CN114018965A - 一种多糖核磁共振氢谱法定量检测技术 - Google Patents
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Abstract
本技术方案首次公开了一种多糖核磁共振氢谱法定量检测技术，对于确定的核磁活性原子核，其核磁共振信号强度（峰面积）与产生该信号的原子数目成正比，通过比较待测物定量质子的信号峰面积与参考物定量信号峰面积，外标法确定待测物浓度。
Description
技术领域
本发明属含能材料计量检测领域，也属于医药技术领域。具体涉及质量检测，特别是一种核磁共振氢谱定量检测方法。
背景技术
多糖（polysaccharide）是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质，多糖在自然界分布极广，亦很重要，有的是构成动植物细胞壁的组成成分，如肽聚糖和纤维素；有的是作为动植物储藏的养分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，像人体中的肝素有抗凝血作用。
硫酸软骨素，是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，目前其含量的检测主要使用高效液相色谱法，另外，采用层析法、气相色谱法等方法在特定条件下也能够实现对硫酸软骨素的含量检测。薄层层析法分析时间长、展开剂体积需求大，分离结果差，实验结果准确性、稳定性以及精密度较差；气相色谱法需将糖通过衍生化的方法转换成为可挥发的成分后再测定，过程较为繁琐；高效液相色谱法是较为常用的方法，但其分析时间较长，示差折光检测器的稳定性、重复性和选择性均有一定程度的不足。
硫酸软骨素
核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）作为一种有机化合物结构解析的代表性分析方法，在1963年首次应用于定量分析，即定量核磁共振技术(quantitativenuclear magnetic resonance，qNMR)，确定了 26 种纯有机物质中的分子内质子比率。近年来，NMR定量技术已经在药物分析、代谢组学、食品分析鉴别等领域得到了较为广泛的运用。与气相色谱法、高效液相色谱法等传统分析方法相比，qNMR方法快捷、样品用量少，且不破坏样品，定量成本大大降低。利用定量核磁共振氢谱法，选择内标物代替使用目标测试物的标准品做外标的高效液相色谱法的研究具有重要意义。
发明内容
本技术方案首次公开了一种核磁共振氢谱定量检测方法，尤其是一种硫酸软骨素核磁氢谱定量检测方法，通过选择合适的溶剂（混合溶剂），增加样品溶解性；调整仪器的检测参数，适当延长氢谱的检测时间，增加响应等技术手段，实现对硫酸软骨素核磁定量检测。本发明是通过如下技术方案实现的：
一种硫酸软骨素核磁共振氢谱定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)测定药物和内标物马来酸在体积比1000:5-1000:7的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中的定量峰；
(2)设置核磁共振波谱仪的参数，包括包括脉冲序列，检测谱宽，谱宽中心值，采样时间，驰豫延迟时间，线宽因子，采样温度、采样次数，将内标物马来酸溶于体积比1000:5-1000:7的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中，得内标物马来酸溶液；取内标物马来酸溶液，加入待测药物，待完全溶解后，上机测试，得到图谱后，进行相位和基线调整；
(3)测定含有药物的样品和内标物马来酸的定量目标峰的相对积分面积，积分面积是将定量目标峰值积分2-4次，取平均值，得到积分面积；
(4)根据内标物马来酸的质量，计算药物的质量，然后计算药物的含量。
一种硫酸软骨素核磁共振氢谱定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)测定硫酸软骨素和内标物马来酸在体积比1000:6的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中的定量峰，硫酸软骨素定量目标峰为硫酸软骨素中化学位移值4.62-4.35 ppm的氢质子峰，内标物马来酸的定量目标峰为内标物中化学位移值6.22-5.82 ppm的氢质子峰；
(2)设置核磁共振波谱仪的参数，包括：脉冲序列zg90，检测谱宽20ppm，采样时间3min30s，驰豫延迟时间8s，线宽因子0.4Hz，采样温度310K、采样次数16次；
(3)样品配制：分别称取硫酸软骨素约10 mg，马来酸约10 mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，10-30μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，按上述仪器方法检测；
(4)定量检测：选用马来酸氢峰化学位移值6.22-5.82 ppm的烯键上2个氢积分值定义为100%，该峰与硫酸软骨素核磁共振氢谱出峰无干扰；选取硫酸软骨素化学位移值4.62-4.35 ppm的糖端基上2个氢的积分值为测定值，按上述仪器方法检测，得到硫酸软骨素的积分测定值；
(5)根据内标物马来酸的质量，计算硫酸软骨素的质量，然后计算硫酸软骨素的含量。
一种硫酸软骨素核磁共振氢谱定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)测定硫酸软骨素和内标物柠檬酸在体积比1000:6的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中的定量峰，硫酸软骨素定量目标峰为硫酸软骨素中化学位移值4.62-4.35 ppm的质子峰，内标物柠檬酸的定量目标峰为内标物中化学位移值2.84-3.01ppm的质子峰；
(2)设置核磁共振波谱仪的参数，包括：脉冲序列zg90，检测谱宽20ppm，采样时间3min30s，驰豫延迟时间8s，线宽因子0.4Hz，采样温度310K、采样次数16次；
(3)样品配制：分别称取硫酸软骨素约10 mg，柠檬酸约10 mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，按上述仪器方法检测；
(4)定量检测：选用柠檬酸氢峰化学位移值2.84-3.01ppm的烯键上2个氢积分值定义为100%，该峰与硫酸软骨素核磁共振氢谱出峰无干扰；选取硫酸软骨素化学位移值4.62-4.35 ppm的糖端基上2个氢的积分值为测定值，按上述仪器方法检测，得到硫酸软骨素的积分测定值；
(5)根据内标物柠檬酸的质量，计算硫酸软骨素的质量，然后计算硫酸软骨素的含量。
附图说明
图1 -图3 专属性试验图谱
图4-图5 精密度试验部分图谱
图6-图7 样品测定图谱
具体实施方式
下面通过实施例及其附图详细阐述本发明的技术方案，所列举的实施例及附图对本发明没有限制。
实施例1：一种硫酸软骨素核磁共振氢谱定量检测方法及其验证
1.1仪器方法
表 仪器方法描述
1.1.
1.2. 1.2分析方法
样品配制：分别称取硫酸软骨素约10 mg，马来酸约10 mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，按上述仪器方法检测。
定量方法：内标法（峰面积），选用马来酸氢峰化学位移值（6.22-5.82 ppm，烯键上2个氢）（将其定义为100%），该峰与硫酸软骨素核磁共振氢谱出峰无干扰。选取硫酸软骨素4.62-4.35 ppm（糖端基上2个氢）处的积分值，按上述仪器方法检测，得到硫酸软骨素的积分值，计算硫酸软骨素的含量。
1.3. 1.3验证内容
1.4. 1.3.1专属性
1.5. 1.3.1.1溶液配制
（1）空白溶液：1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合均匀，即得。
（2）样品空白溶液（约10mg/ml）：称取硫酸软骨素约10mg，精密称定，置离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，即得约10mg/ml的样品空白溶液。
（3）内标溶液（约10mg/ml）：称取马来酸约10mg，精密称定，置离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，即得约10mg/ml的对照品溶液。
（4）样品加标溶液（内标浓度约10mg/ml）：称取硫酸软骨素约10mg，马来酸约10mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得样品加标溶液。
1.6. 1.3.1.2试验过程
取上述溶液，分别置核磁共振波谱仪中，采集数据，记录各样品中峰的化学位移值。
1.7. 1.3.1.3结果及结论
表 专属性试验结果
相关图谱见图1-图3。
1.3.2精密度
1.3.2.1重复性
1.3.2.1.1溶液配制
100%样品加标溶液：称取硫酸软骨素约10mg，马来酸约10mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制共6份。
1.3.2.1.2试验过程
取上述溶液依次进样分析，以内标法计算浓度，并计算含量的RSD。
1.3.2.1.3结果及结论
表 重复性试验结果
1.3.2.2中间精密度
1.3.2.2.1溶液配制
在不同日期按上述重复性溶液配制要求重新配制6份100%样品加标溶液。
1.3.2.2.2试验过程
取上述溶液依次进样分析，以内标法计算含量，并计算含量的RSD。
1.3.2.2.3结果及结论
表 中间精密度试验结果
相关试验部分图谱见图4-图5。
1.3.3准确度
1.3.3.1溶液配制
（1）80%样品加标溶液：称取硫酸软骨素约8mg，马来酸约10mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制3份。
（2）100%样品加标溶液：称取硫酸软骨素约10mg，马来酸约10mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制3份。
（3）120%样品加标溶液：称取硫酸软骨素约12mg，马来酸约10mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制3份。
1.3.3.2试验过程
每份溶液测定1次，以内标法计算含量，并计算含量的RSD。
1.3.3.3结果及结论
表 准确度试验结果
1.3.4溶液稳定性
1.3.4.1溶液配制
（1）100%样品加标溶液：称取硫酸软骨素约10mg，马来酸约10mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得。
1.3.4.2试验过程
上述溶液于室温放置，分别于0h、2h、13h，每份溶液测定1次，记录峰面积，具体时间可根据实际情况进行调整。
1.3.4.3溶液稳定性结果及结论
表 样品加标溶液稳定性结果
1.3.5样品检测结果
表 样品检测结果
相关图谱见图6-图7。
1.3.6计算公式
（1）含量（%）=A*Mmal*M1*P/（M样*M2）
A：仪器测得峰面积
P：马来酸的含量
Mmal：称取马来酸的质量（mg）
M样：称取样品的质量（mg）
M1：硫酸软骨素的分子量
M2：马来酸的分子量
（2）其它公式
平均值（
）=（x1+x2+x3+…+xn）/n
标准偏差（SD）=
相对标准偏差（RSD）=标准偏差（SD）/平均值（
）*100%
实施例2：一种硫酸软骨素核磁共振氢谱定量检测方法
(1)测定硫酸软骨素和内标物马来酸在体积比1000:5的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中的定量峰，硫酸软骨素定量目标峰为硫酸软骨素中化学位移值4.62-4.35 ppm的氢质子峰，内标物马来酸的定量目标峰为内标物中化学位移值6.22-5.82 ppm的氢质子峰；
(2)设置核磁共振波谱仪的参数，包括：脉冲序列zg90，检测谱宽20ppm，采样时间3min30s，驰豫延迟时间8s，线宽因子0.4Hz，采样温度310K、采样次数16次；
(3)样品配制：分别称取硫酸软骨素约10 mg，马来酸约10 mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，10μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，按上述仪器方法检测；
(4)定量检测：选用马来酸氢峰化学位移值6.22-5.82 ppm的烯键上2个氢积分值定义为100%，该峰与硫酸软骨素核磁共振氢谱出峰无干扰；选取硫酸软骨素化学位移值4.62-4.35 ppm的糖端基上2个氢的积分值为测定值，按上述仪器方法检测，得到硫酸软骨素的积分测定值；
(5)根据内标物马来酸的质量，计算硫酸软骨素的质量，计算硫酸软骨素的含量为95.34%。
实施例3：一种硫酸软骨素核磁共振氢谱定量检测方法
(1)测定硫酸软骨素和内标物马来酸在体积比1000:7的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中的定量峰，硫酸软骨素定量目标峰为硫酸软骨素中化学位移值4.62-4.35 ppm的氢质子峰，内标物马来酸的定量目标峰为内标物中化学位移值6.22-5.82 ppm的氢质子峰；
(2)设置核磁共振波谱仪的参数，包括：脉冲序列zg90，检测谱宽20ppm，采样时间3min30s，驰豫延迟时间8s，线宽因子0.4Hz，采样温度310K、采样次数16次；
(3)样品配制：分别称取硫酸软骨素约10 mg，马来酸约10 mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，30μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，按上述仪器方法检测；
(4)定量检测：选用马来酸氢峰化学位移值6.22-5.82 ppm的烯键上2个氢积分值定义为100%，该峰与硫酸软骨素核磁共振氢谱出峰无干扰；选取硫酸软骨素化学位移值4.62-4.35 ppm的糖端基上2个氢的积分值为测定值，按上述仪器方法检测，得到硫酸软骨素的积分测定值；
(5)根据内标物马来酸的质量，计算硫酸软骨素的质量，计算硫酸软骨素的含量为95.77%。
实施例4：一种硫酸软骨素核磁共振氢谱定量检测方法
(1)测定硫酸软骨素和内标物马来酸在体积比1000:6的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中的定量峰，硫酸软骨素定量目标峰为硫酸软骨素中化学位移值4.62-4.35 ppm的质子峰，内标物马来酸的定量目标峰为内标物中化学位移值6.22-5.82 ppm的质子峰；
(2)设置核磁共振波谱仪的参数，包括：脉冲序列zg90，检测谱宽20ppm，采样时间3min30s，驰豫延迟时间8s，线宽因子0.4Hz，采样温度310K、采样次数16次；
(3)样品配制：分别称取硫酸软骨素约10 mg，马来酸约10 mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，按上述仪器方法检测；
(4)定量检测：选用马来酸氢峰化学位移值6.22-5.82 ppm的烯键上2个氢积分值定义为100%，该峰与硫酸软骨素核磁共振氢谱出峰无干扰；选取硫酸软骨素化学位移值4.62-4.35 ppm的糖端基上2个氢的积分值为测定值，按上述仪器方法检测，得到硫酸软骨素的积分测定值；
(5)根据内标物马来酸的质量，计算硫酸软骨素的质量，计算硫酸软骨素的含量为95.72%。
实施例5：一种硫酸软骨素核磁共振氢谱定量检测方法
(1)测定硫酸软骨素和内标物柠檬酸在体积比1000:6的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中的定量峰，硫酸软骨素定量目标峰为硫酸软骨素中化学位移值4.62-4.35 ppm的质子峰，内标物柠檬酸的定量目标峰为内标物中化学位移值2.84-3.01ppm的质子峰；
(2)设置核磁共振波谱仪的参数，包括：脉冲序列zg90，检测谱宽20ppm，采样时间3min30s，驰豫延迟时间8s，线宽因子0.4Hz，采样温度310K、采样次数16次；
(3)样品配制：分别称取硫酸软骨素约10 mg，柠檬酸约10 mg，精密称定，置同一离心管中，加1ml重水，20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，按上述仪器方法检测；
(4)定量检测：选用柠檬酸氢峰化学位移值2.84-3.01ppm的烯键上2个氢积分值定义为100%，该峰与硫酸软骨素核磁共振氢谱出峰无干扰；选取硫酸软骨素化学位移值4.62-4.35 ppm的糖端基上2个氢的积分值为测定值，按上述仪器方法检测，得到硫酸软骨素的积分测定值；
(5)根据内标物柠檬酸的质量，计算硫酸软骨素的质量，计算硫酸软骨素的含量为95.57%。
Claims (3)
1.一种多糖核磁共振氢谱法定量检测技术，其特征在于，包括以下步骤：
(1)测定玻璃酸钠、肝素钠、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰素的含量时，采用2,4,6-三硝基甲苯或柠檬酸或马来酸或对苯二酚作为对照品，采用体积比1000:5-1000:7的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂溶解测定，确定定量峰；
(2)设置核磁共振波谱仪的参数，包括脉冲序列，检测谱宽，采样时间，驰豫延迟时间，线宽因子，采样温度、采样次数；
(3)对照品及待测物分别溶于体积比1000:5-1000:7的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中，待完全溶解后，上机测试，分别测定待测物和对照品的定量峰相对积分面积，然后计算待测物的含量。
2.根据权利要求1所述的一种多糖核磁共振氢谱法定量检测技术，其特征在于，包括以下步骤：
(1)测定硫酸软骨素的含量时，采用马来酸作为对照品，采用体积比1000:6的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂溶解测定，分别测定，确定硫酸软骨素定量峰为硫酸软骨素中化学位移值4.62-4.35 ppm的质子峰，确定马来酸的定量峰为马来酸中化学位移值6.22-5.82 ppm的质子峰；
(2)设置核磁共振波谱仪的参数，包括：脉冲序列zg90，检测谱宽20ppm，采样时间3min30s，驰豫延迟时间8s，线宽因子0.4Hz，采样温度310K、采样次数16次；
(3)对照品马来酸及待测物硫酸软骨素分别溶于体积比1000:6的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中，待完全溶解后，上机测试，采用外标法，分别测定硫酸软骨素和马来酸的定量峰相对积分面积，然后计算硫酸软骨素的含量。
3.根据权利要求1所述的，一种多糖核磁共振氢谱法定量检测技术，其特征在于，包括以下步骤：
(1)测硫酸软骨素的含量时，采用柠檬酸作为对照品，采用体积比1000:6的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂溶解测定，分别测定，确定硫酸软骨素定量峰为硫酸软骨素中化学位移值4.62-4.35 ppm的质子峰，确定柠檬酸的定量峰为柠檬酸中化学位移值2.84-3.01 ppm的质子峰；
(2)设置核磁共振波谱仪的参数，包括：脉冲序列zg90，检测谱宽20ppm，采样时间3min30s，驰豫延迟时间8s，线宽因子0.4Hz，采样温度310K、采样次数16次；
(3)对照品柠檬酸及待测物硫酸软骨素分别溶于体积比1000:6的重水:氘代氢氧化钠混合溶剂中，待完全溶解后，上机测试，采用外标法，分别测定硫酸软骨素和柠檬酸的定量峰相对积分面积，然后计算硫酸软骨素的含量。
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114594122A (zh) * | 2022-03-07 | 2022-06-07 | 山东大学 | 一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN102809616A (zh) * | 2012-08-21 | 2012-12-05 | 山东齐都药业有限公司 | 乳香药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱 |
| US20190154601A1 (en) * | 2016-07-19 | 2019-05-23 | Laboratorios Farmaceuticos Rovi, S.A. | Method for the Analysis of Glycosaminoglycans, and Their Derivatives and Salts by Nuclear Magnetic Resonance |
-
2021
- 2021-11-04 CN CN202111278295.5A patent/CN114018965A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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