CN114594122A - 一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法 - Google Patents
一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114594122A CN114594122A CN202210213712.6A CN202210213712A CN114594122A CN 114594122 A CN114594122 A CN 114594122A CN 202210213712 A CN202210213712 A CN 202210213712A CN 114594122 A CN114594122 A CN 114594122A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sodium hyaluronate
- sample
- internal standard
- nuclear magnetic
- magnetic resonance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 title claims abstract description 152
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 title claims abstract description 152
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 title claims abstract description 149
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 104
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 104
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 title claims abstract description 104
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 title claims abstract description 79
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 63
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 56
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 claims description 44
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 claims description 31
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid group Chemical group C(\C=C/C(=O)O)(=O)O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 claims description 31
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 27
- HEMHJVSKTPXQMS-DYCDLGHISA-M Sodium hydroxide-d Chemical compound [Na+].[2H][O-] HEMHJVSKTPXQMS-DYCDLGHISA-M 0.000 claims description 19
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 18
- 239000011903 deuterated solvents Substances 0.000 claims description 13
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 238000001208 nuclear magnetic resonance pulse sequence Methods 0.000 claims description 7
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 6
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 abstract description 4
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 68
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 13
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 13
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 11
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 9
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 9
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 6
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 compound sodium hyaluronate Chemical class 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005461 lubrication Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004026 tunica intima Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
- G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
- G01N24/087—Structure determination of a chemical compound, e.g. of a biomolecule such as a protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
- G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
- G01N24/088—Assessment or manipulation of a chemical or biochemical reaction, e.g. verification whether a chemical reaction occurred or whether a ligand binds to a receptor in drug screening or assessing reaction kinetics
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- High Energy & Nuclear Physics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法。本发明采用含有重水和氘代氢氧化钠的氘代溶剂对待测样品进行溶解，可以降低透明质酸钠溶液的粘度，增加透明质酸钠的溶解性，提高氢谱图的分辨率，再通过调整核磁共振氢谱的检测参数，延长驰豫延迟时间增强信号响应，优化定量特征峰峰形，实现对待测样品中透明质酸钠的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法。
背景技术
透明质酸又名玻璃酸，是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间通过β-1,4配糖键和β-1,3配糖键相连。透明质酸的相对分子质量(Mr)一般为1×105～1×107D，分子中两种单糖的摩尔比为1:1。透明质酸广泛存在于动物组织的细胞间质和某些细菌的夹膜中。在人和脊椎动物的组织中，透明质酸广泛存在，是组成细胞外基质的几种粘多糖之一。透明质酸在人体皮肤的真皮层和关节的滑液中含量比较多，具有保湿、润滑等非常重要的生理功能。由于具有独特的流变学特性、保湿性、润滑性、天然性、良好的生物相容性和无过敏性，透明质酸在化妆品领域、保健食品领域、美容手术及医药领域均得到广泛地发展与应用。
透明质酸的商品形式一般为其钠盐，即透明质酸钠。现有透明质酸钠含量的测定方法主要是首先测定葡萄糖醛酸的含量，进而计算得出透明质酸钠的含量。但是该方法不能直接测定透明质酸钠的含量，过程复杂，准确性较低。目前，有些研究人员采用核磁共振氢谱对透明质酸钠的含量进行测定，但由于透明质酸钠是大分子化合物，溶解性较差，样品比较粘稠，使得氢谱谱线宽度增加，分辨率下降，而且透明质酸钠的结构式为糖链，在氢谱中氢的化学位移值主要集中在3～6ppm之间，不易区分定量特征峰，使其定量过程的难度增加。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，该方法可以优化定量特征峰的峰形，提高氢谱图的分辨率，对透明质酸钠的含量进行准确的定量分析。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，包括以下步骤：
将待测样品、内标物和氘代溶剂混合后，进行核磁共振氢谱测试，得到核磁共振氢谱图；所述待测样品和内标物的质量比为1∶1；
所述内标物为马来酸；所述氘代溶剂包括重水和氘代氢氧化钠；
所述核磁共振氢谱测试的脉冲序列为zg；
所述核磁共振氢谱测试的驰豫延迟时间≥8s；
根据所述核磁共振氢谱图，对透明质酸钠的定量目标峰和内标物的定量目标峰分别进行积分，得到透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，通过透明质酸钠的含量的计算公式，计算得到透明质酸钠的含量；
所述透明质酸钠的定量目标峰为氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰；所述内标物的定量目标峰为氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键上的2个氢特征峰；
所述透明质酸钠的积分面积测定值为所述透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与所述内标物的定量目标峰的积分面积的比值；
所述透明质酸钠的含量的计算公式为：
透明质酸钠含量＝A×Mmal×M1×P/(M样×M2)，％；
A：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
P：内标物的含量，％；
Mmal：内标物的质量，mg；
M样：待测样品的质量，mg；
M1：透明质酸钠的分子质量；
M2：内标物的分子质量。
优选的，所述重水和氘代氢氧化钠的体积比为100∶(1～3)。
优选的，将所述待测样品和内标物的质量比为1:1替换为所述待测样品和内标物的摩尔比为1:1；且所述透明质酸钠的含量的计算公式为：
透明质酸钠含量＝A×m×M1×P/M样，％；
A：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
P：内标物的含量，％；
m：内标物的摩尔质量，mol；
M样：待测样品的质量，mg；
M1：透明质酸钠的分子质量。
优选的，所述核磁共振氢谱测试的采样温度≥295K。
优选的，所述核磁共振氢谱测试的检测谱宽范围为18～22ppm。
优选的，所述核磁共振氢谱测试的谱宽中心值为5～7ppm。
优选的，所述核磁共振氢谱测试的扫描次数≥12次。
优选的，所述核磁共振氢谱测试的采样时间≥2min。
优选的，所述核磁共振氢谱测试的线宽因子为0.2～0.4Hz。
本发明提供了一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，包括以下步骤：将待测样品、内标物和氘代溶剂混合后，进行核磁共振氢谱测试，得到核磁共振氢谱图；所述透明质酸钠样品和内标物的质量比为1∶1；所述内标物为马来酸；所述氘代溶剂包括重水和氘代氢氧化钠；所述核磁共振氢谱测试的脉冲序列为zg；所述核磁共振氢谱测试的驰豫延迟时间≥8s；根据所述核磁共振氢谱图，对透明质酸钠的定量目标峰和内标物的定量目标峰分别进行积分，得到透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，通过透明质酸钠的含量的计算公式，计算得到透明质酸钠的含量；所述透明质酸钠的定量目标峰为氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰；所述内标物的定量目标峰为氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键上的2个氢特征峰；所述透明质酸钠的积分面积测定值为所述透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与所述内标物的定量目标峰的积分面积的比值；所述透明质酸钠的含量的计算公式为：透明质酸钠含量＝A×Mmal×M1×P/(M样×M2)，％；A：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；P：内标物的含量，％；Mmal：内标物的质量，mg；M样：透明质酸钠样品的质量，mg；M1：透明质酸钠的分子质量；M2：内标物的分子质量。
本发明采用马来酸作为内标物，马来酸与透明质酸钠可以在相同的溶剂中溶解，出峰互不干扰，两者不会发生化学反应，且马来酸出峰少，干扰小；马来酸中只有氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键上的2个氢特征峰，而透明质酸钠为糖单元，端基氢质子出峰具有规律；采用含有重水和氘代氢氧化钠的氘代溶剂对待测样品进行溶解，可以降低透明质酸钠溶液的粘度，增加透明质酸钠的溶解性，提高氢谱图的分辨率，再通过调整核磁共振氢谱的检测参数，延长驰豫延迟时间可以增强信号响应，减少基线的干扰，优化定量特征峰峰形，实现对待测样品中透明质酸钠的定量检测。该方法不会破坏对待测样品中的透明质酸钠，可直接准确地测定透明质酸钠的含量，与高效液相法、气质及液质联用等定量技术相比，无需使用高纯度的透明质酸钠标准品作为内标或外标，不需要建立标准曲线，具有不受杂质响应值影响，能同时给出定性的结构信息和定量分析结果的特点，而且本方法高效、简便、采样量少、重复性好，可降低定量成本。
附图说明
图1为空白溶液测定图；
图2为空白溶液加内标测定图；
图3为空白溶液加内标加样品测定图；
图4为重复性测定图；
图5为中间精密度测定图；
图6为实施例1中样品测定图；
图7为实施例1中样品测定图。
具体实施方式
本发明提供了一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，包括以下步骤：
一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，包括以下步骤：
将待测样品、内标物和氘代溶剂混合后，进行核磁共振氢谱测试，得到核磁共振氢谱图；所述待测样品和内标物的质量比为1∶1；
所述内标物为马来酸；所述氘代溶剂包括重水和氘代氢氧化钠；
所述核磁共振氢谱测试的脉冲序列为zg；
所述核磁共振氢谱测试的驰豫延迟时间≥8s；
根据所述核磁共振氢谱图，对透明质酸钠的定量目标峰和内标物的定量目标峰分别进行积分，得到透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，通过透明质酸钠的含量的计算公式，计算得到透明质酸钠的含量；
所述透明质酸钠的定量目标峰为氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰；所述内标物的定量目标峰为氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键上的2个氢特征峰；
所述透明质酸钠的积分面积测定值为所述透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与所述内标物的定量目标峰的积分面积的比值；
所述透明质酸钠的含量的计算公式为：
透明质酸钠含量＝A×Mmal×M1×P/(M样×M2)，％；
A：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
P：内标物的含量，％；
Mmal：内标物的质量，mg；
M样：待测样品的质量，mg；
M1：透明质酸钠的分子质量；
M2：内标物的分子质量。
如无特殊说明，本发明对所用原料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明将待测样品、内标物和氘代溶剂混合后，进行核磁共振氢谱测试，得到核磁共振氢谱图。
在本发明中，将所述待测样品、内标物和氘代溶剂混合前，优选将所述透明质酸钠样品进行干燥；所述干燥的方式优选为减压干燥；所述干燥的温度优选为60℃，所述干燥的时间优选为5h，本发明对所述减压干燥的压强没有特殊限定，采用本领域熟知的减压干燥压强即可。在本发明中，所述待测样品优选为市售的透明质酸钠产品。
在本发明中，所述内标物为马来酸；所述马来酸的质量为8～30mg；所述待测样品和内标物的质量比为1∶1；或者，所述待测样品和内标物的摩尔比为1∶1；所述氘代溶剂包括重水和氘代氢氧化钠；所述重水和氘代氢氧化钠的体积比优选为100∶(1～3)；为了达到核磁共振氢谱测试中检测样品溶液的高度，所述氘代溶剂的用量优选≥500μL，更优选为500～1000μL。本发明对所述待测样品、内标物和氘代溶剂的混合过程没有特殊限定，采用本领域熟知的混合过程使物料混合均匀即可。本发明对所述核磁共振氢谱测试所用的仪器没有特殊限定，采用本领域熟知的核磁共振波谱仪即可。在本发明实施例中，所述核磁共振氢谱测试所用的仪器具体为1H核磁共振波谱仪。
在本发明中，所述核磁共振氢谱测试的脉冲序列为zg；所述核磁共振氢谱测试的驰豫延迟时间≥8s，优选为8～12s；所述核磁共振氢谱测试的采样温度优选≥295K，更优选为295～313K；所述核磁共振氢谱测试的检测谱宽范围优选为18～22ppm；所述核磁共振氢谱测试的谱宽中心值优选为5～7ppm；所述核磁共振氢谱测试的扫描次数优选≥12次，更优选为12～20次；所述核磁共振氢谱测试的采样时间优选≥2min，更优选为2～8min；所述核磁共振氢谱测试的线宽因子优选为0.2～0.4Hz。
得到核磁共振氢谱图后，本发明优选对所述核磁共振氢谱图进行相位调整和基线调整；本发明对所述相位调整和基线调整的过程没有特殊限定，采用本领域熟知的相位调整和基线调整的过程即可。
调整所述核磁共振氢谱图的相位和基线后，本发明根据所述核磁共振氢谱图，对透明质酸钠的定量目标峰和内标物的定量目标峰分别进行积分，得到透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，通过透明质酸钠的含量的计算公式，计算得到透明质酸钠的含量。
在本发明中，所述透明质酸钠的定量目标峰为氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰；所述内标物的定量目标峰为氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键上的2个氢特征峰。
当所述待测样品和内标物的质量比为1∶1时，所述透明质酸钠的含量的计算公式为：
透明质酸钠含量＝A×Mmal×M1×P/(M样×M2)，％；
A：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
P：内标物的含量，％；
Mmal：内标物的质量，mg；
M样：待测样品的质量，mg；
M1：透明质酸钠的分子质量；
M2：内标物的分子质量；
当所述待测样品和内标物的摩尔比优选为1∶1时，所述透明质酸钠的含量的计算公式优选为：
透明质酸钠含量＝A×m×M1×P/M样，％；
A：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
P：内标物的含量，％；
m：内标物的摩尔质量，mol；
M样：待测样品的质量，mg；
M1：透明质酸钠的分子质量。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
(1)仪器方法
1H核磁共振波谱仪的参数设置如表1所示。
表11H核磁共振波谱仪的参数
(2)分析方法
样品配制：分别称取透明质酸钠10mg和马来酸10mg，置同一离心管中再加入1mL重水和20μL氘代氢氧化钠的混合溶剂进行溶解，涡旋，转移至核磁管中，按上述表1的参数进行检测。
定量方法：内标法(峰面积)，选择氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为透明质酸钠的定量目标峰，氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为内标物的定量目标峰，对其进行积分，得到透明质酸钠定量特征峰的积分面积测定值(透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与内标物的定量目标峰的积分面积的比值)，通过如下计算公式，计算得到透明质酸钠的含量；
1)透明质酸钠的含量的计算公式为：
透明质酸钠含量＝A×Mmal×M1×P/(M样×M2)，％；
A：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
P：内标物的含量，％；
Mmal：内标物的质量，mg；
M样：待测样品的质量，mg；
M1：透明质酸钠的分子质量；
M2：内标物的分子质量。
实施例2
分别称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1mL重水和10μL氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，得到待测溶液；采用1H核磁共振波谱仪对待测溶液进行核磁共振氢谱测试，设定参数为脉冲序列zg，检测谱宽18ppm，谱宽中心值5ppm，采样时间2min34s，驰豫延迟时间8s，线宽因子0.2Hz，采样温度295K，采样次数12次，得到核磁共振氢谱图；根据所述核磁共振氢谱图，选择氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为透明质酸钠的定量目标峰，氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为内标物的定量目标峰进行积分，得到透明质酸钠定量特征峰的积分面积测定值(透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与内标物的定量目标峰的积分面积的比值)，通过上述透明质酸钠积分面积测定值带入计算公式，计算得到透明质酸钠的含量为95.69％。
实施例3
分别称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1mL重水和30μL氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，得到待测溶液；采用1H核磁共振波谱仪对待测溶液进行核磁共振氢谱测试，设定参数为脉冲序列zg，检测谱宽22ppm，谱宽中心值7ppm，采样时间5min19s，驰豫延迟时间12s，线宽因子0.4Hz，采样温度313K，采样次数20次，得到核磁共振氢谱图；根据所述核磁共振氢谱图，选择氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为透明质酸钠的定量目标峰，氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为内标物的定量目标峰进行积分，得到透明质酸钠定量特征峰的积分面积测定值(透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与内标物的定量目标峰的积分面积的比值)，通过上述透明质酸钠积分面积测定值带入计算公式，计算得到透明质酸钠的含量为95.73％。
方法验证：
方法验证过程中1H核磁共振波谱仪的参数与实施例1一致。
(1)专属性测试
1)溶液配制
空白溶液：1mL重水和20μL氘代氢氧化钠混合均匀，即得。
样品空白溶液：称取透明质酸钠10mg置离心管中，加入1mL重水和20μL氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，即得10mg/mL的样品空白溶液。
内标溶液：称取马来酸10mg，置离心管中，加入1mL重水和20μL氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，即得10mg/mL的对照品溶液前边写的是内标，名称尽量保持一致。
样品加标溶液(内标浓度10mg/mL)：称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1mL重水和20μL氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得样品加标溶液。
2)试验过程
取上述溶液，分别置于核磁共振波谱仪中进行测试，参数如表1所示，采集数据，记录各样品中峰的化学位移值。
3)接受标准
空白溶液、对照品溶液与样品空白溶液峰无干扰。
3)结果及结论
测试结果如表2所示，测试谱图如图1～3所示，图1为空白溶液测定图，图2为空白溶液加内标测定图，图3为空白溶液加内标加样品测定图。
表2专属性试验结果
由表2可知，空白溶液、内标溶液与样品空白溶液峰无干扰，专属性良好。
(2)精密度测试
1)重复性
1、溶液配制
100％样品加标溶液：称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1mL重水和20μL氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制共6份。
2、试验过程
取上述溶液依次进样分析，以内标法计算浓度，并计算透明质酸钠含量的RSD。
3、接受标准
6份样品中透明质酸钠含量RSD≤2％。
4、结果及结论
重复性试验结果如表3所示。
表3重复性试验结果
由表3可知，6份样品中透明质酸钠含量的RSD为0.11％，重复性良好。
2)中间精密度
1、溶液配制
在不同日期按上述重复性溶液配制要求重新配制6份100％样品加标溶液。
2、试验过程
取上述溶液依次进样分析，以内标法计算透明质酸钠含量，并计算透明质酸钠含量的RSD。
3、接受标准
12份加标溶液透明质酸钠含量的RSD≤2％。
4、结果及结论
中间精密度试验结果如表4所示。相关试验部分图谱见图4和图5，图4为重复性测定图，图5位中间精密度测定图。
表4中间精密度试验结果
由表4可知，12针透明质酸钠样品加标含量的RSD为0.15％，中间精密度良好。
3)准确度
1、溶液配制
80％样品加标溶液：称取透明质酸钠8mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1mL重水和20μL氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制3份。
100％样品加标溶液：称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1mL重水和20μL氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制3份。
120％样品加标溶液：称取透明质酸钠12mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1mL重水和20μL氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制3份。
2、试验过程
每份溶液测定1次，以内标法计算透明质酸钠含量，并计算透明质酸钠含量的RSD。
3、接受标准
各浓度下样品中透明质酸钠含量的RSD≤2％。
4、结果及结论
准确度试验结果如表5所示。
表5准确度试验结果
由表5可知，80％加标下样品中透明质酸钠含量的RSD为0.09％，100％加标下样品中透明质酸钠含量的RSD为0.16％，120％加标下样品中透明质酸钠含量的RSD为0.16％，准确度良好。
4)溶液稳定性
1、溶液配制
100％样品加标溶液：称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1mL重水和20μL氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得。
2、试验过程
上述溶液于室温放置，分别于0h、2h、13h，每份溶液测定1次，记录峰面积，具体时间可根据实际情况进行调整。
3、接受标准
各放置时间点溶液测得含量与0h的比值在98～102％之间。
4、溶液稳定性结果及结论
样品加标溶液稳定性结果如表6所示。
表6样品加标溶液稳定性结果
由表6可知，2h、13h时间点溶液测得含量与0h的比值在98～102％之间，即样品加标溶液室温放置13h内稳定性良好。
实施例1的样品检测结果
对实施例1的样品测定两针平行样，检测结果如表7所示。相关图谱如图6和图7所示。
表7样品检测结果
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (9)
1.一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，包括以下步骤：
将待测样品、内标物和氘代溶剂混合后，进行核磁共振氢谱测试，得到核磁共振氢谱图；所述待测样品和内标物的质量比为1∶1；
所述内标物为马来酸；所述氘代溶剂包括重水和氘代氢氧化钠；
所述核磁共振氢谱测试的脉冲序列为zg；
所述核磁共振氢谱测试的驰豫延迟时间≥8s；
根据所述核磁共振氢谱图，对透明质酸钠的定量目标峰和内标物的定量目标峰分别进行积分，得到透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，通过透明质酸钠的含量的计算公式，计算得到透明质酸钠的含量；
所述透明质酸钠的定量目标峰为氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰；所述内标物的定量目标峰为氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键上的2个氢特征峰；
所述透明质酸钠的积分面积测定值为所述透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与所述内标物的定量目标峰的积分面积的比值；
所述透明质酸钠的含量的计算公式为：
透明质酸钠含量＝A×Mmal×M1×P/(M样×M2)，％；
A：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
P：内标物的含量，％；
Mmal：内标物的质量，mg；
M样：待测样品的质量，mg；
M1：透明质酸钠的分子质量；
M2：内标物的分子质量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重水和氘代氢氧化钠的体积比为100∶(1～3)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述待测样品和内标物的质量比为1:1替换为所述待测样品和内标物的摩尔比为1:1；且所述透明质酸钠的含量的计算公式为：
透明质酸钠含量＝A×m×M1×P/M样，％；
A：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
P：内标物的含量，％；
m：内标物的摩尔质量，mol；
M样：待测样品的质量，mg；
M1：透明质酸钠的分子质量。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核磁共振氢谱测试的采样温度≥295K。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核磁共振氢谱测试的检测谱宽范围为18～22ppm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核磁共振氢谱测试的谱宽中心值为5～7ppm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核磁共振氢谱测试的扫描次数≥12次。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核磁共振氢谱测试的采样时间≥2min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核磁共振氢谱测试的线宽因子为0.2～0.4Hz。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210213712.6A CN114594122A (zh) | 2022-03-07 | 2022-03-07 | 一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210213712.6A CN114594122A (zh) | 2022-03-07 | 2022-03-07 | 一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114594122A true CN114594122A (zh) | 2022-06-07 |
Family
ID=81816073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210213712.6A Pending CN114594122A (zh) | 2022-03-07 | 2022-03-07 | 一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114594122A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103439491A (zh) * | 2013-09-17 | 2013-12-11 | 北京润诺思医疗科技有限公司 | 一种透明质酸化学发光定量测定试剂盒及其制备方法 |
| CN114018965A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-02-08 | 五源本草(山东)健康科技有限公司 | 一种多糖核磁共振氢谱法定量检测技术 |
| CN114018966A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-02-08 | 五源本草(山东)健康科技有限公司 | 一种低聚糖核磁共振氢谱法定量检测技术 |
-
2022
- 2022-03-07 CN CN202210213712.6A patent/CN114594122A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103439491A (zh) * | 2013-09-17 | 2013-12-11 | 北京润诺思医疗科技有限公司 | 一种透明质酸化学发光定量测定试剂盒及其制备方法 |
| CN114018965A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-02-08 | 五源本草(山东)健康科技有限公司 | 一种多糖核磁共振氢谱法定量检测技术 |
| CN114018966A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-02-08 | 五源本草(山东)健康科技有限公司 | 一种低聚糖核磁共振氢谱法定量检测技术 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lehnert et al. | Possibilities of selective screening for inborn errors of metabolism using high-resolution 1 H-FT-NMR spectrometry | |
| Zhu et al. | Spectrofluorimetric determination of heparin using a tetracycline–europium probe | |
| CN111999332A (zh) | 一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法 | |
| Martineau et al. | Non-linear effects in quantitative 2D NMR of polysaccharides: Pitfalls and how to avoid them | |
| Pieters et al. | Applications of quantitative 1H-and 13C-NMR spectroscopy in drug analysis | |
| CN107421975B (zh) | 一种注射剂中甘油含量的检测方法 | |
| CN114594122A (zh) | 一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法 | |
| CN106124550A (zh) | 一种基于氢核磁共振快速测定维格列汀纯度的方法 | |
| Zhang et al. | Consistency of NMR and mass spectrometry determinations of natural-abundance site-specific carbon isotope ratios. The case of glycerol | |
| Cravey et al. | Current status of blood alcohol methods | |
| CN113341028A (zh) | 一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法 | |
| CN110736796B (zh) | 一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法 | |
| CN102119973A (zh) | 一种栀子渗漉液质量控制方法 | |
| Korir et al. | On-line NMR detection of microgram quantities of heparin-derived oligosaccharides and their structure elucidation by microcoil NMR | |
| CN115902036A (zh) | 一种尿囊素铝中尿素含量的测定方法 | |
| CN113567593B (zh) | 一种银杏蜜环口服溶液多成分含量检测及其指纹图谱方法的构建 | |
| CN105911081B (zh) | 一种鉴别甘露聚糖肽的方法 | |
| CN114137107A (zh) | 一种去氧胆酸注射液的含量测定方法 | |
| CN114018965A (zh) | 一种多糖核磁共振氢谱法定量检测技术 | |
| Milanovich et al. | Raman spectroscopic investigations of sarcoplasmic reticulum membranes | |
| Lunazzi et al. | Conformational studies by dynamic nuclear magnetic resonance. Part 4. Rotational isomers and torsional barriers of pyridinecarbaldehydes | |
| Ni et al. | Low-speed magic-angle-spinning carbon-13 NMR of fruit tissue | |
| CN108152319A (zh) | 一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法 | |
| CN106124551B (zh) | 佛手氢核磁共振指纹图谱及其建立方法和用途 | |
| CN108398452A (zh) | 一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Re对照品含量的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |