TW202126332A - 蛋白-大分子偶聯物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供如本文所定義的蛋白-大分子偶聯物、可釋放接頭和大分子。所揭露的偶聯物提供至少基於接頭性質和接頭-大分子部分數目的獨特性質。本發明還提供該偶聯物的合成方法和其在治療疾病和病症中的使用。

Description

蛋白-大分子偶聯物及其使用方法
[相關申請的交叉引用]
本發明主張2019年9月30日提交的美國臨時專利申請No. 62/908,435的優先權益，該專利申請以其全部內容作為參考併入本文。 [序列表]
本發明以電子形式提交，並且包括以.txt格式電子提交的序列表。所述.txt檔包含2020年9月29日創建並且大小為～3.71千位元組的標題為“CSPL_008_01TW_SeqList_ST25.txt”的序列表。包含在該.txt檔中的序列表是本說明書的一部分並且以其全部內容作為參考併入本文。
本發明揭露關於通過利用雙官能接頭製備蛋白-大分子偶聯物的方法。另外，本發明揭露關於設計用於遞送具有生物學功能的蛋白的藥物動力學控制的新型偶聯物。具體地，本發明揭露關於具有預期蛋白釋放速率的蛋白-大分子偶聯物。更具體地，本發明揭露關於具有IL-2部分(即具有類似於人IL-2的至少一些活性的部分)和大分子以及一個或多個接頭的偶聯物。另外，本發明揭露關於偶聯物組合物，製備偶聯物的方法，施用偶聯物的方法和在癌症療法領域使用所述偶聯物的方法。
多種藥物的有效性受限制於它們的不良藥物動力學參數。這些藥物從生理學隔室內通過代謝或排泄的快速清除導致了短壽命和對靶標的暴露減少。例如，基於天然蛋白的治療激動劑是可以幫助建立有效、持久的抗腫瘤反應的有吸引力的免疫調節劑；然而，由於不良的藥物動力學(PK)、不良的耐受性和可以通過頻繁劑量施用而加劇的多效性活性，它們不是理想的藥劑。
細胞因子白介素-2(IL-2)是IL-2途徑的內源激動劑並且是已詳細描述的CD8+ T細胞(CD8 T)和NK細胞的刺激劑。在1990年代，美國食品和藥物管理局批准使用被稱為“阿地白介素”的IL-2變體，在醫院環境中每8小時施用高劑量IL-2方案來治療轉移性黑素瘤和腎細胞癌，從而提供了高達25%的持久反應。需要使用高劑量的IL-2來啟動CD8 T細胞和NK細胞，其往往表達低親合力的IL-2受體βγ亞基(IL-2Rβγ)。該蛋白較差的PK加劇了對於高劑量IL-2的需求。由於與免疫系統過度啟動有關的嚴重毒性，高劑量阿地白介素並未廣泛使用。除這些毒性外，IL-2還刺激調節性T細胞(Tregs)的增殖和啟動。這些細胞組成性地表達高親合力的異源三聚體IL-2受體αβγ亞基(IL-2Rαβγ)。Treg啟動可以加劇免疫抑制，從而潛在地損害預期的抗腫瘤反應。
聚合物前體藥物和聚合物-藥物偶聯物可以改善藥物對於治療應用的有效性。聚合物偶聯的藥物通常顯示出延長的半衰期，較高的穩定性、水溶性、較低的免疫原性和抗原性以及對組織或細胞的特異性靶向。聚合物在聚合物前體藥物/大分子前體藥物中用作遞送藥物、蛋白、靶向部分和成像劑的載體。可以將聚合物前體藥物視為通過在一段持續時間內從聚合物鏈分子釋放較小的治療藥物分子來顯示其治療活性的藥物遞送系統，其通過提高半衰期、生物利用度和因此延長藥理作用來提高藥物動力學行為。
為了解決IL-2的毒性問題以及不良的PK性質，已提議了某些IL-2偶聯物。參見，例如，美國專利No. 4,766,106、5,206,344、5,089,261、4,902,502、9,861,705和WO 2019/028419。
除了延長血漿半衰期和降低免疫原性外，PEG化提供了控制蛋白結合的選擇性的機會。舉例來說，作為PEG化的IL-2的臨床候選的NKTR-214由於在IL-2-IL-2Rα介面的賴氨酸殘基處具有可釋放接頭的位點-特異的PEG化而顯示出與IL-2受體α-亞基(IL-2Rα)結合的降低。最小程度地影響了與IL-2受體β-亞基(IL-2Rβ)的結合。因此，在臨床前評價中，相對於IL-2，NKTR-214提供了升高的CD8+ 腫瘤-殺傷記憶性效應T細胞增殖，降低的免疫抑制性調節性T細胞增殖和升高的抗腫瘤效力。參見，例如，U.S. 9,861,705，Clin. Cancer Res. 22, 680–690 (2016)；PLOS ONE 12, e0179431 (2017)。
接頭化學的選擇在聚合物-藥物偶聯物治療劑的設計中是重要的，因為它賦予了對活性劑的切割以及後續釋放的時空控制。在沒有充分的接頭穩定性的情況下，偶聯的藥物可以顯示出提前釋放，從而消除了其大分子載體的優勢。然而，就無活性的聚合物前體藥物來說，藥物釋放不足可能導致藥物治療水平降低，並因此導致次優的治療效力。因此，提供能夠延長治療效力的持續藥物釋放是大家非常期望的。
一些前體藥物分子在生理條件下由於pH-依賴的β消除而釋放活性藥物。這種方法利用了藥物從PEG載體的自發、一級速率切割，該切割是當偶聯物暴露於生理學pH時引發的。通過接頭上C-H鍵的酸性預先確定它們的切割速率；反過來，通過連接至可電離的C-H的吸電子基團控制酸度。參見，例如，美國專利No. 6,504,005、8,680,315和WO 2004/089279。
儘管其廣泛應用，但是PEG及其在治療中的後續應用的明顯限制在於它不是生物可降解的。目前，已批准的PEG化蛋白治療劑使用≤40kDa分子量的PEG，這接近於約50kDa的腎小球過濾閾值。儘管提高分子量通常將提供延長的循環時間，但是與非生物可降解的PEG的積累有關的問題限制了聚合物分子量的優化以及所產生的藥物動力學。
本文描述了具有多個接頭的蛋白-[大分子]z偶聯物的一般設計。本發明揭露的獨特接頭使得能夠構建具有可預測、可調節釋放動力學的藥物偶聯物。另外，可以將每個大分子的分子量控制在對於腎清除所期望的分子量下，在一些實施方式中，所述分子量為小於40-50kDa。通過提高蛋白上大分子的數目(z)，偶聯物的總分子量可以升高，並隨後可以延長偶聯物的循環時間。除了使用可釋放接頭上的可調節的吸電子基團之外，還可以通過改變蛋白上的大分子的數目(z)來控制和優化活性蛋白的釋放速率。
通常，多個大分子對一個蛋白的偶聯是困難且低效的。我們設想了用多個雙官能接頭對蛋白進行偶聯，然後使所述接頭與大分子反應以提供蛋白-[大分子]z偶聯物的一般方法。該技術提供了使空間位阻最小的優勢，並因此改善了反應效率。此外，合成和純化步驟簡單且成本更低。因此，該技術提供了用於聚合物-蛋白治療劑的大規模生產和製造的顯著優勢。
本發明揭露描述了用於提供具有可預測和可控制釋放速率的可釋放接頭的蛋白-[大分子]z偶聯物的這種一般策略。具有可控釋放速率的這些偶聯物可以為疾病治療提供有價值的治療工具。在一些實施方式中，本發明揭露描述了具有非可釋放接頭和可釋放接頭的蛋白-[大分子]z偶聯物。因此，本發明揭露的實施方式涉及製備這些偶聯物的方法，包含所述偶聯物的組合物及其使用方法，這對於本領域來說是新穎且完全未提出的。
因此，在本發明揭露的一個或多個實施方式中，本發明的揭示內容涉及用於製備具有通過接頭連接的具有相關生物學功能的蛋白和多個大分子的偶聯物的偶聯方法。在一些實施方式中，所述偶聯方法包括通過雙官能接頭對蛋白的官能化，以及隨後與大分子的偶聯。在一些實施方式中，所述蛋白包括(但不限於)細胞因子、趨化因子、抗體和肽。在一些實施方式中，所述大分子包括(但不限於)水溶性聚合物、PEG、脂質、聚唾液酸、白蛋白和Fc。
本發明的揭示內容還涉及新型雙官能可釋放接頭及其組合物，新型雙官能可釋放接頭在治療應用中的利用以及製備方法。其中，所揭露的技術的優勢在於通過本文所提供的多個雙官能可釋放接頭有效官能化蛋白的能力。然後，可以使用對大分子的偶聯以改善高度官能化的蛋白的藥物動力學性質。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中，提供了偶聯物，所述偶聯物包含通過可釋放接頭共價連接至一個或多個水溶性聚合物的IL-2部分的殘基。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中，提供了偶聯物，所述偶聯物包含通過非可釋放接頭共價連接至一個或多個水溶性聚合物的IL-2部分的殘基。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中，提供了偶聯物，所述偶聯物包含通過非可釋放和可釋放接頭共價連接至一個或多個水溶性聚合物的IL-2部分的殘基。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中，提供了遞送偶聯物的方法，所述方法包括向患者靜脈內或皮下施用由IL-2的殘基和水溶性聚合物的偶聯物所組成的組合物的步驟。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中，提供了遞送偶聯物的方法，所述方法包括向癌症患者施用：(a)包含IL-2的殘基和一個或多個水溶性聚合物的偶聯物的組合物；和(b)有效量的抗-CTLA-4抗體或有效量的抗-PD-1/PD-L1抗體的步驟。在一些實施方式中，有效量的抗-CTLA-4抗體為抑制CTLA-4途徑的量。在一些實施方式中，有效量的抗-PD-1/PD-L1抗體為抑制PD-1/PD-L1途徑的量。為了清楚起見，對於根據該方法的步驟順序，除非另外說明，否則所述方法不局限於所述步驟順序，並且可以在實施步驟(b)之前、之後或同時實施步驟(a)。
本發明提供了如本文所定義的蛋白-大分子偶聯物、可釋放接頭和大分子。所揭露的偶聯物提供了至少基於接頭性質和接頭-大分子部分數目的獨特性質。本文還提供了獨特的合成方法和偶聯物在治療疾病和病症中的使用。
在以下描述和申請專利範圍中說明了本發明的其它實施方式。
[定義]
在描述和主張本發明的一個或多個實施方式中，將根據如下所述的定義使用以下術語。
應理解本文所使用的術語僅出於描述具體實施方式的目的，並且其不意欲進行限制。
除非另外定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語具有與本發明申請所屬領域的技術人員通常理解的含義相同的含義。儘管可以在本發明申請的實踐或測試中使用與本文所述的那些類似或等價的任何方法和材料，但是在本文中描述了代表性的方法和材料。
按照長期存在的專利法慣例，當在本發明，包括申請專利範圍中使用時，術語“一個”和“所述”表示“一個或多個”。因此，例如，對“載體”的提及包括了一個或多個載體，兩個或更多個載體的混合物等。
除非另外說明，否則在本說明書和申請專利範圍中所使用的表示成分、反應條件等的量的所有數值將被理解為在一切情況下被術語“約”修飾。因此，除非有相反的說明，否則在本發明的說明書中和在所附申請專利範圍中所述的數值參數是可以基於通過本發明申請所設法獲得的所期望的性質而不同的近似值。
術語“本發明的化合物”或“本發明的化合物”是指本文所揭露的化學式所表示的化合物或者如本文所公開的，其任何亞類或其藥物可用的鹽、立體異構體、溶劑化物或水合物。在某些實施方式中，將中間體考慮作為本發明的化合物。
本發明的化合物或它們的藥物可用的鹽可以含有一個或多個不對稱中心並因此可以產生對映異構體、非對映體和其它立體異構化形式，就絕對立體化學來說，可以將它們定義為(R) -或(S )-或者對於氨基酸定義為(D)-或(L)-。無論它們是否在本文中具體顯示，本發明公開意味著包括所有這些可能的異構體以及它們的外消旋和光學純形式。可以使用手性合成單體或手性試劑製備或者使用常規方法，例如，色譜法和分級結晶分離光學活性的(+)和(-)、(R )-和(S )-或者(D)-和(L)-異構體。用於單個對映異構體的製備/分離的常規方法包括從適合的光學純的前體手性合成或使用，例如，手性高壓液相色譜法(HPLC)的外消旋物(或者鹽或衍生物的外消旋物)的分離。當本文所述的化合物含有烯烴雙鍵或其它幾何不對稱性中心時，並且除非另外說明，否則所述化合物旨在包括E和Z幾何異構體兩者。同樣地，還旨在包括所有互變異構形式。
“立體異構體”是指由通過相同鍵鍵合的相同原子組成，但是具有不可互換的不同立體結構的化合物。本發明公開考慮了多種立體異構體及其混合物。在一些實施方式中，如本文所使用的“立體異構體”是指對映異構體、對映異構體的混合物、非對映體或兩種或更多種非對映體的混合物。
“對映異構體”表示彼此是不能重疊的鏡像的化合物的兩種立體異構體。這些異構體的混合物可以稱為對映體混合物。
將對映異構體的50:50的混合物稱為外消旋混合物或外消旋物，它可以在化學反應或過程中沒有立體選擇或立體專一性的情況下發生。術語“外消旋混合物”和“外消旋物”表示兩種對映體物質的等莫耳混合物，其缺少光學活性。本發明公開包括本文所述的化合物的所有立體異構體。
“非對映體”是指具有兩個或更多個手性中心的立體異構體並且它們的分子彼此不為鏡象。非對映體具有不同的物理性質，例如，熔點、沸點、光譜性質和反應性。可以通過高分辨分析方法，如電泳和色譜法分離非對映體混合物。
術語“位置異構體”是本領域承認的並且表示具有相同分子式，但是原子連線性程度不同的化合物。因此，“位置選擇性過程”是其中相對於其它位置異構體，較佳特定位置異構體的形成的過程，例如，顯著提高特定位置異構體的產率的反應。如本文所使用的，“位置異構體”可以表示單一位置異構體或兩個或更多個位置異構體的混合物。
“互變異構體”是指分子的一個原子向相同分子的另一個原子的質子移動。本發明包括任何所述化合物的互變異構體。
如本文所使用的術語“藥物組合”、“治療組合”或“組合”表示包含至少兩種治療活性劑的單一劑量形式，或者一起包含至少兩種治療活性劑並且在組合療法中單獨使用的單獨的劑量形式。例如，可以將一種治療活性劑配製成一種劑量形式並且可以將另一種治療活性劑配製成單一或不同的劑量形式。例如，可以將一種治療活性劑配製成固體口服劑量形式，而將第二治療活性劑配製成用於腸胃外施用的溶液劑量形式。
本文所使用的化學命名規程和結構圖是使用ACD/Name 9.07版軟體程式、ChemDraw Ultra 11.0.1版和/或ChemDraw Ultra 14.0版軟體命名程式(CambridgeSoft)的I.U.P.A.C.命名系統的修改形式。對於本文所使用的複雜化學名稱，在它所連接的基團之前命名取代基團。例如，環丙基乙基包含具有環丙基取代基的乙基主鏈。除如下所述，除一些碳原子外，在本文中的化學結構圖中標出了所有的鍵，其假定鍵合至足夠的氫原子以達到化合價。
術語“組合物”或“製劑”表示處於物理形式，如固體、液體、氣體或其混合物的一種或多種物質。組合物的一個實例是藥物組合物，即與醫療有關、製備用於醫療或者在醫療中使用的組合物。
如本文所使用的，“藥物可用的”表示適合於與人和動物的組織接觸的使用而無過度毒性、刺激、過敏反應等，具有合理的效益/風險比並且對於它們在合理醫學判斷範圍內的預期使用有效。
“鹽”包括活性劑的衍生物，其中通過製備酸或鹼加成鹽來修飾所述活性劑。較佳地，這些鹽是藥學上可接受的鹽。這些鹽包括(但不限於)藥物可用的酸加成鹽、藥物可用的鹼加成鹽、藥物可用的金屬鹽、銨和烷基化銨鹽。酸加成鹽包括無機酸和有機酸的鹽。適合的無機酸的代表性實例包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。適合的有機酸的代表性實例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、檸檬酸、反丁烯二酸、乙醇酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、焦葡萄酸、水楊酸、琥珀酸、甲磺酸、乙烷磺基天冬氨酸、硬脂酸、棕櫚酸、EDTA、乙醇酸、p-氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、高氯酸鹽、硼酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、羥基萘甲酸鹽、甘油磷酸鹽、酮戊二酸鹽等。鹼加成鹽包括(但不限於)乙二胺、N-甲基-葡糖胺、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、膽鹼、N,N'-二苄基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-苄基苯乙基胺、二乙胺、呱嗪、三(羥甲基)-氨基甲烷、氫氧化四甲銨、三乙胺、二苄基胺、二苯羥甲胺、脫氫樅胺、N-乙基呱啶、苯甲基胺、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、鹼性氨基酸，例如，賴氨酸和精氨酸、二環己基胺等。金屬鹽的實例包括鋰、鈉、鉀、鎂鹽等。銨和烷基化銨鹽的實例包括銨、甲基銨、二甲基銨、三甲基銨、乙基銨、羥乙基銨、二乙基、丁基銨、四甲銨鹽等。有機鹼的實例包括賴氨酸、精氨酸、胍、二乙醇胺、膽鹼等。用於藥物可用的鹽以及它們的製劑的製備的標準方法在本領域中是熟知的並且在多種參考文獻中揭露，所述參考文獻包括，例如，“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, A. Gennaro主編, 第20版, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA。
如本文所使用的，“溶劑化物”表示通過溶劑化所形成的複合物(溶劑分子與本發明的活性劑的分子或離子的組合)或者由溶質離子或分子(本發明的活性劑)與一種或多種溶劑分子所組成的聚集體。在本發明中，較佳的溶劑化物是水合物。水合物的實例包括(但不限於)半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、六水合物等。本領域的技術人員應理解本發明的化合物的藥物可用的鹽還可以以溶劑化物的形式存在。通常通過水合形成溶劑化物，水合是本發明的化合物的製備的一部分或者是通過本發明的無水化合物的天然吸濕。包括水合物的溶劑化物可以以化學計量比存在，例如，以每個溶劑化物或每個水合物分子2、3、4個鹽分子。存在另一種可能性，例如，相對於3、5、7個溶劑或水合物分子，兩個鹽分子是化學計量的。用於結晶的溶劑，如醇，特別是甲醇和乙醇；醛；酮，特別是丙酮；酯，例如，乙酸乙酯可以嵌入在晶格中。較佳藥物可用的溶劑。
術語“賦形劑”、“載體”和“媒介物”在整個本發明申請中是可互換使用的並且表示與之一起施用本發明的化合物的物質。
“治療有效量”表示當施用於患者用於治療疾病或其它不希望的醫學病況時，相對於該疾病或病況足以具有有益效果的化合物或治療活性劑的量。所述治療有效量將基於所選化合物或治療活性劑的類型、疾病或病況及其嚴重程度以及要治療的患者的年齡、體重等而不同。確定給定化合物或治療活性劑的治療有效量在本領域常規技術範圍內並且不要求超常規實驗。
如本文所使用的“治療”涵蓋了在患有所關心的疾病或病況的哺乳動物(較佳人)中對於所關心的疾病或病況的治療：預防哺乳動物中所述疾病或病況的發生，具體地，當該哺乳動物對所述病況易感，但尚未診斷為患有所述病況時；抑制所述疾病或病況，即終止其發展；減輕所述疾病或病況，即導致所述疾病或病況消退；或者減輕由所述疾病或病況所造成的症狀，即緩解疼痛而不針對潛在的疾病或病況。
如本文所使用的“疾病”和“病況”可以互換使用或者可以在具體疾病或病況不可以具有已知病因(從而尚未獲得病原學)時是不同的，並因此尚未將其認為是疾病，而僅視為不希望的病況或綜合征，其中已通過臨床醫師鑒別了大致特異的一類症狀。
本發明還意味著涵蓋了所揭露的化合物的體內代謝產物。這些產物可以由(例如)所施用的化合物的氧化、還原、水解、醯胺化、酯化等產生，其主要是由於酶促過程而發生。因此，本發明包括通過以下方法所產生的化合物，所述方法包括向哺乳動物施用足以獲得其代謝產物的一段時間的本發明的化合物。通常，通過以可檢測的劑量向動物，如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或向人施用放射性標記的本發明所述的化合物，進行足以發生代謝的時間並從尿液、血液或其它生物樣品中分離其轉化產物來鑒別這些產物。
如本文所使用的，“受試者”可以是人、非人靈長類動物、哺乳動物、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓等。術語“受試者”和“患者”在本文中可互換使用以表示(例如)哺乳動物受試者，如人受試者。
受試者可以被懷疑患有癌症或具有患癌風險，所述癌症如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、唾液腺癌或子宮內膜癌，或者懷疑其患有痤瘡、多毛症、脫髮、良性前列腺肥大、卵巢囊腫、多囊卵巢病、早熟青春期、脊髓延髓肌肉萎縮症或年齡相關性黃斑變性或具有患病風險。多種癌症，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、肝細胞癌、唾液腺癌或子宮內膜癌的診斷方法和痤瘡、多毛症、脫髮、良性前列腺肥大、卵巢囊腫、多囊卵巢病、早熟青春期、脊髓延髓肌肉萎縮症或年齡相關性黃斑變性的診斷方法，以及癌症，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、肝細胞癌、唾液腺癌或子宮內膜癌的臨床描述，痤瘡、多毛症、脫髮、良性前列腺肥大、卵巢囊腫、多囊卵巢病、早熟青春期、脊髓延髓肌肉萎縮症或年齡相關性黃斑變性的診斷和臨床描述是本領域那些技術人員已知的。
“哺乳動物”包括人和家畜，如實驗動物和家庭寵物(例如，貓、狗、豬、牛、綿羊、山羊、馬、兔)和非家畜，如野生生物兩者等。
“任選的”或“任選地”表示隨後所述的事件或狀況可以或可以不發生，並且描述包括其中所述事件或狀況發生的情況和其中它不發生的情況。例如，“任選地取代的芳基”表示所述芳基可以被取代或可以不被取代，並且描述包括取代的芳基和未取代的芳基兩者。
如本文所使用的“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”是可互換的並且涵蓋了任何非肽水溶性聚(環氧乙烷)。通常，根據本發明揭露所使用的PEG包括以下結構“-(OCH2 CH2 )n -”，其中(n)為2至4000。如本文所使用的，基於(例如)合成轉化期間，末端氧是否被替換，PEG還包括“-CH2 CH2 -O(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 -”和“-(OCH2 CH2 )n O-”。在整個說明書和申請專利範圍中，應記住術語“PEG”包括具有多種末端或“封端”基團等的結構。術語“PEG”還表示含有大部分(也就是大於50%)的-OCH2 CH2 -重複亞單元的聚合物。對於具體形式，PEG可以採取任何數目的多種分子量以及以下將更詳細描述的結構或幾何形狀，如“支鏈”、“直鏈”、“叉狀”、“多官能”等。
術語“封端”和“末端封端”在本文中可互換使用以表示具有封端部分的聚合物的末端或端點。通常，儘管不一定，所述封端部分包含羥基或C1-20 烷氧基，更佳地C1-10 烷氧基，並且更佳地C1-5 烷氧基。因此，封端部分的實例包括烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基和苄氧基)以及芳基、雜芳基、環、雜環等。必須記住所述封端部分可以包括聚合物中末端單體的一個或多個原子[例如，CH3 O(CH2 CH2 O)n -和CH3 (OCH2 CH2 )n -中的封端部分“甲氧基”]。另外，設想了以上每一個的飽和、不飽和、取代和未取代形式。此外，所述封端基團還可以是矽烷。所述封端基團還可以有利地包含可檢測標記物。當所述聚合物具有包含可檢測標記物的封端基團時，可以通過使用適合的檢測器確定所述聚合物和/或所述聚合物所偶聯至的部分(例如，活性劑)的量或位置。這些標記物無限制地包括螢光劑、化學發光劑、酶標記中使用的部分、比色劑(例如，染料)、金屬離子、放射性部分等。適合的檢測器包括光度計、膠片、光譜儀等。所述封端基團還可以有利地包含磷脂。當所述聚合物具有包含磷脂的封端基團時，將賦予所述聚合物和所得偶聯物獨特的性質。示例性的磷脂無限制地包括選自稱為磷脂醯膽鹼的磷脂類的那些。具體的磷脂無限制地包括選自二月桂醯基磷脂醯膽鹼、二油烯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二十二醯基磷脂醯膽鹼、二十烷醯基磷脂醯膽鹼和卵磷脂的那些。所述封端基團還可以包括靶標部分，從而所述聚合物—以及與之連接的任何物質，例如，IL-2部分可以優先定位在所關心的區域中。
相對於如本文所述的聚合物，“非天然存在的”表示其在自然界中不存在其整體的聚合物。然而，非天然存在的聚合物可以含有天然存在的一個或多個單體或單體部分，只是整體聚合物結構在自然界中不存在。
如“水溶性聚合物”中的術語“水溶性”聚合物是在室溫下可溶於水的任何聚合物。通常，水溶性聚合物將透過至少約75%，更佳地至少約95%的在過濾後通過相同溶液所透過的光。基於重量，水溶性聚合物將較佳地為至少約35%(按重量計)可溶於水，更佳地至少約50%(按重量計)可溶於水，更佳地約70%(按重量計)可溶於水，並且更佳地約85%(按重量計)可溶於水。然而，最佳地，水溶性聚合物為約95%(按重量計)可溶於水或完全可溶於水。
在水溶性聚合物如PEG的背景下，分子量可以表示為數目平均分子量或重量平均分子量。除非另外說明，否則在本文中所有對分子量的提及均表示重量平均分子量。可以使用凝膠滲透色譜或其它液相色譜技術測量數目平均和重量平均分子量兩者。還可以使用其它測量分子量值的方法，如使用末端基團分析或測量依數性(例如，凝固點降低、沸點升高或滲透壓)來確定數目平均分子量，或者使用光散射技術、超速離心法或黏度測定法來確定重量平均分子量。本發明揭露的聚合物通常是多分散的(即聚合物的數目平均分子量和重量平均分子量不相等)，較佳地，其低多分散性值小於約1.2，更佳地小於約1.15，更佳地小於約1.10，更佳地小於約1.05並且最佳地小於約1.03。
當結合特定官能團使用時，術語“活性”、“反應性”或“啟動的”表示容易與另一種分子上的親電體或親核體反應的反應性官能團。這與需要強催化劑或特別不實用的反應條件來進行反應的那些基團相反(即“非反應性”或“惰性”基團)。
如本文所使用的，術語“官能團”或其任何同義詞表示涵蓋了其受保護的形式以及未受保護的形式。
如本文所使用的，術語“電子改變基團”表示包括改變它所連接的部分的電子密度的任何原子或官能團。電子改變基團包括提供電子密度的供電子基團(例如，胺、羥基、烷氧基、烷基)和抽出電子密度的吸電子基團(例如，硝基、氰基、三氟甲基)。
術語“間臂部分”、“鍵”和“接頭”在本文中用於表示任選地用於連接互相連接部分，如大分子部分和蛋白的末端或蛋白的親電試劑或親核試劑的鍵或原子或一系列原子。所述間臂部分可以是水解穩定的或者可以包括生理學可水解的或酶促可降解的鍵。除非上下文明確規定，否則間臂部分任選地存在於化合物的任何兩個元素之間(例如，可以直接或通過間臂部分間接連接所提供的包含蛋白殘基和大分子的偶聯物)。
本發明揭露的適合的間臂包括含有一個或多個碳原子、氮原子、硫原子、磷原子、氧原子及其組合的接頭的間臂。適合的間臂部分可以包含醯胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚、磷酸酯、硫代磷酯、二硫基和/或點擊化學基團。具體的間臂部分的非限制性實例包括選自下列組的那些：-O-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-OP(O)(OH)-、-OP(S)(OH)-、-C(S)-、-CH2 -、-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -、O-CH2 -、-CH2 -O-、-O-CH2 -CH2 -、-CH2 -O-CH2 -、-CH2 -CH2 -O-、-O-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -O-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -O-CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -O-、-O-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -O-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -O-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -O-CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -O-、-C(O)-NH-CH2 -、-C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -C(O)-NH-CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-、-C(O)-O-CH2 -、-CH2 -C(O)-O-CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-O-CH2 -、-C(O)-O-CH2 -CH2 -、-NH-C(O)-CH2 -、-CH2 -NH-C(O)-CH2 -、-CH2 -CH2 -NH-C(O)-CH2 -、-NH-C(O)-CH2 -CH2 -、-CH2 -NH-C(O)-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -NH-C(O)-CH2 -CH2 -、-C(O)-NH-CH2 -、-C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-O-C(O)-NH-CH2 -、-O-C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-NH-CH2 -、-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -NH-CH2 -、-CH2 -CH2 -NH-CH2 -、-C(O)-CH2 -、-C(O)-CH2 -CH2 -、-CH2 -C(O)-CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -NH-、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -NH-C(O)-、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -NH-C(O)-CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -NH-C(O)-CH2 -CH2 -、-O-C(O)-NH-[CH2 ]l -(OCH2 CH2 )m -、二價環烷基、二價芳基、-O-、-S-、二價氨基酸殘基、-N(R3 )-、以及任何上述基團中的兩種或更多種的組合，其中R3 是H或選自下列的有機基：取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的芳基，(l)是0至6，並且(m)是0至20。其它具體的間臂部分具有以下結構：-C(O)-NH-(CH2 )1-6 -NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH2 )1-6 -NH-C(O)-和-O-C(O)-NH-(CH2 )1-6 -NH-C(O)-，其中每個亞甲基後的下標值表示所述結構中所含的亞甲基的數目，例如，(CH2 )1-6 表示所述結構可以含有1、2、3、4、5或6個亞甲基。
術語“雙官能接頭”是指如上定義的具有兩個反應性原子或官能團的接頭。在某些實施方式中，所述兩個反應基團是具有不同反應模式的互不相關的官能團，從而如果需要，則每個官能團能夠獨立於另一個並且以具體順序反應。如本領域技術人員將理解的，本文所揭露的雙官能接頭可以用於實施位點-特異的反應以組裝蛋白-大分子偶聯物。
“醯基”是指–C(=O)-烷基。
“氨基”是指-NH2 基團。
“氰基”是指-CN基團。
“鹵代”、“鹵化物”或“鹵素”是指溴代、氯代、氟代或碘代基團。
“羥基”是指-OH基團。
“亞氨基”是指=NH取代基。
“硝基”是指-NO2 基團。
“氧”是指=O取代基。
“硫代”是指=S取代基。
“巰基”是指-SH基團。
氫是H或D。
“烷基”或“烷基基團”是指具有1至20個碳原子的完全飽和的直鏈(線性)或支鏈的烴鏈基團，並且其通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。包括了包含1至20的任意數目的碳原子的烷基。包含多至20個碳原子的烷基是C1 -C20 烷基，包含多至10個碳原子的烷基是C1 -C10 烷基，包含多至6個碳原子的烷基是C1 -C6 烷基並且包含多至5個碳原子的烷基是C1 -C5 烷基。C1 -C5 烷基包括C5 烷基、C4 烷基、C3 烷基、C2 烷基和C1 烷基(即甲基)。C1 -C6 烷基包括以上對於C1 -C5 烷基所述的所有部分，但是還包括C6 烷基。C1 -C10 烷基包括以上對於C1 -C5 烷基和C1 -C6 烷基所述的所有部分，但是還包括C7 、C8 、C9 和C10 烷基。類似地，C1 -C12 烷基包括所有上述部分，但是還包括C11 和C12 烷基。C1 -C12 烷基的非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、仲丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、叔戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一基和正十二基。除非在說明書另有具體說明，否則烷基可以是任選地取代的。術語“低級烷基”是指C1 -C6 烷基，它可以是直鏈或支鏈的，例如，包括支鏈C3 -C6 烷基。示例性的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等。如本文所使用的，“烷基”包括環烷基和含環亞烷基的烷基。
“亞烷基”、“-烷基-”或“亞烷基鏈”是指具有1至20個碳原子的完全飽和的直鏈或支鏈二價烴鏈基團。C1 -C20 亞烷基的非限制性實例包括亞甲基、亞乙基、亞丙基、正亞丁基、亞乙烯基、亞丙烯基、正亞丁烯基、亞丙炔基、正亞丁炔基等。亞烷基鏈通過單鍵連接至所述分子的其餘部分並且通過單鍵連接至基團。亞烷基鏈與所述分子的其餘部分以及與基團的連結點可以通過所述鏈內的一個碳或任意兩個碳。除非在說明書中另有具體說明，否則亞烷基鏈可以是任選地取代的。
“烯基”或“烯基基團”是指具有2至20個碳原子並且具有一個或多個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴鏈基團。每個烯基基團通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。包括了包含2至20的任意數目的碳原子的烯基基團。包含多至20個碳原子的烯基基團是C2 -C20 烯基基團，包含多至10個碳原子的烯基是C2 -C10 烯基基團，包含多至6個碳原子的烯基基團是C2 -C6 烯基並且包含多至5個碳原子的烯基是C2 -C5 烯基。C2 -C5 烯基包括C5 烯基、C4 烯基、C3 烯基和C2 烯基。C2 -C6 烯基包括以上對於C2 -C5 烯基所述的所有部分，但是還包括C6 烯基。C2 -C10 烯基包括以上對於C2 -C5 烯基和C2 -C6 烯基所述的所有部分，但是還包括C7 、C8 、C9 和C10 烯基。類似地，C2 -C12 烯基包括所有上述部分，但是還包括C11 和C12 烯基。C2 -C12 烯基的非限制性實例包括乙烯基(乙烯基)、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、異丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基、8-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基、9-癸烯基、1-十一碳烯基、2-十一碳烯基、3-十一碳烯基、4-十一碳烯基、5-十一碳烯基、6-十一碳烯基、7-十一碳烯基、8-十一碳烯基、9-十一碳烯基、10-十一碳烯基、1-十二碳烯基、2-十二碳烯基、3-十二碳烯基、4-十二碳烯基、5-十二碳烯基、6-十二碳烯基、7-十二碳烯基、8-十二碳烯基、9-十二碳烯基、10-十二碳烯基和11-十二碳烯基。除非在說明書另有具體說明，否則烷基可以是任選地取代的。
“亞烯基”或“亞烯基鏈”是指具有2至20個碳原子並且具有一個或多個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈二價烴鏈基團。C2 -C20 亞烯基的非限制性實例包括亞乙烯基、亞丙烯基、亞丁烯基等。亞烯基鏈通過單鍵連接至所述分子的其餘部分並且通過單鍵連接至基團。亞烯基鏈與所述分子的其餘部分以及與基團的連結點可以通過所述鏈內的一個碳或任意兩個碳。除非在說明書中另有具體說明，否則亞烯基鏈可以是任選地取代的。
“炔基”或“炔基基團”是指具有2至20個碳原子並且具有一個或多個碳-碳三鍵的直鏈或支鏈烴鏈基團。每個炔基基團通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。包括了包含2至20的任意數目的碳原子的炔基基團。包含多至20個碳原子的炔基基團是C2 -C20 炔基，包含多至10個碳原子的炔基是C2 -C10 炔基，包含多至6個碳原子的炔基基團是C2 -C6 炔基並且包含多至5個碳原子的炔基是C2 -C5 炔基。C2 -C5 炔基包括C5 炔基、C4 炔基、C3 炔基和C2 炔基。C2 -C6 炔基包括以上對於C2 -C5 炔基所述的所有部分，但是還包括C6 炔基。C2 -C10 炔基包括以上對於C2 -C5 炔基和C2 -C6 炔基所述的所有部分，但是還包括C7 、C8 、C9 和C10 炔基。類似地，C2 -C12 炔基包括所有上述部分，但是還包括C11 和C12 炔基。C2 -C12 炔基的非限制性實例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等。除非在說明書另有具體說明，否則烷基可以是任選地取代的。
“亞炔基”或“亞炔基鏈”是指具有2至20個碳原子並且具有一個或多個碳-碳三鍵的直鏈或支鏈二價烴鏈基團。C2 -C20 亞炔基的非限制性實例包括亞乙炔基、亞丙炔基等。亞炔基鏈通過單鍵連接至所述分子的其餘部分並且通過單鍵連接至基團。亞炔基鏈與所述分子的其餘部分以及與基團的連結點可以通過所述鏈內的一個碳或任意兩個碳。除非在說明書中另有具體說明，否則亞炔基鏈可以是任選地取代的。
“烷氧基”或“-O-烷基”是指化學式ORa 所示的基團，其中Ra 是如上定義的含有1至20個碳原子的烷基、烯基或炔基基團。除非在說明書另有具體說明，否則烷氧基可以是任選地取代的。
“烷基氨基”是指化學式-NHRa 或-NRa Ra 所示的基團，其中每個Ra 獨立地為如上定義的含有1至12個碳原子的烷基、烯基或炔基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則烷基氨基基團可以是任選地取代的。
“烷基羰基”是指-C(=O)Ra 部分，其中Ra 是如上定義的烷基、烯基或炔基基團。烷基羰基的非限制性實例是甲基羰基(“乙縮醛”)部分。還可以將烷基羰基基團稱為“Cw-Cz醯基”，其中w和z表示如上定義的，Ra 中碳的數目範圍。例如，“C1 -C10 醯基”是指如上定義的烷基羰基基團，其中Ra 是如上定義的C1 -C10 烷基、C1 -C10 烯基或C1 -C10 炔基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則烷基羰基可以是任選地取代的。
術語“氨烷基”是指被一個或多個-NH2 基團取代的烷基。在某些實施方式中，氨烷基基團被1、2、3、4、5或更多個-NH2 基團取代。氨烷基基團可以任選地被如本文所述的一個或多個其它取代基取代。
“芳基”是指包含氫、6至18個碳原子和至少一個芳環的烴環系統基團。出於本發明揭露的目的，芳基可以是單環、雙環、三環或四環的環系統，其可以包括稠合或橋連的環系統。芳基包括(但不限於)衍生自醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、屈、螢蒽、芴、不對稱引達省、對稱引達省、茚滿、茚、萘、非那烯、菲、七曜烯、芘和苯并菲的芳基。除非在說明書中另有具體說明，否則術語“芳基”表示包括任選地取代的芳基。芳基包括可以稠合(如在萘基中)或非稠合(如在聯苯基中)的多個芳基環。芳基環還可以與一個或多個環烴、雜芳基或雜環稠合或非稠合。如本文所使用的，“芳基”包括雜芳基。
“芳烷基”、“芳基烷基”或“-烷基芳基”是指化學式-Rb -Rc 所示的基團，其中Rb 是如上定義的亞烷基、亞烯基或亞炔基基團，Rc 是如上定義的一個或多個芳基，例如，苄基、二苯甲基等。除非在說明書另有具體說明，否則芳烷基可以是任選地取代的。
“烷氧基”是指-OR基團，其中R是烷基或取代的烷基，較佳地C1-6 烷基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。
“碳環基”、“碳環”或“碳環”是指環狀結構，其中形成所述環的原子均為碳。碳環可以在所述環中包含3至20個碳原子。碳環包括芳基和環烷基。環烯基和環炔基如本文所定義。除非在說明書中另有具體說明，否則碳環基基團可以是任選地取代的。
“環烷基”是指僅由碳和氫原子組成的穩定、非芳族單環或多環完全飽和的烴基團，其可以包括稠合或橋連的環系統，其具有3至20個碳原子，較佳地具有3至約12個碳原子，更佳地3至約8個碳原子，並且其通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。單環環烷基基團包括(例如)環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基和環辛基。多環環烷基基團包括(例如)金剛烷基、降冰片基、十氫萘基、7,7-二甲基-雙環[2.2.1]庚基、雙環[3.1.0]己烷、八氫戊搭烯，雙環[1.1.1]戊烷、立方烷等。除非在說明書中另有具體說明，否則環烷基基團可以是任選地取代的。“環亞烷基”是指通過在所述環系統中的任何兩個碳處鍵合所述鏈而插入烷基鏈的環烷基基團。
“環烯基”是指僅由碳和氫原子組成，具有一個或多個碳-碳雙鍵的穩定、非芳族單環或多環烴基團，其可以包括稠合或橋連的環系統，其具有3至20個碳原子，較佳地具有3至10個碳原子並且其通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。單環環烯基基團包括(例如)環戊烯基、環己烯基、環庚烯基、環辛烯基等。多環環烯基基團包括(例如)雙環[2.2.1]庚-2-烯基等。除非在說明書中另有具體說明，否則環烯基可以是任選地取代的。
“環炔基”是指僅由碳和氫原子組成，具有一個或多個碳-碳三鍵的穩定、非芳族單環或多環烴基團，其可以包括稠合或橋連的環系統，其具有3至20個碳原子，較佳地具有3至10個碳原子並且其通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。單環環炔基基團包括(例如)環庚炔基、環辛炔基等。除非在說明書中另有具體說明，否則環炔基可以是任選地取代的。
“環烷基烷基”或“-烷基環烷基”是指化學式Rb -Rd 所示的基團，其中Rb 是如上定義的亞烷基、亞烯基或亞炔基基團，並且Rd 是如上定義的環烷基、環烯基、環炔基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則環烷基烷基基團可以是任選地取代的。
“鹵代烷基”是指被1、2、3、4、5、6或更多個如上定義的鹵代基團取代的如上定義的烷基，例如，三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴甲基等。除非在說明書中另有具體說明，否則鹵代烷基基團可以是任選地取代的。
“鹵代烯基”是指被1、2、3、4、5、6或更多個如上定義的鹵代基團取代的如上定義的烯基，例如，1-氟代丙烯基、1,1-二氟丁烯基等。除非在說明書中另有具體說明，否則鹵代烯基基團可以是任選地取代的。
“鹵代炔基”是指被1、2、3、4、5、6或更多個如上定義的鹵代基團取代的如上定義的炔基，例如，1-氟代丙炔基、1-氟代丁炔基等。除非在說明書中另有具體說明，否則鹵代烯基基團可以是任選地取代的。
如(例如)“取代的烷基”中的術語“取代的”是指被一個或多個互不干擾的取代基取代的部分(例如，烷基)，所述取代基如(但不限於)：烷基、C3-8 環烷基，例如，環丙基、環丁基等；鹵代，例如，氟代、氯代、溴代和碘代；氰基；硝基；烷氧基，低級苯基；取代的苯基；等。“取代的芳基”是具有一個或多個互不干擾的基團作為取代基的芳基。對於苯環上的取代，所述取代基可以處於任何定位(即鄰位、間位或對位)。
“互不干擾的取代基”是當存在於分子中時，通常與包含在所述分子中的其它官能團不起反應的那些基團。非限制性實例包括鹵素(F、Br、Cl、I)，烷基(例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、s-丁基、戊基、新戊基、己基、異戊基等)、鹵代烷基(例如，CF3 、CHF2 、CH2 F等)、環烷基(環丙基、環丁基、環戊基、環己基等)、烷氧基(-OR)、鹵代烷氧基(例如，-OCF3 、-OCHF2 、-OCH2 F等)、氨基(例如，-N(H)烷基、-N(烷基)2 、-NH(環烷基)、-NH(芳基)等)、醯胺基(例如，-NH(COR)、磺醯基(例如，-SO2 R)，醯基(例如，-C(O)R)、氰基、硝基、苯基和雜芳基(例如，噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基等)，其中R獨立地為H、烷基、烷氧基、氨基或芳基(例如，苯基)。
“雜環基”、“雜環”或“雜環”是指由2至12個碳原子和1至6個選自氮、氧和硫的雜原子所組成的穩定3-至20-員非芳族環基團。雜環基或雜環包括如以下所定義的雜芳基。除非在說明書中另有具體說明，否則雜環基基團可以是單環、雙環、三環或四環的環系統，其可以包括稠合或橋連的環系統；並且雜環基基團中的氮、碳或硫原子可以任選地被氧化；所述氮原子可以任選地季銨化；並且所述雜環基基團可以是部分或完全飽和的。這些雜環基基團的實例包括(但不限於)二氧戊環基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氫異喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、異噻唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、2-氧呱嗪基、2-氧呱啶基、2-氧吡咯烷基、噁唑烷基、呱啶基、呱嗪基、4-呱啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎寧環基、噻唑烷基、四氫呋喃基、三噻烷基、四氫吡喃基、硫代嗎啉基、硫嗎啉基、1-氧-硫代嗎啉基和1,1-二氧代-硫代嗎啉基。除非在說明書中另有具體說明，否則雜環基基團可以是任選地取代的。在一些實施方式中，“取代的雜環”是具有由互不干擾的取代基所形成的一個或多個側鏈的雜環。
術語“羥烷基”或“羥基烷基”是指被一個或多個羥基(-OH)基團取代的烷基。在某些實施方式中，羥烷基基團被1、2、3、4、5或更多個-OH基團取代。羥烷基基團可以任選地被如本文所述的一個或多個其它取代基取代。
術語“烴基”是指一價烴基，不論它是脂族的、部分或完全不飽和的、非環、環或芳族的，或任何上述的組合。在某些實施方式中，烴基基團具有1至40個或更多個，1至30個或更多個，1至20個或更多個或者1至10個或更多個碳原子。術語“亞烴基”是指二價烴基基團。烴基或亞烴基基團可以任選地被如本文所述的一個或多個取代基取代。
術語“雜烴基”是指其中一個或多個碳原子分別獨立地被選自氧、硫、氮和磷的雜原子替換的烴基基團。在某些實施方式中，雜烴基基團具有1至40個或更多個，1至30個或更多個，1至20個或更多個或者1至10個或更多個碳原子，和1至10個或更多個或1至5個或更多個雜原子。術語“雜亞烴基”是指二價烴基基團。雜烴基和雜亞烴基基團的實例無限制地包括乙二醇和聚乙二醇部分，如(-CH2 CH2 O-)n H(一價雜烴基基團)和(-CH2 CH2 O-)n (二價雜亞烴基基團)，其中n是1至12或以上的整數，以及丙二醇和聚丙二醇部分，如(-CH2 CH2 CH2 O-)n H和(-CH2 CH(CH3 )O-)n H(一價雜烴基基團)以及(-CH2 CH2 CH2 O-)n 和(-CH2 CH(CH3 )O-)n (二價雜亞烴基基團)，其中n是1至12或以上的整數。雜烴基或雜亞烴基基團可以任選地被如本文所述的一個或多個取代基取代。
“N -雜環基”是指含有至少一個氮並且其中雜環基基團與所述分子的其餘部分的連結點是通過所述雜環基基團中的氮原子的如上定義的雜環基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則N -雜環基基團可以是任選地取代的。
“雜環基烷基”或“-烷基雜環基”是指化學式-Rb -Re 所示的基團，其中Rb 是如上定義的亞烷基、亞烯基或亞炔基鏈，並且Re 是如上定義的雜環基基團，並且如果所述雜環基是含氮雜環基，則所述雜環基可以在所述氮原子處連接至烷基、烯基、炔基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則雜環基烷基基團可以是任選地取代的。
“雜芳基”是指包含氫原子、1至13個碳原子、1至6個雜原子，較佳地選自氮、氧和硫和至少一個芳環的5-至20-員環系統基團。出於本發明的目的，所述雜芳基基團可以是單環、雙環、三環或四環的環系統，其可以包括稠合或橋連的環系統；並且雜芳基基團中的氮、碳或硫原子可以任選地被氧化；所述氮原子可以任選地季銨化。實例包括(但不限於)氮雜卓基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二噁茂基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b ][1,4]二氧雜環庚三烯基、1,4-苯并二噁烷、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并二噁茂基、苯并二氧雜環己烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并噻吩基)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、哢唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并苯硫基、呋喃基、呋喃酮基、異噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、異氮茚基、二氫吲哚基、異二氫氮茚基、異喹啉基、吲哚嗪基、異噁唑基、萘啶基、氧雜二唑基、2-氧代氮雜基、噁唑基、環氧乙烷基、1-氧代吡啶基、1-氧代嘧啶基、1-氧代吡嗪基、1-氧代噠嗪基、1-苯基-1H -吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、啡噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎寧環基、異喹唑基、四氫喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和苯硫基(即噻吩基)。除非在說明書中另有具體說明，否則雜芳基基團可以是任選地取代的。在一些實施方式中，“取代的雜芳基”是具有一個或多個互不干擾的基團作為取代基的雜芳基。
“N -雜芳基”是指含有至少一個氮並且其中雜芳基基團與所述分子的其餘部分的連結點是通過所述雜芳基基團中的氮原子的如上定義的雜芳基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則N -雜芳基基團可以是任選地取代的。
“雜芳基烷基”或“-烷基雜芳基”是指化學式-Rb -Rf 所示的基團，其中Rb 是如上定義的亞烷基、亞烯基或亞炔基鏈，並且Rf 是如上定義的雜芳基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則雜芳基烷基基團可以是任選地取代的。
本文所使用的術語“取代的”表示任何上述基團(即烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基羰基、硫烷基、芳基、芳烷基、碳環基、環烷基、環烯基、環炔基、環烷基烷基、鹵代烷基、雜環基、N -雜環基、雜環基烷基、雜芳基、N -雜芳基和/或雜芳烷基)，其中至少一個氫原子被本文所提供的列表中的非氫原子的鍵替換。如果未包括取代基列表，則取代基可以是(但不限於)：鹵素原子，如F、Cl、Br和I；氧原子基團，如羥基、烷氧基和酯基中的氧原子；硫原子基團如硫醇基、硫烷基、碸基、磺醯基和亞碸基中的硫原子；氮原子基團如胺、醯胺、烷基胺、二烷基胺、芳基氨基、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、亞醯胺和烯胺中的氮原子；矽原子基團如三烷基甲矽烷基、二烷基芳基甲矽烷基、烷基二芳基甲矽烷基和三芳基甲矽烷基中的矽原子；和多種其它基團中的其它雜原子。“取代的”還表示其中一個或多個氫原子被高鍵級的鍵(例如，雙-或三-鍵)替換為雜原子，如以氧(oxo)表示的氧(oxygen)、羰基、羧基和酯基；和基團如亞胺、肟、腙和腈中的氮的任何上述基團。例如，“取代的”包括任何上述基團，其中一個或多個氫原子被鹵化物、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、-ORg 、-SRg 、-NRh Ri 、烷基、烯基、炔基、鹵代烷基、羥烷基、氨烷基、-烷基環烷基、-烷基雜環基、-烷基芳基、-烷基雜芳基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-C(=O)Rg 、-C(=NRj )Rg 、-S(=O)Rg 、-S(=O)2 Rg 、-S(=O)2 ORk 、-C(=O)ORk 、-OC(=O)Rg 、-C(=O)NRh Ri 、-NRg C(=O)Rg 、-S(=O)2 NRh Ri 、-NRg S(=O)2 Rg 、-OC(=O)ORg 、-OC(=O)NRh Ri 、-NRg C(=O)ORg 、-NRg C(=O)NRh Ri 、-NRg C(=NRj )NRh Ri 、-P(=O)(Rg )2 、-P(=O)(ORk )Rg 、-P(=O)(ORk )2 、-OP(=O)(Rg )2 、-OP(=O)(ORk )Rg 和-OP(=O)(ORk )2 替換，其中：每次出現的Rg 獨立地選自氫、烷基、鹵代烷基、羥烷基、氨烷基、-烷基環烷基、-烷基雜環基、-烷基芳基、-烷基雜芳基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；每次出現的Rh 和Ri 獨立地選自氫、烷基、鹵代烷基、羥烷基、氨烷基、-烷基環烷基、-烷基雜環基、-烷基芳基、-烷基雜芳基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，或者Rh 和Ri 與它們所連接的氮原子一起形成雜環或雜芳基環；每次出現的Rj 獨立地為氫、-ORg 、烷基、鹵代烷基、羥烷基、氨烷基、-烷基環烷基、-烷基雜環基、-烷基芳基、-烷基雜芳基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；並且每次出現的Rk 獨立地為氫、W、烷基、鹵代烷基、羥烷基、氨烷基、-烷基環烷基、-烷基雜環基、-烷基芳基、-烷基雜芳基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，其中每次出現的W獨立地為H+ 、Li+ 、Na+ 、K+ 、Cs+ 、Mg2+ 、Ca2+ 或-+ N(Rg )2 Rh Ri 。
“硫烷基”是指化學式-SRa 所示的基團，其中Ra 為如上定義的含有1至12個碳原子的烷基、烯基或炔基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則硫烷基基團可以是任選地取代的。
如本文所使用的“有機基”應包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。
如本文所使用的，符號 “
Figure 02_image003
”(在下文中可以稱為“連接鍵點”)表示兩個化學實體之間的連接點的鍵，其中將一個化學實體描述為連接至連接鍵點，而不將另一個描述為連接至連接鍵點。例如，“
Figure 02_image005
”表示化學實體“XY”通過連結鍵點鍵合至另一個化學實體。此外，可以通過推斷指明對未顯示的化學實體的具體連結點。例如，化合物CH3 -R3 ，其中R3 是H或“
Figure 02_image005
”表示當R3 是“XY”時，則連結鍵點是與將R3 描述為鍵合至CH3 的鍵相同的鍵。
“稠合的”是指稠合至本發明所述的化合物中已有的環狀結構的任何本文所述的環狀結構。當所述稠環是雜環基環或雜芳基環時，成為稠合雜環基環或稠合雜芳基環的一部分的已有的環狀結構上的任何碳原子可以被氮原子替換。
“親電試劑”和“親電基團”表示具有能夠與親核試劑反應的親電中心(即尋求電子的中心)的離子或可以為離子的原子或原子集合。
“親核試劑”和“親核基團”是指具有能夠與親電試劑反應的親核中心(即尋求親電中心或親電試劑的中心)的離子或可以為離子的原子或原子集合。
“生理學可切割的”或“可水解的”或“可降解的”鍵是在生理條件下與水反應(即被水解)的鍵。在水中水解的鍵的傾向不僅將取決於連接兩個中心原子的鍵的一般類型，而且還取決於連接至這些中心原子的取代基。適當的水解不穩定鍵或弱鍵包括(但不限於)氨基甲酸酯、羧酸酯、磷酸酯、酸酐、縮醛、縮酮、醯氧基烷基醚、亞胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。
“可釋放接頭”是指將蛋白與大分子連接的接頭。通過水解、酶促過程、催化過程或其它方法，釋放大分子，借此導致產生了非偶聯的蛋白質部分。在某些實施方式中，所述可釋放接頭通過體內發生的上述過程釋放大分子。
“酶促可降解的鍵”表示經受一種或多種酶的降解的鍵。
“水解穩定的”鍵是指化學鍵，通常共價鍵，其在水中基本是穩定的，也就是在生理條件下，在長時間內不經歷任何明顯程度的水解。水解穩定的鍵的實例包括(但不限於)以下：碳-碳鍵(例如，脂肪鏈中)、碳-硫鍵、醚、醯胺、氨基甲酸酯等。通常，水解穩定的鍵是在生理條件下，顯示出每天小於約1-2%的水解速率的鍵。代表性的化學鍵的水解速率可見於大部分標準化學教科書。
“藥物可用的賦形劑或載體”是指可以任選地包含在本發明所述的組合物中並且不對患者造成明顯不利的毒理學作用的賦形劑。“藥理學有效量”、“生理學有效量”和“治療有效量”在本文中可互換使用以表示在血流或在靶組織中提供所期望的偶聯物(或相應非偶聯蛋白)水平所需的蛋白-大分子偶聯物的量。準確的量將基於多種因素，例如，具體的蛋白、治療性組合物的組分和物理性質、預期患者群體、個體患者的考慮等，並且基於本文所提供的資訊，本領域技術人員可以容易地確定所述量。
如本文所使用的術語“IL-2部分”是指具有人IL-2活性的部分。IL-2部分還將具有適合於與聚合試劑反應的至少一個親電基團或親核基團。另外，術語“IL-2部分”涵蓋了偶聯前的IL-2部分和偶聯後的IL-2部分殘基兩者。如以下將進一步詳細解釋的，本領域的技術人員可以確定任何給定部分是否具有IL-2活性。包含對應於圖1中序列的氨基酸序列的蛋白是IL-2部分以及與之基本同源的任何蛋白或多肽。如本文所使用的，術語“IL-2部分”包括有意修飾(例如，通過定點突變)或通過突變偶然修飾的這些蛋白。這些術語還包括具有1至6個額外的糖基化位點的類似物，在蛋白的羧基末端具有至少一個額外的氨基酸的類似物，其中所述額外的氨基酸包括至少一個糖基化位點，和具有包括至少一個糖基化位點的氨基酸序列的類似物。該術語包括天然和重組產生的部分兩者。
術語“基本同源”是指特定主題序列，例如，突變體序列與參考序列相差一個或多個替換、缺失或添加，其淨效果不會在參考和主題序列之間造成不利的功能差異。出於本發明的目的，將具有大於80%(更佳地大於85%，更佳地大於90%，最佳大於95%)的同源等價生物活性(儘管不必需等價的生物活性強度)和等價表達特徵的序列認為是基本同源的。出於確定同源性的目的，應忽略成熟序列的截短。
術語“片段”表示具有IL-2部分的部分或片段的氨基酸序列並且具有IL-2的生物活性的任何蛋白或多肽。片段包括通過IL-2部分的蛋白水解降解所產生的蛋白或多肽以及通過本領域中常規方法，通過化學合成所產生的蛋白或多肽。
術語“患者”是指患有或易患通過施用活性劑(例如，偶聯物)可以預防或治療的病況的生物體，並且包括人和動物兩者。
“任選的”或“任選地”表示隨後所述的狀況可以發生或可以不發生，從而該描述包括其中所述狀況發生的情況和其中它不發生的情況。
“基本上”表示接近全部或完全，例如，滿足以下中的一種或多種：大於所述條件的50%、51%或以上，75%或以上，80%或以上，90%或以上或95%或以上。
如下所示縮寫肽中的氨基酸殘基：苯丙氨酸為Phe或F；亮氨酸為Leu或L；異亮氨酸為lie或I；蛋氨酸為Met或M；纈氨酸為Val或V；絲氨酸為Ser或S；脯氨酸為Pro或P；蘇氨酸為Thr或T；丙氨酸為Ala或A；酪氨酸為Tyr或Y；組氨酸為His或H；穀氨醯胺為Gln或Q；天冬醯胺是Asn或N；賴氨酸為Lys或K；天冬氨酸是Asp或D；谷氨酸為Glu或E；半胱氨酸為Cys或C；色氨酸為Trp或W；精氨酸為Arg或R；和甘氨酸為Gly或G。
本發明揭露包括本發明揭露的所有藥物可用的同位素標記化合物，其中一個或多個原子被具有相同原子序數，但是原子量或質量數不同於自然界中常見的原子量或質量數的原子替換。適合於在本發明揭露所述的化合物中包括的同位素的實例包括氫的同位素，如2 H和3 H、碳的同位素，如11 C、13 C和14 C、氯的同位素，如36 Cl、氟的同位素，如18 F、碘的同位素，如123 I和125 I、氮的同位素，如13 N和15 N、氧的同位素，如15 O、17 O和18 O、磷的同位素，如32 P和硫的同位素，如35 S。
本發明揭露的某些同位素-標記的化合物，例如，引入放射性同位素的那些在藥物和/或底物組織分佈研究中是有用的。考慮到它們易於摻入和方便的檢測方式，對於該目的，放射性同位素氚，即3 H，和碳-14，即14 C是特別有用的。
用重同位素，如氘，即2 H替換可以由於更大的代謝穩定性而提供某些治療優勢，例如，提高體內半衰期或降低劑量要求，並因此在一些情況下可以是較佳的。
通過發射正電子的同位素，如11 C、18 F、15 O和13 N的取代可以在用於檢查底物受體佔用的正電子發射斷層掃描(PET)研究中是有用的。
通常可以通過本領域技術人員已知的常規方法製備本發明揭露的同位素-標記的化合物。
短語“其對映異構體、對映異構體的混合物、兩種或更多種非對映體的混合物、互變異構體、兩種或更多種互變異構體的混合物、位置異構體、兩種或更多種位置異構體的混合物或同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物”具有與短語“(i)其中提及的化合物的對映異構體、對映異構體的混合物、兩種或更多種非對映體的混合物、互變異構體、兩種或更多種互變異構體的混合物、位置異構體、兩種或更多種位置異構體的混合物或同位素變體；(ii)其中提及的化合物的藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物；或者(iii)其中提及的化合物的對映異構體、對映異構體的混合物、兩種或更多種非對映體的混合物、互變異構體、兩種或更多種互變異構體的混合物、位置異構體、兩種或更多種位置異構體的混合物或同位素變體的藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物”具有相同含義。 [製備方法]
本發明揭露提供了製備用於控制釋放治療蛋白劑在施用於需要用該治療劑治療的患者時的遞送速率的蛋白-[大分子]z偶聯物的方法。通過本發明揭露的方法製備的偶聯物, 提供了通過接頭的可釋放速率和大分子數目控制的、在一段持續時間內遞送治療劑的方式。
在一個方面，本發明揭露涉及使用方案(I)製備蛋白-大分子偶聯物的方法：
Figure 02_image007
(方案I) 其中x是1-25的整數； y是0-24的整數； z是1-25的整數； x=y+z； L是接頭； FG0 是能夠與活性蛋白劑的親核基團反應以形成鍵，包括氨基甲酸酯鍵、硫醇橋等的官能團； FG2 是能夠通過點擊化學與FG3 反應的官能團，其包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基基團(例如，二苯并環辛炔(DBCO))； FG3 是能夠通過點擊化學與FG2 反應的官能團，其包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽； 所述細胞因子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α或TNF-β。
在某些實施方式中，所述細胞因子是IL-2。
在某些實施方式中，所述IL-2包含與SEQ ID NO:1約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
所述趨化因子包括MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309(CCL1)、BCA1(CXCL13)、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸細胞活化趨化因子-1、嗜酸細胞活化趨化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC(CCL20)、ELC(CCL19)、SLC(CCL21)、ENA-78、PBP、TECK(CCL25)、CTACK(CCL27)、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
所述抗體靶向以下中的一種或多種：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受體樣激酶1、澱粉狀蛋白A蛋白、β–澱粉狀蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125(模擬)、C5、CA-125、CCL11(嗜酸細胞活化趨化因子-1)、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C24抗原、CD276、CD278、CD319、艱難梭菌(clostridium difficile )、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、達比加群(Dabigatran)、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、內皮糖蛋白(Endoglin)、上皮唾蛋白(episialin)、EPHA3、c-Met、FGFR2、纖維蛋白IIβ鏈、FGF 23、葉酸受體1、GMCSF、GD2神經節糖苷、GDF-8、GCGR、明膠酶B、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受體α-鏈、激肽釋放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受體、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6 R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干擾素α/β受體、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、乙型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-選擇素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、間皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、連接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂醯絲氨酸、RANKL、RTN4、獼猴因子、ROR1、SLAMF7、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )α毒素、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )雙組分殺白細胞素、SOST、選擇素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受體、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
肽包括(但不限於)：高血糖素樣肽1(GLP-1)、艾塞那肽-2、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、心房利鈉因子(ANF)、胃饑餓素、加壓素、生長激素、生長激素-釋放激素(GHRH)、RC-3095、生長抑素、鈴蟾肽、PCK-3145、Phe-His-Ser-Cys-Asn(PHSCN)、IGFl、B-型利尿鈉肽、肽YY(PYY)、干擾素、血小板反應蛋白、血管生成素、降鈣素、促性腺激素釋放激素、水蛭素、高血糖素、抗-TNF-α、成纖維細胞生長因子、粒細胞集落刺激因子、奧尼匹肽、垂體甲狀腺激素(PTH)、亮脯利特、舍莫瑞林、pramorelin、奈西立肽、羅替加肽、西侖吉肽、MBP-8298、AL-108、恩夫韋地、胸腺法新、daptamycin、HLFI-II、乳鐵傳遞蛋白、地米肽、谷胱甘肽、T細胞表位PR1、蛋白酶-3肽1-11、B細胞表位P3、促黃體激素-釋放激素(LHRH)、P物質、神經激肽A、神經激肽B、CCK-8、腦啡肽，包括亮氨酸腦啡肽和蛋氨酸腦啡肽、皮抑菌肽、[des-Ala20, Gln34]-皮抑菌肽、表面活性劑-相關抗微生物陰離子肽、蜜蜂抗菌肽IA；蜜蜂抗菌肽IB；OV-2；1025，乙醯基-黏附素肽(1025-1044)醯胺；Theroma-cin(49-63)；培西加南(MSI-78)；吲哚青黴素；愛帕琳肽-15(63-77)；CFPlO(71-85)；炭疽相關的致死因子(LF)抑制劑；牛抗菌肽；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑2；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑3；肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑4；NS4A-NS4B丙型肝炎病毒(NS3蛋白酶抑制劑I)；HIV-1、HIV-2蛋白酶底物；抗-FM肽；Bak-BH3；Bax BH3肽(55-74)(野生型)；Bid BH3-r8；CTT(明膠酶抑制劑)；E75(Her-2/neu)(369-377)；GRP78結合嵌合肽基序；p53(17-26)；EGFR2/KDR拮抗劑；Colivelin AGA-(C8R) HNGl 7(人體肽衍生物)；活性-依賴性神經營養性因子(ADNF)；β-分泌酶抑制劑1；β-分泌酶抑制劑2；ch[β]-澱粉狀蛋白(30-16)；Humanun(HN)sHNG、[Glyl4]-HN、[Glyl 4]-人體肽；血管緊張素轉化酶抑制劑(BPP)；腎素抑制劑III；膜聯蛋白I(ANXA-I；Ac2-12)；抗炎肽I；抗炎肽2；抗炎愛帕琳肽12；[D-Phel2, Leul4]-鈴蟾肽；黑腹果蠅觸足肽(酸)(穿透肽)；黑腹果蠅觸足前導肽(CT)；肥碩脫粒肽；硫酸酯化的[Thr28, Nle31]-縮膽囊肽(25-33)；痛敏肽(1-13)(醯胺)；纖維蛋白溶解抑制因子；Γ-纖維蛋白原(377-395)；類爪蟾肽；肥胖抑制素(人)；[Hisl, Lys6]-GHRP(GHRP-6)；[Ala5,[β]-Ala8]-神經激肽A(4-10)；神經調節肽B；神經調節肽C；神經調節肽N；活性-依賴性神經營養性因子(ADNF-14)；Acetalin I(阿片樣物質受體拮抗劑1)；Acetalin 2(阿片樣物質受體拮抗劑2)；Acetalin 3(阿片樣物質受體拮抗劑3)；ACTH(1-39)(人)；ACTH(7-38)(人)；蛙皮降壓肽；脂動激素(東亞飛蝗(Locusta Migratoria ))；十八烷基化的ADP-核糖基化因子6、myr-ARF6(2-13)；PAMP(1-20)(腎上腺髓質素前體(1-20)人)；AGRP(25-51)；胰澱素(8-37)(人)；血管緊張素I(人)；血管緊張素II(人)；Apstatin(氨肽酶P抑制劑)；沼水蛙抗菌肽-I；蛙皮素I；RL-37；LL-37(抗微生物肽)(人)；天蠶抗菌肽A；抗氧化肽A；抗氧化肽B；L-肌肽；BcI 9-2；NPVF；神經肽AF(hNPAF)(人)；Bax BH3肽(55-74)；bFGF抑制肽；bFGF抑制肽II；血管舒緩激肽；[Des-Argl OJ-HOE 140；半胱天冬氨酸酶I抑制劑II；半胱天冬氨酸酶I抑制劑VIII；Smac N7蛋白(MEKl衍生肽抑制劑I；hBD-1([β]-防禦素-1)(人)；hBD-3([β]-防禦素-3)(人)；hBD-4([β]-防禦素-4)(人)；HNP-I(防禦素人嗜中性白細胞肽I)；HNP-2(防禦素人嗜中性白細胞肽-2強啡肽A(1-17))；內嗎啡肽-I；[β]-內啡肽(人、豬)；內皮素2(人)；纖維蛋白原結合抑制肽；環(-GRGDSP)；TP508(凝血酶-衍生肽)；甘丙肽(人)；GIP(人)；促胃液素釋放肽(人)；促胃液素-1(人)；胃饑餓素(人)；PDGF-BB肽；[D-Lys3]-GHRP-6；HCV核心蛋白(1-20)；a3Bl整合素肽片段(325)(醯胺)；層黏連蛋白五肽(醯胺)Mel-anotropin-強化因子(MPF)；VA-[β]-MSH、促脂素-Y(阿黑皮素原-衍生的)；心房鈉尿肽(1-28)(人)；血管鈉肽(1-27)；[Ala5, B-Ala8]-神經激肽A(4-10)；神經調節肽L(NKA)；Ac-(Leu28, 31)-神經肽Y(24-26)；阿利特辛；腦神經肽II；[D-tyrll]-神經降壓素；IKKy NEMO結合域(NBD)抑制肽；PTD-p50(NLS)抑制肽；食欲肽A(牛、人、小鼠、大鼠)；食欲肽B(人)；水通道蛋白-2(254-267)(人胰抑素)(37-52)；胰多肽(人)；神經肽；肽YY(3-36)(人)；羥甲基-植物螯合肽2；PACAP(1-27)(醯胺，人、牛、大鼠)；促乳激素釋放肽(1-31)(人)；salusin-α；salusin-β；鞘脂活化蛋白C22；胰泌素(人)；L-選擇素；Endokinin A/B；Endokinin C(人)；Endokinin D(人)；凝血酶受體(42-48)激動劑(人)；LSKL(血小板反應蛋白的抑制劑)；促甲狀腺素釋放激素(TRH)；P55-TNFR片段；尿緊張素II(人)；VIP(人、豬、大鼠)；VIP拮抗劑；毒蜥素；艾塞那肽；ZPlO(AVEOOIOO)；普蘭林肽；AC162352(PYY)(3-36)；PYY；奧尼匹肽；高血糖素；GRP；胃饑餓素(GHRP6)；亮脯利特；組氨瑞林；縮宮素；阿托西班(RWJ22164)；舍莫瑞林；奈西立肽；比伐盧定(水蛭肽)；艾替班特；Aviptadin；羅替加肽(ZP123、GAP486)；西侖吉肽(EMD-121924、RGD肽)；AlbuBNP；BN-054；血管緊張素II；MBP-8298；肽亮氨酸精氨酸；齊考諾肽；AL-208；AL-108；Carbeticon；三肽；SAL；Coliven；人體肽；ADNF-14；VIP(血管活性腸肽)；胸腺法新；桿菌肽；短桿菌肽；培西加南(MSI-78)；Pl 13；PAC-113；SCV-07；HLFl-Il(乳鐵傳遞蛋白)；DAPTA；TRI-1144；Tritrpticin；抗炎素2；Gattex(替度魯肽，ALX-0600)；Stimuvax(L-BLP25)；Chrysalin(TP508)；Melanonan II；Spantide II；藍肽；辛卡利特；五肽胃泌素；胰泌素；內皮抑素肽；E-選擇素；HER2；IL-6；IL-8；IL-10；PDGF；血小板反應蛋白；uPA (I)；uPA (2)；VEGF；VEGF (2)；五肽-3；XXLRR；β-澱粉狀蛋白原纖維形成；內嗎啡肽-2；TIP 39(結節漏斗部神經肽)；PACAP(1-38)(醯胺，人、牛、大鼠)；TGFB啟動肽；胰島素敏化因子(ISF402)；轉化生長因子BI肽(TGF-B1)；雨蛙素釋放因子；IELLQAR(8-branchMAPS)；替加泊肽PK3145；戈舍瑞林；阿巴瑞克；西曲瑞克；加尼瑞克；地加瑞克(曲普瑞林)；巴蘆西班(FE 200440)；促生長激素釋放肽；奧曲肽；依替巴肽；Netamiftide(INN-00835)；Daptamycin；Spantide II；地米肽(RDP-58)；AL-209；恩夫韋地；IDR-I；六勝肽-6；胰島素-A鏈；蘭瑞肽；六[ρ]肽-3；胰島素B-鏈；甘精胰島素-A鏈；甘精胰島素-B鏈；胰島素-賴脯人胰島素B-鏈類似物；胰島素-天冬胰島素B-鏈類似物；胰島素-賴穀胰島素B鏈類似物；胰島素-地特胰島素B鏈類似物；生長抑素腫瘤抑制類似物；胰抑素(37-52)；血管活性腸肽片段(KKYL-NH2 )；和強啡肽A。適合於在本發明中使用的蛋白的實例包括(但不限於)：免疫毒素SSlP、腺苷脫氨酶、精氨酸酶等。
所述大分子可以是水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。在一些實施方式中，所述大分子包括包含約6至約26個碳原子的脂肪酸，選自下列的聚合物：2-甲丙烯醯-氧乙基磷醯膽鹼、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸脂)、聚(丙烯醯胺)、聚(N-丙烯醯嗎啉)、聚(烷氧基)聚合物、聚(醯胺)、聚(醯胺胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬醯胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚對苯二甲酸丁二醇酯、聚(己內酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯醯胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(磷酸三乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(a-羥酸)、聚(羥乙基丙烯酸脂)、聚(羥乙基噁唑啉)、聚(羥基甲基丙烯酸酯)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚(羥丙基噁唑啉)、聚(亞氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯醯胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有機磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚磷腈、聚(丙二醇)、聚(糖)、聚(矽氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲醚)、聚(乙烯吡硌烷酮)、矽酮、直鏈澱粉、纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、殼多糖、殼聚糖、葡聚糖、糊精、明膠、透明質酸(HA)和衍生物、官能化透明質酸、甘露聚糖、果膠、肝素、硫酸乙醯肝素(HS)、鼠李聚糖半乳糖醛酸、澱粉、羥烷基澱粉、羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸(PSA)及其它碳水化合物-基聚合物、木聚糖和共聚物。
所述大分子還可以是選自下列的蛋白或多肽：白蛋白、轉鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白、免疫球蛋白、XTEN肽、富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、彈性蛋白-樣多肽(ELP)、CTP肽或明膠-樣蛋白(GLK)聚合物。
在某些實施方式中，接頭L是可釋放接頭(RL)的殘基。
在某些實施方式中，x或z是2或更大。在某些實施方式中，x或z是3或更大。在某些實施方式中，x或z是4或更大。在某些實施方式中，x或z是5或更大。在某些實施方式中，x或z是6或更大。在某些實施方式中，x或z大於6。
在某些實施方式中，本文所述的製備方法涉及包括蛋白與多個雙官能接頭的偶聯的第一步。預計由於接頭較小的尺寸，與蛋白和大分子的直接偶聯相比，上述偶聯過程更有效並且可以實現更高的偶聯程度。還如本文所述的，所揭露的方法的第二步可採用能夠將接頭與大分子高效率連接的點擊化學。不受任何具體理論的束縛，據信該方法提供了採用空間位阻減小的優勢，因此這可以改善反應效率。此外，所述合成和純化步驟是簡化且成本較低的，因此該方法提供了用於聚合物-蛋白治療劑的大規模生產和製造的顯著優勢。 [雙官能可釋放接頭]
本發明揭露所述的偶聯物可以衍生自雙官能可釋放接頭。
在一些方面，本發明涉及化學式(I)所示的雙官能可釋放接頭：
Figure 02_image001
(I) 或其立體異構體、互變異構體或它們的混合物，或者它們的同位素變體； 其中： X1 是第一間臂部分； X2 是第二間臂部分； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； Re 是電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基； a是0至4的整數； b是1至3的整數； c是0至1的整數； FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵，如氨基甲酸酯鍵的官能團；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團。
在化學式(I)的一些實施方式中，R1 和R2 分別獨立地為C1-5 烷基、取代的C1-5 烷基、C2-6 烯基，取代的C2-6 烯基、C2-6 炔基，取代的C2-6 炔基、苯基或取代的苯基。在某些實施方式中，R1 和R2 分別獨立地為C1-5 烷基或取代的C1-5 烷基。
在化學式(I)的一些實施方式中，Re 是硝基、氰基、鹵素、-CONH(C1-5 烷基)或-CONH(苯基)、取代的-CONH(C1-5 烷基)或-CONH(苯基)、-SO2 NH(C1-5 烷基)或-SO2 NH(苯基)、取代的-SO2 NH(C1-5 烷基)或-SO2 NH(苯基)、-SO2 (C1-5 烷基)或-SO2 (苯基)、取代的-SO2 (C1-5 烷基)或-SO2 (苯基)、C­1-5 烷氧基、取代的C­1-5 烷氧基、C1-5 烷基或C­3-6 環烷基、取代的C1-5 烷基或C­3-6 環烷基、苯基或5-至6-員雜芳基或取代的苯基或5-至6-員雜芳基。
在化學式(I)的一些實施方式中，a是0至3的整數。在一些實施方式中，a是0至2的整數。在一些實施方式中，a是0。在一些實施方式中，a是1。在一些實施方式中，a是2。在一些實施方式中，a是3。在一些實施方式中，a是4。
在化學式(I)的一些實施方式中，b是1或2的整數。在一些實施方式中，b是1。在一些實施方式中，b是2。在一些實施方式中，b是3。
在化學式(I)的一些實施方式中，在一些實施方式中，c是0。在一些實施方式中，c是1。
在化學式(I)的一些實施方式中，X1 和X2 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是不同的間臂部分。
在化學式(I)內，提供了具有更限定的結構的雙官能可釋放接頭：
Figure 02_image010
(I-B)；
Figure 02_image012
(I-C) 其中每一個X1 是第一間臂部分；X2 是第二間臂部分；R1 、R2 、[Re ]a 、FG1 和FG2 如先前所定義的。
在化學式(I)、(I-B)或(I-C)的某些實施方式中，a是0至2的整數；R1 和R2 分別獨立地為H、Me或Et；並且Re 為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
在化學式(I)、(I-B)或(I-C)的某些實施方式中，所述雙官能可釋放接頭具有以下結構：
Figure 02_image014
；或
Figure 02_image016
。
在另一個方面，本發明揭露涉及化學式(XVIII)所示的雙官能可釋放接頭：
Figure 02_image018
(XVIII) 或其立體異構體、互變異構體或它們的混合物，或者它們的同位素變體； 其中： X1 是間臂部分； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； Re 是電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基； a是0至4的整數； c是2； FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵的官能團；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團。
在化學式(XVIII)的某些實施方式中，a是0至2的整數；R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；並且Re 為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
在化學式(XVIII)的某些實施方式中，所述雙官能可釋放接頭具有以下結構之一：
Figure 02_image020
或
Figure 02_image022
。
在另一個方面，本發明揭露涉及式(II)所示的雙官能可釋放接頭：
Figure 02_image024
(II) 或其立體異構體、互變異構體或它們的混合物，或者它們的同位素變體； 其中： R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； X2 ，當存在時，是第二間臂部分； X3 ，當存在時，是第三間臂部分； FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵，如氨基甲酸酯鍵的官能團；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團。
在化學式(II)的一些實施方式中，R1 和R2 分別獨立地為C1-5 烷基、取代的C1-5 烷基、C2-6 烯基、取代的C2-6 烯基、C2 -6 炔基、取代的C2 -6 炔基、苯基或取代的苯基。在某些實施方式中，R1 和R2 分別獨立地為C1-5 烷基或取代的C1-5 烷基。
在化學式(II)的一些實施方式中，Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、鹵代烷基(例如，-CF3 、-CHF2 、-CH2 F、-CH2 F)、-OC1-5 烷基、-O-鹵代烷基(例如，-OCF3 、-OCHF2 、-OCH2 F、-OCH2 F)、-NH(C1-5 烷基)、-NHCO(C1-5 烷基)、-NHSO2 (C1-5 烷基)、-CONH(C1-5 烷基)或-SO2 NH(C1-5 烷基)。在某些實施方式中，Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
在化學式(II)的一些實施方式中，X2 和X3 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是不同的間臂部分。
在化學式(II)的某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R1 和R2 分別獨立地為H、Me或Et；並且Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
其它示例性雙官能接頭屬於以下式(II-A)或(II-B)：
Figure 02_image026
(II-A)； 其中Re 是氫或電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基。在某些實施方式中，Re 是氫或氟代。
Figure 02_image028
(II-B)
可以根據US20060293499A1中所述的程式製備這些提供可釋放鍵的試劑。
在另一個方面，本發明揭露涉及化學式(III)所示的雙官能可釋放接頭：
Figure 02_image030
(III) 或其立體異構體、互變異構體或它們的混合物，或者它們的同位素變體； 其中： R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rp 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團；和 FG4 是能夠與活性劑的氨基反應以形成醯胺鍵的官能團。
在化學式(III)的一些實施方式中，R1 、R2 和Rp 分別獨立地為C1-5 烷基、取代的C1-5 烷基、C2-6 烯基、取代的C2-6 烯基、C2 -6 炔基、取代的C2 -6 炔基、苯基或取代的苯基。在某些實施方式中，R1 和R2 分別獨立地為C1-5 烷基或取代的C1-5 烷基。
在化學式(III)的一些實施方式中，Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、鹵代烷基(例如，-CF3 、-CHF2 、-CH2 F、-CH2 F)、-OC1-5 烷基、-O-鹵代烷基(例如，-OCF3 、-OCHF2 、-OCH2 F、-OCH2 F)、-NH(C1-5 烷基)、-NHCO(C1-5 烷基)、-NHSO2 (C1-5 烷基)、-CONH(C1-5 烷基)或-SO2 NH(C1-5 烷基)。在某些實施方式中，Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
在化學式(III)的一些實施方式中，X2 和X3 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是不同的間臂部分。
在化學式(III)的某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R1 和R2 分別獨立地為H、Me或Et；並且Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
示例性的雙官能可釋放接頭屬於以下化學式(III-A)：
Figure 02_image032
(III-A)  。
在另一個方面，本發明揭露涉及化學式(IV)所示的雙官能可釋放接頭：
Figure 02_image034
(IV) 或其立體異構體、互變異構體或它們的混合物，或者它們的同位素變體； 其中： R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R3 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R4 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； c是0至4的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rd 是硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基或者取代的芳基或雜芳基； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵，如氨基甲酸酯鍵的官能團；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團。
在化學式(IV)的一些實施方式中，R1 、R2 、R3 和R4 分別獨立地為C1-5 烷基、取代的C1-5 烷基、C2-6 烯基、取代的C2-6 烯基、C2 -6 炔基、取代的C2 -6 炔基、苯基或取代的苯基。在某些實施方式中，R1 、R2 、R3 和R4 分別獨立地為C1-5 烷基或取代的C1-5 烷基。
在化學式(IV)的一些實施方式中，Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、鹵代烷基(例如，-CF3 、-CHF2 、-CH2 F、-CH2 F)、-OC1-5 烷基、-O-鹵代烷基(例如，-OCF3 、-OCHF2 、-OCH2 F、-OCH2 F)、-NH(C1-5 烷基)、-NHCO(C1-5 烷基)、-NHSO2 (C1-5 烷基)、-CONH(C1-5 烷基)或-SO2 NH(C1-5 烷基)。在某些實施方式中，Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
在化學式(IV)的一些實施方式中，Rd 是硝基、氰基、鹵素、-CONH(C1-5 烷基)或-CONH(苯基)、取代的-CONH(C1-5 烷基)或-CONH(苯基)、-SO2 NH(C1-5 烷基)或-SO2 NH(苯基)、取代的-SO2 NH(C1-5 烷基)或-SO2 NH(苯基)、-SO2 (C1-5 烷基)或-SO2 (苯基)、取代的-SO2 (C1-5 烷基)或-SO2 (苯基)、C1-5 烷氧基、取代的C1-5 烷氧基、C1-5 烷基或C3-6 環烷基、取代的C1-5 烷基或C­3-6 環烷基、苯基或5-至6-員雜芳基或取代的苯基或5-至6-員雜芳基。
在化學式(IV)的一些實施方式中，X2 和X3 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是不同的間臂部分。
使用可釋放接頭，如化學式(III)和化學式(IV)所示的，其優勢在於具備改善穩定性的潛力，其提供了持續藥物釋放並最終延長了治療效力。因此，本發明揭露所述的接頭提供了優於現有技術的那些的聚合物-蛋白治療劑的穩定性和儲存優勢。 [具有可釋放接頭的聚合試劑]
本發明還涉及可以衍生自具有可釋放接頭的聚合試劑的偶聯物。
在一些方面，本發明涉及化學式(V)所示的具有可釋放接頭的聚合試劑：
Figure 02_image036
(V) 或其立體異構體、互變異構體或它們的混合物，或者它們的同位素變體； 其中： POLY1 是第一水溶性聚合物； POLY2 是第二水溶性聚合物； X1 是第一間臂部分； X2 是第二間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R3 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R4 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1是0至3的整數； a2是0至3的整數； c是0至4的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rd 是硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基；和 FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵，如氨基甲酸酯鍵的官能團。
在一些實施方式中，R1 、R2 、R3 、R4 、Re1 、Re2 和Rd 如以上化學式(IV)中所定義。
在化學式(V)的一些實施方式中，Re1 和Re2 是相同的電子改變基團。在一些實施方式中，Re1 和Re2 是不同的電子改變基團。
在化學式(V)的一些實施方式中，POLY1 和POLY2 分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY1 和POLY2 是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY1 和POLY2 是不同的水溶性聚合物。
在化學式(V)的一些實施方式中，X1 和X2 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是不同的間臂部分。示例性的聚合試劑屬於以下化學式(V-A)：
Figure 02_image038
, (V-A) 其中n獨立地為4至1500的整數，例如，4、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500，包括它們之間的所有範圍和數值。
具有兩個可釋放鍵的其它聚合試劑涵蓋了以下化學式(VI)：
Figure 02_image040
(VI) 或其立體異構體、互變異構體或它們的混合物，或者它們的同位素變體； 其中： POLY1 是第一水溶性聚合物； POLY2 是第二水溶性聚合物； X1 是第一間臂部分； X2 是第二間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1是0-3的整數； a2是0-3的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rp 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；和 FG4 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵，如醯胺鍵的官能團。
在化學式(VI)的一些實施方式中，R1 、R2 和Rp 分別獨立地為C1-5 烷基、取代的C1-5 烷基、C2-6 烯基、取代的C2-6 烯基、C2 -6 炔基、取代的C2 -6 炔基、苯基或取代的苯基。在某些實施方式中，R1 、R2 、R3 和R4 分別獨立地為C1-5 烷基或取代的C1-5 烷基。
在化學式(VI)的一些實施方式中，Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CONH(C1-5 烷基)或-CONH(苯基)、取代的-CONH(C1-5 烷基)或-CONH(苯基)、-SO2 NH(C1-5 烷基)或-SO2 NH(苯基)、取代的-SO2 NH(C1-5 烷基)或-SO2 NH(苯基)、-SO2 (C1-5 烷基)或-SO2 (苯基)、取代的-SO2 (C1-5 烷基)或-SO2 (苯基)、C1-5 烷氧基、取代的C1-5 烷氧基、C1-5 烷基或C3-6 環烷基、取代的C1-5 烷基或C3-6 環烷基、苯基或5-至6-員雜芳基或取代的苯基或5-至6-員雜芳基。
在化學式(VI)的一些實施方式中，POLY1 和POLY2 分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY1 和POLY2 是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY1 和POLY2 是不同的水溶性聚合物。
在化學式(VI)的一些實施方式中，X1 和X2 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是不同的間臂部分。
示例性的聚合試劑屬於以下化學式(VI-A)：
Figure 02_image042
(VI-A) 其中n獨立地為4至1500的整數，例如，4、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500，包括它們之間的所有範圍和數值。 [蛋白-接頭偶聯物]
在一些實施方式中，本發明揭露提供了偶聯物，所述偶聯物包含與一個或多個接頭共價連接的蛋白的殘基，其中所述偶聯物包含根據化學式(XIX)的結構： 蛋白-(L)z (XIX) 或其立體異構體、位置異構體、互變異構體或它們的混合物，或它們的同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： z是1至25的整數； L是接頭；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
本文所述的偶聯物是來自方案(I)的步驟1合成的產物。在某些實施方式中，所述接頭是非可釋放接頭。在某些實施方式中，所述接頭是可釋放接頭。在一些實施方式中，所述可釋放接頭是本文所揭露的雙官能可釋放接頭(例如，化學式(I)、化學式(II)、化學式(III)或化學式(IV)所示的接頭)的衍生物。
在某些實施方式中，所述接頭共價連接至所述蛋白內的殘基的胺基。在某些實施方式中，所述殘基是賴氨酸。在某些實施方式中，提供了包含含有不同數目的連接至蛋白的接頭的偶聯物的混合物的組合物。
使用與蛋白綴合的提供雙官能可釋放鍵的試劑所形成的示例性偶聯物包括化學式(VII)所示的那些：
Figure 02_image044
(VII) 其中： X1 是第一間臂部分； X2 ，當存在時，是第二間臂部分； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； Re 是電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基； a是0至5的整數； b是0至3的整數； c是0至2的整數； z是1至25的整數； Y1 是O或S； Y2 是O或S； FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團； -NH-是所述蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R1 、R2 、和Re 如以上化學式(I)中所定義的。
在化學式(VII)的一些實施方式中，a是0至4的整數。在一些實施方式中，a是0至3的整數。在一些實施方式中，a是0至2的整數。在一些實施方式中，a是0。在一些實施方式中，a是1。在一些實施方式中，a是2。在一些實施方式中，a是3。在一些實施方式中，a是4。在一些實施方式中，a是5。
在化學式(VII)的一些實施方式中，b是0至2的整數。在一些實施方式中，b是0。在一些實施方式中，b是1。在一些實施方式中，b是2。在一些實施方式中，b是3。
在化學式(VII)的一些實施方式中，c是0或1。在一些實施方式中，c是0。在一些實施方式中，c是1。在一些實施方式中，c是2。
在化學式(VII)的一些實施方式中，z是1至20的整數。在一些實施方式中，z是1至15的整數。在一些實施方式中，z是1至10的整數。在一些實施方式中，z是1至8的整數。在一些實施方式中，z是1至5的整數。
常規技術人員將認識到本文所述的a、b、c和z的值和範圍可以以任何方式組合以提供本發明的偶聯物。例如，在一些實施方式中，a是0至2的整數，b是0或1，c是0或1，並且z是1至25的整數。在一些實施方式中，a是1，b是1，c是1，並且z是1至25的整數。在一些實施方式中，a是1，b是0，c是1，並且z是1至25的整數。在一些實施方式中，a是1，b是1，c是0，並且z是1至25的整數。在本發明中考慮了這些和多種其它組合。在一些實施方式中，X1 和X2 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是不同的間臂部分。
在化學式(VII)內，將具有更限定的結構的偶聯物考慮為化學式(VII-A)、(VII-B)、(VII-C)或(VII-D)：
Figure 02_image046
(VII-A)；
Figure 02_image048
(VII-B)；
Figure 02_image050
(VII-C)；或
Figure 02_image052
(VII-D)， 其中X1 是第一間臂部分；X2 是第二間臂部分；R1 、R2 、Re 、a、z、Y1 、Y2 、FG2 和蛋白如以上化學式(VII)中所定義。
在化學式(VII)、(VII-A)、(VII-B)、(VII-C)或(VII-D)的某些實施方式中，a是0至2的整數；R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；並且Re 為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
其它示例性偶聯物具有以下結構(VII-A1)：
Figure 02_image054
(VII-A1) 其中，Re 是電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基；z是1-25的整數；“-NH-”代表一種或多種接頭單獨連接至的蛋白質部分。在某些實施方式中，其中a是1至2的整數；並且Re 為4-F、4-Cl、4-CF3 、2,4-二氟或2-CF3 -4-F取代基。
其它示例性偶聯物具有以下結構：
Figure 02_image056
；
Figure 02_image058
；
Figure 02_image060
；或
Figure 02_image062
。
使用提供雙官能可釋放鍵的試劑所形成的其它示例性偶聯物包括以下化學式(VIII)所示的那些：
Figure 02_image064
(VIII) 其中： R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團； -NH-是蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R1 、R2 、Re1 和Re2 如以上化學式(VI)中所定義。
在化學式(VIII)的某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；並且Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
在化學式(VIII)內，具有更限定的結構的偶聯物為化學式(VIII-A)：
Figure 02_image066
(VIII-A)。
使用提供兩種可釋放鍵的試劑所形成的其它示例性偶聯物包括以下化學式(IX)所示的那些：
Figure 02_image068
(IX) 其中： R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rp 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團； -NH-是蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R1 、R2 、Rp 、Re1 和Re2 如以上化學式(VI)中所定義。
在化學式(IX)的某些實施方式中，其中a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；並且Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
在化學式(IX)內，具有更限定的結構的偶聯物如以下化學式(IX-A)所示：
Figure 02_image070
(IX-A)
使用提供兩種可釋放鍵的試劑所形成的其它示例性偶聯物包括以下化學式(X)所示：
Figure 02_image072
(X) 其中： R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R3 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R4 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； c是0至4的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rd 是硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； Y4 是O或S； FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團； -NH-是蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R1 、R2 、R3 、R4 、Rd 、Re1 和Re2 如以上化學式(IV)中所定義。
在本文所揭露的化學式的某些實施方式中，z是1至22，1至20，1至18，1至15，1至12，1至10，1至8，1至5或1至3的整數，其中z代表綴合至蛋白的可釋放接頭的數目。
蛋白-大分子偶聯物
在本發明的一個或多個實施方式中，提供了蛋白-大分子偶聯物，所述偶聯物包含蛋白、至少一種接頭和至少一種水溶性聚合物，其中所述蛋白通過接頭共價連接至每個水溶性聚合物，其中所述大分子是直鏈或支鏈水溶性聚合物。在某些實施方式中，所述至少一種接頭是兩種或更多種接頭。在某些實施方式中，所述兩種或更多種接頭包含至少一種非可釋放接頭。在某些實施方式中，所述兩種或更多種接頭包含至少一種可釋放接頭。在某些實施方式中，所述兩種或更多種接頭包含至少一種非可釋放接頭和一種可釋放接頭。在某些實施方式中，所述兩種或更多種接頭包含至少一種非可釋放接頭和1至8種可釋放接頭。
在某些實施方式中，所述至少一種接頭是非可釋放接頭。在某些實施方式中，所述至少一種接頭是可釋放接頭。在某些實施方式中，每個所述接頭是可釋放接頭。在某些實施方式中，一個或多個大分子通過一個或多個接頭共價連接至所述蛋白。在某些實施方式中，8個或更多個大分子通過8個或更多個接頭共價連接至所述蛋白。
在某些實施方式中，所述大分子通過接頭共價連接至所述蛋白內的殘基的胺基。在某些實施方式中，所述殘基是賴氨酸。在某些實施方式中，所述偶聯物是包含不同數目的連接至所述蛋白的大分子的偶聯物的混合物。
在多個實施方式中，所述大分子是水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。它可以包括任何以下化合物：包含約6至約26個碳原子的脂肪酸，選自下列的聚合物之一：2-甲丙烯醯-氧乙基磷醯膽鹼、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸脂)、聚(丙烯醯胺)、聚(N-丙烯醯嗎啉)、聚(烷氧基)聚合物、聚(醯胺)、聚(醯胺胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬醯胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚對苯二甲酸丁二醇酯、聚(己內酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯醯胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(磷酸三乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(a-羥酸)、聚(羥乙基丙烯酸脂)、聚(羥乙基噁唑啉)、聚(羥基甲基丙烯酸酯)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚(羥丙基噁唑啉)、聚(亞氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯醯胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有機磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚磷腈、聚(丙二醇)、聚(糖)、聚(矽氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲醚)、聚(乙烯吡硌烷酮)、矽酮、直鏈澱粉、纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、殼多糖、殼聚糖、葡聚糖、糊精、明膠、透明質酸(HA)和衍生物、官能化透明質酸、甘露聚糖、果膠、肝素、硫酸乙醯肝素(HS)、鼠李聚糖半乳糖醛酸、澱粉、羥烷基澱粉、羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸(PSA)及其它碳水化合物-基聚合物、木聚糖，以及白蛋白、轉鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白、免疫球蛋白、XTEN肽的共聚物、富甘氨酸高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、彈性蛋白-樣多肽(ELP)、CTP肽或明膠-樣蛋白(GLK)聚合物。
在某些實施方式中，所述大分子是水溶性聚合物。在某些實施方式中，所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。在某些實施方式中，用選自下列的封端部分對聚(乙二醇)封端：羥基、烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基。
對於所述水溶性聚合物，所述水溶性聚合物是無毒的、非天然存在的和生物相容的。對於生物相容性，如果通過臨床醫師，例如，醫師，的評價，與所述物質單獨或與另一種與生命組織有關的物質(例如，活性劑，如IL-2部分)一起的使用(例如，向患者施用)有關的有益作用大於任何有害作用，則認為該物質是生物相容的。對於非免疫原性，如果所述物質在預期體內的使用不產生不期望的免疫反應(例如，抗體的形成)，或者如果產生免疫反應，但如臨床醫師所評價的，不認為這種反應是臨床顯著的或重要的，則認為該物質是非免疫原性的。特別較佳地，非肽水溶性聚合物是生物相容的和非免疫原性的。
此外，所述聚合物的特徵通常在於具有2至約300個末端。這些聚合物的實例包括(但不限於)聚(烷撐二醇)，如聚乙二醇(“PEG”)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚乙烯吡咯烷酮、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(a-羥酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉(“POZ”)(其在WO 2008/106186中有描述)、聚(N-丙烯醯嗎啉)和任何上述的組合。
所述水溶性聚合物不局限於特定結構並且可以是直鏈的(例如，封端的，例如，烷氧基PEG或雙官能PEG)、支鏈或多臂的(例如，叉狀PEG或連接至多元醇芯的PEG)、樹枝狀(或星形)結構，其每個具有或不具有一個或多個可降解鍵。此外，可以以任意數目的不同的重複模式組織所述水溶性聚合物的內部結構並且所述內部結構可以選自均聚物、交替共聚物、無規共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、無規三聚體和嵌段三聚體。
活化的PEG及其它活化的水溶性聚合物(即聚合試劑)用適合於偶聯至所述蛋白上所期望的位點的適合的活化基團來活化。因此，聚合試劑將具有用於與蛋白質部分反應的反應基團。用於將這些聚合物偶聯至活性部分的代表性聚合試劑和方法在本領域中是已知的並且進一步描述於Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992) Zalipsky, S.等人, “Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides”和Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182中。適合於偶聯至蛋白質部分的示例性啟動基團包括羥基、馬來醯亞胺、酯、乙縮醛、縮酮、胺、羧基、醛、醛合水、酮、烯基酮、硫酮、硫醇、乙烯碸、肼等。
通常，所述偶聯物中的所述水溶性聚合物的重量平均分子量為約100道耳頓至約150,000道耳頓。然而，示例性範圍包括約500道耳頓至小於20,000道耳頓的範圍內，約20,000道耳頓至小於85,000道耳頓的範圍內，約85,000道耳頓至約100,000道耳頓的範圍內，大於5,000道耳頓至約100,000道耳頓的範圍內，約6,000道耳頓至約90,000道耳頓的範圍內，約10,000道耳頓至約85,000道耳頓的範圍內，大於10,000道耳頓至約85,000道耳頓的範圍內，約20,000道耳頓至約85,000道耳頓的範圍內，約53,000道耳頓至約85,000道耳頓的範圍內，約25,000道耳頓至約120,000道耳頓的範圍內，約29,000道耳頓至約120,000道耳頓的範圍內，約35,000道耳頓至約120,000道耳頓的範圍內和約40,000道耳頓至約120,000道耳頓的範圍內的重量平均分子量。對於任何給定水溶性聚合物，PEG的較佳分子量在這些範圍中的一個或多個中。
示例性的水溶性聚合物的重量平均分子量包括約100道耳頓，約200道耳頓，約300道耳頓，約400道耳頓，約500道耳頓，約600道耳頓，約700道耳頓，約750道耳頓，約800道耳頓，約900道耳頓，約1,000道耳頓，約1,500道耳頓，約2,000道耳頓，約2,200道耳頓，約2,500道耳頓，約3,000道耳頓，約4,000道耳頓，約4,400道耳頓，約4,500道耳頓，約5,000道耳頓，約5,500道耳頓，約6,000道耳頓，約7,000道耳頓，約7,500道耳頓，約8,000道耳頓，約9,000道耳頓，約10,000道耳頓，約11,000道耳頓，約12,000道耳頓，約13,000道耳頓，約14,000道耳頓，約15,000道耳頓，約16,000道耳頓，約18,000道耳頓，約20,000道耳頓，約22,500道耳頓，約25,000道耳頓，約30,000道耳頓，約35,000道耳頓，約40,000道耳頓，約45,000道耳頓，約50,000道耳頓，約55,000道耳頓，約60,000道耳頓，約65,000道耳頓，約70,000道耳頓和約75,000道耳頓。還可以使用具有任何上述總分子量的水溶性聚合物的支鏈形式(例如，由兩個20,000道耳頓聚合物組成的支鏈40,000道耳頓水溶性聚合物)。
當用作所述聚合物時，PEG通常將包含一定數目的(OCH2 CH2 )單體[或(CH2 CH2 O)單體，取決於如何定義PEG]。如在整個描述中所使用的，通過“(OCH2 CH2 )n ”中的下標“n”來表示重複單元的數目。因此，(n)值通常在以下範圍中的一個或多個內：2至約3400，約100至約2300，約100至約2270，約136至約2050，約225至約1930，約450至約1930，約1200至約1930，約568至約2727，約660至約2730，約795至約2730，約795至約2730，約909至約2730和約1,200至約1,900。對於其中分子量已知的任何給定聚合物，可以通過將所述聚合物的總重量平均分子量除以重複單體的分子量來確定重複單元的數目(即“n”)。
用於在本發明揭露中使用的一個特別較佳的聚合物是封端聚合物，即具有至少一個用相對惰性的基團，如低級C1-6 烷氧基(儘管還可以使用羥基)封端的末端的聚合物。當所述聚合物是PEG時，例如，較佳地使用甲氧基-PEG(通常稱為mPEG)，它是其中所述聚合物的一個末端為甲氧基(-OCH3 )，而另一個末端是羥基或可以任選地化學修飾的其它官能團的PEG的直鏈形式。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中有用的一種形式中，游離或結合的PEG是在每個末端用羥基封端的直鏈聚合物。 HO-CH2 CH2 O-(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 -OH， 其中(n)通常在0至約4,000的範圍內。
可以用簡明形式，如HO-PEG-OH表示上述聚合物，α-,ω-二羥基聚(乙二醇)，其中應理解-PEG-符號可以表示以下結構單元： -CH2 CH2 O-(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 -， 其中(n)如以上定義。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中有用的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-OH或mPEG-OH，簡要地，其中一個末端是相對惰性的甲氧基，而另一個末端是羥基。以下提供了mPEG-OH的結構。 CH3 O-CH2 CH2 O-(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 -OH 其中(n)如以上定義。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中有用的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-NH2 或mPEG-NH2 ，簡要地，其中一個末端是相對惰性的甲氧基，而另一個末端是氨基。以下提供了mPEG-NH2 的結構。 CH3 O-CH2 CH2 O-(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 -NH2 其中(n)如以上定義。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中有用的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-CO2 H或mPEG-CO2 H，簡要地，其中一個末端是相對惰性的甲氧基，而另一個末端是羧基。以下提供了mPEG-CO2 H的結構。 CH3 O-CH2 CH2 O-(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 -CO2 H 其中(n)如以上定義。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中有用的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-N3 或mPEG-N3 ，簡要地，其中一個末端是相對惰性的甲氧基，而另一個末端是疊氮基。以下提供了mPEG-N3 的結構。 CH3 O-CH2 CH2 O-(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 -N3 其中(n)如以上定義。
在本發明揭露的一個或多個實施方式中有用的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-DBCO或mPEG-DBCO，簡要地，其中一個末端是相對惰性的甲氧基，而另一個末端是二苯并環辛炔(DBCO)基團。以下提供了mPEG-DBCO的結構的一個實例。
Figure 02_image074
其中(n)如以上定義。
多臂或支鏈PEG分子，如美國專利No. 5,932,462中所述的那些也可以用作PEG聚合物。例如，PEG可以具有以下結構：
Figure 02_image076
其中： polya 和polyb 是PEG主鏈(相同或不同的)，如甲氧基聚(乙二醇)；R'是非反應性部分，如H、甲基或PEG主鏈；並且P和Q是非反應性鍵。
另外，PEG可以包含叉狀PEG。通過以下結構表示叉狀PEG的實例：
Figure 02_image078
其中：X是一個或多個原子的間臂部分並且每個Z是通過限定長度的原子鏈連接至CH的啟動的末端基團。國際專利申請案WO 99/45964揭露了能夠在本發明的一個或多個實施方式中使用的多種叉狀PEG結構。將Z官能團連接至支鏈碳原子的原子鏈用作連接基團，並且可以包括(例如)烷基鏈、醚鏈、酯鏈、醯胺鏈及其組合。
PEG聚合物可以包含具有沿PEG長度，而不是在PEG鏈末端共價連接的反應基團，如羧基, 的側基PEG分子。側基反應基團可以直接或通過間臂部分，如亞烷基基團連接至PEG。
作為聚合物骨架內的可降解鍵和/或作為與蛋白質部分連接的可降解鍵有用的一些水解可降解鍵包括：酯鍵、碳酸酯鍵；從(例如)胺和醛的反應獲得的亞胺鍵(參見，例如，Ouchi等人 (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3)；例如，通過醇與磷酸基的反應所形成的磷酸酯鍵；通常通過醯肼和醛的反應所形成的腙鍵；通常通過醛和醇之間的反應所形成的乙縮醛鍵；例如，通過甲酸酯和醇之間的反應所形成的原酸酯鍵；通過(例如)聚合物(如PEG)末端的胺基與另一個PEG鏈的羧基所形成的醯胺鍵；由(例如)具有末端異氰酸酯基的PEG和PEG醇的反應所形成的氨基甲酸酯鍵；通過(例如)聚合物(如PEG)末端的胺基和肽的羧基所形成的肽鍵；和通過(例如)位於(例如)聚合物末端的亞磷醯胺基與寡核苷酸的5'羥基所形成的寡核苷酸鍵。
通過施用偶聯物的這些任選的特徵，即一個或多個可降解鍵向聚合物鏈或向蛋白質部分的引入，可以對偶聯物最終所期望的藥理學性質提供額外的控制。例如，可以施用大且相對惰性的偶聯物(即，具有一個或多個與之連接的高分子量PEG鏈，例如，一個或多個分子量大於約10,000的PEG鏈，其中所述偶聯物基本上不具有生物活性)，以其釋放而產生具有部分原始PEG鏈的有生物活性的偶聯物。以這種方式，可以更有效地調節所述偶聯物的性質以平衡所述偶聯物隨時間的生物活性。
與偶聯物結合的水溶性聚合物可以是“可釋放的”。即，釋放水溶性聚合物(通過水解、酶促過程、催化過程或其它方法)，借此導致產生了非偶聯的蛋白質部分。在一些情況下，可釋放聚合物在體內與蛋白質部分分離，從而不會留下任何水溶性聚合物片段。在其它實例中，可釋放聚合物在體內與蛋白質部分分離，從而留下來自水溶性聚合物的相對小的片段(例如，琥珀酸酯標籤)。示例性的可切割聚合物包括通過氨基甲酸酯鍵連接至蛋白質部分的聚合物。
本領域那些技術人員將認識到以上有關水溶性聚合物的討論決不是窮舉的並且僅是說明性的，並且考慮了具有如上所述的品質的所有聚合物材料。如本文所使用的，術語“聚合試劑”一般地表示整個分子，其可以包含水溶性聚合物部分和官能團。
如上所述，本發明揭露的偶聯物可以包含共價連接至蛋白質部分的多個水溶性聚合物。在一些實施方式中，共價連接至蛋白質部分的多個水溶性聚合物是相同的。在一些實施方式中，共價連接至蛋白質部分的多個水溶性聚合物中的至少一個是不同的。通常，對於任何給定偶聯物，將存在共價連接至一個或多個具有蛋白活性的部分的一個或多個水溶性聚合物。在一些情況下，所述偶聯物可以具有單獨連接至蛋白質部分的1、2、3、4、5、6、7、8或更多個水溶性聚合物。可以將任何給定水溶性聚合物共價連接至蛋白質部分的氨基酸，或者當所述蛋白質部分是(例如)糖蛋白時，連接至所述蛋白質部分的碳水化合物。可以(例如)使用利用唾液酸-疊氮化物化學的代謝官能化[Luchansky等人 (2004) Biochemistry 43(38): 12358-123661]或其它適合的方法，如使用縮水甘油以有利於醛基的引入[Heldt等人 (2007) European Journal of Organic Chemistry 32:5429-5433]來實現與碳水化合物的連接。
所述蛋白質部分和所述聚合物內具體的鍵取決於一些因素。這些因素包括(例如)所使用的具體的鍵的化學、具體的蛋白質部分、所述蛋白質部分內可用的官能團(對於與接頭、聚合物的連接或向適合連接位點的轉化)、所述蛋白質部分內其它反應性官能團的存在等。
本發明揭露所述的偶聯物可以是前體藥物，這表示所述聚合物和所述蛋白質部分之間的鍵是可釋放的以允許母體部分的釋放。除了本發明揭露中所述的可釋放接頭之外，其它示例性可釋放鍵可以包括羧酸酯、磷酸酯、硫酯、酸酐、乙縮醛、縮酮、醯氧基烷基醚、亞胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。可以通過蛋白質部分(例如，蛋白的羧基C末端或者蛋白內所含的氨基酸，如絲氨酸或蘇氨酸的側鏈羥基，或者碳水化合物內的類似官能性)的適當修飾和/或使用本領域中常用的偶聯方法的聚合試劑來容易地製備這些鍵。然而，最佳的可釋放鍵是通過適當啟動的聚合物與蛋白質部分內所含的未修飾的官能團的反應所容易形成的可釋放鍵。
作為另外一種選擇，還可以將水解穩定的鍵，如醯胺、氨基甲酸酯(urethane)(也稱為氨基甲酸酯(carbamate))、胺、硫醚(thioether)(也稱為硫醚(sulfide))或脲(也稱為尿素)鍵用作用於偶聯蛋白質部分的鍵。較佳的水解穩定的鍵是醯胺。在一種方法中，具有啟動的酯的水溶性聚合物可以與蛋白質部分上的胺基反應，借此導致產生醯胺鍵。另一種較佳的水解穩定的鍵是硫醇橋。
所述偶聯物(與非偶聯的蛋白質部分相反)可以具有或可以不具有可測量程度的蛋白活性。也就是，根據本發明揭露的聚合物-蛋白偶聯物將具有約0.1%至約100%，包括約0.1%，約0.5%，約1%，約5%，約10%，約15%，約20%，約25%，約30%，約35%，約40%，約45%，約50%，約55%，約60%，約65%，約70%，約75%，約80%，約85%，約90%，約55%或約100%中任何數量的未修飾的母體蛋白質部分的生物活性。在一些情況下，所述聚合物-蛋白偶聯物可以具有大於100%的未修飾的母體蛋白質部分的生物活性。較佳地，幾乎不或不具有蛋白活性的偶聯物含有將聚合物連接至蛋白的可水解鍵，從而不考慮所述偶聯物中活性的缺乏(或相對缺乏)，通過所述可水解鍵的水解引起的切割釋放活性母體分子(或其衍生物)。基於具體蛋白的已知活性，可以使用適合的體內或體外模型確定這種活性。
對於具有將蛋白偶聯至聚合物的水解穩定的鍵的偶聯物，所述偶聯物通常將具有可測量程度的生物活性。例如，這些偶聯物的特徵通常在於相對於非綴合蛋白，具有滿足以下百分比中的一種或多種的生物活性：至少約2%，至少約5%，至少約10%，至少約15%，至少約25%，至少約30%，至少約40%，至少約50%，至少約60%，至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%，至少約100%和大於105%(當在適合的模型中測量時，如在本領域中熟知的那些)。較佳地，具有水解穩定的鍵(例如，醯胺鍵、硫醇橋)的偶聯物將具有至少一定程度的未修飾的母體蛋白的生物活性。
蛋白和水溶性聚合物之間通過接頭的連接可以是直接的，其中在所述接頭和所述聚合物之間不存在間隔原子，或者是間接的，其中在所述鍵和所述聚合物之間存在一個或多個原子。對於間接連接，“間臂部分”可以用作鍵的殘基和水溶性聚合物之間的接頭。構成間臂部分的一個或多個原子可以包括碳原子、氮原子、硫原子、氧原子中的一個或多個及其組合。間臂部分可以包含醯胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚、二硫基和/或點擊化學產物組。具體的間臂部分的非限制性實例包括選自下列中的那些：-O-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH2 -、-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -、O-CH2 -、-CH2 -O-、-O-CH2 -CH2 -、-CH2 -O-CH2 -、-CH2 -CH2 -O-、-O-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -O-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -O-CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -O-、-O-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -O-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -O-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -O-CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -O-、-C(O)-NH-CH2 -、-C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -C(O)-NH-CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-、-C(O)-O-CH2 -、-CH2 -C(O)-O-CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-O-CH2 -、-C(O)-O-CH2 -CH2 -、-NH-C(O)-CH2 -、-CH2 -NH-C(O)-CH2 -、-CH2 -CH2 -NH-C(O)-CH2 -、-NH-C(O)-CH2 -CH2 -、-CH2 -NH-C(O)-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -NH-C(O)-CH2 -CH2 -、-C(O)-NH-CH2 -、-C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-O-C(O)-NH-CH2 -、-O-C(O)-NH-CH2 -CH2 -、-NH-CH2 -、-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -NH-CH2 -、-CH2 -CH2 -NH-CH2 -、-C(O)-CH2 -、-C(O)-CH2 -CH2 -、-CH2 -C(O)-CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-CH2 -CH2 -、-CH2 -CH2 -C(O)-、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -NH-、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -NH-C(O)-、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -NH-C(O)-CH2 -、-CH2 -CH2 -CH2 -C(O)-NH-CH2 -CH2 -NH-C(O)-CH2 -CH2 -、-O-C(O)-NH-[CH2 ]l -(OCH2 CH2 )m -、二價環烷基、-O-、-S-、氨基酸、-N(R3 )-，以及任何上述基團中的兩種或更多種的組合，其中R3 是H或選自下列的有機基：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基，(l)是0至6，並且(m)是0至20。其它具體的間臂部分具有以下結構：-C(O)-NH-(CH2 )1-6 -NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH2 )1-6 -NH-C(O)-和-O-C(O)-NH-(CH2 )1-6 -NH-C(O)-，其中每個亞甲基後的下標值表示所述結構中所含的亞甲基的數目，例如，(CH2 )1-6 表示所述結構可以含有1、2、3、4、5或6個亞甲基。另外，任何上述間臂部分還可以包含含有1至20個環氧乙烷單體單元的環氧乙烷寡聚物鏈[即-(CH2 CH2 O)1-20 ]。也就是說，所述環氧乙烷寡聚物鏈可以出現在所述間臂部分之前或之後，並且任選地在由兩個或更多個原子組成的間臂部分的任何兩個原子之間。另外，如果所述寡聚物鄰近於聚合物部分，則寡聚物鏈將不會被認為是所述間臂部分的一部分，並且僅表示所述聚合物部分的擴展。
一般的蛋白-大分子偶聯物包含根據化學式(XX)的結構： 蛋白-(L-大分子)z (XX) 或其立體異構體、位置異構體、互變異構體或它們的混合物，或它們的同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： z是1至25的整數； L是接頭； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 大分子是水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
在一些實施方式中，接頭L是本發明揭露所述的接頭。在一些實施方式中，L是一種或多種非可釋放接頭和/或一種或多種可釋放接頭。在一些實施方式中，所述一種或多種可釋放接頭衍生自本發明揭露所述的雙官能可釋放接頭(例如，化學式(I)、化學式(II)、化學式(III)或化學式(IV)所示的接頭)和/或具有可釋放接頭的聚合試劑(例如，化學式(V)或化學式(VI))。
在一些實施方式中，z是1至20的整數。在一些實施方式中，z是1至15的整數。在一些實施方式中，z是1至10的整數。在一些實施方式中，z是1至8的整數。在一些實施方式中，z是1至5的整數。
在一些實施方式中，當z為2或以上時，連接至所述蛋白的每個L-大分子是相同的。在一些實施方式中，當z為2或以上時，連接至所述蛋白的至少一個L-大分子是不同的。在一些實施方式中，當z為2或以上時，連接至所述蛋白的每個L-大分子是不同的。
結構式XX所示的示例性蛋白-大分子偶聯物涵蓋了以下結構：
Figure 02_image080
其中： n為2至4000的整數； X是間臂部分； RL是可釋放接頭； z是1至25的整數； -NH-是所述蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，RL是本發明揭露所述的可釋放接頭。在一些實施方式中，所述可釋放接頭衍生自本文所揭露的雙官能可釋放接頭(例如，化學式(I)、化學式(II)、化學式(III)或化學式(IV)所示的接頭)和具有可釋放接頭的聚合試劑(例如，化學式(V)或化學式(VI))。
在另一個方面，化學式XX所示的示例性蛋白-大分子偶聯物涵蓋了以下結構：
Figure 02_image082
其中： n為2至4000的整數； X是間臂部分； RL1 是第一可釋放接頭； RL2 是第二可釋放接頭； z是1至25的整數； -NH-是所述蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。 本發明揭露的示例性偶聯物其中那些所述水溶性聚合物中具有支鏈結構的涵蓋了包括以下所述水溶性聚合物的結構：
Figure 02_image084
其中Y=O和NH；每個(n)獨立地為具有2至4000的值的整數，例如，2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000，包括它們之間的所有值和範圍。
本發明揭露的示例性偶聯物其中那些所述水溶性聚合物中具有支鏈結構的涵蓋了包括以下所述水溶性聚合物的結構：
Figure 02_image086
其中每個(n)獨立地為具有2至4000的值的整數，例如，2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000，包括它們之間的所有值和範圍。
使用可提供兩個釋放鍵的聚合試劑所形成的示例性蛋白-大分子偶聯物包括以下化學式(XI)所示的那些：
Figure 02_image088
(XI) 其中： POLY1 是第一水溶性聚合物； POLY2 是第二水溶性聚合物； X1 是第一間臂部分； X2 是第二間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； Y4 是O或S； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R3 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R4 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1是0至3的整數； a2是0至3的整數； c是0至4的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rd 是硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基； -NH-是所述蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R1 、R2 、R3 、R4 、Re1 、Re2 和Rd 如以上化學式(IV)中所定義。
在化學式(XI)的一些實施方式中，POLY1 和POLY2 分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY1 和POLY2 是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY1 和POLY2 是不同的水溶性聚合物。
在化學式(XI)的一些實施方式中，X1 和X2 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是不同的間臂部分。
示例性偶聯物具有以下結構(XI-A)：
Figure 02_image090
(XI-A) 其中n獨立地為4至1500的整數並且z是1至25的整數。
使用可提供兩個釋放鍵的聚合試劑所形成的其它示例性偶聯物包括以下化學式(XII)所示的那些：
Figure 02_image092
(XII) 其中： POLY1 是第一水溶性聚合物； POLY2 是第二水溶性聚合物； X1 是第一間臂部分； X2 是第二間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1是0-3的整數； a2是0-3的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rp 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R1 、R2 、Re1 、Re2 和Rp 如以上化學式(VI)中所定義。
在化學式(XII)的一些實施方式中，POLY1 和POLY2 分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY1 和POLY2 是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY1 和POLY2 是不同的水溶性聚合物。
在化學式(XII)的一些實施方式中，X1 和X2 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是不同的間臂部分。
示例性偶聯物具有以下結構(XII-A)：
Figure 02_image094
(XII-A) 其中n獨立地為4至1500的整數並且z是1至25的整數。
使用適合的聚合試劑通過點擊化學所形成的示例性偶聯物包括以下化學式(XIII)所示的那些：
Figure 02_image096
(XIII) 其中： POLY1 是第一直鏈或支鏈水溶性聚合物； POLY2 是第二直鏈或支鏈水溶性聚合物； X1 是第一間臂部分；或-X-FG2 ； X2 ，當存在時，是第二間臂部分； T1 是第一三唑官能團； T2 是第二三唑官能團； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； Re 是電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基；和-X-FG2 ； 其中： X是間臂部分；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團。 a是0至5的整數； b是0至3的整數； c是0至2的整數； z是1至25的整數； Y1 是O或S； Y2 是O或S；和 -NH-是蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R1 、R2 、Re 、a、b、c和z如以上化學式(I)中所定義的。
在化學式(XIII)的一些實施方式中，POLY1 和POLY2 分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY1 和POLY2 是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY1 和POLY2 是不同的水溶性聚合物。
在化學式(XIII)的一些實施方式中，X1 和X2 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X1 和X2 是不同的間臂部分。
在化學式(XIII)內，具有更限定的結構的偶聯物可考慮為化學式(XIII-A)、(XIII-B)、(XIII-C)或(XIII-D)：
Figure 02_image098
(XIII-A)；
Figure 02_image100
(XIII-B)；
Figure 02_image102
(XIII-C)；或
Figure 02_image104
(XIII-D) 其中每個X1 是第一間臂部分；X2 是第二間臂部分；POLY1 、POLY2 、T1 、T2 、R1 、R2 、Re 、a、z、Y1 、Y2 和蛋白如以上所定義。
在化學式(XIII)、(XIII-A)、(XIII-B)、(XIII-C)或(XIII-D)的某些實施方式中，a是0至2的整數；R1 和R2 分別獨立地為氫，Me或Et；並且Re 為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
進一步的示例性偶聯物具有以下結構(XIII-A1)：
Figure 02_image106
(XIII-A1) 其中，Re 是電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基；n獨立地為4至1500的整數；z是1至25的整數；並且“-NH-”是所述蛋白內的殘基的胺基並且表示所述蛋白單獨連接一個或多個聚合物。在某些實施方式中，a是1至2的整數；Re 是4-F、4-Cl、4-CF3 、2,4-二氟代或2-CF3 -4-F取代基。
其它示例性偶聯物具有以下作為(XIII-B1)、(XIII-C1)、(XIII-D1)或(XIII-D2)的結構：
Figure 02_image108
(XIII-B1)；
Figure 02_image110
(XIII-C1)；
Figure 02_image112
(XIII-D1)；或
Figure 02_image114
(XIII-D2) 其中： n獨立地為4至1500的整數； z是1至25的整數；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
通過點擊化學，使用適合的聚合試劑所形成的其它示例性偶聯物包括以下化學式(XIV)所示的那些：
Figure 02_image116
(XIV) 其中： POLY2 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； POLY3 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團；或-X-FG2 ； 其中 X是間臂部分；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團。 X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； T2 是三唑官能團； T3 是三唑官能團； Y1 是O或S； Y2 是O或S；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R1 、R2 、Re1 和Re2 如以上化學式(VI)中所定義。
在化學式(XIV)的一些實施方式中，POLY2 和POLY3 分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY2 和POLY3 是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY2 和POLY3 是不同的水溶性聚合物。
在化學式(XIV)的一些實施方式中，X2 和X3 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是不同的間臂部分。
在化學式(XIV)的某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；並且Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
在化學式(XIV)內，將具有更限定的結構的偶聯物考慮為化學式(XIV-A)：
Figure 02_image118
(XIV-A) 其中n獨立地為4至1500的整數；z是1至25的整數；並且-NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
通過點擊化學，使用適合的聚合試劑所形成的其它示例性偶聯物包括以下化學式(XV)所示的那些：
Figure 02_image120
(XV) 其中： POLY2 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； POLY3 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團；或-X-FG2 ； 其中 X是間臂部分；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團。 Rp 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； T2 是三唑官能團； T3 是三唑官能團； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R1 、R2 、Rp 、Re1 和Re2 如以上化學式(VI)中所定義。
在化學式(XV)的一些實施方式中，POLY2 和POLY3 分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY2 和POLY3 是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY2 和POLY3 是不同的水溶性聚合物。
在化學式(XV)的一些實施方式中，X2 和X3 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是不同的間臂部分。
在化學式(XV)的某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；並且Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
在化學式(XV)內，具有更限定的結構的偶聯物如以下化學式(XV-A)所示：
Figure 02_image122
(XV-A) 其中n獨立地為4至1500的整數；z是1至25的整數，並且-NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
通過點擊化學，使用適合的聚合試劑所形成的其它示例性偶聯物包括以下化學式(XVI)所示的那些：
Figure 02_image124
(XVI) 其中： POLY2 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； POLY3 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R3 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R4 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； c是0至4的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團；或-X-FG2 ； 其中 X是間臂部分；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括(但不限於)疊氮化物、炔基和環炔基(例如，二苯并環辛炔(DBCO))基團。 Rd 是硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； T2 是三唑官能團； T3 是三唑官能團； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； Y4 是O或S；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R1 、R2 、R3 、R4 、Rd 、Re1 和Re2 如以上化學式(IV)中所定義。
在化學式(XVI)的一些實施方式中，POLY2 和POLY3 分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY2 和POLY3 是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY2 和POLY3 是不同的水溶性聚合物。
在化學式(XVI)的一些實施方式中，X2 和X3 分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X2 和X3 是不同的間臂部分。在一些實施方式中，所述蛋白是細胞因子。所述細胞因子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α或TNF-β。在某些實施方式中，所述細胞因子是IL-2。在某些實施方式中，所述IL-2包含與SEQ ID NO:1約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
在一些實施方式中，所述蛋白是趨化因子。所述趨化因子包括MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309(CCL1)、BCA1(CXCL13)、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸細胞活化趨化因子-1、嗜酸細胞活化趨化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC(CCL20)、ELC(CCL19)、SLC(CCL21)、ENA-78、PBP、TECK(CCL25)、CTACK(CCL27)、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
在一些實施方式中，所述蛋白是抗體。所述抗體可以靶向以下中的一種或多種：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受體樣激酶1、澱粉狀蛋白A蛋白、β-澱粉狀蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125(模擬)、C5、CA-125、CCL11(嗜酸細胞活化趨化因子-1)、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C242抗原、CD276、CD278、CD319、艱難梭菌(clostridium difficile )、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、達比加群(Dabigatran)、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、內皮糖蛋白(Endoglin)、上皮唾蛋白(episialin)、EPHA3、c-Met、FGFR2、纖維蛋白IIβ鏈、FGF 23、葉酸受體1、GMCSF、GD2神經節糖苷、GDF-8、GCGR、明膠酶B、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受體α-鏈、激肽釋放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受體、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6 R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干擾素α/β受體、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、乙型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-選擇素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、間皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、連接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂醯絲氨酸、RANKL、RTN4、獼猴因子、ROR1、SLAMF7、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )α毒素、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )雙組分殺白細胞素、SOST、選擇素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受體、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
在一些實施方式中，所述蛋白是治療性肽。肽包括(但不限於)：高血糖素樣肽1(GLP-1)、艾塞那肽-2、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、心房利鈉因子(ANF)、胃饑餓素、加壓素、生長激素、生長激素-釋放激素(GHRH)、RC-3095、生長抑素、鈴蟾肽、PCK-3145、Phe-His-Ser-Cys-Asn(PHSCN)、IGFl、B-型利尿鈉肽、肽YY(PYY)、干擾素、血小板反應蛋白、血管生成素、降鈣素、促性腺激素釋放激素、水蛭素、高血糖素、抗-TNF-α、成纖維細胞生長因子、粒細胞集落刺激因子、奧尼匹肽、垂體甲狀腺激素(PTH)、亮脯利特、舍莫瑞林、pramorelin、奈西立肽、羅替加肽、西侖吉肽、MBP-8298、AL-108、恩夫韋地、胸腺法新、daptamycin、HLFI-II、乳鐵傳遞蛋白、地米肽、谷胱甘肽、T細胞表位PR1、蛋白酶-3肽1-11、B細胞表位P3、促黃體激素-釋放激素(LHRH)、P物質、神經激肽A、神經激肽B、CCK-8、腦啡肽，包括亮氨酸腦啡肽和蛋氨酸腦啡肽、皮抑菌肽、[des-Ala20, Gln34]-皮抑菌肽、表面活性劑-相關抗微生物陰離子肽、蜜蜂抗菌肽IA；蜜蜂抗菌肽IB；OV-2；1025，乙醯基-黏附素肽(1025-1044)醯胺；Theroma-cin(49-63)；培西加南(MSI-78)；吲哚青黴素；愛帕琳肽-15(63-77)；CFPlO(71-85)；炭疽相關的致死因子(LF)抑制劑；牛抗菌肽；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑2；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑3；肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑4；NS4A-NS4B丙型肝炎病毒(NS3蛋白酶抑制劑I)；HIV-1、HIV-2蛋白酶底物；抗-FM肽；Bak-BH3；Bax BH3肽(55-74)(野生型)；Bid BH3-r8；CTT(明膠酶抑制劑)；E75(Her-2/neu)(369-377)；GRP78結合嵌合肽基序；p53(17-26)；EGFR2/KDR拮抗劑；Colivelin AGA-(C8R) HNGl 7(人體肽衍生物)；活性-依賴性神經營養性因子(ADNF)；β-分泌酶抑制劑1；β-分泌酶抑制劑2；ch[β]-澱粉狀蛋白(30-16)；Humanun(HN)sHNG、[Glyl4]-HN、[Glyl 4]-人體肽；血管緊張素轉化酶抑制劑(BPP)；腎素抑制劑III；膜聯蛋白I(ANXA-I；Ac2-12)；抗炎肽I；抗炎肽2；抗炎愛帕琳肽12；[D-Phel2, Leul4]-鈴蟾肽；黑腹果蠅觸足肽(酸)(穿透肽)；黑腹果蠅觸足前導肽(CT)；肥碩脫粒肽；硫酸酯化的[Thr28, Nle31]-縮膽囊肽(25-33)；痛敏肽(1-13)(醯胺)；纖維蛋白溶解抑制因子；Γ-纖維蛋白原(377-395)；類爪蟾肽；肥胖抑制素(人)；[Hisl, Lys6]-GHRP(GHRP-6)；[Ala5,[β]-Ala8]-神經激肽A(4-10)；神經調節肽B；神經調節肽C；神經調節肽N；活性-依賴性神經營養性因子(ADNF-14)；Acetalin I(阿片樣物質受體拮抗劑1)；Acetalin 2(阿片樣物質受體拮抗劑2)；Acetalin 3(阿片樣物質受體拮抗劑3)；ACTH(1-39)(人)；ACTH(7-38)(人)；蛙皮降壓肽；脂動激素(東亞飛蝗(Locusta Migratoria ))；十八烷基化的ADP-核糖基化因子6、myr-ARF6(2-13)；PAMP(1-20)(腎上腺髓質素前體(1-20)人)；AGRP(25-51)；胰澱素(8-37)(人)；血管緊張素I(人)；血管緊張素II(人)；Apstatin(氨肽酶P抑制劑)；沼水蛙抗菌肽-I；蛙皮素I；RL-37；LL-37(抗微生物肽)(人)；天蠶抗菌肽A；抗氧化肽A；抗氧化肽B；L-肌肽；BcI 9-2；NPVF；神經肽AF(hNPAF)(人)；Bax BH3肽(55-74)；bFGF抑制肽；bFGF抑制肽II；血管舒緩激肽；[Des-Argl OJ-HOE 140；半胱天冬氨酸酶I抑制劑II；半胱天冬氨酸酶I抑制劑VIII；Smac N7蛋白(MEKl衍生肽抑制劑I；hBD-1([β]-防禦素-1)(人)；hBD-3([β]-防禦素-3)(人)；hBD-4([β]-防禦素-4)(人)；HNP-I(防禦素人嗜中性白細胞肽I)；HNP-2(防禦素人嗜中性白細胞肽-2強啡肽A(1-17))；內嗎啡肽-I；[β]-內啡肽(人、豬)；內皮素2(人)；纖維蛋白原結合抑制肽；環(-GRGDSP)；TP508(凝血酶-衍生肽)；甘丙肽(人)；GIP(人)；促胃液素釋放肽(人)；促胃液素-1(人)；胃饑餓素(人)；PDGF-BB肽；[D-Lys3]-GHRP-6；HCV核心蛋白(1-20)；a3Bl整合素肽片段(325)(醯胺)；層黏連蛋白五肽(醯胺)Mel-anotropin-強化因子(MPF)；VA-[β]-MSH、促脂素-Y(阿黑皮素原-衍生的)；心房鈉尿肽(1-28)(人)；血管鈉肽(1-27)；[Ala5, B-Ala8]-神經激肽A(4-10)；神經調節肽L(NKA)；Ac-(Leu28, 31)-神經肽Y(24-26)；阿利特辛；腦神經肽II；[D-tyrll]-神經降壓素；IKKy NEMO結合域(NBD)抑制肽；PTD-p50(NLS)抑制肽；食欲肽A(牛、人、小鼠、大鼠)；食欲肽B(人)；水通道蛋白-2(254-267)(人胰抑素)(37-52)；胰多肽(人)；神經肽；肽YY(3-36)(人)；羥甲基-植物螯合肽2；PACAP(1-27)(醯胺，人、牛、大鼠)；促乳激素釋放肽(1-31)(人)；salusin-α；salusin-β；鞘脂活化蛋白C22；胰泌素(人)；L-選擇素；Endokinin A/B；Endokinin C(人)；Endokinin D(人)；凝血酶受體(42-48)激動劑(人)；LSKL(血小板反應蛋白的抑制劑)；促甲狀腺素釋放激素(TRH)；P55-TNFR片段；尿緊張素II(人)；VIP(人、豬、大鼠)；VIP拮抗劑；毒蜥素；艾塞那肽；ZPlO(AVEOOIOO)；普蘭林肽；AC162352(PYY)(3-36)；PYY；奧尼匹肽；高血糖素；GRP；胃饑餓素(GHRP6)；亮脯利特；組氨瑞林；縮宮素；阿托西班(RWJ22164)；舍莫瑞林；奈西立肽；比伐盧定(水蛭肽)；艾替班特；Aviptadin；羅替加肽(ZP123、GAP486)；西侖吉肽(EMD-121924、RGD肽)；AlbuBNP；BN-054；血管緊張素II；MBP-8298；肽亮氨酸精氨酸；齊考諾肽；AL-208；AL-108；Carbeticon；三肽；SAL；Coliven；人體肽；ADNF-14；VIP(血管活性腸肽)；胸腺法新；桿菌肽；短桿菌肽；培西加南(MSI-78)；Pl 13；PAC-113；SCV-07；HLFl-Il(乳鐵傳遞蛋白)；DAPTA；TRI-1144；Tritrpticin；抗炎素2；Gattex(替度魯肽，ALX-0600)；Stimuvax(L-BLP25)；Chrysalin(TP508)；Melanonan II；Spantide II；藍肽；辛卡利特；五肽胃泌素；胰泌素；內皮抑素肽；E-選擇素；HER2；IL-6；IL-8；IL-10；PDGF；血小板反應蛋白；uPA (I)；uPA (2)；VEGF；VEGF (2)；五肽-3；XXLRR；β-澱粉狀蛋白原纖維形成；內嗎啡肽-2；TIP 39(結節漏斗部神經肽)；PACAP(1-38)(醯胺，人、牛、大鼠)；TGFB啟動肽；胰島素敏化因子(ISF402)；轉化生長因子BI肽(TGF-B1)；雨蛙素釋放因子；IELLQAR(8-branchMAPS)；替加泊肽PK3145；戈舍瑞林；阿巴瑞克；西曲瑞克；加尼瑞克；地加瑞克(曲普瑞林)；巴蘆西班(FE 200440)；促生長激素釋放肽；奧曲肽；依替巴肽；Netamiftide(INN-00835)；Daptamycin；Spantide II；地米肽(RDP-58)；AL-209；恩夫韋地；IDR-I；六勝肽-6；胰島素-A鏈；蘭瑞肽；六[ρ]肽-3；胰島素B-鏈；甘精胰島素-A鏈；甘精胰島素-B鏈；胰島素-賴脯人胰島素B-鏈類似物；胰島素-天冬胰島素B-鏈類似物；胰島素-賴穀胰島素B鏈類似物；胰島素-地特胰島素B鏈類似物；生長抑素腫瘤抑制類似物；胰抑素(37-52)；血管活性腸肽片段(KKYL-NH2 )；和強啡肽A。適合於在本發明揭露中使用的蛋白的實例包括(但不限於)：免疫毒素SSlP、腺苷脫氨酶、精氨酸酶等。 [IL-2-大分子偶聯物]
轉向本發明的一個或多個實施方式，提供了更具體的蛋白質-大分子偶聯物，所述偶聯物包含通過接頭共價連接至水溶性聚合物的IL-2部分殘基。本發明的偶聯物將具有以下特徵中的一種或多種。 [IL-2部分]
如上所述，所述偶聯物通常包含通過可釋放或非可釋放接頭共價連接至一個或多個水溶性聚合物的IL-2部分殘基。如本文所使用的，術語“IL-2部分”應表示偶聯前的IL-2部分以及連接至水溶性聚合物之後的IL-2部分。然而，將理解當原始IL-2部分連接至水溶性聚合物時，IL-2部分由於與和所述聚合物的連接有關的一個或多個共價鍵的存在而輕微改變。通常，連接至另一種分子的IL-2部分的這種輕微改變形式被稱為IL-2部分的“殘基”。
所述IL-2部分可以來源於非重組方法和重組方法，並且本發明揭露就此不受限制。另外，IL-2部分可以來源於人來源、動物來源和植物來源。
非重組和重組方法獲得的任何IL-2部分可以在製備本文所述的偶聯物中用作IL-2部分。
基於用於表達具有IL-2活性的蛋白的系統，IL-2部分可以是未糖基化的或糖基化的並且可以使用任一種。即IL-2部分可以是未糖基化的或IL-2部分可以是糖基化的。在本發明揭露的一個或多個實施方式中，IL-2部分是未糖基化的。
IL-2部分可以被有利地修改，來包括和/或替換一個或多個氨基酸殘基，(例如)賴氨酸、半胱氨酸、組氨酸和/或精氨酸，從而使聚合物與氨基酸側鏈內原子之間更容易連接。在美國專利No. 5,206,344中描述了IL-2部分的替換實例。另外，可以修飾IL-2部分以包括非天然存在的氨基酸殘基。在WO 2019/028419中描述了有非天然存在的氨基酸殘基取代的IL-2部分的實例。用於添加氨基酸殘基和非天然存在的氨基酸殘基的技術對於本領域那些技術人員是熟知的。參考J. March, Advanced Organic IL-2mistry: Reactions Mechanisms and Structure, 第4版. (New York: Wiley-Interscience, 1992)。
另外，官能團的連接也可以有利地修飾IL-2部分(除通過含有官能團的氨基酸殘基的添加外)。例如，可以修飾IL-2部分以包括硫醇基團。另外，可以修飾IL-2部分以包括N末端α碳。另外，可以修飾IL-2部分以包括一個或多個碳水化合物部分。另外，可以修飾IL-2部分以包括醛基。另外，可以修飾IL-2部分以包括酮基。在本發明的某些實施方式中，較佳地IL-2部分是未被一個或多個包括硫醇基團、N末端α碳、碳水化合物、醛基和酮基修飾的。
在文獻 和(例如)美國專利No. 5,116,943、5,153,310、5,635,597、7,101,965和7,567,215以及美國專利申請公開案No. 2010/0036097和2004/0175337中描述了示例性IL-2部分。較佳的IL-2部分具有對應於圖1的氨基酸序列。
在一些情況下，IL-2部分可以處於“單體”形式，其中，相應肽的單一表達被組織成單獨的單元。在其它情況下，IL-2部分可以處於“二聚體”的形式(例如，重組IL-2的二聚體)，其中所述蛋白的兩個單體彼此結合(例如，通過二硫鍵)。例如，在重組人IL-2二聚體的背景中，所述二聚體可以處於通過由每個單體的Cys 125殘基所形成的二硫鍵彼此結合的兩個單體的形式。
另外，IL-2的前體形式可以用作IL-2部分。任何上述序列的截短形式、雜交變體和肽模擬物也可以用作IL-2部分。維持至少一些IL-2活性的任何上述形式的生物活性片段、缺失變體、替換變體或添加變體也可以用作IL-2部分。
對於任何給定肽或蛋白質部分，是可能確定該部分是否具有IL-2活性的。在本領域中描述了用於確定體外IL-2活性的多種方法。示例性方法是以下實驗中所述的CTLL-2細胞增殖測定。在Moreau等人 (1995) Mol. Immunol. 32:1047-1056)中描述了示例性方法。本領域中已知的其它方法也可以用於評價IL-2功能，包括量電法、分光光度法、色譜法和放射性測量法。
現在，將描述根據本發明的更具體的示例性偶聯物。通常，預期該IL-2部分(至少部分)具有與圖1中所提供的序列類似的氨基酸序列。因此，儘管參考了圖1序列內的具體位置或原子，但是該參考僅是為了方便並且本領域常規技術人員將能夠容易地確定具有IL-2活性的其它部分中的相應位置或原子。具體地，本文對於天然人IL-2所提供的描述通常適用於任何上述的片段、缺失變體、替換變體或添加變體。 [偶聯物組裝]
IL-2部分上的氨基提供了IL-2部分和水溶性聚合物之間的連結點。使用圖1中所提供的氨基酸序列，顯然存在幾個賴氨酸殘基，在每個賴氨酸殘基中具有可以對於偶聯可用的ε-氨基酸。此外，任何蛋白的N末端胺也可以用作連結點。
有一些適合的試劑，能夠用於與IL-2部分的可用的胺形成共價可釋放鍵。在下表1中提供了與相應偶聯物一起的非限制性具體實例。在表中，變數“n”代表重複單體單元的數目，z是1至25的整數，並且“-NH-IL-2”代表綴合至聚合物試劑或接頭的IL-2部分的殘基，並且形成單獨連接至一個或多個水溶性聚合物或者連接至一個或多個接頭後的IL-2部分。儘管表1所提供的每個聚合物部分[例如，(OCH2 CH2 )n 或(CH2 CH2 O)n ]的末端為“CH3 ”基，但是也可以替換成其它基團(如H和苄基)。 [表1] [胺-選擇性偶聯劑的實例和由此所形成的IL-2部分偶聯物]
偶聯劑 相應偶聯物
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可以通過多種技術實現試劑與IL-2部分的氨基的偶聯。在一個方法中，IL-2部分可以偶聯至通過琥珀醯亞胺基衍生物(或其它啟動的酯基，其中可以使用與對於這些替代的含有啟動的酯基的試劑所述的那些類似的方法)官能化的偶聯劑。在該方法中，具有琥珀醯亞胺基衍生物的試劑可以在pH 7至9.0的水媒介中連接至IL-2部分，儘管使用不同的反應條件(例如，更低的pH，如6至7或者不同溫度和/或小於15℃的溫度)可以導致試劑連接至IL-2部分的不同位置。
由於在IL-2上存在多個氨基位點，因此可以使用過量當量的試劑實現所揭露的偶聯劑對IL-2部分的不止一個的官能化。與IL-2部分的多個氨基的綴合需要非常高當量的聚合物試劑(例如，100eq)。雙官能接頭試劑的使用可以更有效地實現IL-2部分的高官能化。
通常，雙官能接頭試劑可以具有琥珀醯亞胺基衍生物和適合於點擊化學的反應基團。雙官能試劑與IL-2部分的氨基通過NHS偶聯的綴合可以實現IL-2部分的多個官能化。隨後，使用與適合的聚合物試劑的點擊化學反應可以提供高聚合衍生化的IL-2。下表2提供了一些非限制性具體實例與相應偶聯物。在下表中，變數(n)表示重複單體單元的數目，z是1至25的整數，並且“-NH-IL-2”代表具有單獨連接的一個或多個水溶性聚合物的IL-2部分。儘管表2所提供的每個聚合物部分[例如，(OCH2 CH2 )n 或(CH2 CH2 O)n ]的末端為“CH3 ”基，但是可以替換其它基團(如H和苄基)。 [表2] [IL-2接頭偶聯物和由此所形成的IL-2聚合物偶聯物]
IL-2接頭偶聯物 相應聚合物偶聯物
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點擊化學可用於位點特定的PEG化。通過將含有疊氮化物的非天然氨基酸，即高疊氮基丙氨酸加入重組蛋白，經過與炔烴-PEG分子進行位點特定的偶聯來實現位點特定的PEG化。
Cu-催化的點擊反應的一個主要缺點在於需要高毒性的銅(I)以及Cu(II)。甚至少量的銅可以損害蛋白， 特別是螢光蛋白，如GFP。另外，可能需要還原劑、配體和無氧條件的存在。
一種可以達到與Cu-催化的點擊反應類似的效率，同時維持蛋白存活力來實現位點特定的PEG化的方法是環辛炔的引入，其中八員環中的張力使得能夠在不存在催化劑的情況下，在4℃或在室溫下與疊氮化物發生反應。二苄基環辛炔(所謂的DBCO)屬於這類反應性環辛炔。
DBCO-PEG分子使得能夠在溫和反應條件下進行與含有疊氮化物的蛋白的無Cu -PEG化。相應的，由於點擊化學的固有選擇性，PEG分子與疊氮化物殘基的共價連接是高效且高度位點特定的。
使用點擊-PEG化將多個疊氮化物官能化的IL-2(IL-2-接頭偶聯物)以高效率轉化成多個PEG化的偶聯物(IL-2-聚合物偶聯物)。當疊氮化物和非對稱的1,2-二取代的炔烴，如DBCO，之間發生點擊反應時，本領域技術人員將理解作為產物可以獲得兩種位置異構化合物。位置異構體的差異在於所形成的C-N鍵的位置。
IL-2部分內所含的硫醇基團可以用作水溶性聚合物的有效連接位點。在IL-2部分記憶體在一個溶劑可接近的二硫化物。通常，它有助於蛋白的穩定性而不是其結構或其功能。如Bioconjugate Chem. 2007, 18, 61-76中所報導的，溫和還原可接近的天然二硫鍵之後所釋放的半胱氨酸硫醇可以用與雙(硫醇)-特異性試劑PEG化。這導致兩個半胱氨酸硫醇通過PEG的橋連。
根據本發明揭露，使用硫醇橋PEG化的代表性偶聯物可以包括以下化學式(XVII)：
Figure 02_image180
(XVII) 或其立體異構體、互變異構體或它們的混合物、其位置異構體或混合物，或它們的同位素變體；或其藥物可用的鹽，溶劑化物，水合物或前體藥物； 其中X為間臂部分，POLY為直鏈或支鏈水溶性聚合物，並且“-S-”為IL-2部分內的殘基的硫基。在某些實施方式中，所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
在本文中和其它處所述的那些聚合試劑，可以購自商業來源或從可商購的起始材料製備。另外，文獻中描述了用於製備聚合試劑的方法。 [點擊化學]
在偶聯物的某些實施方式中，本文所揭露的接頭和化學式包含能夠通過點擊化學反應的官能團。如本文所使用的，點擊化學是指疊氮化物和炔烴之間形成1,2,3-三唑的1,3-偶極環化加成或[3+2]環化加成。術語“1,3-偶極環化加成”和“[3+2]環化加成”還涵蓋了疊氮化物和環辛炔之間的“無銅”1,3-偶極環化加成。
因此，除非另有說明，否則在本文中對任何三唑化合物的描述意味著包括化合物的位置異構體及其混合物。
例如，疊氮化物和炔烴的[3+2]環化加成可以產生如下所示的兩種位置異構的三唑：
Figure 02_image182
在某些實施方式中，所述炔烴是應變的環炔基或雜環炔基，並且可以在存在或不存在催化劑的情況下實施所述環化加成反應。在某些實施方式中，例如，可以通過被稱為應變-促進的疊氮化物-炔烴環化加成(Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition，SPAAC)的反應自發發生所述環化加成反應，這在本領域中作為“無金屬點擊化學”所已知的。在某些實施方式中，應變的環炔基或雜環炔基如本文所述。
可以在本文所述的方法中使用這些無催化劑的[3+2]環化加成以形成本發明揭露的偶聯物。可以通過環應變，如(僅通過舉例)將吸電子基團附加至這些炔烴環的8員環狀結構啟動炔烴，或者可以通過添加路易士酸，如Au(l)或Au(lll)啟動炔烴。通過環應變啟動的炔烴已經被描述了。例如，Agard等人, J. Am. Chem. Soc, 2004, 126 (46):15046-15047所述的環辛炔和二氟環辛炔，Boon等人, WO2009/067663 A1 (2009)所述的二苯并環辛炔和Debets等人, Chem. Comm., 2010, 46:97-99所述的氮雜-二苯并環辛炔。
在某些實施方式中，如本文所述，可以通過將包含炔烴基團的官能化大分子與包含疊氮基的官能化蛋白反應以形成偶聯物來獲得本發明揭露的偶聯物。在其它實施方式中，官能化蛋白可以具有啟動的炔烴部分，並且官能化大分子具有疊氮化物部分。
在某些實施方式中，所述官能化大分子是官能化PEG。在某些實施方式中，所述官能化蛋白是官能化IL-2。在某些實施方式中，官能化IL-2中的疊氮化物與官能化PEG中的炔烴反應以形成三唑部分(例如，通過1,3-偶極環化加成)。在某些實施方式中，官能化PEG中的疊氮化物與官能化IL-2中的炔烴反應以形成三唑部分。
在某些實施方式中，本發明揭露所述的點擊化學產物基團包含三唑基團。
在某些實施方式中，點擊化學產物基團選自：
Figure 02_image184
；
Figure 02_image186
；
Figure 02_image188
；
Figure 02_image190
；
Figure 02_image192
；
Figure 02_image194
；和
Figure 02_image196
。
在本文所揭露的化合物、偶聯物和化學式的某些實施方式中，T選自：
Figure 02_image184
；
Figure 02_image186
；
Figure 02_image188
；
Figure 02_image190
；
Figure 02_image192
；
Figure 02_image194
；或
Figure 02_image196
。
在本文所揭露的包含三唑官能團(T)的化合物、偶聯物和化學式的某些實施方式中，所述三唑官能團可以作為位置異構體的混合物存在，導致所產生的化合物或偶聯物以位置異構體的混合物存在。
如本文所使用的，
Figure 02_image198
的結構表示具有以下結構的位置異構體的混合物：
Figure 02_image184
；和
Figure 02_image186
。
當本文所提供的偶聯物含有酸性或鹼性部分時，它還可以用做作為藥物可用的鹽。參見，Berge等人,J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19；Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, 第2版；Stahl and Wermuth Eds.; John Wiley & Sons, 2011。在某些實施方式中，本文所提供的化合物的藥物可用的鹽是溶劑化物。在某些實施方式中，本文所提供的化合物的藥物可用的鹽是水合物。
適合在本文所提供的化合物的藥物可用的鹽的製備中使用的酸包括(但不限於)乙酸、2,2-二氯乙酸、醯化氨基酸、肥酸、海藻酸、抗壞血酸、L-門冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙醯氨基苯甲酸、硼酸、(+)-樟腦酸、樟腦磺酸、(+)-(1S )-樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、檸檬酸、環拉酸、環己基氨基磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羥基-乙磺酸、甲酸、延胡索酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡庚糖酸、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、L-谷氨酸、α-酮戊二酸、乙醇酸、馬尿酸、氫溴酸、鹽酸、氫碘酸、(+)-左旋乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、月桂酸、馬來酸、(-)-L-蘋果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、煙酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、高氯酸、磷酸、L-焦谷氨酸、糖二酸、水楊酸、4-氨基-水楊酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、p -甲苯磺酸、十一烯酸和戊酸。
適合在本文所提供的化合物的藥物可用的鹽的製備中使用的鹼包括(但不限於)無機鹼、如氫氧化鎂、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氫氧化鋅或氫氧化鈉；和有機鹼，如伯、仲、叔和季脂族和芳香胺，包括(但不限於)L-精氨酸、苯乙苄胺、苄星青黴素、膽鹼、地阿諾、二乙醇胺、二乙胺、二甲胺、二丙胺、二異丙胺、2-(二乙基氨)-乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、異丙胺、N -甲基-葡糖胺、哈胺、1H -咪唑、L-賴氨酸、嗎啉、4-(2-羥乙基)-嗎啉、甲胺、呱啶、呱嗪、丙胺、四氫吡咯、1-(2-羥乙基)-四氫吡咯、吡啶、奎寧環、喹啉、異喹啉、三乙醇胺、三甲胺、三乙胺、N -甲基-D-葡糖胺、2-氨基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇和氨丁三醇。
本文所提供的偶聯物還可以用做為前體藥物，它是化合物的功能衍生物並且易於在體內轉化為母體化合物。前體藥物通常是有用的，因為在一些情況下，它們可以比母體化合物更易於施用。例如，它們可以是通過口服生物可用的，然而母體化合物不是。前體藥物還可以在藥物組合物中具有比母體化合物提高的溶解度。前體藥物可以通過多種機制轉化為母體藥物，包括酶促過程和代謝水解。 [藥物組合物]
所述偶聯物通常是組合物的一部分。通常，所述組合物包含多種偶聯物。在某些實施方式中，每種偶聯物由相同蛋白組成(即在整個組合物內，僅存在一種類型的蛋白)。另外，所述組合物可以包含多種偶聯物，其中任何給定的偶聯物由選自兩種或更多種不同的蛋白的部分組成(即在整個組合物內，存在兩種或更多種不同的蛋白)。在其它實施方式中，所述組合物中基本所有的偶聯物(例如，所述組合物中的多種偶聯物的85%或以上)分別包含相同的蛋白。更具體地，所述蛋白是IL-2。
所述組合物可以包含單一偶聯物物質(例如，單PEG化的偶聯物，其中對於所述組合物中的基本所有偶聯物，在相同位置連接單個聚合物)或偶聯物物質的混合物(例如，其中聚合物的連接發生在不同位點的單PEG化的偶聯物的混合物和/或單PEG化、二PEG化、三PEG化和多PEG化偶聯物的混合物)。所述組合物也可以包含具有4、5、6、7、8或更多個連接至任何給定蛋白的聚合物的其它偶聯物。另外，本發明揭露包括其中所述組合物包含多種偶聯物的實例，每種偶聯物包含共價連接至一種蛋白的一種水溶性聚合物，以及包含共價連接至一種蛋白的2、3、4、5、6、7、8或更多種水溶性聚合物的組合物。更具體地，所述蛋白是IL-2。
相對於所述組合物中的偶聯物，所述組合物通常將滿足以下特徵中的一種或多種：所述組合物中的至少約85%的偶聯物將具有1至10種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的偶聯物將具有1至9種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的偶聯物將具有1至8種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的偶聯物將具有1至7種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的偶聯物將具有1至6種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的偶聯物將具有1至5種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的偶聯物將具有1至4種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的偶聯物將具有1至3種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的偶聯物將具有1至2種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的偶聯物將具有1種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的偶聯物將具有1至10種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的偶聯物將具有1至9種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的偶聯物將具有1至8種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的偶聯物將具有1至7種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的偶聯物將具有1至6種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的偶聯物將具有1至5種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的偶聯物將具有1至4種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的偶聯物將具有1至3種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的偶聯物將具有1至2種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的偶聯物將具有1種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的偶聯物將具有1至10種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的偶聯物將具有1至9種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的偶聯物將具有1至8種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的偶聯物將具有1至7種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的偶聯物將具有1至6種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的偶聯物將具有1至5種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的偶聯物將具有1至4種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的偶聯物將具有1至3種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的偶聯物將具有1至2種連接至所述蛋白的聚合物；和所述組合物中的至少約99%的偶聯物將具有1種連接至所述蛋白的聚合物。應理解對聚合物範圍的提及，例如，“x至y種聚合物”, 考慮了x至y(包括x和y)的多種聚合物(也就是說，例如，“1至3種聚合物”考慮了1種聚合物、2種聚合物和3種聚合物，“1至2種聚合物”考慮了1種聚合物和2種聚合物等)。更具體地，所述蛋白是IL-2。
對於任何給定部分，可以通過選擇適當的聚合試劑、聚合試劑與蛋白的比例、溫度、pH條件以及綴合反應的其它方面來實現對所期望的聚合物數目的控制。另外，可以通過純化方式減少或除去不期望的偶聯物。
例如，可以純化聚合物-蛋白質偶聯物以獲得/分離不同的偶聯物質。具體地，可以純化產物混合物以獲得每個IL-2部分平均有1、2、3、4、5或更多個的PEG。最終偶聯物反應混合物的純化策略將取決於許多因素，包括(例如)所使用的聚合試劑的分子量、具體的蛋白、所需的給藥方案和各個偶聯物的殘留活性和體內活性。
如果需要，可以使用凝膠過濾色譜法和/或離子交換色譜法分離具有不同分子量的偶聯物。也就是說，基於它們不同的分子量(其中差異基本上對應於水溶性聚合物部分的平均分子量)，將凝膠過濾色譜法用於分離不同數目的聚合物-與-蛋白質部分的比例(例如，1-聚體、2-聚體、3-聚體等，其中“1-聚體”表示每個蛋白質部分有1個聚合物，“2-聚體”表示每個蛋白質部分有2個聚合物等)。例如，在其中15,000道耳頓蛋白隨機偶聯至分子量約20,000道耳頓的聚合試劑的示例性反應中，所得反應混合物可以含有未修飾的蛋白(具有約15,000道耳頓的分子量)、單PEG化的蛋白(具有約35,000道耳頓的分子量)、二PEG化的蛋白(具有約55,000道耳頓的分子量)等。
儘管這種方法可以用於分離具有不同分子量的PEG及其它聚合物-蛋白偶聯物，但是這種方法對於分離在蛋白內具有不同聚合物連接位點的位置異構體來說通常是無效的。例如，凝膠過濾色譜法可以用於將PEG 1-聚體、2-聚體、3-聚體等的混合物彼此分離，儘管每種所分離的偶聯物的組成可以含有在蛋白內連接至不同反應基團(例如，賴氨酸殘基))的PEG。
具體的凝膠過濾柱的選擇將取決於所期望的分離範圍。通常使用適合的緩衝液，如磷酸鹽、乙酸鹽等進行洗脫。可以通過多種不同的方法分析收集的餾分，例如，(i)對於蛋白質含量，在280nm的吸光值，(ii)使用牛血清白蛋白(BSA)作為標準品的染料-基蛋白質分析，(iii)用於PEG含量的碘測試(Sims等人 (1980) Anal. BioIL-2m, 107:60-63)，(iv)十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS PAGE)，隨後用碘化鋇染色和(v)高效液相色譜法(HPLC)。
位置異構體的分離可以通過反相色譜法使用反相-高效液相色譜(RP-HPLC)，使用適合的柱(例如，C18柱或C3柱)，或者通過離子交換色譜法使用離子交換柱，獲得。可以使用任一種方法來分離具有相同分子量的聚合物-活性劑異構體(即位置異構體)。
對於IL-2-聚合物偶聯物，所述組合物較佳地基本不含不具有IL-2活性的蛋白。另外，所述組合物較佳地基本不含所有其它非共價連接的水溶性聚合物。然而，在一些情況下，所述組合物可以含有聚合物-IL-2偶聯物和非偶聯IL-2的混合物。
任選地，本發明所述的組合物還包含一種或多種藥物可用的載體或賦形劑。如果需要，可以將藥物可用的賦形劑添加至偶聯物以形成組合物。
示例性的賦形劑無限制地包括選自碳水化合物、無機鹽、抗微生物劑、抗氧化劑、表面活性劑、緩衝劑、酸、鹼、氨基酸及其組合的那些。
碳水化合物，如糖、衍生的糖，如醛醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物可以作為賦形劑存在。具體的碳水化合物賦形劑包括(例如)單糖，如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、右旋糖酐、澱粉等；和醛醇，如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、拉克替醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇、環糊精等。
賦形劑還可以包括無機鹽或緩衝液，如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二鈉及其組合。
所述組合物還可以包括用於防止或阻止微生物生長的抗微生物劑。適合於本發明的一個或多個實施方式的抗微生物劑的非限制性實例包括苯紮氯銨、苄索氯銨、苯甲醇、氯化十六烷吡啶、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞及其組合。
抗氧化劑也可以存在於所述組合物中。抗氧化劑用於防止氧化，借此防止偶聯物或製劑的其它組分的破壞。適合在本發明的一個或多個實施方式中使用的抗氧化劑包括(例如)抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯、次磷酸、硫代甘油、沒食子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、甲醛合次硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉及其組合。
表面活性劑可以作為賦形劑存在。示例性的表面活性劑包括：聚山梨醇酯，如“吐溫20”和“吐溫80”以及普盧蘭尼克，如F68和F88；脫水山梨糖醇酯；脂質，如磷脂，如卵磷脂及其它磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺(儘管較佳地不處於脂質體的形式)、脂肪酸和脂肪酸酯；類固醇，如膽固醇；和IL-2化劑(IL-2lating agents)，如EDTA、鋅及其它這些適合的陽離子。
酸和鹼可以作為所述組合物中的賦形劑存在。可以使用的酸的非限制性實例包括選自下列中的那些酸：鹽酸、乙酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、延胡索酸及其組合。適合的鹼的實例無限制地包括選自下列的鹼：氫氧化鈉、乙酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、乙酸銨、乙酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、延胡索酸鉀及其組合。
一種或多種氨基酸可以作為本文所述的組合物中的賦形劑存在。在這方面，示例性的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和甘氨酸。
所述組合物中的偶聯物(即活性劑和聚合試劑之間形成的偶聯物)的量將基於許多因素而改變，但當所述組合物儲存在單位劑量容器(例如，小瓶)中時，所述量將最佳地為治療有效劑量。另外，可以將藥物製劑放在注射器中。可以通過實驗確定治療有效劑量, 通過反復施用劑量升高的偶聯物，以確定哪個量產生了臨床所期望的終點。
所述組合物中任何單個賦形劑的劑量將基於賦形劑的活性和所述組合物的具體需要而改變。通常，通過常規實驗，即通過製備含有不同的劑量的賦形劑(從低到高)的組合物，檢查穩定性及其它參數，然後確定獲得最佳表現且無明顯副作用的範圍，從而確定任何單個賦形劑的最佳的劑量。
然而，通常，賦形劑在組合物中的存在量為按重量計約1%至約99%，較佳地按重量計約5%至約98%，更佳地按重量計約15至約95%，其中濃度小於按重量計30%是最佳的。
以上這些藥物賦形劑與其它賦形劑一起描述於“Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 第19版, Williams & Williams, (1995)，“Physician’s Desk Reference”, 第52版, Medical Economics, Montvale, NJ (1998)和Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000中。 [治療方法]
所述偶聯物及其組合物可以用於治療可以通過施用所述偶聯物醫冶或預防的任何病況。本領域那些技術人員將理解具體偶聯物可以有效治療哪些病況。例如，所述偶聯物可以單獨使用或與其它藥物療法組合以治療癌症、傳染性疾病(例如，病毒)和/或自體免疫疾病。
在一些實施方式中，本發明揭露提供了治療對其有需要的受試者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本文所揭露的偶聯物。在一些實施方式中，所述癌症是血癌。在一些實施方式中，所述血癌是多發性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。在一些實施方式中，所述血癌是急性髓細胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤。在一些實施方式中，所述癌症是實體瘤癌症。在一些實施方式中，所述實體瘤癌症是腎細胞癌、黑素瘤、乳腺癌或膀胱癌。在一些實施方式中，所述黑素瘤是轉移性黑素瘤。在一些實施方式中，所述癌症是可以用IL-2治療的癌症，其選自肉瘤、脊索瘤、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚癌、威爾姆氏瘤、宮頸癌、睾丸癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、寡枝神經膠質細胞瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、急性髓細胞性白血病和白血病。
在一些實施方式中，本發明揭露提供了治療對其有需要的受試者中的傳染性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本文所揭露的偶聯物。在一些實施方式中，所述傳染性疾病是病毒性疾病。在一些實施方式中，所述病毒性疾病是人類免疫缺陷性病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)。在一些實施方式中，所述傳染性疾病是HIV。在一些實施方式中，所述傳染性疾病是HCV。
在一些實施方式中，本發明揭露提供了治療對其有需要的受試者中的自體免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本文所揭露的偶聯物。在一些實施方式中，所述自體免疫疾病是類風濕性關節炎、紅斑狼瘡、炎症性腸病(IBD)或特應性皮炎。在一些實施方式中，所述類風濕性關節炎是兒童類風濕性關節炎。
在某些實施方式中，患者患有選自下列的疾病：腎細胞癌、轉移性黑素瘤、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、急性髓細胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、兒童類風濕性關節炎、特應性皮炎、乳腺癌和膀胱癌。
有利地，可以在另一種活性劑的施用之前、同時或之後向患者施用所述偶聯物。在一些實施方式中，所述偶聯物可以與抗腫瘤抗原抗體組合以產生協同的先天性和適應性免疫反應。在一些實施方式中，所述偶聯物可以與通過抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)功能具有它們的抗腫瘤活性的抗腫瘤抗體組合。本發明揭露中所述的PEG-IL-2偶聯物可以刺激CD8+ T細胞。CD8+ T細胞的刺激不僅提供了直接殺死腫瘤的益處，而且還可以調節多形核白細胞(PMNs)以提供抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)，如通過釋放已知促進嗜中性白細胞活性的細胞因子，如IFNγ的釋放(Pelletier等人, J. Leukoc. Biol. 2010; 88:1163–1170)。PEG-IL-2偶聯物與具有ADCC功能的抗腫瘤抗體的組合療法可以潛在地提高這些抗體的抗腫瘤活性。 [製劑/施用]
本文所揭露的施用於對其有需要的患者的偶聯物和組合物意味著涵蓋了所有制劑類型，具體地，適合於注射的那些類型，例如，可以復原的粉劑或凍乾粉劑(lyophilates)以及液體劑。適合於在注射前復原固體組合物的稀釋劑的實例包括抑菌注射用水、5%葡萄糖水溶液、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液、鹽水、無菌水、去離子水及其組合。對於液體藥物組合物，考慮了溶液和混懸液。
通常，儘管不一定，本發明揭露的一個或多個實施方式的組合物是通過注射施用並因此所述組合物通常在馬上要施用前是液體溶液或混懸液。所述藥物製劑還可以採取其它形式，如糖漿、乳膏劑、軟膏劑、片劑、粉末劑等。還包括了其它施用模式，如肺部、直腸、透皮、經黏膜、口服、鞘內、瘤內、癌周、腹膜內、皮下、動脈內施用等。
本發明揭露還提供了用於將如本文所提供的偶聯物施用於患有對用偶聯物的治療起反應的病況的患者的方法。所述方法包括通常通過注射，向患者施用治療有效量的偶聯物(較佳地作為藥物組合物的一部分提供)。如前所述，可以注射(例如，肌內、皮下和腸胃外注射)所述偶聯物。適合於腸胃外施用的製劑類型包括隨時可注射的溶液、在使用前用於與溶劑混合的乾粉、隨時可注射的混懸液、用於在使用前與媒介物混合的乾燥不溶組合物和在施用前稀釋的乳液和液體濃縮劑等。
可以任選地實施施用所述偶聯物(較佳地作為藥物組合物的一部分提供)的方法以將所述偶聯物定位至特定區域。例如，可以通過手術將包含所述偶聯物的液體、凝膠和固體製劑植入患病區域(如腫瘤中、腫瘤附近、發炎區域中和發炎區域附近)。方便地，還可以對器官和組織成象以確保將所期望的位置更好地暴露於所述偶聯物。
要施用的實際劑量將基於受試者的年齡、體重和一般狀況以及要治療的病況的嚴重程度、專業醫護人員的判斷和要施用的偶聯物而不同。治療有效量是本領域技術人員已知的和/或在相關參考教科書和文獻中描述的。通常，治療有效量將在約0.001mg至100mg的範圍內，較佳地處於0.01mg/天至75mg/天的劑量，並且更較佳地0.10mg/天至50mg/天的劑量。可以定期施用給定劑量直至(例如)疾病症狀減輕和/或完全消除。
基於臨床醫師的判斷、患者的需要等，可以以多種給藥方案來施用任何給定的偶聯物(同樣，較佳地作為藥物製劑的一部分提供)的單位劑量。具體的給藥方案將是本領域那些技術人員已知的或者可以使用常規方法通過實驗確定的。示例性的給藥方案無限制地包括每天施用一次、每週三次、每週兩次、每週一次、每三周1次、每月兩次、每月一次或其任意組合。一旦實現臨床終點，則停止所述組合物的劑量施用。
應理解儘管已結合其較佳的具體實施方式描述了本發明揭露，但是以上描述以及隨後的實施例旨在描述而非限制本發明揭露的範圍。本發明揭露的範圍內的其它方面、優勢和改變將對本發明揭露所屬領域內的技術人員是顯而易見的。
在本文中參考的所有文章、書籍、專利及其它出版物以其全部內容作為參考併入本文。 [實驗]
除非另外說明，否則本發明揭露的實踐將使用有機合成、生物化學、蛋白純化等的常規方法，它們均在本領域的技術範圍內。在文獻中充分解釋了這些技術。參見，例如，J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 第4版 (New York: Wiley-Interscience, 1992)，如上。
在以下實施例中，已努力確保所用數值的準確度(例如，數量、溫度等)，但是應考慮到一些實驗誤差和偏差。除非另外說明，否則以攝氏度表示溫度並且壓力為或接近海平線處的大氣壓力。除非另外說明，否則所有試劑購自Sigma-Aldrich或Thermo Fisher Scientific。所有產生的NMR得自300或400MHz NMR光譜儀。所有處理是在玻璃或玻璃襯裡的容器中進行的並且避免與含金屬容器或設備接觸。
材料：除非另作說明，否則所有有機溶劑和試劑(無水CH2 Cl2 、2-丙醇、丙酮、NMM和DBCO-胺)均購自Sigma Aldrich並直接使用。PyClocK購自Novabiochem®。15kDa、17kDa和20kDa Y-PEG-NHS試劑購自JenKem Technology USA並直接使用。
使用根據發表的方法所修改的方法製備5kDa、10kDa和20kDa TheraPEG™試劑(Brocchini等人,Nat. Protoc. 2006,1:5 , 2241-2252)。DL-二硫蘇糖醇(DTT)購自Melford並且在使用前在細胞培養級水(GE Healthcare)中製備0.1M溶液。用於緩衝液製備的材料來源於Thermo Fisher Scientific、Merck和Sigma-Aldrich並且直接使用。通過使用2M NaOH(VWR)調節pH，從DPBS(Sigma-Aldrich)製備PBS，pH 7.4。所有其它材料購自VWR、Sigma-Aldrich、GE Healthcare、Thermo Fisher Scientific和Merck並直接使用。
除非另外說明，否則在這些實施例中提及的所有前體聚合試劑是可商購的。IL-2(“rIL-2”)的凍乾粉末對應於圖1的氨基酸序列。
基於IL-2的量計算IL-2-PEG偶聯物的質量和莫耳量。 [SDS-PAGE分析]
通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析樣品。製備樣品，加樣至凝膠並如生產商所述，實施電泳。 [尺寸排阻色譜]
將尺寸排阻色譜法用於純化所製備的PEG-rIL-2偶聯物。純化方法的詳細情況如下所述。 [RP-HPLC分析]
通過在HPLC系統上實施的反相色譜法(RP-HPLC)分析來分析樣品。使用ACE Excel 2superC18柱(尺寸：75×2.1mm id，顆粒尺寸2μm)，在Dionex 2 UPLC系統上實施分析型RP-HPLC分析。使用在10min內0-100%緩衝液B(99.95% MeCN，0.05% TFA)在緩衝液A(94.95% H2 O，5.0% MeCN，0.05% TFA)中的線性梯度，流速0.8mL/min。樣品載入量為10µg。 [實施例1] 7-疊氮基-1-((4-氟苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(8)
Figure 02_image200
[6-疊氮基己-1-醇(2)的製備]
向6-氯代己-1-醇(75g，0.549mol，1.0eq)在H2 O(750mL)中的溶液中添加NaN3 (97.5g，1.50mol，2.73eq)。將混合物在105℃攪拌16h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，用乙酸乙酯萃取混合物。用無水Na2 SO4 乾燥有機層並減壓濃縮以提供粗化合物2(75g，95%)。 [6-疊氮基己醛(3)的製備]
在0℃，分3個部分向化合物2(75g，0.523mol，1.0eq)、TEMPO(817mg，5.23mmol，0.01eq)和NaHCO3 (52.7g，0.628mol，1.2eq)在DCM/H2 O(750ml/75ml)中的溶液中添加TCCA(45g，0.194mol，0.37eq)。將混合物在0℃攪拌0.5h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，過濾混合物並用水稀釋。用無水Na2 SO4 乾燥有機層並減壓濃縮以提供粗化合物3(70g，94%)。 [(4-氟苯基)(甲基)硫烷(5)的製備]
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物4(30g，0.234mol，1.0eq)在DMF(250ml)中的溶液中添加MeI(40g，0.281mol，1.2eq)和K2 CO3 (97g，0.702mol，3.0eq)。將混合物在室溫下攪拌4h。反應混合物的TLC分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取。用5% LiCl(aq.)清洗有機層，用無水Na2 SO4 乾燥並減壓濃縮以提供粗化合物5(45g，100%)。 [1-氟-4-(甲基磺醯基)苯(6)的製備]
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物5(45g，0.317mol，1.0eq)在THF/H2 O(450ml/450ml)中的溶液中添加過硫酸氫鉀製劑(oxone)(487g，0.792mol，2.5eq)。將混合物在室溫下攪拌16h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，過濾混合物，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取。用鹽水清洗有機層，用無水Na2 SO4 乾燥並減壓濃縮以提供粗化合物6(35g，63%)。 [7-疊氮基-1-((4-氟苯基)磺醯基)庚烷-2-醇(7)的製備]
在-78℃，向化合物6(20g，0.115mol，1.0eq)在無水THF(200mL)中的溶液中滴加n-BuLi(2.5M在己烷中的溶液，60ml，0.149mol，1.3eq)。除去冷卻浴並使混合物加熱至0℃。在攪拌30min後，在-78℃添加化合物3(21g，0.149mol，1.3eq)。在攪拌15min後，使所述混合物加熱。然後，將所述混合物添加至NH4 Cl的飽和水溶液(混合物變透明)並用乙酸乙酯萃取。用無水Na2 SO4 乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供化合物7(26g，71%)。 [7-疊氮基-1-((4-氟苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(8)的製備]
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物7(15g，47.62mmol，1.0eq)和三光氣(24g，80.95mmol，1.7eq)在無水THF(200mL)中的攪拌溶液中滴加吡啶(7.5g，95.24mmol，2.0eq)。在攪拌10min後，過濾混合物並減壓濃縮。將殘餘物溶於無水THF(100mL)並依次用NHS(16.4g，0.143mol，3.0eq)和吡啶(11.3g，0.143mmol，3.0eq)處理。在攪拌10min後，減壓濃縮混合物。將殘餘物溶於乙酸乙酯(100mL)並用0.1N HCl、水、飽和的NaHCO3 水溶液和鹽水清洗。用無水Na2 SO4 乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供固體狀的化合物8(12g，55%)。1 H NMR (400 MHz, d6 -DMSO)δ 7.95-7.92 (m, 2H), 7.46 (t,J = 8.8 Hz, 2H), 5.10-5.09 (m, 1H), 4.04-3.97 (m, 1H), 3.84 (dd,J = 15.2, 2.0 Hz, 1H), 3.27-3.24 (m, 2H), 2.77 (s, 4H), 1.65-1.64 (m, 2H), 1.44-1.42 (m, 2H), 1.23-1.22 (m, 4H)。 [實施例2] 7-疊氮基-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(13)
Figure 02_image202
[甲基(4-(三氟甲基)苯基)硫烷(10)的製備]
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物9(24.5g，0.138mol，1.0eq)在DMF(200mL)中的溶液中添加MeI(23.4g，0.165mol，1.2eq)和K2 CO3 (57g，0.413mol，3.0eq)。將混合物在室溫下攪拌4h。反應混合物的TLC分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取。用5% LiCl(aq.)清洗有機層，用無水Na2 SO4 乾燥並減壓濃縮以提供粗化合物10(24g，90%)。 [1-(甲基磺醯基)-4-(三氟甲基)苯(11)的製備]
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物10(24g，0.125mol，1.0eq)在THF/H2 O(200ml/200ml)中的溶液中添加過硫酸氫鉀製劑(171g，0.264mol，2.1eq)。將混合物在室溫下攪拌16h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，過濾混合物，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取。用鹽水清洗有機層，用無水Na2 SO4 乾燥並減壓濃縮以提供粗化合物11(30.6g，100%)。 [7-疊氮基-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-醇(12)的製備]
在-78℃，向化合物11(15g，66.96mmol，1.0eq)在無水THF(150ml)中的溶液中滴加n-BuLi(2.5M在己烷中的溶液，35ml，87.05mmol，1.3eq)。除去冷卻浴並使混合物加熱至0℃。在攪拌30min後，在-78℃添加化合物3(12.5g，87.05mmol，1.3eq)。在攪拌15min後，使所述混合物加熱。然後，將所述混合物添加至NH4 Cl的飽和水溶液(混合物變透明)並用乙酸乙酯萃取。用無水Na2 SO4 乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供不純的化合物12(19g，77%)。 [7-疊氮基-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(13)的製備]
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物12(19g，52.05mmol，1.0eq)和三光氣(26.3g，88.49mmol，1.7eq)在無水THF(200mL)中的攪拌溶液中滴加吡啶(8ml，0.104mol，2.0eq)。在攪拌10min後，過濾混合物並減壓濃縮。將殘餘物溶於無水THF(100mL)並依次用NHS(17.95g，0.156mol，3.0eq)和吡啶(12.5mL，0.156mmol，3.0eq)處理。在攪拌10min後，減壓濃縮混合物。將殘餘物溶於乙酸乙酯(100mL)並用0.1N HCl、水、飽和的NaHCO3 水溶液和鹽水清洗。用無水Na2 SO4 乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供固體狀的化合物13(12.5g，47%)。1 H NMR (400 MHz, d6 -DMSO)δ 8.10 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 8.01 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 5.16-5.15 (m, 1H), 4.16-4.09 (m, 1H), 3.95-3.92 (m, 1H), 3.26 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.77 (s, 4H), 1.66-1.65 (m, 2H), 1.44-1.42 (m, 2H), 1.24-1.23 (m, 4H)。 [實施例3] 7-疊氮基-1-((4-氯苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(18)
Figure 02_image204
[(4-氯苯基)(甲基)硫烷(15)的製備]
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物14(30g，0.207mol，1.0eq)在DMF(250ml)中的溶液中添加MeI(35.3g，0.249mol，1.2eq)和K2 CO3 (85.8g，0.622mol，3.0eq)。將混合物在室溫下攪拌4h。反應混合物的TLC分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取。用5% LiCl(aq.)清洗有機層，用無水Na2 SO4 乾燥並減壓濃縮以提供橙色油狀的粗化合物15(44g，100%)。TLC: PE: EA=10:1，Rf (14) =0.5，Rf (15) =0.7。 [1-氯-4-(甲基磺醯基)苯(16)的製備]
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物15(60g，0.380mol，1.0eq)在THF/H2 O(400mL/400mL)中的溶液中添加過硫酸氫鉀製劑(583g，0.948mol，2.5eq)。將混合物在室溫下攪拌16h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，過濾混合物，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取。用鹽水清洗有機層，用無水Na2 SO4 乾燥並減壓濃縮以提供白色固體狀的粗化合物16(57.8g，80%)。 [7-疊氮基-1-((4-氯苯基)磺醯基)庚烷-2-醇(17)的製備]
在-78℃，向化合物16(20g，0.105mol，1.0eq)在無水THF(300mL)中的溶液中滴加n-BuLi(2.5M在己烷中的溶液，55mL，0.137mol，1.3eq)。除去冷卻浴並使混合物加熱至0℃。在攪拌30min後，在-78℃添加化合物3(19g，0.137mol，1.3eq)。在攪拌15min後，使所述混合物加熱。然後，將所述混合物添加至NH4 Cl的飽和水溶液(混合物變透明)並用乙酸乙酯萃取。用無水Na2 SO4 乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供黃色固體狀的化合物17(26g，74%)。 [7-疊氮基-1-((4-氯苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(18)的製備]
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物17(31g，93.42mmol，1.0eq)和三光氣(47g，0.159mol，1.7eq)在無水THF(500mL)中的攪拌溶液中滴加吡啶(15mL，0.187mol，2.0eq)。在攪拌10min後，過濾混合物並減壓濃縮。將殘餘物溶於無水THF(500mL)並依次用NHS(32g，0.280mol，3.0eq)和吡啶(22mL，0.280mmol，3.0eq)處理。在攪拌10min後，減壓濃縮混合物。將殘餘物溶於乙酸乙酯(300mL)並用0.1N HCl、水、飽和的NaHCO3 水溶液和鹽水清洗。用無水Na2 SO4 乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供固體狀的化合物18(26g，59%)。1 H NMR (400 MHz, d6 -DMSO)δ 7.87 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 7.69 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 5.11-5.10 (m, 1H), 4.06-4.00 (m, 1H), 3.86 (dd,J = 15.6, 2.4 Hz, 1H), 3.26 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.77 (s, 4H), 1.66-1.62 (m, 2H), 1.45-1.42 (m, 2H), 1.23-1.22 (m, 4H)。 [實施例4] 7-疊氮基-1-((2,4-二氟苯)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(19)
Figure 02_image206
以與實施例1類似的製備程式，使用2,4-二氟苯硫酚製備實施例4。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 )δ 8.01 – 7.94 (m, 1H), 7.12 – 7.05 (m, 1H), 7.05 – 6.97 (m, 1H), 5.24 (d,J = 6.6 Hz, 1H), 3.78 (dd,J = 15.2, 8.4 Hz, 1H), 3.46 (dd,J = 15.2, 3.4 Hz, 1H), 3.26 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.80 (s, 4H), 1.79 (s, 2H), 1.63 – 1.56 (m, 2H), 1.43 – 1.33 (m, 4H)。 [實施例5] 7-疊氮基-1-((4-氟-2-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(20)
Figure 02_image208
以與實施例1類似的製備程式，使用4-氟-2-(三氟甲基)苯硫酚製備實施例5。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 )δ 8.31 (dd,J = 8.8, 5.2 Hz, 1H), 7.60 (dd,J = 8.8, 2.6 Hz, 1H), 7.54 – 7.46 (m, 1H), 5.36 – 5.26 (m, 1H), 3.79 (dd,J = 15.2, 8.8 Hz, 1H), 3.47 (dd,J = 15.2, 3.2 Hz, 1H), 3.25 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.81 (s, 4H), 1.83 – 1.70 (m, 2H), 1.61 – 1.52 (m, 2H), 1.45 – 1.34 (m, 4H)。 [實施例6] (2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(24)
Figure 02_image210
[N2,N7-雙(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9-(羥甲基)-9H-芴-2,7-二甲醯胺(23)的製備]
將9-(羥甲基)-9H-芴-2,7-二羧酸(82.5mg，0.24mmol)溶於無水吡啶(1.0ml)並在室溫下向所述溶液中添加HATU(273.8mg，0.72mmol)和2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(117.1mg，0.54mmol)。然後，將反應攪拌2hr。用HPLC，以0-70% MeCN/H2 O(具有0.1%甲酸)純化產物以提供化合物23(47.4mg，30%)。LCMS：m/z 685 (M+1)+ 。 [(2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(24)的製備]
在室溫下，在N2 下，將化合物23(47.4mg，0.069mmol)溶於DCM(0.2ml)，並用DSC(35.47mg，0.14mmol)和吡啶(16.7µL，0.21mmol)處理。將反應攪拌1.5hr，然後用DCM稀釋並用1N HCl和鹽水清洗。用Na2 SO4 乾燥有機相並濃縮。用HPLC，以MeCN/H2 O(具有0.1% TFA)純化殘餘物以提供所期望的產物24(31.7mg，56%，淺黃色油)。LCMS：m/z 826 (M+1)+ 。 [實施例7] (2-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(31)
Figure 02_image212
[甲基9H-芴-2-羧酸酯(26)的製備]
將化合物25、2-溴-9H-芴(128g，522mmol)、三乙胺TEA(106g，1.04mol，145ml)和Pd(dppf)Cl2 (38.2g，52.2mmol)在MeOH(890ml)中的混合物脫氣並用CO(50Psi)吹掃3次，然後在80℃，在N2 氣氛下，將混合物攪拌5hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯=10/1)顯示形成新的斑點(Rf =0.42)。通過柱色譜法(SiO2 ，石油醚/乙酸乙酯=100/1至10/1)純化殘餘物以提供白色固體狀的化合物26(120g，粗產物)。 [9H-芴-2-羧酸(27)的製備]
向化合物26(120g，535mmol)在MeOH(840ml)中的混合物中添加NaOH(2M)，然後將混合物在20℃，在N2 氣氛下攪拌5hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯=10/1)顯示起始材料完全消耗並且形成新的斑點(Rf =0.01)。向所述溶液中加入水(50mL)，然後將其用EtOAc(100mL)萃取。用3M HCl將水相調節至pH 3，然後將其用EtOAc(100mL)萃取。減壓濃縮有機相以提供黃色固體狀的化合物27(40.0g，190mmol，35.6%得率)。 [9-甲醯基-9H-芴-2-羧酸(28)的製備]
向化合物27(6.00g，28.5mmol)在DMF(196ml)中的混合物中緩慢添加甲酸乙酯(276g，3.73mol)和t-BuOK(25.6g，228mmol)。將混合物在45℃攪拌0.5hr，然後使其冷卻至25℃，2.5小時。TLC(石油醚/乙酸乙酯=0/1)顯示起始材料完全消耗並且形成新的斑點(Rf =0.48)。用1M HCl將溶液調節至pH 3。然後，用EtOAc(50.0mL)萃取混合物。分離有機相，用Na2 SO4 乾燥，過濾，減壓濃縮以提供棕色固體狀的化合物28(7.00g，粗產物)。 [9-(羥甲基)-9H-芴-2-羧酸(29)的製備]
向化合物28(7.00g，29.4mmol)在MeOH(42.0ml)中的混合物中添加NaBH4 (2.78g，73.5mmol)。對反應混合物脫氣並用N2 吹掃3次，然後在N2 氣氛下，將混合物在25℃攪拌16hr。LCMS(產物：RT=0.863min)顯示所期望的化合物的MS。向所述溶液中加入水(120mL)，然後將其用EtOAc(100mL)萃取。用1M HCl將水相調節至pH 3，然後將其用EtOAc(100mL)萃取。分離有機相，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供黃色固體狀的化合物29(4.00g，16.7mmol，56.7%得率)。 [N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9-(羥甲基)-9H-芴-2-羧醯胺(30)的製備]
在25℃，向化合物29(1.00g，4.16mmol)和2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(908mg，4.16mmol)在DMF(7.00ml)中的溶液中添加HOBt(619mg，4.58mmol)、EDCl(878mg，4.58mmol)和DIPEA(1.24g，9.57mmol)。將混合物在25℃攪拌12hr。LCMS(產物：RT=1.002min)顯示起始材料完全消耗。用水(10.0mL)稀釋反應混合物，用EtOAc(10.0mL×2)萃取。用水(10.0mL×2)和鹽水(10.0mL)清洗合併的有機相。分離有機相，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC(柱：Welch Xtimate C18 250*50mm*10um；流動相：[水(10mM NH4 HCO3 )-ACN]；B%：18%-48%，26min)純化殘餘物以提供黃色油狀的化合物30(1.40g，3.17mmol，76.2%得率，99.8%純度)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ):δ 8.10 (s, 1H), 7.88 - 7.76 (m, 3H), 7.63 (d,J = 7.2 Hz, 1H), 7.46 - 7.34 (m, 2H), 6.98 (s, 1H), 4.18 - 4.08 (m, 2H), 4.02 - 3.92 (m, 1H), 3.76 - 3.56 (m, 14H), 3.32 (t,J = 5.2 Hz, 2H), 2.37 (s, 1H)；LC-MS：m/z 441.1 (M+1)+ 。 [(2-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(31)的製備]
將1-羥基吡咯烷-2,5-二酮(0.5g，1eq)在DCM(5ml)中的溶液冷卻至-30℃。向該溶液中滴加氯甲酸三氯甲酯(860mg，1eq)，隨後在-30℃滴加DIPEA(561mg，1eq)。將混合物加熱到0℃並攪拌3hr。將其加熱至25℃並繼續攪拌6小時。TLC(石油醚/乙酸乙酯=0/1，Rf =0.3)顯示起始材料完全消耗。過濾反應混合物以提供濾液(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氯甲酸酯的DCM溶液)，其直接使用而未進一步純化。
在0℃，向化合物30(0.1g，1eq)和Py(17.96mg，1eq)中DCM(1ml)中的溶液中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基氯甲酸酯(10eq，來自先前步驟的DCM溶液)。將混合物在25℃攪拌12hr。LCMS(起始材料：RT=0.992min，產物：RT=1.059min)顯示剩餘3.71%的起始材料並且檢測到40.2%的所期望的化合物。通過水(2.0mL)使反應淬滅，然後用飽和的檸檬酸水溶液將pH調節至6。用DCM萃取混合物(2mL×2)。用鹽水(5.0ml)清洗合併的有機層，然後用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC(柱：Welch Ultimate AQ-C18 150*30mm*5um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：30%-60%，12min)純化殘餘物。在製備-HPLC純化之後，將餾分冷凍乾燥以提供無色油狀的化合物31。LC-MS：m/z 582.2 (M+1)+ 。 [實施例8] (2-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-7-氟-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(39)
Figure 02_image214
[2-氟-7-碘-9H-芴(33)的製備]
對2-氟-9H-芴32(24.4g，132mmol)、I2 (14.1g，55.6mmol)和KIO3 (7.08g，33.1mmol)在CH3 COOH(408ml)、H2 SO4 (9.60ml)和H2 O(19.2ml)中的混合物脫氣並用N2 吹掃3次。將混合物在N2 氣氛下，在80℃攪拌5hr。HPLC(產物：RT=3.515min)顯示檢測到所期望的化合物。用EtOAc(50.0mL)萃取水溶液。用H2 O(20.0mL)、鹽水(10.0mL)清洗有機層，分離，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供棕色固體狀的化合物33(38.0g，123mmol，92.6%得率)。1 H NMR (400 MHz, MeOD): 7.87 (s, 1H), 7.70-7.67 (m, 2H), 7.48-7.46 (m, 1H), 7.27-7.22 (m, 1H), 7.17-7.09 (m, 1H), 3.86 (s, 2H)。 [甲基7-氟-9H-芴-2-羧酸酯(34)的製備]
對化合物33(38.0g，123mmol)、TEA(31.0g，306mmol)、Pd(dppf)Cl2 (8.97g，12.3mmol)在MeOH(200mL)中的混合物脫氣並用CO(50Psi)吹掃3次。將混合物在CO氣氛下，在80℃攪拌24hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯=100/1)顯示起始材料完全消耗並且形成新的斑點(Rf =0.40)。減壓濃縮溶液以提供棕色固體狀的化合物34(40.0g，粗產物)。 [7-氟-9H-芴-2-羧酸(35)的製備]
向化合物34(40.0g，165mmol)在MeOH(280mL)中的混合物中添加NaOH(2M，206mL，2.5eq)水溶液。將反應混合物在100℃，在N2 氣氛下攪拌2hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯=0/1)顯示起始材料完全消耗並且形成新的斑點(Rf =0.03)。向反應溶液添加H2 O(150mL)。然後，用EtOAc(250mL)萃取。分離水層，並且用1M HCl調節pH至3。用EtOAc(200mL)萃取。用鹽水(20.0mL)清洗有機層，分離，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供棕色固體狀的化合物35(33.0g，145mmol，87.6%得率)。 [7-氟-9-甲醯基-9H-芴-2-羧酸(36)的製備]
向化合物35(33.0g，145mmol)在DMF(210mL)中的混合物中添加甲酸乙酯(507g，6.84mol)。然後，緩慢添加t-BuOK(130g，1.16mol)。將混合物在45℃攪拌0.5hr，然後使混合物冷卻至25℃，2.5小時。LCMS(產物：RT=0.889)顯示檢測到所期望的化合物。向反應溶液中加入水(150mL)，並用EtOAc(500mL)萃取。用1M HCl將水相調節至pH 3，然後將其用EtOAc(500mL)萃取。用鹽水(120mL)清洗有機層，分離，用Na2 SO4 乾燥，過濾，減壓濃縮以提供黃色固體狀的化合物36(30.0g，粗產物)。 [7-氟-9-(羥甲基)-9H-芴-2-羧酸(37)的製備]
向化合物36(30.0g，117mmol)在MeOH(210mL)中的混合物中添加NaBH4 (31.0g，820mmol)，然後將混合物在25℃，在N2 氣氛下攪拌24hr。LCMS(產物：RT=0.906min)顯示檢測到所期望的化合物。向反應溶液中加入水(150mL)，並用EtOAc(450mL)萃取。用1M HCl將水相調節至pH 3。然後，用EtOAc(300mL)萃取。用鹽水(120mL)清洗有機層，分離，用Na2 SO4 乾燥，過濾，減壓濃縮以提供黃色固體狀的化合物37(35.0g，粗產物)。 [N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-7-氟-9-(羥甲基)-9H-芴-2-羧醯胺(38)的製備]
將化合物37(2.00g，7.74mmol)、HOBt(1.15g，8.52mmol)、EDCl(1.63g，8.52mmol)和DIPEA(2.50g，19.4mmol)在DMF(14.0ml)中的混合物在25℃攪拌0.5hr。然後，向所述混合物添加2-[2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙胺(1.86g，8.52mmol)。將反應混合物在25℃攪拌3hr。LCMS(產物：RT=1.171min)顯示檢測到所期望的化合物。用水(20mL)稀釋反應溶液，並用EtOAc(20mL)萃取。用鹽水(20.0mL)清洗有機層，分離，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC(柱：Phenomenex luna c18 250mm*100mm*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-53%，25min)純化粗產物以提供黃色油狀的化合物38(1.00g，2.12mmol，48.7%得率，97.4%純度)。1 H NMR: (400 MHz CDCl3 ):δ 8.07 (s, 1H), 7.85 (d,J = 7.8 Hz, 1H), 7.76 - 7.70 (m, 2H), 7.35 (d,J = 7.2 Hz, 1H), 7.39 - 7.31 (m, 1H), 7.18 - 7.08 (m, 1H), 7.02 (s, 1H), 4.16 - 3.96 (m, 3H), 3.76 - 3.56 (m, 14H), 3.33 (t,J = 4.8 Hz, 2H)；LC-MS：m/z 459.1 (M+1)+ 。 [(2-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(39)的製備]
在0℃，向化合物38(0.1g，1eq)在DCM(1mL)中的溶液中添加化合物2,5-二氧代吡咯烷-1-基氯甲酸酯(10eq，DCM溶液)。將反應混合物在25℃攪拌12hr。LCMS(起始材料：RT=1.026min，產物：RT=1.084min)顯示剩餘6.33%的起始材料並且檢測到28.3%的所期望的化合物。用飽和檸檬酸水溶液將反應混合物調節至pH 6。用DCM(2mL×2)萃取混合物。用鹽水(5.0ml)清洗合併的有機層，分離，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC(柱：Phenomenex Luna C18 200*40mm*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-55%，10min)純化殘餘物。在製備-HPLC純化之後，將溶液冷凍乾燥以提供無色油狀的化合物39。LC-MS：m/z 600.2 (M+1)+ 。 [實施例9] 2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(2-((((2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)甘氨酸鹽(44)
Figure 02_image216
[叔丁基N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(2-氨乙基)甘氨酸酯(41)的製備]
在室溫下，向叔丁基N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙基)甘氨酸酯40(75.0mg，0.19mmol，1.0eq)在乙酸乙酯(0.6ml)中的溶液中添加Pd/C(40mg，10%，乾)。用H2 對反應混合物置換3次。然後，將混合物在H2 下，在室溫下攪拌2h。通過1 H NMR和TLC監測反應。(PE:EA=1:1)化合物40：Rf =0.3；化合物41：Rf =0.05。通過矽藻土墊過濾反應溶液。濃縮有機層以提供淺黃色油狀的產物41(48.4mg，98%)。 [N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(2-((((2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)-乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)甘氨酸(43)的製備]
將如上製備的化合物41在EtOAc(0.6mL)中再溶解。向其中添加化合物24(161.0mg，0.19mmol)在DCM(1mL)中的溶液，然後添加吡啶(20μL)。將反應在RT下攪拌1h，並用LCMS監測。向反應加入EtOAc(5mL)並用1N HCl(2mL)清洗，用Na2 SO4 乾燥有機相並過濾。然後，真空除去溶劑。
向粗產物42添加HCO2 H(4mL)並加熱至60℃，3h。用HPLC，以10-100% MeCN/H2 O(0.1% TFA)純化產物以獲得所期望的化合物43(31.4mg，3步為18%)。 [2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(2-((((2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-氨基)乙基)甘氨酸酯(44)的製備]
將化合物43(9.7mg，0.011mmol)溶於DCM(0.037mL)並在0℃，用HOSu(2.56mg，0.022mmol)和DCC(4.54mg，0.022mmol)在DCM(0.04mL)中的溶液處理。將反應在rt攪拌過夜。過濾並濃縮反應。加入3-5倍體積的Et2 O，並且溶液變渾濁，並將渾濁溶液離心。將頂層透明溶液倒掉，並用Et2 O(2×)清洗底部油狀固體，並在高真空下乾燥以獲得化合物44(7.2mg，65%)。LCMS：1012 (M+1)+ ；HPLC 96% (UV254)；1 H NMR (300 MHz, 氯仿-d)δ 8.09 (p,J = 0.7 Hz, 2H), 7.84 (td,J = 8.3, 1.1 Hz, 4H), 6.92 (s, 3H), 4.43 (d,J = 6.9 Hz, 2H), 4.31 (m, 1H), 4.16 (t,J = 5.3 Hz, 2H), 3.81 (s, 2H), 3.79 – 3.55 (m, 47H), 3.38 – 3.24 (m, 8H), 3.00 – 2.78 (m, 11H), 2.01 (s, 3H)。 [實施例10] 20kDa Y-PEG-DBCO
Figure 02_image218
向配備有特氟龍塗層磁力攪拌棒的乾燥圓-底燒瓶中添加20kDa Y-PEG-NHS(1.08g，50.0µmol，1.0eq)和PyClocK(0.033g，60.0µmol，1.2eq)。用橡膠隔片密封燒瓶並置於惰性氬氣氣氛下。添加無水CH2 Cl2 (5.0ml)，隨後添加N-甲基嗎啉(6.10μL，55.0µmol，1.1eq)並將反應溶液在室溫下攪拌30min。作為固體一次性加入DBCO-胺(0.028mg，100µmol，2.0eq)並將反應混合物在室溫下攪拌另外3h。將粗反應混合物吸入玻璃移液器並邊強烈攪拌，邊滴加至2-丙醇(100mL)中。獲得白色沉澱(PEG材料)並將所得混懸液冷卻至4℃並過濾(真空過濾)，用冰冷的2-丙醇(3×50mL)清洗。將分離的沉澱轉移至預稱重的falcon管(×2)中並溶於熱(40℃)丙酮(90mL)。將溶液在冰浴中冷卻15min以引起PEG材料沉澱。通過離心(10500rpm，20min，4℃)使混懸液沉澱成粒並小心棄去上清液。將沉澱顆粒再溶於新鮮的熱丙酮(40℃)，在冰浴中冷卻以引起沉澱並進行另一輪離心/傾倒。總計重複該過程4次。真空乾燥沉澱顆粒。分離的白色固體，質量=1.08g(99%)。RP-HPLC保留時間=6.9min。 [實施例11] mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS
Figure 02_image220
根據來自US20060293499A1和Bioconjugate Chemistry 2003, 14, 395-403的修改文獻程式，產生了實施例11 mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS。1 H NMR (300 MHz, d6 -DMSO)δ 9.14 (br, 1H), 8.56 (m, 2H), 8.25-8.17 (m, 2H), 8.04-7.97 (m, 4H), 7.44 (m, 2H), 7.33 (m, 2H), 5.77 (s, 2H), 4.69 (m, 2H), 4.46 (m, 1H), 3.51 (br, 1800H), 2.81 (s, 4H)。 HPLC：純度94.7%；GPC：純度91.2%；MALDI/GPC：21048Da。 [實施例12] mPEG2-Fmoc-Bi-20K-NHS
Figure 02_image222
根據來自US20060293499A1和Bioconjugate Chemistry 2006, 17, 341-351的修改文獻程式，產生了實施例12 mPEG2-Fmoc-Bi-20K-NHS。 [實施例13] [rIL-2的製備]
合成了如圖1所示的編碼所述多肽的IL-2基因並將其作為Ndel/Xhol片段克隆至pET2 1a(+)表達載體中。用於克隆的合成引物序列為：正向引物：5'-aatcatatggcacctacttcaagttctacaaa-3'(SEQ ID NO:4)和反向引物：5'-aatttatcaagttagtgttgagatgat-3'(SEQ ID NO：5)。通過限制性內切酶消化(Ndel和Xhol)鑒別陽性克隆並使用標準測序規程測序。
選擇陽性克隆並在大腸桿菌(E. coli )細胞(BL21 DE3)中轉化。按照用於IL-2蛋白誘導的標準程式進行。簡要地，將單個菌落接種至5ml含有100mg/ml氨苄西林的luria肉湯(LB)培養基中並在37℃，200rpm下生長過夜。將過夜培養物在含有100mg/ml氨苄西林的LB培養基中稀釋100倍並在37℃，200rpm下生長。當600nm的吸光值達到約0.8時，用1mM IPTG誘導培養物。對於誘導期，培養溫度升至42℃。誘導4小時後結束發酵。
發酵後，通過離心收穫細胞。將細胞沉澱顆粒在-80℃保存以用於之後的均質化。將冷凍的細胞沉澱顆粒在細胞清洗緩衝液(20mM Tris、1mM EDTA，pH 8.0)中再混懸至10%的濃度(W/V)並以15600×g，在4℃離心30分鐘。棄去上清液。將清洗的沉澱顆粒在均質化緩衝液(20mM Tris、0.1M NaCl、1mM EDTA、1mM PMSF、0.5% Trition-X1 00，pH 8.0)中再混懸並通過超聲波儀(來自SCIENTZ, Ningbo, Zhejiang, PRC的SCIENTZ-IID)在4-15℃均質化3次。將勻漿以15600×g，在4℃離心30分鐘。棄去上清液。將包涵體沉澱顆粒在緩衝液(20mM Tris、0.1M NaCl，2M脲、1mM EDTA，pH 8.0)清洗並以15600×g，在4℃離心30分鐘。棄去上清液。離心後，獲得粗IL-2包涵體。
將粗IL-2包涵體溶於緩衝液，6M胍、100mM Tris、2mM EDTA、5mM二硫蘇糖醇(DTT)，pH 8.0。將混合物在50℃培育30分鐘。在減少後，將水加入至所述混合物以將胍濃度降低至4.8M。在以15600×g離心1小時後，棄去所得膠狀沉澱顆粒。通過加入水將上清液中的胍濃度進一步降低至3.5M。通過100%乙酸的滴定將pH調節至5。將混合物在室溫下培育60分鐘並以15600×g離心1小時。將所得沉澱顆粒在3.5M胍、20mM乙酸鹽、5mM DTT、pH 5的緩衝液中混懸並以15600×g離心小時。再重複該清洗步驟一次。
將純淨且減少的IL-2包涵體溶於6M胍、100mM Tris pH 8緩衝液中。添加100mM CuCl2 儲液以達到0.1mM的最終Cu2+ 濃度。將混合物在4℃培育過夜。
將表達的IL-2溶液置於透滲袋(分子量孔徑3千道耳頓)中。將透滲袋置於含有4.8M胍、0.1M Tris，pH 8的緩衝液的儲罐中。在平衡3小時後，首先在15小時的一段時間內，通過將水泵入所述儲罐中將儲罐中的胍濃度緩慢降低至2M，然後通過在8小時的一段時間內，將20mM PB pH 6.0緩衝液泵入所述儲罐中將其降低至小於10mM。在4℃，完成整個複性過程。用SEC-HPLC檢查複性的IL-2。
將複性的IL-2以15600×g離心60分鐘以除去沉澱。用Mini Pellicon TFF膜系統(Millipore Corporation, USA)濃縮上清液。
將複性並濃縮的IL-2載入至裝填了SP Sepharose FF樹脂的XK柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala Sweden)。運行緩衝液為20mM PB pH 6.0並且流速為10mL/min。混合IL-2單體峰下的餾分。
通過載入至裝填了Sephadex G25樹脂的XK柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala Sweden)上對混合的SP Sepharsoe FF洗脫液脫鹽。運行緩衝液為20mM PB pH 6.0並且流速為25mL/min。混合IL-2單體峰下的餾分。
將脫鹽的IL-2單體混合物載入至裝填了Q Sepharose FF樹脂的XK柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala Sweden)。運行緩衝液為20mM PB pH 6.0並且流速為25mL/min。混合流過峰。應注意還可以使用其它適合的純化方法，如尺寸排阻色譜和疏水相互作用色譜(HIC色譜)。
在4℃和10-22psi工作壓力下，使用Mini Pellicon TFF膜系統(Millipore Corporation, USA)將IL-2單體餾分混合物濃縮至約1-2mg/mL。在4℃，將濃縮的IL-2單體溶液對最終製劑緩衝液(10mM乙酸-Na、5%海藻糖，pH 4.5)透析。通過將配製的IL-2溶液通過0.22μm篩檢程式使其無菌並將其保存在-80℃以用於今後使用。 [用於偶聯的冷凍乾燥的rIL-2的製備]
將16小瓶rIL-2(16×5mg)從-80℃加熱至室溫。向冷凍乾燥材料的每個小瓶中加入0.1% SDS水溶液(21mL)，將小瓶的內容物混合直至實現完全溶解。將rIL-2溶液通過UF/DF(Vivaspin20，5kDa MWCO PES)緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 8。將緩衝液交換的蛋白溶液無菌過濾(0.22µm PVDF)並使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量(3.19mg/mL)。 [用於偶聯的溶液-基IL-2在pH 8.0緩衝液中的製備]
根據生產商的說明，使用P100柱將IL-2(15mg，10ml)緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS。通過UF/DF(Vivaspin20，5kDa MWCO PES)濃縮IL-2溶液。將緩衝液交換的蛋白溶液無菌過濾(0.22µm PVDF)並使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量(分別為2.67或2.5或3.0mg/mL)。 [用於偶聯的溶液-基IL-2在pH 9.0緩衝液中的製備]
根據生產商的說明，使用P100柱將IL-2(15mg，10ml)緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS。通過UF/DF(Vivaspin20，5kDa MWCO PES)濃縮IL-2溶液。將緩衝液交換的蛋白溶液無菌過濾(0.22µm PVDF)並使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量(2.9mg/mL)。 [實施例14]
Figure 02_image224
rIL-2通過NHS偶聯至實施例1。 ([rIL-2]-[F-Ph-SO2 -N3 ]z 的產生)
在偶聯前，用100mM硼酸鈉，pH 8將IL-2稀釋至3.09mg/ml。
將化合物8(4.4mg)溶於DMF(0.885ml)以提供4.97mg/mL的試劑溶液。向rIL-2(10mg，3.24ml)小瓶中添加化合物8(1.79mg，360μL，6eq.)，將反應混合並在22℃培育1h。在1h，通過LC-MS分析反應以確定官能化的IL-2形式作為[rIL-2]-[F-Ph-SO2 -N3 ]z 的分佈。
圖2顯示通過LC-MS確定，[rIL-2]-[F-Ph-SO2 -N3 ]z 的分佈集中在6周圍。 [實施例15]
Figure 02_image226
通過20kDa Y-PEG-DBCO對[rIL-2]-[F-Ph-SO2 -N3 ]z 的點擊-PEG化。
將20kDa Y-PEG-DBCO(143.7mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8(1.419ml)。向[rIL-2]-[F-Ph-SO2 -N3 ]z 實施例14(9.5mg，3.42ml)的溶液中添加20kDa Y-PEG-DBCO(134mg，1.33ml，10eq.)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物。使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
使用DirectDetect儀，通過IR定量樣品(8.8mg，92%得率)。通過SDS-PAGE確定PEG:IL-2比。
圖3顯示了PEG:IL-2比等於4.9的[20K mPEG-(F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2]偶聯物的SDS-分析。 [實施例16]
Figure 02_image228
rIL-2通過NHS偶聯至實施例2。 ([rIL-2]-[CF3 -Ph-SO2 -N3 ]z 的產生)
在偶聯前，用100mM硼酸鈉，pH 8將IL-2稀釋至3.09mg/ml。
將化合物13(7.5mg)溶於DMF(0.816mL)以提供9.19mg/mL的試劑溶液。向rIL-2(10mg，3.24ml)小瓶中添加化合物13(3.31mg，360μL，10eq.)，將反應混合並在22℃培育1h。在1h，通過LC-MS分析反應以確定官能化的IL-2形式作為[rIL-2]-[CF3 -Ph-SO2 -N3 ]z 的分佈。
圖1顯示通過LC-MS確定，[rIL-2]-[CF3 -Ph-SO2 -N3 ]z 的分佈的形成集中在6周圍。 [實施例17]
Figure 02_image230
通過20kDa Y-PEG-DBCO對[rIL-2]-[CF3 -Ph-SO2 -N3 ]z 的點擊-PEG化。
將20kDa Y-PEG-DBCO(210.9mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8(1.388mL)。向[rIL-2]-[CF3 -Ph-SO2 -N3 ]z 實施例16(9.7mg，3.49mL)的溶液中添加20kDa Y-PEG-DBCO(207mg，1.36mL，15eq.)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物。使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
使用DirectDetect儀，通過IR定量樣品(7.9mg，81%得率)。通過SDS-PAGE確定PEG:IL-2比。
圖3顯示了PEG:IL-2比等於5.4的[20K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2]偶聯物的SDS-分析。 [實施例18]
Figure 02_image232
rIL-2通過NHS偶聯至實施例3。 ( [rIL-2]-[Cl-Ph-SO2 -N3 ]z 的產生)
在綴合前，用100mM硼酸鈉，pH 8將IL-2稀釋至3.09mg/ml。將化合物18(5.0mg)溶於DMF(0.971mL)以提供5.15mg/mL的試劑溶液。向rIL-2(10mg，3.24ml)小瓶中添加化合物18(1.85mg，360μL，6eq.)，將反應混合並在22℃培育1h。在1h，通過LC-MS分析反應以確定官能化的IL-2形式作為[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2 -N3 ]z 的分佈。
圖1顯示通過LC-MS確定，[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2 -N3 ]z 的分佈的形成集中在5周圍。 [實施例19]
Figure 02_image234
通過20kDa Y-PEG-DBCO對[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2 -N3 ]z 的點擊-PEG化。
將20kDa Y-PEG-DBCO(213.2mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8(1.403mL)。向[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2 -N3 ]z 實施例18(9.7mg，3.49mL)的溶液中添加20kDa Y-PEG-DBCO(207mg，1.36mL，15eq.)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物。使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
使用DirectDetect儀，通過IR定量樣品(8.2mg，84%)。通過SDS-PAGE確定PEG:IL-2比。
圖3顯示了PEG:IL-2比等於4.9的[20K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2]偶聯物的SDS-分析。 [實施例20]
Figure 02_image236
rIL-2通過NHS偶聯至實施例4和通過20kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例4(5.8mg)溶於DMF(0.677mL)以提供8.57mg/mL的試劑溶液。向rIL-2(7mg，0.458μmol，2.265mL)小瓶中添加實施例4(2.16mg，4.55μmol，252μL，10eq.)，將反應混合並在22℃培育1h。1h後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將20kDa Y-PEG-DBCO(406.4mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8(2.00mL)以提供203mg/mL溶液。向[rIL-2]-[F,F-Ph-SO2 -N3 ]z (7.0mg，0.458μmol，2.52mL)中添加20kDa Y-PEG-DBCO(199mg，9.15μmol，0.98mL，20eq.)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。作為[20K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例20(5.2mg，74%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於4.8。 [實施例21]
Figure 02_image238
rIL-2通過NHS偶聯至實施例5和通過20kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例5(4.5mg)溶於DMF(0.528mL)以提供8.52mg/mL的試劑溶液。向rIL-2(7mg，0.458μmol，2.265mL)小瓶中添加實施例5(2.15mg，4.10μmol，252μL，9eq.)，將反應混合並在22℃培育1h。1h後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將20kDa Y-PEG-DBCO(406.4mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8(2.00mL)以提供203mg/mL溶液。向[rIL-2]-[F,CF3 -Ph-SO2 -N3 ]z (7.0mg，0.458μmol，2.52mL)中添加20kDa Y-PEG-DBCO(199mg，9.15μmol，0.98ml，20eq.)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。作為[20K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例21(2.9mg，41%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於4.5。 [實施例22]
Figure 02_image240
rIL-2通過NHS偶聯至實施例6和通過10kDa PEG-DBCO的點擊-PEG化。
在偶聯前，用100mM硼酸鈉，pH 8將IL-2稀釋至3.09mg/ml。將化合物24(16.5mg)溶於DMF(1.107mL)以提供14.9mg/mL的試劑溶液。向rIL-2(10mg，3.24ml)小瓶中添加化合物24(5.96mg，400μL，11eq.)，將反應混合並在22℃培育1h。在1h，通過LC-MS分析反應以確定官能化的IL-2形式作為[rIL-2]-[Fmoc-(N3 )2 ]z 的分佈。
將10kDa PEG-DBCO(Iris Biotech，276.3mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8(1.439ml)。向[rIL-2]-[Fmoc-(N3 )2 ]z (10mg，3.64mL)的溶液中添加10kDa PEG-DBCO(262mg，1.36mL，40eq.)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物。使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
使用DirectDetect儀，通過IR定量樣品。通過SDS-PAGE確定PEG:IL-2比。
圖3顯示了偶聯物[mPEG2 -T2 -Fmoc-20K]z -[rIL-2]的SDS-分析，其PEG:IL-2比等於4.9。 [實施例23]
Figure 02_image242
rIL-2通過NHS偶聯至實施例9和通過10kDa PEG-DBCO的點擊-PEG化。
以與實施例14和15類似的製備程式，使用實施例9，作為[mPEG2 -T2 -Fmoc-Bi-20K]z -[rIL-2]製備實施例23。 [實施例24]
Figure 02_image244
通過實施例11對rIL-2的PEG化。
在偶聯前，用100mM硼酸鈉，pH 8將IL-2稀釋至1.5mg/ml。將mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS實施例11溶於100mM硼酸鈉，pH 8，並將其以足以達到100:1的mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS比rIL-2的莫耳比的量添加至rIL-2(10mg)。使偶聯反應在22℃進行1小時以提供[mPEG2-Fmoc-Bn-20K]z -[rIL-2]偶聯物。使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
使用DirectDetect儀，通過IR定量[mPEG2-Fmoc-Bn-20K]z -[rIL-2]。通過SDS-PAGE確定PEG:IL-2比。 [實施例25]
Figure 02_image246
通過實施例12對rIL-2的PEG化。
使用實施例24的類似PEG化和純化條件，通過實施例12 mPEG2-Fmoc-Bi-20K-NHS的rIL-2的PEG化產生了[mPEG2-Fmoc-Bi-20K]z -[rIL-2]偶聯物。 [實施例26]
Figure 02_image248
通過10kDa PEG雙(碸)45對rIL-2二硫鍵的PEG化
Figure 02_image250
向r-IL-2(4.2mg，0.25mg/ml)在100mM硼酸鈉緩衝液，pH 8中的溶液中添加10mM DTT。將溶液在22℃培育1小時。使用含有20mM EDTA的100mM硼酸鈉緩衝液，pH 8，通過凝膠過濾除去過量DTT。向減少的蛋白溶液中添加1.3eq 10kDa PEG雙(碸)45 ，0.05% w/v SDS，並使溶液在22℃反應16h。將反應溶液通過Vivapure Q Mani H篩檢程式過濾以除去SDS。然後，使用5kDa MWCO離心篩檢程式，通過超濾使其緩衝液-交換為50mM乙酸鈉，pH 4.0。然後，將所述溶液載入至5mL MacroCapSP樹脂柱。通過0-1M氯化鈉在50mM乙酸鈉緩衝液，pH 4中的線性梯度，從柱上洗脫偶聯物。通過尺寸排阻色譜(SEC)進一步分離偶聯物以產生1.4mg產物。通過SDS-PAGE確定的純度：97%。通過分析SEC確定的純度：87.3%。 [實施例27] 通過PEG試劑46對rIL-2的PEG化
Figure 02_image252
在2mM HCl(3.702mL)中製備405mg/mL PEG試劑46 (1.50g)溶液。向rIL-2(10mg，3.135ml)中添加405mg/ml PEG試劑46 (1.43g，3.535ml，100eq.)。將反應混合並在22℃培育。1h後，通過SDS-PAGE分析粗反應並通過SEC純化。使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱，通過SEC純化粗IL-2-(PEG)z 產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。使用DirectDetect儀，通過IR定量蛋白濃度(6.6mg，66%)並通過SDS-PAGE確定PEG:IL-2的比。偶聯物[mPEG2 -Fmoc-20K]z -[rIL-2]的SDS-分析顯示PEG:IL-2的比等於5.1。 [實施例28] 1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(52)
Figure 02_image254
[N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-(甲基磺醯基)苯甲醯胺(48)的製備]
向化合物47(1.0g，5.0mmol)在DMF(15ml)中的溶液中添加化合物22(1.3g，6.0mmol)、HATU(2.47g，6.5mmol)和TEA(1.01g，10.0mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌16h。濃縮反應混合物並用乙酸乙酯和水溶解。用乙酸乙酯萃取混合物(3×20mL)。用鹽水清洗合併的有機物，用硫酸鈉乾燥，過濾並通過旋轉蒸發濃縮。通過柱色譜法純化所得殘餘物以提供黃色油狀的化合物48(900mg)。 [N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-((2-羥基-5-甲氧基戊基)磺醯基)苯甲醯胺(50)的製備]
在-78℃，在N2 下，向化合物48(400mg，1mmol)和化合物49(560mg，5.5mmol)在無水THF(30ml)中的溶液中緩慢添加KHMDS(5.5ml，5.5mmol)。將反應混合物在-78℃攪拌2h。通過飽和NH4 Cl水溶液使反應混合物淬滅。用乙酸乙酯萃取混合物(3×20mL)。用鹽水清洗合併的有機物，用硫酸鈉乾燥，過濾並通過旋轉蒸發濃縮。通過2% CH3 OH在CH2 Cl2 中的溶液洗脫，通過柱色譜法純化所得殘餘物以提供黃色油狀的化合物50(168mg)。 [1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-氨基甲醯基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(51)的製備]：
向化合物50(100mg，0.2mmol)和三光氣(89mg，0.3mmol)在無水THF(5ml)中的溶液中緩慢添加吡啶(64mg，0.8mmol)。將反應混合物在rt.攪拌20min。然後，將其通過旋轉蒸發過濾並濃縮。在下一步中使用所得殘餘物。
向所得殘餘物(117mg，0.2mmol)和HOSu(69mg，0.6mmol)在無水THF(5mL)中的溶液中緩慢添加吡啶(64mg，0.8mmol)。在RT下攪拌反應混合物30min。用乙酸乙酯萃取混合物(3×10mL)。用鹽水清洗合併的有機物，用硫酸鈉乾燥，過濾並通過旋轉蒸發濃縮。通過製備-TLC純化所得殘餘物(CH2 Cl2 ：CH3 OH=30：1)以提供無色油狀的化合物51(55mg)。
LCMS：m/z 644.25 [M+1]。
1 H NMR (400 MHz, CDCl3 )δ 8.32 (s, 1H), 8.18 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 8.04 (d,J = 7.7 Hz, 1H), 7.68 (t,J = 8.0 Hz, 1H), 7.37 (br s, 1H), 5.30 – 5.24 (m, 1H), 3.77 – 3.55 (m, 15H), 3.45 – 3.31 (m, 5H), 3.27 (s, 3H), 2.81 (s, 4H), 1.94 – 1.78 (m, 2H), 1.66 – 1.58 (m, 2H)。 [實施例29] 1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(61)
Figure 02_image256
[甲基5-((4-甲氧苯甲基)硫基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯(54)的製備]
將化合物52(5.0g，17.66mmol，1.0eq)、化合物53(4.09g，26.5mmol，1.5eq)、Pd2 (dba)3 (1.62g，1.76mmol，0.1eq)、Xant-phose(2.04g，3.52mmol，0.2eq)和DIEA(6.84g，52.99mol，3.0eq)在二噁烷(50mL)中的溶液在80℃攪拌2hr。將所得混合物冷卻至rt並通過矽藻土墊過濾。濃縮濾液並將殘餘物溶於EtOAc(100mL)。用水(100mL)清洗混合物並用EtOAc(100ml×3)萃取，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上純化殘餘物(PE/EA=100/1至80/1至50/1)以提供淡黃色油狀的化合物54(6.2g，98%)。
TLC：PE/EA=10/1，UV，Rf (化合物52)=0.80，Rf (化合物54)=0.60。
LC-MS：379.10 [M+23]+ 。 [甲基5-巰基-2-(三氟甲基)苯甲酸酯(55)的製備]
通過微波，在120℃運行化合物54(1.0g，2.80mmol，1.0eq)和TES(0.98g，8.42mmol，3.0eq)在TFA(15ml)中的溶液1hr。將所得混合物減壓濃縮。將殘餘物倒入冰-水(20mL)中並通過碳酸氫鈉水溶液將混合物調節至pH=7～8。通過EtOAc(30mL×3)萃取混合物，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供灰色油狀的化合物55(800mg)，將其直接在下一步中使用而未進一步純化。
TLC：PE/EA=5:1，UV，Rf (化合物54)=0.80，Rf (化合物55)=0.30。 [甲基5-(甲硫基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯(56)的製備]
在0℃，向化合物55(4.8g，20.32mmol，1.0eq)在MeCN(50mL)中的溶液中滴加K2 CO3 (8.5g，60.96mmol，3.0eq)和CH3 I(14.4g，101.6mmol，5.0eq)。將反應混合物在室溫下攪拌16hr。向所得混合物加入水並通過EtOAc(50mL×3)萃取，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠(PE)上純化殘餘物以提供黃色固體狀的化合物56(4.0g，78%)。
TLC：PE/EA=5:1，UV，Rf (化合物55)=0.30，Rf (化合物56)=0.85。
LC-MS：251.00 [M+1]+ 。 [甲基5-(甲基磺醯基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯(57)的製備]
在0℃，向化合物56(4.7g，18.78mmol，1.0eq)在DCM(50mL)中的溶液中分部分添加m-CPBA(19.5g，112.68mmol，6.0eq)。將反應混合物在室溫下攪拌16hr。通過碳酸氫鈉溶液使反應混合物淬滅。通過DCM(50mL×3)萃取混合物，用NaCl溶液(100mL×3)清洗，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上純化殘餘物(PE/EA=100/1至50/1至20/1至10/1)以提供白色固體狀的化合物57(2.97g，56%)。
TLC：PE/EA=5:1，UV，Rf (化合物56)=0.85，Rf (化合物57)=0.10。 [甲基5-((2-羥基-5-甲氧基戊基)磺醯基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯(58)的製備]
在-78℃，向化合物57(0.9g，3.543mmol，1.0eq)和4-甲氧基丁醛(0.724mg，7.086mmol，2.0eq)在THF(10ml)中的溶液中滴加KHMDS(5.4ml，5.315mmol，1.5eq)，將反應混合物在-78℃攪拌2小時。在0℃，通過NH4 Cl水溶液使反應淬滅，並通過EtOAc(30ml×3)萃取。用飽和NaCl溶液(100mL×3)清洗有機相，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上純化殘餘物(PE/EA=20/1至5/1至2/1)以提供黃色油狀的化合物58(520mg，40%)。
TLC：PE/EA=2:1，UV，Rf (化合物57)=0.60，Rf (化合物58)=0.20。
LC-MS：385.10 [M+1]+ 。 [5-((2-羥基-5-甲氧基戊基)磺醯基)-2-(三氟甲基)苯甲酸(59)的製備]
在0℃，向化合物58(510mg，1.327mmol，1.0eq)在MeOH/THF=1/1(6ml)中的溶液中滴加5% LiOH(63.6mg，2.654mmol，2.0eq)。將反應混合物在室溫下攪拌2hr。用1N HCl將反應混合物調節至pH 2。通過EtOAc(20ml×3)萃取混合物，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供黃色油狀的化合物59(505mg，粗產物，100%)。
LC-MS：393.10 [M+23]+ 。 [N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((2-羥基-5-甲氧基戊基)磺醯基)-2-(三氟甲基)苯甲醯胺(60)的製備]
將化合物59(1.0g，3.24mmol，1.0eq)、化合物22(0.849g，3.89mmol，1.2eq)、HATU(1.6g，4.21mmol，1.3eq)和TEA(0.982g，9.72mol，3.0eq)在DMF(12ml)中的溶液在室溫下攪拌16hr。向反應混合物加入水(50mL)並通過乙酸乙酯萃取(30ml×3)。用NaCl的水溶液(50mL×3)清洗有機相，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上(PE/EA=20/1至10/1至5/1至2/1至1/1)並通過製備-TLC純化殘餘物以提供淡黃色油狀的化合物60(520mg，34%)。
LC-MS：571.35 [M+1]+ 。 [1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(61)的製備]
在0℃，向化合物60(0.3g，0.5258mmol，1.0eq)在THF(3ml)中的溶液中分部分添加吡啶(0.166g，2.103mmol，4.0eq)和三光氣(0.39g，1.3145mmol，2.5eq)。將混合物在室溫下攪拌30min。將反應混合物過濾並減壓濃縮。將殘餘物溶於THF(3mL)。在0℃，向混合物分部分添加吡啶(0.166g，2.103mmol，4.0eq)和HOSU(0.182g，1.5774mmol，3.0eq)。將混合物在rt攪拌1hr。在0℃，用水使反應混合物淬滅，並通過EtOAc(20mL×3)萃取。用Na2 SO4 乾燥有機相，過濾並減壓濃縮。通過製備-HPLC(0.1% HCOOH)純化殘餘物。用EtOAc萃取洗脫溶液。用Na2 SO4 乾燥有機相，過濾並減壓濃縮以提供無色油狀的化合物61(150mg，40%)。
LC-MS：712.35[M+1]+ 。
1 H NMR (400 MHz, CDCl3 )δ 8.11 (d,J = 9.5 Hz, 2H), 7.94 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 6.94 (s, 1H), 5.31 (d,J = 6.9 Hz, 1H), 3.65 (d,J = 6.3 Hz, 8H), 3.59 (q,J = 5.0 Hz, 6H), 3.36 (dt,J = 18.4, 5.4 Hz, 4H), 3.29 (d,J = 1.0 Hz, 3H), 2.83 (s, 4H), 1.90 (q,J = 7.2 Hz, 2H), 1.65 (d,J = 8.5 Hz, 2H)。 [實施例30] 1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-4-氯苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(68)
Figure 02_image258
[甲基2-氯-5-(甲硫基)苯甲酸酯(63)的製備]
在室溫下，向化合物62(10.0g，49.53mmol，1.0eq)、CH3 I(7.73g，54.48mmol，1.1eq)的溶液中添加K2 CO3 (7.5g，54.48mmol，1.1eq)。將反應混合物在rt下攪拌3hr。向所得混合物中加入水(200mL)和EtOAc(200mL)。分離有機層，用5% LiCl水溶液清洗5次，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供黃色油狀的化合物63(11.0g，粗產物)。
TLC：PE/EA=3/1，UV，Rf (化合物62)=0.05，Rf (化合物63)=0.85。
1 HNMR (400 MHz, CD3 OD)δ 7.61 (d,J = 2.3 Hz, 1H), 7.44 – 7.32 (m, 2H), 3.88 (s, 3H), 2.48 (s, 3H)。 [甲基2-氯-5-(甲基磺醯基)苯甲酸酯(64)的製備]
在0℃，向化合物63(6.0g，27.78mmol，1.0eq)在DCM(60mL)中的溶液中分部分添加m-CPBA(28.7g，166.67mmol，6.0eq)。將反應混合物在室溫下攪拌16hr。通過碳酸氫鈉水溶液使反應混合物淬滅，用DCM萃取(100mL×3)，用NaCl水溶液(100mL×3)清洗，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上(PE/EA=40/1至20/1至3/1)純化殘餘物以提供白色固體狀的化合物64(5.6g，81%)。
TLC：PE/EA=3/1，UV，Rf (化合物63)=0.85，Rf (化合物64)=0.45。
1 HNMR (CD3 OD, 400 MHz)δ 8.39 (d,J = 2.4 Hz, 1H), 7.96 (dd,J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.66 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.07 (s, 3H)。 [2-氯-5-(甲基磺醯基)苯甲酸(65)的製備]
在0℃，向化合物64(2.5g，1.327mmol，1.0eq)在MeOH/THF=1/1(6ml)中的溶液中滴加5% LiOH水溶液(63.6mg，2.654mmol，2.0eq)。將反應混合物在室溫下攪拌2hr。用1N HCl將反應調節至pH=3-4，濃縮。通過EtOAc(20ml×3)萃取水相，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供淡黃色固體狀的化合物65(2.1g，粗產物)。
TLC：PE/EA=3:1，UV，Rf (化合物64)=0.45，Rf (化合物65)=0.05。
1 HNMR (CD3 OD, 400 MHz)δ 8.36 (d,J = 2.3 Hz, 1H), 8.02 (dd,J = 8.4, 2.3 Hz, 1H), 7.76 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 3.15 (s, 3H)。 [N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-氯-5-(甲基磺醯基)苯甲醯胺(66)的製備]
將化合物65(879mg，3.74mmol，1.0eq)、化合物22(900mg，4.12mmol，1.1eq)、HATU(1.85g，4.87mmol，1.3eq)和TEA(1.14g，11.24mol，3.0eq)在DMF(8ml)中的混懸液在室溫下攪拌16hr。向反應混合物加入水(20mL)並通過乙酸乙酯(30mL×3)萃取，用NaCl水溶液(50mL×3)清洗，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上(PE/EA=100/1至10/1至5/1至2/1至1/1)純化殘餘物以提供無色油狀的化合物66(995mg，61%)。
TLC：PE/EA=0:1，UV，Rf (化合物65)=0.25，Rf (化合物66)=0.55。
1 HNMR (CD3 OD, 400 MHz)δ 8.04–7.96 (m, 2H), 7.73 (d,J = 8.3 Hz, 1H), 3.70–3.53 (m, 14H), 3.33 (s, 2H), 3.15 (s, 3H)。 [N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-氯-5-((2-羥基-5-甲氧基戊基)磺醯基)苯甲醯胺(67)的製備]
在-78℃，向化合物66(700mg，1.609mmol，1.0eq)和4-甲氧基丁醛(657mg，6.44mmol，4.0eq)在THF(7ml)中的溶液中滴加KHMDS(5.4ml，5.315mmol，1.5eq)。
將反應混合物在-78℃下攪拌2hr。在0℃，通過NH4 Cl水溶液使反應淬滅，通過乙酸乙酯(30mL×3)萃取，用NaCl水溶液(100mL×3)清洗，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上(PE/EA=20/1至5/1至2/1)純化殘餘物以提供淡黃色油狀的化合物67(205mg，25%)。
TLC：PE/EA=0:1，UV，Rf (化合物66)=0.55，Rf (化合物67)=0.50。
1 HNMR (CD3 OD, 400 MHz)δ 8.01–7.92 (m, 2H), 7.71 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 4.16–4.01 (m, 2H), 3.72–3.53 (m, 12H), 3.42–3.35 (m, 3H), 3.31–3.25 (m, 5H), 1.73–1.39 (m, 4H)。 [1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-4-氯苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(68)的製備]
在0℃，向化合物67(200mg，0.372mmol，1.0eq)在THF(2mL)中的溶液中分部分添加吡啶(117.5mg，1.49mmol，4.0eq)和三光氣(221mg，0.744mmol，2.0eq)。將混合物在室溫下攪拌30min。將反應混合物過濾並減壓濃縮。將殘餘物溶於THF(3mL)。在0℃，向混合物分部分添加吡啶(117.5mg，1.49mmol，4.0eq)和HOSU(128mg，1.12mmol，3.0eq)。將混合物在室溫下攪拌1hr。在0℃，通過水淬滅反應混合物，通過乙酸乙酯(20mL×3)萃取，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮。通過製備-HPLC(0.1% HCOOH)純化殘餘物並通過乙酸乙酯萃取，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供淺黃色油狀的化合物68(101mg，27%)。
TLC：PE/EA=0/1，UV，Rf (化合物67)=0.50，Rf (化合物68)=0.55。
LC-MS：678.25 [M+1]+ 。
1 HNMR (400 MHz, CDCl3 )δ 8.09 (s, 1H), 7.94–7.86 (m, 1H), 7.64 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.00 (s, 1H), 5.29 (s, 1H), 3.74–3.52 (m, 15H), 3.44–3.31 (m, 5H), 3.28 (s, 3H), 2.82 (s, 4H), 1.87 (d,J = 7.4 Hz, 2H), 1.61 (s, 2H)。 [實施例31] 7-((3-(2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-哢唑-9-基)丙基)氨基)-7-氧-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(82)
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Figure 02_image264
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[叔丁基6-羥基己酸酯(70)的製備]
對化合物69(100g，876mmol)和t-BuOK(108g，964mmol)在t-BuOH(600ml)中的混合物脫氣並用N2 吹掃3次，然後將混合物在120℃，在N2 氣氛下攪拌2.5hr。TLC(板1，二氯甲烷/甲醇=10/1，化合物69，Rf =0.60，化合物70，Rf =0.50)表明化合物69完全消耗並且形成一個新斑點。根據TLC，反應是純淨的。將反應混合物在二氯甲烷(600mL)和水(1.20L)之間分配。分離有機相，用鹽水清洗(300ml)，用無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物以提供黃色油狀的化合物70(127g，77.2%得率)並將其在未進一步純化的情況下在下一步中使用。
1 H NMR (400 MHz, CDCl3 )δ ppm 3.66-3.63 (m, 2H), 2.25-2.21 (m, 2H), 1.66-1.57 (m, 5H), 1.44 (s, 9H), 1.40-1.39 (m, 2H)。 [叔丁基6-氧己酸酯(71)的製備]
向化合物70(64.0g，340mmol)在DCM(400ml)中的溶液中添加Dess-Martin試劑(159g，374mmol，116ml)。將混合物在20℃攪拌2hr。TLC(板1，石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物70 Rf =0.40，化合物71 Rf =0.50)表明化合物70完全消耗。通過添加NaHCO3 水溶液(200mL)使反應混合物淬滅並用DCM萃取(100mL×3)。用鹽水(100mL)清洗合併的有機層，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過柱色譜法(SiO2 ，石油醚/乙酸乙酯=10/1至1/1，板2，石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物71 Rf =0.50)純化殘餘物以提供黃色油狀的化合物71(26.8g，42.3%得率)。
1 H NMR: (400 MHz CDCl3 )δ ppm 2.44-2.21 (m, 4H), 1.65-1.60 (m, 4H), 1.43 (s, 9H)。 [叔丁基6-羥基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚酸酯(72)的製備]
向化合物11(7.15g，31.9mmol)在THF(30.0ml)中的溶液中滴加n-BuLi(2.5M，11.60ml)，將混合物在0℃攪拌30min。然後，在-78℃添加化合物71(5.40g，29.0mmol)在THF(5.00ml)中的溶液。將混合物在-78℃攪拌1.5hr。TLC(板1，石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物71 Rf =0.70，化合物72 Rf =0.40)表明化合物71完全消耗。通過添加NH4 Cl水溶液(50.0mL)使反應混合物淬滅，然後用EtOAc萃取(20.0mL×3)。用鹽水(30.0mL)清洗合併的有機層，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過柱色譜法(SiO2 ，石油醚/乙酸乙酯=30/1至1/1，板2，石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物72 Rf =0.40)純化殘餘物以提供黃色固體狀的化合物72(8.57g，72.0%得率)。
1H NMR: (400 MHz CDCl3 )δ ppm 8.10-8.08 (d,J = 8.4Hz, 2H), 7.88-7.86 (d,J = 8Hz, 2H), 4.21-4.20 (m, 1H), 3.31-3.16 (m, 3H), 2.23-2.18 (m, 2H), 1.61-1.35 (m, 15H)。 [6-羥基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚酸(73)的製備]
將化合物72(1.00g，2.44mmol)加入到微波管中的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(15.0ml)中。將密封管在微波下在110℃加熱1hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物72：Rf =0.5，化合物73：Rf =0.2)表明化合物72完全消耗。減壓濃縮該反應混合物以提供殘餘物。將粗產物直接用於下一步而未純化以提供黃色膠狀的化合物73(0.860g，2.43mmol，99.6%得率)。
1H NMR: (400 MHz DMSO)δ ppm 11.93 (s, 1H), 8.00-8.13 (m, 4H), 5.11-5.17 (m, 1H), 4.85 (d,J = 5.2 Hz, 1H), 3.90 (s, 1H), 3.43-3.48 (m, 2H), 2.16 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 1.33-1.46 (m, 6H)。 [二甲基2-硝基-[1,1'-聯苯]-4,4'-二羧酸酯(75)的製備]
將化合物74(33.0g，122mmol)在H2 SO4 (330ml)中的溶液冷卻至-5℃，並且在1hr的一段時間內，在攪拌下滴加HNO3 (13.8g，127mmol，9.85ml，58%的純度)和H2 SO4 (22.8g，232mmol，12.4mL)的混合物，同時將溫度維持在-5-0℃。然後，將混合物在-5-0℃攪拌1hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯=3/1，產物Rf =0.50)顯示化合物74(Rf =0.60)被消耗，形成了具有更大極性的主要的新斑點。用水(300mL)稀釋混合物，並用乙酸乙酯(50.0mL×2)萃取。用鹽水(50.0mL)和碳酸氫鈉溶液(100mL)清洗萃取物，用無水硫酸鈉乾燥並蒸發。通過柱色譜法(SiO2 ，石油醚/乙酸乙酯=50/1至0/1)純化殘餘物以提供白色固體狀的化合物75(16.0g，50.6mmol，41.4%得率，99.6%純度)。
1 H NMR: (400 MHz, CDCl3 )δ 8.57 (s, 1H), 8.31 - 8.29 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 8.14 - 8.12 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 7.56 - 7.54 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.42 - 7.40 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.96 (s, 3H)。 [二甲基9H-哢唑-2,7-二羧酸酯(76)的製備]
將化合物75(20g，63.4mmol)、PPh3 (41.6g，159mmol)在1,2-二氯苯(112ml)中的混合物在25℃脫氣並用N2 吹掃3次，然後將混合物在210℃，在N2 氣氛下攪拌1.5hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物75： Rf =0.43)顯示化合物75完全消耗並且形成了一個新的主要斑點。根據TLC，反應是純淨的。將反應冷卻至25℃，添加甲醇(200mL)。15min後，通過過濾收集所得固體混懸液以提供作為灰色固體獲得的化合物76(12.0g，42.4mmol，66.8%得率)。
1 H NMR: (400 MHz, DMSO)δ 11.81 (s, 1H), 8.33 (d,J = 4.2 Hz, 2H), 8.17 (s, 2H), 7.82 (d,J = 7.6 Hz, 2H), 3.91 (s, 6H)。 [二甲基9-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)-9H-哢唑-2,7-二羧酸酯(77)的製備]
在0℃，向NaH(2.30g，57.6mmol，60%純度)在DMF(80.0ml)中的溶液中添加化合物76(13.6g，48.0mmol)。將混合物在0℃攪拌1hr，然後添加叔丁基N-(3-溴丙基)氨基甲酸酯(22.9g，96.0mmol)，將混合物在40℃攪拌3hr。TLC(石油醚/乙酸乙酯=5/1，化合物76：Rf =0.2，產物：Rf =0.7)表明化合物76完全消耗。用NH4 Cl(100mL)水溶液稀釋反應混合物並用EtOAc萃取(150mL×2)。用鹽水(100mL)清洗合併的有機層，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過柱色譜法(SiO2 ，石油醚/乙酸乙酯=10/1至1/1)純化殘餘物以提供黃色固體狀的化合物77(16.4g，37.2mmol，77.6%得率)。
1 HNMR：(400 MHz, DMSO)δ 8.36 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 8.31 (s, 2H), 7.80 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 7.03 (t,J = 4.8 Hz, 1H), 4.56 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 3.74 (s, 6H), 2.99-3.00 (m, 2H), 1.87-1.98 (m, 2H), 1.22-1.36 (m, 9H)。 [9-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)-9H-哢唑-2,7-二羧酸(78)的製備]
對化合物77(8.00g，18.2mmol)和NaOH(2.18g，54.5mmol)在THF(30.0mL)、MeOH(30.0mL)和H2 O(10.0mL)中的混合物脫氣並用N2 吹掃3次，然後將混合物在80℃，在N2 氣氛下攪拌12hr。TLC(二氯甲烷/甲醇=10/1，化合物77：Rf =0.8)表明化合物77完全消耗。將反應混合物小心倒入100ml冰-水，並用1N HCl稀釋至pH=4。過濾反應混合物並用20.0mL水清洗濾餅，真空乾燥。將粗產物直接用於下一步而無需進一步純化以提供淺黃色固體狀的化合物78(5.00g，12.1mmol，66.8%得率)。
1 HNMR：(400 MHz, CDCl3 )δ 13.01 (s, 2H), 8.34 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 8.25 (s, 2H), 7.85 (q,J = 8.0 Hz, 2H), 4.56 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 2.97-3.00 (m, 2H), 1.89-1.99 (m, 2H), 1.37 (m, 8H)。 [叔丁基(3-(2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-哢唑-9-基)丙基)氨基甲酸酯(79)的製備]
向化合物78(5.00g，12.1mmol)在DMF(50.0ml)中的溶液中添加HATU(11.5g，30.3mmol)和DIPEA(6.27g，48.5mmol)以及2-[2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙胺(5.29g，24.3mmol)。將混合物在15℃攪拌3hr。LC-MS顯示出具有所期望的檢測MS的一個新的峰(化合物79：Rt=0.752min)。用水(90.0mL)稀釋反應混合物並用2-Me-THF(50.0mL×2)萃取。用水(50.0mL)清洗合併的有機層，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過反相HPLC(0.1% NH4 HCO3 條件)純化粗產物以提供白色固體狀的化合物79(4.00g，4.92mmol，40.6%得率)。
1 HNMR：(400 MHz, DMSO)δ 8.68 (t,J = 5.2 Hz, 2H), 8.31 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 8.19 (s, 2H), 7.79 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 7.03 (t,J = 4.8 Hz, 2H), 4.53 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 3.54-3.65 (m, 26H), 3.40-3.41 (m, 4H), 3.38-3.40 (m, 2H), 3.03-3.05 (m, 2H), 1.99-2.02 (m, 2H), 1.40 (s, 9H)。 [9-(3-氨基丙基)-N2,N7-雙(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9H-哢唑-2,7-二甲醯胺(80)的製備]
向化合物79(3.00g，3.69mmol)在DCM(25.0mL)中的溶液中添加HCl/MeOH(5.00mL)。將混合物在15℃攪拌1hr。TLC(二氯甲烷/甲醇=10/1，化合物79：Rf =0.6，化合物80：Rf =0.05)表明化合物79完全消耗。減壓濃縮該反應混合物以提供殘餘物。將粗產物直接用於下一步而無需進一步純化以提供黃色固體狀的化合物80(2.70g，3.60mmol，97.7%得率，HCl鹽)。
1 HNMR：(400 MHz, DMSO)δ 8.78 (t,J = 5.6 Hz, 2H), 8.36 (s, 2H), 8.27 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 8.05 (s, 3H), 7.77 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 4.63 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 3.65-3.60 (m, 17H), 3.50-3.56 (m, 5H), 3.36-3.37 (m, 5H), 2.88-2.91 (m, 2H), 2.14-2.18 (m, 2H)。 [N2,N7-雙(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9-(3-(6-羥基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚醯胺基)丙基)-9H-哢唑-2,7-二甲醯胺(81)的製備]
對化合物80(1.80g，2.40mmol，HCl)，化合物73(851mg，2.40mmol)、HOBt(487mg，3.60mmol)、EDCI(691mg，3.60mmol)和Et3 N(2.19g，21.6mmol)在DCM(15.0ml)中的混合物脫氣並用N2 吹掃3次，然後將混合物在25℃，在N2 氣氛下攪拌2hr。LC-MS顯示出具有所期望的檢測MS的一個新的峰(化合物81：Rt=1.21min)。用水(30.0mL)稀釋反應混合物並用EtOAc(20.0mL×3)萃取。用鹽水(30.0mL)清洗合併的有機層，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC(柱：Xtimate C18 10u 250mm×80mm；流動相：[水(10mM NH4 HCO3 )-ACN]；B%：35%-65%，21min)純化殘餘物以提供淺黃色固體狀的化合物81(1.00g，953umol，39.7%得率)。
1 HNMR：(400 MHz, DMSO)δ 8.71 (t,J = 5.6 Hz, 2H), 8.33 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 8.20 (s, 2H), 8.16 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 8.05 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 7.92-7.93 (m, 1H), 7.81 (d,J = 8.4 Hz, 2H), 4.89 (d,J = 7.0 Hz, 1H), 4.55 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 3.93 (s, 1H), 3.56-3.67 (m, 30H), 3.40-3.42 (m, 5H), 3.15-3.16 (m, 2H), 2.01-2.11 (m, 4H), 1.27-1.51 (m, 7H)。 [7-((3-(2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-哢唑-9-基)丙基)氨基)-7-氧-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(82)的製備]
在0℃，向化合物81 (500mg，477umol)和N,N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯(977mg，3.81mmol)在ACN(6.00ml)中的溶液中添加吡啶(188mg，2.38mmol)。將混合物在15℃攪拌1hr。LC-MS顯示出具有所期望的檢測MS的一個新的峰(產物：Rt=2.26min)。用水(20.0mL)稀釋反應混合物並用DCM(10.0mL×5)萃取。用水(20.0mL)清洗合併的有機層，用Na2 SO4 乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC(柱：Phenomenex luna C18 250×50mm×10um；流動相：[水(0.04% HCl)-ACN]；B%：50%-70%，10min)純化殘餘物以提供黃色固體狀的82 (0.102g，79.4umol，16.7%得率，92.7%純度)。
1 HNMR ：(400 MHz, DMSO)δ 8.6 (t,J = 5.6 Hz, 2H), 8.26 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 8.13-8.17 (m,4H), 8.01-8.11 (m, 3H), 7.96 (d,J = 5.6 Hz, 2H), 5.16-5.18 (m, 1H), 4.49 (t,J = 6.4 Hz, 2H), 3.91-4.12 (m, 13H), 3.55-3.59 (m, 14H), 4.49-4.53 (m, 4H), 3.34-3.36 (m, 4H), 3.09-3.10 (m, 2H), 2.79 (s, 4H), 1.97-2.06 (m, 4H), 1.61-1.68 (m, 2H), 1.42-1.44 (m, 2H), 1.23-1.25 (m, 2H)。
HPLC：保留時間：2.632min，面積百分比：92.0%。
LCMS：保留時間：2.630min，M+H+ =1190.4。 [實施例32] 7-疊氮基-1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(86)
Figure 02_image272
[N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-(甲基磺醯基)苯甲醯胺(84)的製備]
向化合物83(2.0g，10mmol，1.0eq)和化合物22(2.18g，10mmol，1.0eq)在二甲基甲醯胺(40ml)中的溶液中添加2-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(4.56g，12mmol，1.2eq)和N,N -二異丙基乙胺(2.0g，20mmol，2.0eq)。在室溫下將混合物攪拌過夜。通過LCMS和TLC監測反應。用水(50mL)稀釋混合物，用乙酸乙酯(5×150mL)萃取並用鹽水(100mL)清洗。用硫酸鈉乾燥有機層並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠(二氯甲烷：甲醇，97:3)上純化殘餘物以提供化合物84(2.5g，63%)
TLC：二氯甲烷：甲醇=10：1，UV 254nm，通過I2 顯色，Rf ：(化合物83)=0.3；Rf ：(化合物84)=0.5。 [3-((7-疊氮基-2-羥庚基)磺醯基)-N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲醯胺(85)的製備]
在-78℃，向化合物84(2.0g，5.0mmol，1.0eq)在四氫呋喃(30ml)中的溶液中緩慢添加雙(三甲基甲矽烷基)氨基鉀(1.0M，15mL，15mmol，3.0eq)。然後，將化合物3(2.1g，15mmol，3.0eq)加入至所述混合物。將反應混合物在室溫下攪拌2h。通過TLC監測反應。然後，用飽和氯化銨水溶液(30mL)使混合物淬滅，用乙酸乙酯(2×30mL)萃取。用鹽水(20mL)清洗有機層，用硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠(二氯甲烷：甲醇，97:3)上純化殘餘物以提供化合物85(400mg，15%)
TLC：二氯甲烷：甲醇=10：1，UV 254nm，Rf ：(化合物84)=0.5；Rf ：(化合物85)=0.5。 [7-疊氮基-1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲醯基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(86)的製備]
向化合物85(400mg，0.74mmol，1.0eq)在四氫呋喃(4mL)中的混合物中添加三光氣(372mg，1.25mmol，1.7eq)和吡啶(117mg，1.48mmol，2.0eq)。在攪拌30min後，過濾反應混合物。向濾液中添加吡啶(117mg，1.48mmol，2.0eq)和N -羥基琥珀醯亞胺(176mg，0.89mmol，1.2eq)。將混合物在室溫下攪拌2h。通過LCMS監測反應。用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物並用鹽水(5mL)清洗。然後，用硫酸鈉乾燥有機層，過濾並減壓濃縮。通過製備-HPLC純化殘餘物以提供無色油狀的化合物86(270mg，54%)。
LCMS：[M+1]+ =683。
1 HNMR (400 MHz, CD3 OD):δ 8.32 (s, 1H), 8.17 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 8.04 (d,J = 7.6 Hz, 1H), 7.68 (t,J = 7.6 Hz, 1H), 7.29 (s, 1H), 5.25 (s, 1H), 3.59-3.66 (m, 16H), 3.37-3.32 (m, 2H), 3.25 (t,J = 6.8 Hz, 2H), 2.81 (s, 4H), 1.79 (s, 2H), 1.57 (s, 2H), 1.39 (s, 4H)。 [實施例33] 1-疊氮基-12-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-13-氧-19-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-3,6,9-三氧雜-12-氮雜十九烷-18-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(89)
Figure 02_image274
N,N-雙(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-6-羥基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚醯胺(88)的製備
向化合物73(102mg，0.3mmol，1.2eq)在二甲基甲醯胺(3mL)中的溶液中添加2-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(136mg，0.76mmol，1.5eq)和N,N -二異丙基乙胺(124mg，0.96mmol，4.0eq)。將混合物在室溫下攪拌10分鐘。然後，向所述混合物中添加化合物87(100mg，0.24mmol，1.0eq)並攪拌2h。通過LCMS和TLC監測反應。用水(10mL)稀釋混合物，用乙酸乙酯(5×10mL)萃取並用鹽水(10mL)清洗。用硫酸鈉乾燥有機層，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠(二氯甲烷：甲醇，98:2)上純化殘餘物以提供化合物88(50mg，28%)
TLC：二氯甲烷：甲醇=10：1，UV 254nm，通過I2 顯色，Rf ：(化合物87)=0.5；Rf ：(化合物88)=0.4。 [1-疊氮基-12-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-13-氧-19-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-3,6,9-三氧雜-12-氮雜十九烷-18-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(89)的製備]
向化合物88(400mg，0.53mmol，1.0eq)在四氫呋喃(4ml)中的混合物中添加三光氣(267mg，0.9mmol，1.7eq)和吡啶(84mg，1.06mmol，2.0eq)。將反應混合物攪拌30min。過濾反應混合物。向濾液中添加吡啶(84mg，1.06mmol，2.0eq)和N -羥基琥珀醯亞胺(73mg，0.64mmol，1.2eq)。將混合物在室溫下攪拌2h。通過LCMS監測反應。用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物並用鹽水(5mL)清洗。然後，用硫酸鈉乾燥混合物，過濾並減壓濃縮。通過製備-HPLC純化殘餘物以提供黃色油狀的化合物89(85mg，18%)。
LCMS：[M+1]+ =897。
1 HNMR (400 MHz, CD3 OD):δ 8.15-8.13 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.96-7.94 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 5.27 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.73 (m, 1H), 3.59-3.61 (m, 26H), 3.35 (m, 6H), 2.81 (s, 4H), 3.46-3.42 (m, 2H), 1.79-1.77 (m, 2H), 1.58 (m, 2H)和1.39-1.37 (m, 2H)。 [實施例34] 15kDa Y-PEG-DBCO
Figure 02_image276
向配備有特氟龍塗層磁力攪拌棒的乾燥圓-底燒瓶中添加15kDa Y-PEG-NHS(1.13g，74.9µmol，1.0eq)和PyClocK(0.082g，148µmol，2.0eq)。用橡膠隔片密封燒瓶並置於惰性氬氣氣氛下。添加無水CH2 Cl2 (18ml)，隨後添加N-甲基嗎啉(18μL，164µmol，2.2eq)並將反應在室溫下攪拌30min。將DBCO-胺(52mg，188µmol，2.5eq)在CH2 Cl2 (2mL)中的溶液與N-甲基嗎啉(18µL，164µmol，2.2eq)一起一次性加入，並將反應混合物在室溫下攪拌另外5h。真空濃縮粗反應混合物，然後加入熱2-丙醇(120mL)。將所得溶液在冰浴中冷卻以形成沉澱物。將分離的沉澱物轉移至預先稱重的falcon管(×3)中，並通過離心(12000rpm，30min，-3℃)是沉澱物沉降。用2-丙醇(120mL)重複沉澱1次，並用丙酮(3×120mL)重複3次。真空乾燥沉澱顆粒。分離的白色固體，質量=995mg(88%)。RP-HPLC 保留時間=6.9min。 [實施例35] 17kDa Y-PEG-DBCO
Figure 02_image278
向配備有特氟龍塗層磁力攪拌棒的乾燥圓-底燒瓶中添加17kDa Y-PEG-NHS(1.0g，57.2µmol，1.0eq)和CH2 Cl2 (18.0mL)。用橡膠隔片密封燒瓶並置於惰性氬氣氣氛下。添加DBCO-胺(40mg，145µmol，2.5eq)，隨後添加N-甲基嗎啉(19μL，173µmol，3.0eq)，並將反應在室溫下攪拌過夜。真空濃縮粗反應混合物，然後加入熱丙酮(90mL)。將所得溶液在冰浴中冷卻30min以形成沉澱物，通過離心(11000rpm，30min，-8℃)使沉澱物沉降。倒掉溶劑並用2-丙醇(90mL)重複沉澱過程1次，用丙酮(2×90mL)重複2次。真空乾燥所得固體。分離的白色固體，質量=910mg(91%)。RP-HPLC保留時間=6.7min。 [實施例36] 7.5kDa PEG-DBCO
Figure 02_image280
7.5kDa PEG-DBCO試劑購自JenKem Technology USA。HPLC：純度98.0%；GPC：純度99.1%；MALDI：7481Da。 [實施例37]
Figure 02_image230
rIL-2通過NHS偶聯至實施例2和使用15kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例2(3.2mg)溶於DMF(439μL)以提供7.29mg/mL的試劑溶液。用100mM 硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(841μL)稀釋IL-2(8.0mg，0.523μmol，2.76mL)並加入實施例2(2.92mg，5.77μmol，400µL，11eq)。將反應混合並在22℃培育1h。1h後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將15kDa Y-PEG-DBCO(125mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(500μL)以提供250mg/mL溶液。向[rIL-2]-[CF3 -Ph-SO2 -N3 ]z (7.6mg，0.497μmol，3.80ml)添加15kDa Y-PEG-DBCO(114mg，7.47μmol，455μl，15eq)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
作為[15K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例37(5.55mg，73%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於6.7。 [實施例38]
Figure 02_image234
rIL-2通過NHS偶聯至實施例3和用15kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例3(3.0mg)溶於DMF(607μL)以提供4.94mg/mL的試劑溶液。用100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(933μL)稀釋IL-2(8.0mg，0.523μmol，2.67mL)並添加實施例3(1.98mg，4.19μmol，400μL，8eq)。將反應混合並在22℃培育1h。1h後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將15kDa Y-PEG-DBCO(150mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(1.00mL)以提供150mg/mL溶液。向[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2 -N3 ]z (7.7mg，0.503μmol，3.65mL)添加15kDa Y-PEG-DBCO(138mg，9.06μmol，921μL，18eq)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
作為[15K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例38(6.39mg，83%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於5.4。 [實施例39]
Figure 02_image236
rIL-2通過NHS偶聯至實施例4和用15kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例4(4.0mg)溶於DMF(269μL)以提供14.9mg/mL的試劑溶液。向IL-2(8mg，0.523μmol，4.00ml)的小瓶中添加實施例4(2.98mg，6.28μmol，200μL，12eq)。將反應混合並在22℃培育1h。1h後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將15kDa Y-PEG-DBCO(125mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(833μL)以提供150mg/mL的試劑溶液。向[rIL-2]-[F,F-Ph-SO2 -N3 ]z (8.0mg，0.523μmol，4.20mL)中添加15kDa Y-PEG-DBCO(120mg，7.87μmol，798μL，15eq)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
作為[15K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例39(7.26mg，91%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於5.9。 [實施例40]
Figure 02_image238
rIL-2通過NHS偶聯至實施例5和用15kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例5(4.5mg)溶於DMF(438μL)以提供10.3mg/mL的試劑溶液。用100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(817μL)稀釋IL-2(7mg，0.458μmol，2.33mL)並添加實施例3(3.61mg，6.88μmol，350μL，15eq)。將反應混合並在22℃培育1h。1h後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將15kDa Y-PEG-DBCO(120mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(800μL)以提供150mg/mL的試劑溶液。向[rIL-2]-[F,CF3 -Ph-SO2 -N3 ]z (7.0mg，0.458μmol，3.50ml)中添加15kDa Y-PEG-DBCO(105mg，6.88μmol，698μl，15eq)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
作為[15K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例40(6.73mg，96%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於5.9。 [實施例41]
Figure 02_image286
rIL-2通過NHS偶聯至實施例30和用15kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例30(101mg)溶於DMF(2.02mL)以提供50mg/mL的試劑溶液。向IL-2(12mg，0.784μmol，4.88ml)的小瓶中添加實施例30(21.3mg，31.4μmol，425μL，40eq)和DMF(28.3μL)。將反應混合並在22℃培育1h。1h後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將15kDa Y-PEG-DBCO(578mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(2.09mL)以提供277mg/mL的試劑溶液。向[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO2 -N3 ]z (11.6mg，0.758μmol，5.16mL)添加15kDa Y-PEG-DBCO(578mg，37.89μmol，2.09mL，50eq)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
作為[15K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例41(5.37mg，46%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於5.4。 [實施例42]
Figure 02_image288
通過實施例31的rIL-2的NHS綴合和用7.5kDa PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例31(50mg)溶於DMF(1.00mL)以提供50mg/mL的試劑溶液。用100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(0.6mL)稀釋IL-2(12mg，0.784μmol，4.8mL)並添加實施例31(14mg，11.8μmol，280μL，15eq)和DMF(320μL)。將反應混合並在22℃培育1h。在1h，通過LC-MS分析反應以確定官能化IL-2物質的分佈。
將7.5kDa PEG-DBCO(250mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8(1.67mL)以提供150mg/mL溶液。向[rIL-2]-[CF3 -Ph-Ar-SO2 -N3 ]z (12mg，0.784μmol，6.0ml)中添加7.5kDa PEG-DBCO(206mg，27.5μmol，1.37ml，35eq)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。作為[2x7.5K mPEG-(CF3 -Ph-Ar-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例42(10mg，84%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於5-7。 [實施例43]
Figure 02_image290
rIL-2通過NHS偶聯至實施例32和用7.5kDa PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例32(99mg)溶於DMF(1.98mL)以提供50mg/mL的試劑溶液。用100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(1.40mL)稀釋IL-2(12mg，0.784μmol，4.0ml)並添加實施例32(9.1mg，13.4μmol，181μL，17eq)和DMF(419μL)。將反應混合並在22℃培育1h。在1h，通過LC-MS分析反應以確定官能化IL-2物質的分佈。
將7.5kDa PEG-DBCO(250mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8(1.67mL)以提供150mg/mL溶液。向[rIL-2]-[CONH-Ph-R-SO2 -N3 ]z (11.8mg，0.771μmol，5.9mL)添加7.5kDa PEG-DBCO(231mg，30.9μmol，1.54ml，40eq)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。作為[2x7.5K mPEG-(CONH-Ph-R-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例43(10.23mg，87%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於5-7。 [實施例44]
Figure 02_image292
rIL-2通過NHS偶聯至實施例33和用7.5kDa PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例33(11.3mg)溶於DMF(0.226mL)以提供50mg/mL的試劑溶液。用100mM硼酸鈉，pH 8、20mM EDTA、0.05% SDS(1.26mL)稀釋IL-2(10.8mg，0.706μmol，3.60mL)並添加實施例33(9.50mg，10.6μmol，190µL，15eq)和DMF(0.35mL)。將反應混合並在22℃培育1h。在1h，通過LC-MS分析反應以確定官能化IL-2物質的分佈。
將7.5kDa PEG-DBCO(240mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 8(1.60mL)以提供150mg/mL溶液。向[rIL-2]-[CF3 -Ph-R-SO2 -N3 ]z (10.5mg，0.686μmol，3.85ml)中添加7.5kDa PEG-DBCO(205mg，27.4μmol，1.37ml，40eq)。將反應混合並在22℃培育。2h後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。作為[2x7.5K mPEG-(CF3 -Ph-R-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例44(10.45mg，99%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於5.6。 [實施例45]
Figure 02_image230
rIL-2通過NHS偶聯至實施例2和用17kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例2(5.0mg)溶於DMF(687μL)以提供7.28mg/mL的試劑溶液。用100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(1.26mL)稀釋IL-2(12.0mg，0.784μmol，4.14mL)並添加實施例2(4.37mg，8.63μmol，600µL，11eq)。將反應混合並在22℃培育15min。15min後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。向反應添加另外的實施例2(1.99mg，3.93μmol，273μL，5eq)以提高官能化水平。在22℃培育另外15min後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將17kDa Y-PEG-DBCO(302mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(1.21mL)以提供250mg/mL溶液。向[rIL-2]-[CF3 -Ph-SO2 -N3 ]z (12.0mg，0.784μmol，6.00ml)添加17kDa Y-PEG-DBCO(277mg，15.7μmol，1.11ml，20eq)。將反應混合並在22℃培育。15min後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。 [實施例46]
Figure 02_image234
rIL-2通過NHS偶聯至實施例3和用17kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例3(4.2mg)溶於DMF(679μL)以提供6.18mg/mL的試劑溶液。用100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(1.26mL)稀釋IL-2(12.0mg，0.784μmol，4.14mL)並添加實施例3(3.71mg，7.84μmol，600µL，10eq)。將反應混合並在22℃培育15min。15min後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將17kDa Y-PEG-DBCO(185mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(740μL)以提供250mg/mL溶液。向[rIL-2]-[Cl-Ph-SO2 -N3 ]z (12.0mg，0.784μmol，6.00ml)中添加17kDa Y-PEG-DBCO(173mg，9.80μmol，692μl，12.5eq)和100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(165μL)。將反應混合並在22℃培育。15min後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
作為[17K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例46(9.7mg，81%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於6.2。 [實施例47]
Figure 02_image236
rIL-2通過NHS偶聯至實施例4和用17kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例4(6.0mg)溶於DMF(645μL)以提供9.30mg/mL的試劑溶液。用100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(1.10mL)稀釋IL-2(10.5mg，0.686μmol，3.62mL)並添加實施例4(4.88mg，10.3μmol，525µL，15eq)。將反應混合並在22℃培育15min。15min後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將17kDa Y-PEG-DBCO(260mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(1.04mL)以提供250mg/mL的試劑溶液。向[rIL-2]-[F,F-Ph-SO2 -N3 ]z (10.5mg，0.686μmol，5.25ml)中添加17kDa Y-PEG-DBCO(242mg，13.7μmol，968μl，20eq)。將反應混合並在22℃培育。15min後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
作為[17K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例47(9.5mg，91%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於6.5。 [實施例48]
Figure 02_image238
rIL-2通過NHS偶聯至實施例5和用17kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例5(6.6mg)溶於DMF(600μL)以提供11.0mg/mL的試劑溶液。用100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(906μL)稀釋IL-2(12.0mg，0.784μmol，4.49mL)並添加實施例5(6.20mg，11.8μmol，560μL，15eq)。將反應混合並在22℃培育15min。15min後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將17kDa Y-PEG-DBCO(235mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(0.94mL)以提供250mg/mL的試劑溶液。向[rIL-2]-[F,CF3 -Ph-SO2 -N3 ]z (12.0mg，0.784μmol，6.00ml)中添加17kDa Y-PEG-DBCO(228mg，12.9μmol，912μl，16.5eq)。將反應混合並在22℃培育。15min後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
作為[17K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例48(9.4mg，78%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於7.3。 [實施例49]
Figure 02_image286
rIL-2通過NHS偶聯至實施例30和用17kDa Y-PEG-DBCO的點擊-PEG化。
將實施例30(101mg)溶於DMF(2.02mL)以提供50mg/mL的試劑溶液，並且在綴合前，用DMF將該溶液稀釋至35.5mg/mL。用100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(906μL)稀釋IL-2(12.0mg，0.784μmol，4.49mL)並添加實施例30(21.3mg，31.4μmol，600μL，40eq)。將反應混合並在22℃培育15min。15min後，通過LC-MS分析反應以確定IL-2的平均官能化程度。
將17kDa Y-PEG-DBCO(700mg)溶於100mM硼酸鈉，pH 9、20mM EDTA、0.05% SDS(2.80mL)以提供250mg/mL的試劑溶液。向[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO2 -N3 ]z (12.0mg，0.784μmol，6.00ml)中添加17kDa Y-PEG-DBCO(692mg，39.2μmol，2.77ml，50eq)。將反應混合並在22℃培育。15min後，通過SDS-PAGE分析反應混合物並使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化粗反應混合物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以3mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合的餾分濃縮並通過UF/DF(Vivaspin20，50kDa MWCO PES)緩衝液交換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並最終無菌過濾(0.22µm PVDF)。
作為[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2 )]z -[rIL-2]，使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例49(9.3mg，77%得率)。偶聯物的SDS-PAGE分析顯示PEG:IL-2比等於7.0。 [實施例50]
Figure 02_image248
通過20kDa PEG雙(碸)對rIL-2二硫鍵的PEG化
在偶聯前，根據生產商的說明，使用通過100mM硼酸鈉，pH(0.05% SDS)平衡的CentriPure P100柱，通過凝膠過濾更換IL-2溶液(10mM乙酸鈉，pH 4.5，5%海藻糖)的緩衝液。使用Nanodrop 2000分光光度計，通過UV-A280定量更換緩衝液的蛋白溶液(1.34mg/mL)。
用100mM硼酸鈉，pH 8(0.05% SDS)將IL-2(12mg，8.96ml)稀釋至9ml，並向該溶液添加0.1M DTT(1.0mL，100µmol，127eq)，從而提供1.2mg/mL的最終IL-2濃度。輕輕混合所得還原反應並在22℃培育1h。根據生產商的說明，使用CentriPure P100柱，將還原的IL-2緩衝液更換為新鮮的100mM硼酸鈉，pH 8(0.05% SDS)並通過UV-A280確定回收的蛋白的量(21.08mL反應緩衝液中10.5mg)。在水(3.59mL)中製備20kDa TheraPEG™試劑(19.5mg)的溶液。為了使IL-2(10.5mg，0.686μmol，21.08ml)還原，添加100mM硼酸鈉，pH 8(0.05% SDS)(17.71mL)和5.44mg/mL 20kDa TheraPEG™的溶液(3.37mL，0.892µmol，1.3eq)，從而提供了0.25mg/mL的最終IL-2濃度。輕輕混合綴合反應並在22℃培育16h。通過SDS-PAGE和分析型SEC分析粗反應，然後通過製備SEC純化。
將粗反應緩衝液更換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並通過UF/DF(Vivapsin20，5kDa MWCO PES)濃縮。根據生產商的說明，使用4mL去污劑除去離心柱(Pierce®)，從PEG化IL-2樣品除去SDS。然後，使用HiLoad 16/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化PEG化的IL-2產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合部分無菌過濾(0.22µm PVDF)。
使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量樣品並通過SEC和SDS-PAGE分析。在溶液中作為0.9mg(8%得率)產生實施例50。通過SDS-PAGE的純度：＞99%。通過分析SEC的純度：96.1%。 [實施例51]
Figure 02_image248
通過5kDa PEG雙(碸)對rIL-2二硫鍵的PEG化
在偶聯前，根據生產商的說明，使用通過100mM硼酸鈉，pH(0.05% SDS)平衡的CentriPure P100柱，通過凝膠過濾更換IL-2溶液(10mM乙酸鈉，pH 4.5，5%海藻糖)的緩衝液。使用Nanodrop 2000分光光度計，通過UV-A280定量更換緩衝液的蛋白溶液(1.34mg/mL)。
用100mM硼酸鈉，pH 8(0.05% SDS)將IL-2(12mg，8.96ml)稀釋至9ml，並向該溶液添加0.1M DTT(1.0mL，100µmol，127eq)，從而提供1.2mg/mL的最終IL-2濃度。輕輕混合所得還原反應並在22℃培育1h。根據生產商的說明，使用CentriPure P100柱，將還原的IL-2緩衝液更換為100mM硼酸鈉，pH 8(0.05% SDS)並通過UV-A280確定回收的蛋白的量(14.26mL反應緩衝液中11.6mg)。在水(11.03mL)中製備5kDa TheraPEG™試劑(16.1mg)的溶液。為了使IL-2(11.6mg，0.758μmol，14.26ml)還原，添加100mM硼酸鈉，pH 8(0.05% SDS)(28.24mL)和1.5mg/mL 5kDa TheraPEG™的溶液(3.37mL，0.981µmol，1.3eq)。輕輕混合綴合反應並在22℃培育16h。通過SDS-PAGE和分析型SEC分析粗反應，然後通過製備SEC純化。
將粗反應緩衝液更換為50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)並通過UF/DF(Vivapsin20，5kDa MWCO PES)濃縮。根據生產商的說明，使用4mL去污劑除去離心柱(Pierce®)，從PEG化IL-2樣品除去SDS。然後，使用HiLoad 16/600 Superdex 200 pg，通過SEC純化PEG化的IL-2產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5(150mM NaCl)，以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的餾分並混合高純度餾分。將混合部分無菌過濾(0.22µm PVDF)。
使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量樣品並通過SEC和SDS-PAGE分析。在溶液中作為1.7mg(14%得率)產生實施例51。通過SDS-PAGE的純度：＞99%。通過分析SEC的純度：98.3%。 [實施例52] [示例性的rIL-2-[PEG]z偶聯物的活性]
在使用CTLL-2細胞的細胞增殖測定中評價了阿地白介素(對照)、實施例15、17、19、20、22、26、27、37-49的活性。
在37℃，5% CO2 氣氛下，將CTLL-2細胞(小鼠細胞毒T淋巴細胞系)維持在補充有10%胎牛血清和10% IL-2培養補充劑(T-STIM™，具有ConA(伴刀豆球蛋白A))的完全RPMI 1640培養基中。在分裂前，將細胞懸浮培養直至它們達到2-3×105 個細胞/mL的細胞密度。
對於活性測定，在上次分裂後3-4天，將細胞在達爾伯克氏磷酸鹽緩衝鹽水中清洗三次。然後，將細胞以～5×105 個細胞/mL的細胞密度在無T-STIM™的補充培養基中再懸浮，並在以90ml/孔在96孔白壁透明底微板中鋪板。還使用調節至pH 6.7-7的補充培養基(無T-STIM™)進行實驗以最大程度降低培育過程中偶聯物的釋放。然後，添加在無T STIM™的補充培養基中稀釋的10μl 10×濃度的測試化合物。將細胞在37℃，在5% CO2氣氛下培育48小時。培育48小時後，添加CCK8試劑(20　l/孔)並在37℃，5% CO2 下培育2小時。然後，使用Molecular devices Spectra Max i3X在450nm和630nm對板讀數。
測試釋放的IL-2和未釋放的偶聯物兩者的活性。將測試化合物在酸性條件(10mM乙酸鈉緩衝液，pH 4)下儲存以穩定綴合。為了測試偶聯物的活性，在測定前～1小時，將樣品從儲存緩衝液稀釋至補充培養基。為了測試釋放的IL-2的活性，將釋放的偶聯物在100mM(最終濃度)的碳酸氫鈉緩衝液，pH 9中稀釋10-倍並在測定開始前，在37℃預培育8小時。
使用GraphPad's Prism 5.01軟體，從劑量反應曲線的非線性回歸分析獲得細胞增殖的EC50 值(顯示出50%最大反應所需的測試化合物的濃度)。
使用細胞增殖測定測量了IL-2和偶聯物的活性，並且在表3中顯示了結果匯總。所有測試製品以劑量-依賴性方式引起CTLL-2細胞生長，如圖4A-4E中所示的一些實例。如表3和圖4A-4E所示，在來自實施例15、17、19、20、22、27、37-49的偶聯物在誘導IL-2釋放的條件下預培育後，活性恢復。從這些偶聯物釋放的IL-2顯示出對於對照IL-2的相對效力。 [表3. 對IL-2和PEG-IL-2偶聯物起反應的CTLL-2細胞增殖的總結]
測試化合物 EC50 (ng/mL)
IL-2對照 3.96
實施例15：[20K mPEG-(F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) 58.17
實施例15：[20K mPEG-(F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 1.71
實施例17：[20K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) 50.80
實施例17：[20K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 1.54
實施例19：[20K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) 40.87
實施例19：[20K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 2.45
實施例22：[mPEG2 -T2 -Fmoc-20K]z -[rIL-2](未釋放) 5.12
實施例22：[mPEG2 -T2 -Fmoc-20K]z -[rIL-2](釋放) 8.94
實施例27：[mPEG2 -Fmoc-20K]z -[rIL-2](未釋放) 3.40
實施例27：[mPEG2 -Fmoc-20K]z -[rIL-2](釋放) 2.59
實施例20：[20K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) 50.82
實施例20：[20K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 1.30
實施例37：[15K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例37：[15K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 0.85
實施例38：[15K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例38：[15K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 2.08
實施例39：[15K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例39：[15K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 1.51
實施例40：[15K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例40：[15K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 1.28
實施例41：[15K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) 116.0
實施例41：[15K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 0.90
實施例42：[2x7.5K mPEG-(CF3 -Ph-Ar-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例42：[2x7.5K mPEG-(CF3 -Ph-Ar-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 2.53
實施例43：[2x7.5K mPEG-(CONH-Ph-R-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例43：[2x7.5K mPEG-(CONH-Ph-R-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 1.85
實施例44：[2x7.5K mPEG-(CF3 -Ph-R-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例44：[2x7.5K mPEG-(CF3 -Ph-R-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 0.71
實施例45：[17K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例45：[17K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 1.87
實施例46：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例46：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 7.52
實施例47：[17K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例47：[17K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 0.85
實施例48：[17K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) N.A.
實施例48：[17K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 1.21
實施例49：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](未釋放) 176
實施例49：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2 )]z -[rIL-2](釋放) 1.48
實施例26：(10K-Thiobridge)-IL-2 2.73
[實施例53] [示例性的rIL-2-[PEG]z偶聯物的pH釋放研究]
使用P2柱，將測試樣品緩衝液更換為100mM PBS，pH 7.4。將來自所述柱的洗脫液無菌過濾(0.2μm PVDF篩檢程式)並使用Nanodrop分光光度計，通過UV-A280定量。用100mM PBS，pH 7.4將樣品稀釋至0.1mg/mL。向14個小瓶(7個時間點，重複2次)中載入測試樣品(100µL)。用2M乙酸使兩個小瓶立即淬滅，並在-80℃冷凍(t=0h)。將剩餘的12個小瓶在37℃培育。在預定時間點(t=6、24、48、72、96和120h)，從37℃儲存移去兩個小瓶，離心(1.5min，4000g)，用2M乙酸淬滅，然後在-80℃冷凍。一旦收集所有時間點的樣品，則將樣品融化並通過SDS-PAGE分析。通過凝膠的光密度測定分析確定平均PEG:IL-2比，將這些資料轉化並使用GraphPad Prism v7.04對時間作圖，確定接頭切割半衰期並在表4中總結。將T1 /2 確定為從偶聯物中的IL-2釋放一半量的PEG的時間。 [表4. PEG-IL-2偶聯物的接頭切割半衰期]
測試化合物 T1/2 (hr)
實施例15：[20K mPEG-(F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 299
實施例17：[20K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 69
實施例19：[20K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 183
實施例22：[mPEG2 -T2 -Fmoc-20K]z -[rIL-2] 44
實施例20：[20K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 86
實施例21：[20K mPEG-(F, CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 57
實施例37：[15K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 82
實施例38：[15K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 179
實施例39：[15K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 60
實施例40：[15K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 53
實施例41：[15K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 37
實施例42：[2x7.5K mPEG-(CF3 -Ph-Ar-SO2 )]z -[rIL-2] 84
實施例43：[2x7.5K mPEG-(CONH-Ph-R-SO2 )]z -[rIL-2] 257
實施例44：[2x7.5K mPEG-(CF3 -Ph-R-SO2 )]z -[rIL-2] 55
實施例45：[17K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 89
實施例46：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 184
實施例47：[17K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 74
實施例48：[17K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 58
實施例49：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 30
[實施例54] [皮下B16F10黑色素瘤功效研究]
對於每隻7-9周大的同基因C57BL/6小鼠，在中背側區域皮下植入1×105 個B16F10細胞。使腫瘤生長至明顯尺寸，即70-120cu mm，然後如所設計的隨機化並分組(n=8)。以如表5-9中所示的不同的劑量濃度和劑量方案向小鼠施用測試化合物，即rIL-2、rIL-2-聚合物偶聯物或媒介物。每2或3天，測量體重和腫瘤體積。本研究的終點為對於給定組，達到2000cu mm的中值腫瘤體積的時間。 [表5. 實施例54，圖5的分組]
測試化合物 劑量濃度(mg/kg) 施用途徑 劑量
媒介物：10mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5 0 IV q1d
rIL-2對照    3 IP b.i.d.×5
實施例15 [20K mPEG-(F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 5 IV q1d
實施例17 [20K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 5 IV q1d
實施例19 [20K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 5 IV q1d
實施例22 [mPEG2 -T2 -Fmoc-20K]z -[rIL-2] 5 IV q1d
實施例27 [mPEG2 -Fmoc-20K]z -[rIL-2] 5 IV q1d
[註：“b.i.d×5”表示每天2次，共計5天；“q1d”表示一次劑量，一天] [表6. 實施例54，圖6的分組]
測試化合物 劑量濃度(mg/kg) 施用途徑 劑量
媒介物：10mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5 0 IV q1d
rIL-2對照    3 IP b.i.d.×5
實施例27 [mPEG2 -Fmoc-20K]z -[rIL-2] 4 IV q1d
實施例26 (10K-Thiobridge)-IL-2 4 IV q1d
實施例20：                 [20K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 4 IV q1d
實施例21：[20K mPEG-(F, CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 4 IV q1d
[註：“b.i.d×5”表示每天2次，共計5天；“q1d”表示一次劑量，一天] [表7. 實施例54，圖7的分組]
測試化合物 劑量濃度(mg/kg) 施用途徑 劑量
媒介物：10mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5 0 IV qd，在第13天、第21天和第29天施用劑量
rIL-2對照 3 IP b.i.d.×5，2個循環，在第13(PM)、14、15、16、17、18(AM)天和第19(PM)、20、21、22、23、24(AM)天施用劑量
實施例17：[20K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV qd，在第13天、第21天和第29天施用劑量
實施例37：[15K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV qd，在第13天、第21天和第29天施用劑量
實施例38：[15K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV qd，在第13天、第21天和第29天施用劑量
實施例39：[15K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV qd，在第13天、第21天和第29天施用劑量
實施例40：[15K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV qd，在第13天、第21天和第29天施用劑量
[註：“b.i.d×5”表示每天2次，共計5天；“qd”表示一次劑量，一天] [表8. 實施例54，圖8的分組]
測試化合物 劑量濃度(mg/kg) 施用途徑 劑量
媒介物：10mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5 0 IV Q1w×2
rIL-2對照    3 IP b.i.d.×5，2個循環
實施例43：[2x7.5K mPEG-(CONH-Ph-R-SO2 )]z -[rIL-2] 3 IV Q1w×2
實施例41：[15K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 3 IV Q1w×2
實施例44：[2x7.5K mPEG-(CF3 -Ph-R-SO2 )]z -[rIL-2] 3 IV Q1w×2
實施例40：[15K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 3 IV Q1w×2
[註：“b.i.d×5”表示每天2次，共計5天；“q1w×2”表示每週1次，2個循環] [表9. 實施例54，圖9的分組]
測試化合物 劑量濃度(mg/kg) 施用途徑 劑量
媒介物：10mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5 0 IV Q1w×3
rIL-2對照 3 IP b.i.d.×5，2個循環
實施例42：[2x7.5K mPEG-(CF3 -Ph-Ar-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV Q1w×3
實施例45：[17K mPEG-(CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV Q1w×3
實施例46：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV Q1w×3
實施例47：[17K mPEG-(F,F-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV Q1w×3
實施例48：[17K mPEG-(F,CF3 -Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV Q1w×3
實施例49：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO2 )]z -[rIL-2] 2 IV Q1w×3
[註：“b.i.d×5”表示每天2次，共計5天；“q1w×3”表示每週1次，3個循環]
圖5-9提供了以不同施用方案施用rIL-2和rIL-2-聚合物偶聯物後的腫瘤生長抑制。這些結果表明所評價的rIL-2-聚合物偶聯物在比rIL-2更低的劑量下顯示出更好的效力，IL-2以3mg/kg的劑量施用，每天兩次，施用5天。在小鼠模型中，對於IL-2-PEG偶聯物未觀察到明顯的毒性，而IL-2小組小鼠顯示出嗜睡和身體發冷的症狀。通過不同接頭連接的IL-2-PEG偶聯物具有不同的抗腫瘤活性。水解速率為30-80小時的偶聯物顯示出最優的抗腫瘤效力。
無。
圖1顯示了rIL-2的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：1-3)。
圖2顯示了通過LC-MS測試的實施例14、實施例16、實施例18和實施例22所確定的IL-2-(N3 )z 的分佈。
圖3顯示了實施例15、實施例17、實施例19和實施例22的點擊-PEG化產物rIL-2-(PEG)z 的SDS-PAGE(Tris-乙酸鹽)分析。
圖4A-圖4E顯示了比較IL-2、來自實施例15(圖4A)、實施例17(圖4B)、實施例19(圖4C)、實施例22(圖4D)和實施例27(圖4E)的未釋放的偶聯物和釋放的偶聯物的CTLL-2細胞增殖測定的劑量反應曲線。
圖5、圖6、圖7、圖8和圖9顯示了以不同施用方案施用rIL-2和rIL-2-聚合物偶聯物後的腫瘤生長抑制情況。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 109134302-A0101-11-0002-1

Claims (131)

  1. 一種具有根據化學式(I)的結構的可釋放接頭，
    Figure 03_image001
    (I) 或其立體異構體、互變異構體或其混合物，或其同位素變體， 其中， X1 是第一間臂部分； X2 是第二間臂部分； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； Re 是電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基； a是0至4的整數； b是1至3的整數； c是0至1的整數； FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵的官能團；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團。
  2. 如請求項1所述之可釋放接頭，其中，所述可釋放接頭具有根據化學式(I-B)的結構：
    Figure 03_image010
    (I-B)     。
  3. 如請求項2所述之可釋放接頭，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  4. 如請求項3所述之可釋放接頭，其中，所述化合物具有以下結構：
    Figure 03_image014
    。
  5. 如請求項1所述之可釋放接頭，其中，所述可釋放接頭具有根據化學式(I-C)的結構：
    Figure 03_image012
    (I-C)     。
  6. 如請求項5所述之可釋放接頭，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  7. 如請求項6所述之可釋放接頭，其中，所述化合物具有以下結構：
    Figure 03_image016
    。
  8. 一種具有根據化學式(XVIII)的結構的可釋放接頭，
    Figure 03_image018
    (XVIII) 或其立體異構體、互變異構體或其混合物，或其同位素變體， 其中， X1 是間臂部分； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； Re 是電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基； a是0至4的整數； c是2； FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵的官能團；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團。
  9. 如請求項8所述之可釋放接頭，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  10. 如請求項9所述之可釋放接頭，其中，所述化合物具有以下結構：
    Figure 03_image020
    ；或
    Figure 03_image022
    。
  11. 一種具有根據化學式(II)的結構的可釋放接頭，
    Figure 03_image306
    (II) 或其立體異構體、互變異構體或其混合物，或其同位素變體， 其中， R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵的官能團；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團。
  12. 如請求項11所述之可釋放接頭，其中， a1和a2分別獨立地為0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  13. 如請求項11所述之可釋放接頭，其中，所述可釋放接頭具有根據化學式(II-A)的結構：
    Figure 03_image026
    (II-A) 其中Re 是氫或電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基。
  14. 如請求項13所述之可釋放接頭，其中，所述化合物具有以下結構：
    Figure 03_image309
    。
  15. 如請求項12所述之可釋放接頭，其中，所述可釋放接頭具有根據化學式(II-B)的結構：
    Figure 03_image028
    (II-B)   。
  16. 一種具有根據化學式(III)的結構的可釋放接頭，
    Figure 03_image312
    (III) 或其立體異構體、互變異構體或其混合物，或其同位素變體， 其中， R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rp 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； FG4 是能夠與活性劑的氨基反應以形成醯胺鍵的官能團；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團。
  17. 如請求項16所述之可釋放接頭，其中， a1和a2分別獨立地為0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  18. 如請求項17所述之可釋放接頭，其中，所述可釋放接頭具有根據化學式(III-A)的結構：
    Figure 03_image032
    (III-A)  。
  19. 一種具有根據化學式(IV)的結構的可釋放接頭，
    Figure 03_image315
    (IV) 或其立體異構體、互變異構體或其混合物，或其同位素變體， 其中， R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R3 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R4 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； c是0至4的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rd 是硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵的官能團；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團。
  20. 如請求項1至19中任一項所述之可釋放接頭，其中，FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成氨基甲酸酯鍵的官能團。
  21. 如請求項1至20中任一項所述之可釋放接頭，其中，FG2 是疊氮化物、炔基或環炔基基團。
  22. 如請求項1至21中任一項所述之可釋放接頭，其中，所述環炔基基團是二苯并環辛炔。
  23. 一種包含共價連接至至少一種接頭的蛋白的偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIX)的結構： 蛋白-(L)z (XIX) 或其立體異構體、位置異構體、互變異構體或其混合物，或其同位素變體，或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， z是1至25的整數； L是接頭；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  24. 如請求項23所述之偶聯物，其中，至少一種所述接頭是可釋放接頭。
  25. 如請求項24所述之偶聯物，其中，所述可釋放接頭是如請求項1至22所述之可釋放接頭。
  26. 如請求項24或25所述之偶聯物，其中，所述接頭共價連接至所述蛋白內的殘基的胺基。
  27. 如請求項26所述之偶聯物，其中，所述殘基是賴氨酸。
  28. 如請求項23至27中任一項所述之偶聯物，其中，一個或多個所述接頭連接至所述蛋白。
  29. 一種組合物，其包含如請求項23至28中任一項所述的偶聯物的混合物。
  30. 一種包含蛋白、至少一個接頭和至少一個水溶性聚合物的偶聯物，其中，所述蛋白通過接頭共價連接至每個所述水溶性聚合物，其中，所述水溶性聚合物是直鏈或支鏈的。
  31. 如請求項30所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含兩個或多個接頭。
  32. 如請求項31所述之偶聯物，其中，所述兩個或多個接頭包含至少一個非可釋放接頭。
  33. 如請求項31或32所述之偶聯物，其中，所述兩個或多個接頭包含至少一個可釋放接頭。
  34. 如請求項31至33中任一項所述之偶聯物，其中，所述兩個或多個接頭包含至少一個可釋放接頭和至少一個非可釋放接頭。
  35. 如請求項31至34中任一項所述之偶聯物，其中，所述兩個或多個接頭包含1至8個可釋放接頭和1至2個非可釋放接頭。
  36. 如請求項30所述之偶聯物，其中，所述至少一個接頭是可釋放接頭。
  37. 如請求項30或36所述之偶聯物，其中，每個所述接頭都是可釋放接頭。
  38. 如請求項36或37所述之偶聯物，其中，所述可釋放接頭是如請求項1至22中任一項所述之可釋放接頭。
  39. 如請求項30所述之偶聯物，其中，所述至少一個接頭包括非可釋放接頭。
  40. 如請求項30至39中任一項所述之偶聯物，其中，所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
  41. 如請求項40所述之偶聯物，其中，通過選自下列的封端部分對所述聚(乙二醇)封端：羥基、烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基。
  42. 如請求項30至41中任一項所述之偶聯物，其中，所述水溶性聚合物的重量平均分子量在約500道耳頓至約100,000道耳頓的範圍內。
  43. 如請求項42所述之偶聯物，其中，所述水溶性聚合物的重量平均分子量在約500道耳頓至小於20,000道耳頓的範圍內。
  44. 如請求項42所述之偶聯物，其中，所述水溶性聚合物的重量平均分子量在約20,000道耳頓至小於85,000道耳頓的範圍內。
  45. 如請求項42所述之偶聯物，其中，所述水溶性聚合物的重量平均分子量在約85,000道耳頓至約100,000道耳頓的範圍內。
  46. 如請求項30至45中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物通過所述接頭在所述蛋白內的殘基的胺基處共價連接。
  47. 如請求項46所述之偶聯物，其中，所述殘基是賴氨酸。
  48. 如請求項30至47中任一項所述之偶聯物，其中，一個或多個所述水溶性聚合物通過一個或多個接頭連接至所述蛋白。
  49. 如請求項30至48中任一項所述之偶聯物，其中，8個或更多個所述水溶性聚合物通過8個或更多個接頭連接至所述蛋白。
  50. 如請求項30至49中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XX)的結構： 蛋白-(L-大分子)z (XX) 或其立體異構體、位置異構體、互變異構體或其混合物，或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中， z是1至25的整數； L是接頭； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 大分子是水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
  51. 如請求項30至50中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據以下化學式的結構：
    Figure 03_image317
    ；或者
    Figure 03_image319
    ； 其中， n是具有2至4000的值的整數； X是間臂部分； RL、RL1 和RL2 獨立地為可釋放接頭； z是1至25的整數；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  52. 一種組合物，其包含如請求項30至51中任一項所述之偶聯物的混合物。
  53. 如請求項23至28中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(VII)的結構：
    Figure 03_image044
    (VII) 其中， X1 是第一間臂部分； X2 當存在時，是第二間臂部分； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； Re 是電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基； a是0至5的整數； b是0至3的整數； c是0至2的整數； z是1至25的整數； Y1 是O或S； Y2 是O或S； FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  54. 如請求項53所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(VII-A)的結構：
    Figure 03_image046
    (VII-A) 。
  55. 如請求項54所述之偶聯物，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  56. 如請求項55所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(VII-A1)的結構：
    Figure 03_image054
    (VII-A1) 其中，a是1至2的整數；並且Re 為4-F、4-Cl、4-CF3 、2,4-二氟代基團或2-CF3 -4-F取代基。
  57. 如請求項53所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(VII-B)的結構：
    Figure 03_image048
    (VII-B)  。
  58. 如請求項57所述之偶聯物，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  59. 如請求項58所述之偶聯物，其中，所述偶聯物具有以下結構：
    Figure 03_image056
    。
  60. 如請求項53所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(VII-C)的結構：
    Figure 03_image050
    (VII-C)  。
  61. 如請求項60所述之偶聯物，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  62. 如請求項61所述之偶聯物，其中，所述偶聯物具有以下結構：
    Figure 03_image058
    。
  63. 如請求項53所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(VII-D)的結構：
    Figure 03_image052
    (VII-D)  。
  64. 如請求項63所述之偶聯物，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  65. 如請求項64所述之偶聯物，其中，所述偶聯物具有以下結構：
    Figure 03_image060
    ；或
    Figure 03_image062
    。
  66. 如請求項23至28中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(VIII)的結構：
    Figure 03_image064
    (VIII) 其中， R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  67. 如請求項66所述之偶聯物，其中， a1和a2分別獨立地為0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  68. 如請求項67所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(VIII-A)的結構：
    Figure 03_image066
    (VIII-A) 。
  69. 如請求項23至28中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(IX)的結構：
    Figure 03_image068
    (IX) 其中， R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rp 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； X2 當存在時，是間臂部分； X3 當存在時，是間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  70. 如請求項69所述之偶聯物，其中， a1和a2分別獨立地為0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  71. 如請求項70所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(IX-A)的結構：
    Figure 03_image070
    (IX-A)    。
  72. 如請求項23至28中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(X)的結構：
    Figure 03_image072
    (X) 其中， R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R3 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R4 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； c是0至4的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團； Rd 是硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基； X2 當存在時，是間臂部分； X3 當存在時，是間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； Y4 是O或S； FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  73. 如請求項30至51中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XI)的結構：
    Figure 03_image088
    (XI) 其中， POLY1 是第一水溶性聚合物； POLY2 是第二水溶性聚合物； X1 是第一間臂部分； X2 是第二間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； Y4 是O或S； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R3 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R4 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1是0至3的整數； a2是0至3的整數； c是0至4的整數； z是1至25的整數； Rel 當存在時，是第一電子改變基團； Re2 當存在時，是第二電子改變基團； Rd 是硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  74. 如請求項73所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XI-A)的結構：
    Figure 03_image090
    (XI-A) 其中n獨立地為4至1500的整數。
  75. 如請求項30至51中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XII)的結構：
    Figure 03_image092
    (XII) 其中， POLY1 是第一水溶性聚合物； POLY2 是第二水溶性聚合物； X1 是第一間臂部分； X2 是第二間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1是0-3的整數； a2是0-3的整數； z是1至25的整數； Rel 當存在時，是第一電子改變基團； Re2 當存在時，是第二電子改變基團； Rp 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  76. 如請求項75所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XII-A)的結構：
    Figure 03_image094
    (XII-A) 其中n獨立地為4至1500的整數。
  77. 如請求項30至51中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIII)的結構：
    Figure 03_image096
    (XIII) 其中， POLY1 是第一直鏈或支鏈水溶性聚合物； POLY2 是第二直鏈或支鏈水溶性聚合物； X1 是第一間臂部分；或-X-FG2 ； X2 當存在時，是第二間臂部分； T1 是第一三唑官能團； T2 是第二三唑官能團； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； Re 是電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和取代的雜芳基；和-X-FG2 ； 其中， X是間臂部分；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； a是0至5的整數； b是0至3的整數； c是0至2的整數； z是1至25的整數； Y1 是O或S； Y2 是O或S；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  78. 如請求項77所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIII-A)的結構：
    Figure 03_image098
    (XIII-A)  。
  79. 如請求項78所述之偶聯物，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  80. 如請求項79所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIII-A1)的結構：
    Figure 03_image106
    (XIII-A1) 其中， a是1至2的整數； Re 是4-F、4-Cl、4-CF3 、2,4-二氟代或2-CF3 -4-F取代； n獨立地為4至1500的整數； z是1至25的整數；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  81. 如請求項77所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIII-B)的結構：
    Figure 03_image100
    (XIII-B)  。
  82. 如請求項81所述之偶聯物，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  83. 如請求項82所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIII-B1)的結構：
    Figure 03_image108
    (XIII-B1) 其中， n獨立地為4至1500的整數； z是1至25的整數；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  84. 如請求項77所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIII-C)的結構：
    Figure 03_image102
    (XIII-C) 。
  85. 如請求項84所述之偶聯物，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  86. 如請求項85所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIII-C1)的結構：
    Figure 03_image110
    (XIII-C1) 其中， n獨立地為4至1500的整數； z是1至25的整數；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  87. 如請求項77所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIII-D)的結構：
    Figure 03_image104
    (XIII-D)  。
  88. 如請求項87所述之偶聯物，其中， a是0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re 是硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  89. 如請求項88所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIII-D1)或(XIII-D2)的結構：
    Figure 03_image112
    (XIII-D1)；或者
    Figure 03_image114
    (XIII-D2) 其中， n獨立地為4至1500的整數； z是1至25的整數；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  90. 如請求項30至51中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIV)的結構：
    Figure 03_image116
    (XIV) 其中， POLY2 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； POLY3 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； z是1至25的整數； Rel ，當存在時，是第一電子改變基團； Re2 ，當存在時，是第二電子改變基團；或-X-FG2 ； 其中， X是間臂部分；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； X2 ，當存在時，是間臂部分； X3 ，當存在時，是間臂部分； T2 是三唑官能團； T3 是三唑官能團； Y1 是O或S； Y2 是O或S；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  91. 如請求項90所述之偶聯物，其中， a1和a2分別獨立地為0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  92. 如請求項91所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XIV-A)的結構：
    Figure 03_image118
    (XIV-A) 其中， n獨立地為4至1500的整數； z是1至25的整數；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  93. 如請求項30至51中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XV)的結構：
    Figure 03_image120
    (XV) 其中， POLY2 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； POLY3 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； z是1至25的整數； Rel 當存在時，是第一電子改變基團； Re2 當存在時，是第二電子改變基團；或-X-FG2 ； 其中， X是間臂部分；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； Rp 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； X2 當存在時，是間臂部分； X3 當存在時，是間臂部分； T2 是三唑官能團； T3 是三唑官能團； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  94. 如請求項93所述之偶聯物，其中， a1和a2分別獨立地為0至2的整數； R1 和R2 分別獨立地為氫、Me或Et；和 Re1 和Re2 分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF3 、-CONHMe、-SO2 NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO2 Me或-OCF3 。
  95. 如請求項94所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XV-A)的結構：
    Figure 03_image122
    (XV-A) 其中， n獨立地為4至1500的整數； z是1至25的整數；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  96. 如請求項30至51中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XVI)的結構：
    Figure 03_image124
    (XVI) 其中， POLY2 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； POLY3 是直鏈或支鏈水溶性聚合物； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R3 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R4 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； c是0至4的整數； z是1至25的整數； Rel 當存在時，是第一電子改變基團； Re2 當存在時，是第二電子改變基團；或-X-FG2 ； 其中， X是間臂部分；和 FG2 是能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； Rd 是硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基； X2 當存在時，是間臂部分； X3 當存在時，是間臂部分； T2 是三唑官能團； T3 是三唑官能團； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； Y4 是O或S；和 -NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
  97. 如請求項53至96中任一項所述之偶聯物，其中，所述環炔基是二苯并環辛炔 (DBCO)。
  98. 如請求項23至28、30至51和53至97中任一項所述之偶聯物，其中，所述蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  99. 如請求項98所述之偶聯物，其中，所述細胞因子是GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α或TNF-β。
  100. 如請求項98或99所述之偶聯物，其中，所述細胞因子是IL-2。
  101. 如請求項100所述之偶聯物，其中，所述IL-2包含與SEQ ID NO:1約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
  102. 如請求項98所述之偶聯物，其中，所述趨化因子是MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309(CCL1)、BCA1(CXCL13)、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸細胞活化趨化因子-1、嗜酸細胞活化趨化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC(CCL20)、ELC(CCL19)、SLC(CCL21)、ENA-78、PBP、TECK(CCL25)、CTACK(CCL27)、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
  103. 如請求項98所述之偶聯物，其中，所述抗體靶向以下中的一種或多種：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受體樣激酶1、澱粉狀蛋白A蛋白、β-澱粉狀蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125(模擬)、C5、CA-125、CCL11(嗜酸細胞活化趨化因子-1)、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C242抗原、CD276、CD278、CD319、艱難梭菌、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、達比加群、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、內皮糖蛋白、上皮唾蛋白、EPHA3、c-Met、FGFR2、纖維蛋白IIβ鏈、FGF 23、葉酸受體1、GMCSF、GD2神經節糖苷、GDF-8、GCGR、明膠酶B、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受體α-鏈、激肽釋放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受體、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干擾素α/β受體、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、乙型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-選擇素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、間皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、連接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂醯絲氨酸、RANKL、RTN4、獼猴因子、ROR1、SLAMF7、金黃色葡萄球菌α毒素、金黃色葡萄球菌雙組分殺白細胞素、SOST、選擇素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受體、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
  104. 如請求項30至51中任一項所述之偶聯物，其中，所述偶聯物包含根據化學式(XVII)的結構：
    Figure 03_image180
    (XVII) 或其立體異構體、互變異構體或其混合物、其位置異構體或混合物或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中， X是間臂部分； POLY是直鏈或支鏈水溶性聚合物；和 “-S-”是所述IL-2部分內的殘基的硫基。
  105. 如請求項104所述之偶聯物，其中，所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
  106. 一種根據方案(I)用於製備蛋白-大分子偶聯物的方法：
    Figure 03_image007
    (方案I) 其中，x是1至25的整數； y是0至24的整數； z是1至25的整數，其中x=y+z； L是接頭； FG0 是能夠與蛋白的親核基團反應以形成鍵，包括氨基甲酸酯鍵、硫醇橋等的官能團； FG2 是能夠通過點擊化學與FG3 反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； FG3 是能夠通過點擊化學與FG2 反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽； 大分子是水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽；它可以包括任何以下化合物：包含6至26個碳原子的脂肪酸，選自下列的聚合物之一：2-甲丙烯醯-氧乙基磷醯膽鹼、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸脂)、聚(丙烯醯胺)、聚(N-丙烯醯嗎啉)、聚(烷氧基)聚合物、聚(醯胺)、聚(醯胺胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬醯胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚對苯二甲酸丁二醇酯、聚(己內酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯醯胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(磷酸三乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(a-羥酸)、聚(羥乙基丙烯酸脂)、聚(羥乙基噁唑啉)、聚(羥基甲基丙烯酸酯)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚(羥丙基噁唑啉)、聚(亞氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯醯胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有機磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚磷腈、聚(丙二醇)、聚(糖)、聚(矽氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲醚)、聚(乙烯吡硌烷酮)、矽酮、直鏈澱粉、纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、殼多糖、殼聚糖、葡聚糖、糊精、明膠、透明質酸和衍生物、官能化透明質酸、甘露聚糖、果膠、肝素、硫酸乙醯肝素、鼠李聚糖半乳糖醛酸、澱粉、羥烷基澱粉、羥乙基澱粉、聚唾液酸及其它碳水化合物-基聚合物、木聚糖，以及白蛋白、轉鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白、免疫球蛋白、XTEN肽的共聚物、富甘氨酸高氨基酸聚合物、PAS多肽、彈性蛋白-樣多肽 (ELP)、CTP肽或明膠-樣蛋白 (GLK) 聚合物。
  107. 如請求項106所述之方法，其中，x或z是2至25的整數。
  108. 如請求項106所述之方法，其中，x或z是3至25的整數。
  109. 如請求項106所述之方法，其中，x或z是4至25的整數。
  110. 如請求項106所述之方法，其中，x或z是5至25的整數。
  111. 如請求項106所述之方法，其中，x或z是6至25的整數。
  112. 如請求項106至111中任一項所述之方法，其中，L是可釋放接頭。
  113. 如請求項112所述之方法，其中，所述可釋放接頭是如請求項1至22中任一項所述之可釋放接頭。
  114. 如請求項106至113中任一項所述之方法，其中，所述蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  115. 如請求項114所述之方法，其中，所述細胞因子是GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α或TNF-β。
  116. 如請求項114或115所述之方法，其中，所述細胞因子是IL-2。
  117. 如請求項116所述之方法，其中，所述IL-2包含與SEQ ID NO:1的80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
  118. 如請求項114所述之方法，其中，所述趨化因子是MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309(CCL1)、BCA1(CXCL13)、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸細胞活化趨化因子-1、嗜酸細胞活化趨化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC(CCL20)、ELC(CCL19)、SLC(CCL21)、ENA-78、PBP、TECK(CCL25)、CTACK(CCL27)、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
  119. 如請求項114所述之方法，其中，所述抗體靶向以下中的一個或多個：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受體樣激酶1、澱粉狀蛋白A蛋白、β–澱粉狀蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125(模擬)、C5、CA-125、CCL11(嗜酸細胞活化趨化因子-1)、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C242抗原、CD276、CD278、CD319、艱難梭菌、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、達比加群、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、內皮糖蛋白、上皮唾蛋白、EPHA3、c-Met、FGFR2、纖維蛋白II β鏈、FGF 23、葉酸受體1、GMCSF、GD2神經節糖苷、GDF-8、GCGR、明膠酶B、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受體α-鏈、激肽釋放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受體、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6 R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干擾素α/β受體、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、乙型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-選擇素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、間皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、連接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂醯絲氨酸、RANKL、RTN4、獼猴因子、ROR1、SLAMF7、金黃色葡萄球菌α毒素、金黃色葡萄球菌雙組分殺白細胞素、SOST、選擇素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受體、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
  120. 如請求項106至119中任一項所述之方法，其中，所述環炔基是二苯并環辛炔(DBCO)。
  121. 一種聚合試劑，所述聚合試劑具有根據式(V)的結構：
    Figure 03_image345
    (V) 或其立體異構體、互變異構體或其混合物，或其同位素變體， 其中， POLY1 是第一水溶性聚合物； POLY2 是第二水溶性聚合物； X1 是第一間臂部分； X2 是第二間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R3 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R4 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1是0至3的整數； a2是0至3的整數； c是0至4的整數； Rel 當存在時，是第一電子改變基團； Re2 當存在時，是第二電子改變基團； Rd 是硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基；和 FG1 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵，如氨基甲酸酯鍵的官能團。
  122. 如請求項121所述之聚合試劑，其中，所述聚合試劑具有根據化學式(V-A)的結構：
    Figure 03_image038
    (V-A) 其中n獨立地為4至1500的整數。
  123. 一種聚合試劑，所述聚合試劑具有根據化學式(VI)的結構：
    Figure 03_image040
    (VI) 或其立體異構體、互變異構體或其混合物，或其同位素變體， 其中， POLY1 是第一水溶性聚合物； POLY2 是第二水溶性聚合物； X1 是第一間臂部分； X2 是第二間臂部分； Y1 是O或S； Y2 是O或S； Y3 是O或S； R1 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R2 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1是0-3的整數； a2是0-3的整數； Rel 當存在時，是第一電子改變基團； Re2 當存在時，是第二電子改變基團； Rp 是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；和 FG4 是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵，如醯胺鍵的官能團。
  124. 如請求項123所述之聚合試劑，其中，所述聚合試劑具有根據化學式(VI-A)的結構：
    Figure 03_image042
    (VI-A) 其中n獨立地為4至1500的整數。
  125. 一種藥物組合物，其包含如請求項23至28、30至51和53至105中任一項所述的偶聯物；和一個或多個藥物可用的賦形劑。
  126. 一種治療方法，其包括向對其有需要的受試者施用如請求項125所述之藥物組合物。
  127. 如請求項126所述之治療方法，其中，施用所述藥物組合物以用於治療癌症、感染或自身免疫病。
  128. 一種治療方法，其包括結合其它適合的治療劑，向對其有需要的受試者施用如請求項125所述之藥物組合物。
  129. 如請求項128所述之治療方法，其中，所述治療劑是抗體。
  130. 如請求項129所述之治療方法，其中，所述抗體是抗腫瘤抗原抗體。
  131. 如請求項130所述之治療方法，其中，所述抗腫瘤抗原抗體具有通過ADCC功能的活性。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113929731A (zh) * 2021-12-16 2022-01-14 北京春雷杰创生物科技有限公司 一种促进低分子量蛋白体外复性和提高免疫原性的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022103983A2 (en) * 2020-11-11 2022-05-19 Sutro Biopharma, Inc. Fluorenylmethyloxycarbonyl and fluorenylmethylaminocarbonyl compounds, protein conjugates thereof, and methods for their use
WO2023244517A1 (en) * 2022-06-16 2023-12-21 Merck Sharp & Dohme Llc Interleukin-2 prodrugs
CN115947745B (zh) * 2022-12-26 2024-02-27 中山大学 一种基于白蛋白的光热转换纳米材料及其制备方法和应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100240773A1 (en) * 2009-03-23 2010-09-23 Kenneth Korzekwa Multifunctional linkers
WO2011140392A1 (en) * 2010-05-05 2011-11-10 Prolynx Llc Controlled drug release from solid supports
WO2011140393A1 (en) * 2010-05-05 2011-11-10 Prolynx Llc Controlled release from macromolecular conjugates
EP2571496A4 (en) * 2010-05-05 2016-03-30 Prolynx Llc CONTROLLED RELEASE OF MEDICINE FROM DENIMERS
CN103945870B (zh) * 2011-09-07 2016-10-12 普罗林科斯有限责任公司 生物可降解交联的水凝胶
WO2013036857A1 (en) * 2011-09-07 2013-03-14 Prolynx Llc Sulfone linkers
WO2013059323A1 (en) * 2011-10-18 2013-04-25 Prolynx Llc Peg conjugates of exenatide
WO2015061503A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-30 Prolynx Llc Conjugates of somatostatin and its analogs
EP3134128B1 (en) * 2014-10-03 2019-06-05 Synaffix B.V. Sulfamide linker, conjugates thereof, and methods of preparation

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113929731A (zh) * 2021-12-16 2022-01-14 北京春雷杰创生物科技有限公司 一种促进低分子量蛋白体外复性和提高免疫原性的方法

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