CN114409736B - 一种基于两亲性寡肽的定相排列介质及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于两亲性寡肽的定相排列介质及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种基于两亲性寡肽的定相排列介质，该介质为采用多肽FKFKFKFK在高极性溶剂中自组装形成的溶致液晶相，制备时，将多肽完全溶解在高极性溶剂中即可，其用于通过核磁共振实验测定待测物的残留偶极耦合值。该定相排列介质一方面能够兼容水、甲醇等高极性溶剂，通过该溶致液晶溶解的高极性有机分子，会形成一定程度的定向排列，可以实现核磁共振残留偶极耦合的准确测定和有机化合物相对构型的区分，同时，基于FKFKFKFK形成的液晶相具有区分对映异构体的能力，另一方面排列快速，具有较好的流动性和稳定性，而且能够耐受较为广泛的温度和一定浓度的盐。

Description

一种基于两亲性寡肽的定相排列介质及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于核磁测定技术领域，具体涉及一种基于两亲性寡肽的定相排列介质及其制备方法和应用。
背景技术
经典的NMR结构解析通常需要测定化学位移(δ)、耦合常数(J)、NOE(nuclearOverhauser effect)等各向同性参数。残余偶极耦合(RDC)作为各向异性参数，包含距离和角度信息，可以提供有价值的长程和全局定向约束，可用于提高结构分析的精度和准确性，并且可以用来区分分子的相对或绝对构型。残余偶极耦合的产生需要引入适当的弱定向排列介质，创造一个各向异性环境，使分子的运动受限或诱导其产生各向异性，从而产生“残留偶极耦合”。
目前主要有两种排列介质用于分子各向异性参数的测量，即溶致液晶相(lyotropic liquid crystalline phases，LLCs)和压缩或拉伸聚合物凝胶(compressedor stretched polymeric gels)。相对于压缩或拉伸凝胶，溶致液晶可以通过调整介质浓度来调整定向程度，在实际操作上更加方便、简单。其中，基于寡肽的液晶相能够本身具有一定的手性，能够诱导对映异构体产生不同程度的排列，在NMR谱图上产生不同的信号。因此，可以用于区分分子的不同构型。目前，能够同时兼容多种极性溶剂的液晶相排列介质，特别是基于寡肽的液晶相排列介质非常少。因此，需要开发更多的排列介质。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提供一种具有良好流动性和稳定性、且能够区分分子不同构型的基于两亲性寡肽的定相排列介质及其制备方法和应用。
为实现以上目的，本发明的技术方案如下：
一种基于两亲性寡肽的定相排列介质，该定相排列介质为由下述多肽分子自组装的溶致液晶相：
所述溶致液晶相包括高极性溶剂和溶解在高极性溶剂中的多肽。
所述多肽在所述溶致液晶相中的浓度为40-100mg/mL。
所述高极性溶剂为水、甲醇、水与无机盐的混合物中的一种。
所述高极性溶剂为水与NaCl的混合物。
一种基于两亲性寡肽的定相排列介质的制备方法，具体为：将多肽完全溶解在高极性溶剂中即可。
一种基于两亲性寡肽的定相排列介质的应用，所述定相排列介质用于通过核磁共振实验测定待测物的残留偶极耦合值。
所述定相排列介质用于区分分子的不同构型。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明一种基于两亲性寡肽的定相排列介质为采用特定的多肽分子自组装形成的溶致液晶相，该溶致液晶一方面能够兼容水、甲醇等高极性溶剂，通过该溶致液晶溶解的高极性有机分子，会形成一定程度的定向排列，实现核磁共振残留偶极耦合的测定，另一方面排列快速，具有较好的流动性和稳定性，而且能够耐受较为广泛的温度和一定浓度的盐，同时，该溶致液晶能够有效区分分子的不同构型。
附图说明
图1为实施例1-5制备得到的产品在298K条件下经氘核磁共振实验测得的四极裂分。
图2为实施例6-9制备得到的产品在298K条件下经氘核磁共振实验测得的四极裂分。
图3为实施例4制备得到的产品室温放置一周内不同时刻测得的四极裂分。
图4为实施例8制备得到的产品室温放置一周内不同时刻测得的四极裂分。
图5为多肽溶解在含有不同NaCl浓度的D2O中测得的四极裂分。
图6为70mg/mL多肽/D2O形成的定相排列介质在5-40℃下测得的四极裂分。
图7为70mg/mL多肽/CD3OD形成的定相排列介质在5-40℃下测得的四极裂分。
图8为实施例12制备得到的各向异性液晶体系(1)、L-脯氨酸溶于不含多肽的D2O中形成的各项同性D2O溶液(2)的局部[1H,13C]-CLIP-HSQC谱图。
图9为L-脯氨酸在不同浓度多肽/D2O形成的各向异性液晶体系中检测到的RDC值与其在晶体结构基础上经DFT优化结构后计算的RDC值之间的线性图，图中，A为30mg/mL多肽，B为40mg/mL多肽。
图10为对比例(A)与测试例(B)的部分一维13C谱图。
图11为实施例13制备得到的各向异性液晶体系(1)与α-山道年溶于不含多肽的CD3OD中形成的各项同性CD3OD溶液(2)的局部[1H,13C]-CLIP-HSQC谱图。
图12为α-山道年在各向异性液晶体系中检测到的RDC值与其在晶体结构基础上经DFT优化结构后计算的RDC值之间的线性图(A)以及与其在晶体结构基础上经DFT优化结构后计算的8种可能对映异构体的RDC值之间的Q值统计图(B)。
具体实施方式
下面结合附图说明和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一种基于两亲性寡肽的定相排列介质，该定相排列介质为由下述多肽分子自组装的溶致液晶相：
所述溶致液晶相包括高极性溶剂和溶解在高极性溶剂中的多肽。
所述多肽在所述溶致液晶相中的浓度为40-100mg/mL。
所述高极性溶剂为水、甲醇、水与无机盐的混合物中的一种。
所述高极性溶剂为水与NaCl的混合物。
一种基于两亲性寡肽的定相排列介质的制备方法，具体为：将多肽完全溶解在高极性溶剂中即可。
一种基于两亲性寡肽的定相排列介质的应用，所述定相排列介质用于通过核磁共振实验测定待测物的残留偶极耦合值。
所述定相排列介质用于区分分子的不同构型。
本发明所述定相排列介质的优点是临界浓度低，可以简单通过调节多肽浓度来调节定向的强度；制备简单、快速，样品均匀、稳定；粘度低，方便转移；流动性好，线宽窄，测定精确度高；可实现商品化。在二维实验中几乎没有背景信号。这些特点说明多肽FKFKFKFK可以作为一种新的排列介质，具有广泛的应用前景。
实施例1：
一种基于两亲性寡肽的定相排列介质，该定相排列介质的原料包括高极性溶剂D2O和下述多肽：
且多肽在定相排列介质中的浓度为40mg/mL。
上述定相排列介质的制备方法为：将多肽粉末按所需比例加入D2O溶液中，涡旋震荡1min使其完全溶解即可。
实施例2：
与实施例1的不同之处在于：
所述多肽在定相排列介质中的浓度为50mg/mL。
实施例3：
与实施例1的不同之处在于：
所述多肽在定相排列介质中的浓度为60mg/mL。
实施例4：
与实施例1的不同之处在于：
所述多肽在定相排列介质中的浓度为80mg/mL。
实施例5：
与实施例1的不同之处在于：
所述多肽在定相排列介质中的浓度为100mg/mL。
实施例6：
与实施例1的不同之处在于：
所述高极性溶剂为CD3OD。
实施例7：
与实施例6的不同之处在于：
所述多肽在定相排列介质中的浓度为60mg/mL。
实施例8：
与实施例6的不同之处在于：
所述多肽在定相排列介质中的浓度为80mg/mL。
实施例9：
与实施例6的不同之处在于：
所述多肽在定相排列介质中的浓度为90mg/mL。
实施例10：
与实施例1的不同之处在于：
所述高极性溶剂为含有无机盐NaCl的D2O，且NaCl在溶剂中的浓度为50mM，所述多肽在定相排列介质中的浓度为70mg/mL。
实施例11：
与实施例10的不同之处在于：
所述NaCl在溶剂中的浓度为100mM。
实施例12：
选取L-脯氨酸作为水溶液中的模式分子，先将L-脯氨酸充分溶解在D2O或者CD3OD中，再向其中加入实施例1所述多肽粉末，涡旋震荡3min使其完全溶解，其中，多肽的浓度为40mg/mL，L-脯氨酸的浓度为10mg/mL，L-脯氨酸的结构如下：
实施例13：
与实施例12的不同之处在于：
额外加入D-脯氨酸，且L-脯氨酸与D-脯氨酸的浓度比为8：5。
实施例14：
选取α-山道年作为甲醇溶液中的模式分子，先将α-山道年充分溶解在CD3OD中，向其中加入实施例1所述多肽粉末，涡旋震荡3min使其完全溶解，其中，多肽的浓度为80mg/mL，α-山道年的浓度为22mg/mL，α-山道年的结构如下：
为考察本发明的技术效果，将上述实施例产品进行如下测试：
1、将实施例1-9制备得到的产品在298K条件下经氘核磁共振实验测得其四极裂分，其中，实施例1-5的测试结果如图1所示，实施例6-9的测试结果如图2所示。结果显示，对于D2O，随着多肽浓度由40mg/mL上升到100mg/mL，四极裂分从8.8Hz增加到60.9Hz；对于CD3OD，随着多肽浓度由40mg/mL上升到90mg/mL，四极裂分从8.9Hz增加到52.6Hz。该结果表明定相排列介质的定向程度可以通过调节多肽的浓度来进行调节。
2、将实施例4、8制备得到的产品在室温下放置一周，并分别在放置过程中的0min、10min、1h、1week四个时刻取样，在298K条件下经氘核磁共振实验测其四极裂分，结果分别如图3、4所示。结果显示，定相排列介质放置一周内的四极裂分波动不超过2Hz，其定向程度能够保持稳定。
3、将实施例10、11制备得到的产品在298K条件下经氘核磁共振实验测得其四极裂分，并将其与不加入无机盐NaCl的定相排列介质进行对比(参见图5)，结果显示，定相排列介质能耐受NaCl，且其四极裂分随着NaCl浓度的升高而增加。
4、将70mg/mL多肽/D2O形成的定相排列介质、70mg/mL多肽/CD3OD形成的定相排列介质分别于278K、288K、298K、303K条件下经氘核磁共振实验测得其四极裂分(参见图6、7)，结果显示，四极裂分值随着温度的升高而降低。
5、记录实施例12制备得到的各向异性液晶体系、L-脯氨酸溶于不含多肽的D2O或者CD3OD中形成的各项同性溶液(其中L-脯氨酸的浓度为10mg/mL)的局部[1H,13C]-CLIP-HSQC谱图(参见图8)、C-H一键耦合值、实验RDC以及计算的RDC值(参见表1)：
表1 L-脯氨酸在各向异性液晶体系和各项同性D2O溶液中的C-H一键耦合值、实验RDC以及计算的RDC值
并分别绘制L-脯氨酸在40mg/mL多肽/D2O形成的各向异性液晶体系中检测到的RDC值与其在晶体结构基础上经DFT优化结构后计算的RDC值之间的线性图(参见图9A)、L-脯氨酸在50mg/mL多肽/D2O形成的各向异性液晶体系中检测到的RDC值与其在晶体结构基础上经DFT优化结构后计算的RDC值之间的线性图(参见图9B)。
上述结果显示，L-脯氨酸各向异性液晶体系的实验RDC与结构优化得到的计算RDC值基本一致，且在所述两个浓度下，L-脯氨酸计算的Q值都很小，表明多肽液晶能够兼容水，可以作为排列介质获得高质量的RDC值。
6、将实施例13制备得到的各向异性液晶体系与D-脯氨酸混合后作为测试例，以将L-脯氨酸和D-脯氨酸溶于不含多肽的D2O(参见图10A)或者CD3OD(参见图10B)中形成的各项同性溶液(L-脯氨酸和D-脯氨酸的浓度与实施例13相同)作为对比例，对两者分别进行一维13C核磁测试，得到的部分一维13C谱图如图10所示。
图10中的A图出现了两个峰，且比例接近8:5，分别对应L-脯氨酸和D-脯氨酸而B图仅显示出一个峰，表明各向异性液晶体系可有效区分对映异构体。
7、记录实施例13制备得到的各向异性液晶体系与α-山道年溶于不含多肽的CD3OD中形成的各项同性CD3OD溶液(其中α-山道年的浓度为22mg/mL)的局部[1H,13C]-CLIP-HSQC谱图(参见图11)、C-H一键耦合值、实验RDC以及计算的RDC值(参见表2)：
表2α-山道年在各向异性液晶体系和各项同性CD3OD溶液中的C-H一键耦合值、实验RDC以及计算的RDC值
并绘制α-山道年在80mg/mL多肽/CD3OD形成的各向异性液晶体系中检测到的RDC值与其在晶体结构基础上经DFT优化结构后计算的RDC值之间的线性图、与其在晶体结构基础上经DFT优化结构后计算的8种可能对映异构体的RDC值之间的Q值统计图(参见图12)。
上述结果显示，α-山道年各向异性液晶体系的实验RDC与结构优化得到的计算RDC值比较接近，且计算的Q值很小，表明多肽液晶能够兼容甲醇，可以作为排列介质获得高质量的RDC值，且能够用于区分可能的非对映异构体。
以上测试项目的测试条件以及计算方法为：
(1)核磁共振实验条件
核磁共振实验在Bruker 850MHz、700MHz或者600MHz上进行，所有NMR实验均在298K下记录(另有说明除外)，每个核磁共振谱仪均配备具有z轴梯度的低温三共振探头。使用氘通道记录2H NMR光谱。
对于多肽/D2O体系，L-脯氨酸分别溶解在含有多肽的液晶相或者和不含多肽的D2O中，用于记录各向异性和各向同性谱图。二维实验脉冲序列为F2维耦合[1H,13C]-CLIP-HSQC，1H的光谱宽度为14ppm，13C的光谱宽度为160ppm，弛豫延迟时间是2s，采样点数为2048(1H)x 1024(13C)，累加次数8次，一键耦合常数为145Hz。
对于多肽/CD3OD体系，α-山道年分别溶解在含有多肽的液晶相或者和不含多肽的CD3OD中，用于记录各向异性和各向同性谱图。二维实验脉冲序列为F1维耦合[1H,13C]-JSB-HSQC，1H的光谱宽度为12ppm，13C的光谱宽度为170ppm，弛豫延迟时间是2s，采样点数为2048(1H)x 1024(13C)，累加次数8次，J-scaling因子为4，一键耦合常数为145Hz。所有数据均采用Bruker Topspin 4.0.9软件进行分析处理。
(2)计算方法
分别采集在各向同性和各向异性条件下的CLIP-HSQC或者JSB-HSQC谱图，用topspin软件提取出模式分子在D2O或者CD3OD中的标量耦合值(1JCH)，以及在多肽液晶中的复合耦合值(1TCH)，后者减去前者即得到实验RDC值(1DCH)。为了比较实验RDCs的准确性，需要对比实验RDCs与理论RDCs的相关性。具体如下，首先在ChemDraw中绘制分子式，在ChemDraw 3D使用MMFF进行能量最小化。使用MestReNov Suit(Mestrelab Research S.L.，Santiago de Compostela，spain)从2D结构生成所有可能的α-山东宁非对映异构体及其各自的对映异构体。使用Gaussian 09在the IEFPCM solvent model下进行结构优化，最后将优化的结构与实验RDCs值导入StereFitter程序(MestReNov Suit)中计算，得到相应的Q值。

Claims (6)

1.一种基于两亲性寡肽的定相排列介质，其特征在于：
所述定相排列介质为由下述多肽分子自组装的溶致液晶相：
所述溶致液晶相包括高极性溶剂和溶解在高极性溶剂中的多肽，所述高极性溶剂为水、甲醇、水与无机盐的混合物中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种基于两亲性寡肽的定相排列介质，其特征在于：所述多肽在所述溶致液晶相中的浓度为40-100mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种基于两亲性寡肽的定相排列介质，其特征在于：所述高极性溶剂为水与NaCl的混合物。
4.一种权利要求2所述的基于两亲性寡肽的定相排列介质的制备方法，其特征在于：
所述制备方法为：将多肽完全溶解在高极性溶剂中即可。
5.一种权利要求1所述的基于两亲性寡肽的定相排列介质的应用，其特征在于：
所述定相排列介质用于通过核磁共振实验测试待测物的残留偶极耦合值。
6.根据权利要求5所述的一种基于两亲性寡肽的定相排列介质的应用，其特征在于：所述定相排列介质用于区分分子的不同构型。
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