TW202304517A - 蛋白—大分子綴合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供如本文所定義的蛋白-大分子綴合物、可釋放接頭和大分子。所公開的綴合物提供了至少基於接頭性質，接頭-大分子部分數目和產生所述蛋白-大分子的製備方法的獨特性質。本文還提供了合成方法和綴合物在治療疾病和病症中的用途。

Description

蛋白-大分子綴合物及其使用方法
[相關申請[
本發明申請主張2021年3月29日提交的美國臨時專利申請No. 63/167,419的優先權益，該專利申請以其全部內容作為參考併入本文。 [序列表]
正通過EFS-網路以電子形式提交本發明申請，並且其包括以.txt格式電子提交的序列表。所述.txt檔包含2022年3月29日創建並且大小為～1.5千字節的標題為“CSPL_014_01WO_SeqList_ST 25.txt”的序列表。包含在該.txt檔中的序列表是本說明書的一部分並且以其全部內容作為參考併入本文。
本發明關於藉由利用官能性接頭製備蛋白-大分子綴合物的方法。另外，本發明關於設計用於遞送具有生物學功能的蛋白的藥物動力學控制的新型綴合物。具體地，本發明關於具有預期蛋白釋放速率的蛋白-大分子綴合物。更具體地，本發明關於具有IL-2部分（即具有類似於人IL-2的至少一些活性的部分）和大分子以及一個或多個接頭的綴合物。另外，本發明關於綴合物組合物，製備綴合物的方法，施用綴合物的方法和在癌症療法領域使用所述綴合物的方法。
多種藥物經受限制它們的有效性的不良藥物動力學參數。這些藥物從生理學隔室內通過代謝或排泄的快速清除導致了短壽命和對靶標的暴露減少。例如，基於天然蛋白的治療促效劑是可以幫助建立有效、持久的抗-腫瘤反應的有吸引力的免疫調節劑；然而，由於不良的藥物動力學（PK）、不良的耐受性和可以通過頻繁劑量施用而加劇的多效性活性，它們不是理想的藥劑。
細胞因子白介素-2（IL-2）是IL-2途徑的內源促效劑並且是CD8 +T細胞（CD8 T）和NK細胞詳細描述的刺激劑。在1990年代，美國食品和藥物管理局批准使用被稱為“阿地白介素”的IL-2變體，在醫院環境中每8小時施用高-劑量IL-2方案來治療轉移性黑素瘤和腎細胞癌，從而提供了高達25%的持久反應。需要高劑量的IL-2來啟動CD8 T細胞和NK細胞，其往往表達低-親合力的IL-2受體βγ亞基（IL-2Rbg）。對於高劑量IL-2需求的加劇在於該蛋白較差的PK譜。由於與免疫系統過度啟動有關的嚴重毒性，未廣泛使用高-劑量阿地白介素。除這些毒性外，IL-2還刺激調節性T細胞（Tregs）的增殖和啟動。這些細胞組成性地表達高-親合力的異源三聚體IL-2受體αβγ亞基（IL-2Rabg）。Treg啟動可以加劇免疫抑制，從而潛在地損害預期的抗-腫瘤反應。
聚合物前體藥物和聚合物-藥物綴合物可以改善藥物對於治療應用的有效性。聚合物綴合的藥物通常顯示出延長的半衰期，較高的穩定性、水溶性、較低的免疫原性和抗原性以及對組織或細胞的特異性靶向。聚合物在聚合物前體藥物/大分子前體藥物中用作遞送藥物、蛋白、靶向部分和成像劑的載體。可以將聚合物前體藥物視為通過在一段持續時間內從聚合物鏈分子釋放較小的治療藥物分子來顯示其治療活性的藥物遞送系統，其通過提高半衰期、生物利用度和因此延長藥理作用來提高藥物動力學行為。
為了解決IL-2的毒性問題以及不良的PK性質，已提議了某些IL-2綴合物。參見，例如，美國專利No. 4,766,106、5,206,344、5,089,261、4,902,502、9,861,705和WO 2019/028419。
除了延長血漿半衰期和降低免疫原性外，PEG化提供了控制蛋白結合的選擇性的機會。舉例來說，作為PEG化的IL-2的臨床候選的NKTR-214由於在IL-2-IL-2Rα介面的離胺酸殘基處具有可釋放接頭的位點-特異的PEG化而顯示出與IL-2受體α-亞基（IL-2Rα）結合的降低。最小程度地影響了與IL-2受體β-亞基（IL-2Rβ）的結合。因此，在臨床前評價中，相對於IL-2，NKTR-214提供了升高的CD8+腫瘤-殺傷記憶性效應T細胞增殖，降低的免疫抑制性調節性T細胞增殖和升高的抗腫瘤效力。參見，例如，U.S. 9,861,705、Clin. Cancer Res. 22, 680–690 (2016)；PLOS ONE 12, e0179431 (2017)。
接頭化學的選擇在聚合物-藥物綴合物治療劑的設計中是重要的，因為它賦予了對活性劑的切割以及後續釋放的時空控制。在沒有充分的接頭穩定性的情況下，綴合的藥物可以顯示出提前釋放，從而消除了其大分子載體的優勢。然而，就無活性的聚合物前體藥物來說，藥物釋放不足可以導致低治療藥物水平，並因此導致次優的治療效力。因此，非常期望提供延長的治療效力的持續藥物釋放譜。
一些前體藥物分子在生理條件下由於pH-依賴的β消除而釋放活性藥物。這種方法利用了藥物從PEG載體的自發、一級速率切割，所述切割是當綴合物暴露於生理學pH時引起的。通過接頭上C-H鍵的酸性預先確定它們的切割速率；反過來，通過連接至可電離的C-H的吸電子基團控制酸度。參見，例如，美國專利No. 6,504,005、8,680,315和WO 2004/089279。
儘管其廣泛應用，但是PEG及其在治療中的後續應用的明顯限制在於它的非生物可降解性。目前，已批准的PEG化蛋白治療劑使用≤40kDa分子量的PEG，這接近於約50kDa的腎小球過濾閾值。儘管提高分子量通常將提供延長的循環時間，但是與非生物可降解的PEG的積累有關的問題限制了聚合物分子量的優化以及所產生的藥物動力學。
本文描述了包含多個接頭的蛋白綴合物的一般設計。在一些實施方式中，所述綴合物還包含大分子。本發明公開的獨特接頭使得能夠構建具有可預測、可調節釋放動力學的藥物綴合物。另外，可以將每個大分子的分子量控制在對於腎清除所期望的分子量下，在一些實施方式中，所述分子量為小於40-50kDa。通過提高蛋白上大分子的數目（例如，本發明公開所述的綴合物中的z、z1和z2），綴合物的總分子量可以升高，並隨後可以延長綴合物的循環時間。除了使用可釋放接頭上的可調節的吸電子基團之外，可以通過改變蛋白上的大分子的數目來進一步控制和優化活性蛋白的釋放速率。
通常，多個大分子對一個蛋白的綴合是困難且無效的。我們設想了用多個官能性接頭對蛋白綴合，然後使所述接頭（L）與大分子反應以提供蛋白-[L-大分子]z綴合物的一般方法。該技術提供了使空間位阻最小的優勢，並因此改善了反應效率。此外，合成和純化步驟簡單且不太昂貴。因此，該技術提供了用於聚合物-蛋白治療劑的大規模生產和製造的顯著優勢。
本發明公開涉及化學式（XIX）、（XXIII）、（XX）、（XX-I）、（XXIV）、（XXV）、（XXVI）、（XXVII）、（VII）、（VII-A）、（VII-A1）、（VII-B）、（VII-C）、（VII-D）、（XXVIII）、（XXIX）、（XXIX-I）、（XXX）、（VIII）、（IX）、（X）、（XI）、（XII）、（XIII）、（XIII-I）、（XIII-A）、（XIII-A-I）、（XIII-A1）、（XIII-A1-I）、（XIII-B）、（XIII-B-I）、（XIII-B1）、（XIII-B1-I）、（XIII-C）、（XIII-C-I）、（XIII-C1）、（XIII-C1-I）、（XIII-D）、（XIII-D-I）、（XIII-D1）、（XIII-D2）、（XIII-D1-I）、（XIII-D2-I）、（XXXI）、（XXXII）、（XXXII-I）、（XXXIII）、（XXXIV）、（XXXV）、（XXXVI）、（XXXVII）、（XIV）、（XV）和（XVI）所示的綴合物，包括其任何亞屬以及其中所包括的物質，如實施例25-43的綴合物（統稱為“本發明公開的綴合物”）。在本發明公開所述的綴合物的一些實施方式中，所述一種或多種蛋白為IL-2。在一些實施方式中，所述綴合物包含至少一個非可釋放接頭。具有可控釋放速率的綴合物可以為疾病治療提供有價值的治療工具。
本發明公開還涉及製備本發明公開所述的綴合物的方法。在一些實施方式中，所述方法包括如方案I、II或III中所公開的步驟。因此，在一個或多個實施方式中，本發明公開涉及用於製備具有通過接頭連接的具有相關生物學功能的蛋白和多個大分子的綴合物的綴合方法。在一些實施方式中，所述綴合方法包括通過官能性接頭對蛋白的官能化，以及隨後與大分子的綴合。在一些實施方式中，所述蛋白包括（但不限於）細胞因子、趨化因子、抗體和肽。在一些實施方式中，所述大分子包括（但不限於）水溶性聚合物、PEG、脂質、聚唾液酸、白蛋白和Fc。
本發明公開還涉及化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-B-2）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXI-2）、（XXII）、（XXII-1）、（XXII-2）、（II）、（II-1）、（II-A）、（III）、（III-1）或（IV）；RL-1；RL-2；或RL-3所示的可釋放接頭（統稱為“本發明公開的可釋放接頭”）。本發明公開還涉及新型官能性可釋放接頭及其組合物，新型官能性可釋放接頭在治療應用中的利用以及製備方法。其中，所公開的技術的優勢在於通過本文所提供的多個官能性可釋放接頭有效官能化蛋白的能力。然後，可以使用對大分子的綴合以改善高度官能化的蛋白的藥物動力學性質。
本發明公開還涉及利用可釋放和非可釋放接頭兩者連接蛋白和大分子的新型技術。其中，所公開的技術的優勢在於用可釋放接頭短暫佔據蛋白上某些位置的能力。
在本發明公開所述的綴合物的一個或多個實施方式中，所述綴合物包含通過可釋放接頭共價連接至一個或多個水溶性聚合物的IL-2部分的殘基。
在本發明公開所述的綴合物的一個或多個實施方式中，所述綴合物包含通過非可釋放接頭共價連接至一個或多個水溶性聚合物的IL-2部分的殘基。
在本發明公開所述的綴合物的一個或多個實施方式中，所述綴合物包含通過非可釋放和可釋放接頭兩者共價連接至一個或多個水溶性聚合物的IL-2部分的殘基。
在本發明公開所述的綴合物的一個或多個實施方式中，所述綴合物包含通過非可釋放接頭共價連接至一個或多個水溶性聚合物的IL-2部分的殘基，其從通過非可釋放和可釋放接頭兩者與水溶性聚合物共價連接的IL-2的綴合物上水解。
在本發明公開的一個或多個實施方式中，提供了遞送本發明公開所述的綴合物的方法，所述方法包括向患者靜脈內或皮下施用由IL-2的殘基和水溶性聚合物的綴合物所組成的組合物的步驟。
在本發明公開的一個或多個實施方式中，提供了遞送本發明公開所述的綴合物的方法，所述方法包括向癌症患者施用：（a）包含IL-2的殘基和一個或多個水溶性聚合物的綴合物的組合物；和（b）有效量的抗-CTLA-4抗體或者有效量的抗-PD-1/PD-L1抗體的步驟。在一些實施方式中，有效量的抗-CTLA-4抗體為抑制CTLA-4途徑的量。在一些實施方式中，有效量的抗-PD-1/PD-L1抗體為抑制PD-1/PD-L1途徑的量。為了清楚起見，對於根據該方法的步驟順序，除非另外說明，否則所述方法不局限於所述步驟順序，並且可以在實施步驟（b）之前、之後或同時實施步驟（a）。
本發明公開提供了如本文所定義的蛋白-大分子綴合物、可釋放接頭和大分子。所公開的綴合物提供了至少基於接頭性質，接頭-大分子部分數目和產生所述蛋白-大分子的製備方法的獨特性質。本文還提供了獨特的合成方法和綴合物在治療疾病和病症中的使用。
在以下描述和申請專利範圍中說明了本發明公開的其它實施方式。
[定義]
在描述和主張本發明公開的一個或多個實施方式中，將根據如下所述的定義使用以下術語。
應理解本文所使用的術語僅出於描述具體實施方式的目的，並且其不意欲進行限制。
除非另外定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語具有與本發明申請所屬領域的技術人員通常理解的含義相同的含義。儘管可以在本發明申請的實踐或測試中使用與本文所述的那些類似或等價的任何方法和材料，但是在本文中描述了代表性的方法和材料。
按照長期存在的專利法慣例，當在本發明申請，包括權利要求中使用時，術語“一個”和“所述”表示“一個或多個”。因此，例如，對“載體”的提及包括了一個或多個載體，兩個或更多個載體的混合物等。
除非另外說明，否則在本說明書和權利要求中所使用的表示成分、反應條件等的量的所有數值將被理解為在一切情況下被術語“約”修飾。因此，除非有相反的說明，否則在本發明的說明書中和在所附權利要求中所述的數值參數是可以基於通過本發明申請所設法獲得的所期望的性質而不同的近似值。
術語“本發明公開的化合物”或“本發明公開的化合物”是指本文所公開的化學式所表示的化合物或者如本文所公開的，其任何亞類或其藥物可用的鹽、立體異構物、溶劑化物或水合物。在某些實施方式中，將中間體考慮作為本發明公開的化合物。
本發明公開的化合物或它們的藥物可用的鹽可以含有一個或多個不對稱中心並因此可以產生對映異構物、非對映體和其它立體異構化形式，就絕對立體化學來說，可以將它們定義為(R)-或(S)-或者對於胺基酸定義為(D)-或(L)-。無論它們是否在本文中具體顯示，本發明公開意味著包括所有這些可能的異構物以及它們的外消旋和光學純形式。可以使用手性合成單體或手性試劑製備或者使用常規方法，例如，色譜法和分級結晶分離光學活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或者(D)-和(L)-異構物。用於單個對映異構物的製備/分離的常規方法包括從適合的光學純的前體手性合成或使用，例如，手性高壓液相色譜法（HPLC）的外消旋物（或者鹽或衍生物的外消旋物）的分離。當本文所述的化合物含有烯烴雙鍵或其它幾何不對稱性中心時，並且除非另外說明，否則所述化合物旨在包括E和Z幾何異構物兩者。同樣地，還旨在包括所有互變異構形式。
“立體異構物”是指由通過相同鍵鍵合的相同原子組成，但是具有不可互換的不同立體結構的化合物。本發明公開考慮了多種立體異構物及其混合物。在一些實施方式中，如本文所使用的“立體異構物”是指對映異構物、對映異構物的混合物、非對映體或兩種或更多種非對映體的混合物。
“對映異構物”表示彼此是不能重疊的鏡像的化合物的兩種立體異構物。這些異構物的混合物可以稱為對映體混合物。
將對映異構物的50:50的混合物稱為外消旋混合物或外消旋物，它可以在化學反應或過程中沒有立體選擇或立體專一性的情況下發生。術語“外消旋混合物”和“外消旋物”表示兩種對映體物質的等摩爾混合物，其缺少光學活性。本發明公開包括本文所述的化合物的所有立體異構物。
“非對映體”是指具有兩個或更多個手性中心的立體異構物並且它們的分子彼此不為鏡象。非對映體具有不同的物理性質，例如，熔點、沸點、光譜性質和反應性。可以通過高分辨分析方法，如電泳和色譜法分離非對映體混合物。
術語“位置異構物”是本領域承認的並且表示具有相同分子式，但是原子連線性程度不同的化合物。因此，“位置選擇性過程”是其中相對於其它位置異構物，較佳特定位置異構物的形成的過程，例如，顯著提高特定位置異構物的得率的反應。如本文所使用的，“位置異構物”可以表示單一位置異構物或兩個或更多個位置異構物的混合物。
“互變異構物”是指分子的一個原子向相同分子的另一個原子的質子移動。本發明公開包括任何所述化合物的互變異構物。
如本文所使用的術語“藥物組合”、“治療組合”或“組合”表示包含至少兩種治療活性劑的單一劑量形式，或者一起包含至少兩種治療活性劑並且在組合療法中單獨使用的單獨的劑量形式。例如，可以將一種治療活性劑配製成一種劑量形式並且可以將另一種治療活性劑配製成單一或不同的劑量形式。例如，可以將一種治療活性劑配製成固體口服劑量形式，而將第二治療活性劑配製城用於腸胃外施用的溶液劑量形式。
本文所使用的化學命名規程和結構圖是使用ACD/Name 9.07版軟體程式、ChemDraw Ultra 11.0.1版和/或ChemDraw Ultra 14.0版軟體命名程式（CambridgeSoft）的I.U.P.A.C.命名系統的修改形式。對於本文所使用的複雜化學名稱，在它所連接的基團之前命名取代基團。例如，環丙基乙基包含具有環丙基取代基的乙基主鏈。除如下所述，除一些碳原子外，在本文中的化學結構圖中標出了所有的鍵，這假定鍵合至足夠的氫原子以達到化合價。
術語“組合物”或“製劑”表示處於物理形式，如固體、液體、氣體或其混合物的一種或多種物質。組合物的一個實例是藥物組合物，即與醫療有關、製備用於醫療或者在醫療中使用的組合物。
如本文所使用的，“藥物可用的”表示適合於與人和動物的組織接觸的使用而無過度毒性、刺激、過敏反應等，具有合理的效益/風險比並且對於它們在合理醫學判斷範圍內的預期使用有效。
“鹽”包括活性劑的衍生物，其中通過製備酸或鹼加成鹽來修飾所述活性劑。較佳地，所述鹽是藥物可用的鹽。這些鹽包括（但不限於）藥物可用的酸加成鹽、藥物可用的鹼加成鹽、藥物可用的金屬鹽、銨和烷基化銨鹽。酸加成鹽包括無機酸和有機酸的鹽。適合的無機酸的代表性實例包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。適合的有機酸的代表性實例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、檸檬酸、反丁烯二酸、乙醇酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、焦葡萄酸、水楊酸、琥珀酸、甲磺酸、乙烷磺基天冬氨酸、硬脂酸、棕櫚酸、EDTA、乙醇酸、p-氨基苯甲酸、麩胺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、高氯酸鹽、硼酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、羥基萘甲酸鹽、甘油磷酸鹽、酮戊二酸鹽等。鹼加成鹽包括（但不限於）乙二胺、N-甲基-葡糖胺、離胺酸、精胺酸、鳥氨酸、膽鹼、N,N'-二苄基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-苄基苯乙基胺、二乙胺、呱嗪、三(羥甲基)-氨基甲烷、氫氧化四甲銨、三乙胺、二苄基胺、二苯羥甲胺、脫氫樅胺、N-乙基呱啶、苯甲基胺、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、鹼性胺基酸，例如，離胺酸和精胺酸、二環己基胺等。金屬鹽的實例包括鋰、鈉、鉀、鎂鹽等。銨和烷基化銨鹽的實例包括銨、甲基銨、二甲基銨、三甲基氯化氨、乙基溴化銨、羥乙基銨、二乙基、丁基銨、四甲銨鹽等。有機鹼的實例包括離胺酸、精胺酸、胍、二乙醇胺、膽鹼等。用於藥物可用的鹽以及它們的製劑的製備的標準方法在本領域中是熟知的並且在多種參考文獻中公開，所述參考文獻包括，例如，“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, A. Gennaro主編, 第20版, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA。
如本文所使用的，“溶劑化物”表示通過溶劑化所形成的複合物（溶劑分子與本發明公開的活性劑的分子或離子的組合）或者由溶質離子或分子（本發明公開的活性劑）與一種或多種溶劑分子所組成的聚集體。在本發明公開中，較佳的溶劑化物是水合物。水合物的實例包括（但不限於）半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、六水合物等。本領域的技術人員應理解本發明的化合物的藥物可用的鹽還可以以溶劑化物的形式存在。通常通過水合形成溶劑化物，水合是本發明的化合物的製備的一部分或者是通過本發明公開的無水化合物的天然吸濕。包括水合物的溶劑化物可以以化學計量比存在，例如，以每個溶劑化物或每個水合物分子2、3、4個鹽分子。存在另一種可能性，例如，相對於3、5、7個溶劑或水合物分子，兩個鹽分子是化學計量的。用於結晶的溶劑，如醇，特別是甲醇和乙醇；醛；酮，特別是丙酮；酯，例如，乙酸乙酯可以嵌入在晶格中。較佳藥物可用的溶劑。
術語“賦形劑”、“載體”和“媒介物”在整個本發明申請中是可互換使用的並且表示與之一起施用本發明公開的化合物的物質。
“治療有效量”表示當施用於患者用於治療疾病或其它不希望的醫學病況時，相對於該疾病或病況足以具有有益效果的化合物或治療活性劑的量。所述治療有效量將基於所選化合物或治療活性劑的類型、疾病或病況及其嚴重程度以及要治療的患者的年齡、體重等而不同。確定給定化合物或治療活性劑的治療有效量在本領域常規技術範圍內並且不要求超常規實驗。
如本文所使用的“治療”涵蓋了在患有所關心的疾病或病況的哺乳動物，較佳地人中對於所關心的疾病或病況的治療，並且包括：抑制疾病或病況的發展，即終止其發展；減輕疾病或病況，即導致疾病或病況消退；或者減輕由疾病或病況所造成的症狀，即緩解疼痛而不解決潛在的疾病或病況。
如本文所使用的“疾病”和“病況”可以互換使用或者可以在具體疾病或病況不可以具有已知病因（從而尚未獲得病原學）時是不同的，並因此尚未將其認為是疾病，而僅視為不希望的病況或症候群，其中已通過臨床醫師鑒別了大致特異的一類症狀。
本發明公開還意味著涵蓋了所公開的化合物的體內代謝產物。這些產物可以由（例如）所施用的化合物的氧化、還原、水解、醯胺化、酯化等產生，其主要是由於酶促過程而發生。因此，本發明公開包括通過以下方法所產生的化合物，所述方法包括向哺乳動物施用足以獲得其代謝產物的一段時間的本發明公開的化合物。通常，通過以可檢測的劑量向動物，如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或向人施用放射性標記的本發明公開所述的化合物，進行足以發生代謝的時間並從尿液、血液或其它生物樣品中分離其轉化產物來鑒別這些產物。
如本文所使用的，“受試者”可以是人、非人靈長類、哺乳動物、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓等。術語“受試者”和“患者”在本文中可互換使用以表示（例如）哺乳動物受試者，如人受試者。
可以懷疑受試者患有癌症或具有患癌風險，所述癌症如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、唾液腺癌或子宮內膜癌，或者懷疑其患有痤瘡、多毛症、脫髮、良性前列腺肥大、卵巢囊腫、多囊卵巢病、早熟青春期、脊髓延髓肌肉萎縮症或年齡相關性黃斑變性或具有患病風險。多種癌症，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、肝細胞癌、唾液腺癌或子宮內膜癌的診斷方法和痤瘡、多毛症、脫髮、良性前列腺肥大、卵巢囊腫、多囊卵巢病、早熟青春期、脊髓延髓肌肉萎縮症或年齡相關性黃斑變性的診斷方法，以及癌症，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、肝細胞癌、唾液腺癌或子宮內膜癌的臨床描述，痤瘡、多毛症、脫髮、良性前列腺肥大、卵巢囊腫、多囊卵巢病、早熟青春期、脊髓延髓肌肉萎縮症或年齡相關性黃斑變性的診斷和臨床描述是本領域那些技術人員已知的。
“哺乳動物”包括人和家畜，如實驗動物和家庭寵物（例如，貓、狗、豬、牛、綿羊、山羊、馬、兔）和非家畜，如野生生物兩者等。
“任選的”或“任選地”表示隨後所述的事件或狀況可以或可以不發生，並且描述包括其中所述事件或狀況發生的情況和其中它不發生的情況。例如，“任選地取代的芳基”表示所述芳基可以或可以不被取代，並且描述包括取代的芳基和未取代的芳基兩者。
如本文所使用的“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”是可互換的並且涵蓋了任何非肽水溶性聚(環氧乙烷)。通常，根據本發明公開所使用的PEG包括以下結構“-(OCH 2CH 2) n-”，其中（n）為2至4000。如本文所使用的，基於（例如）合成轉化期間，末端氧是否被替換，PEG還包括“-CH 2CH 2-O(CH 2CH 2O) n-CH 2CH 2-”和“-(OCH 2CH 2) nO-”。在整個說明書和權利要求中，應記住術語“PEG”包括具有多種末端或“封端”基團等的結構。術語“PEG”還表示含有大部分（也就是大於50%）的-OCH 2CH 2-重複亞單元的聚合物。對於具體形式，PEG可以採取任何數目的多種分子量以及以下將更詳細描述的結構或幾何形狀，如“支鏈”、“直鏈”、“叉狀”、“多官能”等。
術語“封端”和“末端封端”在本文中可互換使用以表示具有封端部分的聚合物的末端或端點。通常，儘管不一定，所述封端部分包含羥基或C 1-20烷氧基，更佳地C 1-10烷氧基，並且更佳地C 1-5烷氧基。因此，封端部分的實例包括烷氧基（例如，甲氧基、乙氧基和苄氧基）以及芳基、雜芳基、環、雜環等。必須記住所述封端部分可以包括聚合物中末端單體的一個或多個原子[例如，CH 3O(CH 2CH 2O) n-和CH 3(OCH 2CH 2) n-中的封端部分“甲氧基”]。另外，設想了以上每一個的飽和、不飽和、取代和未取代形式。此外，所述封端基團還可以是矽烷。所述封端基團還可以有利地包含可檢測標記物。當所述聚合物具有包含可檢測標記物的封端基團時，可以通過使用適合的檢測器確定所述聚合物和/或所述聚合物所偶聯至的部分（例如，活性劑）的量或位置。這些標記物無限制地包括螢光劑、化學發光劑、酶標記中使用的部分、比色劑（例如，染料）、金屬離子、放射性部分等。適合的檢測器包括光度計、膠片、光譜儀等。所述封端基團還可以有利地包含磷脂。當所述聚合物具有包含磷脂的封端基團時，將賦予所述聚合物和所得綴合物獨特的性質。示例性的磷脂無限制地包括選自稱為磷脂醯膽鹼的磷脂類的那些。具體的磷脂無限制地包括選自二月桂醯基磷脂醯膽鹼、二油烯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二十二醯基磷脂醯膽鹼、二十烷醯基磷脂醯膽鹼和卵磷脂的那些。所述封端基團還可以包括靶標部分，從而所述聚合物—以及與之連接的任何物質，例如，IL-2部分—可以優先定位在所關心的區域中。
相對於如本文所述的聚合物，“非天然存在的”表示其全部在自然界中不存在的聚合物。然而，非天然存在的聚合物可以含有天然存在的一個或多個單體或單體部分，只要整體聚合物結構在自然界中不存在。
如“水溶性聚合物”中的術語“水溶性”聚合物是在室溫下可溶於水的任何聚合物。通常，水溶性聚合物將透過至少約75%，更佳地至少約95%的在過濾後通過相同溶液所透過的光。基於重量，水溶性聚合物將較佳地為至少約35%（按重量計）可溶於水，更佳地至少約50%（按重量計）可溶於水，更佳地約70%（按重量計）可溶於水，並且更佳地約85%（按重量計）可溶於水。然而，最佳地，水溶性聚合物為約95%（按重量計）可溶於水或完全可溶於水。
在水溶性聚合物，如PEG的背景中，分子量可以表示為數均分子量或重均分子量(weight-average molecular weight)。除非另外說明，否則在本文中所有對分子量的提及均表示重均分子量。可以使用凝膠滲透色譜或其它液相色譜技術測量數均分子量(number-average molecular weight)和重均分子量兩者。還可以使用其它測量分子量值的方法，如使用末端基團分析或測量依數性（例如，凝固點降低、沸點升高或滲透壓）來確定數均分子量，或者使用光散射技術、超速離心法或粘度測定法來確定重均分子量。本發明公開所述的聚合物通常是多分散的（即聚合物的數均分子量和重均分子量不相等），從而具有較佳地小於約1.2，更佳地小於約1.15，更佳地小於約1.10，更佳地小於約1.05並且最佳地小於約1.03的低多分散性值。
當結合特定官能團使用時，術語“活性”、“反應性”或“啟動的”表示容易與另一種分子上的親電試劑或親核試劑反應的反應性官能團。這與需要強催化劑或特別不實用的反應條件來進行反應的那些基團相反（即“非反應性”或“惰性”基團）。
如本文所使用的，術語“官能團”或其任何同義詞表示涵蓋了其受保護的形式以及未受保護的形式。
如本文所使用的，術語“電子改變基團”表示包括改變它所連接的部分的電子密度的任何原子或官能團。電子改變基團包括提供電子密度的電子供體基團（例如，胺、羥基、烷氧基、烷基）和抽出電子密度的吸電子基團（例如，硝基、氰基、三氟甲基）。
術語“間臂部分”、“鍵”和“接頭”在本文中用於表示任選地用於連接互相連接部分，如大分子部分和蛋白的末端或蛋白的親電試劑或親核試劑的鍵或原子或一系列原子。所述間臂部分可以是水解穩定的或者可以包括生理學可水解的或酶促可降解的鍵。除非上下文明確規定，否則間臂部分任選地存在於化合物的任何兩個元素之間（例如，可以直接或通過間臂部分間接連接所提供的包含蛋白殘基和大分子的綴合物）。
本發明公開的適合的間臂包括：包含可以包括一個或多個碳原子、氮原子、硫原子、磷原子、氧原子及其組合的接頭的間臂。間臂部分可以是一價、二價、三價或多價的。適合的間臂部分可以包含醯胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚、磷酸酯、硫代磷酯、二硫基和/或點擊化學產物組。具體的間臂部分的非限制性實例包括選自下列中的那些：-O-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-OP(O)(OH)-、-OP(S)(OH)-、-C(S)-、-CH 2-、-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、O-CH 2-、-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-C(O)-O-CH 2-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-NH-CH 2-、-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-CH 2-、-C(O)-CH 2-、-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-O-C(O)-NH-[CH 2] l-(OCH 2CH 2) m-、二價環烷基、二價芳基、-O-、-S-、二價胺基酸殘基、-N(R 3)-、以及任何上述基團中的兩種或更多種的組合，其中R 3是H或選自下列的有機基：取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、取代的或未取代的芳基，（l）是0至6，並且（m）是0至20。其它具體的間臂部分具有以下結構：-C(O)-NH-(CH 2) 1-6-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH 2) 1-6-NH-C(O)-和-O-C(O)-NH-(CH 2) 1-6-NH-C(O)-，其中每個亞甲基後的下標值表示所述結構中所含的亞甲基的數目，例如，(CH 2) 1-6表示所述結構可以含有1、2、3、4、5或6個亞甲基。在一些實施方式中，二價間臂部分為-O-、-NH-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-OP(O)(OH)-、-OP(S)(OH)-、-C(S)-、-[CH 2] 1-6-、-O-CH 2-、-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-C(O)-O-CH 2-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-NH-CH 2-、-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-CH 2-、-C(O)-CH 2-、-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-[CH 2] 0-6-O-(CH 2CH 2O) 1-20-[CH 2] 0-6-或-O-C(O)-NH-[CH 2] 0-6-(OCH 2CH 2) 0-20-。 在一些實施方式中，三價間臂部分為
Figure 02_image001
或
Figure 02_image003
。
在一些實施方式中，一價間臂部分是如本文所公開的任何二價間臂部分，其中用鹵素或氫對其一端加帽，或者如本文所公開的任何三價間臂部分，其中分別獨立地用鹵素或氫對其兩端加帽。在一些實施方式中，一價間臂部分為烷基、鹵代烷基（例如，-CF 3）、烷氧基或鹵代烷氧基。
術語“雙官能接頭”是指如上定義的具有兩個反應性原子或官能團的接頭。在某些實施方式中，所述兩個反應基團是具有不同反應模式的互不相關的官能團，從而如果需要，則每個官能團能夠獨立於另一個並且以具體順序反應。如本領域技術人員將理解的，本文所公開的雙官能接頭可以用於實施位點-特異的反應以組裝蛋白-大分子綴合物。
“醯基”是指–C(=O)-烷基。
“氨基”是指-NH 2基團。
“氰基”是指CN基團。
“鹵代”、“鹵化物”或“鹵素”是指溴代、氯代、氟代或碘代基團。
“羥基”是指-OH基團。
“亞氨基”是指=NH取代基。
“硝基”是指-NO 2基團。
“氧”是指=O取代基。
“硫代”是指=S取代基。
“巰基”是指-SH基團。
氫是H或D。
“烷基”或“烷基基團”是指具有1至20個碳原子的完全飽和的直鏈（線性）或支鏈烴鏈基團，並且其通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。包括了包含1至20的任意數目的碳原子的烷基。包含多至20個碳原子的烷基是C 1-C 20烷基，包含多至10個碳原子的烷基是C 1-C 10烷基，包含多至6個碳原子的烷基是C 1-C 6烷基並且包含多至5個碳原子的烷基是C 1-C 5烷基。C 1-C 5烷基包括C 5烷基、C 4烷基、C 3烷基、C 2烷基和C 1烷基（即甲基)。C 1-C 6烷基包括以上對於C 1-C 5烷基所述的所有部分，但是還包括C 6烷基。C 1-C 10烷基包括以上對於C 1-C 5烷基和C 1-C 6烷基所述的所有部分，但是還包括C 7、C 8、C 9和C 10烷基。類似地，C 1-C 12烷基包括所有上述部分，但是還包括C 11和C 12烷基。C 1-C 12烷基的非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、仲丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、叔戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一基和正十二基。除非在說明書另有具體說明，否則烷基可以是任選地取代的。術語“低級烷基”是指C 1-C 6烷基，它可以是直鏈或支鏈的，例如，包括支鏈C 3-C 6烷基。示例性的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等。如本文所使用的，“烷基”包括環烷基和含環亞烷基的烷基。
“亞烷基”、“-烷基-”或“亞烷基鏈”是指具有1至20個碳原子的完全飽和的直鏈或支鏈二價烴鏈基團。C 1-C 20亞烷基的非限制性實例包括亞甲基、亞乙基、亞丙基、正亞丁基、亞乙烯基、亞丙烯基、正亞丁烯基、亞丙炔基、正亞丁炔基等。亞烷基鏈通過單鍵連接至所述分子的其餘部分並且通過單鍵連接至基團。亞烷基鏈與所述分子的其餘部分以及與基團的連結點可以通過所述鏈內的一個碳或任意兩個碳。除非在說明書中另有具體說明，否則亞烷基鏈可以是任選地取代的。
“烯基”或“烯基基團”是指具有2至20個碳原子並且具有一個或多個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴鏈基團。每個烯基基團通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。包括了包含2至20的任意數目的碳原子的烯基基團。包含多至20個碳原子的烯基基團是C 2-C 20烯基基團，包含多至10個碳原子的烯基是C 2-C 10烯基基團，包含多至6個碳原子的烯基基團是C 2-C 6烯基並且包含多至5個碳原子的烯基是C 2-C 5烯基。C 2-C 5烯基包括C 5烯基、C 4烯基、C 3烯基和C 2烯基。C 2-C 6烯基包括以上對於C 2-C 5烯基所述的所有部分，但是還包括C 6烯基。C 2-C 10烯基包括以上對於C 2-C 5烯基和C 2-C 6烯基所述的所有部分，但是還包括C 7、C 8、C 9和C 10烯基。類似地，C 2-C 12烯基包括所有上述部分，但是還包括C 11和C 12烯基。C 2-C 12烯基的非限制性實例包括乙烯基（乙烯基）、1-丙烯基、2-丙烯基（烯丙基）、異丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基、8-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基、9-癸烯基、1-十一碳烯基、2-十一碳烯基、3-十一碳烯基、4-十一碳烯基、5-十一碳烯基、6-十一碳烯基、7-十一碳烯基、8-十一碳烯基、9-十一碳烯基、10-十一碳烯基、1-十二碳烯基、2-十二碳烯基、3-十二碳烯基、4-十二碳烯基、5-十二碳烯基、6-十二碳烯基、7-十二碳烯基、8-十二碳烯基、9-十二碳烯基、10-十二碳烯基和11-十二碳烯基。除非在說明書另有具體說明，否則烷基可以是任選地取代的。
“亞烯基”或“亞烯基鏈”是指具有2至20個碳原子並且具有一個或多個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈二價烴鏈基團。C 2-C 20亞烯基的非限制性實例包括次乙基、次丙基、次丁基等。亞烯基鏈通過單鍵連接至所述分子的其餘部分並且通過單鍵連接至基團。亞烯基鏈與所述分子的其餘部分以及與基團的連結點可以通過所述鏈內的一個碳或任意兩個碳。除非在說明書中另有具體說明，否則亞烯基鏈可以是任選地取代的。
“炔基”或“炔基基團”是指具有2至20個碳原子並且具有一個或多個碳-碳三鍵的直鏈或支鏈烴鏈基團。每個炔基基團通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。包括了包含2至20的任意數目的碳原子的炔基基團。包含多至20個碳原子的炔基基團是C 2-C 20炔基，包含多至10個碳原子的炔基是C 2-C 10炔基，包含多至6個碳原子的炔基基團是C 2-C 6炔基並且包含多至5個碳原子的炔基是C 2-C 5炔基。C 2-C 5炔基包括C 5炔基、C 4炔基、C 3炔基和C 2炔基。C 2-C 6炔基包括以上對於C 2-C 5炔基所述的所有部分，但是還包括C 6炔基。C 2-C 10炔基包括以上對於C 2-C 5炔基和C 2-C 6炔基所述的所有部分，但是還包括C 7、C 8、C 9和C 10炔基。類似地，C 2-C 12炔基包括所有上述部分，但是還包括C 11和C 12炔基。C 2-C 12炔基的非限制性實例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等。除非在說明書另有具體說明，否則炔基可以是任選地取代的。
“亞炔基”或“亞炔基鏈”是指具有2至20個碳原子並且具有一個或多個碳-碳三鍵的直鏈或支鏈二價烴鏈基團。C 2-C 20亞炔基的非限制性實例包括亞乙炔基、亞丙炔基等。亞炔基鏈通過單鍵連接至所述分子的其餘部分並且通過單鍵連接至基團。亞炔基鏈與所述分子的其餘部分以及與基團的連結點可以通過所述鏈內的一個碳或任意兩個碳。除非在說明書中另有具體說明，否則亞炔基鏈可以是任選地取代的。
“烷氧基”或“-O-烷基”是指化學式OR a所示的基團，其中R a是如上定義的含有1至20個碳原子的烷基、烯基或炔基基團。除非在說明書另有具體說明，否則烷氧基可以是任選地取代的。
“烷基氨基”是指化學式-NHR a或-NR aR a所示的基團，其中每個R a獨立地為如上定義的含有1至12個碳原子的烷基、烯基或炔基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則烷基氨基基團可以是任選地取代的。
“烷基羰基”是指-C(=O)R a部分，其中R a是如上定義的烷基、烯基或炔基基團。烷基羰基的非限制性實例是甲基羰基（“乙縮醛”）部分。還可以將烷基羰基基團稱為“Cw-Cz醯基”，其中w和z表示如上定義的，R a中碳原子的數目範圍。例如，“C 1-C 10醯基”是指如上定義的烷基羰基基團，其中R a是如上定義的C 1-C 10烷基、C 1-C 10烯基或C 1-C 10炔基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則烷基羰基可以是任選地取代的。
術語“氨烷基”是指被一個或多個-NH 2基團取代的烷基。在某些實施方式中，氨烷基基團被1、2、3、4、5或更多個-NH 2基團取代。氨烷基基團可以任選地被如本文所述的一個或多個其它取代基取代。
“芳基”是指包含氫、6至18個碳原子和至少一個芳環的烴環系統基團。出於本發明公開的目的，芳基可以是單環、雙環、三環或四環系統，其可以包括稠合或橋連的環系統。芳基包括（但不限於）衍生自醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、屈、螢蒽、芴、不對稱引達省、對稱引達省、茚滿、茚、萘、非那烯、菲、七曜烯、芘和苯并菲的芳基。除非在說明書中另有具體說明，否則術語“芳基”表示包括任選地取代的芳基。芳基包括可以稠合（如在萘基中）或非稠合（如在聯苯基中）的多個芳基環。芳基環還可以與一個或多個環烴、雜芳基或雜環稠合或非稠合。如本文所使用的，“芳基”包括雜芳基。
“芳烷基”、“芳基烷基”或“-烷基芳基”是指化學式-R b-R c所示的基團，其中R b是如上定義的亞烷基、亞烯基或亞炔基基團，R c是如上定義的一個或多個芳基，例如，苄基、二苯甲基等。除非在說明書另有具體說明，否則芳烷基可以是任選地取代的。
“烷氧基”是指-OR基團，其中R是烷基或取代的烷基，較佳地C 1-6烷基（例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等）。
“碳環基”、“碳環”或“碳環”是指環狀結構，其中形成所述環的原子均為碳。碳環可以在所述環中包含3至20個碳原子。碳環包括芳基和環烷基。環烯基和環炔基如本文所定義。除非在說明書中另有具體說明，否則碳環基基團可以是任選地取代的。
“環烷基”是指僅由碳和氫原子組成的穩定、非芳族單環或多環完全飽和的烴基團，其可以包括稠合或橋連的環系統，其具有3至20個碳原子，較佳地具有3至約12個碳原子，更佳地3至約8個碳原子，並且其通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。單環環烷基基團包括（例如）環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基和環辛基。多環環烷基基團包括（例如）金剛烷基、降冰片基、十氫萘基、7,7-二甲基-雙環[2.2.1]庚基、雙環[3.1.0]己烷、八氫戊搭烯，雙環[1.1.1]戊烷、立方烷等。除非在說明書中另有具體說明，否則環烷基基團可以是任選地取代的。“環亞烷基”是指通過在所述環系統中的任何兩個碳處鍵合所述鏈而插入烷基鏈的環烷基基團。
“環烯基”是指僅由碳和氫原子組成，具有一個或多個碳-碳雙鍵的穩定、非芳族單環或多環烴基團，其可以包括稠合或橋連的環系統，其具有3至20個碳原子，較佳地具有3至10個碳原子並且其通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。單環環烯基基團包括（例如）環戊烯基、環己烯基、環庚烯基、環辛烯基等。多環環烯基基團包括（例如）雙環[2.2.1]庚-2-烯基等。除非在說明書中另有具體說明，否則環烯基可以是任選地取代的。
“環炔基”是指僅由碳和氫原子組成，具有一個或多個碳-碳三鍵的穩定、非芳族單環或多環烴基團，其可以包括稠合或橋連的環系統，其具有3至20個碳原子，較佳地具有3至10個碳原子並且其通過單鍵連接至所述分子的其餘部分。單環環炔基基團包括（例如）環庚炔基、環辛炔基等。除非在說明書中另有具體說明，否則環炔基可以是任選地取代的。
“環烷基烷基”或“-烷基環烷基”是指化學式R b-R d所示的基團，其中R b是如上定義的亞烷基、亞烯基或亞炔基基團，並且R d是如上定義的環烷基、環烯基、環炔基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則環烷基烷基基團可以是任選地取代的。
“鹵代烷基”是指被1、2、3、4、5、6或更多個如上定義的鹵代基團取代的如上定義的烷基，例如，三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴甲基等。除非在說明書中另有具體說明，否則鹵代烷基基團可以是任選地取代的。
“鹵代烯基”是指被1、2、3、4、5、6或更多個如上定義的鹵代基團取代的如上定義的烯基，例如，1-氟代丙烯基、1,1-二氟丁烯基等。除非在說明書中另有具體說明，否則鹵代烯基基團可以是任選地取代的。
“鹵代炔基”是指被1、2、3、4、5、6或更多個如上定義的鹵代基團取代的如上定義的炔基，例如，1-氟代丙炔基、1-氟代丁炔基等。除非在說明書中另有具體說明，否則鹵代烯基基團可以是任選地取代的。
如（例如）“取代的烷基”中的術語“取代的”是指被一個或多個互不干擾的取代基取代的部分（例如，烷基），所述取代基如（但不限於）：烷基、C 3-8環烷基，例如，環丙基、環丁基等；鹵代，例如，氟代、氯代、溴代和碘代；氰基；硝基；烷氧基，低級苯基；取代的苯基；等。“取代的芳基”是具有一個或多個互不干擾的基團作為取代基的芳基。對於苯環上的取代，所述取代基可以處於任何定位（即鄰位、間位或對位）。
“互不干擾的取代基”是當存在於分子中時，通常與包含在所述分子中的其它官能團不起反應的那些基團。非限制性實例包括鹵素（F、Br、Cl、I），烷基（例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、s-丁基、戊基、新戊基、己基、異戊基等）、鹵代烷基（例如，CF 3、CHF 2、CH 2F等）、環烷基（環丙基、環丁基、環戊基、環己基等）、烷氧基（-OR）、鹵代烷氧基（例如，-OCF 3、-OCHF 2、-OCH 2F等）、氨基（例如，-N(H)烷基、-N(烷基) 2、-NH(環烷基)、-NH(芳基)等）、醯胺基（例如，-NH(COR)、磺醯基（例如，-SO 2R），醯基（例如，-C(O)R、氰基、硝基、苯基和雜芳基（例如，噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基等），其中R獨立地為H、烷基、烷氧基、氨基或芳基（例如，苯基）。
“雜環基”、“雜環”或“雜環”是指由2至12個碳原子和1至6個選自氮、氧和硫的雜原子所組成的穩定3-至20-元非芳族環基團。雜環基或雜環包括如以下所定義的雜芳基。除非在說明書中另有具體說明，否則雜環基基團可以是單環、雙環、三環或四環系統，其可以包括稠合或橋連的環系統；並且雜環基基團中的氮、碳或硫原子可以任選地被氧化；所述氮原子可以任選地季銨化；並且所述雜環基基團可以是部分或完全飽和的。這些雜環基基團的實例包括（但不限於）二氧戊環基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氫異喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、異噻唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、2-氧呱嗪基、2-氧呱啶基、2-氧吡咯烷基、噁唑烷基、呱啶基、呱嗪基、4-呱啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎寧環基、噻唑烷基、四氫呋喃基、三噻烷基、四氫吡喃基、硫代嗎啉基、硫嗎啉基、1-氧-硫代嗎啉基和1,1-二氧代-硫代嗎啉基。除非在說明書中另有具體說明，否則雜環基基團可以是任選地取代的。在一些實施方式中，“取代的雜環”是具有由互不干擾的取代基所形成的一個或多個側鏈的雜環。
術語“羥烷基”或“羥基烷基”是指被一個或多個羥基（-OH）基團取代的烷基。在某些實施方式中，羥烷基基團被1、2、3、4、5或更多個-OH基團取代。羥烷基基團可以任選地被如本文所述的一個或多個其它取代基取代。
術語“烴基”是指一價烴基，不論它是脂族的、部分或完全不飽和的、非環、環或芳族的，或任何上述的組合。在某些實施方式中，烴基基團具有1至40個或更多個，1至30個或更多個，1至20個或更多個或者1至10個或更多個碳原子。術語“亞烴基”是指二價烴基基團。烴基或亞烴基基團可以任選地被如本文所述的一個或多個取代基取代。
術語“雜烴基”是指其中一個或多個碳原子分別獨立地被選自氧、硫、氮和磷的雜原子替換的烴基基團。在某些實施方式中，雜烴基基團具有1至40個或更多個，1至30個或更多個，1至20個或更多個或者1至10個或更多個碳原子，和1至10個或更多個或1至5個或更多個雜原子。術語“雜亞烴基”是指二價烴基基團。雜烴基和雜亞烴基基團的實例無限制地包括乙二醇和聚乙二醇部分，如(-CH 2CH 2O-) nH（一價雜烴基基團）和(-CH 2CH 2O-) n（二價雜亞烴基基團），其中n是1至12或以上的整數，以及丙二醇和聚丙二醇部分，如(-CH 2CH 2CH 2O-) nH和(-CH 2CH(CH 3)O-) nH（一價雜烴基基團）以及(-CH 2CH 2CH 2O-) n和(-CH 2CH(CH 3)O-) n（二價雜亞烴基基團），其中n是1至12或以上的整數。雜烴基或雜亞烴基基團可以任選地被如本文所述的一個或多個取代基取代。
“N-雜環基”是指含有至少一個氮並且其中雜環基基團與所述分子的其餘部分的連結點是通過所述雜環基基團中的氮原子的如上定義的雜環基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則N-雜環基基團可以是任選地取代的。
“雜環基烷基”或“-烷基雜環基”是指化學式-R b-R e所示的基團，其中R b是如上定義的亞烷基、亞烯基或亞炔基鏈，並且R e是如上定義的雜環基基團，並且如果所述雜環基是含氮雜環基，則所述雜環基可以在所述氮原子處連接至烷基、烯基、炔基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則雜環基烷基基團可以是任選地取代的。
“雜芳基”是指包含氫原子、1至13個碳原子、1至6個雜原子，較佳地選自氮、氧和硫和至少一個芳環的5-至20-元環系統基團。出於本發明公開的目的，所述雜芳基基團可以是單環、雙環、三環或四環系統，其可以包括稠合或橋連的環系統；並且雜芳基基團中的氮、碳或硫原子可以任選地被氧化；所述氮原子可以任選地季銨化。實例包括（但不限於）氮雜卓基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二噁茂基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧雜環庚三烯基、1,4-苯并二噁烷、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并二噁茂基、苯并二氧雜環己烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基（苯并噻吩基）、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、哢唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并苯硫基、呋喃基、呋喃酮基、異噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、異氮茚基、二氫吲哚基、異二氫氮茚基、異喹啉基、吲哚嗪基、異噁唑基、萘啶基、氧雜二唑基、2-氧代氮雜基、噁唑基、環氧乙烷基、1-氧代吡啶基、1-氧代嘧啶基、1-氧代吡嗪基、1-氧代噠嗪基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、啡噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎寧環基、異喹唑基、四氫喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和苯硫基（即噻吩基）。除非在說明書中另有具體說明，否則雜芳基基團可以是任選地取代的。在一些實施方式中，“取代的雜芳基”是具有一個或多個互不干擾的基團作為取代基的雜芳基。
“N-雜芳基”是指含有至少一個氮並且其中雜芳基基團與所述分子的其餘部分的連結點是通過所述雜芳基基團中的氮原子的如上定義的雜芳基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則N-雜芳基基團可以是任選地取代的。
“雜芳烷基”或“-烷基環烷基”是指化學式-R b-R f所示的基團，其中R b是如上定義的亞烷基、亞烯基或亞炔基鏈，並且R f是如上定義的雜芳基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則雜芳烷基基團可以是任選地取代的。
本文所使用的術語“取代的”表示任何上述基團（即烷基、亞烷基、烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基羰基、硫烷基、芳基、芳烷基、碳環基、環烷基、環烯基、環炔基、環烷基烷基、鹵代烷基、雜環基、N-雜環基、雜環基烷基、雜芳基、N-雜芳基和/或雜芳烷基），其中至少一個氫原子被本文所提供的列表中的非氫原子的鍵替換。如果未包括取代基列表，則取代基可以是（但不限於）：鹵素原子，如F、Cl、Br和I；基團，如羥基、烷氧基和酯基中的氧原子；基團如硫醇基、硫烷基、碸基、磺醯基和亞碸基中的硫原子；基團如胺、醯胺、烷基胺、二烷基胺、芳基氨基、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、亞醯胺和烯胺中的氮原子；基團如三烷基甲矽烷基、二烷基芳基甲矽烷基、烷基二芳基甲矽烷基和三芳基甲矽烷基中的矽原子；和多種其它基團中的其它雜原子。“取代的”還表示其中一個或多個氫原子被高鍵級的鍵（例如，雙-或三-鍵）替換為雜原子，如以氧（oxo）表示的氧（oxygen）、羰基、羧基和酯基；和基團如亞胺、肟、腙和腈中的氮的任何上述基團。例如，“取代的”包括任何上述基團，其中一個或多個氫原子被鹵化物、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、-OR g、-SR g、-NR hR i、烷基、烯基、炔基、鹵代烷基、羥烷基、氨烷基、-烷基環烷基、-烷基雜環基、-烷基芳基、-烷基雜芳基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-C(=O)R g、-C(=NR j)R g、-S(=O)R g、-S(=O) 2R g、-S(=O) 2OR k、-C(=O)OR k、-OC(=O)R g、-C(=O)NR hR i、-NR gC(=O)R g、-S(=O) 2NR hR i、-NR gS(=O) 2R g、-OC(=O)OR g、-OC(=O)NR hR i、-NR gC(=O)OR g、-NR gC(=O)NR hR i、-NR gC(=NR j)NR hR i、-P(=O)(R g) 2、-P(=O)(OR k)R g、-P(=O)(OR k) 2、-OP(=O)(R g) 2、-OP(=O)(OR k)R g和-OP(=O)(OR k) 2替換，其中：每次出現的R g獨立地選自氫、烷基、鹵代烷基、羥烷基、氨烷基、-烷基環烷基、-烷基雜環基、-烷基芳基、-烷基雜芳基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；每次出現的R h和R i獨立地選自氫、烷基、鹵代烷基、羥烷基、氨烷基、-烷基環烷基、-烷基雜環基、-烷基芳基、-烷基雜芳基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，或者R h和R i與它們所連接的氮原子一起形成雜環或雜芳基環；每次出現的R j獨立地為氫、-OR g、烷基、鹵代烷基、羥烷基、氨烷基、-烷基環烷基、-烷基雜環基、-烷基芳基、-烷基雜芳基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；並且每次出現的R k獨立地為氫、W、烷基、鹵代烷基、羥烷基、氨烷基、-烷基環烷基、-烷基雜環基、-烷基芳基、-烷基雜芳基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，其中每次出現的W獨立地為H +、Li +、Na +、K +、Cs +、Mg +2、Ca +2或- +N(R g) 2R hR i。
“硫烷基”是指化學式-SR a所示的基團，其中R a為如上定義的含有1至12個碳原子的烷基、烯基或炔基基團。除非在說明書中另有具體說明，否則硫烷基基團可以是任選地取代的。
如本文所使用的“有機基”應包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。
如本文所使用的，符號“
Figure 02_image005
”（在下文中可以稱為“連接鍵點”）表示兩個化學實體之間的連接點的鍵，其中將一個化學實體描述為連接至連接鍵點，而不將另一個描述為連接至連接鍵點。例如，“
Figure 02_image007
”表示化學實體“XY”通過連結鍵點鍵合至另一個化學實體。此外，可以通過推斷指明對未顯示的化學實體的具體連結點。例如，化合物CH 3-R 3，其中R 3是H或“
Figure 02_image007
”表示當R 3是“XY”時，則連結鍵點是與將R 3描述為鍵合至CH 3的鍵相同的鍵。
“稠合的”是指稠合至本發明公開所述的化合物中已有的環狀結構的任何本文所述的環狀結構。當所述稠環是雜環基環或雜芳基環時，成為稠合雜環基環或稠合雜芳基環的一部分的已有的環狀結構上的任何碳原子可以被氮原子替換。
“親電試劑”和“親電基團”表示具有能夠與親核試劑反應的親電中心（即吸引電子的中心）的離子或可以為離子的原子或原子集合。
“親核試劑”和“親核基團”是指具有能夠與親電試劑反應的親核中心（即吸引親電中心的中心）的離子或可以為離子的原子或原子集合。
“生理學可切割的”或“可水解的”或“可降解的”鍵是在生理條件下與水反應（即被水解）的鍵。在水中水解的鍵的傾向不僅將取決於連接兩個中心原子的鍵的一般類型，而且還取決於連接至這些中心原子的取代基。適當的水解不穩定鍵或弱鍵包括（但不限於）氨基甲酸酯、羧酸酯、磷酸酯、酸酐、乙縮醛、縮酮、醯氧基烷基醚、亞胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。
“可釋放接頭”是指將蛋白與大分子連接的接頭。通過水解、酶促過程、催化過程或其它方法，釋放大分子，借此導致產生了非綴合的蛋白質部分。在某些實施方式中，所述可釋放接頭通過體內發生的上述過程釋放大分子。
“酶促可降解的鍵”表示經受一種或多種酶的降解的鍵。
“水解穩定的”鍵是指化學鍵，通常共價鍵，其在水中基本是穩定的，也就是在生理條件下，在長時間內不經歷任何明顯程度的水解。水解穩定的鍵的實例包括（但不限於）以下：碳-碳鍵（例如，脂肪鏈中）、碳-硫鍵、乙醚、醯胺、氨基甲酸酯等。通常，水解穩定的鍵是在生理條件下，顯示出每天小於約1-2%的水解速率的鍵。代表性的化學鍵的水解速率可見於大部分標準化學教科書。
“藥物可用的賦形劑或載體”是指可以任選地包含在本發明公開所述的組合物中並且不對患者造成明顯不利的毒理學作用的賦形劑。“藥理學有效量”、“生理學有效量”和“治療有效量”在本文中可互換使用以表示在血流或在靶組織中提供所期望的綴合物（或相應非綴合蛋白）水平所需的蛋白-大分子綴合物的量。準確的量將基於多種因素，例如，具體的蛋白、治療性組合物的組分和物理性質、預期患者群體、個體患者的考慮等，並且基於本文所提供的資訊，本領域技術人員可以容易地確定所述量。
如本文所使用的術語“IL-2部分”是指具有人IL-2活性的部分。IL-2部分還將具有適合於與聚合試劑反應的至少一個親電基團或親核基團。另外，術語“IL-2部分”涵蓋了綴合前的IL-2部分和綴合後的IL-2部分殘基兩者。如以下將進一步詳細解釋的，本領域的技術人員可以確定任何給定部分是否具有IL-2活性。包含對應於圖1中序列的胺基酸序列的蛋白是IL-2部分以及與之基本同源的任何蛋白或多肽。如本文所使用的，術語“IL-2部分”包括有意修飾（例如，通過定點突變或）或通過突變偶然修飾的這些蛋白。這些術語還包括具有1至6個額外的糖基化位點的類似物，在蛋白的羧基末端具有至少一個額外的胺基酸的類似物，其中所述額外的胺基酸包括至少一個糖基化位點，和具有包括至少一個糖基化位點的胺基酸序列的類似物。該術語包括天然和重組產生的部分兩者。
術語“基本同源”是指特定主題序列，例如，突變體序列與參考序列相差一個或多個替換、缺失或添加，其淨效果不會在參考和主題序列之間造成不利的功能差異。出於本發明公開的目的，將具有大於80%（更佳地大於85%，更佳地大於90%，最佳大於95%）的同源等價生物活性（儘管不必需等價的生物活性強度）和等價表達特徵的序列認為是基本同源的。出於確定同源性的目的，應忽略成熟序列的截短。
術語“片段”表示具有IL-2部分的部分或片段的胺基酸序列並且具有IL-2的生物活性的任何蛋白或多肽。片段包括通過IL-2部分的蛋白水解降解所產生的蛋白或多肽以及通過本領域中常規方法，通過化學合成所產生的蛋白或多肽。
術語“患者”是指患有或易患通過施用活性劑（例如，綴合物）可以預防或治療的病況的生物體，並且包括人和動物兩者。
“任選的”或“任選地”表示隨後所述的狀況可以或可以不發生，從而該描述包括其中所述狀況發生的情況和其中它不發生的情況。
“基本上”表示接近全部或完全，例如，滿足以下中的一種或多種：大於所述條件的50%、51%或以上，75%或以上，80%或以上，90%或以上或95%或以上。
如下所示縮寫肽中的胺基酸殘基：丙胺酸苯丙胺酸為Phe或F；白胺酸為Leu或L；異白胺酸為lie或I；甲硫胺酸為Met或M；纈胺酸為Val或V；絲胺酸為Ser或S；脯胺酸為Pro或P；蘇胺酸為Thr或T；丙胺酸為Ala或A；酪胺酸為Tyr或Y；組胺酸為His或H；麩醯胺酸為Gln或Q；天門冬醯胺是Asn或N；離胺酸為Lys或K；門冬胺酸是Asp或D；麩胺酸為Glu或E；半胱胺酸為Cys或C；色胺酸為Trp或W；精胺酸為Arg或R；和甘胺酸為Gly或G。
本發明公開包括本發明公開的所有藥物可用的同位素標記化合物，其中一個或多個原子被具有相同原子序數，但是原子量或質量數不同於自然界中常見的原子量或質量數的原子替換。適合於在本發明公開所述的化合物中包括的同位素的實例包括氫的同位素，如 2H和 3H、碳的同位素，如 11C、 13C和 14C、氯的同位素，如 36Cl、氟的同位素，如 18F、碘的同位素，如 123I和 125I、氮的同位素，如 13N和 15N、氧的同位素，如 15O、 17O和 18O、磷的同位素，如 32P和硫的同位素，如 35S。
本發明公開的某些同位素-標記的化合物，例如，引入放射性同位素的那些在藥物和/或底物組織分佈研究中是有用的。考慮到它們易於摻入和方便的檢測方式，對於該目的，放射性同位素氚，即 3H，和碳-14，即 14C是特別有用的。
用重同位素，如氘，即 2H替換可以由於更大的代謝穩定性而提供某些治療優勢，例如，提高體內半衰期或降低劑量要求，並因此在一些情況下可以是較佳的。
通過發射正電子的同位素，如 11C、 18F、 15O和 13N的取代可以在用於檢查底物受體佔用的正電子發射斷層掃描（PET）研究中是有用的。
通常可以通過本領域技術人員已知的常規方法製備本發明公開的同位素-標記的化合物。
短語“其對映異構物、對映異構物的混合物、兩種或更多種非對映體的混合物、互變異構物、兩種或更多種互變異構物的混合物、位置異構物、兩種或更多種位置異構物的混合物或同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物”具有與短語“（i）其中提及的化合物的對映異構物、對映異構物的混合物、兩種或更多種非對映體的混合物、互變異構物、兩種或更多種互變異構物的混合物、位置異構物、兩種或更多種位置異構物的混合物或同位素變體；（ii）其中提及的化合物的藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物；或者（iii）其中提及的化合物的對映異構物、對映異構物的混合物、兩種或更多種非對映體的混合物、互變異構物、兩種或更多種互變異構物的混合物、位置異構物、兩種或更多種位置異構物的混合物或同位素變體的藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物”具有相同含義。
製備方法
本發明公開提供了製備用於控制治療蛋白劑在施用於需要用該治療劑治療的患者時的遞送速率的蛋白-[大分子]z綴合物的方法。通過本發明公開的方法製備的綴合物提供了通過接頭的可釋放速率和大分子數目控制的，在一段持續時間內遞送治療劑的方式。
在一個方面，本發明公開涉及使用方案（I）製備蛋白-大分子綴合物的方法：
Figure 02_image009
（方案I） 其中x是1-25的整數； y是0-24的整數； z是1-25的整數； x=y+z； 每個L獨立地為接頭； FG 0是能夠與活性蛋白劑的親核基團反應以形成鍵，包括氨基甲酸酯鍵、醯胺鍵、硫醇橋等的官能團； 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學與FG 3反應的官能團，其包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基基團（例如，二苯并環辛炔（DBCO））； FG 3是能夠通過點擊化學與FG 2反應的官能團，其包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一個方面，本發明公開涉及使用方案（II）或者方案（III）製備蛋白-大分子綴合物的方法：
Figure 02_image011
（方案II）
Figure 02_image013
（方案III） 其中： z1為1至20的整數； z2為1至5的整數； 每個RL獨立地為可釋放接頭； 每個SL獨立地為非可釋放接頭； FG 4和FG 5分別獨立地為能夠與活性蛋白劑的親核基團反應以形成鍵，包括氨基甲酸酯鍵、醯胺鍵、硫醇橋等的官能團； FG 2是能夠通過點擊化學與FG 3反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； FG 3是能夠通過點擊化學與FG 2反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 大分子 1和大分子 2分別獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
在方案I中，當x、y或z大於或等於2時，括弧內的每個基團直接結合至蛋白。在方案II和方案III中，當z1或z2大於或等於2時，括弧內的每個基團直接結合至蛋白。
在一個實施方式中，細胞因子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α或TNF-β。在一個實施方式中，細胞因子為M-CSF、G-CSF、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37、IL-38、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β或CXL10。
在某些實施方式中，所述細胞因子是IL-2。
在某些實施方式中，所述IL-2包含與SEQ ID NO:1約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
所述趨化因子包括MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309（CCL1）、BCA1（CXCL13）、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸細胞活化趨化因子-1、嗜酸細胞活化趨化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC（CCL20）、ELC（CCL19）、SLC（CCL21）、ENA-78、PBP、TECK（CCL25）、CTACK（CCL27）、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
所述抗體靶向以下中的一種或多種：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受體樣激酶1、澱粉狀蛋白A蛋白、β–澱粉狀蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125（模擬）、C5、CA-125、CCL11（嗜酸細胞活化趨化因子-1）、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C24抗原、CD276、CD278、CD319、艱難梭菌（ clostridium difficile）、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、達比加群（Dabigatran）、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、內皮糖蛋白（Endoglin）、上皮唾蛋白（episialin）、EPHA3、c-Met、FGFR2、纖維蛋白IIβ鏈、FGF 23、葉酸受體1、GMCSF、GD2神經節糖苷、GDF-8、GCGR、明膠酶B、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受體α-鏈、激肽釋放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受體、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6 R、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干擾素α/β受體、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、B型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-選擇素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、間皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、連接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂醯絲胺酸、RANKL、RTN4、獼猴因子、ROR1、SLAMF7、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）α毒素、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）雙組分殺白細胞素、SOST、選擇素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受體、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
肽包括（但不限於）：高血糖素樣肽1（GLP-1）、艾塞那肽-2、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、心房利鈉因子（ANF）、胃饑餓素、加壓素、生長激素、生長激素-釋放激素（GHRH）、RC-3095、生長抑素、鈴蟾肽、PCK-3145、Phe-His-Ser-Cys-Asn（PHSCN）、IGFl、B-型利尿鈉肽、肽YY（PYY）、干擾素、血小板反應蛋白、血管生成素、降鈣素、促性腺激素釋放激素、水蛭素、高血糖素、抗-TNF-α、成纖維細胞生長因子、粒細胞集落刺激因子、奧尼匹肽、垂體甲狀腺激素（PTH）、亮脯利特、舍莫瑞林、pramoR elin、奈西立肽、羅替加肽、西侖吉肽、MBP-8298、AL-108、恩夫韋地、胸腺法新、daptamycin、HLFI-II、乳鐵傳遞蛋白、地米肽、谷胱甘肽、T細胞表位PR 1、蛋白酶-3肽1-11、B細胞表位P3、促黃體激素-釋放激素（LHRH）、P物質、神經激肽A、神經激肽B、CCK-8、腦啡肽，包括白胺酸腦啡肽和甲硫胺酸 腦啡肽、皮抑菌肽、[des-Ala20, Gln34]-皮抑菌肽、表面活性劑-相關抗微生物陰離子肽、蜜蜂抗菌肽IA；蜜蜂抗菌肽IB；OV-2；1025，乙醯基-粘附素肽（1025-1044）醯胺；Theroma-cin（49-63）；培西加南（MSI-78）；吲哚青黴素；愛帕琳肽-15（63-77）；CFPlO（71-85）；炭疽相關的致死因子（LF）抑制劑；牛抗菌肽；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑2；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑3；肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑4；NS4A-NS4B丙型肝炎病毒（NS3蛋白酶抑制劑I）；HIV-1、HIV-2蛋白酶底物；抗-FM肽；Bak-BH3；Bax BH3肽（55-74）（野生型）；Bid BH3-r8；CTT（明膠酶抑制劑）；E75（Her-2/neu）（369-377）；GRP78結合嵌合肽基序；p53（17-26）；EGFR 2/KDR拮抗劑；Colivelin AGA-(C8R) HNGl 7（人體肽衍生物）；活性-依賴性神經營養性因子（ADNF）；β-分泌酶抑制劑1；β-分泌酶抑制劑2；ch[β]-澱粉狀蛋白（30-16）；Humanun（HN）sHNG、[Glyl4]-HN、[Glyl 4]-人體肽；血管緊張素轉化酶抑制劑（BPP）；腎素抑制劑III；膜聯蛋白I（ANXA-I；Ac2-12）；抗炎肽I；抗炎肽2；抗炎愛帕琳肽12；[D-Phel2, Leul4]-鈴蟾肽；黑腹果蠅觸足肽（酸）（穿透肽）；黑腹果蠅觸足前導肽（CT）；肥碩脫粒肽；硫酸酯化的[Thr28, Nle31]-縮膽囊肽（25-33）；痛敏肽（1-13）（醯胺）；纖維蛋白溶解抑制因子；Γ-纖維蛋白原（377-395）；類爪蟾肽；肥胖抑制素（人）；[Hisl, Lys6]-GHRP（GHRP-6）；[Ala5,[β]-Ala8]-神經激肽A（4-10）；神經調節肽B；神經調節肽C；神經調節肽N；活性-依賴性神經營養性因子（ADNF-14）；Acetalin I（阿片樣物質受體拮抗劑1）；Acetalin 2（阿片樣物質受體拮抗劑2）；Acetalin 3（阿片樣物質受體拮抗劑3）；ACTH（1-39）（人）；ACTH（7-38）（人）；蛙皮降壓肽；脂動激素（東亞飛蝗（ Locusta Migratoria））；十八烷基化的ADP-核糖基化因子6、myr-ARF6（2-13）；PAMP（1-20）（腎上腺髓質素前體（1-20）人）；AGRP（25-51）；胰澱素（8-37）（人）；血管緊張素I（人）；血管緊張素II（人）；Apstatin（氨肽酶P抑制劑）；沼水蛙抗菌肽-I；蛙皮素I；RL-37；LL-37（抗微生物肽）（人）；天蠶抗菌肽A；抗氧化肽A；抗氧化肽B；L-肌肽；BcI 9-2；NPVF；神經肽AF（hNPAF）（人）；Bax BH3肽（55-74）；bFGF抑制肽；bFGF抑制肽II；血管舒緩激肽；[Des-Argl OJ-HOE 140；半胱天冬氨酸酶I抑制劑II；半胱天冬氨酸酶I抑制劑VIII；Smac N7蛋白（MEKl衍生肽抑制劑I；hBD-1（[β]-防禦素-1）（人）；hBD-3（[β]-防禦素-3）（人）；hBD-4（[β]-防禦素-4）（人）；HNP-I（防禦素人嗜中性白細胞肽I）；HNP-2（防禦素人嗜中性白細胞肽-2強啡肽A（1-17））；內嗎啡肽-I；[β]-內啡肽（人、豬）；內皮素2（人）；纖維蛋白原結合抑制肽；環(-GRGDSP)；TP508（凝血酶-衍生肽）；甘丙肽（人）；GIP（人）；促胃液素釋放肽（人）；促胃液素-1（人）；胃饑餓素（人）；PDGF-BB肽；[D-Lys3]-GHRP-6；HCV核心蛋白（1-20）；a3Bl整合素肽片段（325）（醯胺）；層粘連蛋白五肽（醯胺）Mel-anotropin-強化因子（MPF）；VA-[β]-MSH、促脂素-Y（阿黑皮素原-衍生的）；心房鈉尿肽（1-28）（人）；血管鈉肽（1-27）；[Ala5, B-Ala8]-神經激肽A（4-10）；神經調節肽L（NKA）；Ac-(Leu28, 31)-神經肽Y（24-26）；阿利特辛；腦神經肽II；[D-tyrll]-神經降壓素；IKKy NEMO結合域（NBD）抑制肽；PTD-p50（NLS）抑制肽；食欲肽A（牛、人、小鼠、大鼠）；食欲肽B（人）；水通道蛋白-2（254-267）（人胰抑素）（37-52）；胰多肽（人）；神經肽；肽YY（3-36）（人）；羥甲基-植物螯合肽2；PACAP（1-27）（醯胺，人、牛、大鼠）；促乳激素釋放肽（1-31）（人）；salusin-α；salusin-β；鞘脂活化蛋白C22；胰泌素（人）；L-選擇素；Endokinin A/B；Endokinin C（人）；Endokinin D（人）；凝血酶受體（42-48）促效劑（人）；LSKL（血小板反應蛋白的抑制劑）；促甲狀腺素釋放激素（TRH）；P55-TNFR片段；尿緊張素II（人）；VIP（人、豬、大鼠）；VIP拮抗劑；毒蜥素；艾塞那肽；ZPlO（AVEOOIOO）；普蘭林肽；AC162352（PYY）（3-36）；PYY；奧尼匹肽；高血糖素；GRP；胃饑餓素（GHRP6）；亮脯利特；組氨瑞林；縮宮素；阿托西班（RWJ22164）；舍莫瑞林；奈西立肽；比伐盧定（水蛭肽）；艾替班特；Aviptadin；羅替加肽（ZP123、GAP486）；西侖吉肽（EMD-121924、RGD肽）；AlbuBNP；BN-054；血管緊張素II；MBP-8298；肽白胺酸精胺酸；齊考諾肽；AL-208；AL-108；Carbeticon；三肽；SAL；Coliven；人體肽；ADNF-14；VIP（血管活性腸肽）；胸腺法新；桿菌肽；短桿菌肽；培西加南（MSI-78）；Pl 13；PAC-113；SCV-07；HLFl-Il（乳鐵傳遞蛋白）；DAPTA；TRI-1144；Tritrpticin；抗炎素2；Gattex（替度魯肽，ALX-0600）；Stimuvax（L-BLP25）；Chrysalin（TP508）；Melanonan II；Spantide II；藍肽；辛卡利特；五肽胃泌素；胰泌素；內皮抑素肽；E-選擇素；HER2；IL-6；IL-8；IL-10；PDGF；血小板反應蛋白；uPA (I)；uPA (2)；VEGF；VEGF (2)；五肽-3；XXLRR；β-澱粉狀蛋白原纖維形成；內嗎啡肽-2；TIP 39（結節漏斗部神經肽）；PACAP（1-38）（醯胺，人、牛、大鼠）；TGFB啟動肽；胰島素敏化因子（ISF402）；轉化生長因子BI肽（TGF-B1）；雨蛙素釋放因子；IELLQAR（8-branchMAPS）；替加泊肽PK3145；戈舍瑞林；阿巴瑞克；西曲瑞克；加尼瑞克；地加瑞克（曲普瑞林）；巴蘆西班（FE 200440）；促生長激素釋放肽；奧曲肽；依替巴肽；Netamiftide（INN-00835）；Daptamycin；Spantide II；地米肽（RDP-58）；AL-209；恩夫韋地；IDR-I；六勝肽-6；胰島素-A鏈；蘭瑞肽；六[ρ]肽-3；胰島素B-鏈；甘精胰島素-A鏈；甘精胰島素-B鏈；胰島素-賴脯人胰島素B-鏈類似物；胰島素-天冬胰島素B-鏈類似物；胰島素-賴穀胰島素B鏈類似物；胰島素-地特胰島素B鏈類似物；生長抑素腫瘤抑制類似物；胰抑素（37-52）；血管活性腸肽片段（KKYL-NH 2）；和強啡肽A。適合於在本發明公開中使用的蛋白的實例包括（但不限於）：免疫毒素SSlP、腺苷脫氨酶、精胺酸酶等。
所述大分子可以是水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。在一些實施方式中，所述大分子包括包含約6至約26個碳原子的脂肪酸，選自下列的聚合物：2-甲丙烯醯-氧乙基磷醯膽鹼、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸脂)、聚(丙烯醯胺)、聚(N-丙烯醯嗎啉)、聚(烷氧基)聚合物、聚(醯胺)、聚(醯胺胺)、聚(胺基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬醯胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚對苯二甲酸丁二醇酯、聚(己內酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯醯胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(磷酸三乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(α-羥酸)、聚(羥乙基丙烯酸脂)、聚(羥乙基噁唑啉)、聚(羥基甲基丙烯酸酯)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚(羥丙基噁唑啉)、聚(亞氨基碳酸酯)、聚（乳酸）、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯醯胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有機磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚磷腈、聚(丙二醇)、聚(糖)、聚(矽氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲醚)、聚(乙烯吡硌烷酮)、矽酮、直鏈澱粉、纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、幾丁質、殼聚糖、右旋糖酐、糊精、明膠、透明質酸（HA）和衍生物、官能化透明質酸、甘露聚糖、果膠、肝素、硫酸乙醯肝素（HS）、鼠李聚糖半乳糖醛酸、澱粉、羥烷基澱粉、羥乙基澱粉（HES）、聚唾液酸（PSA）及其它碳水化合物-基聚合物、木聚糖和共聚物。
所述大分子還可以是選自下列的蛋白或多肽：白蛋白、轉鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白、免疫球蛋白、XTEN肽、富含甘胺酸的高胺基酸聚合物（HAP）、PAS多肽、彈性蛋白-樣多肽（ELP）、CTP肽或明膠-樣蛋白（GLK）聚合物。
在某些實施方式中，接頭L是可釋放接頭（RL）的殘基。在某些實施方式中，接頭L是非可釋放接頭（SL）的殘基。
在一些實施方式中，所述可釋放接頭是化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-B-2）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXI-2）、（XXII）、（XXII-1）、（XXII-2）、（II）、（II-1）、（II-A）、（III）、（III-1）或（IV）；RL-1；RL-2；或RL-3所示的可釋放接頭，如本文所描述的。
在某些實施方式中，x或z為2或以上。在某些實施方式中，x或z為3或以上。在某些實施方式中，x或z為4或以上。在某些實施方式中，x或z為5或以上。在某些實施方式中，x或z為6或以上。在某些實施方式中，x或z大於6。
在某些實施方式中，z1為1至10的整數；並且z2為1至3的整數。在某些實施方式中，z1為1至5的整數；並且z2為1。
在某些實施方式中，本文所述的製備方法涉及包括用多個官能性接頭使蛋白綴合的第一步。預計由於接頭較小的尺寸，與蛋白和大分子的直接綴合相比，所述綴合過程更有效並且可以實現更高的綴合情況。還如本文所述的，所公開的方法的第二步可以包括設計以高效率將接頭與大分子連接的點擊化學。不受任何具體理論的束縛，據信該方法提供了使空間位阻最小的優勢，因此這可以改善反應效率。此外，所述合成和純化步驟是簡化且不太昂貴的，因此該方法提供了用於聚合物-蛋白治療劑的大規模生產和製造的顯著優勢。由於首先要綴合的接頭的尺寸較小，因此這種綴合技術的另一個優勢在於與直接通過較大的大分子綴合相比，佔據蛋白上不同綴合位點的潛能。這將提供改變蛋白-大分子綴合物的生物性質的潛能。
官能性可釋放接頭
本發明公開所述的綴合物可以衍生自官能性可釋放接頭。在一個實施方式中，所述官能性可釋放接頭為雙官能可釋放接頭。在一個實施方式中，所述官能性可釋放接頭為單官能可釋放接頭。
在一些方面，本發明公開涉及化學式（I）所示的官能性可釋放接頭：
Figure 02_image015
（I） 或其立體異構物、互變異構物或其混合物或者同位素變體； 其中： X 1是第一間臂部分； X 2是第二間臂部分； R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基； a為0至4的整數； b為1至3的整數； c為0至1的整數； FG 1是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵，如氨基甲酸酯鍵的官能團；和 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團。
在化學式（I）的一些實施方式中，當c為2或以上時，方括號內的每個FG 2直接結合至X 1，即如果c為1，則X 1是二價第一間臂部分並且如果c為2，則X 1為三價第一間臂部分。
在化學式（I）的一些實施方式中，R 1和R 2分別獨立地為C 1-5烷基、取代的C 1-5烷基、C 2-6烯基，取代的C 2-6烯基、C 2-6炔基，取代的C 2-6炔基、苯基或取代的苯基。在某些實施方式中，R 1和R 2分別獨立地為C 1-5烷基或取代的C 1-5烷基。
在化學式（I）的一些實施方式中，R e是硝基、氰基、鹵素、-CONH(C 1-5烷基)或-CONH(苯基)、取代的-CONH(C 1-5烷基)或-CONH(苯基)、-SO 2NH(C 1-5烷基)或-SO 2NH(苯基)、取代的-SO 2NH(C 1-5烷基)或-SO 2NH(苯基)、-SO 2(C 1-5烷基)或-SO 2(苯基)、取代的-SO 2(C 1-5烷基)或-SO 2(苯基)、C­ 1-5烷氧基、取代的C­ 1-5烷氧基、C­ 1-5烷基或C­ 3-6環烷基、取代的C­ 1-5烷基或C 3-6環烷基、苯基或5-至6-元雜芳基、或取代的苯基或5-至6-元雜芳基。
在化學式（I）的一些實施方式中，a為0至3的整數。在一些實施方式中，a為0至2的整數。在一些實施方式中，a為0。在一些實施方式中，a為1。在一些實施方式中，a為2。在一些實施方式中，a為3。在一些實施方式中，a為4。
在化學式（I）的一些實施方式中，b為1或2的整數。在一些實施方式中，b是1。在一些實施方式中，b是2。在一些實施方式中，b是3。
在化學式（I）的一些實施方式中，在一些實施方式中，c為0。在一些實施方式中，c為1。
在化學式（I）的一些實施方式中，X 1和X 2分別獨立地選自本文所描述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是不同的間臂部分。
在化學式（I）內，提供了具有更限定的結構的官能性可釋放接頭：
Figure 02_image017
（I-B）；
Figure 02_image019
（I-C） 其中每個X 1是第一間臂部分或者當未連接至FG 1時，X 1還可以是氫；X 2是第二間臂部分；R 1、R 2、[R e] a、FG 1和FG 2如先前所定義。
在化學式（I）、（I-B）或（I-C）的某些實施方式中，a為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為H、Me或Et；並且R e是硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。在化學式（I-B）的一個實施方式中，a為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為H、Me或Et；並且R e是硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3（“化學式（I-B-1）”）。在化學式（I-C）的一個實施方式中，a為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為H、Me或Et；並且R e是硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3（“化學式（I-C-1）”）。
在化學式（I）、（I-B）或（I-C）的某些實施方式中，所述官能性可釋放接頭具有以下結構之一：
Figure 02_image021
（化學式（I-B-2））；或
Figure 02_image023
。
在另一個方面，本發明公開涉及化學式（XVIII）所示的官能性可釋放接頭：
Figure 02_image025
（XVIII） 或其立體異構物、互變異構物或其混合物或者同位素變體； 其中： X 1是間臂部分； R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基； a為0至4的整數； c為2； FG 1為能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵的官能團；且 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團。 在化學式（XVIII）的一些實施方式中，方括號內的每個FG 2直接結合至X 1，即X 1是三價間臂部分。
在化學式（XVIII）的某些實施方式中，a為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；並且R e是硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3（“化學式（XVIII-1）”）。
在化學式（XVIII）的某些實施方式中，所述官能性可釋放接頭具有以下結構之一：
Figure 02_image027
或
Figure 02_image029
。
在另一個方面，本發明公開涉及化學式（XXI）所示的官能性可釋放接頭：
Figure 02_image031
（XXI） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體； 其中： X為間臂部分或氫； R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基； a為0至4的整數；且 FG 1為能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵的官能團。
在化學式（XXI）的某些實施方式中，a為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；並且每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3（“化學式（XXI-1）”）。
在化學式（XXI）的某些實施方式中，所述官能性可釋放接頭具有以下結構：
Figure 02_image033
（XXI-2）。
在另一個方面，本發明公開涉及化學式（XXII）所示的官能性可釋放接頭：
Figure 02_image035
（XXII） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體； 其中： X 1是間臂部分； R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基； a為0至4的整數； Y 1為O或S； Y 2為O或S； FG 1為能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵的官能團；且 FG 2是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團。 在化學式（XXII）的某些實施方式中，a為0；R 1是氫；R 2是氫；Y 1為O；且Y 2為O（“化學式（XXII-1）”）。
在化學式（XXII）的某些實施方式中，所述官能性可釋放接頭具有以下結構：
Figure 02_image037
其中n為1-10的整數（“化學式（XXII-2）”）。
在另一個方面，本發明公開涉及化學式（II）所示的官能性可釋放接頭：
Figure 02_image039
（II） 或其立體異構物、互變異構物或其混合物或者同位素變體； 其中： R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1為1； b2為0至1的整數； 當存在時，R el分別獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，R e2分別獨立地為第二電子改變基團； X 2是第二間臂部分； 當存在時，X 3分別獨立地為第三間臂部分； FG 1是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵，如氨基甲酸酯鍵的官能團；和 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團。
在化學式（II）的一些實施方式中，R 1和R 2分別獨立地為C 1-5烷基、取代的C 1-5烷基、C 2-6烯基，取代的C 2-6烯基、C 2-6炔基，取代的C 2-6炔基、苯基或取代的苯基。在某些實施方式中，R 1和R 2分別獨立地為C 1-5烷基或取代的C 1-5烷基。
在化學式（II）的一些實施方式中，R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、鹵代烷基（例如，-CF 3、­-CHF 2、-CH 2F、-CH 2F）、-OC 1-5烷基、-O-鹵代烷基（例如，-OCF 3、­-OCHF 2、-OCH 2F、-OCH 2F）、-NH(C 1-5烷基)、-NHCO(C 1-5烷基)、-NHSO 2(C 1-5烷基)、-CONH(C 1-5烷基)或-SO 2NH(C 1-5烷基)。在某些實施方式中，R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
在化學式（II）的一些實施方式中，X 2和X 3分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是不同的間臂部分。
在化學式（II）的某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為H、Me或Et；且R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3（“化學式（II-1）”）。
其它示例性官能性接頭屬於以下化學式（II-A）或（II-B）：
Figure 02_image041
（II-A）； 其中R e是氫或電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基。在某些實施方式中，R e是氫或氟代。
Figure 02_image043
（II-B）
可以根據US20060293499A1中所述的程式製備這些提供可釋放鍵的試劑。
在另一個方面，本發明公開涉及化學式（III）所示的官能性可釋放接頭：
Figure 02_image045
（III） 或其立體異構物、互變異構物或其混合物或者同位素變體； 其中： R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1為1； b2為0至1的整數； 當存在時，R el分別獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，R e2分別獨立地為第二電子改變基團； R p是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； X 2是間臂部分； 當存在時，X 3分別獨立地為間臂部分； Y 1為O或S； Y 2為O或S； Y 3為O或S； FG 2分別獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團；且 FG 4是能夠與活性劑的氨基反應以形成醯胺鍵的官能團。
在化學式（III）的一些實施方式中，R 1、R 2和R p分別獨立地為C 1-5烷基、取代的C 1-5烷基、C 2-6烯基、取代的C 2-6烯基、C 2-6炔基，取代的C 2-6炔基、苯基或取代的苯基。在某些實施方式中，R 1和R 2分別獨立地為C 1-5烷基或取代的C 1-5烷基。
在化學式（III）的一些實施方式中，R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、鹵代烷基（例如，-CF 3、­-CHF 2、-CH 2F、-CH 2F）、-OC 1-5烷基、-O-鹵代烷基（例如，-OCF 3、­-OCHF 2、-OCH 2F、-OCH 2F）、-NH(C 1-5烷基)、-NHCO(C 1-5烷基)、-NHSO 2(C 1-5烷基)、-CONH(C 1-5烷基)或-SO 2NH(C 1-5烷基)。在某些實施方式中，R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
在化學式（III）的一些實施方式中，X 2和X 3分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是不同的間臂部分。
在化學式（III）的某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為H、Me或Et；且R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3（“化學式（III-1）”）。
示例性的官能性可釋放接頭屬於以下化學式（III-A）：
Figure 02_image047
（III-A）
在另一個方面，本發明公開涉及化學式（IV）所示的官能性可釋放接頭：
Figure 02_image049
（IV） 或其立體異構物、互變異構物或其混合物或者同位素變體； 其中： R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 3是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 4是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1為1； b2為0至1的整數； c是0至4的整數； 當存在時，R el分別獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，R e2分別獨立地為第二電子改變基團； R d為硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基或者取代的芳基或雜芳基； X 2是間臂部分； 當存在時，X 3分別獨立地為間臂部分； Y 1為O或S； Y 2為O或S； FG 1是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵，如氨基甲酸酯鍵的官能團；和 FG 2分別獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團。
在化學式（IV）的一些實施方式中，R 1、R 2、R 3和R 4分別獨立地為C 1-5烷基、取代的C 1-5烷基、C 2-6烯基，取代的C 2-6烯基、C 2-6炔基，取代的C 2-6炔基、苯基或取代的苯基。在某些實施方式中，R 1、R 2、R 3和R 4分別獨立地為C 1-5烷基或取代的C 1-5烷基。
在化學式（IV）的一些實施方式中，R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、鹵代烷基（例如，-CF 3、­-CHF 2、-CH 2F、-CH 2F）、-OC 1-5烷基、-O-鹵代烷基（例如，-OCF 3、­-OCHF 2、-OCH 2F、-OCH 2F）、-NH(C 1-5烷基)、-NHCO(C 1-5烷基)、-NHSO 2(C 1-5烷基)、-CONH(C 1-5烷基)或-SO 2NH(C 1-5烷基)。在某些實施方式中，R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3 。
在化學式（IV）的一些實施方式中，R d為硝基、氰基、鹵素、-CONH(C 1-5烷基)或-CONH(苯基)、取代的-CONH(C 1-5烷基)或-CONH(苯基)、-SO 2NH(C 1-5烷基)或-SO 2NH(苯基)、取代的-SO 2NH(C 1-5烷基)或-SO 2NH(苯基)、-SO 2(C 1-5烷基)或-SO 2(苯基)、取代的-SO 2(C 1-5烷基)或-SO 2(苯基)、C­ 1-5烷氧基、取代的C­ 1-5烷氧基、C­ 1-5烷基或C­ 3-6環烷基、取代的C­ 1-5烷基或C­ 3-6環烷基、苯基或5-至6-元雜芳基，或者取代的苯基或5-至6-元雜芳基。
在化學式（IV）的一些實施方式中，X 2和X 3分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是不同的間臂部分。
使用可釋放接頭，如化學式（III）和化學式（IV）所示的那些的優勢在於改善穩定性的潛力，其提供了持續藥物釋放並最終提供了延長的治療效力。因此，本發明公開所述的接頭提供了優於現有技術的那些的聚合物-蛋白治療劑的穩定性和儲存優勢。
在化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXII）、（XXII-1）、（II）、（II-1）、（III）、（III-1）或（IV）的一些實施方式中，FG 1是能夠與活性劑的氨基反應以形成氨基甲酸酯鍵的官能團（統稱為“RL-1”）。在一些實施方式中，FG 1為
Figure 02_image051
。
在化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXII）、（XXII-1）、（II）、（II-1）、（III）、（III-1）或（IV）或RL-1的一些實施方式中，FG 2為疊氮化物、炔基或環炔基（統稱為“RL-2”）。
在化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXII）、（XXII-1）、（II）、（II-1）、（III）、（III-1）或（IV）或RL-1或RL-2的一些實施方式中，環炔基為二苯并環辛炔（DBCO）（統稱為“RL-3”）。
具有可釋放接頭的聚合試劑
本發明公開還涉及可以衍生自具有可釋放接頭的聚合試劑的綴合物。
在一些方面，本發明公開涉及化學式（V）所示的具有可釋放接頭的聚合試劑：
Figure 02_image053
（V） 或其立體異構物、互變異構物或其混合物或者同位素變體； 其中： POLY 1是第一水溶性聚合物； POLY 2是第二水溶性聚合物； X 1是第一間臂部分； X 2是第二間臂部分； Y 1是O或S； Y 2是O或S； R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 3是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 4是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1是0至3的整數； a2是0至3的整數； c是0至4的整數； R el，當存在時，分別獨立地為第一電子改變基團； R e2，當存在時，分別獨立地為第二電子改變基團； R d分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基；和 FG 1是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵，如氨基甲酸酯鍵的官能團。
在一些實施方式中，R 1、R 2、R 3、R 4、R e1、R e2和R d如以上化學式（IV）中所定義。
在化學式（V）的一些實施方式中，R e1和R e2是相同的電子改變基團。在一些實施方式中，R e1和R e2是不同的電子改變基團。
在化學式（V）的一些實施方式中，POLY 1和POLY 2分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是不同的水溶性聚合物。
在化學式（V）的一些實施方式中，X 1和X 2分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是不同的間臂部分。示例性的聚合試劑屬於以下化學式（V-A）：
Figure 02_image055
， （V-A）
其中n獨立地為4至1500的整數，例如，4、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500，包括它們之間的所有範圍和值。
具有兩個可釋放鍵的其它聚合試劑涵蓋了以下化學式（VI）：
Figure 02_image057
（VI） 或其立體異構物、互變異構物或其混合物或者同位素變體； 其中： POLY 1是第一水溶性聚合物； POLY 2是第二水溶性聚合物； X 1是第一間臂部分； X 2是第二間臂部分； Y 1是O或S； Y 2是O或S； Y 3是O或S； R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1是0-3的整數； a2是0-3的整數； R el，當存在時，分別獨立地為第一電子改變基團； R e2，當存在時，分別獨立地為第二電子改變基團； R p是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；和 FG 4是能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵，如醯胺鍵的官能團。
在化學式（VI）的一些實施方式中，R 1、R 2和R p分別獨立地為C 1-5烷基、取代的C 1-5烷基、C 2-6烯基、取代的C 2-6烯基、C 2- 6炔基、取代的C 2- 6炔基、苯基或取代的苯基。在某些實施方式中，R 1、R 2、R 3和R 4分別獨立地為C 1-5烷基或取代的C 1-5烷基。
在化學式（VI）的一些實施方式中，R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CONH(C 1-5烷基)或-CONH(苯基)、取代的-CONH(C 1-5烷基)或-CONH(苯基)、-SO 2NH(C 1-5烷基)或-SO 2NH(苯基)、取代的-SO 2NH(C 1-5烷基)或-SO 2NH(苯基)、-SO 2(C 1-5烷基)或-SO 2(苯基)、取代的-SO 2(C 1-5烷基)或-SO 2(苯基)、C 1-5烷氧基、取代的C 1-5烷氧基、C 1-5烷基或C 3-6環烷基、取代的C 1-5烷基或C 3-6環烷基、苯基或5-至6-元雜芳基或取代的苯基或5-至6-元雜芳基。
在化學式（VI）的一些實施方式中，POLY 1和POLY 2分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是不同的水溶性聚合物。
在化學式（VI）的一些實施方式中，X 1和X 2分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是不同的間臂部分。
示例性的聚合試劑屬於以下化學式（VI-A）：
Figure 02_image059
（VI-A） 其中n獨立地為4至1500的整數，例如，4、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500，包括它們之間的所有範圍和值。
蛋白-接頭綴合物
在一些實施方式中，本發明公開提供了綴合物，所述綴合物包含通過一個或多個接頭共價連接的蛋白的殘基，其中所述綴合物包含根據化學式（XIX）的結構： 蛋白-(L) z（XIX） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： z是1至25的整數； 每個L獨立地為接頭；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在化學式（XIX）所示的綴合物的一些實施方式中，至少一個接頭為非可釋放接頭。在一些實施方式中，至少一個接頭是可釋放接頭。在一些實施方式中，所述蛋白是IL-2。在一些實施方式中，至少一個接頭是非可釋放接頭且所述蛋白為IL-2。在一些實施方式中，至少一個接頭是可釋放接頭且所述蛋白為IL-2。在一些實施方式中，所述可釋放接頭是化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-B-2）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXI-2）、（XXII）、（XXII-1）、（XXII-2）、（II）、（II-1）、（II-A）、（III）、（III-1）或（IV）；RL-1；RL-2；或RL-3所示的可釋放接頭。
如本文所描述的本發明公開的綴合物可以是來自方案（I）的步驟一合成的產物。在某些實施方式中，所述接頭為非可釋放接頭。在某些實施方式中，所述接頭是可釋放接頭。在一些實施方式中，所述可釋放接頭是本文所公開的官能性可釋放接頭（例如，化學式（I）、化學式（II）、化學式（III）、化學式（IV）、化學式（XXI）或者化學式（XXII）所示的接頭）的衍生物。在一些實施方式中，所述可釋放接頭是化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-B-2）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXI-2）、（XXII）、（XXII-1）、（XXII-2）、（II）、（II-1）、（II-A）、（III）、（III-1）或（IV）；RL-1；RL-2；或RL-3所示的可釋放接頭，如本文所描述的。
在一些實施方式中，本發明公開提供了綴合物，所述綴合物包含通過接頭共價連接的蛋白的殘基，其中所述綴合物包含根據化學式（XXIII）的結構： (L 2) z2-蛋白-(L 1) z1（XXIII） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： z1為1至20的整數； z2為1至5的整數； 每個L 1獨立地為可釋放接頭； 每個L 2獨立地為非可釋放接頭；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在化學式（XXIII）的綴合物的一些實施方式中，在L 2綴合至蛋白之前將L 1綴合至蛋白。在一些實施方式中，所述蛋白為IL-2。在一些實施方式中，所述蛋白是IL-2並且在L 2綴合至IL-2之前將L 1綴合至IL-2。
在化學式（XXIII）的綴合物的一些實施方式中，在L 1綴合至蛋白之前將L 2綴合至蛋白。在一些實施方式中，所述蛋白為IL-2。在一些實施方式中，所述蛋白是IL-2並且在L 1綴合至IL-2之前將L 2綴合至IL-2。
在某些實施方式中，接頭L、L 1或L 2分別獨立地包含能夠通過點擊化學反應的官能團FG 2，其選自疊氮化物、炔基和環炔基。
在某些實施方式中，接頭L、L 1或L 2共價連接至蛋白內殘基的胺基。在某些實施方式中，所述殘基是離胺酸。在某些實施方式中，提供了包含含有不同數目的連接至蛋白的接頭的綴合物的混合物的組合物。
在化學式（XXIII）的綴合物的一些實施方式中，所述可釋放接頭是化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-B-2）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXI-2）、（XXII）、（XXII-1）、（XXII-2）、（II）、（II-1）、（II-A）、（III）、（III-1）或（IV）；RL-1；RL-2；或RL-3所示的可釋放接頭，如本文所公開的。
使用與蛋白綴合的提供官能性可釋放鍵的試劑所形成的示例性綴合物包括化學式（VII）所示的那些：
Figure 02_image061
（VII） 其中： 每個X 1獨立地為第一間臂部分； 當存在時，每個X 2獨立地為第二間臂部分； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基； a為0至5的整數；且 b是0至3的整數； c是0至2的整數； z是1至25的整數； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（VII）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
當z大於或等於2時，方括號內的每個基團直接結合至蛋白。當c為2或以上時，方括號內的每個FG 2直接結合至X 1，即如果c為1，則X 1是二價第一間臂部分並且如果c為2，則X 1為三價第一間臂部分。這適用於在本發明申請中所公開的其它化學式。
在一些實施方式中，R 1、R 2和R e如以上化學式（I）中所定義。
在化學式（VII）的一些實施方式中，a為0至4的整數。在一些實施方式中，a為0至3的整數。在一些實施方式中，a為0至2的整數。在一些實施方式中，a為0。在一些實施方式中，a為1。在一些實施方式中，a為2。在一些實施方式中，a為3。在一些實施方式中，a為4。在一些實施方式中，a為5。
在化學式（VII）的一些實施方式中，b是0至2的整數。在一些實施方式中，b是0。在一些實施方式中，b是1。在一些實施方式中，b是2。在一些實施方式中，b是3。
在化學式（VII）的一些實施方式中，c為0或1。在一些實施方式中，c為0。在一些實施方式中，c為1。在一些實施方式中，c為2。
在化學式（VII）的一些實施方式中，z為1至20的整數。在一些實施方式中，z為1至15的整數。在一些實施方式中，z為1至10的整數。在一些實施方式中，z為1至8的整數。在一些實施方式中，z為1至5的整數。
常規技術人員將認識到本文所述的a、b、c和z的值和範圍可以以任何方式組合以提供本發明公開的綴合物。例如，在一些實施方式中，a為0至2的整數，b為0或1，c為0或1，且z為1至25的整數。在一些實施方式中，a為1，b為1，c為1且z為1至25的整數。在一些實施方式中，a為1，b為0，c為1且z為1至25的整數。在一些實施方式中，a為1，b為1，c為0且z為1至25的整數。在本發明公開中考慮了這些和多種其它組合。在一些實施方式中，X 1和X 2分別獨立地選自本文所描述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是不同的間臂部分。
在化學式（VII）內，將具有更限定的結構的綴合物考慮為化學式（VII-A）、（VII-B）、（VII-C）或（VII-D）、
Figure 02_image063
（VII-A）；
Figure 02_image065
（VII-B）；
Figure 02_image067
（VII-C）；或
Figure 02_image069
（VII-D）， 其中X 1是第一間臂部分或者當未連接至至少一個FG 2時，X 1還可以是氫；X 2是第二間臂部分；R 1、R 2、R e、a、z、Y 1、Y 2、FG 2和蛋白如以上在化學式（VII）中所定義的。
在化學式（VII）、（VII-A）、（VII-B）、（VII-C）或（VII-D）的某些實施方式中，a為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；並且R e是硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
其它示例性綴合物具有以下結構（VII-A1）：
Figure 02_image071
（VII-A1） 其中，每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基；z為1-25的整數；每個連接至蛋白的“-NH-”（如化學式（VII-A1）中所示）表示分別連接至蛋白的一個或多個接頭。在某些實施方式中，其中a為1至2的整數；且R e為4-F、4-Cl、4-CF 3、2,4-二氟或2-CF 3-4-F取代。
其它示例性綴合物具有以下結構：
Figure 02_image073
；
Figure 02_image075
；
Figure 02_image077
；或
Figure 02_image079
； 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體，其中z為1至25的整數。
使用與蛋白綴合的提供官能性可釋放鍵的試劑所形成的示例性綴合物包括化學式（XXVIII）所示的那些：
Figure 02_image081
（XXVIII） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體； 其中： 每個X獨立地為間臂部分或氫； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基； 每個a獨立地為0至4的整數； z是1至25的整數； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXVIII）中所示）為蛋白內殘基的胺基。
在化學式（XXVIII）的一些實施方式中，a為0至4的整數。在一些實施方式中，a為0至3的整數。在一些實施方式中，a為0至2的整數。在一些實施方式中，a為0。在一些實施方式中，a為1。在一些實施方式中，a為2。在一些實施方式中，a為3。在一些實施方式中，a為4。
在化學式（XXVIII）的一些實施方式中，z為1至20的整數。在一些實施方式中，z為1至15的整數。在一些實施方式中，z為1至10的整數。在一些實施方式中，z為1至8的整數。在一些實施方式中，z為1至5的整數。
常規技術人員將認識到本文所述的a和z的值和範圍可以以任何方式組合以提供本發明公開的綴合物。例如，在一些實施方式中，a為0至2的整數，且z為1至25的整數。在一些實施方式中，a為1且z是1至25的整數。在本發明公開中考慮了這些和多種其它組合。
在一些實施方式中，Y 1為O。在一些實施方式中，Y 2為O。在一些實施方式中，Y 1和Y 2為O。在一些實施方式中，R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et。在一些實施方式中，R e是硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。在一些實施方式中，X選自本文所描述的間臂部分。
在化學式（XXVIII）的某些實施方式中，其它示例性綴合物具有以下結構之一：
Figure 02_image083
。
使用與蛋白綴合的提供可釋放和非可釋放鍵兩者的試劑所形成的示例性綴合物包括化學式（XXIX）所示的那些：
Figure 02_image085
（XXIX） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體； 其中： 每個X 1獨立地為間臂部分或氫； 每個X 2獨立地為間臂部分； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基； a獨立地為0至4的整數； z1為1至20的整數； z2為1至5的整數； Y 1、Y 2和Y 3分別獨立地為O或S； 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXIX）中所示）為蛋白內殘基的胺基。
在一些實施方式中，所述綴合物包含化學式（XXIX-I）所示的結構：
Figure 02_image087
（XXIX-I） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體； 其中： 每個X 2獨立地為間臂部分； z2為1至5的整數； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXIX-I）中所示）為蛋白內殘基的胺基。
在化學式（XXIX）的一些實施方式中，a為0至4的整數。在一些實施方式中，a為0至3的整數。在一些實施方式中，a為0至2的整數。在一些實施方式中，a為0。在一些實施方式中，a為1。在一些實施方式中，a為2。在一些實施方式中，a為3。在一些實施方式中，a為4。
在化學式（XXIX）的一些實施方式中，z1是1至15的整數。在一些實施方式中，z1為1至10的整數。在一些實施方式中，z1為1至8的整數。在一些實施方式中，z1為1至5的整數。在一些實施方式中，z1為1至3的整數。
在化學式（XXIX）或（XXIX-I）的一些實施方式中，z2是1至4的整數。在一些實施方式中，z2為1至3的整數。在一些實施方式中，z2為1至2的整數。在一些實施方式中，z2為1。在一些實施方式中，z2為2。在一些實施方式中，z2為3。
常規技術人員將認識到本文所述的a、z1和z2的值和範圍可以以任何方式組合以提供本發明公開的綴合物。例如，在一些實施方式中，a為0至2的整數，z1是1，且z2是1至15的整數。在一些實施方式中，a為1，z1是1且z2是1至15的整數。在一些實施方式中，a為1，z1是1且z2是1至10的整數。在一些實施方式中，a為1，z1是1且z2是1至5的整數。在本發明公開中考慮了這些和多種其它組合。
在一些實施方式中，Y 1為O。在一些實施方式中，Y 2為O。在一些實施方式中，Y 3為O。在一些實施方式中，Y 1、Y 2和Y 3為O。在一些實施方式中，R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et。在一些實施方式中，R e是硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。在一些實施方式中，X 1和X 2分別獨立地選自本文所描述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是不同的間臂部分。
在化學式（XXIX）內，將具有更限定的結構的綴合物考慮為以下結構：
Figure 02_image089
。
在一些實施方式中，化學式（XXIX-I）所示的綴合物具有以下結構：
Figure 02_image091
。
使用與蛋白綴合的提供雙官能可釋放鍵的試劑所形成的示例性綴合物包括化學式（XXX）所示的那些：
Figure 02_image093
（XXX） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體； 其中： 每個X 1獨立地為間臂部分； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基； 每個a獨立地為0至4的整數； z為1至25的整數； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S；且 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXX）中所示）為蛋白內殘基的胺基。
在化學式（XXX）的一些實施方式中，a為0至4的整數。在一些實施方式中，a為0至3的整數。在一些實施方式中，a為0至2的整數。在一些實施方式中，a為0。在一些實施方式中，a為1。在一些實施方式中，a為2。在一些實施方式中，a為3。在一些實施方式中，a為4。
在化學式（XXX）的一些實施方式中，z為1至20的整數。在一些實施方式中，z為1至15的整數。在一些實施方式中，z為1至10的整數。在一些實施方式中，z為1至8的整數。在一些實施方式中，z為1至5的整數。在一些實施方式中，z為1至3的整數。
常規技術人員將認識到本文所述的a和z的值和範圍可以以任何方式組合以提供本發明公開的綴合物。例如，在一些實施方式中，a為0至2的整數且z2為1至15的整數。在一些實施方式中，a為1且z2為1至10的整數。在一些實施方式中，a為0且z2為1至10的整數。在一些實施方式中，a為0且z為1至5的整數。在本發明公開中考慮了這些和多種其它組合。
在一些實施方式中，Y 1為O。在一些實施方式中，Y 2為O。在一些實施方式中，Y 1和Y 2為O。在一些實施方式中，R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et。在一些實施方式中，R 1和R 2是氫。在一些實施方式中，R e是硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。在一些實施方式中，X 1獨立地選自本文所描述的間臂部分。
在一些實施方式中，a為0；z為1至10的整數；R 1是氫；R 2是氫；Y 1為O；且Y 2為O。
使用提供官能性可釋放鍵的試劑所形成的其它示例性綴合物包括以下化學式（VIII）所示的那些：
Figure 02_image095
（VIII） 其中： 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； 每個b1為1； 每個b2獨立地為0至1的整數； z為1至25的整數； 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團； 每個X 2獨立地為間臂部分； 當存在時，每個X 3獨立地為間臂部分； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個FG 2是能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（VIII）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R 1、R 2、R e1和R e2如以上化學式（VI）中所定義。
在化學式（VIII）的某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；且R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
在化學式（VIII）內，將具有更限定的結構的綴合物考慮為化學式（VIII-A）：
Figure 02_image097
（VIII-A）。
使用兩種提供可釋放鍵的試劑所形成的其它示例性綴合物包括以下化學式（IX）所示的那些：
Figure 02_image099
（IX） 其中： 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； 每個b1為1； 每個b2獨立地為0至1的整數； z為1至25的整數； 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團； 每個R p獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個X 2獨立地為間臂部分； 當存在時，每個X 3獨立地為間臂部分； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（IX）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R 1、R 2、R p、R e1和R e2如以上化學式（VI）中所定義。
在化學式（IX）的某些實施方式中，其中a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；且R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
在化學式（IX）內，具有更限定的結構的綴合物如以下化學式（IX-A）所示：
Figure 02_image101
（IX-A）。
使用兩種提供可釋放鍵的試劑所形成的其它示例性綴合物包括以下化學式（X）所示的那些：
Figure 02_image103
（X） 其中： 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 3獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 4獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； 每個b1為1； 每個b2獨立地為0至1的整數； 每個c獨立地為0至4的整數； z為1至25的整數； 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團； 每個R d獨立地為硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基； 每個X 2獨立地為間臂部分； 當存在時，每個X 3獨立地為間臂部分； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個Y 4獨立地為O或S； 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（X）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R 1、R 2、R 3、R 4、R d、R e1和R e2如以上化學式（IV）中所定義。
在本文所公開的化學式的某些實施方式中，z是1至22、1至20、1至18、1至15、1至12、1至10、1至8、1至5或1至3的整數，其中z代表綴合至蛋白的可釋放接頭的數目。在一些實施方式中，z為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。在一些實施方式中，z為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方式中，z為1、2、3、4、5或6。
在一些實施方式中，z1為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些實施方式中，z1為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方式中，z1為1、2、3、4、5或6。在一些實施方式中，z2為1、2、3、4或5。在一些實施方式中，z2為1、2或3。
在一些實施方式中，本發明公開涉及包含根據本發明公開所述的綴合物中的任一個的組合物。在一些實施方式中，組合物包含本發明公開所述的綴合物的混合物。在一些實施方式中，組合物包含本發明公開所述的綴合物中的多個。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z的平均值為1至約20、1至約15、1至約10、1至約8、1至約7、1至約6、1至約5、1至約4、1至約3或者1至約2。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z1的平均值為1至約15、1至約10、1至約8、1至約6、1至約4、1至約3或者1至約2。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z2的平均值為1至約4、1至約3或者1至約2。在一些實施方式中，所述組合物還包括藥物可用的賦形劑或載體。
在一些實施方式中，本發明公開涉及包含本發明公開所述的至少一種綴合物的組合物。在一些實施方式中，所述組合物包含本發明公開所述的綴合物的混合物。在一些實施方式中，所述綴合物的混合物包含具有不同的z和/或y的多個綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；其中z是6的綴合物；其中z是7的綴合物；其中z是8的綴合物；其中z是9的綴合物；和/或其中z是10的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；其中z是6的綴合物；其中z是7的綴合物；和/或其中z是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；和/或其中z是6的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；其中z是6的綴合物；其中z是7的綴合物；和/或其中z是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；和/或其中z是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；和/或其中z是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物和/或其中z是2的綴合物。
在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；其中y是6的綴合物；其中y是7的綴合物；其中y是8的綴合物；其中y是9的綴合物；和/或其中y是10的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；其中y是6的綴合物；其中y是7的綴合物；和/或其中y是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；和/或其中y是6的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；其中y是6的綴合物；其中y是7的綴合物；和/或其中y是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；和/或其中y是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；和/或其中y是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物和/或其中y是2的綴合物。
在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；其中z1是6的綴合物；其中z1是7的綴合物；其中z1是8的綴合物；其中z1是9的綴合物；和/或其中z1是10的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；其中z1是6的綴合物；其中z1是7的綴合物；和/或其中z1是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；和/或其中z1是6的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；其中z1是6的綴合物；其中z1是7的綴合物；和/或其中z1是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；和/或其中z1是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；和/或其中z1是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；和/或其中z1是2的綴合物。
在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z2是1的綴合物；其中z2是2的綴合物；其中z2是3的綴合物；其中z2是4的綴合物；和/或其中z2是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z2是1的綴合物；其中z2是2的綴合物；和/或其中z2是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z2是1的綴合物和/或其中z2是2的綴合物。
蛋白-大分子綴合物
在本發明公開的一個或多個實施方式中，提供了蛋白-大分子綴合物，所述綴合物包含蛋白、至少一個接頭和至少一個大分子，其中所述蛋白通過接頭共價連接至每個大分子，其中所述大分子是直鏈或支鏈水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。在某些實施方式中，所述至少一個接頭是兩個或更多個接頭。在某些實施方式中，所述兩個或更多個接頭包含至少一個非可釋放接頭。在某些實施方式中，所述兩個或更多個接頭包含至少一個可釋放接頭。在某些實施方式中，所述兩個或更多個接頭包含至少一個非可釋放接頭和一個可釋放接頭。在某些實施方式中，所述兩個或更多個接頭包含至少一個非可釋放接頭和1至8個可釋放接頭。在一些實施方式中，所述可釋放接頭是化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-B-2）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXI-2）、（XXII）、（XXII-1）、（XXII-2）、（II）、（II-1）、（II-A）、（III）、（III-1）或（IV）；RL-1；RL-2；或RL-3所示的可釋放接頭，如本文所公開的。
在所述蛋白-大分子綴合物的一些實施方式中，所述綴合物包含蛋白、至少一個接頭和至少一個大分子，其中所述蛋白通過接頭共價連接至每個大分子，其中所述大分子是直鏈或支鏈水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽，並且其中至少一個接頭為非可釋放接頭。在一些實施方式中，所述蛋白是IL-2。
在某些實施方式中，所述至少一個接頭為非可釋放接頭。在某些實施方式中，所述至少一個接頭是可釋放接頭。在某些實施方式中，每個所述接頭是可釋放接頭。在某些實施方式中，一個或多個大分子通過一個或多個接頭共價連接至所述蛋白。在某些實施方式中，8個或更多個大分子通過8個或更多個接頭共價連接至所述蛋白。
在某些實施方式中，所述大分子通過接頭共價連接至所述蛋白內的殘基的胺基。在某些實施方式中，所述殘基是離胺酸。在某些實施方式中，所述綴合物是包含不同數目的連接至所述蛋白的大分子的綴合物的混合物。
在所述蛋白-大分子綴合物的一些實施方式中，所述綴合物通過接頭在所述蛋白內殘基的胺基處共價連接。在一些實施方式中，所述殘基為離胺酸。在一些實施方式中，所述大分子通過可釋放接頭連接至蛋白，並且所述大分子具有約500道爾頓至小於20,000道爾頓的範圍內的重均分子量。
在多個實施方式中，所述大分子是水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。它可以包括任何以下化合物：包含約6至約26個碳原子的脂肪酸，選自下列的聚合物之一：2-甲丙烯醯-氧乙基磷醯膽鹼、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸脂)、聚(丙烯醯胺)、聚(N-丙烯醯嗎啉)、聚(烷氧基)聚合物、聚(醯胺)、聚(醯胺胺)、聚(胺基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬醯胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚對苯二甲酸丁二醇酯、聚(己內酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯醯胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(磷酸三乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(α-羥酸)、聚(羥乙基丙烯酸脂)、聚(羥乙基噁唑啉)、聚(羥基甲基丙烯酸酯)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚(羥丙基噁唑啉)、聚(亞氨基碳酸酯)、聚（乳酸）、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯醯胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有機磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚磷腈、聚(丙二醇)、聚(糖)、聚(矽氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲醚)、聚(乙烯吡硌烷酮)、矽酮、直鏈澱粉、纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、幾丁質、殼聚糖、右旋糖酐、糊精、明膠、透明質酸（HA）和衍生物、官能化透明質酸、甘露聚糖、果膠、肝素、硫酸乙醯肝素（HS）、鼠李聚糖半乳糖醛酸、澱粉、羥烷基澱粉、羥乙基澱粉（HES）、聚唾液酸（PSA）及其它碳水化合物-基聚合物、木聚糖，以及白蛋白、轉鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白、免疫球蛋白、XTEN肽的共聚物、富甘胺酸高胺基酸聚合物（HAP）、PAS多肽、彈性蛋白-樣多肽（ELP）、CTP肽或明膠-樣蛋白（GLK）聚合物。
在某些實施方式中，所述大分子是水溶性聚合物。在某些實施方式中，所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)的聚合物。在某些實施方式中，用選自下列的封端部分對聚(乙二醇)封端：羥基、烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基。
對於所述水溶性聚合物，所述水溶性聚合物是無毒的、非天然存在的和生物相容的。對於生物相容性，如果如通過臨床醫師，例如，醫師所評價的，與所述物質單獨或與另一種與生命組織有關的物質（例如，活性劑，如IL-2部分）一起的使用（例如，向患者施用）有關的有益作用大於任何有害作用，則認為該物質是生物相容的。對於非免疫原性，如果所述物質的預期體內使用不產生不期望的免疫應答（例如，抗體的形成），或者如果產生免疫應答，但如臨床醫師所評價的，不認為這種應答是臨床顯著的或重要的，則認為該物質是非免疫原性的。特別較佳地，非肽水溶性聚合物是生物相容的和非免疫原性的。
此外，所述聚合物的特徵通常在於具有2至約300個末端。這些聚合物的實例包括（但不限於）聚(烷撐二醇)，如聚乙二醇（“PEG”）、聚(丙二醇)（“PPG”）、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚乙烯吡咯烷酮、聚(羥基烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥基烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羥酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉（“POZ”）（其在WO 2008/106186中有描述）、聚(N-丙烯醯嗎啉)和任何上述的組合。
所述水溶性聚合物不局限於特定結構並且可以是直鏈的（例如，封端的，例如，烷氧基PEG或雙官能PEG）、支鏈或多臂的（例如，叉狀PEG或連接至多元醇芯的PEG）、樹枝狀（或星形）結構，其每個具有或不具有一個或多個可降解鍵。此外，可以以任意數目的不同的重複模式組織所述水溶性聚合物的內部結構並且所述內部結構可以選自均聚物、交替共聚物、無規共聚物、嵌段共聚物、交替三聚體、隨機三聚體和嵌段三聚體。
用適合於偶聯至所述蛋白上所期望的位點的適合的啟動基團來啟動啟動的PEG及其它啟動的水溶性聚合物（即聚合試劑）。因此，聚合試劑將具有用於與蛋白質部分反應的反應基團。用於將這些聚合物綴合至活性部分的代表性聚合試劑和方法在本領域中是已知的並且進一步描述於Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)中的Zalipsky, S.等人, “Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides”和Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182中。適合於偶聯至蛋白質部分的示例性啟動基團包括羥基、馬來醯亞胺、酯、乙縮醛、縮酮、胺、羧基、醛、醛合水、酮、烯基酮、硫酮、硫醇、乙烯碸、肼等。
通常，所述綴合物中的所述水溶性聚合物的重均分子量為約100道爾頓至約150,000道爾頓。然而，示例性範圍包括約500道爾頓至小於20,000道爾頓的範圍內，約20,000道爾頓至小於85,000道爾頓的範圍內，約85,000道爾頓至約100,000道爾頓的範圍內，大於5,000道爾頓至約100,000道爾頓的範圍內，約6,000道爾頓至約90,000道爾頓的範圍內，約10,000道爾頓至約85,000道爾頓的範圍內，大於10,000道爾頓至約85,000道爾頓的範圍內，約20,000道爾頓至約85,000道爾頓的範圍內，約53,000道爾頓至約85,000道爾頓的範圍內，約25,000道爾頓至約120,000道爾頓的範圍內，約29,000道爾頓至約120,000道爾頓的範圍內，約35,000道爾頓至約120,000道爾頓的範圍內和約40,000道爾頓至約120,000道爾頓的範圍內的重均分子量。對於任何給定水溶性聚合物，較佳分子量在這些範圍中的一個或多個中的PEG。
示例性的水溶性聚合物的重均分子量包括約100道爾頓，約200道爾頓，約300道爾頓，約400道爾頓，約500道爾頓，約600道爾頓，約700道爾頓，約750道爾頓，約800道爾頓，約900道爾頓，約1,000道爾頓，約1,500道爾頓，約2,000道爾頓，約2,200道爾頓，約2,500道爾頓，約3,000道爾頓，約4,000道爾頓，約4,400道爾頓，約4,500道爾頓，約5,000道爾頓，約5,500道爾頓，約6,000道爾頓，約7,000道爾頓，約7,500道爾頓，約8,000道爾頓，約9,000道爾頓，約10,000道爾頓，約11,000道爾頓，約12,000道爾頓，約13,000道爾頓，約14,000道爾頓，約15,000道爾頓，約16,000道爾頓，約17,000道爾頓，約18,000道爾頓，約19,000道爾頓，約20,000道爾頓，約22,500道爾頓，約25,000道爾頓，約30,000道爾頓，約35,000道爾頓，約40,000道爾頓，約45,000道爾頓，約50,000道爾頓，約55,000道爾頓，約60,000道爾頓，約65,000道爾頓，約70,000道爾頓和約75,000道爾頓。還可以使用具有任何上述總分子量的水溶性聚合物的支鏈形式（例如，由兩個20,000道爾頓聚合物組成的支鏈40,000道爾頓水溶性聚合物）。
在一些實施方式中，所述大分子是水溶性聚合物。在一些實施方式中，所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。在一些實施方式中，所述大分子具有約500道爾頓至約100,000道爾頓的範圍內的重均分子量。在一些實施方式中，所述大分子具有約500道爾頓至小於20,000道爾頓的範圍內的重均分子量。在一些實施方式中，所述大分子具有約20,000道爾頓至小於85,000道爾頓的範圍內的重均分子量。在一些實施方式中，所述大分子具有約85,000道爾頓至約100,000道爾頓的範圍內的重均分子量。在一些實施方式中，所述大分子具有約10,000道爾頓至小於30,000道爾頓的範圍內的重均分子量。在一些實施方式中，所述大分子具有約17,000道爾頓或者約20,000道爾頓的範圍內的重均分子量。
在一些實施方式中，所述聚(乙二醇)具有約500道爾頓至約100,000道爾頓，約500道爾頓至約20,000道爾頓，約20,000道爾頓至約85,000道爾頓，約85,000道爾頓至約100,000道爾頓的範圍內的重均分子量。在一些實施方式中，所述聚(乙二醇)具有約10,000道爾頓至約30,000道爾頓的範圍內的重均分子量。在一些實施方式中，所述聚(乙二醇)具有約17,000道爾頓或者約20,000道爾頓的範圍內的重均分子量。
當用作所述聚合物時，PEG通常將包含一定數目的(OCH 2CH 2)單體[或(CH 2CH 2O)單體，取決於如何定義PEG]。如在整個描述中所使用的，通過“(OCH 2CH 2) n”中的下標“n”來表示重複單元的數目。因此，（n）值通常在以下範圍中的一個或多個內：2至約3400，約100至約2300，約100至約2270，約136至約2050，約225至約1930，約450至約1930，約1200至約1930，約568至約2727，約660至約2730，約795至約2730，約795至約2730，約909至約2730和約1,200至約1,900。對於其中分子量已知的任何給定聚合物，有可能通過將所述聚合物的總重均分子量除以重複單體的分子量來確定重複單元的數目（即“n”）。
用於在本發明公開中使用的一個特別較佳的聚合物是封端聚合物，即具有至少一個用相對惰性的基團，如低級C 1-6烷氧基（儘管還可以使用羥基）封端的末端的聚合物。當所述聚合物是PEG時，例如，較佳地使用甲氧基-PEG（通常稱為mPEG），它是其中所述聚合物的一個末端為甲氧基（-OCH 3），而另一個末端是羥基或可以任選地化學修飾的其它官能團的PEG的直鏈形式。
在本發明公開的一個或多個實施方式中有用的一種形式中，游離或結合的PEG是在每個末端用羥基封端的直鏈聚合物。 HO-CH 2CH 2O-(CH 2CH 2O) n-CH 2CH 2-OH， 其中（n）通常在0至約4,000的範圍內。
可以用簡明形式，如HO-PEG-OH表示上述聚合物，α-,ω-二羥基聚(乙二醇)，其中應理解-PEG-符號可以表示以下結構單元： -CH 2CH 2O-(CH 2CH 2O) n-CH 2CH 2-， 其中（n）如以上定義。
在本發明公開的一個或多個實施方式中有用的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-OH或mPEG-OH，簡要地，其中一個末端是相對惰性的甲氧基，而另一個末端是羥基。以下提供了mPEG-OH的結構。 CH 3O-CH 2CH 2O-(CH 2CH 2O) n-CH 2CH 2-OH 其中（n）如以上定義。
在本發明公開的一個或多個實施方式中有用的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-NH 2或mPEG-NH 2，簡要地，其中一個末端是相對惰性的甲氧基，而另一個末端是氨基。以下提供了mPEG-NH 2的結構。 CH 3O-CH 2CH 2O-(CH 2CH 2O) n-CH 2CH 2-NH 2其中（n）如以上定義。
在本發明公開的一個或多個實施方式中有用的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-CO 2H或mPEG-CO 2H，簡要地，其中一個末端是相對惰性的甲氧基，而另一個末端是羧基。以下提供了mPEG-CO 2H的結構。 CH 3O-CH 2CH 2O-(CH 2CH 2O) n-CH 2CH 2-CO 2H 其中（n）如以上定義。
在本發明公開的一個或多個實施方式中有用的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-N 3或mPEG-N 3，簡要地，其中一個末端是相對惰性的甲氧基，而另一個末端是疊氮基。以下提供了mPEG-N 3的結構。 CH 3O-CH 2CH 2O-(CH 2CH 2O) n-CH 2CH 2-N 3其中（n）如以上定義。
在本發明公開的一個或多個實施方式中有用的另一種類型的PEG是甲氧基-PEG-DBCO或mPEG-DBCO，簡要地，其中一個末端是相對惰性的甲氧基，而另一個末端是二苯并環辛炔（DBCO）基團。以下提供了mPEG-DBCO的結構的一個實例。
Figure 02_image105
其中（n）如以上定義。
多臂或支鏈PEG分子，如美國專利No. 5,932,462中所述的那些也可以用作PEG聚合物。例如，PEG可以具有以下結構：
Figure 02_image107
其中： poly a和poly b是PEG主鏈（相同或不同的），如甲氧基聚(乙二醇)；R'是非反應性部分，如H、甲基或PEG主鏈；並且P和Q是非反應性鍵。
另外，PEG可以包含叉狀PEG。通過以下結構表示叉狀PEG的實例：
Figure 02_image109
其中：X是一個或多個原子的間臂部分並且每個Z是通過限定長度的原子鏈連接至CH的啟動的末端基團。國際專利申請公開WO 99/45964公開了能夠在本發明公開的一個或多個實施方式中使用的多種叉狀PEG結構。將Z官能團連接至支鏈碳原子的原子鏈用作連接基團，並且可以包括（例如）烷基鏈、醚鏈、酯鏈、醯胺鏈及其組合。
PEG聚合物可以包含具有沿PEG長度，而不是在PEG鏈末端共價連接的反應基團，如羧基的側基PEG分子。側基反應基團可以直接或通過間臂部分，如亞烷基基團連接至PEG。
作為聚合物骨架內的可降解鍵和/或作為與蛋白質部分連接的可降解鍵有用的一些水解可降解鍵包括：酯鍵、碳酸酯鍵；從（例如）胺和醛的反應獲得的亞胺鍵（參見，例如，Ouchi等人 (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3）；例如，通過醇與磷酸基的反應所形成的磷酸酯鍵；通常通過醯肼和醛的反應所形成的腙鍵；通常通過醛和醇之間的反應所形成的乙縮醛鍵；例如，通過甲酸酯和醇之間的反應所形成的原酸酯鍵；通過（例如）聚合物（如PEG）末端的胺基與另一個PEG鏈的羧基所形成的醯胺鍵；由（例如）具有末端異氰酸酯基的PEG和PEG醇的反應所形成的氨基甲酸酯鍵；通過（例如）聚合物（如PEG）末端的胺基和肽的羧基所形成的肽鍵；和通過（例如）位於（例如）聚合物末端的亞磷醯胺基與寡核苷酸的5'羥基所形成的寡核苷酸鍵。
綴合物的這些任選的特徵，即一個或多個可降解鍵向聚合物鏈或向蛋白質部分的引入可以通過施用，對綴合物最終所期望的藥理學性質提供額外的控制。例如，可以施用大且相對惰性的綴合物（即，具有一個或多個與之連接的高分子量PEG鏈，例如，一個或多個分子量大於約10,000的PEG鏈，其中所述綴合物基本上不具有生物活性），其釋放以產生具有原始PEG鏈部分的生物活性綴合物。以這種方式，可以更有效地調節所述綴合物的性質以平衡所述綴合物隨時間的生物活性。
與綴合物結合的水溶性聚合物可以是“可釋放的”。即，釋放水溶性聚合物（通過水解、酶促過程、催化過程或其它方法），借此導致產生了非綴合的蛋白質部分。在一些情況下，可釋放聚合物在體內與蛋白質部分分離，從而不會留下任何水溶性聚合物片段。在其它實例中，可釋放聚合物在體內與蛋白質部分分離，從而留下來自水溶性聚合物的相對小的片段（例如，琥珀酸酯標籤）。示例性的可切割聚合物包括通過氨基甲酸酯鍵連接至蛋白質部分的聚合物。
本領域那些技術人員將認識到以上有關水溶性聚合物的討論決不是窮舉的並且僅是說明性的，並且考慮了具有如上所述的品質的所有聚合物材料。如本文所使用的，術語“聚合試劑”一般地表示整個分子，其可以包含水溶性聚合物部分和官能團。
如上所述，本發明公開的綴合物可以包含共價連接至蛋白質部分的多個水溶性聚合物。在一些實施方式中，共價連接至蛋白質部分的多個水溶性聚合物是相同的。在一些實施方式中，共價連接至蛋白質部分的多個水溶性聚合物中的至少一個是不同的。通常，對於任何給定綴合物，將存在共價連接至一個或多個具有蛋白活性的部分的一個或多個水溶性聚合物。在一些情況下，所述綴合物可以具有單獨連接至蛋白質部分的1、2、3、4、5、6、7、8或更多個水溶性聚合物。可以將任何給定水溶性聚合物共價連接至蛋白質部分的胺基酸，或者當所述蛋白質部分是（例如）糖蛋白時，連接至所述蛋白質部分的碳水化合物。可以（例如）使用利用唾液酸-疊氮化物化學的代謝官能化[Luchansky等人 (2004) Biochemistry 43(38): 12358-123661]或其它適合的方法，如使用縮水甘油以有利於醛基的引入[Heldt等人 (2007) European Journal of Organic Chemistry 32:5429-5433]來實施與碳水化合物的連接。
所述蛋白質部分內具體的鍵和所述聚合物取決於一些因素。這些因素包括（例如）所使用的具體的鍵化學、具體的蛋白質部分、所述蛋白質部分內可用的官能團（對於與接頭、聚合物的連接或向適合連接位點的轉化）、所述蛋白質部分內其它反應性官能團的存在等。
本發明公開所述的綴合物可以是前體藥物，這表示所述聚合物和所述蛋白質部分之間的鍵是可釋放的以允許母體部分的釋放。除了本發明公開中所述的可釋放接頭之外，其它示例性可釋放鍵可以包括羧酸酯、磷酸酯、硫酯、酸酐、乙縮醛、縮酮、醯氧基烷基醚、亞胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。可以通過蛋白質部分（例如，蛋白的羧基C末端或者蛋白內所含的胺基酸，如絲胺酸或蘇胺酸的側鏈羥基，或者碳水化合物內的類似官能性）的適當修飾和/或使用本領域中常用的偶聯方法的聚合試劑來容易地製備這些鍵。然而，最較佳通過適當啟動的聚合物與蛋白質部分內所含的未修飾的官能團的反應所容易地形成的可釋放鍵。
作為另外一種選擇，還可以將水解穩定的鍵，如醯胺、氨基甲酸酯（urethane）（也稱為氨基甲酸酯（carbamate））、胺、硫醚（thioether）（也稱為硫醚（sulfide））或脲（也稱為尿素）鍵用作用於偶聯蛋白質部分的鍵。較佳的水解穩定的鍵是醯胺。在一種方法中，具有啟動的酯的水溶性聚合物可以與蛋白質部分上的胺基反應，借此導致產生醯胺鍵。另一種較佳的水解穩定的鍵是硫醇橋。
所述綴合物（與未綴合的蛋白質部分相反）可以或可以不具有可測量程度的蛋白活性。也就是，根據本發明公開的聚合物-蛋白綴合物將具有約0.1%至約100%，包括約0.1%，約0.5%，約1%，約5%，約10%，約15%，約20%，約25%，約30%，約35%，約40%，約45%，約50%，約55%，約60%，約65%，約70%，約75%，約80%，約85%，約90%，約55%或約100%中任何數量的未修飾的母體蛋白質部分的生物活性。在一些情況下，所述聚合物-蛋白綴合物可以具有大於100%的未修飾的母體蛋白質部分的生物活性。較佳地，幾乎不或不具有蛋白活性的綴合物含有將聚合物連接至蛋白的可水解鍵，從而不考慮所述綴合物中活性的缺乏（或相對缺乏），通過所述可水解鍵的水-引起的切割釋放活性母體分子（或其衍生物）。基於具體蛋白的已知活性，可以使用適合的體內或體外模型確定這種活性。
對於具有將蛋白偶聯至聚合物的水解穩定的鍵的綴合物，所述綴合物通常將具有可測量程度的生物活性。例如，這些綴合物的特徵通常在於相對於非綴合蛋白，具有滿足以下百分比中的一種或多種的生物活性：至少約2%，至少約5%，至少約10%，至少約15%，至少約25%，至少約30%，至少約40%，至少約50%，至少約60%，至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%，至少約100%和大於105%（當在適合的模型中測量時，如在本領域中熟知的那些）。較佳地，具有水解穩定的鍵（例如，醯胺鍵、硫醇橋）的綴合物將具有至少一定程度的未修飾的母體蛋白的生物活性。
蛋白和水溶性聚合物之間通過接頭的連接可以是直接的，其中在所述接頭和所述聚合物之間不存在間隔原子，或者是間接的，其中在所述鍵和所述聚合物之間存在一個或多個原子。對於間接連接，“間臂部分”可以用作鍵的殘基和水溶性聚合物之間的接頭。構成間臂部分的一個或多個原子可以包括碳原子、氮原子、硫原子、氧原子中的一個或多個及其組合。間臂部分可以包含醯胺、仲胺、氨基甲酸酯、硫醚、二硫基和/或點擊化學產物組。具體的間臂部分的非限制性實例包括選自下列中的那些：-O-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH 2-、-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、O-CH 2-、-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-C(O)-O-CH 2-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-NH-CH 2-、-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-CH 2-、-C(O)-CH 2-、-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-O-C(O)-NH-[CH 2] l-(OCH 2CH 2) m-、二價環烷基、-O-、-S-、胺基酸、-N(R 3)-，以及任何上述基團中的兩種或更多種的組合，其中R 3是H或選自下列的有機基：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基，（l）是0至6，並且（m）是0至20。其它具體的間臂部分具有以下結構：-C(O)-NH-(CH 2) 1-6-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH 2) 1-6-NH-C(O)-和-O-C(O)-NH-(CH 2) 1-6-NH-C(O)-，其中每個亞甲基後的下標值表示所述結構中所含的亞甲基的數目，例如，(CH 2) 1-6表示所述結構可以含有1、2、3、4、5或6個亞甲基。在一些實施方式中，所述間臂部分是-O-、-NH-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-OP(O)(OH)-、-OP(S)(OH)-、-C(S)-、-[CH 2] 1-6-、-O-CH 2-、-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-C(O)-O-CH 2-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-NH-CH 2-、-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-CH 2-、-C(O)-CH 2-、-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-[CH 2] 0-6-O-(CH 2CH 2O) 1-20-[CH 2] 0-6-或-O-C(O)-NH-[CH 2] 0-6-(OCH 2CH 2) 0-20-。在一些實施方式中，所述間臂部分是-[CH 2] 4-6-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-CH 2-或-CH 2-O-(CH 2CH 2O) 4-6-[CH 2] 2-。在一些實施方式中，所述間臂部分是-[CH 2] 5-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-CH 2-或-CH 2-O-(CH 2CH 2O) 5-[CH 2] 2-。在一些實施方式中，三價間臂部分為
Figure 02_image001
或
Figure 02_image003
。
另外，任何上述間臂部分還可以包含含有1至20個環氧乙烷單體單元的環氧乙烷寡聚物鏈[即-(CH 2CH 2O) 1-20]。也就是說，所述環氧乙烷寡聚物鏈可以出現在所述間臂部分之前或之後，並且任選地在由兩個或更多個原子組成的間臂部分的任何兩個原子之間。另外，如果所述寡聚物鄰近於聚合物部分，則寡聚物鏈將不會被認為是所述間臂部分的一部分，並且僅表示所述聚合物部分的擴展。
一般的蛋白-大分子綴合物包含根據化學式（XX）的結構： 蛋白-(L-大分子) z（XX） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： z是1至25的整數； 每個L獨立地為接頭； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 每個大分子獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
在一些實施方式中，所述綴合物包含化學式（XX-I）所示的結構： (FG 2-L) y-蛋白-(L-大分子) z（XX-I）
或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： z是1至25的整數； y是0至24的整數； 每個L獨立地為接頭； 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 每個大分子獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
在化學式（XX）或（XX-I）的綴合物的一些實施方式中，至少一個接頭是非可釋放接頭。在一些實施方式中，至少一個接頭是可釋放接頭。在一些實施方式中，所述蛋白是IL-2。在一些實施方式中，至少一個接頭是非可釋放接頭且所述蛋白為IL-2。在一些實施方式中，至少一個接頭是可釋放接頭且所述蛋白為IL-2。
在綴合物化學式（XX）或（XX-I）的一些實施方式中，z為1至5的整數；L為非可釋放接頭；從化學式（XIX）所示的綴合物與適合的大分子的點擊化學反應產生綴合物，其中化學式（XIX）所示的綴合物中的L分別獨立地包含能夠通過點擊化學反應的官能團FG 2，其選自疊氮化物、炔基和環炔基。
在一些實施方式中，所述接頭L是本發明公開的接頭。在一些實施方式中，L是一個或多個非可釋放接頭和/或一個或多個可釋放接頭。在一些實施方式中，所述一個或多個可釋放接頭衍生自本發明公開的官能性可釋放接頭（例如，化學式（I）、化學式（II）、化學式（III）、化學式（IV）、化學式（XVIII）、化學式（XXI）或者化學式（XXII）所示的接頭）和/或具有可釋放接頭的聚合試劑（例如，化學式（V）或化學式（VI））。在一些實施方式中，所述可釋放接頭是化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-B-2）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXI-2）、（XXII）、（XXII-1）、（XXII-2）、（II）、（II-1）、（II-A）、（III）、（III-1）或（IV）；RL-1；RL-2；或RL-3所示的可釋放接頭，如本文所描述的。
在一些實施方式中，z為1至20的整數。在一些實施方式中，z為1至15的整數。在一些實施方式中，z為1至10的整數。在一些實施方式中，z為1至8的整數。在一些實施方式中，z為1至5的整數。
在一些實施方式中，當z為2或以上時，連接至所述蛋白的每個L-大分子是相同的。在一些實施方式中，當z為2或以上時，連接至所述蛋白的至少一個L-大分子是不同的。在一些實施方式中，當z為2或以上時，連接至所述蛋白的每個L-大分子是不同的。
在一些實施方式中，z是1至5的整數；L為非可釋放接頭；從化學式（XIX）所示的綴合物與適合的大分子的點擊化學反應產生綴合物。
在（XX-I）的綴合物的一些實施方式中，y是1至15的整數。在一些實施方式中，y為1至10的整數。在一些實施方式中，y為1至8的整數。在一些實施方式中，y為1至5的整數。
在（XX-I）的綴合物的一些實施方式中，FG 2為疊氮化物。在一些實施方式中，FG 2是炔基。在一些實施方式中，FG 2是環炔基。在一些實施方式中，環炔基為二苯并環辛炔（DBCO）。
蛋白-大分子綴合物包括根據化學式（XXIV）的結構： (大分子 2-L 2) z2-蛋白-(L 1) z1（XXIV） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： z1為1至20的整數； z2為1至5的整數； 每個L 1獨立地為可釋放接頭或非可釋放接頭且無能夠通過點擊化學反應的官能團； 每個L 2獨立地為可釋放接頭或非可釋放接頭； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 每個大分子 2獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
蛋白-大分子綴合物包括根據化學式（XXV）的結構： (FG 2-L 2) z2-蛋白-(L 1-大分子 1) z1（XXV） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： z1為1至20的整數； z2為1至5的整數； 每個L 1獨立地為可釋放接頭或非可釋放接頭； 每個L 2獨立地為可釋放接頭或非可釋放接頭； 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 每個大分子 1獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
蛋白-大分子綴合物包括根據化學式（XXVI）的結構： (大分子 2-L 2) z2-蛋白-(L 1-大分子 1) z1（XXVI） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： z1為1至20的整數； z2為1至5的整數； 每個L 1獨立地為可釋放接頭； 每個L 2獨立地為非可釋放接頭； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽； 每個大分子 1獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽；且 每個大分子 2獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
在化學式（XXVI）的一些實施方式中，從化學式（XXV）的綴合物與適合的大分子的點擊化學反應產生綴合物。
在化學式（XXIV）、（XXV）或者（XXVI）的一些實施方式中，每個L 1為可釋放接頭且每個L 2為非可釋放接頭。在一些實施方式中，每個L 1為可釋放接頭且每個L 2為可釋放接頭。在一些實施方式中，每個L 1為非可釋放接頭且每個L 2為可釋放接頭。
在一些實施方式中，將化學式（XXIV）、化學式（XXV）和化學式（XXVI）所示的蛋白-大分子綴合物水解以產生蛋白-大分子綴合物，其包含根據化學式（XXVII）的結構： (大分子 2-L 2) z2-蛋白 （XXVII） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： z2為1至5的整數； 每個L 2獨立地為非可釋放接頭； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；和 每個大分子 2獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
在化學式（XXIV）、（XXV）、（XXVI）和（XXVII）的一些實施方式中，接頭L 1和L 2是本發明公開所述的接頭。在一些實施方式中，所述一個或多個可釋放接頭衍生自本發明公開的官能性可釋放接頭（例如，化學式（I）、化學式（II）、化學式（III）、化學式（IV）、化學式（XVIII）、化學式（XXI）或者化學式（XXII）所示的接頭）和/或具有可釋放接頭的聚合試劑（例如，化學式（V）或化學式（VI））。
在一些實施方式中，z1為1至20的整數。在一些實施方式中，z1為1至15的整數。在一些實施方式中，z1為1至10的整數。在一些實施方式中，z1為1至8的整數。在一些實施方式中，z1為1至5的整數。
在一些實施方式中，z2為1至5的整數。在一些實施方式中，z2為1至4的整數。在一些實施方式中，z2為1至3的整數。在一些實施方式中，z2為1至2的整數。在一些實施方式中，z2為1。在一些實施方式中，z1為2。在一些實施方式中，z1為3。
在一些實施方式中，連接至蛋白的大分子 1和大分子 2是相同的。在一些實施方式中，連接至蛋白的大分子 1和大分子 2是不同的。
在一些實施方式中，本發明公開涉及包含根據本發明公開所述的綴合物中的任一個的組合物。在一些實施方式中，組合物包含本發明公開所述的綴合物的混合物。在一些實施方式中，組合物包含本發明公開所述的綴合物中的多個。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z的平均值為1至約20、1至約15、1至約10、1至約8、1至約7、1至約6、1至約5、1至約4、1至約3或者1至約2。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z1的平均值為1至約15、1至約10、1至約8、1至約6、1至約4、1至約3或者1至約2。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z2的平均值為1至約4、1至約3或者1至約2。在一些實施方式中，所述組合物還包括藥物可用的賦形劑或載體。
在一些實施方式中，本發明公開涉及包含本發明公開所述的至少一種綴合物的組合物。在一些實施方式中，所述組合物包含本發明公開所述的綴合物的混合物。在一些實施方式中，所述綴合物的混合物包含具有不同的z和/或y的多個綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；其中z是6的綴合物；其中z是7的綴合物；其中z是8的綴合物；其中z是9的綴合物；和/或其中z是10的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；其中z是6的綴合物；其中z是7的綴合物；和/或其中z是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；和/或其中z是6的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；其中z是6的綴合物；其中z是7的綴合物；和/或其中z是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；和/或其中z是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；和/或其中z是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物和/或其中z是2的綴合物。
在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；其中y是6的綴合物；其中y是7的綴合物；其中y是8的綴合物；其中y是9的綴合物；和/或其中y是10的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；其中y是6的綴合物；其中y是7的綴合物；和/或其中y是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；和/或其中y是6的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；其中y是6的綴合物；其中y是7的綴合物；和/或其中y是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；和/或其中y是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；和/或其中y是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物和/或其中y是2的綴合物。
在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；其中z1是6的綴合物；其中z1是7的綴合物；其中z1是8的綴合物；其中z1是9的綴合物；和/或其中z1是10的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；其中z1是6的綴合物；其中z1是7的綴合物；和/或其中z1是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；和/或其中z1是6的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；其中z1是6的綴合物；其中z1是7的綴合物；和/或其中z1是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；和/或其中z1是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；和/或其中z1是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；和/或其中z1是2的綴合物。
在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z2是1的綴合物；其中z2是2的綴合物；其中z2是3的綴合物；其中z2是4的綴合物；和/或其中z2是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z2是1的綴合物；其中z2是2的綴合物；和/或其中z2是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z2是1的綴合物和/或其中z2是2的綴合物。
以下結構涵蓋了式XX所示的示例性蛋白-大分子綴合物：
Figure 02_image111
其中： 每個n獨立地為2至4000的整數； 每個X獨立地為間臂部分； 每個RL獨立地為可釋放接頭； z是1至25的整數； 每個連接至蛋白的-NH-（如以上化學式中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，RL是本發明公開所述的可釋放接頭。在一些實施方式中，所述可釋放接頭衍生自本文所公開的官能性可釋放接頭（例如，化學式（I）、化學式（II）、化學式（III）或化學式（IV）的接頭）或者具有可釋放接頭的聚合試劑（例如，化學式（V）或化學式（VI））。
在另一個方面，以下結構涵蓋了化學式XX所示的示例性蛋白-大分子綴合物：
Figure 02_image113
其中： 每個n獨立地為2至4000的整數； 每個X獨立地為間臂部分； 每個RL 1獨立地為第一可釋放接頭； 每個RL 2獨立地為第二可釋放接頭； z是1至25的整數； 每個連接至蛋白的-NH-（如以上化學式中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
其中所述水溶性聚合物處於支鏈形式的本發明公開的示例性綴合物包括其中以下結構涵蓋了所述水溶性聚合物的那些：
Figure 02_image115
其中Y=O和NH；每個（n）獨立地為具有下列值的整數：2至4000，例如，2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000，包括它們之間的所有值和範圍。
其中所述水溶性聚合物處於支鏈形式的本發明公開的示例性綴合物包括其中以下結構涵蓋了所述水溶性聚合物的那些：
Figure 02_image117
其中每個（n）獨立地為具有下列值的整數：2至4000，例如，2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500或4000，包括它們之間的所有值和範圍。
使用兩個提供可釋放鍵的聚合試劑所形成的示例性蛋白-大分子綴合物包括以下化學式（XI）所示的那些：
Figure 02_image119
（XI） 其中： 每個POLY 1獨立地為第一水溶性聚合物； 每個POLY 2獨立地為第二水溶性聚合物； 每個X 1獨立地為第一間臂部分； 每個X 2獨立地為第二間臂部分； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個Y 4獨立地為O或S； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 3獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 4獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個a1獨立地為0至3的整數； 每個a2獨立地為0至3的整數； 每個c獨立地為0至4的整數； z為1至25的整數； 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團； 每個R d獨立地為硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XI）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R 1、R 2、R 3、R 4、R e1、R e2和R d如以上化學式（IV）中所定義。
在化學式（XI）的一些實施方式中，POLY 1和POLY 2分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是不同的水溶性聚合物。
在化學式（XI）的一些實施方式中，X 1和X 2分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是不同的間臂部分。
示例性綴合物具有以下結構（XI-A）：
Figure 02_image121
（XI-A） 其中n分別獨立地為4至1500的整數且z是1至25的整數。
使用兩個提供可釋放鍵的聚合試劑所形成的其它示例性綴合物包括以下化學式（XII）所示的那些：
Figure 02_image123
（XII） 其中： 每個POLY 1獨立地為第一水溶性聚合物； 每個POLY 2獨立地為第二水溶性聚合物； 每個X 1獨立地為第一間臂部分； 每個X 2獨立地為第二間臂部分； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個a1獨立地為0-3的整數； 每個a2獨立地為0-3的整數； z為1至25的整數； 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團； 每個R p獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基；且 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XII）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R 1、R 2、R e1、R e2和R p如以上化學式（VI）中所定義。
在化學式（XII）的一些實施方式中，POLY 1和POLY 2分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是不同的水溶性聚合物。
在化學式（XII）的一些實施方式中，X 1和X 2分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是不同的間臂部分。
示例性綴合物具有以下結構（XII-A）：
Figure 02_image125
（XII-A） 其中n分別獨立地為4至1500的整數且z是1至25的整數。
使用點擊化學，使用適合的聚合試劑所形成的示例性綴合物包括以下化學式（XIII）所示的那些：
Figure 02_image127
（XIII） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： 每個POLY 1獨立地為第一直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個POLY 2獨立地為第二直鏈或支鏈水溶性聚合物； 當相鄰的c是1或2時，每個X 1獨立地為第一間臂部分； 當相鄰的c為0時，每個X 1獨立地為氫或-X-FG 2； 當存在時，每個X 2獨立地為第二間臂部分； 每個T 1獨立地為第一三唑官能團； 每個T 2獨立地為第二三唑官能團； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基；或者-X-FG 2； 每個X獨立地為間臂部分；且 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團。 每個a獨立地為0至5的整數； 每個b獨立地為0至3的整數； 每個c獨立地為0至2的整數； z為1至25的整數； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S；且 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XIII）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，所述綴合物包含化學式（XIII-I）所示的結構：
Figure 02_image129
（XIII-I） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： 每個POLY 1獨立地為第一直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個POLY 2獨立地為第二直鏈或支鏈水溶性聚合物； 當相鄰的c是1或2時，每個X 1獨立地為第一間臂部分； 當相鄰的c為0時，每個X 1獨立地為氫或-X-FG 2； 當存在時，每個X 2獨立地為第二間臂部分； 每個T 1獨立地為第一三唑官能團； 每個T 2獨立地為第二三唑官能團； R 1分別獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R 2分別獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； R e分別獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基；或者-X-FG 2； 其中： 每個X獨立地為間臂部分；且 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團。 a分別獨立地為0至5的整數； b分別獨立地為0至3的整數； c分別獨立地為0至2的整數； z為1至25的整數； 每個y獨立地為0至24的整數； Y 1分別獨立地為O或S； Y 2分別獨立地為O或S； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XIII-I）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R 1、R 2、R e、a、b、c和z如以上化學式（I）所定義。
在化學式（XIII）或（XIII-I）的一些實施方式中，POLY 1和POLY 2分別獨立地選自本文所述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是不同的水溶性聚合物。
在化學式（XIII）或（XIII-I）的一些實施方式中，X 1和X 2分別獨立地選自本文所述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是不同的間臂部分。
在化學式（XIII）內，將具有更限定的結構的綴合物考慮為化學式（XIII-A）、（XIII-B）、（XIII-C）或（XIII-D）：
Figure 02_image131
（XIII-A）；
Figure 02_image133
（XIII-B）；
Figure 02_image135
（XIII-C）；或
Figure 02_image137
（XIII-D） 其中每個X 1是第一間臂部分；X 2是第二間臂部分；POLY 1、POLY 2、T 1、T 2、R 1、R 2、R e、a、z、Y 1、Y 2和蛋白如先前所定義。
在化學式（XIII-I）所示的綴合物的一些實施方式中，所述綴合物具有化學式（XIII-A-I）所示的結構：
Figure 02_image139
。 （XIII-A-I）
在化學式（XIII）、（XIII-I）、（XIII-A）、（XIII-B）、（XIII-C）、（XIII-D）或（XIII-A-I）的某些實施方式中，每個a獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；並且每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
其它示例性綴合物具有以下結構（XIII-A1）：
Figure 02_image141
（XIII-A1）
其中，R e為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基；n獨立地為4至1500的整數；z為1至25的整數；且每個連接至蛋白的“-NH-”（如化學式（XIII-A1）中所示）為蛋白內殘基的胺基且表示單獨連接至蛋白的一個或多個聚合物。
在一些實施方式中，所述綴合物具有化學式（XIII-A1-I）所示的結構：
Figure 02_image143
（XIII-A1-I） 其中： 每個a獨立地為1至2的整數； 每個R e獨立地為4-F、4-Cl、4-CF 3、2,4-二氟或2-CF 3-4-F取代； 每個n獨立地為4至1500的整數； y為0至24的整數； z為1至25的整數；且 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XIII-A1-I）中所示）為蛋白內殘基的胺基。
在化學式（XIII-A1）或者（XIII-A1-I）的某些實施方式中，每個a獨立地為1至2的整數；每個R e獨立地為4-F、4-Cl、4-CF 3、2,4-二氟或2-CF 3-4-F取代。在某些實施方式中，每個a為1；每個R e獨立地為4-Cl或2-CF 3-4-F；每個n獨立地為4至1500的整數；z是1至10的整數；y為0至10的整數；蛋白為IL-2；且-NH-是IL-2內殘基的胺基。在某些實施方式中，z為1。在某些實施方式中，z為3。在某些實施方式中，z為6。
在化學式（XIII-I）所示的綴合物的一些實施方式中，所述綴合物具有化學式（XIII-B-I）所示的結構：
Figure 02_image145
。 （XIII-B-I） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物。
在化學式（XIII-I）或者（XIII-B-I）所示的綴合物的一些實施方式中，每個a獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；並且每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
在化學式（XIII-I）所示的綴合物的一些實施方式中，所述綴合物具有化學式（XIII-C-I）所示的結構：
Figure 02_image147
。 （XIII-C-I） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物。
在化學式（XIII-I）或（XIII-C-I）所示的綴合物的一些實施方式中，每個a獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；並且每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
在化學式（XIII-I）所示的綴合物的一些實施方式中，所述綴合物具有化學式（XIII-D-I）所示的結構：
Figure 02_image149
。 （XIII-D-I） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物。
在化學式（XIII-I）或（XIII-D-I）所示的綴合物的一些實施方式中，每個a獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；並且每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
其它示例性綴合物具有以下作為（XIII-B1）、（XIII-C1）、（XIII-D1）或（XIII-D2）的結構：
Figure 02_image151
（XIII-B1）；
Figure 02_image153
（XIII-C1）；
Figure 02_image155
（XIII-D1）；或
Figure 02_image157
（XIII-D2） 其中： n獨立地為4至1500的整數； z為1至25的整數；且 -NH-是蛋白內殘基的胺基；和 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，所述綴合物具有化學式（XIII-B1-I）、（XIII-C1-I）、（XIII-D1-I）或者（XIII-D2-I）所示的結構：
Figure 02_image159
（XIII-B1-I）；
Figure 02_image161
（XIII-C1-I）；
Figure 02_image163
（XIII-D1-I）；或
Figure 02_image165
（XIII-D2-I） 其中： 每個n獨立地為4至1500的整數； y為0至24的整數； z為1至25的整數； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XIII-B1-I）、（XIII-C1-I）、（XIII-D1-I）或者（XIII-D2-I）中所示）是蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在化學式（XIII-B-I）或者（XIII-B1-I）的某些實施方式中，z為1至10的整數；y為0至10的整數；且蛋白為IL-2。在一些實施方式中，z為6。在一些實施方式中，z為3。在一些實施方式中，z為1。
在化學式（XIII-B1）或者（XIII-B1-I）的某些實施方式中，n獨立地為4至1500的整數；z是1至10的整數；蛋白為IL-2；且-NH-是IL-2內殘基的胺基。在某些實施方式中，z為1。在某些實施方式中，z為3。在某些實施方式中，z為6。
在化學式（XIII-C）、（XIII-C-I）、（XIII-D）或（XIII-D-I）的某些實施方式中，a為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；並且R e是硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
在化學式（XIII-I）、（XIII-A-I）、（XIII-B-I）、（XIII-C-I）、（XIII-D-I）、（XIII-A1-I）、（XIII-B1-I）、（XIII-C1-I）、（XIII-D1-I）或（XIII-D2-I）的一些實施方式中，y為1至15的整數。在一些實施方式中，y為1至10的整數。在一些實施方式中，y為1至8的整數。在一些實施方式中，y為1至5的整數。
在另一個方面，化學式（XX）所示的示例性蛋白-大分子綴合物包含根據化學式（XXXI）的結構：
Figure 02_image167
（XXXI） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物 其中： 每個X 1獨立地為間臂部分或氫； 每個X 2獨立地為間臂部分； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基； 每個T 2獨立地為三唑官能團； 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個a獨立地為0至4的整數； z1為1至20的整數； z2為1至5的整數； Y 1、Y 2和Y 3分別獨立地為O或S； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXXI）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在化學式（XXXI）的一些實施方式中，POLY 2選自本文所描述的水溶性聚合物。
在化學式（XXXI）的一些實施方式中，X 1和X 2分別獨立地選自本文所描述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1和X 2是不同的間臂部分。
在某些實施方式中，每個a獨立地為0至2的整數；Y 1、Y 2和Y 3為O；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；並且每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
在化學式（XXXI）內，具有更限定的結構的綴合物具有以下結構：
Figure 02_image169
其中：每個n獨立地為4至1500的整數；z1為1至20的整數；z2為1至5的整數；且每個-NH-是所述蛋白內殘基的胺基。在某些實施方式中，z1是1至10的整數；z2為1至3的整數；蛋白為IL-2；且連接至蛋白的-NH-（如以上化學式中所示）為IL-2內殘基的胺基。在某些實施方式中，z1為3至4的整數；且z2為1。
在另一個方面，化學式（XX）所示的示例性蛋白-大分子綴合物包含根據化學式（XXXII）的結構：
Figure 02_image171
（XXXII） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中： 每個X 2獨立地為間臂部分； 每個T 2獨立地為三唑官能團； 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； z2為1至5的整數； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXXII）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，所述綴合物具有化學式（XXXII-I）所示的結構：
Figure 02_image173
（XXXII-I） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： 每個X 2獨立地為間臂部分； 每個T 2獨立地為三唑官能團； 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； y為1至5的整數； z2為1至5的整數； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXXII-I）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在化學式（XXXII）或（XXXII-I）的一些實施方式中，POLY 2選自本文所描述的水溶性聚合物。在化學式（XXXII）或（XXXII-I）的一些實施方式中，X 2選自本文所描述的間臂部分。在某些實施方式中，Y 3為O。
在化學式（XXXII）內，具有更限定的結構的綴合物具有以下結構：
Figure 02_image175
其中：每個n獨立地為4至1500的整數；z2為1至3的整數；且每個連接至蛋白的-NH-（如以上化學式中所示）為蛋白內殘基的胺基。在某些實施方式中，z2為1；蛋白為IL-2；且-NH-是IL-2內殘基的胺基。
在化學式（XXXII-I）所示的綴合物的一些實施方式中，所述綴合物具有以下結構：
Figure 02_image177
其中： 每個n獨立地為4至1500的整數； y為1至3的整數； z2為1至3的整數；且 每個連接至蛋白的-NH-（如以上化學式中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，z2為1；蛋白為IL-2；且-NH-是IL-2內殘基的胺基。
在另一個方面，化學式（XX）所示的示例性蛋白-大分子綴合物包含根據化學式（XXXIII）的結構：
Figure 02_image179
（XXXIII） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： 每個X 1是間臂部分； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或者取代的雜芳基； 每個a獨立地為0至4的整數； z為1至25的整數； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個T 1獨立地為三唑官能團； 每個POLY 1獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXXIII）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在化學式（XXXIII）的一些實施方式中，POLY 1選自本文所描述的水溶性-聚合物。在化學式（XXXIII）的一些實施方式中，X 1選自本文所描述的間臂部分。在某些實施方式中，a為0；z為1至10的整數；R 1是氫；R 2是氫；Y 1為O；且Y 2為O。
在另一個方面，化學式（XX）所示的示例性蛋白-大分子綴合物包含根據化學式（XXXIV）的結構：
Figure 02_image181
（XXXIV） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： 每個POLY 1獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個POLY 3獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； z1為1至20的整數； z2為1至5的整數； 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基； 每個X 1獨立地為間臂部分； 每個X 2獨立地為間臂部分； 每個X 3獨立地為間臂部分； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXXIV）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在化學式（XXXIV）的一些實施方式中，POLY 1、POLY 2和POLY 3分別獨立地選自本文所描述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1、POLY 2和POLY 3是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1、POLY 2和POLY 3是不同的水溶性聚合物。
在化學式（XXXIV）的一些實施方式中，X 1、X 2和X 3分別獨立地選自本文所描述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1、X 2和X 3是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1、X 2和X 3是不同的間臂部分。
在某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3；且Y 1、Y 2和Y 3分別為O。
在化學式（XXXIV）內，具有更限定的結構的綴合物具有以下結構：
Figure 02_image183
其中：每個n獨立地為4至1500的整數；z1是1至10的整數；z2是1至3的整數；且每個連接至蛋白的-NH-（如以上化學式中所示）為蛋白內殘基的胺基。在某些實施方式中，z1是4；z2是1；蛋白是IL-2；且-NH-是IL-2內殘基的胺基。
在另一個方面，從化學式（XXXIV）所示的綴合物水解的蛋白-大分子綴合物並且其包含根據化學式（XXXV）的結構：
Figure 02_image185
（XXXV） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： 每個POLY 3獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； z2是1至5的整數； 每個X 3獨立地為間臂部分； 每個Y 3獨立地為O或S；且 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXXV）中所示）為蛋白內殘基的胺基。
在化學式（XXXV）的一些實施方式中，POLY 3選自本文所描述的水溶性聚合物。
在化學式（XXXV）的一些實施方式中，X 3選自本文所描述的間臂部分。
在某些實施方式中，Y 3為O；且z2是1至3的整數。
在化學式（XXXV）內，具有更限定的結構的綴合物具有以下結構：
Figure 02_image187
其中：每個n獨立地為4至1500的整數；z2是1；蛋白是IL-2；且每個連接至蛋白的-NH-（如以上化學式中所示）為IL-2內殘基的胺基。
在另一個方面，化學式（XX）所示的示例性蛋白-大分子綴合物包含根據化學式（XXXVI）的結構：
Figure 02_image189
（XXXVI） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： 每個POLY 1獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； z1是1至20的整數； z2是1至5的整數； 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基； 每個X 1獨立地為間臂部分； 每個X 2獨立地為間臂部分； 每個X 3獨立地為間臂部分； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXXVI）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在化學式（XXXVI）的一些實施方式中，POLY 1和POLY 2分別獨立地選自本文所描述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1和POLY 2是不同的水溶性聚合物。
在化學式（XXXVI）的一些實施方式中，X 1、X 2和X 3分別獨立地選自本文所描述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1、X 2和X 3是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1、X 2和X 3是不同的間臂部分。
在某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3；且Y 1、Y 2和Y 3是O。
在化學式（XXXVI）內，具有更限定的結構的綴合物具有以下結構：
Figure 02_image191
其中：每個n獨立地為4至1500的整數；z1是1至10的整數；z2是1至3的整數；且每個連接至蛋白的-NH-（如以上化學式中所示）為蛋白內殘基的胺基。在某些實施方式中，z1是1至4的整數；z2是1；蛋白是IL-2；且-NH-是IL-2內殘基的胺基。
在另一個方面，化學式（XX）所示的示例性蛋白-大分子綴合物包含根據化學式（XXXVII）的結構：
Figure 02_image193
（XXXVII） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物； 其中： 每個POLY 1獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個POLY 3獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； z1是1至20的整數； z2是1至5的整數； 當存在時，R el獨立地為第一電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基； 每個X 1獨立地為間臂部分； 每個X 2獨立地為間臂部分； 每個X 3獨立地為間臂部分； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個T獨立地為三唑官能團； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XXXVII）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在化學式（XXXVII）的一些實施方式中，POLY 1、POLY 2和POLY 3分別獨立地選自本文所描述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1、POLY 2和POLY 3是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 1、POLY 2和POLY 3是不同的水溶性聚合物。
在化學式（XXXVII）的一些實施方式中，X 1、X 2和X 3分別獨立地選自本文所描述的間臂部分。在一些實施方式中，X 1、X 2和X 3是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 1、X 2和X 3是不同的間臂部分。
在某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3；且Y 1、Y 2和Y 3分別為O。
在化學式（XXXVII）內，具有更限定的結構的綴合物具有以下結構：
Figure 02_image195
其中：每個n獨立地為4至1500的整數；z1是1至10的整數；z2是1至3的整數；且每個連接至蛋白的-NH-（如以上化學式中所示）為蛋白內殘基的胺基。在某些實施方式中，z1是1至4的整數；z2是1；蛋白是IL-2；且-NH-是IL-2內殘基的胺基。
使用點擊化學，使用適合的聚合試劑所形成的其它示例性綴合物包括以下化學式（XIV）所示的那些：
Figure 02_image197
（XIV） 其中： 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個POLY 3獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； z為1至25的整數； 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團；或-X-FG 2； 每個X獨立地為間臂部分；且 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團； 每個X 2獨立地為間臂部分； 當存在時，每個X 3獨立地為間臂部分； 每個T 2獨立地為三唑官能團； 每個T 3獨立地為三唑官能團； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XIV）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R 1、R 2、R e1和R e2如以上化學式（VI）中所定義。
在化學式（XIV）的一些實施方式中，POLY 2和POLY 3分別獨立地選自本文所描述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 2和POLY 3是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 2和POLY 3是不同的水溶性聚合物。
在化學式（XIV）的一些實施方式中，X 2和X 3分別獨立地選自本文所描述的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是不同的間臂部分。
在化學式（XIV）的某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；且R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
在化學式（XIV）內，將具有更限定的結構的綴合物考慮為化學式（XIV-A）：
Figure 02_image199
（XIV-A） 其中n獨立地為4至1500的整數；z為1至25的整數；且-NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
使用點擊化學，使用適合的聚合試劑所形成的其它示例性綴合物包括以下化學式（XV）所示的那些：
Figure 02_image201
（XV） 其中： 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個POLY 3獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； z為1至25的整數； 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團；或-X-FG 2； 每個X獨立地為間臂部分；且 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團。 每個R p獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個X 2獨立地為間臂部分； 當存在時，每個X 3獨立地為間臂部分； 每個T 2獨立地為三唑官能團； 每個T 3獨立地為三唑官能團； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XV）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R 1、R 2、R p、R e1和R e2如以上化學式（VI）中所定義。
在化學式（XV）的一些實施方式中，POLY 2和POLY 3分別獨立地選自本文所描述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 2和POLY 3是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 2和POLY 3是不同的水溶性聚合物。
在化學式（XV）的一些實施方式中，X 2和X 3分別獨立地選自本文所描述的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是不同的間臂部分。
在化學式（XV）的某些實施方式中，a1和a2分別獨立地為0至2的整數；R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et；且R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
在化學式（XV）內，具有更限定的結構的綴合物如以下化學式（XV-A）所示：
Figure 02_image203
（XV-A） 其中n獨立地為4至1500的整數；z是1至25的整數，且-NH-是所述蛋白內殘基的胺基。
使用點擊化學，使用適合的聚合試劑所形成的其它示例性綴合物包括以下化學式（XVI）所示的那些：
Figure 02_image205
（XVI） 其中： 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個POLY 3獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物； 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 3獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； 每個R 4獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基； a1和a2分別獨立地為0至4的整數； b1是1； b2是0至1的整數； 每個c獨立地為0至4的整數； z為1至25的整數； 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團； 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團；或-X-FG 2； 每個X獨立地為間臂部分；且 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其獨立地包括（但不限於）疊氮化物、炔基和環炔基（例如，二苯并環辛炔（DBCO））基團。
每個R d獨立地為硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基或環烷基、取代的烷基或環烷基、芳基或雜芳基、取代的芳基或雜芳基； 每個X 2獨立地為間臂部分； 當存在時，每個X 3獨立地為間臂部分； 每個T 2獨立地為三唑官能團； 每個T 3獨立地為三唑官能團； 每個Y 1獨立地為O或S； 每個Y 2獨立地為O或S； 每個Y 3獨立地為O或S； 每個Y 4獨立地為O或S； 每個連接至蛋白的-NH-（如化學式（XVI）中所示）為蛋白內殘基的胺基；且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
在一些實施方式中，R 1、R 2、R 3、R 4、R d、R e1和R e2如以上化學式（IV）中所定義。
在化學式（XVI）的一些實施方式中，POLY 2和POLY 3分別獨立地選自本文所描述的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 2和POLY 3是相同的水溶性聚合物。在一些實施方式中，POLY 2和POLY 3是不同的水溶性聚合物。
在化學式（XVI）的一些實施方式中，X 2和X 3分別獨立地選自本文所描述的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是相同的間臂部分。在一些實施方式中，X 2和X 3是不同的間臂部分。
在本發明公開所述的綴合物的一些實施方式中，所述環炔基是二苯并環辛炔（DBCO）。
在本發明公開所述的綴合物的一些實施方式中，所述直鏈或支鏈水溶性聚合物是聚(乙二醇)的聚合物。
在如本文所描述的綴合物中的任一個的一些實施方式中，所述間臂部分為-O-、-NH-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-OP(O)(OH)-、-OP(S)(OH)-、-C(S)-、-[CH 2] 1-6-、-O-CH 2-、-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-C(O)-O-CH 2-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-NH-CH 2-、-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-CH 2-、-C(O)-CH 2-、-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-[CH 2] 0-6-O-(CH 2CH 2O) 1-20-[CH 2] 0-6-或-O-C(O)-NH-[CH 2] 0-6-(OCH 2CH 2) 0-20-。在一些實施方式中，所述間臂部分為-[CH 2] 4-6-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-CH 2-或-CH 2-O-(CH 2CH 2O) 4-6-[CH 2] 2-。在一些實施方式中，所述間臂部分為-[CH 2] 5-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-CH 2-或-CH 2-O-(CH 2CH 2O) 5-[CH 2] 2-。在一些實施方式中，所述間臂部分為
Figure 02_image001
或
Figure 02_image003
。
在本發明公開所述的綴合物的一些實施方式中，所述一種或多種蛋白為細胞因子。所述細胞因子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α或TNF-β。在一些實施方式中，細胞因子為M-CSF、G-CSF、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37、IL-38、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β或CXL10。在某些實施方式中，所述細胞因子是IL-2。在某些實施方式中，所述IL-2包含與SEQ ID NO:1約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
在本發明公開所述的綴合物的一些實施方式中，所述一種或多種蛋白為趨化因子。所述趨化因子包括MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309（CCL1）、BCA1（CXCL13）、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸細胞活化趨化因子-1、嗜酸細胞活化趨化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC（CCL20）、ELC（CCL19）、SLC（CCL21）、ENA-78、PBP、TECK（CCL25）、CTACK（CCL27）、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
在本發明公開所述的綴合物的一些實施方式中，所述一種或多種蛋白是抗體。所述抗體可以靶向以下中的一種或多種：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受體樣激酶1、澱粉狀蛋白A蛋白、β-澱粉狀蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125（模擬）、C5、CA-125、CCL11（嗜酸細胞活化趨化因子-1）、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C242抗原、CD276、CD278、CD319、艱難梭菌（ clostridium difficile）、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、達比加群（Dabigatran）、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、內皮糖蛋白（Endoglin）、上皮唾蛋白（episialin）、EPHA3、c-Met、FGFR2、纖維蛋白IIβ鏈、FGF 23、葉酸受體1、GMCSF、GD2神經節糖苷、GDF-8、GCGR、明膠酶B、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受體α-鏈、激肽釋放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受體、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6 R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干擾素α/β受體、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、B型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-選擇素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、間皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、連接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂醯絲胺酸、RANKL、RTN4、獼猴因子、ROR1、SLAMF7、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）α毒素、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）雙組分殺白細胞素、SOST、選擇素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受體、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或者VEGFR2。
在本發明公開所述的綴合物的一些實施方式中，所述一種或多種蛋白是治療肽。肽包括（但不限於）：高血糖素樣肽1（GLP-1）、艾塞那肽-2、艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、心房利鈉因子（ANF）、胃饑餓素、加壓素、生長激素、生長激素-釋放激素（GHRH）、RC-3095、生長抑素、鈴蟾肽、PCK-3145、Phe-His-Ser-Cys-Asn（PHSCN）、IGFl、B-型利尿鈉肽、肽YY（PYY）、干擾素、血小板反應蛋白、血管生成素、降鈣素、促性腺激素釋放激素、水蛭素、高血糖素、抗-TNF-α、成纖維細胞生長因子、粒細胞集落刺激因子、奧尼匹肽、垂體甲狀腺激素（PTH）、亮脯利特、舍莫瑞林、pramoR elin、奈西立肽、羅替加肽、西侖吉肽、MBP-8298、AL-108、恩夫韋地、胸腺法新、daptamycin、HLFI-II、乳鐵傳遞蛋白、地米肽、谷胱甘肽、T細胞表位PR 1、蛋白酶-3肽1-11、B細胞表位P3、促黃體激素-釋放激素（LHRH）、P物質、神經激肽A、神經激肽B、CCK-8、腦啡肽，包括白胺酸腦啡肽和甲硫胺酸 腦啡肽、皮抑菌肽、[des-Ala20, Gln34]-皮抑菌肽、表面活性劑-相關抗微生物陰離子肽、蜜蜂抗菌肽IA；蜜蜂抗菌肽IB；OV-2；1025，乙醯基-粘附素肽（1025-1044）醯胺；Theroma-cin（49-63）；培西加南（MSI-78）；吲哚青黴素；愛帕琳肽-15（63-77）；CFPlO（71-85）；炭疽相關的致死因子（LF）抑制劑；牛抗菌肽；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑2；丙型肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑3；肝炎病毒NS3蛋白酶抑制劑4；NS4A-NS4B丙型肝炎病毒（NS3蛋白酶抑制劑I）；HIV-1、HIV-2蛋白酶底物；抗-FM肽；Bak-BH3；Bax BH3肽（55-74）（野生型）；Bid BH3-r8；CTT（明膠酶抑制劑）；E75（Her-2/neu）（369-377）；GRP78結合嵌合肽基序；p53（17-26）；EGFR 2/KDR拮抗劑；Colivelin AGA-(C8R) HNGl 7（人體肽衍生物）；活性-依賴性神經營養性因子（ADNF）；β-分泌酶抑制劑1；β-分泌酶抑制劑2；ch[β]-澱粉狀蛋白（30-16）；Humanun（HN）sHNG、[Glyl4]-HN、[Glyl 4]-人體肽；血管緊張素轉化酶抑制劑（BPP）；腎素抑制劑III；膜聯蛋白I（ANXA-I；Ac2-12）；抗炎肽I；抗炎肽2；抗炎愛帕琳肽12；[D-Phel2, Leul4]-鈴蟾肽；黑腹果蠅觸足肽（酸）（穿透肽）；黑腹果蠅觸足前導肽（CT）；肥碩脫粒肽；硫酸酯化的[Thr28, Nle31]-縮膽囊肽（25-33）；痛敏肽（1-13）（醯胺）；纖維蛋白溶解抑制因子；Γ-纖維蛋白原（377-395）；類爪蟾肽；肥胖抑制素（人）；[Hisl, Lys6]-GHRP（GHRP-6）；[Ala5,[β]-Ala8]-神經激肽A（4-10）；神經調節肽B；神經調節肽C；神經調節肽N；活性-依賴性神經營養性因子（ADNF-14）；Acetalin I（阿片樣物質受體拮抗劑1）；Acetalin 2（阿片樣物質受體拮抗劑2）；Acetalin 3（阿片樣物質受體拮抗劑3）；ACTH（1-39）（人）；ACTH（7-38）（人）；蛙皮降壓肽；脂動激素（東亞飛蝗（ Locusta Migratoria））；十八烷基化的ADP-核糖基化因子6、myr-ARF6（2-13）；PAMP（1-20）（腎上腺髓質素前體（1-20）人）；AGRP（25-51）；胰澱素（8-37）（人）；血管緊張素I（人）；血管緊張素II（人）；Apstatin（氨肽酶P抑制劑）；沼水蛙抗菌肽-I；蛙皮素I；RL-37；LL-37（抗微生物肽）（人）；天蠶抗菌肽A；抗氧化肽A；抗氧化肽B；L-肌肽；BcI 9-2；NPVF；神經肽AF（hNPAF）（人）；Bax BH3肽（55-74）；bFGF抑制肽；bFGF抑制肽II；血管舒緩激肽；[Des-Argl OJ-HOE 140；半胱天冬氨酸酶I抑制劑II；半胱天冬氨酸酶I抑制劑VIII；Smac N7蛋白（MEKl衍生肽抑制劑I；hBD-1（[β]-防禦素-1）（人）；hBD-3（[β]-防禦素-3）（人）；hBD-4（[β]-防禦素-4）（人）；HNP-I（防禦素人嗜中性白細胞肽I）；HNP-2（防禦素人嗜中性白細胞肽-2強啡肽A（1-17））；內嗎啡肽-I；[β]-內啡肽（人、豬）；內皮素2（人）；纖維蛋白原結合抑制肽；環(-GRGDSP)；TP508（凝血酶-衍生肽）；甘丙肽（人）；GIP（人）；促胃液素釋放肽（人）；促胃液素-1（人）；胃饑餓素（人）；PDGF-BB肽；[D-Lys3]-GHRP-6；HCV核心蛋白（1-20）；a3Bl整合素肽片段（325）（醯胺）；層粘連蛋白五肽（醯胺）Mel-anotropin-強化因子（MPF）；VA-[β]-MSH、促脂素-Y（阿黑皮素原-衍生的）；心房鈉尿肽（1-28）（人）；血管鈉肽（1-27）；[Ala5, B-Ala8]-神經激肽A（4-10）；神經調節肽L（NKA）；Ac-(Leu28, 31)-神經肽Y（24-26）；阿利特辛；腦神經肽II；[D-tyrll]-神經降壓素；IKKy NEMO結合域（NBD）抑制肽；PTD-p50（NLS）抑制肽；食欲肽A（牛、人、小鼠、大鼠）；食欲肽B（人）；水通道蛋白-2（254-267）（人胰抑素）（37-52）；胰多肽（人）；神經肽；肽YY（3-36）（人）；羥甲基-植物螯合肽2；PACAP（1-27）（醯胺，人、牛、大鼠）；促乳激素釋放肽（1-31）（人）；salusin-α；salusin-β；鞘脂活化蛋白C22；胰泌素（人）；L-選擇素；Endokinin A/B；Endokinin C（人）；Endokinin D（人）；凝血酶受體（42-48）促效劑（人）；LSKL（血小板反應蛋白的抑制劑）；促甲狀腺素釋放激素（TRH）；P55-TNFR片段；尿緊張素II（人）；VIP（人、豬、大鼠）；VIP拮抗劑；毒蜥素；艾塞那肽；ZPlO（AVEOOIOO）；普蘭林肽；AC162352（PYY）（3-36）；PYY；奧尼匹肽；高血糖素；GRP；胃饑餓素（GHRP6）；亮脯利特；組氨瑞林；縮宮素；阿托西班（RWJ22164）；舍莫瑞林；奈西立肽；比伐盧定（水蛭肽）；艾替班特；Aviptadin；羅替加肽（ZP123、GAP486）；西侖吉肽（EMD-121924、RGD肽）；AlbuBNP；BN-054；血管緊張素II；MBP-8298；肽白胺酸精胺酸；齊考諾肽；AL-208；AL-108；Carbeticon；三肽；SAL；Coliven；人體肽；ADNF-14；VIP（血管活性腸肽）；胸腺法新；桿菌肽；短桿菌肽；培西加南（MSI-78）；Pl 13；PAC-113；SCV-07；HLFl-Il（乳鐵傳遞蛋白）；DAPTA；TRI-1144；Tritrpticin；抗炎素2；Gattex（替度魯肽，ALX-0600）；Stimuvax（L-BLP25）；Chrysalin（TP508）；Melanonan II；Spantide II；藍肽；辛卡利特；五肽胃泌素；胰泌素；內皮抑素肽；E-選擇素；HER2；IL-6；IL-8；IL-10；PDGF；血小板反應蛋白；uPA (I)；uPA (2)；VEGF；VEGF (2)；五肽-3；XXLRR；β-澱粉狀蛋白原纖維形成；內嗎啡肽-2；TIP 39（結節漏斗部神經肽）；PACAP（1-38）（醯胺，人、牛、大鼠）；TGFB啟動肽；胰島素敏化因子（ISF402）；轉化生長因子BI肽（TGF-B1）；雨蛙素釋放因子；IELLQAR（8-branchMAPS）；替加泊肽PK3145；戈舍瑞林；阿巴瑞克；西曲瑞克；加尼瑞克；地加瑞克（曲普瑞林）；巴蘆西班（FE 200440）；促生長激素釋放肽；奧曲肽；依替巴肽；Netamiftide（INN-00835）；Daptamycin；Spantide II；地米肽（RDP-58）；AL-209；恩夫韋地；IDR-I；六勝肽-6；胰島素-A鏈；蘭瑞肽；六[ρ]肽-3；胰島素B-鏈；甘精胰島素-A鏈；甘精胰島素-B鏈；胰島素-賴脯人胰島素B-鏈類似物；胰島素-天冬胰島素B-鏈類似物；胰島素-賴穀胰島素B鏈類似物；胰島素-地特胰島素B鏈類似物；生長抑素腫瘤抑制類似物；胰抑素（37-52）；血管活性腸肽片段（KKYL-NH2）；和強啡肽A。適合於在本發明公開中使用的蛋白的實例包括（但不限於）：免疫毒素SSlP、腺苷脫氨酶、精胺酸酶等。
在一些實施方式中，本發明公開涉及包含根據本發明公開所述的綴合物中的任一個的組合物。在一些實施方式中，組合物包含本發明公開所述的綴合物的混合物。在一些實施方式中，組合物包含本發明公開所述的綴合物中的多個。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z的平均值為1至約20、1至約15、1至約10、1至約8、1至約7、1至約6、1至約5、1至約4、1至約3或者1至約2。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z1的平均值為1至約15、1至約10、1至約8、1至約6、1至約4、1至約3或者1至約2。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z2的平均值為1至約4、1至約3或者1至約2。在一些實施方式中，所述組合物還包括藥物可用的賦形劑或載體。
在一些實施方式中，本發明公開涉及包含本發明公開所述的至少一種綴合物的組合物。在一些實施方式中，所述組合物包含本發明公開所述的綴合物的混合物。在一些實施方式中，所述綴合物的混合物包含具有不同的z和/或y的多個綴合物。在一些實施方式中，所述綴合物選自化學式（XX）、（XX-I）、（XXIX）、（XXIX-I）、（XXXII）、（XXXII-I）、（XIII）、（XIII-I）、（XIII-A）、（XIII-B）、（XIII-C）、（XIII-D）、（XIII-A1）、（XIII-B1）、（XIII-C1）、（XIII-D1）、（XIII-D2）、（XIII-A-I）、（XIII-B-I）、（XIII-C-I）、（XIII-D-I）、（XIII-A1-I）、（XIII-B1-I）、（XIII-C1-I）、（XIII-D1-I）和/或（XIII-D2-I）。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；其中z是6的綴合物；其中z是7的綴合物；其中z是8的綴合物；其中z是9的綴合物；和/或其中z是10的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；其中z是6的綴合物；其中z是7的綴合物；和/或其中z是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；和/或其中z是6的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是4的綴合物；其中z是5的綴合物；其中z是6的綴合物；其中z是7的綴合物；和/或其中z是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；其中z是3的綴合物；其中z是4的綴合物；和/或其中z是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物；其中z是2的綴合物；和/或其中z是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物和/或其中z是2的綴合物。
在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；其中y是6的綴合物；其中y是7的綴合物；其中y是8的綴合物；其中y是9的綴合物；和/或其中y是10的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；其中y是6的綴合物；其中y是7的綴合物；和/或其中y是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；和/或其中y是6的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是4的綴合物；其中y是5的綴合物；其中y是6的綴合物；其中y是7的綴合物；和/或其中y是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；其中y是3的綴合物；其中y是4的綴合物；和/或其中y是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物；其中y是2的綴合物；和/或其中y是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中y是1的綴合物和/或其中y是2的綴合物。
在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；其中z1是6的綴合物；其中z1是7的綴合物；其中z1是8的綴合物；其中z1是9的綴合物；和/或其中z1是10的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；其中z1是6的綴合物；其中z1是7的綴合物；和/或其中z1是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；和/或其中z1是6的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是4的綴合物；其中z1是5的綴合物；其中z1是6的綴合物；其中z1是7的綴合物；和/或其中z1是8的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；其中z1是3的綴合物；其中z1是4的綴合物；和/或其中z1是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；其中z1是2的綴合物；和/或其中z1是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z1是1的綴合物；和/或其中z1是2的綴合物。
在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z2是1的綴合物；其中z2是2的綴合物；其中z2是3的綴合物；其中z2是4的綴合物；和/或其中z2是5的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z2是1的綴合物；其中z2是2的綴合物；和/或其中z2是3的綴合物。在一些實施方式中，綴合物的混合物包含其中z2是1的綴合物和/或其中z2是2的綴合物。
在一些實施方式中，本發明公開涉及組合物，其包含以下化學式所示的綴合物中的任一個：（XX）、（XX-I）、（XXIX）、（XXIX-I）、（XXXII）、（XXXII-I）、（XIII）、（XIII-I）、（XIII-A）、（XIII-B）、（XIII-C）、（XIII-D）、（XIII-A1）、（XIII-B1）、（XIII-C1）、（XIII-D1）、（XIII-D2）、（XIII-A-I）、（XIII-B-I）、（XIII-C-I）、（XIII-D-I）、（XIII-A1-I）、（XIII-B1-I）、（XIII-C1-I）、（XIII-D1-I）和/或（XIII-D2-I）。在一些實施方式中，組合物包含多個以下化學式所示的綴合物：（XX）、（XX-I）、（XXIX）、（XXIX-I）、（XXXII）、（XXXII-I）、（XIII）、（XIII-I）、（XIII-A）、（XIII-B）、（XIII-C）、（XIII-D）、（XIII-A1）、（XIII-B1）、（XIII-C1）、（XIII-D1）、（XIII-D2）、（XIII-A-I）、（XIII-B-I）、（XIII-C-I）、（XIII-D-I）、（XIII-A1-I）、（XIII-B1-I）、（XIII-C1-I）、（XIII-D1-I）和/或（XIII-D2-I）。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z的平均值為1至約20、1至約15、1至約10、1至約8、1至約7、1至約6、1至約5、1至約4、1至約3或者1至約2。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z1的平均值為1至約15、1至約10、1至約8、1至約6、1至約4、1至約3或者1至約2。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z2的平均值為1至約4、1至約3或者1至約2。在一些實施方式中，所述組合物還包括藥物可用的賦形劑或載體。
IL-2-大分子綴合物
轉向本發明公開的一個或多個實施方式，提供了更具體的蛋白質-大分子綴合物，所述綴合物包含通過接頭共價連接至水溶性聚合物的IL-2部分殘基。本發明公開的綴合物將具有以下特徵中的一種或多種。
IL-2部分
如上所述，所述綴合物通常包含通過可釋放或非可釋放接頭共價連接至一個或多個水溶性聚合物的IL-2部分殘基。如本文所使用的，術語“IL-2部分”應表示綴合前的IL-2部分以及連接至水溶性聚合物之後的IL-2部分。然而，將理解當原始IL-2部分連接至水溶性聚合物時，IL-2部分由於與和所述聚合物的連接有關的一個或多個共價鍵的存在而輕微改變。通常，連接至另一種分子的IL-2部分的這種輕微改變形式被稱為IL-2部分的“殘基”。
所述IL-2部分可以來源於非重組方法和重組方法，並且本發明公開就此不受限制。另外，IL-2部分可以來源於人來源、動物來源和植物來源。
非重組和重組方法獲得的任何IL-2部分可以在製備本文所述的綴合物中用作IL-2部分。
基於用於表達具有IL-2活性的蛋白的系統，IL-2部分可以是未糖基化的或糖基化的並且可以使用任一種。即IL-2部分可以是未糖基化的或IL-2部分可以是糖基化的。在本發明公開的一個或多個實施方式中，IL-2部分是未糖基化的。
可以有利地修飾IL-2部分以包括和/或替換一個或多個胺基酸殘基，如（例如）離胺酸、半胱胺酸、組胺酸和/或精胺酸，從而提供聚合物與胺基酸側鏈內原子之間容易的連接。在美國專利No. 5,206,344中描述了IL-2部分的替換實例。另外，可以修飾IL-2部分以包括非天然存在的胺基酸殘基。在WO 2019/028419中描述了替換IL-2部分的非天然存在的胺基酸殘基的實例。用於添加胺基酸殘基和非天然存在的胺基酸殘基的技術對於本領域那些技術人員是熟知的。參考J. March, Advanced Organic IL-2mistry: Reactions Mechanisms and Structure, 第4版（New York: Wiley-Interscience, 1992）。
另外，可以有利地修飾IL-2部分以包括官能團的連接（除通過含有官能團的胺基酸殘基的添加外）。例如，可以修飾IL-2部分以包括硫醇基團。另外，可以修飾IL-2部分以包括N末端α碳。另外，可以修飾IL-2部分以包括一個或多個碳水化合物部分。另外，可以修飾IL-2部分以包括醛基。另外，可以修飾IL-2部分以包括酮基。在本發明公開的某些實施方式中，較佳地未修飾IL-2部分以包括硫醇基團、N末端α碳、碳水化合物、醛基和酮基中的一個或多個。
在文獻並且在（例如）美國專利No. 5,116,943、5,153,310、5,635,597、7,101,965和7,567,215以及美國專利申請公開No. 2010/0036097和2004/0175337中描述了示例性IL-2部分。較佳的IL-2部分具有對應於圖1的胺基酸序列。
在一些情況下，IL-2部分可以處於“單體”形式，其中將相應肽的單一表達組織成單獨的單元。在其它情況下，IL-2部分可以處於“二聚體”的形式（例如，重組IL-2的二聚體），其中所述蛋白的兩個單體彼此結合（例如，通過二硫鍵）。例如，在重組人IL-2二聚體的背景中，所述二聚體可以處於通過由每個單體的Cys 125殘基所形成的二硫鍵彼此結合的兩個單體的形式。
另外，IL-2的前體形式可以用作IL-2部分。任何上述序列的截短形式、雜交變體和肽模擬物也可以用作IL-2部分。維持至少一些IL-2活性程度的任何上述形式的生物活性片段、缺失變體、替換變體或添加變體也可以用作IL-2部分。
對於任何給定肽或蛋白質部分，有可能確定該部分是否具有IL-2活性。在本領域中描述了用於確定體外IL-2活性的多種方法。示例性方法是以下實驗中所述的CTLL-2細胞增殖測定。在Moreau等人 (1995) Mol. Immunol. 32:1047-1056中描述了示例性方法。本領域中已知的其它方法也可以用於評價IL-2功能，包括量電法、分光光度法、色譜法和放射性測量法。
現將描述根據本發明公開的更具體的示例性綴合物。通常，預期該IL-2部分（至少部分）具有與圖1中所提供的序列類似的胺基酸序列。因此，儘管參考了圖1序列內的具體位置或原子，但是該參考僅是為了方便並且本領域常規技術人員將能夠容易地確定具有IL-2活性的其它部分中的相應位置或原子。具體地，本文對於天然人IL-2所提供的描述通常適用於任何上述的片段、缺失變體、替換變體或添加變體。
綴合物組裝
IL-2部分上的氨基提供了IL-2部分和水溶性聚合物之間的連結點。使用圖1中所提供的胺基酸序列，顯然存在幾個離胺酸殘基，在每個離胺酸殘基中具有可以對於綴合可用的　-胺基酸。此外，任何蛋白的N末端胺也可以用作連結點。
存在對於與IL-2部分的可用的胺形成共價可釋放鍵有用的適合的試劑的一些實例。在下表1中與相應綴合物一起提供了非限制性具體實例。在表中，變數“n”代表重複單體單元的數目，z是1至10的整數，並且“-NH-IL-2”代表綴合至聚合試劑或接頭並形成單獨連接至IL-2部分的一個或多個水溶性聚合物後的IL-2部分的殘基，或者單獨連接至IL-2部分的一個或多個接頭。儘管表1所提供的每個聚合物部分[例如，(OCH 2CH 2) n或(CH 2CH 2O) n]的末端為“CH 3”基，但是因此可以替換其它基團（如H和苄基）。
表1. 胺-選擇性偶聯劑的實例和由此所形成的IL-2部分綴合物
偶聯劑 相應綴合物
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可以通過多種技術實現試劑與IL-2部分的氨基的綴合。在一個方法中，IL-2部分可以綴合至通過琥珀醯亞胺基衍生物（或其它啟動的酯基，其中可以使用與對於這些替代的含有啟動的酯基的試劑所述的那些類似的方法）官能化的偶聯劑。在該方法中，具有琥珀醯亞胺基衍生物的試劑可以在pH 7至9.0的水媒介中連接至IL-2部分，儘管使用不同的反應條件（例如，更低的pH，如6至7或者不同溫度和/或小於15℃的溫度）可以導致試劑連接至IL-2部分的不同位置。
由於在IL-2上存在多個氨基位點，因此可以使用過量當量的試劑實現所公開的偶聯劑對IL-2部分的不止一個官能化。與IL-2部分的多個氨基的綴合需要非常高當量的聚合物試劑（例如，100eq）。官能性接頭試劑的使用可以更有效地實現IL-2部分的高官能化。
通常，官能性接頭試劑可以具有琥珀醯亞胺基衍生物和適合於點擊化學的反應基團。官能性試劑與IL-2部分的氨基通過NHS偶聯的綴合可以實現IL-2部分的大量官能化。隨後，使用適合的聚合物試劑的點擊化學可以提供高聚合衍生化的IL-2。下表2與相應綴合物一起提供了一些非限制性具體實例。在下表中，變數（n）表示重複單體單元的數目，z是1至10的整數並且“-NH-IL-2”代表具有單獨連接的一個或多個水溶性聚合物的IL-2的殘基。儘管表2所提供的每個聚合物部分[例如，(OCH 2CH 2) n或(CH 2CH 2O) n]的末端為“CH 3”基，但是因此可以替換其它基團（如H和苄基）。
表2. IL-2接頭綴合物和由此所形成的IL-2聚合物綴合物
IL-2接頭綴合物 相應聚合物綴合物
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點擊化學用於位點-特異的PEG化。通過將含有疊氮化物的非天然胺基酸，即高疊氮基丙胺酸摻入到允許通過炔烴-PEG分子進行位點-特異的綴合的重組蛋白中來實現位點-特異的PEG化。
Cu-催化的點擊反應的一個主要缺點在於需要高毒性的銅(I)以及Cu(II)。甚至少量的銅可以損害蛋白，具體地螢光蛋白，如GFP。另外，可能要求還原劑、配體和無氧條件的存在。
以與Cu-催化的點擊反應類似的效率，同時維持蛋白存活力來實現位點-特異的PEG化的方法是環辛炔的引入，其中八元環中的張力使得能夠在不存在催化劑的情況下，在4℃或在室溫下與疊氮化物發生反應。二苄基環辛炔（所謂的DBCO）屬於這類反應性環辛炔。
DBCO-PEG分子使得能夠在溫和反應條件下進行含有疊氮化物的蛋白的無Cu PEG化。相應的，由於點擊化學的固有選擇性，PEG分子與疊氮化物殘基的共價連接是有效且高度位點-特異的。
使用點擊-PEG化將多個疊氮化物官能化的IL-2（IL-2-接頭綴合物）以高效率轉為成多個PEG化的綴合物（IL-2-聚合物綴合物）。當在疊氮化物和非對稱的1,2-二取代的炔烴，如DBCO之間發生點擊反應時，本領域技術人員將理解作為產物可以獲得兩種位置異構化合物。位置異構物的差異在於所形成的C-N鍵的位置。
不同試劑與IL-2部分的氨基的綴合可以產生具有混合接頭的IL-2綴合物。以下提供了非限制性具體實例。變數“n”代表重複單體單元的數目，z是1至5的整數，並且“-NH-IL-2”代表綴合至聚合試劑或接頭並形成單獨連接至IL-2部分的一個或多個水溶性聚合物後的IL-2部分的殘基，或者單獨連接至IL-2部分的一個或多個接頭。
在一些實施方式中，所述綴合物選自：
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；
Figure 02_image288
；
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；
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；或
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。
使用如本文所描述的方案I、方案II和方案III策略的IL-2的PEG化產生了一些PEG化的IL-2綴合物，所述綴合物顯示出對IL-2Rb優於對IL-2Ra的結合偏好。這通過PBMC免疫譜測定得到支援，與對照IL-2和從常規PEG試劑PEG化方法所產生的PEG化的IL-2相比，所述測定顯示出優於T調控細胞增殖的偏好效應性T細胞增殖。
使用如本文所描述的方案I策略的IL-2的PEG化可以產生PEG化的IL-2綴合物，其具有不同數目的連接至IL-2的接頭和PEG聚合物的混合物。以下提供了非限制性具體實例。變數“n”代表重複單體單元的數目，z是1至8的整數，y是1至8的整數，且“-NH-IL-2”代表綴合至接頭並形成單獨連接至IL-2部分的一個或多個接頭後的IL-2部分的殘基。
在一些實施方式中，所述綴合物選自：
Figure 02_image296
；
Figure 02_image298
；或
Figure 02_image300
。
IL-2部分內所含的硫醇基團可以用作水溶性聚合物的有效連接位點。在IL-2部分記憶體在一個溶劑可接近的二硫化物。通常，它有助於蛋白的穩定性而不是其結構或其功能。如Bioconjugate Chem. 2007, 18, 61−76中報導，釋放半胱胺酸硫醇的可接近的天然二硫鍵的溫和還原之後可以是用雙(硫醇)-特異性試劑PEG化。這導致具有所連接的PEG的兩個半胱胺酸硫醇的橋連。
使用硫醇橋PEG化的根據本發明公開的代表性綴合物可以包括以下化學式（XVII）：
Figure 02_image302
（XVII） 或其立體異構物、互變異構物或混合物、其位置異構物或混合物，或其同位素變體；或其藥物可用的鹽，溶劑化物，水合物或前體藥物； 其中X為間臂部分，POLY為直鏈或支鏈水溶性聚合物，並且“-S-”為IL-2部分內的殘基的硫基。在某些實施方式中，所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
對於聚合試劑，在本文中和其它處所述的那些可以購自商品化來源或從可商購的起始材料製備。另外，在文獻中描述了用於製備聚合試劑的方法。
點擊化學
在綴合物的某些實施方式中，本文所公開的接頭和化學式包含能夠通過點擊化學反應的官能團。如本文所使用的，點擊化學是指疊氮化物和炔烴之間形成1,2,3-三唑的1,3-偶極環化加成或[3+2]環化加成。術語“1,3-偶極環化加成”和“[3+2]環化加成”還涵蓋了疊氮化物和環辛炔之間的“無銅”1,3-偶極環化加成。
因此，除非另有說明，否則在本文中對任何三唑化合物的描述意味著包括化合物的位置異構物及其混合物。
例如，疊氮化物和炔烴的[3+2]環化加成可以產生如下所示的兩種位置異構的三唑：
Figure 02_image304
在某些實施方式中，所述炔烴是應變的環炔基或雜環炔基，並且可以在存在或不存在催化劑的情況下實施所述環化加成反應。在某些實施方式中，例如，可以通過被稱為應變-促進的疊氮化物-炔烴環化加成（strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC）的反應自發發生所述環化加成反應，這在本領域中作為“無金屬點擊化學”已知。在某些實施方式中，應變的環炔基或雜環炔基如本文所述。
可以在本文所述的方法中使用這些無催化劑的[3+2]環化加成以形成本發明公開的綴合物。可以通過環應變，如（僅通過舉例）將吸電子基團附加至這些炔烴環的8元環狀結構啟動炔烴，或者可以通過添加路易士酸，如Au(l)或Au(lll)啟動炔烴。已描述了通過環應變啟動的炔烴。例如，Agard等人, J. Am. Chem. Soc, 2004, 126 (46):15046-15047所述的環辛炔和二氟環辛炔、Boon等人, WO2009/067663 A1 (2009)所述的二苯并環辛炔和Debets等人, Chem. Comm., 2010, 46:97-99所述的氮雜-二苯并環辛炔。
在某些實施方式中，如本文所述，可以通過將包含炔烴基團的官能化大分子與包含疊氮基的官能化蛋白反應以形成綴合物來獲得本發明公開的綴合物。在其它實施方式中，官能化蛋白可以具有啟動的炔烴部分，並且官能化大分子具有疊氮化物部分。
在某些實施方式中，所述官能化大分子是官能化PEG。在某些實施方式中，所述官能化蛋白是官能化IL-2。在某些實施方式中，官能化IL-2中的疊氮化物與官能化PEG中的炔烴反應以形成三唑部分（例如，通過1,3-偶極環化加成）。在某些實施方式中，官能化PEG中的疊氮化物與官能化IL-2中的炔烴反應以形成三唑部分。
在某些實施方式中，本發明公開所述的點擊化學產物組包含三唑基團。 在某些實施方式中，點擊化學產物組選自：
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；
Figure 02_image308
；
Figure 02_image310
；
Figure 02_image312
；
Figure 02_image314
；
Figure 02_image316
；和
Figure 02_image318
。
在本文所公開的化合物、綴合物和化學式的某些實施方式中，T選自：
Figure 02_image306
；
Figure 02_image308
；
Figure 02_image310
；
Figure 02_image312
；
Figure 02_image314
；
Figure 02_image316
；或
Figure 02_image318
。
在本文所公開的包含三唑官能團（T）的化合物、綴合物和化學式的某些實施方式中，所述三唑官能團可以作為導致產生化合物或綴合物的位置異構物的混合物存在，以作為位置異構物的混合物存在。
如本文所使用的，
Figure 02_image320
的結構表示具有以下結構的位置異構物的混合物：
Figure 02_image306
；和
Figure 02_image308
。
當本文所提供的綴合物含有酸性或鹼性部分時，它還可以作為藥物可用的鹽提供。參見，Berge等人, J. Pharm. Sci.1977, 66, 1-19； Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use,第2版；Stahl and Wermuth Eds.; John Wiley & Sons, 2011。在某些實施方式中，本文所提供的化合物的藥物可用的鹽是溶劑化物。在某些實施方式中，本文所提供的化合物的藥物可用的鹽是水合物。
適合在本文所提供的化合物的藥物可用的鹽的製備中使用的酸包括（但不限於）乙酸、2,2-二氯乙酸、醯化胺基酸、肥酸、海藻酸、抗壞血酸、L-門冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙醯氨基苯甲酸、硼酸、（+）-樟腦酸、樟腦磺酸、（+）-(1 S)-樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、檸檬酸、環拉酸、環己基氨基磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羥基-乙磺酸、甲酸、延胡索酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡庚糖酸、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、L-麩胺酸、α-酮戊二酸、乙醇酸、馬尿酸、氫溴酸、鹽酸、氫碘酸、（+）-左旋乳酸、（±）-DL-乳酸、乳糖酸、月桂酸、馬來酸、（-）-L-蘋果酸、丙二酸、（±）-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、煙酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、高氯酸、磷酸、L-焦麩胺酸、糖二酸、水楊酸、4-氨基-水楊酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、（+）-L-酒石酸、硫氰酸、 p-甲苯磺酸、十一烯酸和戊酸。
適合在本文所提供的化合物的藥物可用的鹽的製備中使用的鹼包括（但不限於）無機鹼、如氫氧化鎂、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氫氧化鋅或氫氧化鈉；和有機鹼，如伯、仲、叔和季脂族和芳香胺，包括（但不限於）L-精胺酸、苯乙苄胺、苄星青黴素、膽鹼、地阿諾、二乙醇胺、二乙胺、二甲胺、二丙胺、二異丙胺、2-(二乙基氨)-乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、異丙胺、 N-甲基-葡糖胺、哈胺、1 H-咪唑、L-離胺酸、嗎啉、4-(2-羥乙基)-嗎啉、甲胺、呱啶、呱嗪、丙胺、四氫吡咯、1-(2-羥乙基)-四氫吡咯、吡啶、奎寧環、喹啉、異喹啉、三乙醇胺、三甲胺、三乙胺、 N-甲基-D-葡糖胺、2-氨基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇和氨丁三醇。
本文所提供的綴合物還可以作為前體藥物提供，它是化合物的官能衍生物並且易於在體內可轉化為母體化合物。前體藥物通常是有用的，因為在一些情況下，它們可以比母體化合物更易於施用。例如，它們可以是通過口服生物可用的，然而母體化合物不是。前體藥物還可以在藥物組合物中具有比母體化合物提高的溶解度。前體藥物可以通過多種機制轉化為母體藥物，包括酶促過程和代謝水解。
藥物組合物
所述綴合物通常是組合物的一部分。通常，所述組合物包含多種綴合物。在某些實施方式中，每種綴合物由相同蛋白組成（即在整個組合物內，僅存在一種類型的蛋白）。另外，所述組合物可以包含多種綴合物，其中任何給定的綴合物由選自兩種或更多種不同的蛋白的部分組成（即在整個組合物內，存在兩種或更多種不同的蛋白）。在其它實施方式中，所述組合物中基本所有的綴合物（例如，所述組合物中的多種綴合物的85%或以上）分別包含相同的蛋白。更具體地，所述蛋白是IL-2。
所述組合物可以包含單一綴合物物質（例如，單PEG化的綴合物，其中對於所述組合物中的基本所有綴合物，在相同位置連接單個聚合物）或綴合物物質的混合物（例如，其中聚合物的連接發生在不同位點的單PEG化的綴合物的混合物和/或單PEG化、二PEG化、三PEG化和多PEG化綴合物的混合物）。所述組合物也可以包含具有4、5、6、7、8或更多個連接至任何給定蛋白的聚合物的其它綴合物。另外，本發明公開包括其中所述組合物包含多種綴合物的實例，每種綴合物包含共價連接至一種蛋白的一種水溶性聚合物，以及包含共價連接至一種蛋白的2、3、4、5、6、7、8或更多種水溶性聚合物的組合物。更具體地，所述蛋白是IL-2。
相對於所述組合物中的綴合物，所述組合物通常將滿足以下特徵中的一種或多種：所述組合物中的至少約85%的綴合物將具有1至10種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的綴合物將具有1至9種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的綴合物將具有1至8種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的綴合物將具有1至7種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的綴合物將具有1至6種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的綴合物將具有1至5種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的綴合物將具有1至4種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的綴合物將具有1至3種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的綴合物將具有1至2種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約85%的綴合物將具有1種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的綴合物將具有1至10種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的綴合物將具有1至9種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的綴合物將具有1至8種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的綴合物將具有1至7種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的綴合物將具有1至6種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的綴合物將具有1至5種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的綴合物將具有1至4種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的綴合物將具有1至3種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的綴合物將具有1至2種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約95%的綴合物將具有1種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的綴合物將具有1至10種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的綴合物將具有1至9種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的綴合物將具有1至8種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的綴合物將具有1至7種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的綴合物將具有1至6種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的綴合物將具有1至5種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的綴合物將具有1至4種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的綴合物將具有1至3種連接至所述蛋白的聚合物；所述組合物中的至少約99%的綴合物將具有1至2種連接至所述蛋白的聚合物；和所述組合物中的至少約99%的綴合物將具有1種連接至所述蛋白的聚合物。應理解對聚合物範圍的提及，例如，“x至y種聚合物”考慮了一些聚合物x至y（包括x和y）（也就是說，例如，“1至3種聚合物”考慮了1種聚合物、2種聚合物和3種聚合物，“1至2種聚合物”考慮了1種聚合物和2種聚合物等）。更具體地，所述蛋白是IL-2。
對於任何給定部分，可以通過選擇適當的聚合試劑、聚合試劑與蛋白的比、溫度、pH條件以及綴合反應的其它方面來實現對所期望的聚合物數目的控制。另外，可以通過純化方式實現不期望的綴合物的減少或除去。
例如，可以純化聚合物-蛋白質部分綴合物以獲得/分離不同的綴合物質。具體地，可以純化產物混合物以獲得每個IL-2部分來自1、2、3、4、5或更多個的任意數量的PEG的平均值。最終綴合物反應混合物的純化策略將取決於一些因素，包括（例如）所使用的聚合試劑的分子量、具體的蛋白、所期望的劑量施用方案和各個綴合物的殘餘活力和體內性質。
如果需要，可以使用凝膠過濾色譜法和/或離子交換色譜法分離具有不同分子量的綴合物。也就是說，基於它們不同的分子量（其中差異基本上對應於水溶性聚合物部分的平均分子量），將凝膠過濾色譜法用於分離不同數目的聚合物-與-蛋白質部分的比（例如，1-聚體、2-聚體、3-聚體等，其中“1-聚體”表示每個蛋白質部分1個聚合物，“2-聚體”表示每個蛋白質部分2個聚合物等）。例如，在其中15,000道爾頓蛋白隨機綴合至分子量約20,000道爾頓的聚合試劑的示例性反應中，所得反應混合物可以含有未修飾的蛋白（具有約15,000道爾頓的分子量）、單PEG化的蛋白（具有約35,000道爾頓的分子量）、二PEG化的蛋白（具有約55,000道爾頓的分子量）等。
儘管這種方法可以用於分離具有不同分子量的PEG及其它聚合物-蛋白綴合物，但是這種方法對於分離在蛋白內具有不同聚合物連接位點的位置同工型來說通常是無效的。例如，凝膠過濾色譜法可以用於將PEG 1-聚體、2-聚體、3-聚體等的混合物彼此分離，儘管每種所回收的綴合物的組成可以含有在蛋白內連接至不同反應基團（例如，離胺酸殘基））的PEG。
具體的凝膠過濾柱的選擇將取決於所期望的分離範圍。通常使用適合的緩衝液，如磷酸鹽、乙酸鹽等進行洗脫。可以通過一些不同的方法分析收集的餾分，例如，（i）對於蛋白質含量，在280nm的吸光值，（ii）使用牛血清白蛋白（BSA）作為標準品的染料-基蛋白質分析，（iii）用於PEG含量的碘測試（Sims等人 (1980) Anal. BioIL-2m, 107:60-63），（iv）十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS PAGE），隨後用碘化鋇染色和（v）高效液相色譜法（HPLC）。
使用適合的柱（例如，C18柱或C3柱），使用反相-高效液相色譜（RP-HPLC）通過反相色譜法，或者使用離子交換柱，通過離子交換色譜法獲得位置同工型的分離。可以使用任一種方法來分離具有相同分子量的聚合物-活性劑異構物（即位置同工型）。
對於IL-2-聚合物綴合物，所述組合物較佳地基本不含不具有IL-2活性的蛋白。另外，所述組合物較佳地基本不含所有其它非共價連接的水溶性聚合物。然而，在一些情況下，所述組合物可以含有聚合物-IL-2部分綴合物和非綴合IL-2部分的混合物。
在一些實施方式中，所述組合物包含本發明公開所述的綴合物中的任一個。在一些實施方式中，所述組合物包含本發明公開所述的綴合物的混合物。在一些實施方式中，所述組合物包含本發明公開所述的綴合物中的多個。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z的平均值為1至約20、1至約15、1至約10、1至約8、1至約7、1至約6、1至約5、1至約4、1至約3或者1至約2。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z1的平均值為1至約15、1至約10、1至約8、1至約6、1至約4、1至約3或者1至約2。在如本文所描述的組合物的一些實施方式中，多個綴合物的z2的平均值為1至約4、1至約3或者1至約2。在一些實施方式中，所述組合物還包括藥物可用的賦形劑或載體。
任選地，本發明公開所述的組合物還包含一種或多種藥物可用的載體或賦形劑。如果需要，可以將藥物可用的賦形劑添加至綴合物以形成組合物。
示例性的賦形劑無限制地包括選自碳水化合物、無機鹽、抗微生物劑、抗氧化劑、表面活性劑、緩衝劑、酸、鹼、胺基酸及其組合的那些。
碳水化合物，如糖、衍生的糖，如醛醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物可以作為賦形劑存在。具體的碳水化合物賦形劑包括（例如）單糖，如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、右旋糖酐、澱粉等；和醛醇，如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、拉克替醇、木糖醇、山梨糖醇（葡糖醇）、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇、環糊精等。
賦形劑還可以包括無機鹽或緩衝液，如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二鈉及其組合。
所述組合物還可以包括用於防止或阻止微生物生長的抗微生物劑。適合於本發明公開的一個或多個實施方式的抗微生物劑的非限制性實例包括苯紮氯銨、苄索氯銨、苯甲醇、氯化十六烷吡啶、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞及其組合。
抗氧化劑也可以存在於所述組合物中。抗氧化劑用於防止氧化，借此防止綴合物或製劑的其它組分的破壞。適合在本發明公開的一個或多個實施方式中使用的抗氧化劑包括（例如）抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯、次磷酸、硫代甘油、沒食子酸丙酯、亞硫酸氫鈉、甲醛合次硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉及其組合。
表面活性劑可以作為賦形劑存在。示例性的表面活性劑包括：聚山梨醇酯，如“吐溫20”和“吐溫80”以及普盧蘭尼克，如F68和F88；脫水山梨糖醇酯；脂質，如磷脂，如卵磷脂及其它磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺（儘管較佳地不處於脂質體的形式）、脂肪酸和脂肪酸酯；類固醇，如膽固醇；和IL-2化劑（IL-2lating agents），如EDTA、鋅及其它這些適合的陽離子。
酸和鹼可以作為所述組合物中的賦形劑存在。可以使用的酸的非限制性實例包括選自下列中的那些酸：鹽酸、乙酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、延胡索酸及其組合。適合的鹼的實例無限制地包括選自下列的鹼：氫氧化鈉、乙酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、乙酸銨、乙酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、延胡索酸鉀及其組合。
一種或多種胺基酸可以作為本文所述的組合物中的賦形劑存在。在這方面，示例性的胺基酸包括精胺酸、離胺酸和甘胺酸。
所述組合物中的綴合物（即活性劑和聚合試劑之間形成的綴合物）的量將基於一些因素而改變，但當所述組合物儲存在單位劑量容器（例如，小瓶）中時，所述量將最佳地為治療有效劑量。另外，可以將藥物製劑放在注射器中。可以通過升高的量的綴合物的反復施用，通過實驗確定治療有效劑量以確定哪個量產生了臨床所期望的終點。
所述組合物中任何單個賦形劑的量將基於賦形劑的活性和所述組合物的具體需要而改變。通常，通過常規實驗，即通過製備含有不同的量的賦形劑（從低到高）的組合物，檢查穩定性及其它參數，然後確定獲得最佳表現且無明顯副作用的範圍，從而確定任何單個賦形劑的最佳的量。
然而，通常，賦形劑將以按重量計約1%至約99%，較佳地按重量計約5%至約98%，更較佳地按重量計約15至約95%的量的賦形劑存在於所述組合物中，其中濃度小於按重量計30%是最較佳的。
以上這些藥物賦形劑與其它賦形劑一起描述於“Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 第19版, Williams & Williams, (1995)，“Physician’s Desk Reference”, 第52版, Medical Economics, Montvale, NJ (1998)和Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000中。
治療方法
所述綴合物及其組合物可以用於治療可以通過施用所述綴合物醫冶或預防的任何病況。本領域那些技術人員將理解具體綴合物可以有效治療哪些病況。例如，所述綴合物可以單獨使用或與其它藥物療法組合以治療癌症、傳染性疾病（例如，病毒）和/或自體免疫疾病。
在一些實施方式中，本發明公開提供了治療對其有需要的受試者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本文所公開的綴合物。在一些實施方式中，所述癌症是血癌。在一些實施方式中，所述血癌是多發性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。在一些實施方式中，所述血癌是急性髓細胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤。在一些實施方式中，所述癌症是實體瘤癌症。在一些實施方式中，所述實體瘤癌症是腎細胞癌、黑素瘤、乳腺癌或膀胱癌。在一些實施方式中，所述黑素瘤是轉移性黑素瘤。在一些實施方式中，所述癌症是可以用IL-2治療的癌症，其選自肉瘤、脊索瘤、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚癌、威爾姆氏瘤、宮頸癌、睾丸癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、寡枝神經膠質細胞瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、急性髓細胞性白血病和白血病。
在一些實施方式中，本發明公開提供了治療對其有需要的受試者中的傳染性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本文所公開的綴合物。在一些實施方式中，所述傳染性疾病是病毒性疾病。在一些實施方式中，所述病毒性疾病是人類免疫缺陷性病毒（HIV）或丙型肝炎病毒（HCV）。在一些實施方式中，所述傳染性疾病是HIV。在一些實施方式中，所述傳染性疾病是HCV。
在一些實施方式中，本發明公開提供了治療對其有需要的受試者中的自體免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本文所公開的綴合物。在一些實施方式中，所述自體免疫疾病是類風濕性關節炎、紅斑狼瘡、炎症性腸病（IBD）或特應性皮炎。在一些實施方式中，所述類風濕性關節炎是兒童類風濕性關節炎。
在某些實施方式中，患者患有選自下列的疾病：腎細胞癌、轉移性黑素瘤、丙型肝炎病毒（HCV）、人類免疫缺陷性病毒（HIV）、急性髓細胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、兒童類風濕性關節炎、特應性皮炎、乳腺癌和膀胱癌。
有利地，可以在另一種活性劑的施用之前、同時或之後向患者施用所述綴合物。在一些實施方式中，所述綴合物可以與抗-腫瘤抗原抗體組合以產生協同先天性和適應性免疫反應。在一些實施方式中，所述綴合物可以與通過抗體依賴性細胞毒作用（ADCC）功能具有它們的抗-腫瘤活性的抗-腫瘤抗體組合。本發明公開中所述的PEG-IL-2綴合物可以刺激CD8+ T細胞。CD8+ T細胞的刺激不僅提供了直接腫瘤殺死的益處，而且還提供了用於抗體依賴性細胞毒作用（ADCC）的多形核白細胞（PMNs）的調節，如通過已知促進嗜中性白細胞活性的細胞因子，如IFNγ的釋放（Pelletier等人, J. Leukoc. Biol. 2010; 88:1163–1170）。PEG-IL-2綴合物與具有ADCC功能的抗-腫瘤抗體的組合療法可以潛在地提高這些抗體的抗-腫瘤活性。
製劑/施用
本文所公開的施用於對其有需要的患者的綴合物和組合物意味著涵蓋了所有制劑類型，具體地，適合於注射的那些類型，例如，可以復原的粉劑或凍乾粉劑（lyophilates）以及液體劑。適合於在注射前復原固體組合物的稀釋劑的實例包括抑菌注射用水、5%葡萄糖水溶液、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液、鹽水、無菌水、去離子水及其組合。對於液體藥物組合物，考慮了溶液和混懸液。
通常，儘管不一定，通過注射施用本發明公開的一個或多個實施方式的組合物並因此所述組合物通常在馬上要施用前是液體溶液或混懸液。所述藥物製劑還可以採取其它形式，如糖漿、乳膏劑、軟膏劑、片劑、粉末劑等。還包括了其它施用模式，如肺部、直腸、透皮、經粘膜、口服、鞘內、瘤內、癌周、腹膜內、皮下、動脈內施用等。
本發明公開還提供了用於將如本文所提供的綴合物施用於患有對用綴合物的治療起反應的病況的患者的方法。所述方法包括通常通過注射，向患者施用治療有效量的綴合物（較佳地作為藥物組合物的一部分提供）。如前所述，可以注射（例如，肌內、皮下和腸胃外注射）所述綴合物。適合於腸胃外施用的製劑類型包括隨時可注射的溶液、在使用前用於與溶劑混合的乾粉、隨時可注射的混懸液、用於在使用前與媒介物混合的乾不溶組合物和在施用前稀釋的乳液和液體濃縮劑等。
可以任選地實施施用所述綴合物（較佳地作為藥物組合物的一部分提供）的方法以將所述綴合物定位至特定區域。例如，可以通過手術將包含所述綴合物的液體、凝膠和固體製劑植入患病區域（如腫瘤中、腫瘤附近、發炎區域中和發炎區域附近）。方便地，還可以對器官和組織成象以確保將所期望的位置更好地暴露於所述綴合物。
要施用的實際劑量將基於受試者的年齡、體重和一般狀況以及要治療的病況的嚴重程度、專業醫護人員的判斷和要施用的綴合物而不同。治療有效量是本領域技術人員已知的和/或在相關參考教科書和文獻中描述的。通常，治療有效量將在約0.001mg至100mg的範圍內，較佳地處於0.01mg/天至75mg/天的劑量，並且更佳地0.10mg/天至50mg/天的劑量。可以定期施用給定劑量直至（例如）疾病症狀減輕和/或完全消除。
基於臨床醫師的判斷、患者的需要等，可以以多種劑量施用計畫表施用任何給定綴合物（同樣，較佳地作為藥物製劑的一部分提供）的單位劑量。具體的劑量施用計畫表將是本領域那些技術人員已知的或者可以使用常規方法，通過實驗確定的。示例性的劑量施用計畫表無限制地包括每天施用一次、每週三次、每週兩次、每週一次、每三週一次、每月兩次、每月一次或其任意組合。一旦實現臨床終點，則停止所述組合物的劑量施用。
應理解儘管已結合其較佳的具體實施方式描述了本發明公開，但是以上描述以及隨後的實施例旨在描述而非限制本發明公開的範圍。本發明公開的範圍內的其它方面、優勢和改變將對本發明公開所屬領域內的技術人員是顯而易見的。
在本文中參考的所有文章、書籍、專利及其它出版物以其全部內容作為參考併入本文。
實驗
除非另外說明，否則本發明公開的實踐將使用有機合成、生物化學、蛋白純化等的常規方法，它們均在本領域的技術範圍內。在文獻中充分解釋了這些技術。參見，例如，J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 第4版（New York: Wiley-Interscience, 1992），如上。
在以下實施例中，已進行了工作以確保相對於所使用數值的準確度（例如，量、溫度等），但是應說明一些實驗誤差和偏差。除非另外說明，否則以攝氏度表示溫度並且壓力為或接近海平線處的大氣壓力。除非另外說明，否則所有試劑商購自Sigma-Aldrich或Thermo Fisher Scientific。所有產生的NMR得自300或400MHz NMR光譜儀。所有處理是在玻璃或玻璃襯裡的容器中進行的並且避免與含金屬容器或設備接觸。
材料：除非另作說明，否則所有有機溶劑和試劑（無水CH 2Cl 2、2-丙醇、丙酮、NMM和DBCO-胺）均購自Sigma Aldrich並直接使用。PyClocK購自Novabiochem®。15kDa、17kDa和20kDa Y-PEG-NHS試劑購自JenKem Technology USA並直接使用。DL-二硫蘇糖醇（DTT）購自Melford並且在使用前，在細胞培養級水（GE Healthcare）中製備0.1M溶液。用於緩衝液製備的材料來源於Thermo Fisher Scientific、Merck和Sigma-Aldrich並且直接使用。通過使用2M NaOH（VWR）調節pH，從DPBS（Sigma-Aldrich）製備PBS，pH 7.4。所有其它材料購自VWR、Sigma-Aldrich、GE Healthcare、Thermo Fisher Scientific、Corning、Hoeywell、Merck或Cytiva並直接使用。
製劑緩衝液：10mM乙酸鈉，pH 4.5、使用0.5M硼酸鈉pH 9.8將pH調節至9.1的5%的海藻糖。
除非另外說明，否則在這些實施例中提及的所有前體聚合試劑是可商購的。IL-2（“rIL-2”）的凍乾粉末對應於SEQ ID No：1所示的胺基酸序列。
基於IL-2的量計算IL-2-PEG綴合物的品質和摩爾量。
SDS-PAGE分析
通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析樣品。製備樣品，加樣至凝膠並如生產商所述，實施電泳。
尺寸排阻色譜
將尺寸排阻色譜法用於純化所製備的PEG-rIL-2綴合物。純化方法的詳細情況如下所述。
RP-HPLC分析
通過在HPLC系統上實施的反相色譜法（RP-HPLC）分析來分析樣品。使用ACE Excel 2superC18柱（尺寸：75×2.1mm id，顆粒尺寸2μm），在Dionex 2 UPLC系統上實施分析型RP-HPLC分析。使用在10min內0-100%緩衝液B（99.95% MeCN，0.05% TFA）在緩衝液A（94.95% H 2O，5.0% MeCN，0.05% TFA）中的線性梯度，流速0.8mL/min。樣品載入量為10µg。
實施例1
7-疊氮基-1-((4-氟苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（8）
Figure 02_image322
6-疊氮基己-1-醇（2）的製備：
向6-氯代己-1-醇（75g，0.549mol，1.0eq）在H 2O（750mL）中的溶液中添加NaN 3（97.5g，1.50mol，2.73eq）。將混合物在105℃攪拌16h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，用乙酸乙酯萃取混合物。用無水Na 2SO 4乾燥有機層並減壓濃縮以提供粗化合物2（75g，95%）。
6-疊氮基己醛（3）的製備：
在0℃，分3個部分向化合物2（75g，0.523mol，1.0eq）、TEMPO（817mg，5.23mmol，0.01eq）和NaHCO 3（52.7g，0.628mol，1.2eq）在DCM/H 2O（750ml/75ml）中的溶液中添加TCCA（45g，0.194mol，0.37eq）。將混合物在0℃攪拌0.5h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，過濾混合物並用水稀釋。用無水Na 2SO 4乾燥有機層並減壓濃縮以提供粗化合物3（70g，94%）。
(4-氟苯基)(甲基)硫烷（5）的製備：
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物4（30g，0.234mol，1.0eq）在DMF（250ml）中的溶液中添加MeI（40g，0.281mol，1.2eq）和K 2CO 3（97g，0.702mol，3.0eq）。將混合物在室溫下攪拌4h。反應混合物的TLC分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取。用5% LiCl（aq.）清洗有機層，用無水Na 2SO 4乾燥並減壓濃縮以提供粗化合物5（45g，100%）。
1-氟-4-(甲基磺醯基)苯（6）的製備：
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物5（45g，0.317mol，1.0eq）在THF/H 2O（450ml/450ml）中的溶液中添加過硫酸氫鉀製劑（oxone）（487g，0.792mol，2.5eq）。將混合物在室溫下攪拌16h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，過濾混合物，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取。用鹽水清洗有機層，用無水Na 2SO 4乾燥並減壓濃縮以提供粗化合物6（35g，63%）。
7-疊氮基-1-((4-氟苯基)磺醯基)庚烷-2-醇（7）的製備：
在-78℃，向化合物6（20g，0.115mol，1.0eq）在無水THF（200mL）中的溶液中滴加n-BuLi（2.5M在己烷中的溶液，60ml，0.149mol，1.3eq）。除去冷卻浴並使混合物加熱至0℃。在攪拌30min後，在-78℃添加化合物3（21g，0.149mol，1.3eq）。在攪拌15min後，使所述混合物加熱。然後，將所述混合物添加至NH 4Cl的飽和水溶液（混合物變透明）並用乙酸乙酯萃取。用無水Na 2SO 4乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供化合物7（26g，71%）。
7-疊氮基-1-((4-氟苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（8）的製備
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物7（15g，47.62mmol，1.0eq）和三光氣（24g，80.95mmol，1.7eq）在無水THF（200mL）中的攪拌溶液中滴加吡啶（7.5g，95.24mmol，2.0eq）。在攪拌10min後，過濾混合物並減壓濃縮。將殘餘物溶於無水THF（100mL）並依次用NHS（16.4g，0.143mol，3.0eq）和吡啶（11.3g，0.143mmol，3.0eq）處理。在攪拌10min後，減壓濃縮混合物。將殘餘物溶於乙酸乙酯（100mL）並用0.1N HCl、水、飽和的NaHCO 3水溶液和鹽水清洗。用無水Na 2SO 4乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供固體狀的化合物8（12g，55%）。 1H NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ7.95-7.92 (m, 2H), 7.46 (t, J= 8.8 Hz, 2H), 5.10-5.09 (m, 1H), 4.04-3.97 (m, 1H), 3.84 (dd, J= 15.2, 2.0 Hz, 1H), 3.27-3.24 (m, 2H), 2.77 (s, 4H), 1.65-1.64 (m, 2H), 1.44-1.42 (m, 2H), 1.23-1.22 (m, 4H)。
實施例2
7-疊氮基-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（13）
Figure 02_image324
甲基(4-(三氟甲基)苯基)硫烷（10）的製備：
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物9（24.5g，0.138mol，1.0eq）在DMF（200mL）中的溶液中添加MeI（23.4g，0.165mol，1.2eq）和K 2CO 3（57g，0.413mol，3.0eq）。將混合物在室溫下攪拌4h。反應混合物的TLC分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取。用5% LiCl（aq.）清洗有機層，用無水Na 2SO 4乾燥並減壓濃縮以提供粗化合物10（24g，90%）。
1-(甲基磺醯基)-4-(三氟甲基)苯（11）的製備：
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物10（24g，0.125mol，1.0eq）在THF/H 2O（200ml/200ml）中的溶液中添加過硫酸氫鉀製劑（171g，0.264mol，2.1eq）。將混合物在室溫下攪拌16h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，過濾混合物，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取。用鹽水清洗有機層，用無水Na 2SO 4乾燥並減壓濃縮以提供粗化合物11（30.6g，100%）。
7-疊氮基-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-醇（12）的製備：
在-78℃，向化合物11（15g，66.96mmol，1.0eq）在無水THF（150ml）中的溶液中滴加n-BuLi（2.5M在己烷中的溶液，35ml，87.05mmol，1.3eq）。除去冷卻浴並使混合物加熱至0℃。在攪拌30min後，在-78℃添加化合物3（12.5g，87.05mmol，1.3eq）。在攪拌15min後，使所述混合物加熱。然後，將所述混合物添加至NH 4Cl的飽和水溶液（混合物變透明）並用乙酸乙酯萃取。用無水Na 2SO 4乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供不純的化合物12（19g，77%）。
7-疊氮基-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（13）的製備
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物12（19g，52.05mmol，1.0eq）和三光氣（26.3g，88.49mmol，1.7eq）在無水THF（200mL）中的攪拌溶液中滴加吡啶（8ml，0.104mol，2.0eq）。在攪拌10min後，過濾混合物並減壓濃縮。將殘餘物溶於無水THF（100mL）並依次用NHS（17.95g，0.156mol，3.0eq）和吡啶（12.5mL，0.156mmol，3.0eq）處理。在攪拌10min後，減壓濃縮混合物。將殘餘物溶於乙酸乙酯（100mL）並用0.1N HCl、水、飽和的NaHCO 3水溶液和鹽水清洗。用無水Na 2SO 4乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供固體狀的化合物13（12.5g，47%）。 1H NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ8.10 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 8.01 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 5.16-5.15 (m, 1H), 4.16-4.09 (m, 1H), 3.95-3.92 (m, 1H), 3.26 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.77 (s, 4H), 1.66-1.65 (m, 2H), 1.44-1.42 (m, 2H), 1.24-1.23 (m, 4H)。
實施例3
7-疊氮基-1-((4-氯苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（18）
Figure 02_image326
(4-氯苯基)(甲基)硫烷（15）的製備：
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物14（30g，0.207mol，1.0eq）在DMF（250ml）中的溶液中添加MeI（35.3g，0.249mol，1.2eq）和K 2CO 3（85.8g，0.622mol，3.0eq）。將混合物在室溫下攪拌4h。反應混合物的TLC分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取。用5% LiCl（aq.）清洗有機層，用無水Na 2SO 4乾燥並減壓濃縮以提供橙色油狀的粗化合物15（44g，100%）。TLC：PE: EA=10:1，R f (14)=0.5，R f (15)=0.7。
1-氯-4-(甲基磺醯基)苯（16）的製備：
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物15（60g，0.380mol，1.0eq）在THF/H 2O（400mL/400mL）中的溶液中添加過硫酸氫鉀製劑（583g，0.948mol，2.5eq）。將混合物在室溫下攪拌16h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，過濾混合物，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取。用鹽水清洗有機層，用無水Na 2SO 4乾燥並減壓濃縮以提供白色固體狀的粗化合物16（57.8g，80%）。
7-疊氮基-1-((4-氯苯基)磺醯基)庚烷-2-醇（17）的製備：
在-78℃，向化合物16（20g，0.105mol，1.0eq）在無水THF（300mL）中的溶液中滴加n-BuLi（2.5M在己烷中的溶液，55mL，0.137mol，1.3eq）。除去冷卻浴並使混合物加熱至0℃。在攪拌30min後，在-78℃添加化合物3（19g，0.137mol，1.3eq）。在攪拌15min後，使所述混合物加熱。然後，將所述混合物添加至NH 4Cl的飽和水溶液（混合物變透明）並用乙酸乙酯萃取。用無水Na 2SO 4乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供黃色固體狀的化合物17（26g，74%）。
7-疊氮基-1-((4-氯苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（18）的製備：
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物17（31g，93.42mmol，1.0eq）和三光氣（47g，0.159mol，1.7eq）在無水THF（500mL）中的攪拌溶液中滴加吡啶（15mL，0.187mol，2.0eq）。在攪拌10min後，過濾混合物並減壓濃縮。將殘餘物溶於無水THF（500mL）並依次用NHS（32g，0.280mol，3.0eq）和吡啶（22mL，0.280mmol，3.0eq）處理。在攪拌10min後，減壓濃縮混合物。將殘餘物溶於乙酸乙酯（300mL）並用0.1N HCl、水、飽和的NaHCO 3水溶液和鹽水清洗。用無水Na 2SO 4乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供固體狀的化合物18（26g，59%）。 1H NMR (400 MHz, d 6-DMSO) δ7.87 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.69 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 5.11-5.10 (m, 1H), 4.06-4.00 (m, 1H), 3.86 (dd, J= 15.6, 2.4 Hz, 1H), 3.26 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.77 (s, 4H), 1.66-1.62 (m, 2H), 1.45-1.42 (m, 2H), 1.23-1.22 (m, 4H)。
實施例4
7-疊氮基-1-((2,4-二氟苯)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（19）
Figure 02_image328
以與實施例1類似的製備程式，使用2,4-二氟苯硫酚製備實施例4。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ8.01 – 7.94 (m, 1H), 7.12 – 7.05 (m, 1H), 7.05 – 6.97 (m, 1H), 5.24 (d, J= 6.6 Hz, 1H), 3.78 (dd, J= 15.2, 8.4 Hz, 1H), 3.46 (dd, J= 15.2, 3.4 Hz, 1H), 3.26 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.80 (s, 4H), 1.79 (s, 2H), 1.63 – 1.56 (m, 2H), 1.43 – 1.33 (m, 4H)。
實施例5
7-疊氮基-1-((4-氟-2-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（20）
Figure 02_image330
以與實施例1類似的製備程式，使用4-氟-2-(三氟甲基)苯硫酚製備實施例5。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ8.31 (dd, J= 8.8, 5.2 Hz, 1H), 7.60 (dd, J= 8.8, 2.6 Hz, 1H), 7.54 – 7.46 (m, 1H), 5.36 – 5.26 (m, 1H), 3.79 (dd, J= 15.2, 8.8 Hz, 1H), 3.47 (dd, J= 15.2, 3.2 Hz, 1H), 3.25 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.81 (s, 4H), 1.83 – 1.70 (m, 2H), 1.61 – 1.52 (m, 2H), 1.45 – 1.34 (m, 4H)。
實施例6
(2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（24）
Figure 02_image332
N2,N7-雙(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9-(羥甲基)-9H-芴-2,7-二甲醯胺（23）的製備：
將9-(羥甲基)-9H-芴-2,7-二羧酸（82.5mg，0.24mmol）溶於無水吡啶（1.0ml）並在rt下向所述溶液中添加HATU（273.8mg，0.72mmol）和2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺（117.1mg，0.54mmol）。然後，將反應攪拌2hr。用HPLC，以0-70% MeCN/H 2O（具有0.1%甲酸）純化產物以提供化合物23（47.4mg，30%）。LCMS：m/z 685 (M+1) +。
(2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（24）的製備：
將化合物23（47.4mg，0.069mmol）溶於DCM（0.2ml）並在rt，在N 2下用DSC（35.47mg，0.14mmol）和吡啶（16.7µL，0.21mmol）處理。將反應攪拌1.5hr，然後用DCM稀釋並用1N HCl和鹽水清洗。用Na 2SO 4乾燥有機相並濃縮。用HPLC，以MeCN/H 2O（具有0.1% TFA）純化殘餘物以提供所期望的產物24（31.7mg，56%，淺黃色油）。LCMS：m/z 826 (M+1) +。
實施例7
(2-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（31）
Figure 02_image334
甲基9H-芴-2-羧酸酯（26）的製備：
將化合物25、2-溴-9H-芴（128g，522mmol）、三乙胺TEA（106g，1.04mol，145ml）和Pd(dppf)Cl 2（38.2g，52.2mmol）在MeOH（890ml）中的混合物脫氣並用CO（50Psi）吹掃3次，然後在80℃，在N 2氣氛下，將混合物攪拌5hr。TLC（石油醚/乙酸乙酯=10/1）顯示形成新的斑點（R f=0.42）。通過柱色譜法（SiO 2，石油醚/乙酸乙酯=100/1至10/1）純化殘餘物以提供白色固體狀的化合物26（120g，粗產物）。
9H-芴-2-羧酸（27）的製備：
向化合物26（120g，535mmol）在MeOH（840ml）中的混合物中添加NaOH（2M），然後將混合物在20℃，在N 2氣氛下攪拌5hr。TLC（石油醚/乙酸乙酯=10/1）顯示起始材料完全消耗並且形成新的斑點（R f=0.01）。向所述溶液中加入水（50mL），然後將其用EtOAc（100mL）萃取。用3M HCl將水相調節至pH 3，然後將其用EtOAc（100mL）萃取。減壓濃縮有機相以提供黃色固體狀的化合物27（40.0g，190mmol，35.6%得率）。
9-甲醯基-9H-芴-2-羧酸（28）的製備：
向化合物27（6.00g，28.5mmol）在DMF（196ml）中的混合物中緩慢添加甲酸乙酯（276g，3.73mol）和t-BuOK（25.6g，228mmol）。將混合物在45℃攪拌0.5hr，然後使其冷卻至25℃，2.5小時。TLC（石油醚/乙酸乙酯=0/1）顯示起始材料完全消耗並且形成新的斑點（R f=0.48）。用1M HCl將溶液調節至pH 3。然後，用EtOAc（50.0mL）萃取混合物。分離有機相，用Na 2SO 4乾燥，過濾，減壓濃縮以提供棕色固體狀的化合物28（7.00g，粗產物）。
9-(羥甲基)-9H-芴-2-羧酸（29）的製備：
向化合物28（7.00g，29.4mmol）在MeOH（42.0ml）中的混合物中添加NaBH 4（2.78g，73.5mmol）。對反應混合物脫氣並用N 2吹掃3次，然後在N 2氣氛下，將混合物在25℃攪拌16hr。LCMS（產物：RT=0.863min）顯示所期望的化合物的MS。向所述溶液中加入水（120mL），然後將其用EtOAc（100mL）萃取。用1M HCl將水相調節至pH 3，然後將其用EtOAc（100mL）萃取。分離有機相，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供黃色固體狀的化合物29（4.00g，16.7mmol，56.7%得率）。
N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9-(羥甲基)-9H-芴-2-羧醯胺（30）的製備：
在25℃，向化合物29（1.00g，4.16mmol）和2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺（908mg，4.16mmol）在DMF（7.00ml）中的溶液中添加HOBt（619mg，4.58mmol）、EDCl（878mg，4.58mmol）和DIPEA（1.24g，9.57mmol）。將混合物在25℃攪拌12hr。LCMS（產物：RT=1.002min）顯示起始材料完全消耗。用水（10.0mL）稀釋反應混合物，用EtOAc（10.0mL×2）萃取。用水（10.0mL×2）和鹽水（10.0mL）清洗合併的有機相。分離有機相，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC（柱：Welch Xtimate C18 250*50mm*10um；流動相：[水（10mM NH 4HCO 3）-ACN]；B%：18%-48%，26min）純化殘餘物以提供黃色油狀的化合物30（1.40g，3.17mmol，76.2%得率，99.8%純度）。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3): δ8.10 (s, 1H), 7.88 - 7.76 (m, 3H), 7.63 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.46 - 7.34 (m, 2H), 6.98 (s, 1H), 4.18 - 4.08 (m, 2H), 4.02 - 3.92 (m, 1H), 3.76 - 3.56 (m, 14H), 3.32 (t, J= 5.2 Hz, 2H), 2.37 (s, 1H)；LC-MS：m/z 441.1 (M+1) +。
(2-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（31）的製備：
將1-羥基吡咯烷-2,5-二酮（0.5g，1eq）在DCM（5ml）中的溶液冷卻至-30℃。向該溶液中滴加氯甲酸三氯甲酯（860mg，1eq），隨後在-30℃滴加DIPEA（561mg，1eq）。將混合物加熱到0℃並攪拌3hr。將其加熱至25℃並繼續攪拌6小時。TLC（石油醚/乙酸乙酯=0/1，R f=0.3）顯示起始材料完全消耗。過濾反應混合物以提供濾液（2,5-二氧代吡咯烷-1-基氯甲酸酯的DCM溶液），其直接使用而未進一步純化。
在0℃，向化合物30（0.1g，1eq）和Py（17.96mg，1eq）中DCM（1ml）中的溶液中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基氯甲酸酯（10eq，來自先前步驟的DCM溶液）。將混合物在25℃攪拌12hr。LCMS（起始材料：RT=0.992min，產物：RT=1.059min）顯示剩餘3.71%的起始材料並且檢測到40.2%的所期望的化合物。通過水（2.0mL）使反應淬滅，然後用飽和的檸檬酸水溶液將pH調節至6。用DCM萃取混合物（2mL×2）。用鹽水（5.0ml）清洗合併的有機層，然後用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC（柱：Welch Ultimate AQ-C18 150*30mm*5um；流動相：[水（0.1%TFA）-ACN]；B%：30%-60%，12min）純化殘餘物。在製備-HPLC純化之後，將餾分冷凍乾燥以提供無色油狀的化合物31。LC-MS：m/z 582.2 (M+1) +。
實施例8
(2-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-7-氟-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（39）
Figure 02_image336
2-氟-7-碘-9H-芴（33）的製備：
對2-氟-9H-芴32（24.4g，132mmol）、I 2（14.1g，55.6mmol）和KIO 3（7.08g，33.1mmol）在CH 3COOH（408ml）、H 2SO 4（9.60ml）和H 2O（19.2ml）中的混合物脫氣並用N 2吹掃3次。將混合物在N 2氣氛下，在80℃攪拌5hr。HPLC（產物：RT=3.515min）顯示檢測到所期望的化合物。用EtOAc（50.0mL）萃取水溶液。用H 2O（20.0mL）、鹽水（10.0mL）清洗有機層，分離，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供棕色固體狀的化合物33（38.0g，123mmol，92.6%得率）。 1H NMR (400 MHz, MeOD): 7.87 (s, 1H), 7.70-7.67 (m, 2H), 7.48-7.46 (m, 1H), 7.27-7.22 (m, 1H), 7.17-7.09 (m, 1H), 3.86 (s, 2H)。
甲基7-氟-9H-芴-2-羧酸酯（34）的製備：
對化合物33（38.0g，123mmol）、TEA（31.0g，306mmol）、Pd(dppf)Cl 2（8.97g，12.3mmol）在MeOH（200mL）中的混合物脫氣並用CO（50Psi）吹掃3次。將混合物在CO氣氛下，在80℃攪拌24hr。TLC（石油醚/乙酸乙酯=100/1）顯示起始材料完全消耗並且形成新的斑點（R f=0.40）。減壓濃縮溶液以提供棕色固體狀的化合物34（40.0g，粗產物）。
7-氟-9H-芴-2-羧酸（35）的製備：
向化合物34（40.0g，165mmol）在MeOH（280mL）中的混合物中添加NaOH（2M，206mL，2.5eq）水溶液。將反應混合物在100℃，在N 2氣氛下攪拌2hr。TLC（石油醚/乙酸乙酯=0/1）顯示起始材料完全消耗並且形成新的斑點（R f=0.03）。向反應溶液添加H 2O（150mL）。然後，用EtOAc（250mL）萃取。分離水層，並且用1M HCl調節pH至3。用EtOAc（200mL）萃取。用鹽水（20.0mL）清洗有機層，分離，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供棕色固體狀的化合物35（33.0g，145mmol，87.6%得率）。
7-氟-9-甲醯基-9H-芴-2-羧酸（36）的製備：
向化合物35（33.0g，145mmol）在DMF（210mL）中的混合物中添加甲酸乙酯（507g，6.84mol）。然後，緩慢添加t-BuOK（130g，1.16mol）。將混合物在45℃攪拌0.5hr，然後使混合物冷卻至25℃，2.5小時。LCMS（產物：RT=0.889）顯示檢測到所期望的化合物。向反應溶液中加入水（150mL），並用EtOAc（500mL）萃取。用1M HCl將水相調節至pH 3，然後將其用EtOAc（500mL）萃取。用鹽水（120mL）清洗有機層，分離，用Na 2SO 4乾燥，過濾，減壓濃縮以提供黃色固體狀的化合物36（30.0g，粗產物）。
7-氟-9-(羥甲基)-9H-芴-2-羧酸（37）的製備：
向化合物36（30.0g，117mmol）在MeOH（210mL）中的混合物中添加NaBH 4（31.0g，820mmol），然後將混合物在25℃，在N 2氣氛下攪拌24hr。LCMS（產物：RT=0.906min）顯示檢測到所期望的化合物。向反應溶液中加入水（150mL），並用EtOAc（450mL）萃取。用1M HCl將水相調節至pH 3。然後，用EtOAc（300mL）萃取。用鹽水（120mL）清洗有機層，分離，用Na 2SO 4乾燥，過濾，減壓濃縮以提供黃色固體狀的化合物37（35.0g，粗產物）。
N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-7-氟-9-(羥甲基)-9H-芴-2-羧醯胺（38）的製備：
將化合物37（2.00g，7.74mmol）、HOBt（1.15g，8.52mmol）、EDCl（1.63g，8.52mmol）和DIPEA（2.50g，19.4mmol）在DMF（14.0ml）中的混合物在25℃攪拌0.5hr。然後，向所述混合物添加2-[2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙胺（1.86g，8.52mmol）。將反應混合物在25℃攪拌3hr。LCMS（產物：RT=1.171min）顯示檢測到所期望的化合物。用水（20mL）稀釋反應溶液，並用EtOAc（20mL）萃取。用鹽水（20.0mL）清洗有機層，分離，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC（柱：Phenomenex luna c18 250mm*100mm*10um；流動相：[水（0.1%TFA）-ACN]；B%：15%-53%，25min）純化粗產物以提供黃色油狀的化合物38（1.00g，2.12mmol，48.7%得率，97.4%純度）。 1H NMR: (400 MHz CDCl 3): δ8.07 (s, 1H), 7.85 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 7.76 - 7.70 (m, 2H), 7.35 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.39 - 7.31 (m, 1H), 7.18 - 7.08 (m, 1H), 7.02 (s, 1H), 4.16 - 3.96 (m, 3H), 3.76 - 3.56 (m, 14H), 3.33 (t, J= 4.8 Hz, 2H)；LC-MS：m/z 459.1 (M+1) +。
(2-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（39）的製備：
在0℃，向化合物38（0.1g，1eq）在DCM（1mL）中的溶液中添加化合物2,5-二氧代吡咯烷-1-基氯甲酸酯（10eq，DCM溶液）。將反應混合物在25℃攪拌12hr。LCMS（起始材料：RT=1.026min，產物：RT=1.084min）顯示剩餘6.33%的起始材料並且檢測到28.3%的所期望的化合物。用飽和檸檬酸水溶液將反應混合物調節至pH 6。用DCM（2mL×2）萃取混合物。用鹽水（5.0ml）清洗合併的有機層，分離，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC（柱：Phenomenex Luna C18 200*40mm*10um；流動相：[水（0.1%TFA）-ACN]；B%：25%-55%，10min）純化殘餘物。在製備-HPLC純化之後，將溶液冷凍乾燥以提供無色油狀的化合物39。LC-MS：m/z 600.2 (M+1) +。
實施例9
2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(2-((((2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)甘胺酸鹽（44）
Figure 02_image338
叔丁基N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(2-氨乙基)甘胺酸酯（41）的製備：
在室溫下，向叔丁基N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙基)甘胺酸酯40（75.0mg，0.19mmol，1.0eq）在乙酸乙酯（0.6ml）中的溶液中添加Pd/C（40mg，10%，乾）。用H 2對反應混合物置換3次。然後，將混合物在H 2下，在室溫下攪拌2h。通過 1H NMR和TLC監測反應。（PE:EA=1:1）化合物40：R f=0.3；化合物41：R f=0.05。通過矽藻土墊過濾反應溶液。濃縮有機層以提供淺黃色油狀的產物41（48.4mg，98%）。
N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(2-((((2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)-乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)甘胺酸（43）的製備：
將如上製備的化合物41在EtOAc（0.6mL）中再溶解。向其中添加化合物24（161.0mg，0.19mmol）在DCM（1mL）中的溶液，然後添加吡啶（20μL）。將反應在RT下攪拌1h，並用LCMS監測。向反應加入EtOAc（5mL）並用1N HCl（2mL）清洗，用Na 2SO 4乾燥有機相並過濾。然後，真空除去溶劑。
向粗產物42添加HCO 2H（4mL）並加熱至60℃，3h。用HPLC，以10-100% MeCN/H 2O（0.1% TFA）純化產物以獲得所期望的化合物43（31.4mg，3步為18%）。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(2-乙醯氧基乙基)-N-(2-((((2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-氨基)乙基)甘胺酸酯（44）的製備：
將化合物43（9.7mg，0.011mmol）溶於DCM（0.037mL）並在0℃，用HOSu（2.56mg，0.022mmol）和DCC（4.54mg，0.022mmol）在DCM（0.04mL）中的溶液處理。將反應在rt攪拌過夜。過濾並濃縮反應。加入3-5倍體積的Et 2O，並且溶液變渾濁，並將渾濁溶液離心。將頂層透明溶液倒掉，並用Et 2O（2×）清洗底部油狀固體，並在高真空下乾燥以獲得化合物44（7.2mg，65%）。LCMS：1012 (M+1) +；HPLC 96% (UV254)； 1H NMR (300 MHz, 氯仿-d) δ8.09 (p, J= 0.7 Hz, 2H), 7.84 (td, J= 8.3, 1.1 Hz, 4H), 6.92 (s, 3H), 4.43 (d, J= 6.9 Hz, 2H), 4.31 (m, 1H), 4.16 (t, J= 5.3 Hz, 2H), 3.81 (s, 2H), 3.79 – 3.55 (m, 47H), 3.38 – 3.24 (m, 8H), 3.00 – 2.78 (m, 11H), 2.01 (s, 3H)。
實施例10
1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（52）
Figure 02_image340
N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-(甲基磺醯基)苯甲醯胺(48）的製備：
向化合物47（1.0g，5.0mmol）在DMF（15mL）中的溶液中添加化合物22（1.3g，6.0mmol）、HATU（2.47g，6.5mmol）和TEA（1.01g，10.0mmol）。將反應混合物在室溫下攪拌16h。濃縮反應混合物並用乙酸乙酯和水溶解。用乙酸乙酯萃取混合物（3×20mL）。用鹽水清洗合併的有機物，用硫酸鈉乾燥，過濾並通過旋轉蒸發濃縮。通過柱色譜法純化所得殘餘物以提供黃色油狀的化合物48（900mg）。
N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-((2-羥基-5-甲氧基戊基)磺醯基)苯甲醯胺(50）的製備：
在-78℃，在N 2下，向化合物48（400mg，1mmol）和化合物49（560mg，5.5mmol）在無水THF（30ml）中的溶液中緩慢添加KHMDS（5.5ml，5.5mmol）。將反應混合物在-78℃攪拌2h。通過飽和NH 4Cl水溶液使反應混合物淬滅。用乙酸乙酯萃取混合物（3×20mL）。用鹽水清洗合併的有機物，用硫酸鈉乾燥，過濾並通過旋轉蒸發濃縮。通過2% CH 3OH在CH 2Cl 2中的溶液洗脫，通過柱色譜法純化所得殘餘物以提供黃色油狀的化合物50（168mg）。
1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-氨基甲醯基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（51）的製備：
向化合物50（100mg，0.2mmol）和三光氣（89mg，0.3mmol）在無水THF（5ml）中的溶液中緩慢添加吡啶（64mg，0.8mmol）。將反應混合物在rt.攪拌20min。然後，將其通過旋轉蒸發過濾並濃縮。在下一步中使用所得殘餘物。
向所得殘餘物（117mg，0.2mmol）和HOSu（69mg，0.6mmol）在無水THF（5mL）中的溶液中緩慢添加吡啶（64mg，0.8mmol）。將反應混合物在rt下攪拌30min。用乙酸乙酯萃取混合物（3×10mL）。用鹽水清洗合併的有機物，用硫酸鈉乾燥，過濾並通過旋轉蒸發濃縮。通過製備型TLC純化所得殘餘物（CH 2Cl 2：CH 3OH=30：1）以提供無色油狀的化合物51（55mg）。
LCMS：m/z 644.25 [M+1]。
1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.32 (s, 1H), 8.18 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 8.04 (d, J= 7.7 Hz, 1H), 7.68 (t, J= 8.0 Hz, 1H), 7.37 (br s, 1H), 5.30 – 5.24 (m, 1H), 3.77 – 3.55 (m, 15H), 3.45 – 3.31 (m, 5H), 3.27 (s, 3H), 2.81 (s, 4H), 1.94 – 1.78 (m, 2H), 1.66 – 1.58 (m, 2H).
實施例11
1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（61）
Figure 02_image342
甲基5-((4-甲氧苯甲基)硫基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯（54）的製備：
將化合物52（5.0g，17.66mmol，1.0eq）、化合物53（4.09g，26.5mmol，1.5eq）、Pd 2(dba) 3（1.62g，1.76mmol，0.1eq）、Xant-phose（2.04g，3.52mmol，0.2eq）和DIEA（6.84g，52.99mol，3.0eq）在二惡烷（50mL）中的溶液在80℃攪拌2hr。將所得混合物冷卻至rt並通過矽藻土墊過濾。濃縮濾液並將殘餘物溶於EtOAc（100mL）。用水（100mL）清洗混合物並用EtOAc（100ml×3）萃取，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上純化殘餘物（PE/EA=100/1至80/1至50/1）以提供淡黃色油狀的化合物54（6.2g，98%）。
TLC：PE/EA=10/1，UV，R f（化合物52）=0.80，R f（化合物54）=0.60。
LC-MS：379.10 [M+23] +。
甲基5-巰基-2-(三氟甲基)苯甲酸酯（55）的製備：
通過微波，在120℃運行化合物54（1.0g，2.80mmol，1.0eq）和TES（0.98g，8.42mmol，3.0eq）在TFA（15ml）中的溶液1hr。將所得混合物減壓濃縮。將殘餘物倒入冰-水（20mL）中並通過碳酸氫鈉水溶液將混合物調節至pH=7～8。通過EtOAc（30mL×3）萃取混合物，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供灰色油狀的化合物55（800mg），將其直接在下一步中使用而未進一步純化。
TLC：PE/EA=5:1，UV，R f（化合物54）=0.80，R f（化合物55）=0.30。
甲基5-(甲硫基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯（56）的製備：
在0℃，向化合物55（4.8g，20.32mmol，1.0eq）在MeCN（50mL）中的溶液中滴加K 2CO 3（8.5g，60.96mmol，3.0eq）和CH 3I（14.4g，101.6mmol，5.0eq）。將反應混合物在室溫下攪拌16hr。向所得混合物加入水並通過EtOAc（50mL×3）萃取，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠（PE）上純化殘餘物以提供黃色固體狀的化合物56（4.0g，78%）。
TLC：PE/EA=5:1，UV，R f（化合物55）=0.30，R f（化合物56）=0.85。
LC-MS：251.00 [M+1] +。
甲基5-(甲基磺醯基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯（57）的製備：
在0℃，向化合物56（4.7g，18.78mmol，1.0eq）在DCM（50mL）中的溶液中分部分添加m-CPBA（19.5g，112.68mmol，6.0eq）。將反應混合物在rt下攪拌16hr。通過碳酸氫鈉溶液使反應混合物淬滅。通過DCM（50mL×3）萃取混合物，用NaCl溶液（100mL×3）清洗，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上純化殘餘物（PE/EA=100/1至50/1至20/1至10/1）以提供白色固體狀的化合物57（2.97g，56%）。
TLC：PE/EA=5:1，UV，R f（化合物56）=0.85，R f（化合物57）=0.10。
甲基5-((2-羥基-5-甲氧基戊基)磺醯基)-2-(三氟甲基)苯甲酸酯（58）的製備：
在-78℃，向化合物57（0.9g，3.543mmol，1.0eq）和4-甲氧基丁醛（0.724mg，7.086mmol，2.0eq）在THF（10ml）中的溶液中滴加KHMDS（5.4ml，5.315mmol，1.5eq），將反應混合物在-78℃攪拌2小時。在0℃，通過NH 4Cl水溶液使反應淬滅，並通過EtOAc（30ml×3）萃取。用飽和NaCl溶液（100mL×3）清洗有機相，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上純化殘餘物（PE/EA=20/1至5/1至2/1）以提供黃色油狀的化合物58（520mg，40%）。
TLC：PE/EA=2:1，UV，R f（化合物57）=0.60，R f（化合物58）=0.20。
LC-MS：385.10 [M+1] +。
5-((2-羥基-5-甲氧基戊基)磺醯基)-2-(三氟甲基)苯甲酸（59）的製備：
在0℃，向化合物58（510mg，1.327mmol，1.0eq）在MeOH/THF=1/1（6ml）中的溶液中滴加5% LiOH（63.6mg，2.654mmol，2.0eq）。將反應混合物在rt下攪拌2hr。用1N HCl將反應混合物調節至pH 2。通過EtOAc（20ml×3）萃取混合物，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供黃色油狀的化合物59（505mg，粗產物，100%）。
LC-MS：393.10 [M+23] +。
N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((2-羥基-5-甲氧基戊基)磺醯基)-2-(三氟甲基)苯甲醯胺（60）的製備
將化合物59（1.0g，3.24mmol，1.0eq）、化合物22（0.849g，3.89mmol，1.2eq）、HATU（1.6g，4.21mmol，1.3eq）和TEA（0.982g，9.72mol，3.0eq）在DMF（12ml）中的溶液在rt下攪拌16hr。向反應混合物加入水（50mL）並通過乙酸乙酯萃取（30ml×3）。用NaCl的水溶液（50mL×3）清洗有機相，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上（PE/EA=20/1至10/1至5/1至2/1至1/1）並通過製備型TLC純化殘餘物以提供淡黃色油狀的化合物60（520mg，34%）。
LC-MS：571.35 [M+1] +。
1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（61）的製備
在0℃，向化合物60（0.3g，0.5258mmol，1.0eq）在THF（3ml）中的溶液中分部分添加吡啶（0.166g，2.103mmol，4.0eq）和三光氣（0.39g，1.3145mmol，2.5eq）。將混合物在rt攪拌30min。將反應混合物過濾並減壓濃縮。將殘餘物溶於THF（3mL）。在0℃，向混合物分部分添加吡啶（0.166g，2.103mmol，4.0eq）和HOSU（0.182g，1.5774mmol，3.0eq）。將混合物在rt攪拌1hr。在0℃，用水使反應混合物淬滅，並通過EtOAc（20mL×3）萃取。用Na 2SO 4乾燥有機相，過濾並減壓濃縮。通過製備-HPLC（0.1% HCOOH）純化殘餘物。用EtOAc萃取洗脫溶液。用Na 2SO 4乾燥有機相，過濾並減壓濃縮以提供無色油狀的化合物61（150mg，40%）。
LC-MS：712.35[M+1] +。
1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.11 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 7.94 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.94 (s, 1H), 5.31 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 3.65 (d, J = 6.3 Hz, 8H), 3.59 (q, J = 5.0 Hz, 6H), 3.36 (dt, J = 18.4, 5.4 Hz, 4H), 3.29 (d, J = 1.0 Hz, 3H), 2.83 (s, 4H), 1.90 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.65 (d, J = 8.5 Hz, 2H).
實施例12
1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-4-氯苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（68）
Figure 02_image344
甲基2-氯-5-(甲硫基)苯甲酸酯（63）的製備
在RT，向化合物62（10.0g，49.53mmol，1.0eq）、CH 3I（7.73g，54.48mmol，1.1eq）的溶液中添加K 2CO 3（7.5g，54.48mmol，1.1eq）。將反應混合物在rt下攪拌3hr。向所得混合物中加入水（200mL）和EtOAc（200mL）。分離有機層，用5% LiCl水溶液清洗5次，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供黃色油狀的化合物63（11.0g，粗產物）。
TLC：PE/EA=3/1，UV，R f（化合物62）=0.05，R f（化合物63）=0.85。
1HNMR (400 MHz, CD 3OD) δ 7.61 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 7.44 – 7.32 (m, 2H), 3.88 (s, 3H), 2.48 (s, 3H)。
甲基2-氯-5-(甲基磺醯基)苯甲酸酯（64）的製備
在0℃，向化合物63（6.0g，27.78mmol，1.0eq）在DCM（60mL）中的溶液中分部分添加m-CPBA（28.7g，166.67mmol，6.0eq）。將反應混合物在rt下攪拌16hr。通過碳酸氫鈉水溶液使反應混合物淬滅，用DCM萃取（100mL×3），用NaCl水溶液（100mL×3）清洗，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上（PE/EA=40/1至20/1至3/1）純化殘餘物以提供白色固體狀的化合物64（5.6g，81%）。
TLC：PE/EA=3/1，UV，R f（化合物63）=0.85，R f（化合物64）=0.45。
1HNMR (CD 3OD, 400 MHz) δ 8.39 (d, J= 2.4 Hz, 1H), 7.96 (dd, J= 8.4, 2.4 Hz, 1H), 7.66 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.07 (s, 3H).
2-氯-5-(甲基磺醯基)苯甲酸（65）的製備
在0℃，向化合物64（2.5g，1.327mmol，1.0eq）在MeOH/THF=1/1（6ml）中的溶液中滴加5% LiOH水溶液（63.6mg，2.654mmol，2.0eq）。將反應混合物在rt下攪拌2hr。用1N HCl將反應調節至pH=3-4，濃縮。通過EtOAc（20ml×3）萃取水相，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供淡黃色固體狀的化合物65（2.1g，粗產物）。
TLC：PE/EA=3:1，UV，R f（化合物64）=0.45，R f（化合物65）=0.05。
1HNMR (CD 3OD, 400 MHz) δ 8.36 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.02 (dd, J= 8.4, 2.3 Hz, 1H), 7.76 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 3.15 (s, 3H).
N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-氯-5-(甲基磺醯基)苯甲醯胺（66）的製備
將化合物65（879mg，3.74mmol，1.0eq）、化合物22（900mg，4.12mmol，1.1eq）、HATU（1.85g，4.87mmol，1.3eq）和TEA（1.14g，11.24mol，3.0eq）在DMF（8ml）中的混懸液在rt下攪拌16hr。向反應混合物加入水（20mL）並通過乙酸乙酯（30mL×3）萃取，用NaCl水溶液（50mL×3）清洗，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上（PE/EA=100/1至10/1至5/1至2/1至1/1）純化殘餘物以提供無色油狀的化合物66（995mg，61%）。
TLC：PE/EA=0:1，UV，R f（化合物65）=0.25，R f（化合物66）=0.55。
1HNMR (CD 3OD, 400 MHz) δ 8.04–7.96 (m, 2H), 7.73 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 3.70–3.53 (m, 14H), 3.33 (s, 2H), 3.15 (s, 3H).
N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-氯-5-((2-羥基-5-甲氧基戊基)磺醯基)苯甲醯胺（67）的製備
在-78℃，向化合物66（700mg，1.609mmol，1.0eq）和4-甲氧基丁醛（657mg，6.44mmol，4.0eq）在THF（7ml）中的溶液中滴加KHMDS（5.4ml，5.315mmol，1.5eq）。將反應混合物在-78℃下攪拌2hr。在0℃，通過NH 4Cl水溶液使反應淬滅，通過乙酸乙酯（30mL×3）萃取，用NaCl水溶液（100mL×3）清洗，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠上（PE/EA=20/1至5/1至2/1）純化殘餘物以提供淡黃色油狀的化合物67（205mg，25%）。
TLC：PE/EA=0:1，UV，R f（化合物66）=0.55，R f（化合物67）=0.50。
1HNMR (CD 3OD, 400 MHz) δ 8.01–7.92 (m, 2H), 7.71 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 4.16–4.01 (m, 2H), 3.72–3.53 (m, 12H), 3.42–3.35 (m, 3H), 3.31–3.25 (m, 5H), 1.73–1.39 (m, 4H).
1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-4-氯苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（68）的製備
在0℃，向化合物67（200mg，0.372mmol，1.0eq）在THF（2mL）中的溶液中分部分添加吡啶（117.5mg，1.49mmol，4.0eq）和三光氣（221mg，0.744mmol，2.0eq）。將混合物在rt攪拌30min。將反應混合物過濾並減壓濃縮。將殘餘物溶於THF（3mL）。在0℃，向混合物分部分添加吡啶（117.5mg，1.49mmol，4.0eq）和HOSU（128mg，1.12mmol，3.0eq）。將混合物在rt攪拌1hr。在0℃，通過水使反應混合物淬滅，通過乙酸乙酯（20mL×3）萃取，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮。通過製備-HPLC（0.1% HCOOH）純化殘餘物並通過乙酸乙酯萃取，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供淺黃色油狀的化合物68（101mg，27%）。
TLC：PE/EA=0/1，UV，R f（化合物67）=0.50，R f（化合物68）=0.55。
LC-MS：678.25 [M+1] +。
1HNMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.09 (s, 1H), 7.94–7.86 (m, 1H), 7.64 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.00 (s, 1H), 5.29 (s, 1H), 3.74–3.52 (m, 15H), 3.44–3.31 (m, 5H), 3.28 (s, 3H), 2.82 (s, 4H), 1.87 (d, J= 7.4 Hz, 2H), 1.61 (s, 2H).
實施例13
7-((3-(2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-哢唑-9-基)丙基)氨基)-7-氧-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（82）
Figure 02_image346
Figure 02_image348
Figure 02_image350
Figure 02_image352
Figure 02_image354
Figure 02_image356
叔丁基6-羥基己酸酯（70）的製備
對化合物69（100g，876mmol）和t-BuOK（108g，964mmol）在t-BuOH（600ml）中的混合物脫氣並用N 2吹掃3次，然後將混合物在120℃，在N 2氣氛下攪拌2.5hr。TLC（板1，二氯甲烷/甲醇=10/1，化合物69，R f=0.60，化合物70 R f=0.50）表明化合物69完全消耗並且形成一個新斑點。根據TLC，反應是純淨的。將反應混合物在二氯甲烷（600mL）和水（1.20L）之間分配。分離有機相，用鹽水清洗（300ml），用無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物以提供黃色油狀的化合物70（127g，77.2%得率）並將其在未進一步純化的情況下在下一步中使用。
1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ ppm 3.66-3.63 (m, 2H), 2.25-2.21 (m, 2H), 1.66-1.57 (m, 5H), 1.44 (s, 9H), 1.40-1.39 (m, 2H).
叔丁基6-氧己酸酯（71）的製備
向化合物70（64.0g，340mmol）在DCM（400ml）中的溶液中添加Dess-Martin試劑（159g，374mmol，116ml）。將混合物在20℃攪拌2hr。TLC（板1，石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物70 R f=0.40，化合物71 R f=0.50）表明化合物70完全消耗。通過添加NaHCO 3水溶液（200mL）使反應混合物淬滅並用DCM萃取（100mL×3）。用鹽水（100mL）清洗合併的有機層，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過柱色譜法（SiO 2，石油醚/乙酸乙酯=10/1至1/1，板2，石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物71 R f=0.50）純化殘餘物以提供黃色油狀的化合物71（26.8g，42.3%得率）。
1H NMR: (400 MHz CDCl 3) δ ppm 2.44-2.21 (m, 4H), 1.65-1.60 (m, 4H), 1.43 (s, 9H).
叔丁基6-羥基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚酸酯（72）的製備
向化合物11（7.15g，31.9mmol）在THF（30.0ml）中的溶液中滴加n-BuLi（2.5M，11.60ml），將混合物在0℃攪拌30min。然後，在-78℃添加化合物71（5.40g，29.0mmol）在THF（5.00ml）中的溶液。將混合物在-78℃攪拌1.5hr。TLC（板1，石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物71 R f=0.70，化合物72 R f=0.40）表明化合物71完全消耗。通過添加NH 4Cl水溶液（50.0mL）使反應混合物淬滅，然後用EtOAc萃取（20.0mL×3）。用鹽水（30.0mL）清洗合併的有機層，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過柱色譜法（SiO 2，石油醚/乙酸乙酯=30/1至1/1，板2，石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物72 R f=0.40）純化殘餘物以提供黃色固體狀的化合物72（8.57g，72.0%得率）。
1H NMR: (400 MHz CDCl 3) δ ppm 8.10-8.08 (d, J= 8.4Hz, 2H), 7.88-7.86 (d, J= 8Hz, 2H), 4.21-4.20 (m, 1H), 3.31-3.16 (m, 3H), 2.23-2.18 (m, 2H), 1.61-1.35 (m, 15H).
6-羥基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚酸（73）的製備
將化合物72（1.00g，2.44mmol）加入到微波管中的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（15.0ml）中。將密封管在微波下在110℃加熱1hr。TLC（石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物72：R f=0.5，化合物73：R f=0.2）表明化合物72完全消耗。減壓濃縮該反應混合物以提供殘餘物。將粗產物直接用於下一步而未純化以提供黃色膠狀的化合物73（0.860g，2.43mmol，99.6%得率）。
1H NMR: (400 MHz DMSO) δ ppm 11.93 (s, 1H), 8.00-8.13 (m, 4H), 5.11-5.17 (m, 1H), 4.85 (d, J= 5.2 Hz, 1H), 3.90 (s, 1H), 3.43-3.48 (m, 2H), 2.16 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 1.33-1.46 (m, 6H).
二甲基2-硝基-[1,1'-聯苯]-4,4'-二羧酸酯（75）的製備
將化合物74（33.0g，122mmol）在H 2SO 4（330ml）中的溶液冷卻至-5℃，並且在1hr的一段時間內，在攪拌下滴加HNO 3（13.8g，127mmol，9.85ml，58%的純度）和H 2SO 4（22.8g，232mmol，12.4mL）的混合物，同時將溫度維持在-5-0℃。然後，將混合物在-5-0℃攪拌1hr。TLC（石油醚/乙酸乙酯=3/1，產物R f=0.50）顯示化合物74（R f=0.60）被消耗，形成了具有更大極性的主要的新斑點。用水（300mL）稀釋混合物，並用乙酸乙酯（50.0mL×2）萃取。用鹽水（50.0mL）和碳酸氫鈉溶液（100mL）清洗萃取物，用無水硫酸鈉乾燥並蒸發。通過柱色譜法（SiO 2，石油醚/乙酸乙酯=50/1至0/1）純化殘餘物以提供白色固體狀的化合物75（16.0g，50.6mmol，41.4%得率，99.6%純度）。
1H NMR: (400 MHz, CDCl 3) δ8.57 (s, 1H), 8.31 - 8.29 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 8.14 - 8.12 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.56 - 7.54 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.42 - 7.40 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.96 (s, 3H).
二甲基9H-哢唑-2,7-二羧酸酯（76）的製備
將化合物75（20g，63.4mmol）、PPh 3（41.6g，159mmol）在1,2-二氯苯（112ml）中的混合物在25℃脫氣並用N 2吹掃3次，然後將混合物在210℃，在N 2氣氛下攪拌1.5hr。TLC（石油醚/乙酸乙酯=1/1，化合物75：R f=0.43）顯示化合物75完全消耗並且形成了一個新的主要斑點。根據TLC，反應是純淨的。將反應冷卻至25℃，添加甲醇（200mL）。15min後，通過過濾收集所得固體混懸液以提供作為灰色固體獲得的化合物76（12.0g，42.4mmol，66.8%得率）。
1H NMR: (400 MHz, DMSO)δ 11.81 (s, 1H), 8.33 (d, J= 4.2 Hz, 2H), 8.17 (s, 2H), 7.82 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 3.91 (s, 6H).
二甲基9-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)-9H-哢唑-2,7-二羧酸酯（77）的製備
在0℃，向NaH（2.30g，57.6mmol，60%純度）在DMF（80.0ml）中的溶液中添加化合物76（13.6g，48.0mmol）。將混合物在0℃攪拌1hr，然後添加叔丁基N-(3-溴丙基)氨基甲酸酯（22.9g，96.0mmol），將混合物在40℃攪拌3hr。TLC（石油醚/乙酸乙酯=5/1，化合物76：R f=0.2，產物：R f=0.7）表明化合物76完全消耗。用NH 4Cl（100mL）水溶液稀釋反應混合物並用EtOAc萃取（150mL×2）。用鹽水（100mL）清洗合併的有機層，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過柱色譜法（SiO 2，石油醚/乙酸乙酯=10/1至1/1）純化殘餘物以提供黃色固體狀的化合物77（16.4g，37.2mmol，77.6%得率）。
1HNMR: (400 MHz, DMSO) δ 8.36 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 8.31 (s, 2H), 7.80 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.03 (t, J= 4.8 Hz, 1H), 4.56 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 3.74 (s, 6H), 2.99-3.00 (m, 2H), 1.87-1.98 (m, 2H), 1.22-1.36 (m, 9H).
9-(3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)-9H-哢唑-2,7-二羧酸（78）的製備
對化合物77（8.00g，18.2mmol）和NaOH（2.18g，54.5mmol）在THF（30.0mL）、MeOH（30.0mL）和H 2O（10.0mL）中的混合物脫氣並用N 2吹掃3次，然後將混合物在80℃，在N 2氣氛下攪拌12hr。TLC（二氯甲烷/甲醇=10/1，化合物77：R f=0.8）表明化合物77完全消耗。將反應混合物小心倒入100ml冰-水，並用1N HCl稀釋至pH=4。過濾反應混合物並用20.0mL水清洗濾餅，真空乾燥。將粗產物直接用於下一步而無需進一步純化以提供淺黃色固體狀的化合物78（5.00g，12.1mmol，66.8%得率）。
1HNMR: (400 MHz, CDCl 3) δ 13.01 (s, 2H), 8.34 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 8.25 (s, 2H), 7.85 (q, J= 8.0 Hz, 2H), 4.56 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.97-3.00 (m, 2H), 1.89-1.99 (m, 2H), 1.37 (m, 8H).
叔丁基(3-(2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-哢唑-9-基)丙基)氨基甲酸酯（79）的製備
向化合物78（5.00g，12.1mmol）在DMF（50.0ml）中的溶液中添加HATU（11.5g，30.3mmol）和DIPEA（6.27g，48.5mmol）以及2-[2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙胺（5.29g，24.3mmol）。將混合物在15℃攪拌3hr。LC-MS顯示出具有所期望的檢測MS的一個新的峰（化合物79：Rt=0.752min）。用水（90.0mL）稀釋反應混合物並用2-Me-THF（50.0mL×2）萃取。用水（50.0mL）清洗合併的有機層，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過反相HPLC（0.1% NH 4HCO 3條件）純化粗產物以提供白色固體狀的化合物79（4.00g，4.92mmol，40.6%得率）。
1HNMR: (400 MHz, DMSO) δ 8.68 (t, J= 5.2 Hz, 2H), 8.31 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 8.19 (s, 2H), 7.79 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.03 (t, J= 4.8 Hz, 2H), 4.53 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 3.54-3.65 (m, 26H), 3.40-3.41 (m, 4H), 3.38-3.40 (m, 2H), 3.03-3.05 (m, 2H), 1.99-2.02 (m, 2H), 1.40 (s, 9H).
9-(3-氨基丙基)-N2,N7-雙(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9H-哢唑-2,7-二甲醯胺（80）的製備
向化合物79（3.00g，3.69mmol）在DCM（25.0mL）中的溶液中添加HCl/MeOH（5.00mL）。將混合物在15℃攪拌1hr。TLC（二氯甲烷/甲醇=10/1，化合物79：R f=0.6，化合物80：R f=0.05）表明化合物79完全消耗。減壓濃縮該反應混合物以提供殘餘物。將粗產物直接用於下一步而無需進一步純化以提供黃色固體狀的化合物80（2.70g，3.60mmol，97.7%得率，HCl鹽）。
1HNMR: (400 MHz, DMSO) δ 8.78 (t, J= 5.6 Hz, 2H), 8.36 (s, 2H), 8.27 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 8.05 (s, 3H), 7.77 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 4.63 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.65-3.60 (m, 17H), 3.50-3.56 (m, 5H), 3.36-3.37 (m, 5H), 2.88-2.91 (m, 2H), 2.14-2.18 (m, 2H).
N2,N7-雙(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-9-(3-(6-羥基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚醯胺基)丙基)-9H-哢唑-2,7-二甲醯胺（81）的製備
對化合物80（1.80g，2.40mmol，HCl），化合物73（851mg，2.40mmol）、HOBt（487mg，3.60mmol）、EDCI（691mg，3.60mmol）和Et 3N（2.19g，21.6mmol）在DCM（15.0ml）中的混合物脫氣並用N 2吹掃3次，然後將混合物在25℃，在N 2氣氛下攪拌2hr。LC-MS顯示出具有所期望的檢測MS的一個新的峰（化合物81：Rt=1.21min）。用水（30.0mL）稀釋反應混合物並用EtOAc（20.0mL×3）萃取。用鹽水（30.0mL）清洗合併的有機層，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC（柱：Xtimate C18 10u 250mm×80mm；流動相：[水（10mM NH 4HCO 3）-ACN]；B%：35%-65%，21min）純化殘餘物以提供淺黃色固體狀的化合物81（1.00g，953umol，39.7%得率）。
1HNMR: (400 MHz, DMSO) δ 8.71 (t, J= 5.6 Hz, 2H), 8.33 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 8.20 (s, 2H), 8.16 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 8.05 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.92-7.93 (m, 1H), 7.81 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 4.89 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 4.55 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 3.93 (s, 1H), 3.56-3.67 (m, 30H), 3.40-3.42 (m, 5H), 3.15-3.16 (m, 2H), 2.01-2.11 (m, 4H), 1.27-1.51 (m, 7H).
7-((3-(2,7-雙((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)-9H-哢唑-9-基)丙基)氨基)-7-氧-1-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（82）的製備
在0℃，向化合物81（500mg，477umol）和N,N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯（977mg，3.81mmol）在ACN（6.00ml）中的溶液中添加吡啶（188mg，2.38mmol）。將混合物在15℃攪拌1hr。LC-MS顯示出具有所期望的檢測MS的一個新的峰（產物：Rt=2.26min）。用水（20.0mL）稀釋反應混合物並用DCM（10.0mL×5）萃取。用水（20.0mL）清洗合併的有機層，用Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮以提供殘餘物。通過製備-HPLC（柱：Phenomenex luna C18 250×50mm×10um；流動相：[水（0.04% HCl）-ACN]；B%：50%-70%，10min）純化殘餘物以提供黃色固體狀的82（0.102g，79.4umol，16.7%得率，92.7%純度）。
1HNMR: (400 MHz, DMSO) δ 8.6 (t, J= 5.6 Hz, 2H), 8.26 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 8.13-8.17 (m,4H), 8.01-8.11 (m, 3H), 7.96 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 5.16-5.18 (m, 1H), 4.49 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 3.91-4.12 (m, 13H), 3.55-3.59 (m, 14H), 4.49-4.53 (m, 4H), 3.34-3.36 (m, 4H), 3.09-3.10 (m, 2H), 2.79 (s, 4H), 1.97-2.06 (m, 4H), 1.61-1.68 (m, 2H), 1.42-1.44 (m, 2H), 1.23-1.25 (m, 2H).
HPLC：保留時間：2.632min，面積百分比：92.0%。
LCMS：保留時間：2.630min，M+H +=1190.4。
實施例14
7-疊氮基-1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲醯基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（86）
Figure 02_image358
N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-(甲基磺醯基)苯甲醯胺（84）的製備
向化合物83（2.0g，10mmol，1.0eq）和化合物22（2.18g，10mmol，1.0eq）在二甲基甲醯胺（40ml）中的溶液中添加2-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽（4.56g，12mmol，1.2eq）和 N,N-二異丙基乙胺（2.0g，20mmol，2.0eq）。在室溫下將混合物攪拌過夜。通過LCMS和TLC監測反應。用水（50mL）稀釋混合物，用乙酸乙酯（5×150mL）萃取並用鹽水（100mL）清洗。用硫酸鈉乾燥有機層並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠（二氯甲烷：甲醇，97:3）上純化殘餘物以提供化合物84（2.5g，63%）
TLC：二氯甲烷：甲醇=10：1，UV 254nm，通過I 2顯色，R f：（ 化合物 83）=0.3；R f：（ 化合物 84）=0.5。
3-((7-疊氮基-2-羥庚基)磺醯基)-N-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲醯胺（85）的製備
在-78℃，向化合物84（2.0g，5.0mmol，1.0eq）在四氫呋喃（30ml）中的溶液中緩慢添加雙(三甲基甲矽烷基)氨基鉀（1.0M，15mL，15mmol，3.0eq）。然後，將化合物3（2.1g，15mmol，3.0eq）加入至所述混合物。將反應混合物在室溫下攪拌2h。通過TLC監測反應。然後，用飽和氯化銨水溶液（30mL）使混合物淬滅，用乙酸乙酯（2×30mL）萃取。用鹽水（20mL）清洗有機層，用硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠（二氯甲烷：甲醇，97:3）上純化殘餘物以提供化合物85（400mg，15%）
TLC：二氯甲烷：甲醇=10：1，UV 254nm，R f：（ 化合物 84）=0.5；R f：（ 化合物 85）=0.5。
7-疊氮基-1-((3-((2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲醯基)苯基)磺醯基)庚烷-2-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（86）的製備
向化合物85（400mg，0.74mmol，1.0eq）在四氫呋喃（4mL）中的混合物中添加三光氣（372mg，1.25mmol，1.7eq）和吡啶（117mg，1.48mmol，2.0eq）。在攪拌30min後，過濾反應混合物。向濾液中添加吡啶（117mg，1.48mmol，2.0eq）和 N-羥基琥珀醯亞胺（176mg，0.89mmol，1.2eq）。將混合物在室溫下攪拌2h。通過LCMS監測反應。用乙酸乙酯（3×5mL）萃取混合物並用鹽水（5mL）清洗。然後，用硫酸鈉乾燥有機層，過濾並減壓濃縮。通過製備-HPLC純化殘餘物以提供無色油狀的化合物86（270mg，54%）。
LCMS：[M+1] +=683。
1HNMR (400 MHz, CD 3OD): δ 8.32 (s, 1H), 8.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.29 (s, 1H), 5.25 (s, 1H), 3.59-3.66 (m, 16H), 3.37-3.32 (m, 2H), 3.25 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.81 (s, 4H), 1.79 (s, 2H), 1.57 (s, 2H), 1.39 (s, 4H).
實施例15
1-疊氮基-12-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-13-氧-19-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-3,6,9-三氧雜-12-氮雜十九烷-18-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（89）
Figure 02_image360
N,N-雙(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-6-羥基-7-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)庚醯胺（88）的製備
向化合物73（102mg，0.3mmol，1.2eq）在二甲基甲醯胺（3mL）中的溶液中添加2-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽（136mg，0.76mmol，1.5eq）和 N,N-二異丙基乙胺（124mg，0.96mmol，4.0eq）。將混合物在室溫下攪拌10分鐘。然後，向所述混合物中添加化合物87（100mg，0.24mmol，1.0eq）並攪拌2h。通過LCMS和TLC監測反應。用水（10mL）稀釋混合物，用乙酸乙酯（5×10mL）萃取並用鹽水（10mL）清洗。用硫酸鈉乾燥有機層，過濾並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠（二氯甲烷：甲醇，98:2）上純化殘餘物以提供化合物88（50mg，28%）
TLC：二氯甲烷：甲醇=10：1，UV 254nm，通過I 2顯色，R f：（ 化合物 87）=0.5；R f：（ 化合物 88）=0.4。
1-疊氮基-12-(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-13-氧-19-((4-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-3,6,9-三氧雜-12-氮雜十九烷-18-基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（89）的製備
向化合物88（400mg，0.53mmol，1.0eq）在四氫呋喃（4ml）中的混合物中添加三光氣（267mg，0.9mmol，1.7eq）和吡啶（84mg，1.06mmol，2.0eq）。將反應混合物攪拌30min。過濾反應混合物。向濾液中添加吡啶（84mg，1.06mmol，2.0eq）和 N-羥基琥珀醯亞胺（73mg，0.64mmol，1.2eq）。將混合物在室溫下攪拌2h。通過LCMS監測反應。用乙酸乙酯（3×5mL）萃取混合物並用鹽水（5mL）清洗。然後，用硫酸鈉乾燥混合物，過濾並減壓濃縮。通過製備-HPLC純化殘餘物以提供黃色油狀的化合物89（85mg，18%）。
LCMS：[M+1] +=897。
1HNMR (400 MHz, CD 3OD): δ 8.15-8.13 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.96-7.94 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 5.27 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.73 (m, 1H), 3.59-3.61 (m, 26H), 3.35 (m, 6H), 2.81 (s, 4H), 3.46-3.42 (m, 2H), 1.79-1.77 (m, 2H), 1.58 (m, 2H) and 1.39-1.37 (m, 2H).
實施例16
2,5-二氧代吡咯烷-1-基(1-((4-氟-2-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基)碳酸酯（94）
Figure 02_image362
(4-氟-2-(三氟甲基)苯基)(甲基)硫烷（91）的製備：
將化合物90（5.0g，27.9mmol，1.0eq）、亞硝酸異戊酯（4.9g，41.9mmol，1.5eq）和1,2-二甲基二硫烷（37.0g，391mmol，14.0eq）在乙腈（100mL）中的混合物在90℃攪拌過夜。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，將混合物倒入1N HCl溶液，用乙酸乙酯萃取（100mL×3）。用飽和氯化鈉溶液（200mL）清洗有機層，用無水硫酸鈉乾燥並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠（石油醚：乙酸乙酯，100:1～50:1）上純化殘餘物以提供棕色油狀的化合物91（2.5g，43%）。
4-氟-1-(甲基磺醯基)-2-(三氟甲基)苯（92）的製備：
在0℃，在氮氣氛下，向化合物91（2.5g，11.9mmol，1.0eq）在二氯甲烷（100mL）中的溶液中添加3-氯過氧化苯甲酸（6.4g，29.8mmol，2.5eq）。在室溫下將混合物攪拌過夜。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，將混合物倒入飽和亞硫酸鈉溶液（300mL），用二氯甲烷萃取（300mL×3）。用飽和氯化鈉溶液（200mL）清洗有機層，用無水硫酸鈉乾燥並減壓濃縮。通過柱色譜法在矽膠（石油醚：乙酸乙酯，100:1～10:1）上純化殘餘物以提供褐色固體狀的化合物92（1.2g，42%）。
1-((4-氟-2-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-醇（93）的製備：
在-78℃，在氮氣氛下，向化合物92（1.6g，6.6mmol，1.0eq）在無水四氫呋喃（30mL）中的溶液中滴加n-丁基鋰（2.0M，4.3mL，8.6mmol，1.3eq）。將混合物在-78℃攪拌1h。然後，在-78℃添加化合物49（878mg，8.6mmol，1.3eq）在無水四氫呋喃（6mL）中的溶液。然後，將混合物在室溫下攪拌2h。反應混合物的LCMS分析顯示了向所期望的產物的完全轉化。然後，用冰水（180mL）使混合物淬滅並用乙酸乙酯萃取（180mL×3）。用無水硫酸鈉乾燥有機層並減壓濃縮。通過矽膠色譜法純化殘餘物以提供化合物93（1.0g，44%）。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基(1-((4-氟-2-(三氟甲基)苯基)磺醯基)-5-甲氧基戊-2-基)碳酸酯（94）的製備：
在室溫下，在氮氣氛下，向化合物93（900mg，2.35mmol，1.0eq）和三光氣（1.19g，4.0mmol，1.7eq）在無水四氫呋喃（15ml）中的攪拌溶液中滴加吡啶（371.3mg，4.7mmol，2.0eq）。在攪拌10min後，過濾混合物並減壓濃縮。將殘餘物溶於無水四氫呋喃（15mL）並依次用N-羥基琥珀醯亞胺（811mg，7.05mmol，3.0eq）和吡啶（556.9mg，7.05mmol，3.0eq）處理。在攪拌10min後，減壓濃縮混合物並倒入飽和碳酸氫鈉水溶液中。用乙酸乙酯萃取殘餘物並用鹽水清洗。用無水硫酸鈉乾燥有機層並減壓濃縮。通過製備-HPLC純化殘餘物以提供白色固體狀的化合物94（450mg，40%）。LCMS：[M+1] = 486； 1HNMR (400 MHz, CD 3OD): δ8.38-8.35 (m, 1H), 7.82-7.80 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.68-7.64 (m, 1H), 5.35-5.33 (d, J= 6.0 Hz, 1H), 3.96-3.90 (m, 1H), 3.79-3.75 (m, 1H), 3.39 (m, 3H), 3.30 (s, 3H), 2.83 (s, 4H), 1.83 (m, 2H) and 1.63-1.61 (m, 2H).
實施例17
mPEG2-Fmoc-20K-NHS
Figure 02_image364
根據來自US20060293499A1的修改文獻程式，產生了實施例17的mPEG2-Fmoc-20K-NHS PEG試劑。 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 8.57 (m, 2H), 8.22 (m, 1H), 8.08-7.99 (m, 4H), 6.44 (s, 1H), 4.93 (m, 1H), 4.54 (m, 1H), 3.51 (br, 1800H), 2.82 (s, 4H). HPLC：純度95.9%；GPC：純度92.3%；MALDI/GPC：21922Da。
實施例18
4-(23-疊氮基-4-氧-6,9,12,15,18,21-己氧基-3-氮雜二十三烷醯胺基)苄基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（101）
Figure 02_image366
Figure 02_image368
Figure 02_image370
[(4-羥甲基-苯氨羰基)-甲基]-氨基甲酸叔丁酯（97）的製備：
向化合物95、Boc甘胺酸（3.0g，17.125mmol，1eq）在DMF（20mL）中的溶液中添加化合物96、(4-氨基-苯基)-甲醇（2.52g，20.550mmol，1.2eq）、EDCI. HCl（6.5g，34.250mmol，2eq）和HOBt（4.62g，34.250mmol，2eq）。向該反應混合物中添加DIPEA（8.9mL，51.375mmol，3eq）、DMAP（4.18g，34.250mmol，2eq）並將反應混合物在室溫下攪拌15h。通過LCMS確認產物的形成，其顯示產物品質為m/Z=281.10。濃縮反應混合物並使用MeOH在DCM中的梯度（1至3%）通過矽膠色譜法純化所得粗產物以提供1.82g，38%得率的化合物97。
TLC：MeOH/DCM=5/95：R f（化合物97）=0.6，R f（化合物96）=0.4
化合物97的LCMS：281.10 (M+H) +。
2-氨基-N-(4-羥甲基-苯基)-乙醯胺（98）的製備：
向化合物97、[(4-羥甲基-苯氨羰基)-甲基]-氨基甲酸叔丁酯（1.11g，3.959mmol）在DCM（10mL）中的溶液中添加TFA（5.5mL）並將所得溶液在室溫下攪拌3h。通過LCMS確認反應完成。通過添加Et 3N直至pH=8.0使反應淬滅。濃縮反應混合物以提供592mg，83%得率的粗化合物98，將其在不純化的情況下用於下一步。
2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-疊氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-N-[(4-羥甲基-苯氨羰基)-甲基]-乙醯胺（100）的製備：
向化合物99、{2-[2-(2-{2-[2-(2-疊氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸（360mg，0.9852mmol，1eq）在DCM（10mL）中的溶液中添加化合物98、2-氨基-N-(4-羥甲基-苯基)-乙醯胺（433mg，1.4779mmol，1.5eq）和HOBt（4.62g，34.250mmol，2eq）。向該反應混合物添加DIPEA（0.7ml，3.9408mmol，4eq），從而導致形成了透明溶液，該透明溶液將再次產生沉澱。將非均一的溶液冷卻至0℃並添加EDCI.HCl（227mg，1.1822mmol，1.2eq），並將反應混合物加熱至室溫，攪拌5h。通過LCMS確認產物的形成，其顯示產物品質為m/Z=527.85。濃縮反應混合物並使用MeOH在DCM中的梯度（1至5%）通過矽膠色譜法純化所得粗產物以提供389mg，75%得率的化合物100。
TLC：MeOH/DCM=5/95：R f（化合物100）=0.6，R f（化合物98）=0.3
化合物100的LCMS：527.85 (M+H) +
4-(23-疊氮基-4-氧-6,9,12,15,18,21-己氧基-3-氮雜二十三烷醯胺基)苄基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯（101）的製備
在rt下，向化合物100、2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-疊氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-N-[(4-羥甲基-苯氨羰基)-甲基]-乙醯胺（529mg，1.002mmol，1eq）在無水ACN（5ml）中的溶液中添加DSC（514mg，2.0054mmol，2eq），隨後添加吡啶（162μL，2.0054mmol，2eq）。將反應攪拌5h。通過LCMS確認產物的形成，其顯示產物品質為m/Z=668.80。濃縮反應混合物並使用ACN在DCM中的梯度（0至100%）通過矽膠色譜法純化所得粗產物以提供285mg，42%得率的化合物101。化合物101的LCMS：668.80 (M+H) +。 1H NMR (300 MHz, 丙酮- d6) δ 9.32 (br.s, 1H), 7.90 (br.s, 1H), 7.73 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.45 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 5.35 (s, 2H), 4.13 (d, J= 6.1 Hz, 2H), 3.99 (s, 2H), 3.78 – 3.57 (m, 22H), 3.36–3.39 (m, 2H), 2.88 (s, 4H) ppm.
實施例19
mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS
Figure 02_image372
根據來自US20060293499A1和Bioconjugate Chemistry 2003, 14, 395-403的修改文獻程式，產生了實施例19的mPEG2-Fmoc-Bn-20K-NHS。 1H NMR (300 MHz, d 6-DMSO) δ 9.14 (br, 1H), 8.56 (m, 2H), 8.25-8.17 (m, 2H), 8.04-7.97 (m, 4H), 7.44 (m, 2H), 7.33 (m, 2H), 5.77 (s, 2H), 4.69 (m, 2H), 4.46 (m, 1H), 3.51 (br, 1800H), 2.81 (s, 4H).
HPLC：純度94.7%；GPC：純度91.2%；MALDI/GPC：21048Da。
實施例20
20kDa Y-PEG-DBCO
Figure 02_image374
向配備有特氟隆塗層磁力攪拌棒的乾燥圓底燒瓶中添加20kDa Y-PEG-NHS（1.08g，50.0μmol，1.0當量）和PyClocK（0.033g，60.0μmol，1.2當量）。用橡膠隔片密封燒瓶並置於惰性氬氣氣氛下。添加無水CH 2Cl 2（5.0ml），隨後添加N-甲基嗎啉（6.10μL，55.0μmol，1.1當量）並將反應溶液在室溫下攪拌30min。作為固體一次性加入DBCO-胺（0.028mg，100μmol，2.0當量）並將反應混合物在室溫下攪拌另外3h。將粗反應混合物吸入玻璃移液器並邊強烈攪拌，邊滴加至2-丙醇（100mL）中。獲得白色沉澱（PEG材料）並將所得混懸液冷卻至4℃並過濾（真空過濾），用冰冷的2-丙醇（3×50mL）清洗。將分離的沉澱轉移至預稱重的falcon管（×2）中並溶於熱（40℃）丙酮（90mL）。將溶液在冰浴中冷卻15min以引起PEG材料沉澱。通過離心（10500rpm，20min，4℃）使混懸液沉澱成粒並小心棄去上清液。將沉澱顆粒再溶於新鮮的熱丙酮（40℃），在冰浴中冷卻以引起沉澱並進行另一輪離心/傾倒。總計重複該過程4次。真空乾燥沉澱顆粒。分離的白色固體，品質=1.08g（99%）。RP-HPLC保留時間=6.9min。
實施例21
15kDa Y-PEG-DBCO
Figure 02_image376
向配備有特氟隆塗層磁力攪拌棒的乾燥圓底燒瓶中添加15kDa Y-PEG-NHS（1.13g，74.9μmol，1.0當量）和PyClocK（0.082g，148μmol，2.0當量）。用橡膠隔片密封燒瓶並置於惰性氬氣氣氛下。添加無水CH 2Cl 2（18mL），然後添加N-甲基嗎啉（18μL，164μmol，2.2當量）並將反應在室溫下攪拌30min。將DBCO-胺（52mg，188μmol，2.5當量）作為CH 2Cl 2（2mL）中的溶液與N-甲基嗎啉（18μL，164μmol，2.2當量）一起一次性加入，並將反應混合物在室溫下攪拌另外5h。真空濃縮粗反應混合物，然後吸收熱2-丙醇（120mL）。將所得溶液在冰浴中冷卻以形成沉澱。將分離的沉澱轉移到預稱重的falcon管（×3）中，並通過離心（12000rpm，30min，-3℃）使沉澱物沉降。用2-丙醇（120mL）重複一次沉澱並用丙酮（3×120mL）重複三次。真空乾燥沉澱顆粒。分離的白色固體，品質=995mg（88%）。RP-HPLC保留時間=6.9min。
實施例22
17kDa Y-PEG-DBCO
Figure 02_image378
向配備有特氟隆塗層磁力攪拌棒的乾燥圓底燒瓶中添加17kDa Y-PEG-NHS（1.0g，57.2μmol，1.0當量）和CH 2Cl 2（18.0mL）。用橡膠隔片密封燒瓶並置於惰性氬氣氣氛下。添加DBCO-胺（40mg，145μmol，2.5當量），隨後添加N-甲基嗎啉（19μL，173μmol，3.0當量），並將反應在室溫下攪拌過夜。真空濃縮粗反應混合物，然後吸收熱丙酮（90mL）。將所得溶液在冰浴中冷卻30min以形成沉澱，通過離心（11000rpm，30min，-8℃）使沉澱沉降。傾倒溶劑並用2-丙醇（90mL）重複一次沉澱過程並用丙酮（2×90mL）重複兩次。真空乾燥所得固體。分離的白色固體，品質=910mg（91%）。RP-HPLC保留時間=6.7min。
實施例23
7.5kDa PEG-DBCO
Figure 02_image380
7.5kDa PEG-DBCO試劑購自JenKem Technology USA。HPLC：純度98.0%；GPC：純度99.1%；MALDI：7481Da。
實施例24
rIL-2的製備
合成了如圖1所示的編碼所述多肽的IL-2基因並將其克隆至pET(T 7)表達載體中的一個中。在大腸桿菌（ E. coli）BL 21株（DE3）中表達所述蛋白。IL-2蛋白作為包涵體在大腸桿菌（ E. coli）中表達。發酵後，通過離心收穫細胞。將細菌顆粒在-80℃保存以用於之後的均質化。將冷凍顆粒在清洗緩衝液（50mM Tris，5mM EDTA，pH 8.0）中再混懸並以13860×g離心30分鐘。將顆粒在均質緩衝液（50mM Tris，5mM EDTA，1mM PMSF，pH 8.0）中再混懸並通過微射流機（來自Microfluidics, Newton, Massachusetts, USA的M-l 10P）在4℃均勻化1次。在清洗緩衝液中再次清洗勻漿。通過順序使用緩衝液：50mM Tris、5mM EDTA、2% Triton X-100，pH 8.0；50mM Tris、5mM EDTA、1%去氧膽酸鈉，pH 8.0；和50mM Tris、5mM EDTA、1M NaCl，pH 8.0將包含體顆粒清洗3次。在清洗後，獲得了粗IL-2包涵體。
將粗IL-2包涵體溶於6M胍、2mM EDTA、100mM Tris、50mM二硫蘇糖醇（DTT）。在50℃培育30分鐘後，加入H 2O以將胍濃度降低至4.8M。在13860×g離心1小時後，通過添加H 2O將上清液稀釋至3.5M胍濃度。用100%乙酸將pH調節至5.0。將混合物在室溫下培育60分鐘並以13860×g離心1小時。將顆粒在3.5M胍、5mM DTT、20mM乙酸酯，pH 5.0的緩衝液中再混懸並以13860×g離心1小時。再次清洗該顆粒（IL-2包涵體）。
將乾淨且減少的IL-2包涵體溶於6M胍、0.1mM CuCl 2、100mM Tris pH 8緩衝液並在4℃培育過夜。將重折疊的IL-2以13860×g離心60分鐘以除去沉澱。用Pellicon XL TFF膜系統（Millipore Corporation, USA）濃縮上清液。
將重折疊並濃縮的IL-2上樣至裝填了Sephacryl S-100 HR樹脂的BPG柱（GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala Sweden）。運行緩衝液為2M胍、20mM Tris pH 8並且流速為25mL/min。混合IL-2單體峰部分。應注意還可以使用其它適合的純化方法，如離子交換色譜法和疏水相互作用色譜法（HIC色譜法）。
在4℃，使用Pellicon XL TFF膜系統（Millipore Corporation, USA）將IL-2單體部分混合物濃縮至約1-2mg/mL。通過改變幾次製劑緩衝液將濃縮的IL-2單體溶液透析至最終製劑緩衝液（10mM乙酸-Na，5%海藻糖，pH 4.5）以使胍濃度降低至低於0.1mM。通過將配製的IL-2溶液通過0.22μm篩檢程式使其無菌並將其保存在-80℃以用於今後使用。
實施例25
Figure 02_image382
使用實施例1的rIL-2的NHS綴合
[rIL-2]-[F-Ph-SO 2-N 3] x產生
在綴合前，用100mM硼酸鈉，pH 8將IL-2稀釋至3.09mg/ml。
將化合物8（4.4mg）溶於DMF（0.885ml）以提供4.97mg/mL的試劑溶液。向rIL-2（10mg，3.24mL）小瓶中添加化合物8（1.79mg，360μL，6eq），將反應混合並在22℃培育1h。在1h，通過LC-MS分析反應以確定官能化的IL-2物質作為[rIL-2]-[F-Ph-SO 2-N 3] x的分佈。
圖2顯示通過LC-MS確定，[rIL-2]-[F-Ph-SO 2-N 3] x的分佈集中在6周圍。
實施例26
Figure 02_image384
使用實施例2的rIL-2的NHS綴合
[rIL-2]-[CF 3-Ph-SO 2-N 3] x產生：
在綴合前，用100mM硼酸鈉，pH 8將IL-2稀釋至3.09mg/ml。
將化合物13（7.5mg）溶於DMF（0.816mL）以提供9.19mg/mL的試劑溶液。向rIL-2（10mg，3.24ml）小瓶中添加化合物13（3.31mg，360μL，10eq.），將反應混合並在22℃培育1h。在1h，通過LC-MS分析反應以確定官能化的IL-2物質作為[rIL-2]-[CF 3-Ph-SO 2-N 3] x的分佈。
圖2顯示通過LC-MS確定，[rIL-2]-[CF 3-Ph-SO 2-N 3] x分佈的形成集中在6周圍。
實施例27
Figure 02_image386
使用實施例3的rIL-2的NHS綴合
[rIL-2]-[Cl-Ph-SO 2-N 3] x產生：
在綴合前，用100mM硼酸鈉，pH 8將IL-2稀釋至3.09mg/ml。將化合物18（5.0mg）溶於DMF（0.971mL）以提供5.15mg/mL的試劑溶液。向rIL-2（10mg，3.24mL）小瓶中添加化合物8（1.85mg，360μL，6eq），將反應混合並在22℃培育1h。在1h，通過LC-MS分析反應以確定官能化的IL-2物質作為[rIL-2]-[Cl-Ph-SO 2-N 3] x的分佈。
圖2顯示通過LC-MS確定，[rIL-2]-[Cl-Ph-SO 2-N 3] x分佈的形成集中在5周圍。
實施例28 [17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)]-[rIL-2]
Figure 02_image388
使用實施例3的rIL-2的NHS綴合以及與17kDa Y-PEG-DBCO（z=1）的點擊-PEG化
通過使用0.5M硼酸鈉，pH 9.8將pH調節至pH 9.1，將IL-2準備進行綴合。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（2.1mg/mL）。
作為10mM乙酸鈉，pH 4.5，5%海藻糖製備製劑緩衝液，使用0.5M硼酸鈉pH 9.8將pH調節至9.1。
將實施例3（6.0mg）溶於DMF（120μL）以提供50mg/mL的試劑溶液。用製劑緩衝液，pH 9.1（619μL）稀釋IL-2（5.0mg，0.327μmol，2.38mL）並添加實施例3（0.39mg，0.828μmol，7.83μL，2.5eq）和DMF（326μL）。將反應混合並在22℃培育30min。30min後，通過LC-MS分析反應以確定平均IL-2官能化度，實現了1.9的小接頭數x。
向[rIL-2]-[Cl-Ph-SO 2-N 3] x（5.0mg，0.327μmol，3.33mL）中添加17kDa Y-PEG-DBCO（86.5mg，4.90μmol，15eq）和製劑緩衝液，pH9.1（1.67mL）。混合反應，在22℃培育30min，然後用2M乙酸（750μL）淬滅。通過SDS-PAGE分析淬滅的反應，然後通過三步SEC-CEX-SEC色譜分離進行純化。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，純化粗IL-2-(PEG)產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
CEX純化：使用5mL Macrocap SP柱通過CEX純化IL-2-(PEG)樣品。在上樣前，用10體積的緩衝液A（50mM乙酸鈉，pH 4）稀釋樣品。樣品在緩衝液A中結合至柱，並用30柱體積的緩衝液B（50mM乙酸鈉，pH 4，1M NaCl）的梯度以3mL/min的流速洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例28定量為[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)]-[rIL-2]（0.33mg，6.6%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.0。
實施例29
[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]
Figure 02_image388
使用實施例3的rIL-2的NHS綴合以及與17kDa Y-PEG-DBCO（z=3）的點擊-PEG化
通過使用0.5M硼酸鈉，pH 9.8將pH調節至pH 9.1，將IL-2準備進行綴合。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（1.75mg/mL）。
作為10mM乙酸鈉，pH 4.5，5%海藻糖製備製劑緩衝液，使用0.5M硼酸鈉pH 9.8將pH調節至9.1。
將實施例3（4.1mg）溶於DMF（410μL）以提供10mg/mL的試劑溶液。用製劑緩衝液，pH 9.1（343μL）稀釋IL-2（12.0mg，0.784μmol，6.86mL）並添加實施例3（1.85mg，3.91μmol，185.4μL，5.0eq）和DMF（615μL）。將反應混合並在22℃培育30min。30min後，通過LC-MS分析反應以確定平均IL-2官能化度，實現了4.16的小接頭數x。
向[rIL-2]-[Cl-Ph-SO 2-N 3] x（12.0mg，0.784μmol，6.00mL）中添加17kDa Y-PEG-DBCO（207mg，11.7μmol，15eq）和製劑緩衝液，pH 9.1（4.00mL）。混合反應，在22℃培育30min，然後用2M乙酸（1.80mL）淬滅。通過SDS-PAGE分析淬滅的反應，然後通過SEC純化。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，純化粗IL-2-(PEG) z產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例29定量為[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]（10.5mg，88%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於2.7。
實施例30
[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)]-[rIL-2]
Figure 02_image298
使用實施例12的rIL-2的NHS綴合以及與17kDa Y-PEG-DBCO（z=1）的點擊-PEG化
通過使用0.5M硼酸鈉，pH 9.8將pH調節至pH 9.1，將IL-2準備進行綴合。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（1.79mg/mL）。
作為10mM乙酸鈉，pH 4.5，5%海藻糖製備製劑緩衝液，使用0.5M硼酸鈉pH 9.8將pH調節至9.1。
將實施例12（71mg）溶於DMF（1.42mL）以提供50mg/mL的試劑溶液。用製劑緩衝液，pH 9.1（82.7μL）稀釋IL-2（2.0mg，0.131μmol，1.12mL）並添加實施例12（0.44mg，0.649μmol，8.86μL，5.0eq）和DMF（124.5μL）。將反應混合並在22℃培育30min。30min後，通過LC-MS分析反應以確定平均IL-2官能化度，實現了2.4的小接頭數x。
向[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x（2.0mg，0.131μmol，1.33ml）中添加17kDa Y-PEG-DBCO（34.6mg，1.96μmol，15eq）和製劑緩衝液，pH 9.1（667μl）。混合反應，在22℃培育30min，然後用2M乙酸（300μL）淬滅。通過SDS-PAGE分析淬滅的反應，然後通過三步SEC-CEX-SEC色譜分離進行純化。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，純化粗IL-2-(PEG)產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
CEX純化：使用5mL Macrocap SP柱通過CEX純化IL-2-(PEG)樣品。在上樣前，用10體積的緩衝液A（50mM乙酸鈉，pH 4）稀釋樣品。樣品在緩衝液A中結合至柱，並用30柱體積的緩衝液B（50mM乙酸鈉，pH 4，1M NaCl）的梯度以3mL/min的流速洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例30定量為[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)]-[rIL-2]（40μg，2%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.0。
實施例31
[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-6
Figure 02_image298
使用實施例12的rIL-2的NHS綴合以及與17kDa Y-PEG-DBCO（z=3）的點擊-PEG化
通過使用0.5M硼酸鈉，pH 9.8將pH調節至pH 9.1，將IL-2準備進行綴合。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（1.68mg/mL）。
作為10mM乙酸鈉，pH 4.5，5%海藻糖製備製劑緩衝液，使用0.5M硼酸鈉pH 9.8將pH調節至9.1。
將實施例12（71mg）溶於DMF（1.42mL）以提供50mg/mL的試劑溶液。用製劑緩衝液，pH 9.1（57.1μL）稀釋IL-2（12.0mg，0.784μmol，7.14mL）並添加實施例12（13.3mg，19.6μmol，266μL，25eq）和DMF（534μL）。將反應混合並在22℃培育30min。30min後，通過LC-MS分析反應以確定所得[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x的平均IL-2官能化度，其中x的平均數確定為5.94，如圖3A所示（m/z光譜，4.1-5.8min）。
向[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x（12.0mg，0.784μmol，8.00mL）中添加17kDa Y-PEG-DBCO（207mg，11.7μmol，15eq）和製劑緩衝液，pH 9.1（4.00mL）。混合反應，在22℃培育30min，然後用2M乙酸（1.80mL）淬滅。通過SDS-PAGE分析淬滅的反應，然後通過SEC純化。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg，純化粗IL-2-(PEG) z產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例31定量為[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-6（7.2mg，60%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於2.7。
實施例32
[20K支鏈-mPEG]-[rIL-2]
使用實施例17和20kDa支鏈-PEG-NHS的rIL-2的PEG化
Figure 02_image393
使用P100柱，將IL-2緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9.0。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（2.51mg/mL）。
向IL-2（5.0mg，0.327μmol，1.99mL）中添加實施例17（108mg，4.91μmol，15eq）、100mM硼酸鈉，pH 9（1.76mL）和2mM HCl（713μL）。將反應混合並在22℃培育1h。綴合物的SDS-分析顯示PEG：IL-2的比值等於4.3。將20kDa支鏈-PEG-NHS（163mg，8.17μmol，25eq）和100mM硼酸鈉，pH 9（4.87mL）加入至反應混合物並在22℃繼續培育另外1h。綴合物的SDS-分析顯示PEG：IL-2的比值等於4.5。通過添加2M乙酸（1.5mL）使反應淬滅。將淬滅的反應緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9.0緩衝液，然後在37℃進行18h的可切割的PEG的水解。綴合物的SDS-分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.1。通過三步SEC-CEX-SEC色譜分離純化粗反應。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱，純化粗IL-2-(PEG)產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
CEX純化：使用1mL Macrocap SP柱通過CEX純化IL-2-(PEG)樣品。在上樣前，將樣品緩衝液交換為CEX緩衝液A（50mM乙酸鈉，pH 4）。樣品在緩衝液A中結合至柱，並用30柱體積的緩衝液B（50mM乙酸鈉，pH 4，1M NaCl）的梯度以1mL/min的流速洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例32定量為[20K支鏈-mPEG]-[rIL-2]（0.274mg，5.5%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.0。
實施例33
[20K Y-mPEG-T 1]-[rIL-2]
使用實施例17、化合物45和實施例20的rIL-2的PEG化
Figure 02_image395
使用P100柱，將IL-2緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9.0。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（2.51mg/mL）。
向IL-2（5.0mg，0.327μmol，1.99mL）中添加實施例17（108mg，4.91μmol，15eq）、100mM硼酸鈉，pH 9（1.76mL）和2mM HCl（713μL）。將反應混合並在22℃培育1h。綴合物的SDS-分析顯示PEG：IL-2的比值等於3.8。將化合物45（7.5mg）溶於MeCN（1.50mL）以提供5.0mg/mL溶液。向所述反應中添加化合物45（0.6mg，1.30μmol，121μL，4.0eq）和MeCN（130μL）。將反應混合並在22℃培育1h。向所述反應中作為20kDa Y-PEG-DBCO（71mg，3.26μmol，10eq）添加實施例20。將反應混合並在22℃培育1h。綴合物的SDS-分析顯示PEG：IL-2的比值等於3.8。通過添加2M乙酸（750μL）使反應淬滅。將淬滅的反應緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9.0緩衝液，然後在37℃進行18h的可切割的PEG的水解。綴合物的SDS-分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.1。通過三步SEC-CEX-SEC色譜分離純化粗反應。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱，純化粗IL-2-(PEG)產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
CEX純化：使用1mL Macrocap SP柱通過CEX純化IL-2-(PEG)樣品。在上樣前，將樣品緩衝液交換為CEX緩衝液A（50mM乙酸鈉，pH 4）。樣品在緩衝液A中結合至柱，並用30柱體積的緩衝液B（50mM乙酸鈉，pH 4，1M NaCl）的梯度以1mL/min的流速洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例33定量為[20K Y-mPEG-T 1]-[rIL-2]（0.217mg，4.3%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.0。
實施例34
[20K Y-mPEG-T 2]-[rIL-2]
使用實施例17、化合物45和實施例20的rIL-2的PEG化
Figure 02_image397
使用P100柱，將IL-2緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9.0。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（2.51mg/mL）。
向IL-2（10.0mg，0.654μmol，3.98mL）中添加實施例17（14.3mg，0.650μmol，1.0eq）、100mM硼酸鈉，pH 9（3.52mL）和2mM HCl（2.43mL）。將反應混合並在22℃培育1h。通過SDS-PAGE分析反應，然後通過SEC純化。綴合物的SDS-分析顯示PEG：IL-2的比值等於0.8。使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱，純化粗IL-2-(PEG)產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（30kDa MWCO PES）濃縮含有IL-2-(PEG) 1的部分並通過凝膠過濾（P50柱）緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9緩衝液。將化合物45（7.5mg）溶於MeCN（1.50mL）以提供5.0mg/mL溶液。向IL-2-(PEG) 1（3.2mg，0.209μmol，1.52mL）中添加化合物45（0.39mg，0.843μmol，78μL，4.0eq）。將反應混合並在22℃培育1h。向反應中添加20kDa Y-PEG-DBCO（45.5mg，2.09μmol，10eq），將反應混合並在22℃培育另外1h。綴合物的SDS-分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.4。通過添加2M乙酸（480μL）使反應淬滅。將淬滅的反應緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9.0緩衝液，然後在37℃進行18h的可切割的PEG的水解。通過SDS-PAGE進行反應分析。通過凝膠過濾（P50）將粗反應緩衝液交換為CEX緩衝液A，然後通過兩步CEX-SEC色譜分離純化。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱，純化粗IL-2-(PEG)產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
CEX純化：使用1mL Macrocap SP柱通過CEX純化IL-2-(PEG)樣品。在上樣前，將樣品緩衝液交換為CEX緩衝液A（50mM乙酸鈉，pH 4）。樣品在緩衝液A中結合至柱，並用30柱體積的緩衝液B（50mM乙酸鈉，pH 4，1M NaCl）的梯度以1mL/min的流速洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例34定量為[20K Y-mPEG-T 2]-[rIL-2]（0.147mg，1.5%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.0。
實施例35
[20K Y-mPEG-T 3]-[rIL-2]
使用化合物45和實施例20的rIL-2的PEG化
Figure 02_image399
使用P100柱，將IL-2緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9.0。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（2.08mg/mL）。
將化合物45（7.5mg）溶於MeCN（1.50mL）以提供5.0mg/mL溶液。向IL-2（7.0mg，0.458μmol，3.37mL）中添加化合物45（0.63mg，1.36μmol，127μL，3.0eq）、100mM硼酸鈉，pH 9（3.28mL）和MeCN（223μL）。將反應混合並在22℃培育1h。向反應添加作為20kDa Y-PEG-DBCO的實施例20（99.5mg，4.57μmol，10eq）和100mM硼酸鈉，pH 9（7.92mL）。將反應混合並在22℃培育另外1h。通過添加2M乙酸（2.1mL）使反應淬滅。通過SDS-PAGE進行反應分析，然後通過三步SEC-CEX-SEC色譜分離純化粗反應。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱，純化粗IL-2-(PEG)產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
CEX純化：使用1mL Macrocap SP柱通過CEX純化IL-2-(PEG)樣品。在上樣前，將樣品緩衝液交換為CEX緩衝液A（50mM乙酸鈉，pH 4）。樣品在緩衝液A中結合至柱，並用30柱體積的緩衝液B（50mM乙酸鈉，pH 4，1M NaCl）的梯度以1mL/min的流速洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例35定量為[20K Y-mPEG-T 3]-[rIL-2]（0.7mg，10%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.0。
實施例36
[20K Y-mPEG-T 4]-[rIL-2]
使用實施例16、化合物45和實施例20的rIL-2的PEG化
Figure 02_image401
Figure 02_image403
Figure 02_image405
使用P100柱將IL-2緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 8.0（20mM EDTA，0.05% SDS）。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（2.08mg/mL）。
將實施例16（5.0mg）溶於MeCN（539μL）以提供9.27mg/mL溶液。向IL-2（7.0mg，0.458μmol，3.37mL）中添加實施例16（1.8mg，3.71μmol，192μL，8.0eq）、100mM硼酸鈉，pH 8.0（20mM EDTA，0.05% SDS）（1.88mL）和MeCN（158μL）。將反應混合並在22℃培育1h。將化合物45（5.0mg）溶於MeCN（517μL）以提供9.67mg/mL溶液。向所述反應中添加化合物45（1.7mg，3.68μmol，175μl，8.0eq）和MeCN（175μL）。將反應混合並在22℃培育1h。向所述反應添加20kDa Y-PEG-DBCO（99.6mg，4.58μmol，10eq）和100mM硼酸鈉，pH 8.0（20mM EDTA，0.05% SDS）（6.9mL）。將反應混合並在22℃培育1h。通過添加2M乙酸（2.1mL）使反應淬滅。將淬滅的反應緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9.0緩衝液，然後在37℃進行24h的可切割接頭的水解。通過SDS-PAGE進行反應分析。將水解產物緩衝液交換為CEX緩衝液A並除去表面活性劑。根據生產商的說明，使用4mL Pierce去污劑除去柱從粗反應混合物除去SDS。使用1mL Macrocap SP柱，通過CEX純化粗反應。在上樣前，將樣品緩衝液交換為CEX緩衝液A（50mM乙酸鈉，pH 4）。樣品在緩衝液A中結合至柱，並用30柱體積的緩衝液B（50mM乙酸鈉，pH 4，1M NaCl）的梯度以1mL/min的流速洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例36定量為[20K Y-mPEG-T 4]-[rIL-2]（0.61mg，8.7%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.0。
實施例37
[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]
Figure 02_image298
使用實施例12的rIL-2的NHS綴合以及與17kDa Y-PEG-DBCO（z=6）的點擊-PEG化
通過使用0.5M硼酸鈉，pH 9.8將pH調節至pH 9.0，將IL-2準備進行綴合。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（2.0mg/mL）。
將實施例12（200mg）溶於DMF（4.0mL）以提供50mg/mL的試劑溶液。用反應緩衝液100mM硼酸鈉，pH 9.0（1.8mL）稀釋IL-2（18.0mg，1.17μmol，9.0ml）並添加實施例12（39.89mg，58.83μmol，797.76μL，50eq）和DMF（402μL）。將反應輕輕渦旋並在22℃培育30min。30min後，通過LC-MS分析反應以確定所得[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x的平均IL-2官能化度，其中x的平均數確定為8。
向[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x（18.0mg，1.17μmol，12.00ml）中添加17kDa Y-PEG-DBCO（1.24g，70.59μmol，60eq）和反應緩衝液100mM硼酸鈉，pH 9.0（6.0mL）。將反應輕輕渦旋，在22℃培育30min，然後用2M乙酸（2.7mL）淬滅。通過SDS-PAGE分析淬滅的反應，然後使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱通過SEC色譜分離純化。首先，使用Vivaspin20，30kDa MWCO PES將粗樣品濃縮至小於12mL的體積，然後以2mL/min流速用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl）等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例37定量為[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]（12mg，66%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於5.4（即平均值z=5.4），如圖4A所示（SEC純化後，SDS-PAGE（3-8% Tris-乙酸鹽））。在圖4A中，泳道1是HiMark蛋白標準品，泳道2是反應混合物並且泳道3是最終的IL-2-PEG綴合物。
實施例38
[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-4
Figure 02_image298
使用實施例12的rIL-2的NHS綴合以及與17kDa Y-PEG-DBCO（z=3）的點擊-PEG化
通過使用0.5M硼酸鈉，pH 9.8將pH調節至pH 9.0，將IL-2（100mg）準備進行綴合。通過Amicron（10kDa，15mL）濃縮所得的IL-2溶液直至濃度大於1.6mg/mL。通過Nanodrop 2000定量濃度（1.631mg/mL）。
將實施例12（160mg）溶於DMF以提供50mg/mL（73.73mM）的試劑溶液。向濃縮的IL-2（75.0mg，4.9μmol，45.984mL）緩衝溶液中添加30×摩爾過量的實施例12（30eq，1.990mL）。添加其它綴合緩衝液（0.568mL）以製備1.4-1.5mg/mL的IL-2反應濃度。添加DMF（3.181mL）以製備10%的有機溶劑。將反應在22℃的培育箱-振盪器中放置30min，其轉速為60rpm。通過LC-MS分析所得[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x中的接頭官能化，其中將x的平均數確定為4.32，如圖3B所示。
稱量足夠的17kDa Y-PEG-DBCO（3958.7mg），然後溶於綴合緩衝液（15.83mL）至達到250mg/mL（14.71mM）的PEG濃度。向[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x溶液中添加40×摩爾過量的PEG（13.308mL）。添加其它綴合緩衝液（9.968mL）以製備1.0mg/mL的反應中的IL-2濃度。將反應在22℃的培育箱-振盪器中放置另外30min，其轉速為60rpm。用加入反應中的10-20%（v/v）的2M乙酸淬滅反應直至pH達到4.0。
通過Amicon（30kDa，15mL）將反應溶液濃縮至低於6mL或16mL。通過S200柱（HiLoad SuperdexTM 200pg，16/600，120mL或者HiLoad SuperdexTM 200pg，26/600，320mL）純化濃縮樣品。S200緩衝液是50mM乙酸鈉，pH 4.5，150mM NaCl。根據S200譜圖，將幾個部分和粗溶液提交進行SDS-PAGE，並用碘染色和考馬斯亮藍染色SDS-PAGE以檢查綴合效率和純度。根據SDS-PAGE結果，混合高純度部分並通過Amicon（30kDa，15mL）濃縮為最終產物。無菌過濾（0.22μm膜）最終產物。製劑緩衝液是50mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5。
通過BCA法將實施例38定量為[17k mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-4（4.54mg/mL，22.11mg，30%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於3.33（即平均值z=3.33）。
實施例39
[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-5
Figure 02_image298
使用實施例12的rIL-2的NHS綴合以及與17kDa Y-PEG-DBCO（z=3）的點擊-PEG化
通過使用0.5M硼酸鈉，pH 9.8將pH調節至pH 9.0，將IL-2準備進行綴合。通過Amicron（10kDa，15mL）濃縮所得的IL-2溶液直至濃度大於1.6mg/mL。通過Nanodrop 2000定量濃度（2.219mg/mL）。
將實施例12溶於DMF以提供50mg/mL（73.73mM）的試劑溶液。向濃縮的IL-2（5.0mg，0.33μmol，2.253mL）緩衝溶液中添加35×摩爾過量的實施例12（35eq，11.416μmol，0.155mL）。添加其它綴合緩衝液（0.747mL）以製備1.4-1.5mg/mL的IL-2反應濃度。添加DMF（0.179mL）以製備10%的有機溶劑。將反應在22℃的培育箱-振盪器中放置30min，其轉速為60rpm。通過LC-MS分析所得[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x的IL-2的接頭官能化，其中x的平均數確定為5.08，如圖3C所示。
稱量足夠的17kDa Y-PEG-DBCO（273mg），然後溶於綴合緩衝液（1.09mL）至達到250mg/mL（14.71mM）的PEG濃度。向[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x溶液中添加45×摩爾過量的PEG（0.998mL）。添加其它綴合緩衝液（0.669mL）以製備1.0mg/mL的反應中的IL-2濃度。將反應在22℃的培育箱-振盪器中放置另外30min，其轉速為60rpm。用加入反應中的10-20%（v/v）的2M乙酸淬滅反應直至pH達到4.0。
通過Amicon（30kDa，15mL）將反應溶液濃縮至低於1mL。通過S200柱（HiLoad SuperdexT MIncrease, 10/300, 24mL）純化濃縮樣品。S200緩衝液是50mM乙酸鈉，pH 4.5，150mM NaCl。根據S200譜圖，將幾個部分和粗溶液提交進行SDS-PAGE，並用碘染色和考馬斯亮藍染色SDS-PAGE以檢查綴合效率和純度。根據SDS-PAGE結果，混合高純度部分並通過Amicon（30kDa，15mL）濃縮為最終產物。無菌過濾（0.22μm膜）最終產物。製劑緩衝液是50mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5。
通過BCA法將實施例39定量為[17k mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-4（2.32mg/mL，1.5mg，30%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於3.55（即平均值z=3.55）。
實施例40
[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-8
Figure 02_image408
使用實施例12的rIL-2的NHS綴合以及與17kDa Y-PEG-DBCO（z=3）的點擊-PEG化
通過使用0.5M硼酸鈉，pH 9.8將pH調節至pH 9.0，將IL-2在10mM乙酸鈉，pH 4.5，5%海藻糖中的溶液製備用於綴合。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）將所得IL-2溶液濃縮至4.5mg/mL，並使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量其濃度。
將實施例12儲液（200.0mg）溶於DMF（4.0mL）以提供50mg/mL的試劑溶液。用反應緩衝液100mM硼酸鈉，pH 9.0（9.44mL）稀釋IL-2（25.0mg，1.63μmol，5.56mL）並添加實施例12（66.48mg，98.0μmol，1.33mL，60eq）和DMF（337μL）。將反應輕輕渦旋並在22℃培育30min。30min後，通過LC-MS分析反應以確定所得[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x的平均IL-2官能化度，其中將x的平均數確定為8.5，如圖3D所示。
向[rIL-2]-[Cl,CONH-Ph-SO 2-N 3] x（25.0mg，1.63μmol，16.67mL）中添加17kDa Y-PEG-DBCO（864.6mg，48.9μmol，30eq）和反應緩衝液100mM硼酸鈉，pH 9.0（8.33mL）。將反應輕輕渦旋，在22℃培育30min然後用2M乙酸（3.75mL）淬滅。通過SDS-PAGE分析淬滅的反應，然後通過SEC色譜分離純化。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱，通過SEC純化粗IL-2-(PEG) z產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對粗樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect™儀，通過IR將實施例40定量為[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-8（12.48mg，50%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於2.7（即平均值z=2.7），如圖4B所示（SEC純化後，SDS-PAGE（3-8% Tris-乙酸鹽））。
實施例41
[17K mPEG-(F,CF 3-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]
Figure 02_image410
使用實施例5的rIL-2的NHS綴合以及與17kDa Y-PEG-DBCO（z=3）的點擊-PEG化
通過使用0.5M硼酸鈉，pH 9.8將pH調節至pH 9.0，將IL-2準備進行綴合。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（2.0mg/mL）。
將實施例5（23.0mg）溶於DMF（460μL）以提供50mg/mL的試劑溶液。用反應緩衝液100mM硼酸鈉，pH 9.0（1.24mL）稀釋IL-2（42.0mg，2.74μmol，21.0mL）並添加實施例5（12.96mg，24.71μmol，2.47ml，9.0eq）。將反應輕輕渦旋並在22℃培育30min。30min後，通過LC-MS分析反應以確定所得[rIL-2]-[F,CF 3-Ph-SO 2-N 3] x的平均IL-2官能化度，其中將x的平均數確定為5.3。
向[rIL-2]-[F,CF 3-Ph-SO 2-N 3] x（42.0mg，2.74μmol，24.71mL）中添加17kDa Y-PEG-DBCO（968.31mg，54.90μmol，20eq）和反應緩衝液100mM硼酸鈉，pH 9.0（10.29mL）。將反應輕輕渦旋，在22℃培育30min然後用2M乙酸（5.25mL）淬滅。通過SDS-PAGE分析淬滅的反應，然後通過兩步CEX-SEC色譜分離進行純化。
CEX：使用5mL Macrocap SP柱通過CEX純化粗IL-2-(PEG) z樣品。在上樣前，用10體積的緩衝液A（50mM乙酸鈉，pH 4）稀釋樣品。樣品在緩衝液A中結合至柱，並用30柱體積的緩衝液B（50mM乙酸鈉，pH 4，1M NaCl）的梯度以3mL/min的流速洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱，純化粗IL-2-(PEG) z產物。首先，使用Vivaspin20，30kDa MWCO PES將粗樣品濃縮至體積小於12mL，然後用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl）以2mL/min流速等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例41定量為[17K mPEG-(F,CF 3-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]（21mg，50%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於3.1（即z=3）。
實施例42
[20K Y-mPEG]-[rIL-2]
Figure 02_image412
使用20kDa Y-mPEG-NHS的rIL-2的PEG化
使用P50脫鹽柱，將IL-2緩衝液交換為100mM硼酸鈉，pH 9.0。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）濃縮所得的IL-2溶液，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量（1.68mg/mL）。
將20kDa Y-PEG-NHS試劑（52.2mg）溶於DMF（1.04mL）以提供50mg/mL溶液。用反應緩衝液100mM硼酸鈉，pH 9.0（80.95μL）稀釋IL-2（17.0mg，1.1μmol，10.12mL）並添加20kDa Y-PEG-NHS（44.44mg，2.2μmol，889.9μL，2.0eq）和DMF（244.4μL）。將反應輕輕渦旋，並在22℃培育2小時，然後用2M乙酸淬滅（150μL酸：1mL樣品體積的比值）。通過SDS-PAGE分析淬滅的反應，然後通過SEC色譜分離，接著通過CEX色譜分離進行純化。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱，通過SEC純化粗IL-2-(PEG) z產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對粗樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
CEX：使用5mL Macrocap SP柱通過CEX純化粗IL-2-(PEG) z樣品。在上樣前，用10體積的緩衝液A（50mM乙酸鈉，pH 4）稀釋樣品。樣品在緩衝液A中結合至柱，並用30柱體積的緩衝液B（50mM乙酸鈉，pH 4，1M NaCl）的梯度以3mL/min的流速洗脫。通過SDS-PAGE分析所收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR將實施例42定量為[20K Y-mPEG]-[rIL-2]（4.4mg，26%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於1.1。
實施例43
使用PEG試劑46的rIL-2的PEG化
Figure 02_image364
根據來自US20060293499A1的文獻程式產生PEG試劑46。
通過使用0.5M硼酸鈉，pH 9.8將pH調節至pH 9.0，將IL-2在10mM乙酸鈉，pH 4.5，5%海藻糖中的溶液準備進行綴合。通過UF/DF（Vivaspin20，5kDa MWCO PES）將所得IL-2溶液濃縮至2.51mg/mL，然後使用Nanodrop 2000分光光度計通過UV-A280定量其濃度。
將PEG試劑46（2.006g）溶於2mM HCl（6.67mL）以提供300mg/mL試劑溶液。用反應緩衝液100mM硼酸鈉，pH 9.0（6.67mL）和PEG試劑46（2.006g，91μmol，71.64μL，35.0eq）稀釋IL-2（40mg，2.6μmol，15.94mL）。將反應輕輕渦旋，並在22℃培育1小時，然後用2M乙酸淬滅直至溶液pH達到pH 4.0。通過SDS-PAGE分析淬滅的反應，然後通過SEC色譜分離純化。
SEC純化：使用HiLoad 26/600 Superdex 200 pg柱，通過SEC純化粗IL-2-(PEG) z產物。用50mM乙酸鈉，pH 4.5（150mM NaCl），以2mL/min的流速對粗樣品等度洗脫。通過SDS-PAGE分析通過所述方法收集的部分並混合高純度部分。
通過UF/DF（Vivaspin20，30kDa MWCO PES）濃縮混合的部分，並最終無菌過濾（0.22μm PVDF）。
使用DirectDetect儀，通過IR定量實施例43（18.9mg，47%得率）。綴合物的SDS-PAGE分析顯示PEG：IL-2的比值等於5.8。
實施例44
示例性的rIL-2-[PEG] z綴合物的活性
使用CTLL-2細胞在細胞增殖測定中評價阿地白介素（對照）、實施例28-37和實施例42的活性。
在37℃，5% CO 2氣氛下，將CTLL-2細胞（小鼠細胞毒T淋巴細胞系）維持在補充有10%胎牛血清和10% IL-2培養補充劑（T-STIM™，具有ConA（伴刀豆球蛋白A））的完全RPMI 1640培養基中。在分裂前，將細胞懸浮培養直至它們達到2-3×10 5個細胞/mL的細胞密度。
對於活性測定，在上次分裂後3-4天，將細胞在達爾伯克氏磷酸鹽緩衝鹽水中清洗三次。然後，將細胞以～5×10 5個細胞/mL的細胞密度在無T-STIM™的補充培養基中再懸浮，並以90μl/孔在96孔白壁透明底微板中鋪板。還使用調節至pH 6.7-7的補充培養基（無T-STIM™）進行實驗以最大程度降低培育過程中綴合物的釋放。然後，添加在無T-STIM™的補充培養基中稀釋的10μl 10×濃度的測試化合物。將細胞在37℃，在5% CO 2氣氛下培育48小時。培育48小時後，添加CCK8試劑（20μl/孔）並在37℃，5% CO 2下培育2小時。然後，使用Molecular devices Spectra Max i3X在450nm和630nm對板讀數。
測試釋放的IL-2和未釋放的綴合物兩者的活性。將測試化合物在酸性條件（10mM乙酸鈉緩衝液，pH 4）下儲存以穩定綴合。為了測試綴合物的活性，在測定前～1小時，將樣品從儲存緩衝液稀釋至補充培養基。為了測試釋放的IL-2的活性，將釋放的綴合物在100mM（最終濃度）的碳酸氫鈉緩衝液，pH 9中稀釋10-倍並在測定開始前，在37℃預培育8小時。
使用GraphPad's Prism 5.01軟體，從劑量反應曲線的非線性回歸分析獲得細胞增殖的EC 50值（顯示出50%最大反應所需的測試化合物的濃度）。
使用細胞增殖測定測量IL-2和綴合物的活性並且結果總結如3A和表3B所示。所有測試製品以劑量-依賴性方式誘導CTLL-2細胞的生長。如表3B所示，在誘導IL-2釋放的條件下對來自實施例29、31、37-38和41的綴合物預培育後，活性恢復。從這些綴合物釋放的IL-2顯示出對於對照rIL-2的相對效力。
表3A. 對IL-2和PEG-IL-2綴合物起反應的CTLL-2細胞增殖的總結。
測試化合物 EC 50（pM）
實施例24：rIL-2對照 1.03
實施例28：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)]-[rIL-2] 2.34
實施例29：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)] z-[rIL-2] 20.1
實施例30：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)]-[rIL-2] 0.62
實施例31：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-6 8.01
實施例32：[20K支鏈-mPEG]-[rIL-2] 1.10
實施例33：[20K Y-mPEG-T 1]-[rIL-2] 2.10
實施例34：[20K Y-mPEG-T 2]-[rIL-2] 3.20
實施例35：[20K Y-mPEG-T 3]-[rIL-2] 1.65
實施例36：[20K Y-mPEG-T 4]-[rIL-2] 4.91
實施例37：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2] 40.9
實施例42：[20K Y-mPEG]-[rIL-2] 5.64
表3B. 對rIL2、未釋放和釋放的PEG-IL-2綴合物起反應的CTLL-2細胞增殖的總結。
測試化合物 EC 50（ng/mL）
實施例24：rIL-2對照 0.78
實施例29：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]（未釋放） 43.36
實施例29：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]（釋放） 0.98
實施例31：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-6（未釋放） 7.63
實施例31：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-6（釋放） 1.98
實施例37：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]（未釋放） 35.67
實施例37：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]（釋放） 0.69
實施例38：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-4（未釋放） 9.70
實施例38：[17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-4（釋放） 0.97
實施例41：[17K mPEG-(F,CF 3-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]（未釋放） 8.38
實施例41：[17K mPEG-(F,CF 3-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]（釋放） 1.49
實施例45
PEG化的IL-2與人IL-2受體亞基的生物化學相互作用
使用表面等離子共振（SPR）在Biacore T 200上測量PEG化的IL-2化合物與人IL-2受體亞基的相互作用的動力學，感測器晶片是使用標準胺化學偶聯了～9000RU抗-人IgG的CM5。
對於對IL-2Rα的結合動力學的確定，使用了以下晶片製備：在具有0.1% BSA的HBS-P+運行緩衝液中將人IgGl Fc-融合的IL-2 Rα（Sino Biological #10165-H02H）稀釋至1μg/mL並以10μL/min捕獲至～235RU。
對於對IL-2Rβ的結合動力學的確定，使用了以下晶片製備：在具有0.1% BSA的HBS-P+運行緩衝液中將人IgGl Fc-融合的IL-2 Rβ（Sino Biological #10696-H02H）稀釋至1μg/mL並以10μL/min捕獲至～235RU。
對於對IL-2Rαβ複合物的結合動力學的確定，使用了一些晶片製備：將人IL-2Rα-Fc和IL2-Rβ-Fc分別以1μg/mL預混合並捕獲至～440RU。
使用Biacore T 200 SPR儀，用起始於2μΜ對照IL-2以及實施例28-36和實施例42的三倍稀釋系列檢測這些表面。將測試樣品進樣90s以使得能夠測量結合，然後將僅緩衝液（清洗）進樣100s以測量解離。
表4總結了IL-2和PEG-IL-2與各個IL-2受體亞基的結合的K D。所測試的所有綴合物以與rIL-2對照類似的（1-3倍）結合親和力保留了與IL-2Rβ結合的能力。相反，與單獨的rIL-2相比，綴合物與IL-2Rα的結合進一步降低，其結合親和力降低4-9倍。不同的PEG化處理提供了相對於IL-2Rα，對結合至IL-2Rβ具有不同偏好的不同的PEG-IL-2（運行2）。與對照rIL-2相比，實施例33顯示對IL-2Rα的結合親和力低7倍，對IL-2Rβ的結合親和力類似，以及對IL-2Rαβ的結合低10倍。
從如方案1所示的兩步PEG化方法合成了實施例35，而從傳統的PEG試劑PEG化方法合成了實施例42。與實施例35和實施例42的受體結合活性相比（測試4），已證實實施例35顯示出比實施例42進一步降低的IL-2Rα結合。因此，通過方案1方法的IL-2 PEG化顯示與通過傳統方法的IL-2 PEG化相比，對IL-2Rα的結合降低。
表4. IL-2和PEG-IL-2與各個IL-2受體亞基表面的相互作用的動力學參數。
測試化合物 IL-2Rα K D（μM） IL-2Rβ K D（μM） IL-2Rαβ K D（μM）
運行1
實施例24：rIL-2對照 0.0246 0.872 0.00668
實施例28：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)]-[rIL-2] 0.138 2.34 0.0755
實施例29：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)] z-[rIL-2] 0.882 - 0.241
實施例30： [17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)]-[rIL-2] 0.13 2.75 0.054
實施例31： [17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-6 0.816 - 0.267
運行2
實施例24：rIL-2對照 0.0249 0.977 0.00601
實施例32：[20K支鏈-mPEG]-[rIL-2] 0.204 1.96 0.098
實施例33：[20K Y-mPEG-T 1]-[rIL-2] 0.221 2.50 0.0701
實施例34：[20K Y-mPEG-T 2]-[rIL-2] 0.168 0.634 0.0581
實施例35：[20K Y-mPEG-T 3]-[rIL-2] 0.184 1.02 0.0888
運行3
實施例24：rIL-2對照 0.0155 0.511 0.00326
實施例36：[20K Y-mPEG-T 4]-[rIL-2] 0.0559 0.462 0.0423
運行4
實施例24：rIL-2對照 0.0127 - 0.00271
實施例29： [17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)] z-[rIL-2] 1.11 - 0.308
實施例31： [17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-6 0.888 - 0.461
實施例35：[20K Y-mPEG-T 3]-[rIL-2] 0.706 - 0.183
實施例42：[20K Y-mPEG]-[rIL-2] 0.307 - 0.107
實施例46
原代人白細胞還原系統（LRS）-來源的PBMC樣品中的離體免疫應答譜繪製
為了確定測試化合物如何影響原代免疫細胞亞群的啟動，使用多色流式細胞術在人LRS-來源的周圍血單核細胞（PBMC）樣品中進行淋巴細胞啟動的濃度-反應譜繪製。
在采血當天獲得LRS，並使用聚蔗糖密度梯度規程提取PBMC。將PBMC在補充有10%胎牛血清和1% Pen-Strep麩醯胺酸的RPMI中再混懸。在刺激前，將PBMC在37℃培育30分鐘。
對所有化合物產生了通過5-倍稀釋的12-點劑量曲線。最高劑量為30μg/mL。在PBS w/0.1% BSA中稀釋並作為10×儲液添加劑量曲線。在培育45分鐘後，將樣品固定並用抗體染色以檢測轉錄因子STAT 5的磷酸化形式（pTATA5），並檢測一組表面標誌物以追蹤特異性T細胞和自然殺傷（NK）細胞亞群中pSTAT 5的形成。
用以下透性化前(pre-perm)組對樣品染色：CD3、CD25、CD8、CD56、CD16、CD4、Dump（CD14）、Dump（CD19）和CD127。將染色劑培育30分鐘，然後將其沖洗掉。然後添加抗生蛋白鏈菌素BV421（Biolegend cat#405225）並培育20分鐘。清洗掉抗生蛋白鏈菌素並將樣品MeOH透性化並用以下透性化後（post-perm）組染色：FOXP3、STAT 5、Dump（CD15）。將染色劑培育60分鐘，然後將其沖洗掉並通過流式細胞術分析。
對於不同的T和NK細胞亞群的啟動，以濃度-反應方式分析流式細胞術資料，從而讀取測試化合物處理後的pSTAT 5積累。將pSTAT 5的中值螢光強度用於產生劑量曲線。根據濃度-反應曲線計算NK細胞、Treg細胞、CD8+ T細胞的EC50值。
在NK和效應T細胞群體中，PEG-IL-2綴合物相對於對照rIL-2顯示出降低的效力，其對於pSTAT 5生產的EC50值在對照rIL-2的6-27倍內（運行1和2）。在Treg亞群中，與對照IL-2相比，PEG-IL-2的pSTAT 5誘導的EC50值提高了9-51倍。對於所測試的PEG-IL-2綴合物，Treg中降低的效力高於NK和效應T細胞中降低的效力，如通過表5中CD8/Treg比所示。某些位置處的IL-2的PEG化允許IL-2受體的激動，並且不同的PEG化方法提供了相對於Treg對效應T細胞刺激具有不同偏好的不同的PEG-IL-2。與對照rIL-2的CD8/Treg 928的比值相比，實施例33顯示CD8/Treg的比值為432，表示相對於Treg，對CD8和NK細胞的偏好。
與實施例35和實施例42的pSTAT 5活性相比（測試3），已表明由兩步PEG化方法所製備的實施例35顯示出相對於Treg細胞，對刺激性CD8 T和NK細胞更高的偏好，其CD8/Treg的比值為569。而由常規PEG試劑PEG化方法製備的實施例42顯示相對於Treg細胞，對刺激性CD8 T和NK細胞的偏好較小，其CD8/Treg比值為1208。因此，通過方案1的方法的IL-2 PEG化顯示與通過傳統方法的IL-2 PEG化相比，相對於Treg細胞，對CD8 T和NK細胞的刺激更優先。
表5. 在人LRS樣品中對IL-2和PEG-IL-2綴合物起反應的pSTAT 5訊號轉導的劑量反應EC50（EC50，ng/mL）。
測試化合物 CD8+ T細胞 NK細胞 Treg細胞 CD8/Treg的比值
運行1
實施例24：rIL-2對照 37.10 9.34 0.04 928
實施例28：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)]-[rIL-2] 796.82 140.88 1.46 546
實施例30： [17K mPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)]-[rIL-2] 244.70 60.04 0.36 680
實施例32：[20K支鏈-mPEG]-[rIL-2] 491.04 104.74 0.84 584
實施例33：[20K Y-mPEG-T 1]-[rIL-2] 788.28 159.86 1.93 408
實施例34：[20K Y-mPEG-T 2]-[rIL-2] 565.81 89.28 1.31 432
實施例35：[20K Y-mPEG-T 3]-[rIL-2] 988.17 188.43 2.06 480
運行2
實施例24：rIL-2對照 78.50 22.02 0.26 302
實施例36：[20K Y-mPEG-T 4]-[rIL-2] 575.99 136.60 2.43 237
運行3
實施例24：rIL-2對照 37.48 4.01 0.02 1874
實施例29：[17K mPEG-(Cl-Ph-SO 2)] z-[rIL-2] 4132.07 1020.46 5.45 758
實施例31： [17KmPEG-(Cl,CONH-Ph-SO 2)] z-[rIL-2]-6 14060.81 1008.18 6.79 2070
實施例35：[20K Y-mPEG-T 3]-[rIL-2] 6500.88 309.44 11.41 569
實施例42：[20K Y-mPEG]-[rIL-2] 2416.22 161.95 2.00 1208
實施例47
皮下CT26鼠科結腸癌同基因模型效力研究
將0.1ml PBS中的5×10 5個CT26細胞分別在右前側腹區皮下植入7-10周大的同基因雌性BALB/c小鼠。使腫瘤生長至明顯尺寸，即80-110cu mm，然後如所設計的隨機化並分組（n=8）。以如表6-8中所示的不同劑量濃度和劑量方案向小鼠施用測試化合物，即rIL-2、rIL-2-聚合物綴合物或媒介物。每週測量三次體重和腫瘤體積。在左前腹側用0.1ml PBS中的CT26腫瘤細胞（5×10 5）再次激發無腫瘤超過30天的小鼠。觀察再次激發的腫瘤生長至少42天。
表6. 圖5A和5B的分組情況。
組 測試化合物 劑量濃度（mg/kg） 施用途徑 劑量
1 媒介物 - IV qw×3
2 rIL-2對照 2 IP b.i.d.×5，2個循環
3 實施例37 1 IV qw×3
4 實施例43 1 IV qw×3
注意：“b.i.d×5”表示每天兩次，共計5天；在第1、2、3、4、5天和第7、8、9、10、11天劑量施用2個循環；“qw×4”表示每週一次，共計4個循環。媒介物是10mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5的緩衝液。
表7. 圖6A和6B的分組情況。
組 測試化合物 劑量濃度（mg/kg） 施用途徑 劑量
1 媒介物 - IV qw×4
2 rIL-2對照 3（第一循環） 2（第二循環） IP b.i.d.×5，2個循環
3 實施例37 3 IV qw×4
4 實施例37 6 IV qw×4
5 實施例43 3 IV qw×4
6 實施例43 6 IV qw×2
7 實施例29 3 IV qw×4
8 實施例29 6 IV qw×4
9 實施例31 3 IV qw×4
10 實施例31 6 IV qw×4
注意：“b.i.d×5”表示每天兩次，共計5天；在第1、2、3、4、5天和第7、8、9、10天劑量施用2個循環；“qw×4”表示每週一次，共計4個循環。媒介物是10mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5的緩衝液。
表8. 圖7A和7B的分組情況。
組 測試化合物 劑量濃度（mg/kg） 施用途徑 劑量
1 媒介物 - IV qw×4
2 rIL-2對照 2 IP b.i.d.×5，2個循環
3 實施例43 3 IV qw×4
4 實施例43 5 IV qw×4
5 實施例35 3 IV qw×4
6 實施例31 6 IV qw×4
7 實施例31 8 IV qw×4
8 實施例31 3 IV b.i.w
9 實施例31 4 IV b.i.w
10 實施例41 4 IV qw×4
11 實施例41 6 IV qw×4
12 實施例41 8 IV qw×4
注意：“b.i.d×5”表示每天兩次，共計5天；在第1、2、3、4、5天和第7、8、9、10、11天劑量施用2個循環；“qw×4”表示每週一次，共計4個循環。“b.i.w”表示每週兩次。媒介物是10mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5的緩衝液。
圖5A-7B提供了以不同施用方案施用rIL-2和rIL-2-聚合物綴合物後的腫瘤生長抑制。表9-11中顯示了不同處理組的腫瘤生長抑制（TGI）、完全性反應（CR）率、毒性和再次激發結果。腫瘤生長抑制；TGI%=1-ΔT/ΔC）×100；Ti和Ci作為測量當天處理組和媒介物組的平均腫瘤體積；T 0和C0作為第0天時處理組和媒介物組的平均腫瘤體積。
表9. 圖5A和5B的腫瘤抑制劑結果。
組 測試化合物 劑量（mg/kg） TGI （第19天） CR 毒性 再次激發
2 rIL-2對照 2 61.76% 1/8 0/8 1/1
3 實施例37 1 30.44% 0/8 0/8 -
4 實施例43 1 52.37% 0/8 0/8 -
注意：將CR報告為無腫瘤小鼠數/治療的小鼠數。將毒性報告為死亡小鼠數/治療小鼠數。將再次激發結果報告為最終無腫瘤小鼠數/再次激發的小鼠數。
表10. 圖6A和6B腫瘤生長抑制資料。
組 測試化合物 劑量（mg/kg） TGI （第15天） CR 毒性 再次激發
2 rIL-2對照 3、2 95.71% （第8天） 0/8 8/8 -
3 實施例37 3 88.09% 5/8 0/8 5/5
4 實施例37 6 95.27% 6/8 1/8 6/6
5 實施例43 3 76.03% 3/8 0/8 3/3
6 實施例43 6 101.82% - 8/8 -
7 實施例29 3 87.28% 5/8 0/8 5/5
8 實施例29 6 92.83% 6/8 0/8 6/6
9 實施例31 3 89.69% 5/8 0/8 5/5
10 實施例31 6 84.10% 6/8 0/8 6/6
注意：將CR報告為無腫瘤小鼠數/治療的小鼠數。將毒性報告為死亡小鼠數/治療小鼠數。將再次激發結果報告為最終無腫瘤小鼠數/再次激發的小鼠數。
表11. 圖7A和7B的腫瘤生長抑制資料。
組 測試化合物 劑量（mg/kg） TGI （第17天） CR 毒性 再次激發
2 rIL-2對照 2 102.41% 1/8 7/8 1/1
3 實施例43 3 85.72% 2/8 2/8 2/2
4 實施例43 5 96.98% 4/8 0/8 4/4
5 實施例35 3 95.41% 5/8 0/8 5/5
6 實施例31 6 98.93% 7/8 0/8 7/7
7 實施例31 8 100.82% 8/8 0/8 8/8
8 實施例31 3 89.10% （第8天） 0/8 8/8 -
9 實施例31 4 103.83% （第8天） 0/8 8/8 -
10 實施例41 4 83.18% 2/8 0/8 2/2
11 實施例41 6 95.46% 2/8 1/8 2/2
12 實施例41 8 89.02% 3/8 0/8 3/3
注意：將CR報告為無腫瘤小鼠數/治療的小鼠數。將毒性報告為死亡小鼠數/治療小鼠數。將再次激發結果報告為最終無腫瘤小鼠數/再次激發的小鼠數。
這些結果表明所評價的rIL-2-聚合物綴合物證明瞭在較低的劑量下相對於rIL-2的更好效力，rIL-2以2或3mg/kg b.i.d.劑量施用2個循環。實施例29、31、35、37和41均顯示出比rIL-2好得多的效力和更低的毒性。實施例31證明在小鼠模型中以8mg/kg qw劑量施用時的100% CR，其沒有明顯的毒性。當降低劑量並更換為每週兩次劑量施用時，觀察到了致死毒性。
比較體內模型中的實施例37和實施例43，已證明從兩步PEG化方法合成的實施例37顯示出更高的效力和更低的毒性（表10）。實施例37以3mg/kg劑量提供了62.5% CR。而從傳統PEG試劑PEG化方法合成的實施例43，以3mg/kg劑量僅提供了37.5% CR。以6mg/kg劑量，實施例43對所有小鼠均是致命的，而實施例37是很好耐受的並且提供了75% CR的效力。因此，通過方案1方法PEG化的IL-2顯示出比通過傳統PEG方法PEG化的IL-2更好的治療窗、更高的效力和更低的毒性。
為了研究這些治療是否可以引起持久性腫瘤特異的T細胞應答，當所有治癒的小鼠無腫瘤至少一個月時，用CT26細胞再次激發來自這些處理組的所有治癒的小鼠。在再次激發後，治癒的小鼠保持無腫瘤超過42天。
實施例48
皮下MC38鼠科結腸癌同基因模型效力研究
將0.1ml PBS中的1×10 6個MC38細胞分別在右前側腹區皮下植入7-10周大的同基因雌性C57BL/6小鼠。使腫瘤生長至明顯尺寸，即80-100cu mm，然後如所設計的隨機化並分組（n=8）。以如表12中所示的不同劑量濃度和劑量方案向小鼠施用測試化合物，即rIL-2、rIL-2-聚合物綴合物或媒介物。每週測量三次體重和腫瘤體積。
表12. 圖8的分組情況。
組 測試化合物 劑量濃度（mg/kg） 施用途徑 劑量
1 媒介物 - IV qw×4
2 rIL-2對照 2 IP b.i.d.×5，2個循環
3 實施例43 1 IV qw×4
4 實施例43 3 IV qw×4
5 實施例43 6 IV qw×4
6 實施例31 1 IV qw×4
7 實施例31 3 IV qw×4
8 實施例31 6 IV qw×4
9 實施例38 1 IV qw×4
10 實施例38 3 IV qw×4
11 實施例38 6 IV qw×4
注意：“b.i.d×5”表示每天兩次，共計5天；在第1、2、3、4、5天和第7、8、9、10、11天劑量施用2個循環；“qw×4”表示每週一次，共計4個循環。媒介物是10mM乙酸鈉，150mM NaCl，pH 4.5的緩衝液。
圖8提供了以不同施用方案施用rIL-2和rIL-2-聚合物綴合物後的腫瘤生長抑制。表13中顯示了不同處理組的腫瘤生長抑制（TGI）、完全性反應（CR）率和毒性。腫瘤生長抑制；TGI%=1-ΔT/ΔC）×100；Ti和Ci作為測量當天處理組和媒介物組的平均腫瘤體積；T 0和C0作為第0天時處理組和媒介物組的平均腫瘤體積。
表13. 圖8的腫瘤生長抑制資料。
組 測試化合物 劑量（mg/kg） TGI（第15天） CR（第38天） 毒性
2 rIL-2對照 2 100.75% 1/8 7/8
3 實施例43 1 77.17% 1/8 0/8
4 實施例43 3 98.41% 6/8 1/8
5 實施例43 6 101.99% 2/8 6/8
6 實施例31 1 73.86% 0/8 0/8
7 實施例31 3 98.32% 7/8 0/8
8 實施例31 6 100.86% 8/8 0/8
9 實施例38 1 78.13% 1/8 0/8
10 實施例38 3 98.97% 8/8 0/8
11 實施例38 6 91.84% 4/8 0/8
注意：將CR報告為無腫瘤小鼠數/治療的小鼠數。將毒性報告為死亡小鼠數/治療小鼠數。
這些結果表明從兩步PEG化方法合成的所評價的rIL-2-聚合物綴合物證實相對於rIL-2和由傳統PEG試劑綴合所製備的參考PEG-IL2綴合物的更好的效力和更低的毒性。實施例31和實施例38兩者分別以6mg/kg和3mg/kg實現了100% CR。另外，使用小接頭的IL-2的官能化數將影響效力。將實施例31（以x平均值=6的小接頭官能化）與實施例38（以x平均值=4的小接頭官能化）的效力相比，實施例38在1mg/kg和3mg/kg的低劑量下更有效。實施例31具有更好的劑量反應並且證明在6mg/kg的高劑量下效力更好。 [作為參考併入]
本文所引用的所有參考文獻、論文、出版物、專利、專利公開和專利申請出於所有目的以其全部內容作為參考併入本文。然而，對本文所引用的任何參考文獻、論文、出版物、專利、專利公開和專利申請的提及不是也不應視為對下列情況的承認或任何形式的暗示：在全世界任何國家，它們構成有效的先前技術或者構成一般常識的一部分。
無
圖1顯示了rIL-2的胺基酸序列（SEQ ID NO:1）。
圖2顯示了通過LC-MS對於實施例25、實施例26和實施例27所確定的IL-2-(N 3) x的分佈。
圖3A-3D顯示了通過LC-MS對實施例31（圖3A）、實施例38（圖3B）、實施例39（圖3C）和實施例40（圖3D）所確定的IL-2-(N 3) x分佈。
圖4A-4B顯示了通過SDS-PAGE對實施例37（圖4A）和實施例40（圖4B）所確定的平均PEG化程度。
圖5A-5B顯示了rIL-2、實施例37和實施例43的CT26同基因腫瘤模型資料。
圖6A-6B顯示了rIL-2、實施例37、實施例43、實施例29和實施例31的CT26同基因腫瘤模型資料。
圖7A-7B顯示了rIL-2、實施例43、實施例35、實施例31和實施例41的CT26同基因腫瘤模型資料。
圖8顯示了rIL-2、實施例43、實施例31和實施例38的MC38同基因腫瘤模型資料。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (135)

  1. 一種包含共價連接至至少一個接頭的蛋白的綴合物，所述綴合物包含如化學式（XIX）的結構， 蛋白-(L) z（XIX） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， z為1至25的整數， 每個L獨立地為接頭，且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  2. 如請求項1所述之綴合物，其中， a）至少一個所述接頭是非可釋放接頭；和/或 b）至少一個所述接頭是可釋放接頭。
  3. 如請求項2所述之綴合物，其中，所述可釋放接頭是化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-B-2）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXI-2）、（XXII）、（XXII-1）、（XXII-2）、（II）、（II-1）、（II-A）、（III）、（III-1）或（IV）；RL-1；RL-2；或RL-3所示的可釋放接頭。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包含如化學式（XXIII）所示的結構， (L 2) z2-蛋白-(L 1) z1（XXIII） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數， 每個L 1獨立地為可釋放接頭， 每個L 2獨立地為非可釋放接頭，且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之綴合物，其中，所述接頭L、L 1或L 2分別獨立地包含能夠通過點擊化學反應的官能團FG 2，其選自疊氮化物、炔基和環炔基。
  6. 如請求項1至5所述之綴合物，其中，所述接頭共價連接至所述蛋白內的殘基的胺基。
  7. 如請求項6所述之綴合物，其中，所述殘基是離胺酸。
  8. 一種組合物，其包含如請求項1至7中任一項所述之綴合物的混合物。
  9. 一種綴合物，其包含蛋白；至少一個接頭；和至少一個大分子，其中，所述蛋白通過所述接頭共價連接至每個所述大分子，其中，所述大分子是直鏈或支鏈水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
  10. 如請求項9所述之綴合物，其中， a）至少一個所述接頭是可釋放接頭， b）每個所述接頭是可釋放接頭，或者 c）至少一個所述接頭是非可釋放接頭。
  11. 如請求項9或10所述之綴合物，其包含兩個或更多個接頭。
  12. 如請求項11所述之綴合物，其中， a）兩個或更多個所述接頭包含至少一個非可釋放接頭， b）兩個或更多個所述接頭包含至少一個可釋放接頭，或 c）兩個或更多個所述接頭包含1至8個可釋放接頭和1至3個非可釋放接頭。
  13. 如請求項10至12中任一項所述之綴合物，其中，所述可釋放接頭是化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-B-2）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXI-2）、（XXII）、（XXII-1）、（XXII-2）、（II）、（II-1）、（II-A）、（III）、（III-1）或（IV）；RL-1；RL-2；或RL-3所示的可釋放接頭。
  14. 如請求項9至13中任一項所述之綴合物，其中，所述大分子是聚(乙二醇)的聚合物。
  15. 如請求項14所述之綴合物，其中，用選自下列的封端部分對所述聚(乙二醇)封端：羥基、烷氧基、取代的烷氧基、烯氧基、取代的烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧基和取代的芳氧基。
  16. 如請求項9至15中任一項所述之綴合物，其中， a）所述大分子具有約500道爾頓至約100,000道爾頓的範圍內的重均分子量， b）所述大分子具有約500道爾頓至小於20,000道爾頓的範圍內的重均分子量， c）所述大分子具有約20,000道爾頓至小於85,000道爾頓的範圍內的重均分子量，或 d）所述大分子具有約85,000道爾頓至約100,000道爾頓的範圍內的重均分子量。
  17. 如請求項9至16中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物通過所述接頭在所述蛋白內的殘基的胺基處共價連接。
  18. 如請求項17所述之綴合物，其中，所述殘基是離胺酸。
  19. 如請求項18所述之綴合物，其中，所述大分子通過所述可釋放接頭連接至所述蛋白，並且所述大分子具有約500道爾頓至小於20,000道爾頓的範圍內的重均分子量。
  20. 如請求項9至19中任一項所述之綴合物，其中， a）一個或多個所述大分子通過一個或多個所述接頭連接至所述蛋白；或者 b）8個或更多個所述大分子通過8個或更多個所述接頭連接至所述蛋白。
  21. 如請求項9至20中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包含如化學式（XX-I）的結構， (FG 2-L) y-蛋白-(L-大分子) z（XX-I） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， z為1至25的整數， y是0至24的整數， 每個L獨立地為接頭， 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；且 每個大分子獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
  22. 如請求項21所述之綴合物，其中， a）至少一個所述接頭是非可釋放接頭；和/或 b）至少一個所述接頭是可釋放接頭。
  23. 如請求項21或22所述之綴合物，其中， z是1至5的整數；且 L是非可釋放接頭。
  24. 如請求項23所述之綴合物，其中，所述綴合物從如請求項1所述之綴合物與適合的大分子的點擊化學反應產生，其中如請求項1所述之綴合物中的L分別獨立地包含能夠通過點擊化學反應的官能團FG 2，其選自疊氮化物、炔基和環炔基。
  25. 如請求項1至20中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXIV）的結構， (大分子 2-L 2) z2-蛋白-(L 1) z1（XXIV） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數， 每個L 1獨立地為可釋放接頭或非可釋放接頭且無能夠通過點擊化學反應的官能團， 每個L 2獨立地為可釋放接頭或非可釋放接頭， 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽，且 每個大分子 2獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
  26. 如請求項1至24中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXV）的結構， (FG 2-L 2) z2-蛋白-(L 1-大分子 1) z1（XXV） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， z1是1至20的整數； z2是1至5的整數； 每個L 1獨立地為可釋放接頭或非可釋放接頭， 每個L 2獨立地為可釋放接頭或非可釋放接頭， 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；且 每個大分子 1獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
  27. 如請求項25或26所述之綴合物，其中， a）每個L 1為可釋放接頭且每個L 2為非可釋放接頭， b）每個L 1為可釋放接頭且每個L 2為可釋放接頭，或者 c）每個L 1為非可釋放接頭且每個L 2為可釋放接頭。
  28. 如請求項9至20和25中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXVI）的結構， (大分子 2-L 2) z2-蛋白-(L 1-大分子 1) z1（XXVI） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數， 每個L 1獨立地為可釋放接頭， 每個L 2獨立地為非可釋放接頭， 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽， 每個大分子 1獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽，且 每個大分子 2獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
  29. 如請求項28所述之綴合物，其中，所述綴合物是從如請求項26所述之綴合物與適合的大分子的點擊化學反應產生的。
  30. 如請求項9至20中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物是從如請求項25至29中任一項所述之綴合物的水解產生的並且包括如化學式（XXVII）的結構， (大分子 2-L 2) z2-蛋白 （XXVII） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、或其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， z2是1至5的整數， 每個L 2獨立地為非可釋放接頭， 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽，且 每個大分子 2獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
  31. 一種組合物，其包含如請求項9至30中任一項所述之綴合物的混合物。
  32. 一種組合物，其包含多個如請求項1至3和21至24中任一項所述之綴合物，其中，多個所述綴合物的z的平均值在1至約8之間。
  33. 如請求項32所述之組合物，其中，多個所述綴合物的z的平均值在1至約4之間。
  34. 如請求項1至7中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXVIII）的結構，
    Figure 03_image081
    （XXVIII） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體， 其中， 每個X獨立地為間臂部分或氫， 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， 每個a獨立地為0至4的整數， z為1至25的整數， 每個Y 1獨立地為O或S， 每個Y 2獨立地為O或S，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  35. 如請求項34所述之綴合物，其中， a為0至2的整數， Y 1和Y 2分別為O， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et，且 每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
  36. 如請求項34或35所述之綴合物，其中，所述綴合物具有下列結構，
    Figure 03_image083
    。
  37. 如請求項1至7中任一項所述之的綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXIX）的結構，
    Figure 03_image085
    （XXIX） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體， 其中， 每個X 1獨立地為間臂部分或氫， 每個X 2獨立地為間臂部分， 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， 每個a獨立地為0至4的整數， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數， Y 1、Y 2和Y 3分別獨立地為O或S， 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  38. 如請求項37所述之綴合物，其中， 每個a獨立地為0至2的整數， Y 1、Y 2和Y 3為O， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et，且 每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
  39. 如請求項37或38所述之綴合物，其中，所述綴合物具有下列結構，
    Figure 03_image089
    。
  40. 如請求項1至7中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXIX-I）的結構，
    Figure 03_image419
    （XXIX-I） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體， 其中， 每個X 2獨立地為間臂部分， z2是1至5的整數， 每個Y 3獨立地為O或S， 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  41. 如請求項40所述之綴合物，其中，所述綴合物具有下列結構，
    Figure 03_image421
    。
  42. 如請求項9至30中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XIII-I）的結構，
    Figure 03_image129
    （XIII-I） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， 每個POLY 1獨立地為第一直鏈或支鏈水溶性聚合物， 每個POLY 2獨立地為第二直鏈或支鏈水溶性聚合物， 當相鄰的c是1或2時，每個X 1獨立地為第一間臂部分， 當相鄰的c為0時，每個X 1獨立地為氫或-X-FG 2， 當存在時，每個X 2獨立地為第二間臂部分， 每個T 1獨立地為第一三唑官能團， 每個T 2獨立地為第二三唑官能團， 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基；或-X-FG 2， 每個X獨立地為間臂部分， 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團， 每個a獨立地為0至5的整數， 每個b獨立地為0至3的整數， 每個c獨立地為0至2的整數， z為1至25的整數， y為0至24的整數， 每個Y 1獨立地為O或S， 每個Y 2獨立地為O或S，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  43. 如請求項42所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如（XIII-A-I）的結構，
    Figure 03_image139
    。 （XIII-A-I）
  44. 如請求項42或43所述之綴合物，其中， 每個a獨立地為0至2的整數， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et，且 每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
  45. 如請求項42至44中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XIII-A1-I）的結構，
    Figure 03_image143
    （XIII-A1-I） 其中， 每個a獨立地為1至2的整數， 每個R e獨立地為4-F、4-Cl、4-CF 3、2,4-二氟或2-CF 3-4-F取代， 每個n獨立地為4至1500的整數， y為0至24的整數， z為1至25的整數，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  46. 如請求項42至45中任一項所述之綴合物，其中，每個a為1，每個R e獨立地為4-Cl或2-CF 3-4-F取代，每個n獨立地為4至1500的整數，z是1至10的整數，y為0至10的整數，且蛋白為IL-2。
  47. 如請求項42至46中任一項所述之綴合物，其中，z為1、3或6。
  48. 一種組合物，其包含多個如請求項42至47中任一項所述之綴合物，其中，多個所述綴合物的z的平均值在1至約8之間。
  49. 如請求項48所述之組合物，其中，多個所述綴合物的z的平均值在1至約4之間。
  50. 如請求項42所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XIII-B-I）的結構，
    Figure 03_image145
    （XIII-B-I）                                       。
  51. 如請求項51所述之綴合物，其中， 每個a獨立地為0至2的整數， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et，且 每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
  52. 如請求項50或51所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XIII-B1-I）的結構，
    Figure 03_image159
    （XIII-B1-I） 其中， 每個n獨立地為4至1500的整數， y為0至24的整數， z為1至25的整數，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  53. 如請求項50至52中任一項所述之綴合物，其中，z是1至10的整數，y為0至10的整數，且蛋白為IL-2。
  54. 如請求項50至53中任一項所述之綴合物，其中，z為1、3或6。
  55. 一種組合物，其包含多個如請求項50至54中任一項所述之綴合物，其中，多個所述綴合物的z的平均值在1至約8之間。
  56. 如請求項55所述之組合物，其中，多個所述綴合物的z的平均值在1至約4之間。
  57. 如請求項42所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XIII-C-I）的結構，
    Figure 03_image147
    （XIII-C-I）                                     。
  58. 如請求項57所述之綴合物，其中， 每個a獨立地為0至2的整數， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et，且 每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
  59. 如請求項57或58所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XIII-C1-I）的結構，
    Figure 03_image161
    （XIII-C1-I） 其中， 每個n獨立地為4至1500的整數， z為1至25的整數， y為0至24的整數，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  60. 如請求項42所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XIII-D-I）的結構，
    Figure 03_image149
    （XIII-D-I）                                           。
  61. 如請求項60所述之綴合物，其中， 每個a獨立地為0至2的整數， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et，且 每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
  62. 如請求項60或61所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XIII-D1-I）或化學式（XIII-D2-I）的結構，
    Figure 03_image163
    （XIII-D1-I）或
    Figure 03_image165
    （XIII-D2-I） 其中， 每個n獨立地為4至1500的整數， z為1至25的整數， y為0至24的整數，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  63. 一種組合物，其包含多個如請求項57至62中任一項所述之綴合物，其中，多個所述綴合物的z的平均值在1至約8之間。
  64. 如請求項63所述之組合物，其中，多個所述綴合物的z的平均值在1至約4之間。
  65. 如請求項9至30中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXXI）的結構，
    Figure 03_image167
    （XXXI） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， 每個X 1獨立地為間臂部分或氫， 每個X 2獨立地為間臂部分， 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， 每個T 2獨立地為三唑官能團， 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， 每個a獨立地為0至4的整數， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數， Y 1、Y 2和Y 3分別獨立地為O或S，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  66. 如請求項65所述之綴合物，其中， 每個a獨立地為0至2的整數， Y 1、Y 2和Y 3分別為O， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et，且 每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
  67. 如請求項65或66所述之綴合物，其中，所述綴合物具有下列結構，
    Figure 03_image169
    其中， 每個n獨立地為4至1500的整數， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  68. 如請求項65至67中任一項所述之綴合物，其中，z1是1至10的整數，z2是1至3的整數，且蛋白為IL-2。
  69. 如請求項65至68中任一項所述之綴合物，其中，z1是3至4的整數，且z2是1。
  70. 如請求項9至30中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXXII）的結構，
    Figure 03_image171
    （XXXII） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， 每個X 2獨立地為間臂部分， 每個T 2獨立地為三唑官能團， 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， z2是1至5的整數， 每個Y 3獨立地為O或S，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  71. 如請求項9至30中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXXII-I）的結構，
    Figure 03_image173
    （XXXII-I） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， 每個X 2獨立地為間臂部分， 每個T 2獨立地為三唑官能團， 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， y是1至5的整數， z2是1至5的整數， 每個Y 3獨立地為O或S， 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  72. 如請求項70或71所述之綴合物，其中，每個Y 3為O。
  73. 如請求項70所述之綴合物，其中，所述綴合物具有下列結構，
    Figure 03_image175
    其中， 每個n獨立地為4至1500的整數， z2是1至3的整數，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  74. 如請求項71所述之綴合物，其中，所述綴合物具有下列結構，
    Figure 03_image177
    其中， 每個n獨立地為4至1500的整數， y是1至3的整數， z2是1至3的整數，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  75. 如請求項73或74所述之綴合物，其中，z2是1，且蛋白為IL-2。
  76. 如請求項9至30中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXXIV）的結構，
    Figure 03_image181
    （XXXIV） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， 每個POLY 1獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， 每個POLY 3獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， a1和a2分別獨立地為0至4的整數， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數， 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， 每個X 1獨立地為間臂部分， 每個X 2獨立地為間臂部分， 每個X 3獨立地為間臂部分， 每個Y 1獨立地為O或S， 每個Y 2獨立地為O或S， 每個Y 3獨立地為O或S， 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基，且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  77. 如請求項76所述之綴合物，其中， a1和a2分別獨立地為0至2的整數， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et， R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3，且 Y 1、Y 2和Y 3分別為O。
  78. 如請求項76或77所述之綴合物，其中，所述綴合物具有下列結構，
    Figure 03_image183
    其中， 每個n獨立地為4至1500的整數， z1是1至10的整數， z2是1至3的整數，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  79. 如請求項76至78中任一項所述之綴合物，其中，z1是4；z2是1，且蛋白為IL-2。
  80. 一種綴合物，其水解自如請求項9至30和76中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXXV）的結構，
    Figure 03_image185
    （XXXV） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， 每個POLY 3獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， z2是1至5的整數， 每個X 3獨立地為間臂部分， 每個Y 3為O或S， 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基，且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  81. 如請求項80所述之綴合物，其中，Y 3是O，且z2是1至3的整數。
  82. 如請求項80或81所述之綴合物，其中，所述綴合物具有下列結構，
    Figure 03_image187
    其中，每個n獨立地為4至1500的整數，z2是1，蛋白是IL-2，且每個連接至所述蛋白的-NH-是IL-2內殘基的胺基。
  83. 如請求項9至30中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXXVI）的結構，
    Figure 03_image189
    （XXXVI） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， 每個POLY 1獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， a1和a2分別獨立地為0至4的整數， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數， 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， 每個X 1獨立地為間臂部分， 每個X 2獨立地為間臂部分， 每個X 3獨立地為間臂部分， 每個Y 1獨立地為O或S， 每個Y 2獨立地為O或S， 每個Y 3獨立地為O或S， 每個FG 2獨立地為能夠通過點擊化學反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團， 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基，且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  84. 如請求項83所述之綴合物，其中， a1和a2分別獨立地為0至2的整數， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et， R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3，且 Y 1、Y 2和Y 3分別為O。
  85. 如請求項83或84所述之綴合物，其中，所述綴合物具有下列結構，
    Figure 03_image191
    其中， 每個n獨立地為4至1500的整數， z1是1至10的整數， z2是1至3的整數，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  86. 如請求項83至85中任一項所述之綴合物，其中，z1是1至4的整數，z2是1，蛋白為IL-2。
  87. 如請求項9至30中任一項所述之綴合物，其中，所述綴合物包括如化學式（XXXVII）的結構，
    Figure 03_image193
    （XXXVII） 或其立體異構物、位置異構物、互變異構物或混合物、其同位素變體；或其藥物可用的鹽、溶劑化物、水合物或前體藥物， 其中， 每個POLY 1獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， 每個POLY 2獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， 每個POLY 3獨立地為直鏈或支鏈水溶性聚合物， 每個R 1獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R 2獨立地為氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， a1和a2分別獨立地為0至4的整數， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數， 當存在時，每個R el獨立地為第一電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， 當存在時，每個R e2獨立地為第二電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， 每個X 1獨立地為間臂部分， 每個X 2獨立地為間臂部分， 每個X 3獨立地為間臂部分， 每個Y 1為O或S， 每個Y 2為O或S， 每個Y 3為O或S， 每個T獨立地為三唑官能團， 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基，且 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  88. 如請求項87所述之綴合物，其中， a1和a2分別獨立地為0至2的整數， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et， R e1和R e2分別獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3，且 Y 1、Y 2和Y 3分別為O。
  89. 如請求項87或88所述之綴合物，其中，所述化合物具有下列結構，
    Figure 03_image195
    其中， 每個n獨立地為4至1500的整數， z1是1至10的整數， z2是1至3的整數，且 每個連接至所述蛋白的-NH-為所述蛋白內殘基的胺基。
  90. 如請求項87至89中任一項所述之綴合物，其中，z1是1至4的整數，z2是1，且蛋白為IL-2。
  91. 如請求項5至7、21至24、26、27、37、38、40、42至44、71、72、83和84中任一項所述之綴合物，其中，所述環炔基為二苯并環辛炔（DBCO）。
  92. 如請求項1至7、9至30、34至47、50至54、57至62和65至90中任一項所述之綴合物，其中，一個或多個所述蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  93. 如請求項92所述之綴合物，其中，所述細胞因子為M-CSF、G-CSF、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37、IL-38、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β或CXL10。
  94. 如請求項92或93所述之綴合物，其中，所述細胞因子為IL-2。
  95. 如請求項93或94所述之綴合物，其中，所述IL-2包含與SEQ ID NO:1約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
  96. 如請求項92所述之綴合物，其中，所述趨化因子為MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309（CCL1）、BCA1（CXCL13）、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸細胞活化趨化因子-1、嗜酸細胞活化趨化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC（CCL20）、ELC（CCL19）、SLC（CCL21）、ENA-78、PBP、TECK（CCL25）、CTACK（CCL27）、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
  97. 如請求項92所述之綴合物，其中，所述抗體靶向以下中的一種或多種：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受體樣激酶1、澱粉狀蛋白A蛋白、β-澱粉狀蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125（模擬）、C5、CA-125、CCL11（嗜酸細胞活化趨化因子-1）、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C242抗原、CD276、CD278、CD319、艱難梭菌（ clostridium difficile）、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、達比加群（Dabigatran）、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、內皮糖蛋白（Endoglin）、上皮唾蛋白（episialin）、EPHA3、c-Met、FGFR2、纖維蛋白IIβ鏈、FGF 23、葉酸受體1、GMCSF、GD2神經節糖苷、GDF-8、GCGR、明膠酶B、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受體α-鏈、激肽釋放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受體、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干擾素α/β受體、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、B型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-選擇素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、間皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、連接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂醯絲胺酸、RANKL、RTN4、獼猴因子、ROR1、SLAMF7、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）α毒素、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）雙組分殺白細胞素、SOST、選擇素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受體、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
  98. 如請求項34、35、37、38、40、42至44、46、47、50、51、53、54、57、58、65、66、68-72、76、77、79至81、83、84、86至88和90至97中任一項所述之綴合物，其中，所述間臂部分為-O-、-NH-、-S-、-S-S-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-OP(O)(OH)-、-OP(S)(OH)-、-C(S)-、-[CH 2] 1-6-、-O-CH 2-、-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-O-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-O-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-O-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-O-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-O-CH 2-、-C(O)-O-CH 2-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-、-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-、-O-C(O)-NH-CH 2-CH 2-、-NH-CH 2-、-NH-CH 2-CH 2-、-CH 2-NH-CH 2-、-CH 2-CH 2-NH-CH 2-、-C(O)-CH 2-、-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-CH 2-CH 2-、-CH 2-CH 2-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-、-CH 2-CH 2-CH 2-C(O)-NH-CH 2-CH 2-NH-C(O)-CH 2-CH 2-、-[CH 2] 0-6-O-(CH 2CH 2O) 1-20-[CH 2] 0-6-或-O-C(O)-NH-[CH 2] 0-6-(OCH 2CH 2) 0-20-。
  99. 如請求項42、60和61中任一項所述之綴合物，其中所述間臂部分為
    Figure 03_image001
    或
    Figure 03_image003
    。
  100. 如請求項9至30、42至44、46、47、50、51、53、54、57、78、60、61、65、66、68至72、76、77、79至81、83、84、86至88和90至99中任一項所述之綴合物，其中，所述直鏈或支鏈水溶性聚合物是聚(乙二醇)的聚合物。
  101. 一種可釋放接頭，其具有如化學式（XXI）的結構的，
    Figure 03_image031
    （XXI） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體， 其中， X為間臂部分或氫， R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， a為0至4的整數， FG 1為能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵的官能團。
  102. 如請求項101所述之可釋放接頭，其中， a為0至2的整數， R 1和R 2分別獨立地為氫、Me或Et，且 每個R e獨立地為硝基、氰基、鹵素、-CF 3、-CONHMe、-SO 2NHMe、-OMe、-NHMe、-NHAc、-NHSO 2Me或-OCF 3。
  103. 如請求項101或102所述之可釋放接頭，其中，所述可釋放接頭具有以下結構，
    Figure 03_image033
    。
  104. 一種可釋放接頭，其具有如化學式（XXII）的結構的，
    Figure 03_image035
    （XXII） 或其立體異構物、互變異構物或混合物或其同位素變體， 其中， X 1是間臂部分， R 1是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， R 2是氫、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基或取代的芳基， 每個R e獨立地為電子改變基團，其選自硝基、氰基、鹵素、醯胺、取代的醯胺、碸、取代的碸、磺醯胺、取代的磺醯胺、烷氧基、取代的烷氧基、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基， a為0至4的整數， Y 1為O或S， Y 2為O或S， FG 1為能夠與活性劑的氨基反應以形成可釋放鍵的官能團，且 FG 2是能夠通過點擊化學反應的官能團。
  105. 如請求項104所述之可釋放接頭，其中， a為0；R 1是氫，R 2是氫，Y 1是O，且Y 2是O。
  106. 如請求項104或105所述之可釋放接頭，其中，所述可釋放接頭具有以下結構，
    Figure 03_image037
    其中n是1至10的整數。
  107. 如請求項101、102、104和105中任一項所述之可釋放接頭，其中，FG 1是能夠與活性劑的氨基反應以形成氨基甲酸酯鍵的官能團。
  108. 如請求項107所述之可釋放接頭，其中，FG 1是
    Figure 03_image051
    。
  109. 如請求項104、105、107和108中任一項所述之可釋放接頭，其中，FG 2是疊氮化物、炔基或環炔基。
  110. 如請求項109所述之可釋放接頭，其中，所述環炔基是二苯并環辛炔（DBCO）。
  111. 一種如方案（II）用於製備蛋白-大分子綴合物的方法，
    Figure 03_image011
    （方案II） 其中， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數， 每個RL獨立地為可釋放接頭， 每個SL獨立地為非可釋放接頭， FG 4和FG 5分別獨立地為能夠與活性蛋白試劑的親核基團反應以形成鍵的官能團， FG 2是能夠通過點擊化學與FG 3反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團； FG 3是能夠通過點擊化學與FG 2反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團， 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽；且 大分子 1和大分子 2分別獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
  112. 一種如方案（III）用於製備蛋白-大分子綴合物的方法，
    Figure 03_image013
    （方案III） 其中， z1是1至20的整數， z2是1至5的整數， 每個RL獨立地為可釋放接頭， 每個SL獨立地為非可釋放接頭， FG 4和FG 5分別獨立地為能夠與活性蛋白試劑的親核基團反應以形成鍵的官能團， FG 2是能夠通過點擊化學與FG 3反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團， FG 3是能夠通過點擊化學與FG 2反應的官能團，其選自疊氮化物、炔基和環炔基基團， 蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽，且 大分子 1和大分子 2分別獨立地為水溶性聚合物、脂質、蛋白或多肽。
  113. 如請求項111或112所述之方法，其中， a）z1是1至10的整數，且z2是1至3的整數，或 b）z1是1至5的整數，且z2是1。
  114. 如請求項111至113中任一項所述之方法，其中，所述可釋放接頭是化學式（I）、（I-B）、（I-B-1）、（I-B-2）、（I-C）、（I-C-1）、（XVIII）、（XVIII-1）、（XXI）、（XXI-1）、（XXI-2）、（XXII）、（XXII-1）、（XXII-2）、（II）、（II-1）、（II-A）、（III）、（III-1）或（IV）；RL-1；RL-2；或RL-3所示的可釋放接頭。
  115. 如請求項111至114中任一項所述之方法，其中，所述蛋白是趨化因子、趨化因子拮抗劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、抗體或治療性肽。
  116. 如請求項115所述之方法，其中，所述細胞因子為M-CSF、G-CSF、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37、IL-38、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β或CXL10。
  117. 如請求項115或116所述之方法，其中，所述細胞因子為IL-2。
  118. 如請求項116或117所述之方法，其中，所述IL-2包含與SEQ ID NO:1約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
  119. 如請求項115所述之方法，其中，所述趨化因子為MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-24、MCP-5、CXCL76、I-309（CCL1）、BCA1（CXCL13）、MIG、SDF-1/PBSF、IP-10、I-TAC、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、嗜酸細胞活化趨化因子-1、嗜酸細胞活化趨化因子-2、GCP-2、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、LARC（CCL20）、ELC（CCL19）、SLC（CCL21）、ENA-78、PBP、TECK（CCL25）、CTACK（CCL27）、MEC、XCL1、XCL2、HCC-1、HCC-2、HCC-3或HCC-4。
  120. 如請求項115所述之方法，其中，所述抗體靶向以下中的一種或多種：血管生成素2、AXL、ACVR2B、血管生成素3、活化素受體樣激酶1、澱粉狀蛋白A蛋白、β-澱粉狀蛋白、AOC3、BAFF、BAFF-R、B7-H3、BCMAC、A-125（模擬）、C5、CA-125、CCL11（嗜酸細胞活化趨化因子-1）、CEA、CSF1R、CD2、CD3、CD4、CD6、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD54、CD56、CD70、CD74、CD97B、CD125、D134、CD147、CD152、CD154、CD279、CD221、C242抗原、CD276、CD278、CD319、艱難梭菌（ clostridium difficile）、密封蛋白18同工型2、CSF1R、CEACAM5、CSF2、碳酸酐酶9、CLDN18.2、心肌肌球蛋白、CCR4、CGRP、凝血因子III、c-Met、CTLA-4、DPP4、DR5、DLL3、DLL4、達比加群（Dabigatran）、EpCAM、埃博拉病毒糖蛋白、內皮糖蛋白（Endoglin）、上皮唾蛋白（episialin）、EPHA3、c-Met、FGFR2、纖維蛋白IIβ鏈、FGF 23、葉酸受體1、GMCSF、GD2神經節糖苷、GDF-8、GCGR、明膠酶B、磷脂醯肌醇蛋白聚糖3、GPNMB、GMCSF受體α-鏈、激肽釋放酶、KIR2D、ICAM-1、ICOS、IGF1、IGF2、IGF-1受體、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4Rα、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-9、IL-12、IL-13、IL17A、IL17F、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、整合素α4β7、干擾素α/β受體、流感A血球凝集素、ILGF2、HER1、HER2、HER3、HHGFR、HGF、HLA-DR、B型肝炎表面抗原、HNGF、Hsp90、HGFR、L-選擇素、Lewis-Y抗原、LYPD3、LOXL2、LIV-1、MUC1、MCP-1、MSLN、間皮素、MIF、MCAM、NCA-90、NCA-90Notch 1、連接素-4、PCDP1、PD-L1、PD-1、PCSK9、PTK7、PCDC1、磷脂醯絲胺酸、RANKL、RTN4、獼猴因子、ROR1、SLAMF7、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）α毒素、金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）雙組分殺白細胞素、SOST、選擇素P、SLITRK6、SDC1、TFPI、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、TNF-α、TWEAK受體、TNFRSF8、TYRP1、τ蛋白、TAG-72、TSLP、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TGF-β、TAG-72、TRAP、TIGIT、固生蛋白C、OX-40、VEGF-A、VWF、VEGFR1或VEGFR2。
  121. 如請求項111至120中任一項所述之方法，其中，所述大分子、所述大分子 1和所述大分子 2分別獨立地為脂肪酸，其包含約6至約26個碳原子，所述聚合物之一選自：2-甲丙烯醯-氧乙基磷醯膽鹼、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸脂)、聚(丙烯醯胺)、聚(N-丙烯醯嗎啉)、聚(烷氧基)聚合物、聚(醯胺)、聚(醯胺胺)、聚(胺基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬醯胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚對苯二甲酸丁二醇酯、聚(己內酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯醯胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(磷酸三乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(α-羥酸)、聚(羥乙基丙烯酸脂)、聚(羥乙基噁唑啉)、聚(羥基甲基丙烯酸酯)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)、聚(羥丙基噁唑啉)、聚(亞氨基碳酸酯)、聚（乳酸）、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯醯胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有機磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚磷腈、聚(丙二醇)、聚(糖)、聚(矽氧烷)、聚(氨基甲酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲醚)、聚(乙烯吡硌烷酮)、矽酮、直鏈澱粉、纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、幾丁質、殼聚糖、右旋糖酐、糊精、明膠、透明質酸（HA）和衍生物、官能化透明質酸、甘露聚糖、果膠、肝素、硫酸乙醯肝素（HS）、鼠李聚糖半乳糖醛酸、澱粉、羥烷基澱粉、羥乙基澱粉（HES）、聚唾液酸（PSA）及其它碳水化合物-基聚合物、木聚糖，以及白蛋白、轉鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白、免疫球蛋白、XTEN肽的共聚物、富甘胺酸高胺基酸聚合物（HAP）、PAS多肽、彈性蛋白-樣多肽（ELP）、CTP肽或明膠-樣蛋白（GLK）聚合物。
  122. 如請求項111至121中任一項所述之方法，其中，所述環炔基為二苯并環辛炔（DBCO）。
  123. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至7、9至30、34至47、50至54、57至62和65至100中任一項所述之綴合物；和一種或多種藥物可用的賦形劑。
  124. 一種藥物組合物，其包含多種如請求項1至7、9至30、34至47、50至54、57至62和65至100中任一項所述之綴合物；和一種或多種藥物可用的賦形劑。
  125. 一種藥物組合物，其包含至少一種如請求項21至24、42至47、50至54和57至62中任一項所述之綴合物。
  126. 如請求項125所述之藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含如請求項21至24、42至47、50至54和57至62中任一項所述之綴合物的混合物。
  127. 如請求項126所述之藥物組合物，其中，所述綴合物的混合物包含多種具有不同的z和/或y的綴合物。
  128. 如請求項127所述之藥物組合物，其中，所述綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物、其中z是2的綴合物、其中z是3的綴合物、其中z是4的綴合物、其中z是5的綴合物、和/或其中z是6的綴合物。
  129. 如請求項126或127所述之藥物組合物，其中，所述綴合物的混合物包含其中z是1的綴合物、其中z是2的綴合物、和/或其中z是3的綴合物。
  130. 一種治療對其有需要的受試者中的疾病或病況的方法，其包括向對其有需要的受試者施用如請求項8、31至33、48、49、55、56、63、64和123至129中任一項所述之藥物組合物或者如請求項1至7、9至30、34至47、50至54、57至62和65至100中任一項所述之綴合物。
  131. 如請求項130所述之方法，其中，所述疾病或病況是癌症、感染或自體免疫疾病。
  132. 如請求項130或131所述之方法，其進一步包括施用其它治療劑。
  133. 如請求項132所述之方法，其中，所述其它治療劑是抗體。
  134. 如請求項133所述之方法，其中，所述抗體是抗-腫瘤抗原抗體。
  135. 如請求項134所述之方法，其中，所述抗-腫瘤抗原抗體通過ADCC功能具有其活性。
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