CN113341028A - 一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法 - Google Patents
一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法,涉及玻璃酸钠测试技术领域。本发明采用SEC法,由高效液相色谱进行普适校正计算三次函数回归方程,进行玻璃酸钠分子量与分子量分布测定,采用6种不同分子量(重均分子量分别为5.4万~6.6万、12.6万~15.4万、23.4万~28.6万、59.4万~72.6万、90万~110万和180万~220万)系列的聚苯乙烯磺酸钠对照品,用多项式拟合得到一元三次普适校正方程,可以有效避免个别点的波动导致整体数据无法重现的问题,并且一元三次方程可以防止过拟合问题,从而有效提升测量数据的准确性、重现性和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及玻璃酸钠测试技术领域,具体涉及一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法。
背景技术
玻璃酸钠(Sodium hyaluronate,SH)是广泛存在于动物组织细胞间质中的一种酸性黏多糖,其结构为葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖双糖单位重复连接,平均相对分子质量为105~107。不同分子量的SH,其药理作用有很大差别,高分子量SH(相对分子质量120万~200万)具有高度的黏弹性和润滑性,可作为黏弹性保护剂用于眼科手术和关节腔内注射治疗类风湿关节炎和骨关节炎,平均相对分子质量越高疗效越好;较低平均相对分子质量的SH(相对分子质量70万~120万)则更易被机体吸收,可作为天然保湿因子用于化妆品和美容保健食品领域;更低的平均相对分子质量的SH(相对分子质量低于70万)还有促进骨生成、治疗细菌性角膜溃疡以及抗肿瘤等疗效。因此,准确测定SH的平均相对分子质量是控制SH质量的重要指标之一。
玻璃酸钠滴眼液化学名称:[→3)-2-乙酰氨-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖-(1→)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-(1→]n,英文名称:Sodium Hyaluronate Eye Drops。
目前,玻璃酸钠分子量与分子量分布常用的测定方法有黏度法、分子排阻色谱(SEC)法以及多角度激光光散射仪与分子排阻色谱联用(MALLS-SEC)法等。其中,SEC法根据溶液中分子体积大小实现分离,具有快速、简便和不受杂质干扰等优点,应用较为广泛。但是,SEC法需用系列对照品进行普适校正计算回归方程后进行计算,如果对照品选用不合适或者校正曲线计算不准确会导致计算出的样品结果出现较大差异,影响测试结果的重现性。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法,本发明提供的方法测试结果的重现性和稳定性好。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法,包括以下步骤:
(1)提供系列对照品溶液;所述系列对照品为重均分子量分别为5.4万~6.6万、12.6万~15.4万、23.4万~28.6万、59.4万~72.6万、90万~110万和180万~220万的聚苯乙烯磺酸钠盐;
(2)将所述系列对照品溶液进行液相色谱分析,得到保留时间;根据保留时间依据Mark-Houwink方程进行普适校正计算保留时间-重均分子量,得到一元三次普适校正方程;
(3)提供玻璃酸钠供试品溶液;将所述玻璃酸钠供试品溶液进行液相色谱分析,得到保留时间;根据所述保留时间和一元三次普适校正方程计算所述玻璃酸钠的分子量与分子量分布。
优选的,所述一元三次普适校正方程为Y=-0.0007X3-0.0071X2+0.3081X+6.7753,所述一元三次普适校正方程的相关系数R为0.9998;
优选的,步骤(2)和步骤(3)中所述液相色谱分析的条件为:流速0.4~0.5mL/min,柱温为35~40℃,检测器温度为35~40℃,色谱柱为Shodex SB-806HQ;流动相为氯化钠-叠氮化钠水溶液;所述氯化钠-叠氮化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.15~0.2g/L,叠氮化钠的浓度为0.1~0.2g/L。
优选的,所述系列对照品溶液的浓度为0.10~0.15mg/mL。
优选的,所述玻璃酸钠供试品溶液的浓度为0.10~0.15mg/mL。
本发明提供了一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法,包括以下步骤:(1)提供系列对照品溶液;所述系列对照品为重均分子量分别为5.4万~6.6万、12.6万~15.4万、23.4万~28.6万、59.4万~72.6万、90万~110万和180万~220万的聚苯乙烯磺酸钠盐;(2)将所述系列对照品溶液进行液相色谱分析,得到保留时间;根据保留时间依据Mark-Houwink方程进行普适校正计算保留时间-重均分子量,得到一元三次普适校正方程;(3)提供玻璃酸钠供试品溶液;将所述玻璃酸钠滴眼液供试品溶液进行液相色谱分析,得到保留时间;根据所述保留时间和一元三次普适校正方程计算所述玻璃酸钠的分子量与分子量分布。本发明采用SEC法,由高效液相色谱进行普适校正计算三次函数回归方程,进行玻璃酸钠分子量与分子量分布测定,采用6种不同分子量系列的聚苯乙烯磺酸钠对照品,用多项式拟合回归方程(一元三次普适校正方程),可以有效避免个别点的波动导致整体数据无法重现的问题,并且三次方程可以防止过拟合问题,从而有效提升测量数据的准确性、重现性和稳定性。
附图说明
图1为一元三次普适校正方程图;
图2为实施例1中玻璃酸钠滴眼液供试品溶液的液相测试结果图;
图3为实施例3中玻璃酸钠注射液供试品溶液的液相测试结果图;
图4为实施例4中玻璃酸钠原料药供试品溶液的液相测试结果图;
图5为对比例1的校正方程图;
图6为对比例2的校正方程图。
具体实施方式
本发明提供了一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法,包括以下步骤:
(1)提供系列对照品溶液;所述系列对照品为重均分子量分别为5.4万~6.6万、12.6万~15.4万、23.4万~28.6万、59.4万~72.6万、90万~110万和180万~220万的聚苯乙烯磺酸钠盐;
(2)将所述系列对照品溶液进行液相色谱分析,得到保留时间;根据保留时间依据Mark-Houwink方程进行普适校正计算保留时间-重均分子量,得到一元三次普适校正方程;
(3)提供玻璃酸钠供试品溶液;将所述玻璃酸钠供试品溶液进行液相色谱分析,得到保留时间;根据所述保留时间和一元三次普适校正方程计算所述玻璃酸钠的分子量与分子量分布。
在本发明中,若无特殊说明,所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明提供系列对照品溶液。在本发明中,所述系列对照品为分子量分别为5.4万~6.6万、12.6万~15.4万、23.4万~28.6万、59.4万~72.6万、90万~110万和180万~220万的聚苯乙烯磺酸钠盐,重均分子量优选为5.8万~6.4万、13万~15万、25万~27万、65万~70万、95万~105万和190万~210万,更优选为63900、145000、261000、666000、976000、2070000。在本发明中,所述系列对照品溶液的配制方法,优选包括以下步骤:分别将不同分子量聚苯乙烯磺酸钠盐置于流动相中,摇匀后放置至聚苯乙烯磺酸钠溶解,得到系列对照品溶液;所述流动相优选为氯化钠-叠氮化钠水溶液中氯化钠的浓度优选为11.88g/L,叠氮化钠的浓度优选为0.105g/L;所述配制优选在容量瓶中进行。在本发明中,所述流动相的配制方法,优选包括以下步骤:将氯化钠和叠氮化钠,加入水使氯化钠和叠氮化钠溶解后稀释,然后使用0.45μm微孔滤膜抽滤后超声处理,得到流动相。本发明对于所述超声处理的条件没有特殊限定,采用本领域技术人员熟知的超声条件即可;在本发明的实施例中,所述超声处理优选在室温、40KHz、200W条件下在超声波清洗机中超声10min。在本发明中,所述系列对照品溶液的浓度优选为0.10~0.15mg/mL,更优选为0.11~0.14mg/mL,最优选为0.2~0.13mg/mL。
得到系列对照品溶液后,本发明将所述系列对照品溶液进行液相色谱分析,得到保留时间;根据保留时间依据Mark-Houwink方程进行普适校正计算保留时间-重均分子量的一元三次普适校正方程。在本发明中,所述一元三次普适校正方程优选为Y=-0.0007X3-0.0071X2+0.3081X+6.7753,所述一元三次普适校正方程的相关系数R优选为0.9998。在本发明中,所述Mark-Houwink方程为[η]=KMα,其中,η为特性粘数,K和α为方程的常数,M为分子量。在本发明中,所述一元三次普适校正方程优选由Chromeleon软件分析得到依据Mark-Houwink方程进行普适校正计算三次函数回归方程得到。在本发明中,所述液相色谱分析的色谱条件优选为:流速为0.5mL/min,柱温为35℃,检测器温度为35℃,色谱柱为Shodex SB-806HQ;流动相为氯化钠-叠氮化钠水溶液;所述氯化钠-叠氮化钠水溶液中氯化钠的浓度为11.88g/L,叠氮化钠的浓度为0.105g/L。
得到一元三次普适校正方程后,本发明提供玻璃酸钠供试品溶液;将所述玻璃酸钠供试品溶液进行液相色谱分析,得到保留时间;根据所述保留时间和一元三次普适校正方程计算所述玻璃酸钠的分子量与分子量分布。在本发明中,所述玻璃酸钠供试品溶液的配制方法,优选包括以下步骤:将玻璃酸钠溶解加入至流动相中,摇匀后放置至玻璃酸钠溶解,得到玻璃酸钠滴眼液供试品溶液;所述流动相优选为氯化钠-叠氮化钠水溶液中氯化钠的浓度优选为11.88g/L,叠氮化钠的浓度优选为0.105g/L;所述配制优选在容量瓶中进行。在本发明中,所述玻璃酸钠供试品溶液的浓度优选为0.10~0.15mg/mL,更优选为0.11~0.14mg/mL,最优选为0.2~0.13mg/mL。在本发明中,所述液相色谱分析的色谱条件优选为:流速为0.5mL/min,柱温为35℃,检测器温度为35℃,色谱柱为Shodex SB-806HQ;流动相为氯化钠-叠氮化钠水溶液;所述氯化钠-叠氮化钠水溶液中氯化钠的浓度为11.88g/L,叠氮化钠的浓度为0.105g/L。在本发明中,所述玻璃酸钠供试品溶液优选包括玻璃酸钠滴眼液供试品溶液、玻璃酸钠注射液供试品溶液或玻璃酸钠原料药供试品溶液。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
称取23.803g氯化钠和0.211g叠氮化钠,加入水使氯化钠和叠氮化钠溶解,稀释至2000mL,使用0.45μm微孔滤膜抽滤后在室温、40KHz、200W、超声波清洗机中超声处理10min,得到氯化钠-叠氮化钠溶液(流动相)。
系列对照品溶液:精密量取重均分子量分别为63900、145000、261000、666000、976000、2070000的聚苯乙烯磺酸钠各9.78mg、10.01mg、9.91mg、10.12mg、10.05mg、10.22mg,分别置100mL容量瓶中,加流动相稀释至刻度,充分摇匀,放置4h,得到系列对照品溶液;对照品来源为北京同创科技。
玻璃酸钠滴眼液供试品溶液:量取2mL玻璃酸钠滴眼液置于20mL容量瓶中,加入流动相稀释至刻度,充分摇匀放置过夜使玻璃酸钠滴眼液溶解,得到玻璃酸钠滴眼液供试品溶液;所述玻璃酸钠滴眼液来源为参天制药有限公司,批号为S1H0020。
空白溶剂:流动相。
液相色谱条件:流速为0.5mL/min,柱温为35℃,检测器温度为35℃,色谱柱为Shodex SB-806HQ,流动相为上述氯化钠-叠氮化钠溶液。
分别精密量取上述空白溶剂、系列对照品溶液、供试品溶液各100μL注入液相色谱仪进行液相色谱检测,记录色谱图,已知系列对照品溶液K值为0.00018,α值为0.65,玻璃酸钠滴眼液供试品溶液K值为0.00057,α值为0.75。由Chromeleon7.2软件依据Mark-Houwink方程([η]=KMα)进行普适校正计算保留时间-重均分子量的三次回归方程,得到一元三次普适校正方程。
然后根据玻璃酸钠滴眼液供试品的色谱图和所述一元三次普适校正方程计算玻璃酸钠滴眼液供试品中玻璃酸钠的分子量与分子量分布。
在本发明中,所述一元三次普适校正方程如图1所示,由图1可知,一元三次普适校正方程为Y=-0.0007X3-0.0071X2+0.3081X+6.7753,相关系数R为0.9998。
玻璃酸钠滴眼液的液相测试结果如图2所示,根据图2和一元三次普适校正方程计算得到玻璃酸钠滴眼液中玻璃酸钠的重均分子量为747459,分子量分布为1.58。
实施例2
按照实施例1的方法测得十批不同的玻璃酸钠滴眼液中玻璃酸钠的分子量与分子量分布数据,如表1所示:
表1十批不同的玻璃酸钠滴眼液中玻璃酸钠的分子量与分子量分布测试数据
实施例3
称取24.112g氯化钠和0.198g叠氮化钠,加入水使氯化钠和叠氮化钠溶解,稀释至2000mL,使用0.45μm微孔滤膜抽滤后在室温、40KHz、200W、超声波清洗机中超声处理10min,得到氯化钠-叠氮化钠溶液(流动相)。
系列对照品溶液:精密量取重均分子量分别为63900、145000、261000、666000、976000、2070000的聚苯乙烯磺酸钠各10.01mg、10.22mg、10.91mg、9.12mg、9.85mg、10.13mg,分别置100mL容量瓶中,加流动相稀释至刻度,充分摇匀,放置4h,得到系列对照品溶液;对照品来源为北京同创科技。
玻璃酸钠注射液供试品溶液:量取2mL玻璃酸钠注射液置于20mL容量瓶中,加入流动相稀释至刻度,充分摇匀放置过夜使玻璃酸钠注射剂溶解,得到玻璃酸钠注射液供试品溶液;所述玻璃酸钠注射液来源为日本千寿制药有限公司,批号为H20200508。
空白溶剂:流动相。
液相色谱条件:流速为0.5mL/min,柱温为35℃,检测器温度为35℃,色谱柱为Shodex SB-806HQ,流动相为上述氯化钠-叠氮化钠溶液。
分别精密量取上述空白溶剂、系列对照品溶液、供试品溶液各100μL注入液相色谱仪进行液相色谱检测,记录色谱图,已知系列对照品溶液K值为0.00018,α值为0.65,玻璃酸钠注射液供试品溶液中玻璃酸钠的K值为0.00057,α值为0.75。由Chromeleon7.2软件依据Mark-Houwink方程([η]=KMα)进行普适校正计算保留时间-重均分子量的三次回归方程,得到一元三次普适校正方程。
然后根据玻璃酸钠注射液供试品溶液的色谱图和所述一元三次普适校正方程计算玻璃酸钠注射液供试品的分子量与分子量分布。
在本发明中,所述一元三次普适校正方程如图1所示,由图1可知,一元三次普适校正方程为:Y=-0.0007X3-0.0071X2+0.3081X+6.7783,相关系数R为0.9998。
玻璃酸钠注射液供试品溶液的液相测试结果如图3所示,根据一元三次普适校正方程计算得到玻璃酸钠注射液供试品溶液中玻璃酸钠的重均分子量为1085223,分子量分布为1.23。
实施例4
称取24.125g氯化钠和0.212g叠氮化钠,加入水使氯化钠和叠氮化钠溶解,稀释至2000mL,使用0.45μm微孔滤膜抽滤后在室温、40KHz、200W、超声波清洗机中超声处理10min,得到氯化钠-叠氮化钠溶液(流动相)。
系列对照品溶液:精密量取重均分子量分别为63900、145000、261000、666000、976000、2070000的聚苯乙烯磺酸钠各10.01mg、10.22mg、10.91mg、9.12mg、9.85mg、10.13mg,分别置100mL容量瓶中,加流动相稀释至刻度,充分摇匀,放置4h,得到系列对照品溶液;对照品来源为北京同创科技。
玻璃酸钠原料药供试品溶液:精密量取玻璃酸钠原料药50mg置烧杯中,加流动相50ml,于4℃低温条件下充分震摇并放置过夜使溶解,得到玻璃酸钠供试品溶液;所述玻璃酸钠来源为华熙生物科技有限公司,批号为19121002。
空白溶剂:流动相。
液相色谱条件:流速为0.5mL/min,柱温为35℃,检测器温度为35℃,色谱柱为Shodex SB-806HQ,流动相为上述氯化钠-叠氮化钠溶液。
分别精密量取上述空白溶剂、系列对照品溶液、供试品溶液各100μL注入液相色谱仪进行液相色谱检测,记录色谱图,已知系列对照品溶液K值为0.00018,α值为0.65,玻璃酸钠原料药供试品溶液中玻璃酸钠的K值为0.00057,α值为0.75。由Chromeleon7.2软件依据Mark-Houwink方程([η]=KMα)进行普适校正计算保留时间-重均分子量的三次回归方程,得到一元三次普适校正方程。
然后根据玻璃酸钠供试品溶液的色谱图和所述一元三次普适校正方程计算玻璃酸钠供试品的分子量与分子量分布。
在本发明中,所述一元三次普适校正方程如图1所示,由图1可知,一元三次普适校正方程为:Y=-0.0007X3-0.0070X2+0.3075X+6.7953,相关系数R为0.9998。
玻璃酸钠原料药供试品溶液的液相测试结果如图4所示,根据一元三次普适校正方程计算得到玻璃酸钠注射液中玻璃酸钠的重均分子量为998525,分子量分布为1.58。
对比例1
按照实施例1的方法测试玻璃酸钠滴眼液分子量与分子量分布数据,与实施例1的不同之处在于:
系列对照品溶液:精密量取重均分子量分别为145000、261000、666000、976000、2070000的聚苯乙烯磺酸钠各10.15mg、10.20mg、9.98mg、10.05mg、10.11mg分别置100mL容量瓶中,加流动相稀释至刻度,充分摇匀,放置4h,得到系列对照品溶液。对照品来源为北京同创科技。
系列对照品溶液的校正方程如图5所示,校正方程为:Y=-0.6704X+17.7331,相关系数R为0.9983。
测试得到的五批玻璃酸钠滴眼液中玻璃酸钠的重均分子量为和分子量分布如表2所示:
表2五批不同的玻璃酸钠滴眼液中玻璃酸钠的分子量与分子量分布测试数据
由表2可知,减少对照品个数会导致测量结果不准确并且精密度也变低。
对比例2
按照实施例1的方法测试玻璃酸钠滴眼液分子量与分子量分布数据,与实施例1的不同之处在于:
系列对照品溶液:精密量取重均分子量分别为88700、252300、892300、2070000、3462000的聚苯乙烯磺酸钠各10.03mg、10.11mg、10.12mg、9.89mg、9.95mg分别置100mL容量瓶中,加流动相稀释至刻度,充分摇匀,放置4h,得到系列对照品溶液。对照品来源为北京同创科技。
系列对照品溶液的校正方程如图6所示,校正方程为:Y=-0.6671X+17.7570,关系数R为0.9543。
测试得到的五批玻璃酸钠滴眼液中玻璃酸钠的重均分子量和分子量分布如表3所示:
表3五批不同的玻璃酸钠滴眼液中玻璃酸钠的分子量与分子量分布测试数据
由表3可知,更换其它对照品时测量结果发生较大变化且测量精密度低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提供系列对照品溶液;所述系列对照品为重均分子量分别为5.4万~6.6万、12.6万~15.4万、23.4万~28.6万、59.4万~72.6万、90万~110万和180万~220万的聚苯乙烯磺酸钠盐;
(2)将所述系列对照品溶液进行液相色谱分析,得到保留时间;根据保留时间依据Mark-Houwink方程进行普适校正计算保留时间-重均分子量,得到一元三次普适校正方程;
(3)提供玻璃酸钠供试品溶液;将所述玻璃酸钠供试品溶液进行液相色谱分析,得到保留时间;根据所述保留时间和一元三次普适校正方程计算所述玻璃酸钠的分子量与分子量分布。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述一元三次普适校正方程为Y=-0.0007X3-0.0071X2+0.3081X+6.7753,所述一元三次普适校正方程的相关系数R为0.9998。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)和步骤(3)中所述液相色谱分析的条件为:流速0.4~0.5mL/min,柱温为35~40℃,检测器温度为35~40℃,色谱柱为ShodexSB-806HQ;流动相为氯化钠-叠氮化钠水溶液;所述氯化钠-叠氮化钠水溶液中氯化钠的浓度为0.15~0.2g/L,叠氮化钠的浓度为0.1~0.2g/L。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述系列对照品溶液的浓度为0.10~0.15mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述玻璃酸钠供试品溶液的浓度为0.10~0.15mg/mL。
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CN113866300A (zh) * | 2021-09-26 | 2021-12-31 | 山东建筑大学 | 一种药物或其中间体中叠氮化钠的检测方法 |
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