CN113929731A - 一种促进低分子量蛋白体外复性和提高免疫原性的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种促进低分子量蛋白体外复性和提高免疫原性的方法，主要包括如下步骤：构建含有ELP标签的载体蛋白和目的蛋白；使用修饰载体蛋白制备复性工具分子；复性工具分子和变性目的蛋白通过ELP标签在高于相变温度时形成复性复合物；完成复性的复合物，通过降低温度至相变温度之下诱发相变反应使聚合的ELP标签解聚，释放出复性完全的目的蛋白，复性工具分子回收再利用；含有ELP标签的复性完全的抗原免疫动物，由于机体温度高于相变温度，抗原于体内诱发自聚集，进而增加抗原表位，提高抗原稳定性，大幅提升低分子量蛋白的免疫效率。本发明解决了PEG修饰后蛋白免疫原性下降从而不能用于免疫及低分子量蛋白免疫原性低，体内易降解的问题。
Description
技术领域
本申请涉及蛋白体外复性领域，尤其涉及一种可提高低分子量蛋白体外复性效率和增加其免疫原性的方法。
背景技术
通过免疫实验动物制备抗体是一项成熟的生物技术，产生的特异性抗体作为工具被广泛的应用于生命科学研究、临床诊断以及检验检疫等领域。根据应用要求的不同对抗体的性能也存在着不同的要求。
临床检测中通常会通过免疫反应来检测体液中某靶标物质含量的多少进行病情的诊断和治疗效果的判定。由于某些情况下（如尿液）靶标物质含量极低，这就要求相关抗体拥有极高的效价和灵敏度，对痕量靶标也可以做到精准的识别。
众所周知，抗体的性能决定于抗原的质量。纯度越高，结构越接近天然蛋白的抗原越能取的高性能的抗体。通常来说，免疫用抗原优先选择天然来源，但受制于材料来源有限以及杂蛋白过多的影响无法满足持续生产的要求。
第二条思路是利用基因工程技术，将目标蛋白基因重组表达于原核、真核以及哺乳动物细胞等表达体系中，通过大规模发酵和培养后纯化得到目的蛋白。但很多人源蛋白质无法表达或无法正确表达，针对这一情况通常的做法是根据蛋白结构和组成的分析对部分“关键区域”进行截短表达，以增加目的蛋白的表达几率，而对于表达不正确的蛋白如包涵体表达等则需要进行体外复性，通过变性后的蛋白在适宜条件下重折叠来形成正确的结构。
以常用的原核表达系统为例，由于大肠杆菌等原核生物的蛋白转录及转译系统非常原始，其对于人源蛋白的表达相对困难，且对重组蛋白大小有着较为严格的限制，通常大于30kd的蛋白成功表达的几率很低。所以更倾向于重组表达目标分子的特异表位(一般10~30kd）作为抗原进行免疫。
而低分子量蛋白抗原进行免疫经常面临2个问题：1低分子量蛋白免疫原性较低，不易取得高效价抗体；2 蛋白结构不正确，产生的抗体同天然蛋白产生的抗体性质差异过大。
解决免疫原性低常见的思路是通过体外修饰（许杨等 CN200910115824.2）和人工纳米微球组装（刘琦等 2016）等提高抗原的免疫原性和体内稳定性，以获得高效价抗体。解决结构不正确的问题则是通过体外复性工艺的优化以获得结构正确的抗原分子（洪文艳等2017）。综上所述，低分子量蛋白作为抗原进行免疫是获得抗体的有效手段，而获取高性能抗体的关键在于抗原结构正确以及延长其在体内的稳定性。抗原结构的正确往往依赖于蛋白复性工艺的开发，其大致思路都是优化变性蛋白重折叠的过程，保持复性分子的独立性，避免因分子碰撞造成的错误聚集和折叠。做为常见的复性辅助分子，聚乙二醇及其衍生物经常被应用于蛋白质的体外复性工艺中。
聚乙二醇是一种高分子聚合物，化学式是HO(CH2CH2O)nH；分子量从几千到几万不等。化学性质稳定，是常见的医用辅料，Schaffer 等1950年对PEG的生物安全性研究表明，当分子量大于1000时，无明显的生物毒性。在生物制药领域不同改性的聚乙二醇分子如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)等被开发出来用于修饰不同的药物分子，以达到增加体内稳定性和降低免疫原性的作用。
聚乙二醇及其衍生物具有高度亲水性，在水溶液中具有较大的水化半径，当偶联到目标分子（蛋白质、药物分子等）表面时可以改变其在水溶液中的生物分配和溶解性，在其修饰的分子周围形成空间屏障，减少其他大分子如酶类的靠近以增加该分子在溶液中的稳定性。
利用聚乙二醇及其衍生物在水溶液中拥有较大的水化半径这一特性，科学家将其利用在蛋白质复性领域。聚乙二醇及其衍生物同目的蛋白偶联，使得目标蛋白分子拥有了较大的水化半径，降低了蛋白分子之间的碰撞几率，减少了错误聚集引起的变性沉淀(王彦，范开 2009 江红 CN107118269A)。同时也可以将PEG直接引入复性过程，提示PEG的存在可以增加复性的成功率（谢瑶瑶 2014）。
PEG修饰是常见的蛋白质复性及长效性改性思路之一，广泛的应用于药物设计，也可以通过其衍生物形成靶标分子的聚集物以增加靶标分子在体内的稳定性和长效性。（田硕等 2010）但该方法复性的蛋白不能用于动物免疫制备抗体，因为修饰后的蛋白分子免疫原性下降，不利于抗体的产生。这就需要对目标蛋白进行去PEG化，这一操作需要特殊的聚乙二醇衍生物（如巯基化的聚乙二醇）在特殊条件下(如还原状态)来实现，大大限制了该方法的使用。所以单独的PEG修饰策略不能用于抗原分子体外复性。
类弹性蛋白多肽（elastin-like-ploypeptide，ELP）是一种工程蛋白质聚合物，其结构由五肽重复序列构成（五肽序列为(VPGXG)n，其中X为除Pro之外的任何氨基酸）（UrryD W 1991）。ELP的特性是可以引发可逆相变反应，在特定的反转温度（inversetemperature transition，ITT）下该肽段高度可溶且非常伸展。反之当温度高于反转温度，ELP则开始聚集，形成聚合物（Urry D W 1997）。ELP具有特殊温度诱导的自组装能力以及良好生物相容性和极低的免疫原性，被认为是良好的生物工程材料和药物载体。通过调整肽段的组成、重复数量以及修饰方式可以调节ELP的反转温度用于药物在体内释放的调节（Fujita Y 2009）。高卫平等(2015)的研究结果表明融合了ELP的干扰素α(INF-α)半衰期提高28倍。
ELP标签的可逆相变反应介导的蛋白自聚集效应是一种潜在的增加抗体免疫效果的方法。其优势在于：1 ELP标签本身免疫原性极低，不产生杂抗体（Urry DW 1998）；2 体内温度诱导抗原发生自聚集效应，增加了抗原表位的稳定性，提高了抗原呈递的强度。但在具体实施中这种聚集倾向容易诱导目的蛋白在表达过程中和表达后发生聚集进而导致蛋白变性，而且由于不同长度的ELP对蛋白性质以及结构的影响均不相同（沈婷婷等 2015），这也增加了抗原体外复性的难度，所以该方法目前多用于生物工程材料和药物载体方向，而不用于抗原的制备，也就无法应用于免疫。
PEG及其衍生物的修饰技术广泛用于蛋白质复性及长效性改性但不能用于抗原的制备。ELP可以在体内增加抗原的免疫原性但不利于抗原制备过程中形成正确的结构。两种方案均有各自的优点和不可克服的缺点，所以无法单独使用。
所以我们需要开发一种抗原体外复性方案，该方案既能解决PEG及其衍生物不能用于抗原分子复性的问题，同时制备的抗原还具备较高的免疫原性，可以用来制备高效价，高灵敏度的抗体。
发明内容
本发明涉及一种可提高低分子量蛋白体外复性效率和增加其免疫原性的通用方法。该方法使用PEG修饰的含有类弹性蛋白多肽（elastin-like-ploypeptide，ELP）标签的载体蛋白作为复性工具分子，该工具分子在升温时和同样含有ELP标签的变性状态低分子量目的蛋白通过ELP标签聚合形成复性复合物。该复合物通过PEG对待复性蛋白形成的分子水平的空间保护，降低碰撞几率提高复性成功率。之后再通过降温相变过程使结合的ELP标签解聚，复性工具分子同目的蛋白分离。透析后复性工具分子回收重复利用，复性完全的目的蛋白用于动物免疫。由于动物体内温度满足ELP升温相变要求，抗原分子在体内自聚集形成稳定的抗原聚合物具备更高的免疫原性，并且延长抗原分子体内存在时间，强化抗原呈递效果，提高抗体效价。
本发明采用以下技术方案实施
本发明技术实施流程按图1所示：
1复性工具蛋白以及目标蛋白的分子生物学构建。
1.1如图2所示，采用公认的可溶性好且表达量大的标签蛋白做为载体蛋白，包括但不限于：麦芽糖结合蛋白MBP、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、SUMO、GB1、TrxA等。将序列优化的ELP标签（主要是根据蛋白大小、氨基酸组成以及等电点等理化性质对五肽序列中的X 和序列的长度n 进行优化）构建于载体蛋白的C端。
1.2优化后的ELP标签构建于目标分子N端。
2 复性工具分子的制备
2.1构建完成的载体蛋白质粒转化BL21(DE3)工程菌。
2.2 按照常规发酵及诱导条件诱导载体蛋白表达。
2.3 保持体系温度在2~8℃的情况下按照载体蛋白的纯化策略进行纯化，得到载体蛋白纯品，保存于4℃备用。
2.4 按照图3所示将载体蛋白纯品按照同PEG摩尔比1:1.5比例搅拌情况下缓慢滴加入预冷至2~8℃的修饰反应液(5g/L PEG 6K;100mmol/L NaCl;20 mmol/L PB pH7.4)中，保持温度不变的情况下搅拌1h，修饰后产物经超滤换液去除多余PEG后待用。此时由于PEG修饰后的工具分子拥有较大的水化半径，即便温度高于相变温度，工具分子之间也不会发生聚集。
3 目的蛋白的包涵体表达及纯化
3.1目的蛋白菌种按照常规方法发酵后得到含ELP标签的目的蛋白(包涵体)。
3.2 包涵体使用含有梯度变性剂的变性缓冲液进行清洗去除杂蛋白，最终于高浓度胍盐（6 mol/L）或尿素(8 mmol/L)的变性缓冲液中完全变性，保持2~8℃低温备用。
4 复性复合物的制备
4.1按图4所示，将步骤2.4取得的复性工具分子于35℃（升温相变）快速搅拌。按照复性工具分子和变性目的蛋白摩尔比1:0.8的比例，缓慢滴加变性目的蛋白于体系中，持续搅拌2h，此时形成的单分子复性复合物帮助目的蛋白完成折叠复性。
4.2 保持体系35℃下去除产生的沉淀，此沉淀为少数未形成复性复合物的目的蛋白产生的错误聚集。
4.3 按图5所示，保持体系持续搅拌的情况下将温度逐步降低到2~8℃(降温相变)，并持续1h。使得复性复合物中的ELP标签解聚，释放出复性完全的目的蛋白。
4.4 按图5所示，使用超滤膜，2~8℃下根据分子大小不同分离复性工具分子和目的蛋白，工具分子回收再利用，目的蛋白4℃保存。
5 动物免疫及效价检测
按图5所示，目的蛋白为免疫用抗原，4℃保存时为单分子解聚状态，注射入皮下后由于动物基础体温高于相变温度，抗原发生自聚集形成多聚体，提升免疫效果。
5.1 获得的目的蛋白按照王传武等(2002)所述标准免疫流程选择新西兰大耳白进行免疫制备多克隆抗体。共进行五次免疫，每次免疫后取耳血Elisa检测免疫效果。
5.2 按照曹黎黎等(2011)年所述方法免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体，共进行四次免疫，每次免疫后取尾血Elisa检测免疫效果。
附图说明
图1为本发明技术实施流程；
图2为通用复性工具蛋白及待复性抗原的分子设计图；
图3为PEG修饰载体蛋白制备复性工具蛋白图；
图4为复性工具蛋白帮助目的蛋白复性原理图；
图5为复性后目的蛋白的分离以及体内自聚集原理图；
图6为含ELP标签的vWF可以加强多克隆抗体免疫效果；
图7为含ELP标签的HBP可以加强单克隆抗体的免疫效果。
具体实施方式
实施例一
使用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为载体蛋白，按照1.1的要求构建复性工具分子的表达质粒。分子量为15Kd的血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)截短体按照1.2的要求构建表达质粒。采用的ELP序列为-VPGAG-VPGAG-。获得抗原用于免疫新西兰大耳白制备多抗，通过对免疫过程的Elisa检测表明，含有ELP标签的抗原实验组随着免疫次数的增加，抗血清效价提升明显高于无ELP标签抗原对照组。相对于无ELP标签的对照组，抗血清效价提升约4倍达到1:3000(如图6所示)。融合了ELP标签的抗原较常规复性的抗原取得了更好的免疫效果。
实施例二
使用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）作为载体蛋白，按照1.1的要求构建复性工具分子的表达质粒。分子量为17Kd肝素结合蛋白(Heparin-Binding Protein,HBP)截短体按照1.2的要求构建表达质粒。采用的ELP序列为-VPGSG-VPGSG-VPGSG-。获得抗原用于免疫BALB/C小鼠制备单抗，通过对免疫过程的Elisa检测表明，含有ELP标签的抗原实验组随着免疫次数的增加，其抗血清效价提升明显高于无ELP标签抗原实验组。相对于无ELP标签的对照组，抗血清效价提升5倍达到1:10000(如图7所示)。融合了ELP标签的抗原较常规复性的抗原取得了更好的免疫效果。
Claims (8)
1.一种促进低分子量蛋白体外复性和提高免疫原性的方法，其特征在于，所述方法利用复性工具分子与含有类弹性蛋白多肽标签的变性目的蛋白一起组成复性复合物来促进低分子量蛋白体外复性和提高免疫原性，其中，所述复性工具分子为聚乙二醇或其衍生物修饰的含有类弹性蛋白多肽标签的载体蛋白。
2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述方法包含三个步骤：a升温相变，复性工具分子同变性目的蛋白通过类弹性蛋白多肽标签形成复性复合物，目的蛋白在复性复合物的帮助下完成复性；b降温相变，复性的目的蛋白同复性工具分子之间的类弹性蛋白多肽标签连接解聚而释放出来；c 体内升温相变，目的蛋白用于免疫时在动物体内由于温度升高发生自聚集，增加抗原表位及稳定性，提高免疫原性。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述类弹性蛋白多肽标签由一段多肽重复序列构成,其核心五肽序列为(VPGXG)n，其中X为除Pro之外的任一氨基酸,n为重复的次数，所述类弹性蛋白多肽标签具备可逆相变的特征，所述可逆相变是指低于相变温度肽段表现为解聚，而高于相变温度则表现为聚集，且该过程可逆。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述类弹性蛋白多肽标签分别构建于载体蛋白的C端和目的蛋白的N端。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白和目的蛋白所包含的类弹性蛋白多肽标签序列相同或不同。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复性工具分子为聚乙二醇或其衍生物修饰后的载体蛋白，所述聚乙二醇及其衍生物含有-(CH2CH2O)n-的基本骨架结构。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白为可溶性蛋白标签，包括麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、小泛素相关修饰物、GB1、大肠杆菌硫氧还蛋白。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法制备的抗原适用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备过程。
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