CN111999332A - 一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法，该方法包括如下步骤：步骤1、内标物储备液的制备；步骤2、松二糖对照品溶液的制备；步骤3、样品溶液的制备；步骤4、蜂蜜样品中松二糖的含量测定；步骤5、核磁氢谱的测定条件；步骤6、蜂蜜样品中松二糖的含量计算。本发明利用蜂蜜溶液中松二糖包含独立核磁谱峰的优势，分别将适量无干扰的内标物加入到一系列松二糖对照品溶液和蜂蜜样品溶液中，通过高场液体核磁技术结合内标定量法能够准确有效地测定蜂蜜中松二糖的含量。方法简便高效，重现性好，准确度高，为蜂蜜真实性鉴定及蜂蜜质量标准的制定提供了技术支持和参考。

Description

一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体的说是涉及一种利用核磁氢谱测定蜂蜜中送二醇含量的方法。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂精制的天然甜物质，其组成成分与蜂蜜采集的花蜜、蜜露、原料的产地、气候及储存加工等条件息息相关。众所周知，糖类是蜂蜜的主要成分，也是影响蜂蜜风味的重要成分之一。研究表明，蜂蜜中的糖类以果糖和葡萄糖为主，总含量可高达70~80%。此外，蜂蜜中还含有一定的二糖、少量的三糖及低聚寡糖，如蔗糖、蔗果三糖、松二糖、松三糖、异麦芽糖、麦芽糖、麦芽三糖等。
研究表明，松二糖（turanose）是蜂蜜中自然存在的还原性双糖，具有相当于蔗糖甜味的一半程度的甜味，是蔗糖类似物，可在食品、化妆品及医药领域得到重要的应用。目前，蜂蜜掺假过程中常使用果葡糖浆、大米糖浆、甘蔗糖浆、玉米糖浆和甜菜糖浆，其主要糖类组分也是果糖和葡萄糖，因而用于蜂蜜掺假检测的技术多侧重分析糖浆生产过程中引入或产生的物质（即糖浆标记物），然而，随着糖浆生产工艺的日益改进，可被检测到的标记物越来越少，蜂蜜掺假检测的难度也随之加大。因此，测定真实蜂蜜中的其他糖类物质，如松二糖，并与糖浆中的该组分的含量进行对比，建立可用于蜂蜜掺假检测的蜂蜜指标，对于蜂蜜质量安全标准的制定及整个蜂蜜行业的健康发展均有重大意义。
目前，我国尚未公布针对蜂蜜中松二糖含量测定的标准方法，但可以参考《食品安全国家标准》（GB 5009.8-2016）中蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定方法，使用高效液相色谱柱氨基柱实现各糖分子的分离，并使用示差折光检测器或蒸发光散射检测器检测，外标法定量，然而，液相方法通常消耗大量的有机溶剂，氨基柱的使用及维护成本较高，蒸发光散射检测器对于二糖的检测效果更好，却比较耗时（>15 min）。近几年，高场核磁共振技术在蜂蜜中的应用日益增多，国内有学者通过添加内标试剂（邻苯二甲酸氢钾）的方法，测定微量蜂蜜样品的一维1HNMR谱，利用理论内标与糖类分子特定位移处的积分面积与分子中质子数的关系计算得到果糖、葡萄糖和蔗糖分子的含量，可行性高，但该方法需要借助1HNMR、H-H COSY、13 C NMR、DEPT、HSQC和HMBC等一系列谱图完成待测糖分子特定谱峰的归属，耗时耗力，对于定量谱峰重叠严重的糖分子则更难实现。国外学者有借助于CSSF-TOCSY脉冲序列，通过选择性激发蜂蜜中特定位移出峰的糖类实现定量，但前提是需要归属准确的糖质子共振频率，也要耗费很长的扫描时间，并不适合日常检测。因此，亟需开发一种能够高效测定蜂蜜中松二糖含量的方法，为蜂蜜的质量和安全控制提供科学依据。
发明内容
为了克服当前蜂蜜中二糖物质检测时间较长，成本较高的缺陷，本发明提供一种无需对松二糖进行液相分离或核磁质子归属，仅利用核磁氢谱结合内标法定量蜂蜜中松二糖含量的方法，该方法简便快捷，经济实效，准确度高，重现性好等优点，能够对蜂蜜中松二糖实现快速定量，适用于蜂蜜的日常检测，也为蜂蜜的真实性鉴定提供技术支持和参考。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明是一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1、内标物储备液的制备：准确称量邻苯二甲酸氢钾0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加水定容至刻度，涡旋并超声均匀，制成1 mL含100 mg内标物的储备液；
步骤2、松二糖对照品溶液的制备：
（1）精密称取松二糖标准品100 mg，置于5 mL容量瓶中，用1 mol/L KH2PO4缓冲液定容至5 mL，涡旋均匀，制成每1 mL中含20 mg松二糖的储备液；
（2）分别精密吸取松二糖储备液100 -1500 μL，各置于5mL容量瓶中，分别依次加入含内标物10 mg的内标物储备液100 μL、1 mol/L HCl 200 μL，用1 mol/L KH2PO4缓冲液定容至刻度，涡旋均匀，分别制得每1 mL中含松二糖对照品2 -30 mg的系列对照品溶液；
步骤3、样品溶液的制备：精密称取蜂蜜样品1g，置于5mL量瓶中，依次加入含内标物10mg的内标物储备液100 μL、1 mol/L HCl 200 μL，用1 mol/L KH2PO4缓冲液溶解并定容至刻度，涡旋均匀，作为样品溶液；
步骤4、蜂蜜样品中松二糖的含量测定：分别吸取步骤2制备的系列松二糖对照品溶液及步骤3制备的样品溶液900 μL，各加入含质量分数为0.1%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.015%叠氮化钠的重水溶液100 μL，涡旋均匀，各取600 μL装入核磁管待测；
步骤5、核磁氢谱测定条件：脉冲程序为noesygppr1d；O1=4.7-4.8； NS=32；DS=4；D1=4s；TD=65536；SWH=8196.722 Hz；TE=300.1 K；
步骤6、蜂蜜样品中松二糖的含量计算：分别得到松二糖系列对照品溶液和样品溶液的核磁氢谱，在保持原始谱图不放大的前提下，分别将谱图中TSP位移设置为0，然后进行自动相位和基线校正，并设定各谱图中内标邻苯二甲酸氢钾在7.814ppm左右的多重峰的面积为1，分别记录对照品溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积与样品溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积，以系列对照品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积为纵坐标，以松二糖含量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，由样品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积推算样品溶液中松二糖含量（mg/g）。
本发明的进一步改进在于：步骤5中的O1值应由所测定的样品溶液进行预饱和方法压制水峰后得到最优值。
本发明的进一步改进在于：步骤6中系列对照品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积为至少两次独立测试得到的核磁氢谱积分的算术平均值，结果保留4位小数，在重现性条件下，两次独立测定结果的相对标准偏差在5%以内。
本发明的进一步改进在于：步骤6中蜂蜜样品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积为至少两次独立测试得到的核磁氢谱积分的算术平均值，结果保留4位小数，在重现性条件下，两次独立测定结果的相对标准偏差在10%以内，样品中松二糖含量的计算结果保留2位有效数字。
本发明的进一步改进在于：步骤2中松二糖系列对照品溶液的制备应包含至少5个不同的浓度。
本发明有益效果是：本发明利用松二糖在蜂蜜样品溶液中具有独立的核磁氢谱出峰位置如5.30ppm左右优势，结合添加内标建立标准曲线的思路，建立了蜂蜜中松二糖含量测定的核磁方法，在同一仪器条件下，一旦松二糖对照品溶液的标准曲线建立，即可对不同批次的蜂蜜样品进行测定。
本发明方法简便高效，重现性好，准确度高，为蜂蜜真实性鉴定及蜂蜜质量标准的制定提供了技术支持和参考。
附图说明
图1是本发明松二糖专属性的核磁氢谱图，其中a、缓冲液；b：内标溶液；c-h：松二糖对照品溶液。
图2是本发明松二糖对照品溶液中松二糖含量的标准曲线。
图3是本发明实施例1-3中各蜂蜜样品测定的核磁氢谱图。
具体实施方式
以下将以图式揭露本发明的实施方式，为明确说明起见，许多实务上的细节将在以下叙述中一并说明。然而，应了解到，这些实务上的细节不应用以限制本发明。也就是说，在本发明的部分实施方式中，这些实务上的细节是非必要的。
实施例1
1、仪器和试剂：
1.1 仪器：
瑞士布鲁克公司的400 MHz液体核磁共振谱仪，BBI探头；梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司的IT0079电子天平；5 mL 容量瓶；昆山禾创超声仪器有限公司的KH-500B超声波清洗器；美国Wilmad-labglass公司的5 mm核磁管。
1.2试剂：
叠氮化钠（NaN3）纯度规格为分析纯，购于天津福晨化学试剂厂；重水（D2O），氘代率为99.9％，购于上海安耐吉化学有限公司；2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠盐TSP，氘代率为98％；磷酸二氢钾（KH2PO4）纯度为分析纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司；邻苯二甲酸氢钾C8H5KO4，纯度99.95-100.05%，购于天津市化学试剂研究所有限公司，D(+)-松二糖标准品，纯度>99%，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，37%HCl溶液，纯度为优级纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司，其中，1 mol/L的KH2PO4缓冲液，1 mol/L的HCl溶液分别由超纯水配制而成，质量分数为0.1%的TSP及质量分数为0.015%的NaN3的混合溶液用重水配置。
本发明是一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1、内标物储备液的制备：准确称量邻苯二甲酸氢钾0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加水定容至刻度，涡旋并超声均匀，制成每100 mg/mL的内标物储备液；
步骤2、松二糖对照品溶液的制备：
（1）精密称取松二糖标准品100 mg，置于5 mL容量瓶中，用1 mol/L KH2PO4缓冲液定容至5 mL，涡旋均匀，制成每1 mL中含20 mg松二糖的储备液；
（2）分别精密吸取松二糖储备液00 μL、300 μL、400 μL、500 μL、750 μL、1000 μL，各置于5ml容量瓶中，分别依次加入含内标物10 mg的内标物储备液100 μL、1 mol/L HCl 200 μL，用1 mol/L KH2PO4缓冲液定容至刻度，涡旋均匀，分别制得每1 mL中含松二糖对照品2mg、6 mg、8 mg、10 mg、15 mg、20 mg的系列对照品溶液；
步骤3、精密称取油菜蜜原料样品1.5 g，置于5mL量瓶中，依次加入含内标物10 mg的内标物储备液100 μL、1 mol/L HCl 200 μL，用1 mol/L KH2PO4缓冲液溶解并定容至刻度，涡旋均匀，作为油菜蜜溶液；
步骤4、分别吸取系列松二糖对照品溶液和油菜蜜溶液900 μL，各加入含质量分数为0.1%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.015%叠氮化钠的重水溶液100 μL，涡旋均匀，各取600 μL装入核磁管待测；
步骤5、核磁氢谱测定条件：脉冲程序为noesygppr1d；O1=4.7-4.8； NS=32；DS=4；D1=4s；TD=65536；SWH=8196.722 Hz；TE=300.1 K；
步骤6、分别得到松二糖系列对照品溶液和油菜蜜溶液的核磁氢谱，使用Topspin4.0.7软件分析，在保持原始谱图不放大的前提下，分别将谱图中TSP位移设置为0，然后进行自动相位和基线校正，并设定各谱图中内标邻苯二甲酸氢钾在7.814ppm左右的多重峰的面积为1，分别记录对照品溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积与油菜蜜溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积，以系列对照品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积为纵坐标，以松二糖含量为横坐标，绘制标准曲线，如图2所示，计算回归方程，由油菜蜜溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积推算样品溶液中松二糖含量mg/g，如图3所示。油菜蜜中松二糖含量的测定见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例2
1.1 仪器：
瑞士布鲁克公司的400 MHz液体核磁共振谱仪，BBI探头；梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司的IT0079电子天平；5 mL 容量瓶；昆山禾创超声仪器有限公司的KH-500B超声波清洗器；美国Wilmad-labglass公司的5 mm核磁管。
1.2试剂：
叠氮化钠（NaN3），纯度规格为分析纯，购于天津福晨化学试剂厂；重水（D2O），氘代率为99.9％，购于上海安耐吉化学有限公司；2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠盐TSP，氘代率为98％；磷酸二氢钾（KH2PO4）纯度为分析纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司；邻苯二甲酸氢钾C8H5KO4，纯度99.95-100.05%，购于天津市化学试剂研究所有限公司，D(+)-松二糖标准品，纯度>99%，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，37%HCl溶液，纯度为优级纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司，其中，1 mol/L的KH2PO4缓冲液，1 mol/L的HCl溶液分别由超纯水配制而成，质量分数为0.1%的TSP及质量分数为0.015%的NaN3的混合溶液用重水配置。
本发明是一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1、内标物储备液的制备：准确称量邻苯二甲酸氢钾0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加水定容至刻度，涡旋并超声均匀，制成每100 mg/mL的内标物储备液；
步骤2、松二糖对照品溶液的制备：
（1）精密称取松二糖标准品100 mg，置于5 mL容量瓶中，用1 mol/L KH2PO4缓冲液定容至5 mL，涡旋均匀，制成每1 mL中含20 mg松二糖的储备液；
（2）分别精密吸取松二糖储备液00 μL、300 μL、400 μL、500 μL、750 μL、1000 μL，，各置于5ml容量瓶中，分别依次加入含内标物10 mg的内标物储备液100 μL、1 mol/L HCl 200μL，用1 mol/L KH2PO4缓冲液定容至刻度，涡旋均匀，分别制得每1 mL中含松二糖对照品2mg、6 mg、8 mg、10 mg、15 mg、20 mg的系列对照品溶液；
步骤3、精密称取洋槐蜜原料样品1g，置于5mL量瓶中，依次加入内标物储备液100 μL、1mol/L HCl 200 μL，用1 mol/L KH2PO4缓冲液溶解并定容至刻度，涡旋均匀，作为洋槐蜜溶液；
步骤4、分别吸取系列松二糖对照品溶液和洋槐蜜溶液900 μL，各加入含质量分数为0.1%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.015%叠氮化钠的重水溶液100 μL，涡旋均匀，各取600 μL装入核磁管待测；
步骤5、核磁氢谱测定条件：脉冲程序为noesygppr1d；O1=4.7-4.8； NS=32；DS=4；D1=4s；TD=65536；SWH=8196.722 Hz；TE=300.1 K；
步骤6、分别得到松二糖系列对照品溶液和洋槐蜜溶液的核磁氢谱，使用Topspin4.0.7软件分析，在保持原始谱图不放大的前提下，分别将谱图中TSP位移设置为0，然后进行自动相位和基线校正，并设定各谱图中内标邻苯二甲酸氢钾在7.814ppm左右的多重峰的面积为1，分别记录对照品溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积与洋槐蜜溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积，以系列对照品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积为纵坐标，以松二糖含量为横坐标，绘制标准曲线，如图2所示，计算回归方程，由洋槐蜜溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积推算样品溶液中松二糖含量mg/g，如图3所示。洋槐蜜中松二糖含量的测定见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
实施例3
1.1 仪器：
瑞士布鲁克公司的400 MHz液体核磁共振谱仪，BBI探头；梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司的IT0079电子天平；5 mL 容量瓶；昆山禾创超声仪器有限公司的KH-500B超声波清洗器；美国Wilmad-labglass公司的5 mm核磁管。
1.2试剂：
叠氮化钠（NaN3），纯度规格为分析纯，购于天津福晨化学试剂厂；重水（D2O），氘代率为99.9％，购于上海安耐吉化学有限公司；2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠盐TSP，氘代率为98％；磷酸二氢钾（KH2PO4）纯度为分析纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司；邻苯二甲酸氢钾C8H5KO4，纯度99.95-100.05%，购于天津市化学试剂研究所有限公司，D(+)-松二糖标准品，纯度>99%，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，37%HCl溶液，纯度为优级纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司，其中，1 mol/L的KH2PO4缓冲液，1 mol/L的HCl溶液分别由超纯水配制而成，质量分数为0.1%的TSP及质量分数为0.015%的NaN3的混合溶液用重水配置。
本发明是一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1、内标物储备液的制备：准确称量邻苯二甲酸氢钾0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加水定容至刻度，涡旋并超声均匀，制成每100 mg/mL的内标物储备液；
步骤2、松二糖对照品溶液的制备：
（1）精密称取松二糖标准品100 mg，置于5 mL容量瓶中，用1 mol/L KH2PO4缓冲液定容至5 mL，涡旋均匀，制成每1 mL中含20 mg松二糖的储备液；
（2）分别精密吸取松二糖储备液00 μL、300 μL、400 μL、500 μL、750 μL、1000 μL，各置于5ml容量瓶中，分别依次加入含内标物10 mg的内标物储备液100 μL、1 mol/L HCl 200 μL，用1 mol/L KH2PO4缓冲液定容至刻度，涡旋均匀，分别制得每1 mL中含松二糖对照品2mg、6 mg、8 mg、10 mg、15 mg、20 mg的系列对照品溶液；
步骤3、精密称取荆条原料蜜样品1.2 g，置于5mL量瓶中，依次加入内标物储备液100 μL、1 mol/L HCl 200 μL，用1 mol/L KH2PO4缓冲液溶解并定容至刻度，涡旋均匀，作为洋槐蜜溶液；
步骤4、分别吸取系列松二糖对照品溶液和荆条蜜溶液900 μL，各加入含质量分数为0.1%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.015%叠氮化钠的重水溶液100 μL，涡旋均匀，各取600 μL装入核磁管待测；
步骤5、核磁氢谱测定条件：脉冲程序为noesygppr1d；O1=4.7-4.8； NS=32；DS=4；D1=4s；TD=65536；SWH=8196.722 Hz；TE=300.1 K；
步骤6、分别得到松二糖系列对照品溶液和荆条蜜溶液的核磁氢谱，使用Topspin4.0.7软件分析，在保持原始谱图不放大的前提下，分别将谱图中TSP位移设置为0，然后进行自动相位和基线校正，并设定各谱图中内标邻苯二甲酸氢钾在7.814ppm左右的多重峰的面积为1，分别记录对照品溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积与荆条蜜溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积，以系列对照品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积为纵坐标，以松二糖含量为横坐标，绘制标准曲线，如图2所示，计算回归方程，由荆条蜜溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积推算样品溶液中松二糖含量mg/g，如图3所示。荆条蜜中松二糖含量的测定见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
为了说明本发明方法的有效性，本发明做了一系列的试验并且得出数据如下：
1、专属性及线性关系试验
不称取样品，在5 mL量瓶中依次加入内标物储备液100 μL，1 mol/L HCl 200μL，用1mol/L KH2PO4缓冲液定容至刻度，涡旋均匀，作为内标溶液，分别精密吸取1 mol/mL的K2HPO4缓冲液、内标溶液和系列松二糖对照品溶液900 μL，然后各加入质量分数为为0.1%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.015%的叠氮化钠的重水溶液100 μL，涡旋均匀，各取600 μL装入核磁管，按照实施例1~3中的步骤6测定，分别得到缓冲液、内标溶液及松二糖系列对照品溶液的核磁氢谱图，见附图1，使用Topspin 4.0.7软件分析，在保持原始谱图不放大的条件下，分别将谱图中TSP位移设置为0，然后进行自动相位和基线校正，并设定各谱图中内标邻苯二甲酸氢钾在7.814ppm左右的多重峰的面积为1，分别记录空白即缓冲液和内标溶液和对照品品溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积，以松二糖在5.30ppm左右的峰面积为纵坐标，以松二糖含量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，线性曲线结果见附图2，线性试验数据结果见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
2、精密度试验
精密称取同一批洋槐蜜样品6份，每份1 g，按实施例2规定的步骤测定，记录核磁氢谱图，计算样品中松二糖的含量、平均含量、相对标准偏差，结果见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
由上表可以看出，RSD为3.28%，说明精密度良好。
3、定量限
本发明认为1g蜂蜜样品中松二糖的峰面积大于0.0536才可以准确定量，因而规定本发明的定量限为2 mg/g。
4、加标回收率试验
精密称取同一批油菜蜜样品6份，其中松二糖含量为7.80 mg/g，每份1 g，其中3份加入松二糖储备液500 μL，其中含松二糖10 mg，另3份加入松二糖储备液1000 μL，其中含松二糖20 mg，分别计算回收率及平均值，加标回收率试验数据见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
由上表可以看出，当松二糖加标为10 mg/g和20 mg/g时，回收率范围为90%~95%，说明本发明方法的准确度高。
5、稳定性试验
分别于不同日期对同一4°C冷藏保存的批油菜蜜进行试验，按实施例1中的步骤进行，记录每次样品中松二糖含量，稳定性试验数据见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
由上表可知：RSD为2.46%，说明本发明方法的稳定性好。
本发明利用蜂蜜溶液中松二糖包含独立核磁谱峰的优势，分别将适量无干扰的内标物加入到一系列松二糖对照品溶液和蜂蜜样品溶液中，通过高场液体核磁技术结合内标定量法能够准确有效地测定蜂蜜中松二糖的含量。
以上所述仅为本发明的实施方式而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理的内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的权利要求范围之内。

Claims (5)

1.一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤1、内标物储备液的制备：准确称量邻苯二甲酸氢钾0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加水定容至刻度，涡旋并超声均匀，制成1 mL含100 mg内标物的储备液；
步骤2、松二糖对照品溶液的制备：
（1）精密称取松二糖标准品100 mg，置于5 mL容量瓶中，用1 mol/L KH2PO4缓冲液定容至5 mL，涡旋均匀，制成每1 mL中含20 mg松二糖的储备液；
（2）分别精密吸取松二糖储备液100 -1500 μL，各置于5mL容量瓶中，分别依次加入含内标物10 mg的内标物储备液100 μL、1 mol/L HCl 200 μL，用1 mol/L KH2PO4缓冲液定容至刻度，涡旋均匀，分别制得每1 mL中含松二糖对照品2 -30 mg的系列对照品溶液；
步骤3、样品溶液的制备：精密称取蜂蜜样品1-1.5 g，置于5mL量瓶中，依次加入含内标物10 mg的内标物储备液100 μL、1 mol/L HCl 200 μL，用1 mol/L KH2PO4缓冲液溶解并定容至刻度，涡旋均匀，作为样品溶液；
步骤4、蜂蜜样品中松二糖的含量测定：分别吸取步骤2制备的系列松二糖对照品溶液及步骤3制备的样品溶液900 μL，各加入含质量分数为0.1%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.015%叠氮化钠的重水溶液100 μL，涡旋均匀，各取600 μL装入核磁管待测；
步骤5、核磁氢谱测定条件：脉冲程序为noesygppr1d；O1=4.7-4.8； NS=32；DS=4；D1=4s；TD=65536；SWH=8196.722 Hz；TE=300.1 K；
步骤6、蜂蜜样品中松二糖的含量计算：分别得到松二糖系列对照品溶液和样品溶液的核磁氢谱，在保持原始谱图不放大的前提下，分别将谱图中TSP位移设置为0，然后进行自动相位和基线校正，并设定各谱图中内标邻苯二甲酸氢钾在7.814ppm左右的多重峰的面积为1，分别记录对照品溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积与样品溶液中松二糖在5.30ppm左右的峰面积，以系列对照品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积为纵坐标，以松二糖含量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，由样品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积推算样品溶液中松二糖含量。
2.根据权利要求1所述一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法，其特征在于：所述步骤5中的O1值应由所测定的样品溶液进行预饱和方法压制水峰后得到最优值。
3.根据权利要求1所述一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法，其特征在于：所述步骤6中系列对照品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积为至少两次独立测试得到的核磁氢谱积分的算术平均值，结果保留4位小数，在重现性条件下，两次独立测定结果的相对标准偏差在5%以内。
4.根据权利要求1所述一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法，其特征在于：步骤6中蜂蜜样品溶液谱图中松二糖在5.30ppm左右的峰面积为至少两次独立测试得到的核磁氢谱积分的算术平均值，结果保留4位小数，在重现性条件下，两次独立测定结果的相对标准偏差在10%以内，样品中松二糖含量的计算结果保留2位有效数字。
5.根据权利要求1所述一种利用核磁氢谱法测定蜂蜜中松二糖含量的方法，其特征在于：所述步骤2中松二糖系列对照品溶液的制备应包含至少5个不同的浓度。
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