新的斑点(Rf＝0.48)。用1M HCl将溶液调节至pH 3。然后，用EtOAc(50.0mL)萃取混合物。分离有机相，用Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩以提供棕色固体状的化合物28(7.00g，粗产物)。
9-(羟甲基)-9H-芴-2-羧酸(29)的制备：
向化合物28(7.00g，29.4mmol)在MeOH(42.0ml)中的混合物中添加NaBH4(2.78g，73.5mmol)。对反应混合物脱气并用N2吹扫3次，然后在N2气氛下，将混合物在25℃搅拌16hr。LCMS(产物：RT＝0.863min)显示所期望的化合物的MS。向所述溶液中加入水(120mL)，然后将其用EtOAc(100mL)萃取。用1M HCl将水相调节至pH 3，然后将其用EtOAc(100mL)萃取。分离有机相，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供黄色固体状的化合物29(4.00g，16.7mmol，56.7％得率)。
N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9-(羟甲基)-9H-芴-2-羧酰胺(30)的制备：
在25℃，向化合物29(1.00g，4.16mmol)和2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(908mg，4.16mmol)在DMF(7.00ml)中的溶液中添加HOBt(619mg，4.58mmol)、EDCl(878mg，4.58mmol)和DIPEA(1.24g，9.57mmol)。将混合物在25℃搅拌12hr。LCMS(产物：RT＝1.002min)显示起始材料完全消耗。用水(10.0mL)稀释反应混合物，用EtOAc(10.0mL×2)萃取。用水(10.0mL×2)和盐水(10.0mL)清洗合并的有机相。分离有机相，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物。通过制备-HPLC(柱：Welch Xtimate C18 250*50mm*10um；流动相：[水(10mM NH4HCO3)-ACN]；B％：18％-48％，26min)纯化残余物以提供黄色油状的化合物30(1.40g，3.17mmol，76.2％得率，99.8％纯度)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.10(s,1H),7.88-7.76(m,3H),7.63(d,J＝7.2Hz,1H),7.46-7.34(m,2H),6.98(s,1H),4.18-4.08(m,2H),4.02-3.92(m,1H),3.76-3.56(m,14H),3.32(t,J＝5.2Hz,2H),2.37(s,1H)；LC-MS：m/z441.1(M+1)+。
(2-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(31)的制备：
将1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(0.5g，1eq)在DCM(5ml)中的溶液冷却至-30℃。向该溶液中滴加氯甲酸三氯甲酯(860mg，1eq)，随后在-30℃滴加DIPEA(561mg，1eq)。将混合物加热到0℃并搅拌3hr。将其加热至25℃并继续搅拌6小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝0/1，Rf＝0.3)显示起始材料完全消耗。过滤反应混合物以提供滤液(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氯甲酸酯的DCM溶液)，其直接使用而未进一步纯化。
在0℃，向化合物30(0.1g，1eq)和Py(17.96mg，1eq)中DCM(1ml)中的溶液中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基氯甲酸酯(10eq，来自先前步骤的DCM溶液)。将混合物在25℃搅拌12hr。LCMS(起始材料：RT＝0.992min，产物：RT＝1.059min)显示剩余3.71％的起始材料并且检测到40.2％的所期望的化合物。通过水(2.0mL)使反应淬灭，然后用饱和的柠檬酸水溶液将pH调节至6。用DCM萃取混合物(2mL×2)。用盐水(5.0ml)清洗合并的有机层，然后用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物。通过制备-HPLC(柱：Welch Ultimate AQ-C18150*30mm*5um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：30％-60％，12min)纯化残余物。在制备-HPLC纯化之后，将馏分冷冻干燥以提供无色油状的化合物31。LC-MS：m/z 582.2(M+1)+。
实施例8
(2-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-7-氟-9H- 芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(39)
Figure BDA0003571026660001201
2-氟-7-碘-9H-芴(33)的制备：
对2-氟-9H-芴32(24.4g，132mmol)、I2(14.1g，55.6mmol)和KIO3(7.08g，33.1mmol)在CH3COOH(408ml)、H2SO4(9.60ml)和H2O(19.2ml)中的混合物脱气并用N2吹扫3次。将混合物在N2气氛下，在80℃搅拌5hr。HPLC(产物：RT＝3.515min)显示检测到所期望的化合物。用EtOAc(50.0mL)萃取水溶液。用H2O(20.0mL)、盐水(10.0mL)清洗有机层，分离，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供棕色固体状的化合物33(38.0g，123mmol，92.6％得率)。1H NMR(400MHz,MeOD):7.87(s,1H),7.70-7.67(m,2H),7.48-7.46(m,1H),7.27-7.22(m,1H),7.17-7.09(m,1H),3.86(s,2H)。
甲基7-氟-9H-芴-2-羧酸酯(34)的制备：
对化合物33(38.0g，123mmol)、TEA(31.0g，306mmol)、Pd(dppf)Cl2(8.97g，12.3mmol)在MeOH(200mL)中的混合物脱气并用CO(50Psi)吹扫3次。将混合物在CO气氛下，在80℃搅拌24hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝100/1)显示起始材料完全消耗并且形成新的斑点(Rf＝0.40)。减压浓缩溶液以提供棕色固体状的化合物34(40.0g，粗产物)。
7-氟-9H-芴-2-羧酸(35)的制备：
向化合物34(40.0g，165mmol)在MeOH(280mL)中的混合物中添加NaOH(2M，206mL，2.5eq)水溶液。将反应混合物在100℃，在N2气氛下搅拌2hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝0/1)显示起始材料完全消耗并且形成新的斑点(Rf＝0.03)。向反应溶液添加H2O(150mL)。然后，用EtOAc(250mL)萃取。分离水层，并且用1M HCl调节pH至3。用EtOAc(200mL)萃取。用盐水(20.0mL)清洗有机层，分离，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供棕色固体状的化合物35(33.0g，145mmol，87.6％得率)。
7-氟-9-甲酰基-9H-芴-2-羧酸(36)的制备：
向化合物35(33.0g，145mmol)在DMF(210mL)中的混合物中添加甲酸乙酯(507g，6.84mol)。然后，缓慢添加t-BuOK(130g，1.16mol)。将混合物在45℃搅拌0.5hr，然后使混合物冷却至25℃，2.5小时。LCMS(产物：RT＝0.889)显示检测到所期望的化合物。向反应溶液中加入水(150mL)，并用EtOAc(500mL)萃取。用1M HCl将水相调节至pH 3，然后将其用EtOAc(500mL)萃取。用盐水(120mL)清洗有机层，分离，用Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩以提供黄色固体状的化合物36(30.0g，粗产物)。
7-氟-9-(羟甲基)-9H-芴-2-羧酸(37)的制备：
向化合物36(30.0g，117mmol)在MeOH(210mL)中的混合物中添加NaBH4(31.0g，820mmol)，然后将混合物在25℃，在N2气氛下搅拌24hr。LCMS(产物：RT＝0.906min)显示检测到所期望的化合物。向反应溶液中加入水(150mL)，并用EtOAc(450mL)萃取。用1M HCl将水相调节至pH 3。然后，用EtOAc(300mL)萃取。用盐水(120mL)清洗有机层，分离，用Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩以提供黄色固体状的化合物37(35.0g，粗产物)。
N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-7-氟-9-(羟甲基)-9H-芴-2-羧酰胺(38)的制备：
将化合物37(2.00g，7.74mmol)、HOBt(1.15g，8.52mmol)、EDCl(1.63g，8.52mmol)和DIPEA(2.50g，19.4mmol)在DMF(14.0ml)中的混合物在25℃搅拌0.5hr。然后，向所述混合物添加2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙胺(1.86g，8.52mmol)。将反应混合物在25℃搅拌3hr。LCMS(产物：RT＝1.171min)显示检测到所期望的化合物。用水(20mL)稀释反应溶液，并用EtOAc(20mL)萃取。用盐水(20.0mL)清洗有机层，分离，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物。通过制备-HPLC(柱：Phenomenex luna c18 250mm*100mm*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：15％-53％，25min)纯化粗产物以提供黄色油状的化合物38(1.00g，2.12mmol，48.7％得率，97.4％纯度)。1H NMR:(400MHz CDCl3):δ8.07(s,1H),7.85(d,J＝7.8Hz,1H),7.76-7.70(m,2H),7.35(d,J＝7.2Hz,1H),7.39-7.31(m,1H),7.18-7.08(m,1H),7.02(s,1H),4.16-3.96(m,3H),3.76-3.56(m,14H),3.33(t,J＝4.8Hz,2H)；LC-MS：m/z 459.1(M+1)+。
(2-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(39)的制备：
在0℃，向化合物38(0.1g，1eq)在DCM(1mL)中的溶液中添加化合物2,5-二氧代吡咯烷-1-基氯甲酸酯(10eq，DCM溶液)。将反应混合物在25℃搅拌12hr。LCMS(起始材料：RT＝1.026min，产物：RT＝1.084min)显示剩余6.33％的起始材料并且检测到28.3％的所期望的化合物。用饱和柠檬酸水溶液将反应混合物调节至pH 6。用DCM(2mL×2)萃取混合物。用盐水(5.0ml)清洗合并的有机层，分离，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物。通过制备-HPLC(柱：Phenomenex Luna C18200*40mm*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：25％-55％，10min)纯化残余物。在制备-HPLC纯化之后，将溶液冷冻干燥以提供无色油状的化合物39。LC-MS：m/z 600.2(M+1)+。
实施例9
2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(2-乙酰氧基乙基)-N-(2-((((2,7-双((2-(2-(2-(2- 叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基) 甘氨酸盐(44)
Figure BDA0003571026660001231
叔丁基N-(2-乙酰氧基乙基)-N-(2-氨乙基)甘氨酸酯(41)的制备：
在室温下，向叔丁基N-(2-乙酰氧基乙基)-N-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙基)甘氨酸酯40(75.0mg，0.19mmol，1.0eq)在乙酸乙酯(0.6ml)中的溶液中添加Pd/C(40mg，10％，干)。用H2对反应混合物置换3次。然后，将混合物在H2下，在室温下搅拌2h。通过1H NMR和TLC监测反应。(PE:EA＝1:1)化合物40：Rf＝0.3；化合物41：Rf＝0.05。通过硅藻土垫过滤反应溶液。浓缩有机层以提供浅黄色油状的产物41(48.4mg，98％)。
N-(2-乙酰氧基乙基)-N-(2-((((2,7-双((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)-乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲酰基)-9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)甘氨酸(43)的制备：
将如上制备的化合物41在EtOAc(0.6mL)中再溶解。向其中添加化合物24(161.0mg，0.19mmol)在DCM(1mL)中的溶液，然后添加吡啶(20μL)。将反应在RT下搅拌1h，并用LCMS监测。向反应加入EtOAc(5mL)并用1N HCl(2mL)清洗，用Na2SO4干燥有机相并过滤。然后，真空除去溶剂。
向粗产物42添加HCO2H(4mL)并加热至60℃，3h。用HPLC，以10-100％MeCN/H2O(0.1％TFA)纯化产物以获得所期望的化合物43(31.4mg，3步为18％)。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(2-乙酰氧基乙基)-N-(2-((((2,7-双((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-氨基)乙基)甘氨酸酯(44)的制备：
将化合物43(9.7mg，0.011mmol)溶于DCM(0.037mL)并在0℃，用HOSu(2.56mg，0.022mmol)和DCC(4.54mg，0.022mmol)在DCM(0.04mL)中的溶液处理。将反应在rt搅拌过夜。过滤并浓缩反应。加入3-5倍体积的Et2O，并且溶液变浑浊，并将浑浊溶液离心。将顶层透明溶液倒掉，并用Et2O(2×)清洗底部油状固体，并在高真空下干燥以获得化合物44(7.2mg，65％)。LCMS：1012(M+1)+；HPLC 96％(UV254)；1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ8.09(p,J＝0.7Hz,2H),7.84(td,J＝8.3,1.1Hz,4H),6.92(s,3H),4.43(d,J＝6.9Hz,2H),4.31(m,1H),4.16(t,J＝5.3Hz,2H),3.81(s,2H),3.79–3.55(m,47H),3.38–3.24(m,8H),3.00–2.78(m,11H),2.01(s,3H)。
实施例10
20kDa Y-PEG-DBCO
Figure BDA0003571026660001241
向配备有特氟龙涂层磁力搅拌棒的干燥圆-底烧瓶中添加20kDa Y-PEG-NHS(1.08g，50.0μmol，1.0eq)和PyClocK(0.033g，60.0μmol，1.2eq)。用橡胶隔片密封烧瓶并置于惰性氩气气氛下。添加无水CH2Cl2(5.0ml)，随后添加N-甲基吗啉(6.10μL，55.0μmol，1.1eq)并将反应溶液在室温下搅拌30min。作为固体一次性加入DBCO-胺(0.028mg，100μmol，2.0eq)并将反应混合物在室温下搅拌另外3h。将粗反应混合物吸入玻璃移液器并边强烈搅拌，边滴加至2-丙醇(100mL)中。获得白色沉淀(PEG材料)并将所得混悬液冷却至4℃并过滤(真空过滤)，用冰冷的2-丙醇(3×50mL)清洗。将分离的沉淀转移至预称重的falcon管(×2)中并溶于热(40℃)丙酮(90mL)。将溶液在冰浴中冷却15min以引起PEG材料沉淀。通过离心(10500rpm，20min，4℃)使混悬液沉淀成粒并小心弃去上清液。将沉淀颗粒再溶于新鲜的热丙酮(40℃)，在冰浴中冷却以引起沉淀并进行另一轮离心/倾倒。总计重复该过程4次。真空干燥沉淀颗粒。分离的白色固体，质量＝1.08g(99％)。RP-HPLC保留时间＝6.9min。
实施例11
mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS
Figure BDA0003571026660001251
根据来自US20060293499A1和Bioconjugate Chemistry 2003,14,395-403的修改文献程序，产生了实施例11mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS。1H NMR(300MHz,d6-DMSO)δ9.14(br,1H),8.56(m,2H),8.25-8.17(m,2H),8.04-7.97(m,4H),7.44(m,2H),7.33(m,2H),5.77(s,2H),4.69(m,2H),4.46(m,1H),3.51(br,1800H),2.81(s,4H)。
HPLC：纯度94.7％；GPC：纯度91.2％；MALDI/GPC：21048Da。
实施例12
mPEG2-Fmoc-Bi-20K-NHS
Figure BDA0003571026660001252
根据来自US20060293499A1和Bioconjugate Chemistry 2006,17,341-351的修改文献程序，产生了实施例12mPEG2-Fmoc-Bi-20K-NHS。
实施例13
rIL-2的制备
合成了如图1所示的编码所述多肽的IL-2基因并将其作为Ndel/Xhol片段克隆至pET21a(+)表达载体中。用于克隆的合成引物序列为：正向引物：5'-aatcatatggcacctacttcaagttctacaaa-3'(SEQ ID NO:4)和反向引物：5'-aatttatcaagttagtgttgagatgat-3'(SEQID NO：5)。通过限制性内切酶消化(Ndel和Xhol)鉴别阳性克隆并使用标准测序规程测序。
选择阳性克隆并在大肠杆菌(E.coli)细胞(BL21DE3)中转化。按照用于IL-2蛋白诱导的标准程序进行。简要地，将单个菌落接种至5ml含有100mg/ml氨苄西林的luria肉汤(LB)培养基中并在37℃，200rpm下生长过夜。将过夜培养物在含有100mg/ml氨苄西林的LB培养基中稀释100倍并在37℃，200rpm下生长。当600nm的吸光值达到约0.8时，用1mM IPTG诱导培养物。对于诱导期，培养温度升至42℃。诱导4小时后结束发酵。
发酵后，通过离心收获细胞。将细胞沉淀颗粒在-80℃保存以用于之后的均质化。将冷冻的细胞沉淀颗粒在细胞清洗缓冲液(20mM Tris、1mM EDTA，pH 8.0)中再混悬至10％的浓度(W/V)并以15600×g，在4℃离心30分钟。弃去上清液。将清洗的沉淀颗粒在均质化缓冲液(20mM Tris、0.1M NaCl、1mM EDTA、1mM PMSF、0.5％Trition-X100，pH 8.0)中再混悬并通过超声波仪(来自SCIENTZ,Ningbo,Zhejiang,PRC的SCIENTZ-IID)在4-15℃均质化3次。将匀浆以15600×g，在4℃离心30分钟。弃去上清液。将包涵体沉淀颗粒在缓冲液(20mMTris、0.1M NaCl，2M脲、1mM EDTA，pH 8.0)清洗并以15600×g，在4℃离心30分钟。弃去上清液。离心后，获得粗IL-2包涵体。
将粗IL-2包涵体溶于缓冲液，6M胍、100mM Tris、2mM EDTA、5mM二硫苏糖醇(DTT)，pH 8.0。将混合物在50℃培育30分钟。在减少后，将水加入至所述混合物以将胍浓度降低至4.8M。在以15600×g离心1小时后，弃去所得胶状沉淀颗粒。通过加入水将上清液中的胍浓度进一步降低至3.5M。通过100％乙酸的滴定将pH调节至5。将混合物在室温下培育60分钟并以15600×g离心1小时。将所得沉淀颗粒在3.5M胍、20mM乙酸盐、5mM DTT、pH 5的缓冲液中混悬并以15600×g离心小时。再重复该清洗步骤一次。
将纯净且减少的IL-2包涵体溶于6M胍、100mM Tris pH 8缓冲液中。添加100mMCuCl2储液以达到0.1mM的最终Cu2+浓度。将混合物在4℃培育过夜。
将表达的IL-2溶液置于透渗袋(分子量孔径3千道尔顿)中。将透渗袋置于含有4.8M胍、0.1M Tris，pH 8的缓冲液的储罐中。在平衡3小时后，首先在15小时的一段时间内，通过将水泵入所述储罐中将储罐中的胍浓度缓慢降低至2M，然后通过在8小时的一段时间内，将20mM PB pH6.0缓冲液泵入所述储罐中将其降低至小于10mM。在4℃，完成整个复性过程。用SEC-HPLC检查复性的IL-2。
将复性的IL-2以15600×g离心60分钟以除去沉淀。用Mini Pellicon TFF膜系统(Millipore Corporation,USA)浓缩上清液。
将复性并浓缩的IL-2加载至装填了SP Sepharose FF树脂的XK柱(GE HealthcareBio-Sciences AB,Uppsala Sweden)。运行缓冲液为20mM PB pH6.0并且流速为10mL/min。混合IL-2单体峰下的馏分。
通过加载至装填了Sephadex G25树脂的XK柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala Sweden)上对混合的SP Sepharsoe FF洗脱液脱盐。运行缓冲液为20mM PB pH 6.0并且流速为25mL/min。混合IL-2单体峰下的馏分。
将脱盐的IL-2单体混合物加载至装填了Q Sepharose FF树脂的XK柱(GEHealthcare Bio-Sciences AB,Uppsala Sweden)。运行缓冲液为20mM PB pH 6.0并且流速为25mL/min。混合流过峰。应注意还可以使用其它适合的纯化方法，如尺寸排阻色谱和疏水相互作用色谱(HIC色谱)。
在4℃和10-22psi工作压力下，使用Mini Pellicon TFF膜系统(MilliporeCorporation,USA)将IL-2单体馏分混合物浓缩至约1-2mg/mL。在4℃，将浓缩的IL-2单体溶液对最终制剂缓冲液(10mM乙酸-Na、5％海藻糖，pH 4.5)透析。通过将配制的IL-2溶液通过0.22μm过滤器使其无菌并将其保存在-80℃以用于今后使用。
用于偶联的冷冻干燥的rIL-2的制备：
将16小瓶rIL-2(16×5mg)从-80℃加热至室温。向冷冻干燥材料的每个小瓶中加入0.1％SDS水溶液(21mL)，将小瓶的内容物混合直至实现完全溶解。将rIL-2溶液通过UF/DF(Vivaspin20，5kDa MWCO PES)缓冲液交换为100mM硼酸钠，pH 8。将缓冲液交换的蛋白溶液无菌过滤(0.22μm PVDF)并使用Nanodrop 2000分光光度计通过UV-A280定量(3.19mg/mL)。
用于偶联的溶液-基IL-2在pH 8.0缓冲液中的制备
根据生产商的说明，使用P100柱将IL-2(15mg，10ml)缓冲液交换为100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS。通过UF/DF(Vivaspin20，5kDa MWCO PES)浓缩IL-2溶液。将缓冲液交换的蛋白溶液无菌过滤(0.22μm PVDF)并使用Nanodrop 2000分光光度计通过UV-A280定量(分别为2.67或2.5或3.0mg/mL)。
用于偶联的溶液-基IL-2在pH 9.0缓冲液中的制备
根据生产商的说明，使用P100柱将IL-2(15mg，10ml)缓冲液交换为100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS。通过UF/DF(Vivaspin20，5kDa MWCO PES)浓缩IL-2溶液。将缓冲液交换的蛋白溶液无菌过滤(0.22μm PVDF)并使用Nanodrop 2000分光光度计通过UV-A280定量(2.9mg/mL)。
实施例14
Figure BDA0003571026660001281
rIL-2通过NHS偶联至实施例1
[rIL-2]-[F-Ph-SO2-N3]z的产生
在偶联前，用100mM硼酸钠，pH 8将IL-2稀释至3.09mg/ml。
将化合物8(4.4mg)溶于DMF(0.885ml)以提供4.97mg/mL的试剂溶液。向rIL-2(10mg，3.24ml)小瓶中添加化合物8(1.79mg，360μL，6eq.)，将反应混合并在22℃培育1h。在1h，通过LC-MS分析反应以确定官能化的IL-2形式作为[rIL-2]-[F-Ph-SO2-N3]z的分布。
图2显示通过LC-MS确定，[rIL-2]-[F-Ph-SO2-N3]z的分布集中在6周围。
实施例15
Figure BDA0003571026660001291
通过20kDa Y-PEG-DBCO对[rIL-2]-[F-Ph-SO2-N3]z的点击-PEG化将20kDa Y-PEG-DBCO(143.7mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8(1.419ml)。向[rIL-2]-[F-Ph-SO2-N3]z实施例14(9.5mg，3.42ml)的溶液中添加20kDa Y-PEG-DBCO(134mg，1.33ml，10eq.)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物。使用HiLoad 26/600Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mMNaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
使用DirectDetect仪，通过IR定量样品(8.8mg，92％得率)。通过SDS-PAGE确定PEG:IL-2比。
图3显示了PEG:IL-2比等于4.9的[20K mPEG-(F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]偶联物的SDS-分析。
实施例16
Figure BDA0003571026660001301
rIL-2通过NHS偶联至实施例2
[rIL-2]-[CF3-Ph-SO2-N3]z的产生：
在偶联前，用100mM硼酸钠，pH 8将IL-2稀释至3.09mg/ml。
将化合物13(7.5mg)溶于DMF(0.816mL)以提供9.19mg/mL的试剂溶液。向rIL-2(10mg，3.24ml)小瓶中添加化合物13(3.31mg，360μL，10eq.)，将反应混合并在22℃培育1h。在1h，通过LC-MS分析反应以确定官能化的IL-2形式作为[rIL-2]-[CF3-Ph-SO2-N3]z的分布。
图1显示通过LC-MS确定，[rIL-2]-[CF3-Ph-SO2-N3]z的分布的形成集中在6周围。
实施例17
Figure BDA0003571026660001302
通过20kDa Y-PEG-DBCO对[rIL-2]-[CF3-Ph-SO2-N3]z的点击-PEG化将20kDa Y-PEG-DBCO(210.9mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8(1.388mL)。向[rIL-2]-[CF3-Ph-SO2-N3]z实施例16(9.7mg，3.49mL)的溶液中添加20kDa Y-PEG-DBCO(207mg，1.36mL，15eq.)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物。使用HiLoad 26/600 Superdex200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
使用DirectDetect仪，通过IR定量样品(7.9mg，81％得率)。通过SDS-PAGE确定PEG:IL-2比。
图3显示了PEG:IL-2比等于5.4的[20K mPEG-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]偶联物的SDS-分析。
实施例18
Figure BDA0003571026660001311
rIL-2通过NHS偶联至实施例3
[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2-N3]z的产生：
在缀合前，用100mM硼酸钠，pH 8将IL-2稀释至3.09mg/ml。将化合物18(5.0mg)溶于DMF(0.971mL)以提供5.15mg/mL的试剂溶液。向rIL-2(10mg，3.24ml)小瓶中添加化合物18(1.85mg，360μL，6eq.)，将反应混合并在22℃培育1h。在1h，通过LC-MS分析反应以确定官能化的IL-2形式作为[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2-N3]z的分布。
图1显示通过LC-MS确定，[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2-N3]z的分布的形成集中在5周围。
实施例19
Figure BDA0003571026660001321
通过20kDa Y-PEG-DBCO对[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2-N3]z的点击-PEG化将20kDa Y-PEG-DBCO(213.2mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8(1.403mL)。向[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2-N3]z实施例18(9.7mg，3.49mL)的溶液中添加20kDa Y-PEG-DBCO(207mg，1.36mL，15eq.)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物。使用HiLoad 26/600Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mMNaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
使用DirectDetect仪，通过IR定量样品(8.2mg，84％)。通过SDS-PAGE确定PEG:IL-2比。
图3显示了PEG:IL-2比等于4.9的[20K mPEG-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2]偶联物的SDS-分析。
实施例20
Figure BDA0003571026660001331
rIL-2通过NHS偶联至实施例4和通过20kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例4(5.8mg)溶于DMF(0.677mL)以提供8.57mg/mL的试剂溶液。向rIL-2(7mg，0.458μmol，2.265mL)小瓶中添加实施例4(2.16mg，4.55μmol，252μL，10eq.)，将反应混合并在22℃培育1h。1h后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将20kDa Y-PEG-DBCO(406.4mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8(2.00mL)以提供203mg/mL溶液。向[rIL-2]-[F,F-Ph-SO2-N3]z(7.0mg，0.458μmol，2.52mL)中添加20kDa Y-PEG-DBCO(199mg，9.15μmol，0.98mL，20eq.)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600 Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDaMWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μmPVDF)。作为[20K mPEG-(F,F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例20(5.2mg，74％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于4.8。
实施例21
Figure BDA0003571026660001341
rIL-2通过NHS偶联至实施例5和通过20kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例5(4.5mg)溶于DMF(0.528mL)以提供8.52mg/mL的试剂溶液。向rIL-2(7mg，0.458μmol，2.265mL)小瓶中添加实施例5(2.15mg，4.10μmol，252μL，9eq.)，将反应混合并在22℃培育1h。1h后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将20kDa Y-PEG-DBCO(406.4mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8(2.00mL)以提供203mg/mL溶液。向[rIL-2]-[F,CF3-Ph-SO2-N3]z(7.0mg，0.458μmol，2.52mL)中添加20kDa Y-PEG-DBCO(199mg，9.15μmol，0.98ml，20eq.)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600 Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μmPVDF)。作为[20K mPEG-(F,CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例21(2.9mg，41％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于4.5。
实施例22
Figure BDA0003571026660001351
rIL-2通过NHS偶联至实施例6和通过10kDa PEG-DBCO的点击-PEG化
在偶联前，用100mM硼酸钠，pH 8将IL-2稀释至3.09mg/ml。将化合物24(16.5mg)溶于DMF(1.107mL)以提供14.9mg/mL的试剂溶液。向rIL-2(10mg，3.24ml)小瓶中添加化合物24(5.96mg，400μL，11eq.)，将反应混合并在22℃培育1h。在1h，通过LC-MS分析反应以确定官能化的IL-2形式作为[rIL-2]-[Fmoc-(N3)2]z的分布。
将10kDa PEG-DBCO(Iris Biotech，276.3mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8(1.439ml)。向[rIL-2]-[Fmoc-(N3)2]z(10mg，3.64mL)的溶液中添加10kDa PEG-DBCO(262mg，1.36mL，40eq.)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物。使用HiLoad 26/600 Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
使用DirectDetect仪，通过IR定量样品。通过SDS-PAGE确定PEG:IL-2比。
图3显示了偶联物[mPEG2-T2-Fmoc-20K]z-[rIL-2]的SDS-分析，其PEG:IL-2比等于4.9。
实施例23
Figure BDA0003571026660001361
rIL-2通过NHS偶联至实施例9和通过10kDa PEG-DBCO的点击-PEG化
以与实施例14和15类似的制备程序，使用实施例9，作为[mPEG2-T2-Fmoc-Bi-20K]z-[rIL-2]制备实施例23。
实施例24
Figure BDA0003571026660001362
通过实施例11对rIL-2的PEG化
在偶联前，用100mM硼酸钠，pH 8将IL-2稀释至1.5mg/ml。将mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS实施例11溶于100mM硼酸钠，pH 8，并将其以足以达到100:1的mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS比rIL-2的摩尔比的量添加至rIL-2(10mg)。使偶联反应在22℃进行1小时以提供[mPEG2-Fmoc-Bn-20K]z-[rIL-2]偶联物。使用HiLoad 26/600 Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
使用DirectDetect仪，通过IR定量[mPEG2-Fmoc-Bn-20K]z-[rIL-2]。通过SDS-PAGE确定PEG:IL-2比。
实施例25
Figure BDA0003571026660001371
通过实施例12对rIL-2的PEG化
使用实施例24的类似PEG化和纯化条件，通过实施例12mPEG2-Fmoc-Bi-20K-NHS的rIL-2的PEG化产生了[mPEG2-Fmoc-Bi-20K]z-[rIL-2]偶联物。
实施例26
Figure BDA0003571026660001372
通过10kDa PEG双(砜)45对rIL-2二硫键的PEG化
Figure BDA0003571026660001373
向r-IL-2(4.2mg，0.25mg/ml)在100mM硼酸钠缓冲液，pH 8中的溶液中添加10mMDTT。将溶液在22℃培育1小时。使用含有20mM EDTA的100mM硼酸钠缓冲液，pH 8，通过凝胶过滤除去过量DTT。向减少的蛋白溶液中添加1.3eq 10kDa PEG双(砜)45，0.05％w/v SDS，并使溶液在22℃反应16h。将反应溶液通过Vivapure Q Mani H过滤器过滤以除去SDS。然后，使用5kDa MWCO离心过滤器，通过超滤使其缓冲液-交换为50mM乙酸钠，pH 4.0。然后，将所述溶液加载至5mL MacroCapSP树脂柱。通过0-1M氯化钠在50mM乙酸钠缓冲液，pH 4中的线性梯度，从柱上洗脱偶联物。通过尺寸排阻色谱(SEC)进一步分离偶联物以产生1.4mg产物。通过SDS-PAGE确定的纯度：97％。通过分析SEC确定的纯度：87.3％。
实施例27
通过PEG试剂46对rIL-2的PEG化
Figure BDA0003571026660001381
在2mM HCl(3.702mL)中制备405mg/mL PEG试剂46(1.50g)溶液。向rIL-2(10mg，3.135ml)中添加405mg/ml PEG试剂46(1.43g，3.535ml，100eq.)。将反应混合并在22℃培育。1h后，通过SDS-PAGE分析粗反应并通过SEC纯化。使用HiLoad 26/600 Superdex 200pg柱，通过SEC纯化粗IL-2-(PEG)z产物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。使用DirectDetect仪，通过IR定量蛋白浓度(6.6mg，66％)并通过SDS-PAGE确定PEG:IL-2的比。偶联物[mPEG2-Fmoc-20K]z-[rIL-2]的SDS-分析显示PEG:IL-2的比等于5.1。
实施例28
1-((3-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)磺 酰基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(52)
Figure BDA0003571026660001391
N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺(48)的制备：
向化合物47(1.0g，5.0mmol)在DMF(15ml)中的溶液中添加化合物22(1.3g，6.0mmol)、HATU(2.47g，6.5mmol)和TEA(1.01g，10.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。浓缩反应混合物并用乙酸乙酯和水溶解。用乙酸乙酯萃取混合物(3×20mL)。用盐水清洗合并的有机物，用硫酸钠干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩。通过柱色谱法纯化所得残余物以提供黄色油状的化合物48(900mg)。
N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-((2-羟基-5-甲氧基戊基)磺酰基)苯甲酰胺(50)的制备：
在-78℃，在N2下，向化合物48(400mg，1mmol)和化合物49(560mg，5.5mmol)在无水THF(30ml)中的溶液中缓慢添加KHMDS(5.5ml，5.5mmol)。将反应混合物在-78℃搅拌2h。通过饱和NH4Cl水溶液使反应混合物淬灭。用乙酸乙酯萃取混合物(3×20mL)。用盐水清洗合并的有机物，用硫酸钠干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩。通过2％CH3OH在CH2Cl2中的溶液洗脱，通过柱色谱法纯化所得残余物以提供黄色油状的化合物50(168mg)。
1-((3-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-氨基甲酰基)苯基)磺酰基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(51)的制备：
向化合物50(100mg，0.2mmol)和三光气(89mg，0.3mmol)在无水THF(5ml)中的溶液中缓慢添加吡啶(64mg，0.8mmol)。将反应混合物在rt.搅拌20min。然后，将其通过旋转蒸发过滤并浓缩。在下一步中使用所得残余物。
向所得残余物(117mg，0.2mmol)和HOSu(69mg，0.6mmol)在无水THF(5mL)中的溶液中缓慢添加吡啶(64mg，0.8mmol)。在RT下搅拌反应混合物30min。用乙酸乙酯萃取混合物(3×10mL)。用盐水清洗合并的有机物，用硫酸钠干燥，过滤并通过旋转蒸发浓缩。通过制备-TLC纯化所得残余物(CH2Cl2：CH3OH＝30：1)以提供无色油状的化合物51(55mg)。
LCMS：m/z 644.25[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(s,1H),8.18(d,J＝7.6Hz,1H),8.04(d,J＝7.7Hz,1H),7.68(t,J＝8.0Hz,1H),7.37(br s,1H),5.30–5.24(m,1H),3.77–3.55(m,15H),3.45–3.31(m,5H),3.27(s,3H),2.81(s,4H),1.94–1.78(m,2H),1.66–1.58(m,2H)。
实施例29
1-((3-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-4-(三 氟甲基)苯基)磺酰基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(61)
Figure BDA0003571026660001411
甲基5-((4-甲氧苯甲基)硫基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯(54)的制备：
将化合物52(5.0g，17.66mmol，1.0eq)、化合物53(4.09g，26.5mmol，1.5eq)、Pd2(dba)3(1.62g，1.76mmol，0.1eq)、Xant-phose(2.04g，3.52mmol，0.2eq)和DIEA(6.84g，52.99mol，3.0eq)在二噁烷(50mL)中的溶液在80℃搅拌2hr。将所得混合物冷却至rt并通过硅藻土垫过滤。浓缩滤液并将残余物溶于EtOAc(100mL)。用水(100mL)清洗混合物并用EtOAc(100ml×3)萃取，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶上纯化残余物(PE/EA＝100/1至80/1至50/1)以提供淡黄色油状的化合物54(6.2g，98％)。
TLC：PE/EA＝10/1，UV，Rf(化合物52)＝0.80，Rf(化合物54)＝0.60。
LC-MS：379.10[M+23]+。
甲基5-巯基-2-(三氟甲基)苯甲酸酯(55)的制备：
通过微波，在120℃运行化合物54(1.0g，2.80mmol，1.0eq)和TES(0.98g，8.42mmol，3.0eq)在TFA(15ml)中的溶液1hr。将所得混合物减压浓缩。将残余物倒入冰-水(20mL)中并通过碳酸氢钠水溶液将混合物调节至pH＝7～8。通过EtOAc(30mL×3)萃取混合物，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供灰色油状的化合物55(800mg)，将其直接在下一步中使用而未进一步纯化。
TLC：PE/EA＝5:1，UV，Rf(化合物54)＝0.80，Rf(化合物55)＝0.30。
甲基5-(甲硫基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯(56)的制备：
在0℃，向化合物55(4.8g，20.32mmol，1.0eq)在MeCN(50mL)中的溶液中滴加K2CO3(8.5g，60.96mmol，3.0eq)和CH3I(14.4g，101.6mmol，5.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌16hr。向所得混合物加入水并通过EtOAc(50mL×3)萃取，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶(PE)上纯化残余物以提供黄色固体状的化合物56(4.0g，78％)。
TLC：PE/EA＝5:1，UV，Rf(化合物55)＝0.30，Rf(化合物56)＝0.85。
LC-MS：251.00[M+1]+。
甲基5-(甲基磺酰基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯(57)的制备：
在0℃，向化合物56(4.7g，18.78mmol，1.0eq)在DCM(50mL)中的溶液中分部分添加m-CPBA(19.5g，112.68mmol，6.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌16hr。通过碳酸氢钠溶液使反应混合物淬灭。通过DCM(50mL×3)萃取混合物，用NaCl溶液(100mL×3)清洗，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶上纯化残余物(PE/EA＝100/1至50/1至20/1至10/1)以提供白色固体状的化合物57(2.97g，56％)。
TLC：PE/EA＝5:1，UV，Rf(化合物56)＝0.85，Rf(化合物57)＝0.10。
甲基5-((2-羟基-5-甲氧基戊基)磺酰基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯(58)的制备：
在-78℃，向化合物57(0.9g，3.543mmol，1.0eq)和4-甲氧基丁醛(0.724mg，7.086mmol，2.0eq)在THF(10ml)中的溶液中滴加KHMDS(5.4ml，5.315mmol，1.5eq)，将反应混合物在-78℃搅拌2小时。在0℃，通过NH4Cl水溶液使反应淬灭，并通过EtOAc(30ml×3)萃取。用饱和NaCl溶液(100mL×3)清洗有机相，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶上纯化残余物(PE/EA＝20/1至5/1至2/1)以提供黄色油状的化合物58(520mg，40％)。
TLC：PE/EA＝2:1，UV，Rf(化合物57)＝0.60，Rf(化合物58)＝0.20。
LC-MS：385.10[M+1]+。
5-((2-羟基-5-甲氧基戊基)磺酰基)-2-(三氟甲基)苯甲酸(59)的制备：
在0℃，向化合物58(510mg，1.327mmol，1.0eq)在MeOH/THF＝1/1(6ml)中的溶液中滴加5％LiOH(63.6mg，2.654mmol，2.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌2hr。用1N HCl将反应混合物调节至pH 2。通过EtOAc(20ml×3)萃取混合物，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供黄色油状的化合物59(505mg，粗产物，100％)。
LC-MS：393.10[M+23]+。
N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((2-羟基-5-甲氧基戊基)磺酰基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺(60)的制备
将化合物59(1.0g，3.24mmol，1.0eq)、化合物22(0.849g，3.89mmol，1.2eq)、HATU(1.6g，4.21mmol，1.3eq)和TEA(0.982g，9.72mol，3.0eq)在DMF(12ml)中的溶液在室温下搅拌16hr。向反应混合物加入水(50mL)并通过乙酸乙酯萃取(30ml×3)。用NaCl的水溶液(50mL×3)清洗有机相，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶上(PE/EA＝20/1至10/1至5/1至2/1至1/1)并通过制备-TLC纯化残余物以提供淡黄色油状的化合物60(520mg，34％)。
LC-MS：571.35[M+1]+。
1-((3-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(61)的制备
在0℃，向化合物60(0.3g，0.5258mmol，1.0eq)在THF(3ml)中的溶液中分部分添加吡啶(0.166g，2.103mmol，4.0eq)和三光气(0.39g，1.3145mmol，2.5eq)。将混合物在室温下搅拌30min。将反应混合物过滤并减压浓缩。将残余物溶于THF(3mL)。在0℃，向混合物分部分添加吡啶(0.166g，2.103mmol，4.0eq)和HOSU(0.182g，1.5774mmol，3.0eq)。将混合物在rt搅拌1hr。在0℃，用水使反应混合物淬灭，并通过EtOAc(20mL×3)萃取。用Na2SO4干燥有机相，过滤并减压浓缩。通过制备-HPLC(0.1％HCOOH)纯化残余物。用EtOAc萃取洗脱溶液。用Na2SO4干燥有机相，过滤并减压浓缩以提供无色油状的化合物61(150mg，40％)。
LC-MS：712.35[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝9.5Hz,2H),7.94(d,J＝8.1Hz,1H),6.94(s,1H),5.31(d,J＝6.9Hz,1H),3.65(d,J＝6.3Hz,8H),3.59(q,J＝5.0Hz,6H),3.36(dt,J＝18.4,5.4Hz,4H),3.29(d,J＝1.0Hz,3H),2.83(s,4H),1.90(q,J＝7.2Hz,2H),1.65(d,J＝8.5Hz,2H)。
实施例30
1-((3-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-4-氯苯 基)磺酰基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(68)
Figure BDA0003571026660001441
甲基2-氯-5-(甲硫基)苯甲酸酯(63)的制备
在室温下，向化合物62(10.0g，49.53mmol，1.0eq)、CH3I(7.73g，54.48mmol，1.1eq)的溶液中添加K2CO3(7.5g，54.48mmol，1.1eq)。将反应混合物在rt下搅拌3hr。向所得混合物中加入水(200mL)和EtOAc(200mL)。分离有机层，用5％LiCl水溶液清洗5次，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供黄色油状的化合物63(11.0g，粗产物)。
TLC：PE/EA＝3/1，UV，Rf(化合物62)＝0.05，Rf(化合物63)＝0.85。
1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.61(d,J＝2.3Hz,1H),7.44–7.32(m,2H),3.88(s,3H),2.48(s,3H)。
甲基2-氯-5-(甲基磺酰基)苯甲酸酯(64)的制备
在0℃，向化合物63(6.0g，27.78mmol，1.0eq)在DCM(60mL)中的溶液中分部分添加m-CPBA(28.7g，166.67mmol，6.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌16hr。通过碳酸氢钠水溶液使反应混合物淬灭，用DCM萃取(100mL×3)，用NaCl水溶液(100mL×3)清洗，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶上(PE/EA＝40/1至20/1至3/1)纯化残余物以提供白色固体状的化合物64(5.6g，81％)。
TLC：PE/EA＝3/1，UV，Rf(化合物63)＝0.85，Rf(化合物64)＝0.45。
1HNMR(CD3OD,400MHz)δ8.39(d,J＝2.4Hz,1H),7.96(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),7.66(d,J＝8.4Hz,1H),3.96(s,3H),3.07(s,3H)。
2-氯-5-(甲基磺酰基)苯甲酸(65)的制备
在0℃，向化合物64(2.5g，1.327mmol，1.0eq)在MeOH/THF＝1/1(6ml)中的溶液中滴加5％LiOH水溶液(63.6mg，2.654mmol，2.0eq)。将反应混合物在室温下搅拌2hr。用1NHCl将反应调节至pH＝3-4，浓缩。通过EtOAc(20ml×3)萃取水相，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供淡黄色固体状的化合物65(2.1g，粗产物)。
TLC：PE/EA＝3:1，UV，Rf(化合物64)＝0.45，Rf(化合物65)＝0.05。
1HNMR(CD3OD,400MHz)δ8.36(d,J＝2.3Hz,1H),8.02(dd,J＝8.4,2.3Hz,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),3.15(s,3H)。
N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-氯-5-(甲基磺酰基)苯甲酰胺(66)的制备
将化合物65(879mg，3.74mmol，1.0eq)、化合物22(900mg，4.12mmol，1.1eq)、HATU(1.85g，4.87mmol，1.3eq)和TEA(1.14g，11.24mol，3.0eq)在DMF(8ml)中的混悬液在室温下搅拌16hr。向反应混合物加入水(20mL)并通过乙酸乙酯(30mL×3)萃取，用NaCl水溶液(50mL×3)清洗，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶上(PE/EA＝100/1至10/1至5/1至2/1至1/1)纯化残余物以提供无色油状的化合物66(995mg，61％)。
TLC：PE/EA＝0:1，UV，Rf(化合物65)＝0.25，Rf(化合物66)＝0.55。
1HNMR(CD3OD,400MHz)δ8.04–7.96(m,2H),7.73(d,J＝8.3Hz,1H),3.70–3.53(m,14H),3.33(s,2H),3.15(s,3H)。
N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-氯-5-((2-羟基-5-甲氧基戊基)磺酰基)苯甲酰胺(67)的制备
在-78℃，向化合物66(700mg，1.609mmol，1.0eq)和4-甲氧基丁醛(657mg，6.44mmol，4.0eq)在THF(7ml)中的溶液中滴加KHMDS(5.4ml，5.315mmol，1.5eq)。将反应混合物在-78℃下搅拌2hr。在0℃，通过NH4Cl水溶液使反应淬灭，通过乙酸乙酯(30mL×3)萃取，用NaCl水溶液(100mL×3)清洗，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶上(PE/EA＝20/1至5/1至2/1)纯化残余物以提供淡黄色油状的化合物67(205mg，25％)。
TLC：PE/EA＝0:1，UV，Rf(化合物66)＝0.55，Rf(化合物67)＝0.50。
1HNMR(CD3OD,400MHz)δ8.01–7.92(m,2H),7.71(d,J＝8.4Hz,1H),4.16–4.01(m,2H),3.72–3.53(m,12H),3.42–3.35(m,3H),3.31–3.25(m,5H),1.73–1.39(m,4H)。
1-((3-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-4-氯苯基)磺酰基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(68)的制备
在0℃，向化合物67(200mg，0.372mmol，1.0eq)在THF(2mL)中的溶液中分部分添加吡啶(117.5mg，1.49mmol，4.0eq)和三光气(221mg，0.744mmol，2.0eq)。将混合物在室温下搅拌30min。将反应混合物过滤并减压浓缩。将残余物溶于THF(3mL)。在0℃，向混合物分部分添加吡啶(117.5mg，1.49mmol，4.0eq)和HOSU(128mg，1.12mmol，3.0eq)。将混合物在室温下搅拌1hr。在0℃，通过水淬灭反应混合物，通过乙酸乙酯(20mL×3)萃取，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过制备-HPLC(0.1％HCOOH)纯化残余物并通过乙酸乙酯萃取，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供浅黄色油状的化合物68(101mg，27％)。
TLC：PE/EA＝0/1，UV，Rf(化合物67)＝0.50，Rf(化合物68)＝0.55。
LC-MS：678.25[M+1]+。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(s,1H),7.94–7.86(m,1H),7.64(d,J＝8.4Hz,1H),7.00(s,1H),5.29(s,1H),3.74–3.52(m,15H),3.44–3.31(m,5H),3.28(s,3H),2.82(s,4H),1.87(d,J＝7.4Hz,2H),1.61(s,2H)。
实施例31
7-((3-(2,7-双((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰 基)-9H-咔唑-9-基)丙基)氨基)-7-氧-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二 氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(82)
Figure BDA0003571026660001471
Figure BDA0003571026660001481
Figure BDA0003571026660001491
叔丁基6-羟基己酸酯(70)的制备
对化合物69(100g，876mmol)和t-BuOK(108g，964mmol)在t-BuOH(600ml)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，然后将混合物在120℃，在N2气氛下搅拌2.5hr。TLC(板1，二氯甲烷/甲醇＝10/1，化合物69，Rf＝0.60，化合物70，Rf＝0.50)表明化合物69完全消耗并且形成一个新斑点。根据TLC，反应是纯净的。将反应混合物在二氯甲烷(600mL)和水(1.20L)之间分配。分离有机相，用盐水清洗(300ml)，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物以提供黄色油状的化合物70(127g，77.2％得率)并将其在未进一步纯化的情况下在下一步中使用。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 3.66-3.63(m,2H),2.25-2.21(m,2H),1.66-1.57(m,5H),1.44(s,9H),1.40-1.39(m,2H)。
叔丁基6-氧己酸酯(71)的制备
向化合物70(64.0g，340mmol)在DCM(400ml)中的溶液中添加Dess-Martin试剂(159g，374mmol，116ml)。将混合物在20℃搅拌2hr。TLC(板1，石油醚/乙酸乙酯＝1/1，化合物70Rf＝0.40，化合物71Rf＝0.50)表明化合物70完全消耗。通过添加NaHCO3水溶液(200mL)使反应混合物淬灭并用DCM萃取(100mL×3)。用盐水(100mL)清洗合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物。通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1/1，板2，石油醚/乙酸乙酯＝1/1，化合物71Rf＝0.50)纯化残余物以提供黄色油状的化合物71(26.8g，42.3％得率)。
1H NMR:(400MHz CDCl3)δppm 2.44-2.21(m,4H),1.65-1.60(m,4H),1.43(s,9H)。
叔丁基6-羟基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)庚酸酯(72)的制备
向化合物11(7.15g，31.9mmol)在THF(30.0ml)中的溶液中滴加n-BuLi(2.5M，11.60ml)，将混合物在0℃搅拌30min。然后，在-78℃添加化合物71(5.40g，29.0mmol)在THF(5.00ml)中的溶液。将混合物在-78℃搅拌1.5hr。TLC(板1，石油醚/乙酸乙酯＝1/1，化合物71Rf＝0.70，化合物72Rf＝0.40)表明化合物71完全消耗。通过添加NH4Cl水溶液(50.0mL)使反应混合物淬灭，然后用EtOAc萃取(20.0mL×3)。用盐水(30.0mL)清洗合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物。通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝30/1至1/1，板2，石油醚/乙酸乙酯＝1/1，化合物72Rf＝0.40)纯化残余物以提供黄色固体状的化合物72(8.57g，72.0％得率)。
1H NMR:(400MHz CDCl3)δppm 8.10-8.08(d,J＝8.4Hz,2H),7.88-7.86(d,J＝8Hz,2H),4.21-4.20(m,1H),3.31-3.16(m,3H),2.23-2.18(m,2H),1.61-1.35(m,15H)。
6-羟基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)庚酸(73)的制备
将化合物72(1.00g，2.44mmol)加入到微波管中的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(15.0ml)中。将密封管在微波下在110℃加热1hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，化合物72：Rf＝0.5，化合物73：Rf＝0.2)表明化合物72完全消耗。减压浓缩该反应混合物以提供残余物。将粗产物直接用于下一步而未纯化以提供黄色胶状的化合物73(0.860g，2.43mmol，99.6％得率)。
1H NMR:(400MHz DMSO)δppm 11.93(s,1H),8.00-8.13(m,4H),5.11-5.17(m,1H),4.85(d,J＝5.2Hz,1H),3.90(s,1H),3.43-3.48(m,2H),2.16(t,J＝8.0Hz,2H),1.33-1.46(m,6H)。
二甲基2-硝基-[1,1'-联苯]-4,4'-二羧酸酯(75)的制备
将化合物74(33.0g，122mmol)在H2SO4(330ml)中的溶液冷却至-5℃，并且在1hr的一段时间内，在搅拌下滴加HNO3(13.8g，127mmol，9.85ml，58％的纯度)和H2SO4(22.8g，232mmol，12.4mL)的混合物，同时将温度维持在-5-0℃。然后，将混合物在-5-0℃搅拌1hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝3/1，产物Rf＝0.50)显示化合物74(Rf＝0.60)被消耗，形成了具有更大极性的主要的新斑点。用水(300mL)稀释混合物，并用乙酸乙酯(50.0mL×2)萃取。用盐水(50.0mL)和碳酸氢钠溶液(100mL)清洗萃取物，用无水硫酸钠干燥并蒸发。通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至0/1)纯化残余物以提供白色固体状的化合物75(16.0g，50.6mmol，41.4％得率，99.6％纯度)。
1H NMR:(400MHz,CDCl3)δ8.57(s,1H),8.31-8.29(d,J＝8.0Hz,1H),8.14-8.12(d,J＝8.4Hz,2H),7.56-7.54(d,J＝8.0Hz,1H),7.42-7.40(d,J＝8.4Hz,2H),4.01(s,3H),3.96(s,3H)。
二甲基9H-咔唑-2,7-二羧酸酯(76)的制备
将化合物75(20g，63.4mmol)、PPh3(41.6g，159mmol)在1,2-二氯苯(112ml)中的混合物在25℃脱气并用N2吹扫3次，然后将混合物在210℃，在N2气氛下搅拌1.5hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，化合物75：Rf＝0.43)显示化合物75完全消耗并且形成了一个新的主要斑点。根据TLC，反应是纯净的。将反应冷却至25℃，添加甲醇(200mL)。15min后，通过过滤收集所得固体混悬液以提供作为灰色固体获得的化合物76(12.0g，42.4mmol，66.8％得率)。
1H NMR:(400MHz,DMSO)δ11.81(s,1H),8.33(d,J＝4.2Hz,2H),8.17(s,2H),7.82(d,J＝7.6Hz,2H),3.91(s,6H)。
二甲基9-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)-9H-咔唑-2,7-二羧酸酯(77)的制备
在0℃，向NaH(2.30g，57.6mmol，60％纯度)在DMF(80.0ml)中的溶液中添加化合物76(13.6g，48.0mmol)。将混合物在0℃搅拌1hr，然后添加叔丁基N-(3-溴丙基)氨基甲酸酯(22.9g，96.0mmol)，将混合物在40℃搅拌3hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝5/1，化合物76：Rf＝0.2，产物：Rf＝0.7)表明化合物76完全消耗。用NH4Cl(100mL)水溶液稀释反应混合物并用EtOAc萃取(150mL×2)。用盐水(100mL)清洗合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物。通过柱色谱法(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1/1)纯化残余物以提供黄色固体状的化合物77(16.4g，37.2mmol，77.6％得率)。
1HNMR：(400MHz,DMSO)δ8.36(d,J＝8.4Hz,2H),8.31(s,2H),7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.03(t,J＝4.8Hz,1H),4.56(t,J＝6.4Hz,2H),3.74(s,6H),2.99-3.00(m,2H),1.87-1.98(m,2H),1.22-1.36(m,9H)。
9-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)-9H-咔唑-2,7-二羧酸(78)的制备对化合物77(8.00g，18.2mmol)和NaOH(2.18g，54.5mmol)在THF(30.0mL)、MeOH(30.0mL)和H2O(10.0mL)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，然后将混合物在80℃，在N2气氛下搅拌12hr。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10/1，化合物77：Rf＝0.8)表明化合物77完全消耗。将反应混合物小心倒入100ml冰-水，并用1N HCl稀释至pH＝4。过滤反应混合物并用20.0mL水清洗滤饼，真空干燥。将粗产物直接用于下一步而无需进一步纯化以提供浅黄色固体状的化合物78(5.00g，12.1mmol，66.8％得率)。
1HNMR：(400MHz,CDCl3)δ13.01(s,2H),8.34(d,J＝8.0Hz,2H),8.25(s,2H),7.85(q,J＝8.0Hz,2H),4.56(t,J＝6.4Hz,2H),2.97-3.00(m,2H),1.89-1.99(m,2H),1.37(m,8H)。
叔丁基(3-(2,7-双((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-9H-咔唑-9-基)丙基)氨基甲酸酯(79)的制备
向化合物78(5.00g，12.1mmol)在DMF(50.0ml)中的溶液中添加HATU(11.5g，30.3mmol)和DIPEA(6.27g，48.5mmol)以及2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙胺(5.29g，24.3mmol)。将混合物在15℃搅拌3hr。LC-MS显示出具有所期望的检测MS的一个新的峰(化合物79：Rt＝0.752min)。用水(90.0mL)稀释反应混合物并用2-Me-THF(50.0mL×2)萃取。用水(50.0mL)清洗合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物。通过反相HPLC(0.1％NH4HCO3条件)纯化粗产物以提供白色固体状的化合物79(4.00g，4.92mmol，40.6％得率)。
1HNMR：(400MHz,DMSO)δ8.68(t,J＝5.2Hz,2H),8.31(d,J＝8.4Hz,2H),8.19(s,2H),7.79(d,J＝8.4Hz,2H),7.03(t,J＝4.8Hz,2H),4.53(t,J＝7.2Hz,2H),3.54-3.65(m,26H),3.40-3.41(m,4H),3.38-3.40(m,2H),3.03-3.05(m,2H),1.99-2.02(m,2H),1.40(s,9H)。
9-(3-氨基丙基)-N2,N7-双(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9H-咔唑-2,7-二甲酰胺(80)的制备
向化合物79(3.00g，3.69mmol)在DCM(25.0mL)中的溶液中添加HCl/MeOH(5.00mL)。将混合物在15℃搅拌1hr。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10/1，化合物79：Rf＝0.6，化合物80：Rf＝0.05)表明化合物79完全消耗。减压浓缩该反应混合物以提供残余物。将粗产物直接用于下一步而无需进一步纯化以提供黄色固体状的化合物80(2.70g，3.60mmol，97.7％得率，HCl盐)。
1HNMR：(400MHz,DMSO)δ8.78(t,J＝5.6Hz,2H),8.36(s,2H),8.27(d,J＝8.0Hz,2H),8.05(s,3H),7.77(d,J＝8.4Hz,2H),4.63(t,J＝6.8Hz,2H),3.65-3.60(m,17H),3.50-3.56(m,5H),3.36-3.37(m,5H),2.88-2.91(m,2H),2.14-2.18(m,2H)。
N2,N7-双(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9-(3-(6-羟基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)庚酰胺基)丙基)-9H-咔唑-2,7-二甲酰胺(81)的制备
对化合物80(1.80g，2.40mmol，HCl)，化合物73(851mg，2.40mmol)、HOBt(487mg，3.60mmol)、EDCI(691mg，3.60mmol)和Et3N(2.19g，21.6mmol)在DCM(15.0ml)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，然后将混合物在25℃，在N2气氛下搅拌2hr。LC-MS显示出具有所期望的检测MS的一个新的峰(化合物81：Rt＝1.21min)。用水(30.0mL)稀释反应混合物并用EtOAc(20.0mL×3)萃取。用盐水(30.0mL)清洗合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物。通过制备-HPLC(柱：Xtimate C18 10u 250mm×80mm；流动相：[水(10mMNH4HCO3)-ACN]；B％：35％-65％，21min)纯化残余物以提供浅黄色固体状的化合物81(1.00g，953umol，39.7％得率)。
1HNMR：(400MHz,DMSO)δ8.71(t,J＝5.6Hz,2H),8.33(d,J＝8.4Hz,2H),8.20(s,2H),8.16(d,J＝8.0Hz,2H),8.05(d,J＝8.4Hz,2H),7.92-7.93(m,1H),7.81(d,J＝8.4Hz,2H),4.89(d,J＝7.0Hz,1H),4.55(t,J＝7.2Hz,2H),3.93(s,1H),3.56-3.67(m,30H),3.40-3.42(m,5H),3.15-3.16(m,2H),2.01-2.11(m,4H),1.27-1.51(m,7H)。
7-((3-(2,7-双((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-9H-咔唑-9-基)丙基)氨基)-7-氧-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(82)的制备
在0℃，向化合物81(500mg，477umol)和N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(977mg，3.81mmol)在ACN(6.00ml)中的溶液中添加吡啶(188mg，2.38mmol)。将混合物在15℃搅拌1hr。LC-MS显示出具有所期望的检测MS的一个新的峰(产物：Rt＝2.26min)。用水(20.0mL)稀释反应混合物并用DCM(10.0mL×5)萃取。用水(20.0mL)清洗合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以提供残余物。通过制备-HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250×50mm×10um；流动相：[水(0.04％HCl)-ACN]；B％：50％-70％，10min)纯化残余物以提供黄色固体状的82(0.102g，79.4umol，16.7％得率，92.7％纯度)。
1HNMR：(400MHz,DMSO)δ8.6(t,J＝5.6Hz,2H),8.26(d,J＝8.0Hz,2H),8.13-8.17(m,4H),8.01-8.11(m,3H),7.96(d,J＝5.6Hz,2H),5.16-5.18(m,1H),4.49(t,J＝6.4Hz,2H),3.91-4.12(m,13H),3.55-3.59(m,14H),4.49-4.53(m,4H),3.34-3.36(m,4H),3.09-3.10(m,2H),2.79(s,4H),1.97-2.06(m,4H),1.61-1.68(m,2H),1.42-1.44(m,2H),1.23-1.25(m,2H)。
HPLC：保留时间：2.632min，面积百分比：92.0％。
LCMS：保留时间：2.630min，M+H+＝1190.4。
实施例32
7-叠氮基-1-((3-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰 基)苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(86)
Figure BDA0003571026660001541
N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺(84)的制备
向化合物83(2.0g，10mmol，1.0eq)和化合物22(2.18g，10mmol，1.0eq)在二甲基甲酰胺(40ml)中的溶液中添加2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(4.56g，12mmol，1.2eq)和N,N-二异丙基乙胺(2.0g，20mmol，2.0eq)。在室温下将混合物搅拌过夜。通过LCMS和TLC监测反应。用水(50mL)稀释混合物，用乙酸乙酯(5×150mL)萃取并用盐水(100mL)清洗。用硫酸钠干燥有机层并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶(二氯甲烷：甲醇，97:3)上纯化残余物以提供化合物84(2.5g，63％)
TLC：二氯甲烷：甲醇＝10：1，UV 254nm，通过I2显色，Rf：(化合物83)＝0.3；Rf：(化合物84)＝0.5。
3-((7-叠氮基-2-羟庚基)磺酰基)-N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺(85)的制备
在-78℃，向化合物84(2.0g，5.0mmol，1.0eq)在四氢呋喃(30ml)中的溶液中缓慢添加双(三甲基甲硅烷基)氨基钾(1.0M，15mL，15mmol，3.0eq)。然后，将化合物3(2.1g，15mmol，3.0eq)加入至所述混合物。将反应混合物在室温下搅拌2h。通过TLC监测反应。然后，用饱和氯化铵水溶液(30mL)使混合物淬灭，用乙酸乙酯(2×30mL)萃取。用盐水(20mL)清洗有机层，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶(二氯甲烷：甲醇，97:3)上纯化残余物以提供化合物85(400mg，15％)
TLC：二氯甲烷：甲醇＝10：1，UV 254nm，Rf：(化合物84)＝0.5；Rf：(化合物85)＝0.5。
7-叠氮基-1-((3-((2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)磺酰基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(86)的制备
向化合物85(400mg，0.74mmol，1.0eq)在四氢呋喃(4mL)中的混合物中添加三光气(372mg，1.25mmol，1.7eq)和吡啶(117mg，1.48mmol，2.0eq)。在搅拌30min后，过滤反应混合物。向滤液中添加吡啶(117mg，1.48mmol，2.0eq)和N-羟基琥珀酰亚胺(176mg，0.89mmol，1.2eq)。将混合物在室温下搅拌2h。通过LCMS监测反应。用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物并用盐水(5mL)清洗。然后，用硫酸钠干燥有机层，过滤并减压浓缩。通过制备-HPLC纯化残余物以提供无色油状的化合物86(270mg，54％)。
LCMS：[M+1]+＝683。
1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.32(s,1H),8.17(d,J＝8.0Hz,1H),8.04(d,J＝7.6Hz,1H),7.68(t,J＝7.6Hz,1H),7.29(s,1H),5.25(s,1H),3.59-3.66(m,16H),3.37-3.32(m,2H),3.25(t,J＝6.8Hz,2H),2.81(s,4H),1.79(s,2H),1.57(s,2H),1.39(s,4H)。
实施例33
1-叠氮基-12-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-13-氧-19- ((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十九烷-18-基(2,5-二氧代吡咯烷- 1-基)碳酸酯(89)
Figure BDA0003571026660001561
N,N-双(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-6-羟基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)庚酰胺(88)的制备
向化合物73(102mg，0.3mmol，1.2eq)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中添加2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(136mg，0.76mmol，1.5eq)和N,N-二异丙基乙胺(124mg，0.96mmol，4.0eq)。将混合物在室温下搅拌10分钟。然后，向所述混合物中添加化合物87(100mg，0.24mmol，1.0eq)并搅拌2h。通过LCMS和TLC监测反应。用水(10mL)稀释混合物，用乙酸乙酯(5×10mL)萃取并用盐水(10mL)清洗。用硫酸钠干燥有机层，过滤并减压浓缩。通过柱色谱法在硅胶(二氯甲烷：甲醇，98:2)上纯化残余物以提供化合物88(50mg，28％)
TLC：二氯甲烷：甲醇＝10：1，UV 254nm，通过I2显色，Rf：(化合物87)＝0.5；Rf：(化合物88)＝0.4。
1-叠氮基-12-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-13-氧-19-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十九烷-18-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(89)的制备
向化合物88(400mg，0.53mmol，1.0eq)在四氢呋喃(4ml)中的混合物中添加三光气(267mg，0.9mmol，1.7eq)和吡啶(84mg，1.06mmol，2.0eq)。将反应混合物搅拌30min。过滤反应混合物。向滤液中添加吡啶(84mg，1.06mmol，2.0eq)和N-羟基琥珀酰亚胺(73mg，0.64mmol，1.2eq)。将混合物在室温下搅拌2h。通过LCMS监测反应。用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物并用盐水(5mL)清洗。然后，用硫酸钠干燥混合物，过滤并减压浓缩。通过制备-HPLC纯化残余物以提供黄色油状的化合物89(85mg，18％)。
LCMS：[M+1]+＝897。
1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.15-8.13(d,J＝8.0Hz,2H),7.96-7.94(d,J＝8.8Hz,2H),5.27(m,1H),3.89(m,1H),3.73(m,1H),3.59-3.61(m,26H),3.35(m,6H),2.81(s,4H),3.46-3.42(m,2H),1.79-1.77(m,2H),1.58(m,2H)和1.39-1.37(m,2H)。
实施例34
15kDa Y-PEG-DBCO
Figure BDA0003571026660001571
向配备有特氟龙涂层磁力搅拌棒的干燥圆-底烧瓶中添加15kDa Y-PEG-NHS(1.13g，74.9μmol，1.0eq)和PyClocK(0.082g，148μmol，2.0eq)。用橡胶隔片密封烧瓶并置于惰性氩气气氛下。添加无水CH2Cl2(18ml)，随后添加N-甲基吗啉(18μL，164μmol，2.2eq)并将反应在室温下搅拌30min。将DBCO-胺(52mg，188μmol，2.5eq)在CH2Cl2(2mL)中的溶液与N-甲基吗啉(18μL，164μmol，2.2eq)一起一次性加入，并将反应混合物在室温下搅拌另外5h。真空浓缩粗反应混合物，然后加入热2-丙醇(120mL)。将所得溶液在冰浴中冷却以形成沉淀物。将分离的沉淀物转移至预先称重的falcon管(×3)中，并通过离心(12000rpm，30min，-3℃)是沉淀物沉降。用2-丙醇(120mL)重复沉淀1次，并用丙酮(3×120mL)重复3次。真空干燥沉淀颗粒。分离的白色固体，质量＝995mg(88％)。RP-HPLC保留时间＝6.9min。
实施例35
17kDa Y-PEG-DBCO
Figure BDA0003571026660001581
向配备有特氟龙涂层磁力搅拌棒的干燥圆-底烧瓶中添加17kDa Y-PEG-NHS(1.0g，57.2μmol，1.0eq)和CH2Cl2(18.0mL)。用橡胶隔片密封烧瓶并置于惰性氩气气氛下。添加DBCO-胺(40mg，145μmol，2.5eq)，随后添加N-甲基吗啉(19μL，173μmol，3.0eq)，并将反应在室温下搅拌过夜。真空浓缩粗反应混合物，然后加入热丙酮(90mL)。将所得溶液在冰浴中冷却30min以形成沉淀物，通过离心(11000rpm，30min，-8℃)使沉淀物沉降。倒掉溶剂并用2-丙醇(90mL)重复沉淀过程1次，用丙酮(2×90mL)重复2次。真空干燥所得固体。分离的白色固体，质量＝910mg(91％)。RP-HPLC保留时间＝6.7min。
实施例36
7.5kDa PEG-DBCO
Figure BDA0003571026660001582
7.5kDa PEG-DBCO试剂购自JenKem Technology USA。HPLC：纯度98.0％；GPC：纯度99.1％；MALDI：7481Da。
实施例37
Figure BDA0003571026660001591
rIL-2通过NHS偶联至实施例2和使用15kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例2(3.2mg)溶于DMF(439μL)以提供7.29mg/mL的试剂溶液。用100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(841μL)稀释IL-2(8.0mg，0.523μmol，2.76mL)并加入实施例2(2.92mg，5.77μmol，400μL，11eq)。将反应混合并在22℃培育1h。1h后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将15kDa Y-PEG-DBCO(125mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(500μL)以提供250mg/mL溶液。向[rIL-2]-[CF3-Ph-SO2-N3]z(7.6mg，0.497μmol，3.80ml)添加15kDa Y-PEG-DBCO(114mg，7.47μmol，455μl，15eq)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
作为[15K mPEG-(CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例37(5.55mg，73％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于6.7。
实施例38
Figure BDA0003571026660001601
rIL-2通过NHS偶联至实施例3和用15kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例3(3.0mg)溶于DMF(607μL)以提供4.94mg/mL的试剂溶液。用100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(933μL)稀释IL-2(8.0mg，0.523μmol，2.67mL)并添加实施例3(1.98mg，4.19μmol，400μL，8eq)。将反应混合并在22℃培育1h。1h后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将15kDa Y-PEG-DBCO(150mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(1.00mL)以提供150mg/mL溶液。向[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2-N3]z(7.7mg，0.503μmol，3.65mL)添加15kDa Y-PEG-DBCO(138mg，9.06μmol，921μL，18eq)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
作为[15K mPEG-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例38(6.39mg，83％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于5.4。
实施例39
Figure BDA0003571026660001611
rIL-2通过NHS偶联至实施例4和用15kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例4(4.0mg)溶于DMF(269μL)以提供14.9mg/mL的试剂溶液。向IL-2(8mg，0.523μmol，4.00ml)的小瓶中添加实施例4(2.98mg，6.28μmol，200μL，12eq)。将反应混合并在22℃培育1h。1h后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将15kDa Y-PEG-DBCO(125mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(833μL)以提供150mg/mL的试剂溶液。向[rIL-2]-[F,F-Ph-SO2-N3]z(8.0mg，0.523μmol，4.20mL)中添加15kDa Y-PEG-DBCO(120mg，7.87μmol，798μL，15eq)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
作为[15K mPEG-(F,F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例39(7.26mg，91％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于5.9。
实施例40
Figure BDA0003571026660001621
rIL-2通过NHS偶联至实施例5和用15kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例5(4.5mg)溶于DMF(438μL)以提供10.3mg/mL的试剂溶液。用100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(817μL)稀释IL-2(7mg，0.458μmol，2.33mL)并添加实施例3(3.61mg，6.88μmol，350μL，15eq)。将反应混合并在22℃培育1h。1h后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将15kDa Y-PEG-DBCO(120mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(800μL)以提供150mg/mL的试剂溶液。向[rIL-2]-[F,CF3-Ph-SO2-N3]z(7.0mg，0.458μmol，3.50ml)中添加15kDa Y-PEG-DBCO(105mg，6.88μmol，698μl，15eq)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
作为[15K mPEG-(F,CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例40(6.73mg，96％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于5.9。
实施例41
Figure BDA0003571026660001631
rIL-2通过NHS偶联至实施例30和用15kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例30(101mg)溶于DMF(2.02mL)以提供50mg/mL的试剂溶液。向IL-2(12mg，0.784μmol，4.88ml)的小瓶中添加实施例30(21.3mg，31.4μmol，425μL，40eq)和DMF(28.3μL)。将反应混合并在22℃培育1h。1h后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将15kDa Y-PEG-DBCO(578mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(2.09mL)以提供277mg/mL的试剂溶液。向[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO2-N3]z(11.6mg，0.758μmol，5.16mL)添加15kDa Y-PEG-DBCO(578mg，37.89μmol，2.09mL，50eq)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mMNaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
作为[15K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例41(5.37mg，46％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于5.4。
实施例42
Figure BDA0003571026660001641
通过实施例31的rIL-2的NHS缀合和用7.5kDa PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例31(50mg)溶于DMF(1.00mL)以提供50mg/mL的试剂溶液。用100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(0.6mL)稀释IL-2(12mg，0.784μmol，4.8mL)并添加实施例31(14mg，11.8μmol，280μL，15eq)和DMF(320μL)。将反应混合并在22℃培育1h。在1h，通过LC-MS分析反应以确定官能化IL-2物质的分布。
将7.5kDa PEG-DBCO(250mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8(1.67mL)以提供150mg/mL溶液。向[rIL-2]-[CF3-Ph-Ar-SO2-N3]z(12mg，0.784μmol，6.0ml)中添加7.5kDa PEG-DBCO(206mg，27.5μmol，1.37ml，35eq)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600 Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDaMWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μmPVDF)。作为[2x7.5K mPEG-(CF3-Ph-Ar-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例42(10mg，84％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于5-7。
实施例43
Figure BDA0003571026660001651
rIL-2通过NHS偶联至实施例32和用7.5kDa PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例32(99mg)溶于DMF(1.98mL)以提供50mg/mL的试剂溶液。用100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(1.40mL)稀释IL-2(12mg，0.784μmol，4.0ml)并添加实施例32(9.1mg，13.4μmol，181μL，17eq)和DMF(419μL)。将反应混合并在22℃培育1h。在1h，通过LC-MS分析反应以确定官能化IL-2物质的分布。
将7.5kDa PEG-DBCO(250mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8(1.67mL)以提供150mg/mL溶液。向[rIL-2]-[CONH-Ph-R-SO2-N3]z(11.8mg，0.771μmol，5.9mL)添加7.5kDa PEG-DBCO(231mg，30.9μmol，1.54ml，40eq)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600 Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDaMWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μmPVDF)。作为[2x7.5K mPEG-(CONH-Ph-R-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例43(10.23mg，87％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于5-7。
实施例44
Figure BDA0003571026660001661
rIL-2通过NHS偶联至实施例33和用7.5kDa PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例33(11.3mg)溶于DMF(0.226mL)以提供50mg/mL的试剂溶液。用100mM硼酸钠，pH 8、20mM EDTA、0.05％SDS(1.26mL)稀释IL-2(10.8mg，0.706μmol，3.60mL)并添加实施例33(9.50mg，10.6μmol，190μL，15eq)和DMF(0.35mL)。将反应混合并在22℃培育1h。在1h，通过LC-MS分析反应以确定官能化IL-2物质的分布。
将7.5kDa PEG-DBCO(240mg)溶于100mM硼酸钠，pH 8(1.60mL)以提供150mg/mL溶液。向[rIL-2]-[CF3-Ph-R-SO2-N3]z(10.5mg，0.686μmol，3.85ml)中添加7.5kDa PEG-DBCO(205mg，27.4μmol，1.37ml，40eq)。将反应混合并在22℃培育。2h后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600 Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDaMWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μmPVDF)。作为[2x7.5K mPEG-(CF3-Ph-R-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例44(10.45mg，99％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于5.6。
实施例45
Figure BDA0003571026660001671
rIL-2通过NHS偶联至实施例2和用17kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例2(5.0mg)溶于DMF(687μL)以提供7.28mg/mL的试剂溶液。用100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS(1.26mL)稀释IL-2(12.0mg，0.784μmol，4.14mL)并添加实施例2(4.37mg，8.63μmol，600μL，11eq)。将反应混合并在22℃培育15min。15min后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。向反应添加另外的实施例2(1.99mg，3.93μmol，273μL，5eq)以提高官能化水平。在22℃培育另外15min后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将17kDa Y-PEG-DBCO(302mg)溶于100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS(1.21mL)以提供250mg/mL溶液。向[rIL-2]-[CF3-Ph-SO2-N3]z(12.0mg，0.784μmol，6.00ml)添加17kDa Y-PEG-DBCO(277mg，15.7μmol，1.11ml，20eq)。将反应混合并在22℃培育。15min后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
实施例46
Figure BDA0003571026660001681
rIL-2通过NHS偶联至实施例3和用17kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例3(4.2mg)溶于DMF(679μL)以提供6.18mg/mL的试剂溶液。用100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS(1.26mL)稀释IL-2(12.0mg，0.784μmol，4.14mL)并添加实施例3(3.71mg，7.84μmol，600μL，10eq)。将反应混合并在22℃培育15min。15min后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将17kDa Y-PEG-DBCO(185mg)溶于100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS(740μL)以提供250mg/mL溶液。向[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2-N3]z(12.0mg，0.784μmol，6.00ml)中添加17kDa Y-PEG-DBCO(173mg，9.80μmol，692μl，12.5eq)和100mM硼酸钠，pH9、20mM EDTA、0.05％SDS(165μL)。将反应混合并在22℃培育。15min后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600 Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
作为[17K mPEG-(Cl-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例46(9.7mg，81％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于6.2。
实施例47
Figure BDA0003571026660001691
rIL-2通过NHS偶联至实施例4和用17kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例4(6.0mg)溶于DMF(645μL)以提供9.30mg/mL的试剂溶液。用100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS(1.10mL)稀释IL-2(10.5mg，0.686μmol，3.62mL)并添加实施例4(4.88mg，10.3μmol，525μL，15eq)。将反应混合并在22℃培育15min。15min后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将17kDa Y-PEG-DBCO(260mg)溶于100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS(1.04mL)以提供250mg/mL的试剂溶液。向[rIL-2]-[F,F-Ph-SO2-N3]z(10.5mg，0.686μmol，5.25ml)中添加17kDa Y-PEG-DBCO(242mg，13.7μmol，968μl，20eq)。将反应混合并在22℃培育。15min后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mMNaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
作为[17K mPEG-(F,F-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例47(9.5mg，91％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于6.5。
实施例48
Figure BDA0003571026660001701
rIL-2通过NHS偶联至实施例5和用17kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例5(6.6mg)溶于DMF(600μL)以提供11.0mg/mL的试剂溶液。用100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS(906μL)稀释IL-2(12.0mg，0.784μmol，4.49mL)并添加实施例5(6.20mg，11.8μmol，560μL，15eq)。将反应混合并在22℃培育15min。15min后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将17kDa Y-PEG-DBCO(235mg)溶于100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS(0.94mL)以提供250mg/mL的试剂溶液。向[rIL-2]-[F,CF3-Ph-SO2-N3]z(12.0mg，0.784μmol，6.00ml)中添加17kDa Y-PEG-DBCO(228mg，12.9μmol，912μl，16.5eq)。将反应混合并在22℃培育。15min后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600Superdex 200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mMNaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
作为[17K mPEG-(F,CF3-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例48(9.4mg，78％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于7.3。
实施例49
Figure BDA0003571026660001711
rIL-2通过NHS偶联至实施例30和用17kDa Y-PEG-DBCO的点击-PEG化
将实施例30(101mg)溶于DMF(2.02mL)以提供50mg/mL的试剂溶液，并且在缀合前，用DMF将该溶液稀释至35.5mg/mL。用100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS(906μL)稀释IL-2(12.0mg，0.784μmol，4.49mL)并添加实施例30(21.3mg，31.4μmol，600μL，40eq)。将反应混合并在22℃培育15min。15min后，通过LC-MS分析反应以确定IL-2的平均官能化程度。
将17kDa Y-PEG-DBCO(700mg)溶于100mM硼酸钠，pH 9、20mM EDTA、0.05％SDS(2.80mL)以提供250mg/mL的试剂溶液。向[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO2-N3]z(12.0mg，0.784μmol，6.00ml)中添加17kDa Y-PEG-DBCO(692mg，39.2μmol，2.77ml，50eq)。将反应混合并在22℃培育。15min后，通过SDS-PAGE分析反应混合物并使用HiLoad 26/600 Superdex200pg，通过SEC纯化粗反应混合物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合的馏分浓缩并通过UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)缓冲液交换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并最终无菌过滤(0.22μm PVDF)。
作为[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2)]z-[rIL-2]，使用DirectDetect仪，通过IR定量实施例49(9.3mg，77％得率)。偶联物的SDS-PAGE分析显示PEG:IL-2比等于7.0。
实施例50
Figure BDA0003571026660001721
通过20kDa PEG双(砜)对rIL-2二硫键的PEG化
在偶联前，根据生产商的说明，使用通过100mM硼酸钠，pH(0.05％SDS)平衡的CentriPure P100柱，通过凝胶过滤更换IL-2溶液(10mM乙酸钠，pH 4.5，5％海藻糖)的缓冲液。使用Nanodrop 2000分光光度计，通过UV-A280定量更换缓冲液的蛋白溶液(1.34mg/mL)。
用100mM硼酸钠，pH 8(0.05％SDS)将IL-2(12mg，8.96ml)稀释至9ml，并向该溶液添加0.1M DTT(1.0mL，100μmol，127eq)，从而提供1.2mg/mL的最终IL-2浓度。轻轻混合所得还原反应并在22℃培育1h。根据生产商的说明，使用CentriPure P100柱，将还原的IL-2缓冲液更换为新鲜的100mM硼酸钠，pH 8(0.05％SDS)并通过UV-A280确定回收的蛋白的量(21.08mL反应缓冲液中10.5mg)。在水(3.59mL)中制备20kDa TheraPEGTM试剂(19.5mg)的溶液。为了使IL-2(10.5mg，0.686μmol，21.08ml)还原，添加100mM硼酸钠，pH 8(0.05％SDS)(17.71mL)和5.44mg/mL 20kDa TheraPEGTM的溶液(3.37mL，0.892μmol，1.3eq)，从而提供了0.25mg/mL的最终IL-2浓度。轻轻混合缀合反应并在22℃培育16h。通过SDS-PAGE和分析型SEC分析粗反应，然后通过制备SEC纯化。
将粗反应缓冲液更换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并通过UF/DF(Vivapsin20，5kDa MWCO PES)浓缩。根据生产商的说明，使用4mL去污剂除去离心柱
Figure BDA0003571026660001722
从PEG化IL-2样品除去SDS。然后，使用HiLoad 16/600 Superdex 200pg，通过SEC纯化PEG化的IL-2产物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以2mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合部分无菌过滤(0.22μm PVDF)。
使用Nanodrop 2000分光光度计通过UV-A280定量样品并通过SEC和SDS-PAGE分析。在溶液中作为0.9mg(8％得率)产生实施例50。通过SDS-PAGE的纯度：>99％。通过分析SEC的纯度：96.1％。
实施例51
Figure BDA0003571026660001731
通过5kDa PEG双(砜)对rIL-2二硫键的PEG化
在偶联前，根据生产商的说明，使用通过100mM硼酸钠，pH(0.05％SDS)平衡的CentriPure P100柱，通过凝胶过滤更换IL-2溶液(10mM乙酸钠，pH 4.5，5％海藻糖)的缓冲液。使用Nanodrop 2000分光光度计，通过UV-A280定量更换缓冲液的蛋白溶液(1.34mg/mL)。
用100mM硼酸钠，pH 8(0.05％SDS)将IL-2(12mg，8.96ml)稀释至9ml，并向该溶液添加0.1M DTT(1.0mL，100μmol，127eq)，从而提供1.2mg/mL的最终IL-2浓度。轻轻混合所得还原反应并在22℃培育1h。根据生产商的说明，使用CentriPure P100柱，将还原的IL-2缓冲液更换为100mM硼酸钠，pH 8(0.05％SDS)并通过UV-A280确定回收的蛋白的量(14.26mL反应缓冲液中11.6mg)。在水(11.03mL)中制备5kDa TheraPEGTM试剂(16.1mg)的溶液。为了使IL-2(11.6mg，0.758μmol，14.26ml)还原，添加100mM硼酸钠，pH 8(0.05％SDS)(28.24mL)和1.5mg/mL 5kDa TheraPEGTM的溶液(3.37mL，0.981μmol，1.3eq)。轻轻混合缀合反应并在22℃培育16h。通过SDS-PAGE和分析型SEC分析粗反应，然后通过制备SEC纯化。
将粗反应缓冲液更换为50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)并通过UF/DF(Vivapsin20，5kDa MWCO PES)浓缩。根据生产商的说明，使用4mL去污剂除去离心柱
Figure BDA0003571026660001732
从PEG化IL-2样品除去SDS。然后，使用HiLoad 16/600 Superdex 200pg，通过SEC纯化PEG化的IL-2产物。用50mM乙酸钠，pH 4.5(150mM NaCl)，以2mL/min的流速对样品等度洗脱。通过SDS-PAGE分析通过所述方法收集的馏分并混合高纯度馏分。将混合部分无菌过滤(0.22μm PVDF)。
使用Nanodrop 2000分光光度计通过UV-A280定量样品并通过SEC和SDS-PAGE分析。在溶液中作为1.7mg(14％得率)产生实施例51。通过SDS-PAGE的纯度：>99％。通过分析SEC的纯度：98.3％。
实施例52
示例性的rIL-2-[PEG]z偶联物的活性
在使用CTLL-2细胞的细胞增殖测定中评价了阿地白介素(对照)、实施例15、17、19、20、22、26、27、37-49的活性。
在37℃，5％CO2气氛下，将CTLL-2细胞(小鼠细胞毒T淋巴细胞系)维持在补充有10％胎牛血清和10％IL-2培养补充剂(T-STIMTM，具有ConA(伴刀豆球蛋白A))的完全RPMI1640培养基中。在分裂前，将细胞悬浮培养直至它们达到2-3×105个细胞/mL的细胞密度。
对于活性测定，在上次分裂后3-4天，将细胞在达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水中清洗三次。然后，将细胞以～5×105个细胞/mL的细胞密度在无T-STIMTM的补充培养基中再悬浮，并在以90ml/孔在96孔白壁透明底微板中铺板。还使用调节至pH 6.7-7的补充培养基(无T-STIMTM)进行实验以最大程度降低培育过程中偶联物的释放。然后，添加在无T STIMTM的补充培养基中稀释的10μl 10×浓度的测试化合物。将细胞在37℃，在5％CO2气氛下培育48小时。培育48小时后，添加CCK8试剂(20l/孔)并在37℃，5％CO2下培育2小时。然后，使用Molecular devices Spectra Max i3X在450nm和630nm对板读数。
测试释放的IL-2和未释放的偶联物两者的活性。将测试化合物在酸性条件(10mM乙酸钠缓冲液，pH 4)下储存以稳定缀合。为了测试偶联物的活性，在测定前～1小时，将样品从储存缓冲液稀释至补充培养基。为了测试释放的IL-2的活性，将释放的偶联物在100mM(最终浓度)的碳酸氢钠缓冲液，pH 9中稀释10-倍并在测定开始前，在37℃预培育8小时。
使用GraphPad's Prism 5.01软件，从剂量反应曲线的非线性回归分析获得细胞增殖的EC50值(显示出50％最大反应所需的测试化合物的浓度)。
使用细胞增殖测定测量了IL-2和偶联物的活性，并且在表3中显示了结果汇总。所有测试制品以剂量-依赖性方式引起CTLL-2细胞生长，如图4A-4E中所示的一些实例。如表3和图4A-4E所示，在来自实施例15、17、19、20、22、27、37-49的偶联物在诱导IL-2释放的条件下预培育后，活性恢复。从这些偶联物释放的IL-2显示出对于对照IL-2的相对效力。
表3.对IL-2和PEG-IL-2偶联物起反应的CTLL-2细胞增殖的总结。
Figure BDA0003571026660001751
Figure BDA0003571026660001761
实施例53
示例性的rIL-2-[PEG]z偶联物的pH释放研究
使用P2柱，将测试样品缓冲液更换为100mM PBS，pH 7.4。将来自所述柱的洗脱液无菌过滤(0.2μm PVDF过滤器)并使用Nanodrop分光光度计，通过UV-A280定量。用100mMPBS，pH 7.4将样品稀释至0.1mg/mL。向14个小瓶(7个时间点，重复2次)中加载测试样品(100μL)。用2M乙酸使两个小瓶立即淬灭，并在-80℃冷冻(t＝0h)。将剩余的12个小瓶在37℃培育。在预定时间点(t＝6、24、48、72、96和120h)，从37℃储存移去两个小瓶，离心(1.5min，4000g)，用2M乙酸淬灭，然后在-80℃冷冻。一旦收集所有时间点的样品，则将样品融化并通过SDS-PAGE分析。通过凝胶的光密度测定分析确定平均PEG:IL-2比，将这些数据转化并使用GraphPad Prism v7.04对时间作图，确定接头切割半衰期并在表4中总结。将T1/2确定为从偶联物中的IL-2释放一半量的PEG的时间。
表4.PEG-IL-2偶联物的接头切割半衰期。
测试化合物 T<sub>1/2</sub>(hr)
实施例15：[20K mPEG-(F-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 299
实施例17：[20K mPEG-(CF<sub>3</sub>-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 69
实施例19：[20K mPEG-(Cl-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 183
实施例22：[mPEG<sub>2</sub>-T<sub>2</sub>-Fmoc-20K]<sub>z</sub>-[rIL-2] 44
实施例20：[20K mPEG-(F,F-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 86
实施例21：[20K mPEG-(F,CF<sub>3</sub>-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 57
实施例37：[15K mPEG-(CF<sub>3</sub>-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 82
实施例38：[15K mPEG-(Cl-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 179
实施例39：[15K mPEG-(F,F-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 60
实施例40：[15K mPEG-(F,CF<sub>3</sub>-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 53
实施例41：[15K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 37
实施例42：[2x7.5K mPEG-(CF<sub>3</sub>-Ph-Ar-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 84
实施例43：[2x7.5K mPEG-(CONH-Ph-R-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 257
实施例44：[2x7.5K mPEG-(CF<sub>3</sub>-Ph-R-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 55
实施例45：[17K mPEG-(CF<sub>3</sub>-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 89
实施例46：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 184
实施例47：[17K mPEG-(F,F-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 74
实施例48：[17K mPEG-(F,CF<sub>3</sub>-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 58
实施例49：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO<sub>2</sub>)]<sub>z</sub>-[rIL-2] 30
实施例54
皮下B16F10黑色素瘤功效研究
对于每只7-9周大的同基因C57BL/6小鼠，在中背侧区域皮下植入1×105个B16F10细胞。使肿瘤生长至明显尺寸，即70-120cu mm，然后如所设计的随机化并分组(n＝8)。以如表5-9中所示的不同的剂量浓度和剂量方案向小鼠施用测试化合物，即rIL-2、rIL-2-聚合物偶联物或媒介物。每2或3天，测量体重和肿瘤体积。本研究的终点为对于给定组，达到2000cu mm的中值肿瘤体积的时间。
表5.实施例54，图5的分组。
Figure BDA0003571026660001781
注：“b.i.d×5”表示每天2次，共计5天；“q1d”表示一次剂量，一天。
表6.实施例54，图6的分组。
Figure BDA0003571026660001782
Figure BDA0003571026660001791
注：“b.i.d×5”表示每天2次，共计5天；“q1d”表示一次剂量，一天。
表7.实施例54，图7的分组。
Figure BDA0003571026660001792
Figure BDA0003571026660001801
注：“b.i.d×5”表示每天2次，共计5天；“qd”表示一次剂量，一天。
表8.实施例54，图8的分组。
Figure BDA0003571026660001802
注：“b.i.d×5”表示每天2次，共计5天；“q1w×2”表示每周1次，2个循环。
表9.实施例54，图9的分组。
Figure BDA0003571026660001803
Figure BDA0003571026660001811
注：“b.i.d×5”表示每天2次，共计5天；“q1w×3”表示每周1次，3个循环。
图5-9提供了以不同施用方案施用rIL-2和rIL-2-聚合物偶联物后的肿瘤生长抑制。这些结果表明所评价的rIL-2-聚合物偶联物在比rIL-2更低的剂量下显示出更好的效力，IL-2以3mg/kg的剂量施用，每天两次，施用5天。在小鼠模型中，对于IL-2-PEG偶联物未观察到明显的毒性，而IL-2小组小鼠显示出嗜睡和身体发冷的症状。通过不同接头连接的IL-2-PEG偶联物具有不同的抗肿瘤活性。水解速率为30-80小时的偶联物显示出最优的抗肿瘤效力。
序列表
<110> 北京轩义医药科技有限公司
<120> 蛋白-大分子偶联物及其使用方法
<130> CSPL-008/01WO 332638-2065
<150> US 62/908,435
<151> 2019-09-30
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组IL-2
<400> 1
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组IL-2
<400> 2
atgccaacct cctcctctac caagaaaact caactgcaac tggaacacct gctgctggat 60
ctgcaaatga ttctgaacgg cattaacaac tacaagaacc cgaaactgac ccgtatgctg 120
accttcaaat tctatatgcc gaagaaagct accgaactga aacacctgca atgcctggaa 180
gaggagctga aaccgctgga ggaggttctg aacctggctc agagcaagaa ctttcatctg 240
cgtccacgtg acctgatttc caacatcaac gttatcgttc tggaactgaa aggtagcgaa 300
accactttca tgtgcgagta cgctgacgaa accgctacca tcgttgaatt tctgaaccgc 360
tggatcacct tctctcagtc cattatctct actctgacct aa 402
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组IL-2
<400> 3
Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 4
aatcatatgg cacctacttc aagttctaca aa 32
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 5
aatttatcaa gttagtgttg agatgat 27

Claims (131)

1.一种具有根据式(I)的结构的可释放接头：
Figure FDA0003571026650000011
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
X1是第一间隔子部分；
X2是第二间隔子部分；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
Re是电子改变基团，选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；
a是0至4的整数；
b是1至3的整数；
c是0至1的整数；
FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放键的官能团；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团。
2.根据权利要求1所述的可释放接头，其中所述可释放接头具有根据式(I-B)的结构：
Figure FDA0003571026650000021
3.根据权利要求2所述的可释放接头，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；和
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
4.根据权利要求3所述的可释放接头，其中所述化合物具有以下结构：
Figure FDA0003571026650000022
R＝H,CF3，Cl。
5.根据权利要求1所述的可释放接头，其中所述可释放接头具有根据式(I-C)的结构：
Figure FDA0003571026650000031
6.根据权利要求5所述的可释放接头，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；和
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
7.根据权利要求6所述的可释放接头，其中所述化合物具有以下结构：
Figure FDA0003571026650000032
8.一种具有根据式(XVIII)的结构的可释放接头：
Figure FDA0003571026650000033
Figure FDA0003571026650000041
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
X1是间隔子部分；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
Re是电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；
a是0至4的整数；
c是2；
FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放键的官能团；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团。
9.根据权利要求8所述的可释放接头，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；和
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
10.根据权利要求9所述的可释放接头，其中所述化合物具有以下结构：
Figure FDA0003571026650000051
11.一种具有根据式(II)的结构的可释放接头：
Figure FDA0003571026650000052
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放键的官能团；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团。
12.根据权利要求11所述的可释放接头，其中
a1和a2各自独立地为0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；和
Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
13.根据权利要求11所述的可释放接头，其中所述可释放接头具有根据式(II-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000061
其中Re是氢或电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基。
14.根据权利要求13所述的可释放接头，其中所述化合物具有以下结构：
Figure FDA0003571026650000071
15.根据权利要求12所述的可释放接头，其中所述可释放接头具有根据式(II-B)的结构：
Figure FDA0003571026650000072
16.一种具有根据式(III)的结构的可释放接头：
Figure FDA0003571026650000081
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rp是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
FG4是能够与活性剂的氨基反应以形成酰胺键的官能团；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团。
17.根据权利要求16所述的可释放接头，其中
a1和a2各自独立地为0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；和
Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
18.根据权利要求17所述的可释放接头，其中所述可释放接头具有根据式(III-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000091
19.一种具有根据式(IV)的结构的可释放接头：
Figure FDA0003571026650000101
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R3是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R4是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
c是0至4的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rd是硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或环烷基、取代的烷基或环烷基、芳基或杂芳基、取代的芳基或杂芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放键的官能团；和
FG2是能够通过点击化学反应的官能团。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的可释放接头，其中FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成氨基甲酸酯键的官能团。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的可释放接头，其中FG2是叠氮化物、炔基或环炔基基团。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的可释放接头，其中所述环炔基基团是二苯并环辛炔(DBCO)。
23.一种偶联物，包含共价连接至至少一种接头的蛋白；其中所述偶联物包含根据式(XIX)的结构：
蛋白-(L)z
(XIX)
或其立体异构体、位置异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；或其药用盐、溶剂化物、水合物或前药；
其中：
z是1至25的整数；
L是接头；并且
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
24.根据权利要求23所述的偶联物，其中至少一种接头是可释放接头。
25.根据权利要求24所述的偶联物，其中所述可释放接头是根据权利要求1-22所述的可释放接头。
26.根据权利要求24或25所述的偶联物，其中所述接头共价连接至所述蛋白内的残基的胺基。
27.根据权利要求26所述的偶联物，其中所述残基是赖氨酸。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的偶联物，其中一个或多个接头连接至所述蛋白。
29.一种组合物，包含根据权利要求23-28中任一项所述的偶联物的混合物。
30.一种偶联物，包含蛋白、至少一种接头和至少一种水溶性聚合物，其中所述蛋白通过接头共价连接至每个水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物是直链或支链的。
31.根据权利要求30所述的偶联物，包含两个或更多个接头。
32.根据权利要求31所述的偶联物，其中所述两个或更多个接头包含至少一个非可释放接头。
33.根据权利要求31或32所述的偶联物，其中所述两个或更多个接头包含至少一个可释放接头。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的偶联物，其中所述两个或更多个接头包含至少一个可释放接头和至少一个非可释放接头。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的偶联物，其中所述两个或更多个接头包含1至8个可释放接头和1至2个非可释放接头。
36.根据权利要求30所述的偶联物，其中所述至少一种接头是可释放接头。
37.根据权利要求30或36所述的偶联物，其中每个所述接头是可释放接头。
38.根据权利要求36或37所述的偶联物，其中所述可释放接头是根据权利要求1-22中任一项所述的可释放接头。
39.根据权利要求30所述的偶联物，其中所述至少一种接头包括非可释放接头。
40.根据权利要求30-39中任一项所述的偶联物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
41.根据权利要求40所述的偶联物，其中通过选自由以下组成的组的封端部分对所述聚(乙二醇)封端：羟基、烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基。
42.根据权利要求30-41中任一项所述的偶联物，其中所述水溶性聚合物的重均分子量在约500道尔顿至约100,000道尔顿的范围内。
43.根据权利要求42所述的偶联物，其中所述水溶性聚合物的重均分子量在约500道尔顿至小于20,000道尔顿的范围内。
44.根据权利要求42所述的偶联物，其中所述水溶性聚合物的重均分子量在约20,000道尔顿至小于85,000道尔顿的范围内。
45.根据权利要求42所述的偶联物，其中所述水溶性聚合物的重均分子量在约85,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围内。
46.根据权利要求30-45中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物通过所述接头在所述蛋白内的残基的胺基处共价连接。
47.根据权利要求46所述的偶联物，其中所述残基是赖氨酸。
48.根据权利要求30-47中任一项所述的偶联物，其中一个或多个水溶性聚合物通过一个或多个接头连接至所述蛋白。
49.根据权利要求30-48中任一项所述的偶联物，其中8个或更多个水溶性聚合物通过8个或更多个接头连接至所述蛋白。
50.根据权利要求30-49中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XX)的结构：
蛋白-(L-大分子)z
(XX)
或其立体异构体、位置异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；或其药用盐、溶剂化物、水合物或前药；
其中：
z是1至25的整数；
L是接头；
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽；并且
大分子是水溶性聚合物、脂质、蛋白或多肽。
51.根据权利要求30-50中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据下式的结构：
Figure FDA0003571026650000151
或者
Figure FDA0003571026650000152
其中：
n是具有2至4000的值的整数；
X是间隔子部分；
RL、RL1和RL2独立地为可释放接头；
z是1至25的整数；和
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
52.一种组合物，其包含根据权利要求30-51中任一项所述的偶联物的混合物。
53.根据权利要求23-28中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(VII)的结构：
Figure FDA0003571026650000161
其中：
X1是第一间隔子部分；
X2，当存在时，是第二间隔子部分；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
Re是电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；
a是0至5的整数；
b是0至3的整数；
c是0至2的整数；
z是1至25的整数；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其选自叠氮化物、炔基和环炔基基团；和
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
54.根据权利要求53所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(VII-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000171
55.根据权利要求54所述的偶联物，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
56.根据权利要求55所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(VII-A1)的结构：
Figure FDA0003571026650000181
其中a是1至2的整数；并且Re为4-F、4-Cl、4-CF3、2,4-二氟代基或2-CF3-4-F取代基。
57.根据权利要求53所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(VII-B)的结构：
Figure FDA0003571026650000182
58.根据权利要求57所述的偶联物，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；和
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
59.根据权利要求58所述的偶联物，其中所述偶联物具有以下结构：
Figure FDA0003571026650000191
60.根据权利要求53所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(VII-C)的结构：
Figure FDA0003571026650000192
61.根据权利要求60所述的偶联物，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
62.根据权利要求61所述的偶联物，其中所述偶联物具有以下结构：
Figure FDA0003571026650000201
63.根据权利要求53所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(VII-D)的结构：
Figure FDA0003571026650000202
64.根据权利要求63所述的偶联物，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
65.根据权利要求64所述的偶联物，其中所述偶联物具有以下结构：
Figure FDA0003571026650000203
或
Figure FDA0003571026650000211
66.根据权利要求23-28中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(VIII)的结构：
Figure FDA0003571026650000212
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，选自叠氮化物、炔基和环炔基基团；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
67.根据权利要求66所述的偶联物，其中
a1和a2各自独立地为0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
68.根据权利要求67所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(VIII-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000231
69.根据权利要求23-28中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(IX)的结构：
Figure FDA0003571026650000232
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rp是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其选自叠氮化物、炔基和环炔基基团；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
70.根据权利要求69所述的偶联物，其中
a1和a2各自独立地为0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
71.根据权利要求70所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(IX-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000251
72.根据权利要求23-28中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(X)的结构：
Figure FDA0003571026650000252
其中：
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R3是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R4是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
c是0至4的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rd是硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或环烷基、取代的烷基或环烷基、芳基或杂芳基、取代的芳基或杂芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
Y4是O或S；
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其选自叠氮化物、炔基和环炔基基团；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
73.根据权利要求30-51中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XI)的结构：
Figure FDA0003571026650000271
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔子部分；
X2是第二间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
Y4是O或S；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R3是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R4是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1是0至3的整数；
a2是0至3的整数；
c是0至4的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rd是硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或环烷基、取代的烷基或环烷基、芳基或杂芳基、取代的芳基或杂芳基；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
74.根据权利要求73所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XI-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000281
其中n独立地为4至1500的整数。
75.根据权利要求30-51中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XII)的结构：
Figure FDA0003571026650000291
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔子部分；
X2是第二间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1是0-3的整数；
a2是0-3的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rp是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
76.根据权利要求75所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XII-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000301
其中n独立地为4至1500的整数。
77.根据权利要求30-51中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIII)的结构：
Figure FDA0003571026650000311
其中：
POLY1是第一直链或支链水溶性聚合物；
POLY2是第二直链或支链水溶性聚合物；
X1是第一间隔子部分；或-X-FG2；
X2，当存在时，是第二间隔子部分；
T1是第一三唑官能团；
T2是第二三唑官能团；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
Re是电子改变基团，其选自硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基；和-X-FG2；
其中：
X是间隔子部分；并且
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其选自叠氮化物、炔基和环炔基基团。
a是0至5的整数；
b是0至3的整数；
c是0至2的整数；
z是1至25的整数；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
78.根据权利要求77所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIII-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000321
79.根据权利要求78所述的偶联物，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
80.根据权利要求79所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIII-A1)的结构：
Figure FDA0003571026650000331
其中：
a是1至2的整数；
Re是4-F、4-Cl、4-CF3、2,4-二氟代基或2-CF3-4-F取代基
n独立地为4至1500的整数；
z是1至25的整数；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
81.根据权利要求77所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIII-B)的结构：
Figure FDA0003571026650000332
(XIII-B)。
82.根据权利要求81所述的偶联物，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
83.根据权利要求82所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIII-B1)的结构：
Figure FDA0003571026650000341
其中：
n独立地为4至1500的整数；
z是1至25的整数；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
84.根据权利要求77所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIII-C)的结构：
Figure FDA0003571026650000351
85.根据权利要求84所述的偶联物，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
86.根据权利要求85所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIII-C1)的结构：
Figure FDA0003571026650000352
其中：
n独立地为4至1500的整数；
z是1至25的整数；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
87.根据权利要求77所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIII-D)的结构：
Figure FDA0003571026650000361
88.根据权利要求87所述的偶联物，其中
a是0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re是硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
89.根据权利要求88所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIII-D1)或(XIII-D2)的结构：
Figure FDA0003571026650000371
其中：
n独立地为4至1500的整数；
z是1至25的整数；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
90.根据权利要求30-51中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIV)的结构：
Figure FDA0003571026650000381
其中：
POLY2是直链或支链水溶性聚合物；
POLY3是直链或支链水溶性聚合物；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；或-X-FG2；
其中
X是间隔子部分；并且
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，选自叠氮化物、炔基和环炔基基团；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
T2是三唑官能团；
T3是三唑官能团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
91.根据权利要求90所述的偶联物，其中
a1和a2各自独立地为0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
92.根据权利要求91所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XIV-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000391
其中：
n独立地为4至1500的整数；
z是1至25的整数；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
93.根据权利要求30-51中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XV)的结构：
Figure FDA0003571026650000401
其中：
POLY2是直链或支链水溶性聚合物；
POLY3是直链或支链水溶性聚合物；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；或-X-FG2；
其中
X是间隔子部分；并且
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其选自叠氮化物、炔基和环炔基基团；
Rp是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
T2是三唑官能团；
T3是三唑官能团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
94.根据权利要求93所述的偶联物，其中
a1和a2各自独立地为0至2的整数；
R1和R2各自独立地为氢、Me或Et；并且
Re1和Re2各自独立地为硝基、氰基、卤素、-CF3、-CONHMe、-SO2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2Me或-OCF3。
95.根据权利要求94所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XV-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000421
其中：
n独立地为4至1500的整数；
z是1至25的整数；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
96.根据权利要求30-51中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XVI)的结构：
Figure FDA0003571026650000422
其中：
POLY2是直链或支链水溶性聚合物；
POLY3是直链或支链水溶性聚合物；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R3是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R4是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1和a2各自独立地为0至4的整数；
b1是1；
b2是0至1的整数；
c是0至4的整数；
z是1至25的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；或-X-FG2；
其中
X是间隔子部分；并且
FG2是能够通过点击化学反应的官能团，其选自叠氮化物、炔基和环炔基基团；
Rd是硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或环烷基、取代的烷基或环烷基、芳基或杂芳基、取代的芳基或杂芳基；
X2，当存在时，是间隔子部分；
X3，当存在时，是间隔子部分；
T2是三唑官能团；
T3是三唑官能团；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
Y4是O或S；并且
-NH-是所述蛋白内残基的胺基。
97.根据权利要求53-96中任一项所述的偶联物，其中所述环炔基是二苯并环辛炔(DBCO)。
98.根据权利要求23-28、30-51和53-97中任一项所述的偶联物，其中所述蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
99.根据权利要求98所述的偶联物，其中所述细胞因子是GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α或TNF-β。
100.根据权利要求98或99所述的偶联物，其中所述细胞因子是IL-2。
101.根据权利要求100所述的偶联物，其中所述IL-2包含与SEQ ID NO:1约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
102.根据权利要求98所述的偶联物，其中所述趋化因子是MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309(CCL1)、BCA1(CXCL13)、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子-1、嗜酸细胞活化趋化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC(CCL20)、ELC(CCL19)、SLC(CCL21)、ENA-78、PBP、TECK(CCL25)、CTACK(CCL27)、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
103.根据权利要求98所述的偶联物，其中所述抗体靶向以下中的一种或多种：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受体样激酶1、淀粉状蛋白A蛋白、β–淀粉状蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125(模拟)、C5、CA-125、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C242抗原、CD276、CD278、CD319、艰难梭菌、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、达比加群、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、内皮糖蛋白、上皮唾蛋白、EPHA3、c-Met、FGFR2、纤维蛋白IIβ链、FGF 23、叶酸受体1、GMCSF、GD2神经节糖苷、GDF-8、GCGR、明胶酶B、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受体α-链、激肽释放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受体、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干扰素α/β受体、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、乙型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-选择素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、间皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、连接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂酰丝氨酸、RANKL、RTN4、猕猴因子、ROR1、SLAMF7、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素、SOST、选择素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受体、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
104.根据权利要求30-51中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物包含根据式(XVII)的结构：
Figure FDA0003571026650000461
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物、其位置异构体或混合物或者它们的同位素变体；或其药用盐、溶剂化物、水合物或前药；
其中
X是间隔子部分；
POLY是直链或支链水溶性聚合物；并且
“-S-”是所述IL-2部分内的残基的硫基。
105.根据权利要求104所述的偶联物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
106.一种根据方案(I)的用于制备蛋白-大分子偶联物的方法：
Figure FDA0003571026650000471
其中x是1至25的整数；
y是0至24的整数；
z是1至25的整数，其中x＝y+z；
L是接头；
FG0是能够与蛋白的亲核基团反应以形成键，包括氨基甲酸酯键、硫醇桥等的官能团；
FG2是能够通过点击化学与FG3反应的官能团，选自叠氮化物、炔基和环炔基基团；
FG3是能够通过点击化学与FG2反应的官能团，选自叠氮化物、炔基和环炔基基团；
蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽；
大分子是水溶性聚合物、脂质、蛋白或多肽；其可以包括以下中的任一种：包含6至26个碳原子的脂肪酸，选自下列的聚合物之一：2-甲丙烯酰-氧乙基磷酰胆碱、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸脂)、聚(丙烯酰胺)、聚(N-丙烯酰吗啉)、聚(烷氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(磷酸三乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(a-羟酸)、聚(羟乙基丙烯酸脂)、聚(羟乙基噁唑啉)、聚(羟基甲基丙烯酸酯)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(羟丙基噁唑啉)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有机磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚磷腈、聚(丙二醇)、聚(糖)、聚(硅氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲醚)、聚(乙烯吡硌烷酮)、硅酮、直链淀粉、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、壳多糖、壳聚糖、葡聚糖、糊精、明胶、透明质酸和衍生物、官能化透明质酸、甘露聚糖、果胶、肝素、硫酸乙酰肝素、鼠李聚糖半乳糖醛酸、淀粉、羟烷基淀粉、羟乙基淀粉、聚唾液酸及其它碳水化合物-基聚合物、木聚糖，以及白蛋白、转铁蛋白、甲状腺素运载蛋白、免疫球蛋白、XTEN肽的共聚物、富甘氨酸高氨基酸聚合物、PAS多肽、弹性蛋白-样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。
107.根据权利要求106所述的方法，其中x或z是2至25的整数。
108.根据权利要求106所述的方法，其中x或z是3至25的整数。
109.根据权利要求106所述的方法，其中x或z是4至25的整数。
110.根据权利要求106所述的方法，其中x或z是5至25的整数。
111.根据权利要求106所述的方法，其中x或z是6至25的整数。
112.根据权利要求106-111中任一项所述的方法，其中L是可释放接头。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述可释放接头是根据权利要求1-22中任一项所述的可释放接头。
114.根据权利要求106-113中任一项所述的方法，其中所述蛋白是趋化因子、趋化因子拮抗剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体或治疗性肽。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述细胞因子是GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α或TNF-β。
116.根据权利要求114或115所述的方法，其中所述细胞因子是IL-2。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述IL-2包含与SEQ ID NO:1的80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
118.根据权利要求114所述的方法，其中所述趋化因子是MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309(CCL1)、BCA1(CXCL13)、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子-1、嗜酸细胞活化趋化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC(CCL20)、ELC(CCL19)、SLC(CCL21)、ENA-78、PBP、TECK(CCL25)、CTACK(CCL27)、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
119.根据权利要求114所述的方法，其中所述抗体靶向以下中的一种或多种：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受体样激酶1、淀粉状蛋白A蛋白、β–淀粉状蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125(模拟)、C5、CA-125、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子-1)、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C242抗原、CD276、CD278、CD319、艰难梭菌、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、达比加群、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、内皮糖蛋白、上皮唾蛋白、EPHA3、c-Met、FGFR2、纤维蛋白IIβ链、FGF 23、叶酸受体1、GMCSF、GD2神经节糖苷、GDF-8、GCGR、明胶酶B、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受体α-链、激肽释放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受体、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干扰素α/β受体、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、乙型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-选择素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、间皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、连接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂酰丝氨酸、RANKL、RTN4、猕猴因子、ROR1、SLAMF7、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素、SOST、选择素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受体、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
120.根据权利要求106-119中任一项所述的方法，其中所述环炔基是二苯并环辛炔(DBCO)。
121.一种聚合试剂，其中所述聚合试剂具有根据式(V)的结构：
Figure FDA0003571026650000511
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔子部分；
X2是第二间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R3是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R4是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1是0至3的整数；
a2是0至3的整数；
c是0至4的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rd是硝基、氰基、卤素、酰胺、取代的酰胺、砜、取代的砜、磺酰胺、取代的磺酰胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或环烷基、取代的烷基或环烷基、芳基或杂芳基、取代的芳基或杂芳基；并且
FG1是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放的键，如氨基甲酸酯键的官能团。
122.根据权利要求121所述的聚合试剂，其中所述聚合试剂具有根据式(V-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000521
Figure FDA0003571026650000532
其中n独立地为4至1500的整数。
123.一种聚合试剂，其中所述聚合试剂具有根据式(VI)的结构：
Figure FDA0003571026650000531
或其立体异构体、互变异构体或它们的混合物，或者它们的同位素变体；
其中：
POLY1是第一水溶性聚合物；
POLY2是第二水溶性聚合物；
X1是第一间隔子部分；
X2是第二间隔子部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
Y3是O或S；
R1是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
R2是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；
a1是0-3的整数；
a2是0-3的整数；
Rel，当存在时，是第一电子改变基团；
Re2，当存在时，是第二电子改变基团；
Rp是氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；并且
FG4是能够与活性剂的氨基反应以形成可释放的键，如酰胺键的官能团。
124.根据权利要求123所述的聚合试剂，其中所述聚合试剂具有根据式(VI-A)的结构：
Figure FDA0003571026650000541
其中n独立地为4至1500的整数。
125.一种药物组合物，包含根据权利要求23-28、30-51和53-105中任一项所述的偶联物和一种或多种药用赋形剂。
126.一种治疗方法，包括向对其有需要的受试者施用根据权利要求125所述的药物组合物。
127.根据权利要求126所述的方法，其中施用所述药物组合物用于治疗癌症、感染或自身免疫病。
128.一种治疗方法，包括结合其它适合的治疗剂，向对其有需要的受试者施用根据权利要求125所述的药物组合物。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述治疗剂是抗体。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述抗体是抗肿瘤抗原抗体。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述抗肿瘤抗原抗体通过ADCC功能具有其活性。
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