CN107118269A - 一种重组人il‑24蛋白的peg修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人IL‑24蛋白(rhIL‑24)的PEG修饰方法,包括：a.构建人IL‑24的重组原核表达载体，诱导表达，得到包涵体；b.选择变性剂对所述包涵体进行变性，得到变性后的蛋白；c.确定复性条件，对所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白；d.在对所述复性后的蛋白添加SDS的条件下，进行凝胶过滤纯化，得到纯化后的目的蛋白；e.对所述纯化后的目的蛋白用PEG修饰剂进行定点修饰，得到终产品。该方法在制备高纯度重组人IL‑24蛋白的基础上，利用聚乙二醇进行定点修饰，在修饰蛋白的周围产生空间屏障，减少蛋白的酶解，延长了半衰期，且不影响其体外抑瘤活性，利用率增加，提高了稳定性和生物学活性。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤生物治疗技术领域，特别是涉及一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法。
背景技术
人白细胞介素24(Interleukin 24,IL-24)是1995年哥伦比亚大学Paul Fisher教授通过消减杂交在人黑色素瘤细胞HO-1中发现的一种细胞因子，属于IL-10超家族成员。近二十年的研究表明IL-24是抗肿瘤的“明星”分子。首先，IL-24在正常组织的内源性表达具有高度的组织特异性，只在免疫系统相关组织(如脾、胸腺和外周血白细胞)和特定类型的细胞中表达；其次，IL-24具有广谱而特异的抗瘤活性，能够抑制多种肿瘤(如肺癌、乳腺癌、宫颈癌等)的体内外生长，对正常细胞几乎没有影响，与p53基因型的改变无关；同时，IL-24具有刺激机体抗肿瘤免疫反应的能力，能够诱导外周血单核细胞PBMC产生IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α，IFN-γ)等；而且，IL-24可以增强肿瘤细胞的放化疗敏感性，与肿瘤靶向药物(如厄洛替尼等)、化疗药物(如顺铂等)或放疗联用可产生叠加或协同的抗瘤效果；最后，IL-24在一些肿瘤组织(如黑色素瘤)的高水平表达与预后正相关，提示它可能是一个新的肿瘤预后标志物。正是因为上述这些的特点，IL-24被称为肿瘤治疗的“神奇子弹”，对IL-24进行深入研究不仅具有重要的理论意义，而且具有重大的临床应用价值。
在将IL-24应用于临床肿瘤的研究中，美国Introgen Therapeutics公司于2002年率先开发了携带IL-24基因的重组腺病毒--“INGN241”，Ⅰ期临床实验结果显示对乳腺癌、肺癌和结肠癌的治疗效果良好。与腺病毒载体相比，基因工程蛋白药物更为安全，同时还具有药理活性高、副作用小、用量少、生物活性强、疗效好等特点。当然，在蛋白质多肽类药物的临床使用过程中也存在一些问题，如易被蛋白水解酶水解、较短的循环半衰期、需要频繁注射、较短的保存有效期、易被机体快速清除和易于引起中和抗体的产生等。因此，需求一种方法可以提高其稳定性。
发明内容
重组人IL-24蛋白在哺乳动物体系中表达水平极低，但体内外的抑瘤活性高，终浓度为ng/ml，而在大肠杆菌中表达水平高，但活性较低，终浓度为ug/ml，甚至没有活性。考虑到聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)没有免疫原性，亲水性强，在水溶液中有较大的水动力学体积，与蛋白质的某些氨基酸结合后，在修饰蛋白质的周围产生空间屏障，减少蛋白的酶解，避免在机体代谢中被快速清除，同时考虑到PEG是经美国食品药品监督管理局批准的极少数能作为体内注射用药的合成聚合物之一，本发明的申请人提出一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，来提高大肠杆菌中表达的重组人IL-24蛋白的活性，提高稳定性，延长其半衰期。
本发明目的在于，克服大肠杆菌表达的重组人IL-24蛋白由于缺乏糖基化修饰等原因导致活性较低的缺陷。本发明在制备高纯度重组人IL-24蛋白的基础上，利用聚乙二醇对大肠杆菌表达的重组人IL-24蛋白进行定点修饰，来提高抑瘤活性，提高稳定性，延长半衰期。
本发明的一个方面，提供一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.构建人IL-24的重组原核表达载体，诱导表达，得到包涵体；
b.选择变性剂，对所述包涵体进行变性，得到变性后的蛋白；
c.确定复性条件，对所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白；
d.对所述复性后的蛋白进行凝胶过滤纯化，得到纯化后的目的蛋白；
e.对所述纯化后的目的蛋白用PEG修饰剂进行定点修饰，得到终产品。
本发明所述的IL-24重组蛋白的PEG修饰方法的步骤，其中，
步骤a中，首先，选取模板，进行PCR扩增，得到成熟蛋白基因序列，将成熟蛋白基因序列克隆至载体，得到人IL-24的重组原核表达载体，然后，确认诱导条件，优化表达条件，进行诱导表达，得到包涵体。其中，所述确定诱导条件包括选择宿主菌，确定起始菌浓度，确定诱导剂及诱导剂终浓度，确定诱导温度以及诱导时间。
优选地，所述模板为IL-24-Flag质粒；所述载体为pET-28a载体。
优选地，所述宿主菌为大肠杆菌BL21。
优选地，所述起始菌浓度OD600值的范围为0.6～0.8。
优选地，所述诱导剂为IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂)。
优选地，所述诱导剂的终浓度范围为0.5mM～1mM。
优选地，所述诱导时间范围为4～5h。
更优选地，所述诱导菌起始浓度OD600值为0.6，所述诱导剂终浓度为0.5mM，所述诱导温度为37℃，所述诱导时间为5h。
步骤b，变性前，洗涤所述包涵体，超声碎菌后加入洗涤液对包涵体进行离心洗涤，提高包涵体的纯度；选择变性剂，按照比例加入包涵体和变性剂进行变性，震荡过夜，得到变性后的蛋白。
优选地，所述洗涤液包括TritonX-100、NaCl、蒸馏水以及脲。
优选地，所述变性剂包括盐酸胍和脲，高浓度的脲和盐酸胍的水溶液能断裂氢键，从而使蛋白质发生不同程度的变性，同时，还可以通过增大疏水基酸性残基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用；更优选地，所述变性剂为盐酸胍，重组人IL-24蛋白成熟蛋白疏水性极强，包涵体主要为疏水性聚集，盐酸胍对于疏水性聚集的溶解更好。
优选地，所述包涵体与变性剂比例范围为1g：10ml～1g：30ml；更优选地，所述包涵体与变性剂比例为1g：20ml。
优选地，所述变性剂在β-疏基乙醇还原二硫键的存在下，配制变性缓冲溶液进行变性。更优选地，所述β-疏基乙醇含量为所述变性缓冲液的1％。
步骤c，首先分析重组人IL-24蛋白等电点，进行等电点的模拟确定复性条件：确定复性液pH、氧化还原对及氧化还原对比例、以及复性添加剂；然后对步骤b得到的所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白。
优选地，在酸性条件下进行复性，pH越低，复性效果越好；更优选地，所述复性液pH值为5.5。
优选地，所述氧化还原对为谷胱甘肽(GSH-GSSG)；更优选地，所述氧化还原对比例为1:1左右，二硫键正确配对率高。
优选地，所述复性添加剂为精氨酸、脲、盐酸胍和甘油；更优选地，所述复性添加剂为脲，脲溶于水后不会电离出离子，助溶效果好。
优选地，所述复性添加剂浓度范围为0.5M～3M；更优选地，所述复性添加剂为浓度为2M。
步骤d，在步骤c得到的所述复性后的蛋白中，添加表面活性剂，然后采用凝胶过滤柱进行一步凝胶过滤纯化，得到纯化后的目的蛋白，再脱盐除去SDS得到纯度较高的复性蛋白。
优选地，所述凝胶过滤柱为GE公司的生产的S200/75。
优选地，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂，更优选地，所述表面活性剂为高级脂肪醇硫酸酯类，特别优选地，SDS(十二烷基硫酸钠溶液)表面活性剂，重组人IL-24蛋白具有疏水性极强，容易与纯化所用的介质相互作用以及对高盐及其敏感。
步骤e中，所述定点修饰包括：确定PEG修饰剂的修饰条件，选择PEG修饰剂，确定PEG与蛋白质摩尔数比例，对步骤d得到的所述纯化后的目的蛋白进行定点修饰，混匀，加入氰基硼氢化钠，混匀静置，得到终产品。
优选地，所述PEG修饰剂的修饰条件为酸性条件。
优选地，所述PEG修饰剂为醛基修饰剂，更优选地，所述PEG修饰剂为mPEG-ALD(甲氧基聚乙二醇-丙醛)。
优选地，优选分子量为5、20和30kD的mPEG-ALD进行定点修饰，更优选地，选择分子量为5kD的mPEG-ALD进行定点修饰，经过5kD修饰的蛋白可以过柱子把一些过量没修饰的PEG分离开来。
优选地，所述PEG与蛋白质摩尔数比为1:10。
优选地，所述重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，包括，利用原核表达载体pET-28a在细菌中表达的重组人IL-24蛋白经过IPTG诱导后存在于包涵体中，；重组人IL-24蛋白经变性剂6M盐酸胍变性，复性剂透析过夜后，在1％SDS存在的条件下，经凝胶过滤纯化得到高纯度的单体重组人IL-24蛋白；用mPEG-ALD(单甲氧基聚乙二醇-丙醛)定点修饰；其中，所述IPTG诱导条件：宿主菌BL21、诱导菌起始浓度OD600为0.6，诱导剂IPTG终浓度0.5mM，在37℃下诱导5h；所述复性剂：20mM乙酸-乙酸钠，2M脲，1mM GSSG，1mMGSH，pH5.5。
本发明的另一方面，还公开一种上述方法在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种PEG修饰的重组人IL-24蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述肿瘤为黑色素瘤。
与现有技术相比，本发明重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法的有益效果：
1)现有技术重组人IL-24蛋白在大肠杆菌中表达水平高，但活性较低，甚至没有活性。本发明PEG修饰大肠杆菌中表达的重组人IL-24蛋白，表达水平高、活性损失较少。
2)现有技术蛋白质多肽类药物易被蛋白水解酶水解，而聚乙二醇没有免疫原性，亲水性强，在水溶液中有较大的水动力学体积，本发明采用聚乙二醇进行修饰，与蛋白质的某些氨基酸结合后，在修饰蛋白质的周围产生空间屏障，减少蛋白的酶解，避免在机体代谢中被快速清除，提高稳定性。
3)经过PEG修饰后的重组人IL-24蛋白半衰期进一步延长，且其体外抑瘤活性不受影响，在体内存留时间延长，药物利用率增加，提高了稳定性和生物学活性。
4)经过PEG修饰后的重组人IL-24蛋白对人黑色素瘤细胞A375有显著的抑瘤活性。
附图说明
图1A是构建人IL-24的重组原核表达载体时PCR扩增IL-24片段图。其中，泳道1为DNA Marker DL2000；泳道2为阴性对照；泳道3为扩增出的IL-24M1片段。
图1B是构建人IL-24的重组原核表达载体时双酶切鉴定结果。其中，泳道1为DNAMarker DL 15000；泳道2为未双酶切重组质粒；泳道3为双酶切重组质粒；泳道4为DNAMarker DL2000。
图1C是重组人IL-24蛋白在细菌BL21中的诱导表达时，SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果。其中，泳道1为Marker；泳道2为未诱导菌裂解液；泳道3为诱导菌裂解液；泳道4为诱导菌裂解液上清；泳道5为诱导菌裂解液沉淀(包涵体)。
图1D是重组人IL-24蛋白在细菌BL21中的诱导表达时WB检测结果。
图2A是SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测不同洗涤剂对包涵体的清洗效果图。其中，Lane1为Marker；Lane2为对照即未洗包涵体；Lane3和Lane4为1％Triton洗涤包涵体后的上清C和沉淀P；Lane5和Lane6为1M NaCl洗涤包涵体后的上清C和沉淀P；Lane7和8为2M脲洗涤包涵体的上清C和沉淀P。
图2B是SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测不同变性剂盐酸胍和脲变性重组人IL-24蛋白包涵体的效果。其中，Lane1为Marker；Lane2为对照；Lane3和Lane4为盐酸胍变性后的上清C和沉淀P；Lane5和Lane6为脲变性后的上清C和沉淀P。
图2C是SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测pH和氧化还原对比例对复性的影响。
图2D是WB检测pH和氧化还原对比例对复性的影响。
图2E是SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测不同复性添加剂稀释复性的效果。其中，Lane 1为Marker；Lane2为0.5M精氨酸；Lane3和Lane 4为2M脲和3M脲；Lane 5和Lane 6为0.5M盐酸胍和1M盐酸胍；Lane 7、Lane 8和Lane 9为10％甘油、15％甘油和20％甘油。
图2F是Antheprot软件模拟重组人IL-24蛋白的等电点为pH8.8。
图3A是IL-24M1重组蛋白HPSEC纯化复性后的样品。
图3B是非还原性SDS-PAGE考马斯亮蓝检测纯化后的样品。其中，Lane 1为Marker；Lane 2为未纯化IL-24重组蛋白；Lane 3为P1；Lane 4为P2；Lane 5为P3。
图3C是还原性SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测纯化后的样品。其中，Lane1为Marker；Lane2为未纯化IL-24重组蛋白；Lane3为P1；Lane4为P2；Lane 5为P3。
图3D是Western blot检测纯化后的样品。其中，Lane 1为未纯化IL-24重组蛋白；Lane2为P1；Lane3为P2；Lane4为P3。
图4A是细菌表达重组人IL-24蛋白PEG修饰后SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测结果。其中，Lane1为Marker；Lane2为未修饰重组人IL-24蛋白；Lane 3为mPEG-ALD，5kD且PEG与蛋白质摩尔数比为1:5修饰样品；Lane 4为mPEG-ALD，5kD且PEG与蛋白质摩尔数比为1:10修饰样品；Lane 5为mPEG-ALD，20kD且PEG与蛋白质摩尔数比为1:5修饰样品；Lane6为mPEG-ALD，20kD且PEG与蛋白质摩尔数比为1:10修饰样品；Lane7为mPEG-ALD，30kD且PEG与蛋白质摩尔数比为1:5修饰样品；Lane8为mPEG-ALD，30kD且PEG与蛋白质摩尔数比为1:10修饰样品。
图4B是细菌表达重组人IL-24蛋白PEG修饰后SDS-PAGE碘染检测结果。其中，样品上样顺序同图4A。
图4C是细菌表达重组人IL-24蛋白PEG修饰后WB检测结果。其中，Lane1为未修饰重组人IL-24蛋白。
图5A是以PBS对照组OD值作为1，不同浓度buffer、IL-24和PEG-IL-24测试细胞的存活率结果示意图。
图5B是以Buffer对照组OD值作为1，不同浓度IL-24和PEG-IL-24测试细胞的存活率结果示意图。
图6是大鼠尾静脉分别注射PEG-rhIL-24、rhIL-24和Buffer B，不同时间点所取血浆中IL-24浓度变化的示意图。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。
本发明所述重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，利用原核表达载体pET-28a在细菌中表达的重组人IL-24蛋白经过IPTG诱导，其中，宿主菌BL21、诱导菌起始浓度OD600为0.6，诱导剂IPTG终浓度0.5mM，37℃诱导5h，诱导后存在于包涵体中；重组人IL-24蛋白经变性剂6M盐酸胍变性，复性剂20mM乙酸-乙酸钠，2M脲，1mM GSSG，1mM GSH，pH5.5的透析过夜后，在1％SDS存在的条件下，经凝胶过滤纯化得到高纯度的单体重组人IL-24蛋白；荧光光谱显示空间结构正确；SDS-PAGE电泳后烤染和碘染，以及Western-blot显示重组人IL-24蛋白能够被单甲氧基聚乙二醇-丙醛20000(mPEG-ALD 20000)修饰；MTT实验表明，PEG-rhIL-24和rhIL-24都具有抑瘤活性，药代动力学显示PEG修饰能够显著提高重组人IL-24蛋白的稳定性和半衰期。
具体实验步骤如下：
a.构建人IL-24的重组原核表达载体，诱导表达,得到包涵体。
以IL-24-Flag质粒为模板，利用设计的上下游引物进行PCR扩增，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物IL-24约450bp，PCR扩增IL-24片段如图1A泳道3所示。PCR产物回收后，将IL-24成熟蛋白基因序列克隆至pET-28a载体，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定重组克隆(限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA Marker购自TaKaRa公司)，获得约450bp大小目的片段如图1B泳道3所示，将IL-24表达重组载体命名为pET-28a-IL-24。将重组表达载体pET28a-IL-24转化至大肠杆菌宿主菌BL21中，确定起始菌浓度OD600＝0.6，选择IPTG诱导剂，IPTG终浓度为0.5mM，37℃条件下，诱导5h，12000rpm离心收集菌体。按1g菌体和10ml碎菌液的比例加入碎菌液20mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.5中搅拌均匀；离心收集上清和沉淀通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和WB鉴定。
SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果如图1C所示：在诱导菌全菌裂解液图1C泳道3和裂解液沉淀图1C泳道5的15--25kD之间可见到明显的诱导带，而诱导菌上清中图1C泳道4未见到相应的诱导带。
WB检测结果如图1D所示，WB检测显示在细菌裂解液沉淀中出现重组蛋白的诱导带，一抗分别为IL-24抗体AF1965(从RD公司购得)和His单抗。WB检测结果表明细菌裂解液沉淀中重组蛋白的诱导带可被IL-24的抗体AF1965和His-tag的抗体识别，重组人IL-24蛋白在细菌中获得正确表达，并含有His标签，但重组蛋白只在包涵体即裂解液的沉淀中表达，在上清中几乎不表达。
b.选择变性剂对所述包涵体进行变性，得到变性后的蛋白。
变性前，洗涤所述包涵体：超声碎菌后按1g包涵体和10ml洗涤液的比例，分别加入1％Triton X-100、1M NaCl和2M脲各离心洗涤包涵体一次，4℃10000rpm离心40min，洗涤好的包涵体用蒸馏水重悬，离心，完全去除洗涤液。SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测不同洗涤剂对包涵体的清洗效果如图2A所示，包涵体的纯度得到提高。
用两种变性剂脲和盐酸胍分别对包涵体进行变性检测，高浓度的脲和盐酸胍的水溶液能断裂氢键，从而使蛋白质发生不同程度的变性，同时，还可以通过增大疏水基酸性残基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用。按1g包涵体和20ml变性剂的比例加入变性buffer(变性缓冲液)。
变性bufferⅠ：20mM，Tris-HCl缓冲液,6M盐酸胍，1％β-巯基乙醇，pH 8.5，对包涵体进行变性，室温震荡过夜，4℃10000rpm离心20min取上清，沉淀用水重悬。
变性bufferⅡ：20mM，Tris-HCl缓冲液,8M脲，1％β-巯基乙醇，pH 8.5，对包涵体进行变性，室温震荡过夜，4℃10000rpm离心20min取上清，沉淀用水重悬。
用Bradford法测定两种变性buffer下，包涵体上清中的蛋白浓度。SDS-PAGE考马斯亮蓝染色测试不同变性剂的变性效果如图2B所示，采用盐酸胍变性剂变性上清中的目的蛋白量远远高于采用脲变性剂的蛋白量；盐酸胍变性后不溶物质的量明显少于脲变性的。由此确定6M盐酸胍作为重组人IL-24蛋白的变性剂更好，重组人IL-24成熟蛋白疏水性极强，包涵体主要为疏水性聚集，盐酸胍对于疏水性聚集的溶解更好。
c.确定复性条件，对所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白。
首先，利用Antheprot软件分析重组人IL-24蛋白等电点，等电点约为8.8，如图2F所示。将重组人IL-24蛋白的氨基酸序列导入Antheprot软件中，进行等电点的模拟；其次，根据对重组人IL-24蛋白等电点的模拟结果，确定复性液pH和氧化还原对比例，
确定复性液pH：设置不同的复性液pH值分别为5.5、6.4、9.5和10，将变性后的蛋白用不同pH值的溶液稀释至0.1mg/ml，4℃静置20h，通过WB检测复性效果，结果显示复性液酸性条件下pH值为5.5时效果最好。
选择氧化还原对为谷胱甘肽(GSH-GSSG)。确定复性buffer中氧化还原对谷胱甘肽(GSH-GSSG)比例：将变性后的蛋白用含有2M脲的20mM HAc-NaAcpH5.5溶液稀释至蛋白浓度0.1mg/ml，均分为四份，分别加入摩尔浓度比例为10:1的GSH和GSSG，摩尔浓度比例为5:1的GSH和GSSG，摩尔浓度比例为1:1的GSH和GSSG，摩尔浓度比例为1:2的GSH和GSSG，均轻轻混匀后，4℃静置过夜。12000rpm，4℃离心20min，取同样体积上清，用Bradford法测蛋白浓度。用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色检测pH和氧化还原对比例对复性的影响如图2C所示，用WB检测pH和氧化还原对比例对复性的影响如图2D所示。结果显示在复性条件为pH5.5和GSH：GSSG＝1:1时，复性后的上清中目的蛋白量最多，复性效果最好。
复性添加剂的筛选；将变性后的重组蛋白用复性buffer：20mMHAc-NaAc，1mMGSSG，1mM GSH，pH 5.5稀释至0.1mg/ml后，分成多份，分别加入复性添加剂，分别加入精氨酸、脲、盐酸胍和甘油，使其终浓度分别为精氨酸0.5mM、脲2M和3M、盐酸胍0.5M和1M、甘油10％、15％和20％；轻轻混匀后，4℃静置过夜；将复性过夜的样品12000rpm，4℃离心20min后取上清，用Bradford法测不同变性添加剂上清中的蛋白浓度如表1所示：复性溶液中添加脲后，溶液中复性上清中蛋白浓度最高，2M脲和3M脲基本无区别；而添加精氨酸的蛋白浓度最低。用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析不同复性添加剂稀释复性的效果如图2E所示，脲的助溶效果最好。
综上，最终确定重组人IL-24蛋白的复性条件为：20mM的HAc-NaAc，2M的脲，1mM的GSH，1mM的GSSG，pH 5.5，4℃透析过夜。
表1 不同复性添加剂处理变性的重组人IL-24蛋白后总蛋白浓度比较
d.在对所述复性后的蛋白添加SDS表面活性剂的条件下，用凝胶过滤柱一步凝胶过滤纯化，脱盐除去SDS，得到纯化后的目的蛋白；进行高级法相表征。
在实验过程中，发现重组人IL-24蛋白对于pH值、盐浓度以及介质极其敏感，该蛋白为强疏水性蛋白。重组人IL-24蛋白在中性pH、碱性pH，以及在高浓度的盐存在的情况下均会沉淀，而镍柱亲和层析在pH偏碱的条件下洗脱效率较好，阳离子交换需要用高盐洗脱，同时，重组人IL-24蛋白包涵体纯度比较高，因此最终选择采用添加阴离子表面活性剂SDS，乳化性很强，且较稳定，可将疏水性聚集打开，进行一步凝胶过滤纯化。具体步骤：将复性后的样品加入SDS使其终浓度为1％，用从GE公司购得的S200/75凝胶过滤柱纯化，buffer为20mM的HAc-NaAc，1％SDS，pH 5.5，上样量5mg，流速1ml/min收取约12ml处的蛋白峰如图3A的HPSEC纯化复性后样品所示，出现3个明显的峰P1、P2和P3。用非还原性SDS-PAGE考马斯亮蓝染色如图3B所示，结果显示P1、P3在20kD处，P2在40kD处，表明P2为二硫键错配导致的二聚体。用还原性SDS-PAGE考马斯亮蓝染检测纯化后的样品如图3C所示，结果显示P1、P2和P3出现在同一位置。用WB检测结果如图3D显示：显示P1、P3在20kD处，P2在40kD处，综合以上结果，判断P1峰为疏水性聚集，P2为二硫键错配导致的二聚体，P3为单体。收集P3峰，获得纯的重组人IL-24蛋白。
高级法相表征：通过荧光光谱分析重组人IL-24蛋白，分别将复性后的蛋白，凝胶纯化的三个峰P1、P2、P3各1.5ml加入石英比色皿中，以变性蛋白作为对照，在激发波长295nm下扫描300-450nm的吸光度。结果显示，变性蛋白最大吸收峰在350nm，凝胶纯化P1、P2、P3最大吸收峰分别为340nm、343nm和345nm。变性蛋白结构松散，相对于复性蛋白发生红移。结合凝胶纯化结果，P1、P2和P3均为IL-24的不同形式，P1为疏水性多聚体，蓝移最明显。P2为二硫键错配引起的二聚体，蓝移较少。P3为单体，最大吸收峰介于P1、P2和变性蛋白之间，结果与电泳结果吻合。透析复性过夜的最大吸收峰在341nm处，说明复性过夜的样品主要以疏水性聚集的形式存在。
e.对所述纯化后的目的蛋白进行PEG定点修饰，得到终产品。
由于复性后的重组人IL-24蛋白对于pH极其敏感，只在酸性条件下稳定且多以可溶性疏水聚集为主，因此在酸性条件下进行PEG定点修饰。
将复性的凝胶过滤纯化的重组人IL-24蛋白，按PEG与蛋白质摩尔数比A:B＝1:5和1：10。分别加入三种不同分子量5kD、20kD和30kD的甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)进行定点修饰(mPEG-ALD 5kD、20kD和30kD购自北京键凯科技有限公司)，即PEG的用量分别为5mg，20mg，30mg，重组人IL-24蛋白的用量为1mg，混匀；各加入10倍PEG摩尔数比的氰基硼氢化钠，轻轻混匀；室温静置反应16h。SDS-PSGE考马斯亮蓝染色检测PEG修饰的效果如图4A所示；碘染对PEG修饰的效果如图4B所示；WB对PEG修饰的效果如图4C所示。结果显示三种不同的PEG都能成功的修饰上重组人IL-24蛋白，且在PEG与蛋白质摩尔数比A:B＝1:5和1：10两种条件中，A:B＝1：10的效果要好一些。由于PEG修饰对原蛋白重组人IL-24蛋白影响挺大的，WB中蛋白带会受到一些美观的影响，修饰后的纯化，因为经过5kD修饰的蛋白可以过柱子把一些过量没修饰的PEG分离开来，所以选的分子量5kD的mPEG-ALD。
检测PEG定点修饰对重组人IL-24蛋白的体外抑瘤活性的影响：为了分析大肠杆菌表达的rhIL-24和被PEG-rhIL-24在体外是否有抑瘤活性，将两种蛋白的相同终浓度加入到A375细胞的培养液中进行MTT检测。用MTT测定大肠杆菌重组IL-24蛋白抑制人黑色素瘤细胞A375体外增殖能力。加入不同浓度(0.1、1和10μg/ml)纯化的rhIL-24和PEG-rhIL-24孵箱中培养后用酶标仪测定OD490值；将对照组值作为1看其细胞的存活率，确保实验的可重复性和数据准确性。图5A所示以PBS对照组OD值作为1测试结果；图5B所示以Buffer对照组OD值作为1测试结果，结果表明，rhIL-24和PEG-rhIL-24在(0.1、1和10μg/ml)下对人黑色素瘤细胞A375都有显著性的抑瘤活性，且抑瘤活性呈剂量依赖性。在相同的浓度下，PEG-rhIL-24和rhIL-24的抑瘤活性差异不大，在蛋白浓度为10μg/ml时，细胞存活率分别为33.7％和35.2％，在蛋白浓度为1μg/ml时，细胞存活率分别为58.9％和58.4％，在蛋白浓度为0.1μg/ml时，细胞存活率分别为分别为80.2％和90.7％，PEG-rhIL-24对黑色素瘤细胞抑瘤活性微低于rhIL-24。
PEG定点修饰对重组人IL-24蛋白半衰期的影响：进行药代动力学实验，由于纯化后和修饰后的蛋白缓冲液是Buffer A：含10mg/ml SDS的pH5.5，20mM的NaAC-HAC溶液，高剂量的SDS会导致大鼠溶血作用从而导致死亡，所以选取了200μl含有SDS不同浓度0.001，0.01，0.1，1和10mg/ml的pH5.5，20mMNaAC-HAC溶液尾静脉注射大鼠，发现注射低于0.1mg/ml的SDS大鼠的生理状态和存活情况基本良好。于是我们将溶于Buffer A中PEG-rhIL-24和rhIL-24通过透析置换到Buffer B：含0.1mg/ml SDS的pH5.5，20mM的NaAC-HAC溶液中，置换后蛋白没有发生沉降。再用Buffer B将蛋白超滤至1.25mg/ml；然后按照1mg/kg剂量尾静脉注射SD大鼠，9只雄鼠，随机分三组，分别注射PEG-rhIL-24、rhIL-24和对照组Buffer B，注射后，在不同时间点0.5、1.5、3、6、12、24、48和72h断尾采血各收集0.5ml血液，加入EDTA-Na2抗凝剂，离心取血清，做ELISA检测，分别测出不同时间点的IL-24蛋白浓度，如图6所示。由于蛋白药物在体内分为吸收、消除和吸收并存、完全消除三个阶段，选取消除期的四个时间点6、12、24和48h，根据公式t1/2＝0.693/k，其中，k为消除常数，k＝(lntb-lnta)/(ta-tb))计算出IL-24蛋白的半衰期。结果表明,PEG-rhIL-24和rhIL-24两种蛋白随着时间延长在体内逐渐降解，而对照组注射Buffer B大鼠血浆中IL-24浓度极低，而且随着时间延长基本保持不变。统计学分析t检验显示，除了0.5h外，其余时间两个实验组大鼠血浆中的IL-24浓度都具有统计学意义的差异(P值分别为0.002、0.006、0.01、0.022、0.078和0.093)。浓度相差最大的时间点在12h，PEG-rhIL-24和rhIL-24浓度分别为1369pg/ml和451pg/ml。根据公式，用消除期的IL-24浓度计算出重组人IL-24蛋白半衰期为12.62h，PEG-rhIL-24半衰期为18.44h，结果表明PEG定点修饰后重组人IL-24蛋白的半衰期明显延长，由此可以提高重组人IL-24蛋白稳定性。
综上所述，本发明采用聚乙二醇对大肠杆菌表达的重组人IL-24蛋白的进行定点修饰，与蛋白质的某些氨基酸结合后，在修饰蛋白质的周围产生空间屏障，减少蛋白的酶解，避免在机体代谢中被快速清除。实验结果表明细菌中表达的重组人IL-24蛋白表达水平高，以包涵体形式表达，复性蛋白主要以疏水性聚集存在，得到高纯度的结构正确的重组人IL-24蛋白。PEG修饰后IL-24人重组蛋白的稳定性提高，半衰期延长，且抑瘤活性不受影响，尤其提高了对人黑色素瘤细胞的抑瘤活性，为在制备抗肿瘤药物中应用提供实验基础。
以上对本发明优选实施例进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.构建人IL-24的重组原核表达载体，诱导表达，得到包涵体；
b.选择变性剂，对所述包涵体进行变性，得到变性后的蛋白；
c.确定复性条件，对所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白；
d.对所述复性后的蛋白凝胶过滤纯化，得到纯化后的目的蛋白；
e.对所述纯化后的目的蛋白用PEG修饰剂进行定点修饰，得到终产品。
2.根据权利要求1所述的重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，步骤a中，所述诱导表达包括诱导条件的确认，所述诱导条件包括选择宿主菌，确定起始菌浓度，确定诱导剂及诱导剂终浓度，确定诱导温度以及诱导时间。
3.根据权利要求1所述的重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，步骤b中，所述变性剂为盐酸胍。
4.根据权利要求1所述的重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，步骤c中，所述复性条件包括：复性液pH、氧化还原对及氧化还原对比例、以及复性添加剂。
5.根据权利要求1所述的重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，步骤d中，所述纯化是在添加表面活性剂的条件下进行。
6.根据权利要求1所述的重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，步骤e中，所述PEG修饰剂的修饰条件为酸性条件。
7.根据权利要求1所述的重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，步骤e中，所述PEG修饰剂为醛基修饰剂。
8.根据权利要求7所述的重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，步骤e中，所述PEG修饰剂为mPEG-ALD。
9.一种PEG修饰的重组人IL-24蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的一种PEG修饰的重组人IL-24蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤。
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