CN114137107B - 一种去氧胆酸注射液的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种去氧胆酸注射液的药物含量测定方法，该方法操作简单、便捷、快速、准确，其包括以下步骤：a)将去氧胆酸标准品溶于溶剂中，配制成8µg/ml~12µg/ml梯度浓度分布的去氧胆酸标准品溶液，各标准品溶液浓度分别为Xi；b)在常压下，采用高效液相色谱分析法测定各个标准品溶液的峰面积Yi；c)应用最小二乘法进行线性回归，建立峰面积、标准品溶液浓度两者之间的数学关系，Y＝kX+b；d)在常压下，采用高效液相色谱分析法测定待测去氧胆酸供试品溶液的峰面积A；e)利用步骤c)中的数学关系，按照以下公式、计算待测去氧胆酸注射液的药物浓度和药物含量。
Description
技术领域
本发明涉及有机化学分析领域，具体而言涉及去氧胆酸注射液的含量测定方法。
背景技术
随着我国人均可支配收入和消费水平的提高，人们对医疗美容的需求也日益增多。从美容的角度来看，身体局部脂肪沉积是影响美观的，特别是脸部的脂肪沉积。例如，有双下巴或深颊，会使脸可能看起来更大。为了克服这个问题，以减脂为目的的运动方案和饮食控制方案层出不穷，但效果有限。
目前有效的去除颏下脂肪(双下巴)的主要手段有包括脂肪吸除手术、抽脂手术、脂肪吸除手术切口等在内的外科手术疗法。然而，外科疗法的局限性在于它们需要几个星期才能痊愈，某些患者(例如，糖尿病患者)的治愈期更长，并且存在产生副作用的风险，包括出血过多、内部器官损伤、细菌感染、瘢痕或疼痛等。
Kythera公司开发的去氧胆酸皮下注射制剂在欧洲获批上市，商品名：Belkyra，是含去氧胆酸的透明无色、无菌溶液，去氧胆酸的结构式如下：
去氧胆酸注射液的处方包括：每支(2ml)去氧胆酸注射液中含20mg去氧胆酸、2.84mg无水磷酸氢二钠、14.98mg氯化钠、2.86mg氢氧化钠和注射用水，使用盐酸和氢氧化钠调节pH至8.3。去氧胆酸注射液的上市适应症为改善成人中度至重度颏下脂肪的凸起或丰满(双下巴)。去氧胆酸注射液为颏下脂肪的凸起或丰满(双下巴)患者提供了一种非外科手术治疗的安全途径。
对药物制剂进行质量控制一直是药物研发过程中的重点和难点，目前对去氧胆酸注射液的含量测定方法鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种去氧胆酸注射液的药物含量测定方法，该方法操作简单、便捷、快速、准确。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种去氧胆酸注射液的药物含量测定方法，其包括以下步骤：
a)将去氧胆酸标准品溶于溶剂中，配制成8μg/ml～12μg/ml梯度浓度分布的去氧胆酸标准品溶液，各标准品溶液浓度分别为Xi；
b)在常压下，采用高效液相色谱分析法测定各个标准品溶液的峰面积Yi；
c)应用最小二乘法进行线性回归，建立峰面积、标准品溶液浓度两者之间的数学关系，Y＝kX+b；
d)在常压下，采用高效液相色谱分析法测定待测去氧胆酸供试品溶液的峰面积A；
e)利用步骤c)中的数学关系，按照以下公式①、②计算待测去氧胆酸注射液的药物浓度C药和药物含量。
①去氧胆酸注射液的药物浓度计算公式为：
②去氧胆酸注射液的药物含量计算公式为：
上式中：A为供试品溶液峰面积，k为线性方程斜率，b为线性方程截距，N为供试品溶液的稀释倍数，C为制剂标示量，10mg/ml。
在上述测定方法的一些实施方案中，其中，步骤a)中，所述溶剂为80％的甲醇溶液；所述的8μg/ml～12μg/ml梯度浓度选自8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml梯度浓度或8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml梯度浓度中的一种。
在上述测定方法的一些实施方案中，其中，所述高效液相色谱分析法的条件为：高效液相色谱仪、检测器为电喷雾检测器(CAD)、色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，优选地色谱柱为Agilent Pursuit C18色谱柱，进一步优选地色谱柱为Agilent PursuitC18 3μm 4.6×150mm或与其效能相当色谱柱；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱条件为A相：B相＝35：65等度洗脱；柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量为25μl。
在上述测定方法的具体实施方案中，本发明提供了一种去氧胆酸注射液的药物含量测定方法，其包括以下步骤：
a)将去氧胆酸标准品溶于溶剂中，配制成8μg/ml～12μg/ml梯度浓度分布的去氧胆酸注射液的标准品溶液，各标准品溶液浓度分别为Xi；
b)在常压下，采用高效液相色谱分析法测定各个标准品溶液的峰面积Yi；
c)应用最小二乘法进行线性回归，建立峰面积、标准品溶液浓度两者之间的数学关系，Y＝kX+b；
d)在常压下，配制10μg/ml浓度的去氧胆酸标准品溶液作为质控溶液，采用高效液相色谱分析法测定质控溶液的峰面积，代入公式③计算质控回收率，质控回收率应在97.0％～103.0％范围内；
e)在常压下，采用高效液相色谱分析法测定待测去氧胆酸供试品溶液的峰面积A；
f)利用步骤c)中的数学关系，按照以下公式①、②计算待测去氧胆酸注射液的药物浓度和药物含量。
①去氧胆酸注射液的药物浓度计算公式为：
②去氧胆酸注射液的药物含量计算公式为：
上式①、②中：A为供试品溶液峰面积，k为线性方程斜率，b为线性方程截距，N为供试品溶液的稀释倍数，C为制剂标示量，10mg/ml；
③标准品溶液4质控回收率：
上式③中：AS为标准品溶液4峰面积，CS为标准品溶液4浓度，mg/ml，b为线性方程截距，k为线性方程斜率。
在上述测定方法的一些实施方案中，其中，步骤a)中，所述溶剂为80％的甲醇溶液；所述的8μg/ml～12μg/ml梯度浓度选自8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml梯度浓度或8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml梯度浓度中的一种。
在上述测定方法的一些实施方案中，其中，所述高效液相色谱分析法的条件为：高效液相色谱仪、检测器为电喷雾检测器(CAD)、色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，优选地色谱柱为Agilent Pursuit C18色谱柱，进一步优选地色谱柱为Agilent PursuitC18 3μm 4.6×150mm或与其效能相当色谱柱；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱条件为A相：B相＝35：65等度洗脱；柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量为25μl。
有益效果
本发明提供的去氧胆酸注射液的药物含量测定方法在于，配制一系列梯度浓度的去氧胆酸标准品溶液，用高效液相色谱法测定各标准品溶液中去氧胆酸的峰面积，通过线性回归得到去氧胆酸标准品溶液浓度-峰面积的标准曲线，所得去氧胆酸标准品溶液的标准曲线的线性系数r均大于0.995，线性良好，定量能力好，从而能准确的定量测定去氧胆酸注射液中的浓度。特别地，在极限浓度水平(如80％浓度水平、120浓度水平)时均具备良好的定量能力。
本发明的去氧胆酸注射液的药物含量测定方法准确度高，适应性好，能够快速定量，单次高效液相分析时间仅为9分钟，能快速的完成去氧胆酸注射液中的药物含量测定。
通过具体实验可知，外标一点法的结果在极限浓度水平下所测得的结果不准确，如，在浓度水平为80％时测得结果偏大，在浓度水平为120％时测得结果偏小，相当于放宽了药品含量限度标准。而本发明提供的去氧胆酸注射液的药物含量测定方法在80％～120％的浓度水平测定的药物含量结果基本一致，更能够反映药品真实含量值，药物含量的测定结果更加准确，更有利于对去氧胆酸注射液的药品质量进行控制。
附图说明
图1为对比实施例1所述外标一点法测定去氧胆酸注射液含量的色谱图；
图2为实施例1所述本发明方法测定去氧胆酸注射液含量的色谱图；
图3为实施例8中的线性回归方程(三点法)的线性曲线；
图4为实施例8中的线性回归方程(五点法)的线性曲线。
具体实施方式
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。
本发明中，术语“系统适用性实验”按中国药典规定的含义，色谱系统的适用性实验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。本发明系统适用性评价指标主要包括进样重复性(精密度)和拖尾因子。本发明中系统适用性可接受标准为：6针标准品溶液2的去氧胆酸峰面积的RSD应不得大于3.0％，保留时间的RSD应不得大于1.0％，标准品溶液2第一针的去氧胆酸峰拖尾因子应不得大于1.8。
本发明中，术语“准确度”系指用所建立方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度，一般用回收率(％)表示。
本发明中，术语“质控回收率”是指用回收率对实验过程进行质量控制。质控回收率主要是保证整个实验过程结果可信准确。
本发明中，术语“含量”是指去氧胆酸注射液实测含量与其标示量的比值，单位为％。
本发明中，“本发明含量测定方法”、“本发明分析方法”、“去氧胆酸注射液的药物含量测定方法”可以替换使用，均是指本发明的发明内容中的去氧胆酸注射液的药物含量测定方法。
本发明中的去氧胆酸注射液可以是通过市售或者按照常规方法自行配制得到，该去氧胆酸注射的处方为：去氧胆酸注射液的规格为2ml:20mg，每支去氧胆酸注射液中含20mg去氧胆酸、2.84mg无水磷酸氢二钠、14.98mg氯化钠、2.86mg氢氧化钠和注射用水，使用盐酸和氢氧化钠调节pH至8.3。
本发明中安慰剂是指在去氧胆酸注射液处方的基础上不含有去氧胆酸原料药的产品，其每2ml中含有2.84mg无水磷酸氢二钠、14mg氯化钠、2.86mg氢氧化钠和注射用水，使用盐酸和氢氧化钠调节pH至8.3。
下面会通过实施例具体描述本发明，这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。
本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。
本发明采用下述缩略词：CAD代表电喷雾检测器；μg/ml代表微克/毫升；Xi代表各标准品溶液的浓度；Yi代表各标准品溶液的峰面积；Y＝kX+b代表所得的线性回归方程，其中，k为线性方程斜率，b为线性方程截距；r代表线性相关系数，线性相关系数越大，定量能力越好；RSD代表相对标准偏差；PA代表皮安。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，可按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，本文所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
对比实施例1外标一点法测定去氧胆酸注射液含量的方法
1.仪器与分析条件
高效液相色谱仪(Waters e2695)，电喷雾检测器(型号Corona Veo)，色谱柱为Agilent Pursuit C18，3μm，4.6×150mm，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量为25μl，电喷雾检测器参数：T＝35℃，采集频率10HZ，filter＝5.0s，进样器温度5℃，运行时间45分钟。梯度洗脱条件见下表1：
表1
2.溶剂、标准溶液及供试品溶液的配制
溶剂：80％甲醇溶液，以量筒分别量取800ml甲醇和200ml水，超声混匀，放冷，即得80％的甲醇溶液。
标准品溶液：取去氧胆酸标准品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得标准品溶液。平行配制两份，分别作为标准品溶液1和标准品溶液2。
供试品溶液：取去氧胆酸注射液(规格2ml:20mg)10支，混匀，精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。平行配制2份。
3.实验过程及结果
取溶剂25μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，溶剂应无干扰。
取25μl标准品溶液1连续进样6针考察进样精密度。
进样精密度可接受标准为：6针标准品溶液1的去氧胆酸峰面积的RSD应不得大于3.0％，保留时间的RSD应不得大于1.0％。
标准品溶液1第一针的去氧胆酸峰拖尾因子应不得大于1.8。
取25μl标准品溶液2注入高效液相色谱仪，计算回收率作为质控。回收率应在98.0％～102.0％。
取供试品溶液25μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。每份供试品溶液进样1针，利用以下公式计算供试品溶液中去氧胆酸的含量。
式中，
AT：供试品溶液中去氧胆酸峰面积；
AS：6份标准品溶液1中去氧胆酸平均峰面积；
NT：供试品溶液稀释倍数；
NS：标准品溶液稀释倍数；
WS：标准品称样量，mg；
PS：标准品的纯度；
CT：制剂标示量，10mg/ml。
两份含量结果X1和X2均应在90.0％～110.0％，且相对偏差X不得大于3.0％。
实施例1本发明的去氧胆酸注射液的药物含量测定方法
1.仪器与分析条件
高效液相色谱仪(Waters e2695)，电喷雾检测器(型号Corona Veo)，色谱柱为Agilent Pursuit C18，3μm，4.6×150mm，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱条件为A相：B相＝35：65等度洗脱，柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量为25μl，电喷雾检测器参数：T＝35℃，采集频率10HZ，filter＝5.0s，进样器温度5℃，运行时间9分钟。
2.溶剂、标准品溶液和供试品溶液的配制
溶剂：本发明中所述溶剂均为80％甲醇溶液，以量筒分别量取800ml甲醇和200ml水，超声混匀，放冷，即得80％的甲醇溶液。
标准品储备液：取去氧胆酸标准品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液10.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得标准品储备液。平行配制两份，分别作为标准品储备液1和标准品储备液2。
标准品溶液1：为8μg/ml浓度水平的去氧胆酸标准品溶液。精密量取4.0ml标准品储备液1，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
标准品溶液2：为10μg/ml浓度水平的去氧胆酸标准品溶液。精密量取5.0ml标准品储备液1，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
标准品溶液3：为12μg/ml浓度水平的去氧胆酸标准品溶液。精密量取6.0ml标准品储备液1，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
标准品溶液4(质控溶液)：为10μg/ml浓度水平的去氧胆酸标准品溶液。精密量取5.0ml标准品储备液2，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液配制方法：取去氧胆酸注射液(规格2ml:20mg)10支，混匀，精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。平行配制2份。
3.实验过程
取溶剂25μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，溶剂应无干扰。
取25μl标准品溶液2连续进样6针考察进样精密度。
进样精密度可接受标准为：6针标准品溶液2的去氧胆酸峰面积的RSD应不得大于3.0％，保留时间的RSD应不得大于1.0％。
标准品溶液2第一针的去氧胆酸峰拖尾因子应不得大于1.8。
取标准品溶液1、标准品溶液2和标准品溶液3各25μl分别进样2针，去氧胆酸标准品的保留时间在4.5左右，取峰面积平均值，以峰面积平均值(As)对标准品溶液浓度(Cs,μg/ml)作线性回归方程Y＝kX+b。线性回归方程的线性系数r应不小于0.995。
取25μl标准品溶液4进样2针，取峰面积平均值代入上述回归方程，计算回收率作为质控，该针回收率应为97.0％～103.0％。
取供试品溶液25μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。每份供试品溶液进样2针，利用以下公式计算供试品溶液中去氧胆酸的浓度和含量。两份供试品溶液共4个含量结果取平均值，4个含量结果的RSD应不得大于3.0％。
①去氧胆酸注射液浓度计算公式为：
②供试品含量计算公式为：
上式中：A为供试品溶液峰面积；k为线性方程斜率；b为线性方程截距；N为供试品溶液的稀释倍数；C为制剂标示量，10mg/ml；
③标准品溶液4质控回收率：
上式中：AS为标准品溶液4峰面积；CS为标准品溶液4浓度，mg/ml；b为线性方程截距；k为线性方程斜率。
实施例2本发明含量测定方法的系统适用性考察试验
本实验的目的在于确认实施例1的含量测试方法的是否符合系统适用性的要求，系统适用性考察实验的可接受标准为：6针标准品溶液2的去氧胆酸峰面积的RSD应≤3.0％，保留时间的RSD应≤1.0％，标准品溶液2第一针的去氧胆酸峰拖尾因子应≤1.8。
1.仪器及分析条件：同实施例1.
2.溶液配制：参照实施例1方法配制标准品溶液及供试品溶液。
3.实验过程：
取溶剂25μ1，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，溶剂应无干扰。取25μ1标准品溶液2注入高效液相色谱仪，连续进样6针考察进样精密度及拖尾因子，具体结果见下表2。
表2系统进样精密度结果
经过实验色谱图和表2实验结果可知，溶剂在去氧胆酸峰位置无干扰，6针标准品溶液2的去氧胆酸峰面积的RSD为0.94％，去氧胆酸保留时间的RSD为0.046％，第一针去氧胆酸峰的拖尾因子为1.3，明显优于可接受标准(去氧胆酸峰面积的RSD应≤3.0％，保留时间的RSD应≤1.0％，拖尾因子应≤1.8)。
实施例3本发明含量测定方法的专属性考察
本实验的目的在于：验证本发明含量测定方法可以完全分离去氧胆酸峰与所有的已知杂质与潜在杂质，含量测试不受杂质峰干扰，以证明本发明含量测试方法的专属性良好。
1.仪器及分析条件同实施例1。
2.溶液配制
辅料空白溶液：精密量取安慰剂5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
未破坏样品：精密量取去氧胆酸注射液5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
酸破坏样品：精密量取去氧胆酸注射液5.0ml，置50ml量瓶中，加200μl 1mol/L盐酸溶液(样品析出)，室温放置10天后，加适量1mol/L氢氧化钠溶液，使碱稍过量，摇匀，使析出样品全部溶解，再加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
酸破坏空白溶液：精密量取安慰剂5.0ml，置50ml量瓶中，加200μl 1mol/L盐酸溶液，室温放置10天后，加适量1mol/L氢氧化钠溶液，使碱稍过量，摇匀，再加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
碱破坏样品：精密量取去氧胆酸注射液5.0ml，置50ml量瓶中，加200μl 1mol/L氢氧化钠溶液，室温放置10天后，慢慢滴加适量1mol/L盐酸溶液，使碱稍过量，摇匀，使析出样品全部溶解，再加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
碱破坏空白溶液：精密量取5.0ml安慰剂5.0ml，置50ml量瓶中，加200μl 1mol/L氢氧化钠溶液，室温放置10天后，取出，慢慢滴加适量1mol/L盐酸溶液，使碱稍过量，摇匀，再加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化破坏样品：精密量取去氧胆酸注射液5.0ml，置50ml量瓶中，加200μl 30％过氧化氢溶液，室温放置6天后，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化破坏空白溶液：精密量取安慰剂5.0ml，置50ml量瓶中，加200μl 30％过氧化氢溶液，室温放置6天后，取出，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏样品(1)：取去氧胆酸注射液10支(20mg:2ml)，80℃放置10天后，取出，恢复至室温后，取出内容物混匀，精密量取去氧胆酸注射液5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏空白溶液(1)：取安慰剂10支，80℃放置10天后，取出，精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏样品(2)：取去氧胆酸注射液10支(20mg:2ml)，置121℃灭菌锅中放置30min，取出，恢复至室温后，取出内容物混匀，精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏空白溶液(2)：取安慰剂10支，置121℃灭菌锅中放置30min，取出，恢复至室温后，取出内容物混匀，精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
光照破坏样品：取去氧胆酸注射液10支(20mg:2ml)，在照度仪中放置一段时间后取出，使其总照度达到1.2х106Lux，近紫外能量不低于200W·hr/m2，取出内容物混匀，精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
光照破坏空白溶液：取安慰剂10支，在照度仪中放置一段时间后取出，使其总照度达到1.2х106Lux，近紫外能量不低于200W·hr/m2，取出内容物混匀，精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液配制：参见本发明实施例2方法进行配制。
3.实验过程及结果
系统适用性按实施例2方法验证合格后，取辅料空白溶液和各破坏空白溶液各25μ1进样，取未破坏溶液和各破坏溶液各25μ1各进样2针，辅料空白溶液和各破坏空白溶液在去氧胆酸峰位置应无干扰，各破坏溶液中去氧胆酸峰与相邻峰的分离度应≥1.5，供试品溶液和各破坏溶液中去氧胆酸峰保留时间与标准品溶液2连续进样6针的去氧胆酸峰保留时间的均值的比值应为95.0％～105.0％，报告供试品溶液和各破坏溶液主成分含量。空白干扰试验结果见表3，破坏试验结果见表4、表5。
表3空白干扰试验结果
表4破坏试验结果1
表5破坏试验结果2
通过上述试验和结果可知，辅料空白溶液和各破坏空白溶液在去氧胆酸峰位置均无干扰。供试品溶液和各破坏溶液中，去氧胆酸峰附近均未产生其他杂质峰，供试品溶液和各破坏溶液中去氧胆酸峰保留时间与标准品溶液2连续进样6针的去氧胆酸峰保留时间的均值的比值均为95.0％～105.0％。样品在酸、碱、氧化、高温及光照条件下均稳定，证明该方法的专属性良好。
实施例4本发明含量测定方法的溶液稳定性考察
本实验的目的在于：确定本发明含量测定方法中所使用的供试品溶液在一定条件下、放置一段时间后，测试结果不受影响的程度。
1.仪器及分析条件同实施例1。
2.溶液配制参照实施例1方法配制标准品溶液及供试品溶液。
3.实验过程及结果
系统适用性按实施例2方法验证合格后，取各自于室温以及5℃放置的标准品溶液1、标准品溶液2、标准品溶液3和供试品溶液各25μ1，分别在0h、24h和48h各进样2针，考察各溶液去氧胆酸峰面积的变化，与0h相比，各溶液去氧胆酸峰面积的回收率应为97.0％～103.0％。溶液稳定性结果见表6～表9。
表6标准品溶液1稳定性实验结果
表7标准品溶液2稳定性实验结果
表8标准品溶液3稳定性实验结果
表9供试品溶液稳定性实验结果
通过试验可知，证明标准品溶液1、标准品溶液2、标准品溶液3和供试品溶液在室温以及5℃条件下48小时内稳定。
实施例5本发明含量测定方法的重复性考察实验
确定同一操作者对于同一批样品多次测量结果的重现程度。
1.仪器及分析条件同实施例1。
2.溶液配制参见实施例1方法配制标准品溶液。
供试品溶液配制方法：取去氧胆酸注射液(规格：2ml:20mg)20支，混匀，精密量取去氧胆酸注射液5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制6份。
3.实验过程及结果
系统适用性按实施例2方法验证合格后，取6份供试品溶液各进样25μ1，分别进样2针，计算每份供试品溶液含量平均值，6份供试品溶液含量测定结果的RSD应≤5.0％。重复性结果见下表10。
表10供试品溶液重复性实验结果
通过试验可知，供试品溶液的含量的RSD为0.93％，远小于可接受限度5.0％，该方法的分析重复性符合接受标准，证明本方法重复性良好。
实施例6本发明分析方法中间精密度考察实验
取样品由不同人员、不同日期在不同仪器上，用不同色谱柱进行检测，考察仪器、人员及色谱柱的差异对测试结果重现性的影响。
1.分析条件同实施例1，仪器如表11所示。
2.溶液配制
在不同的日期，由不同的两名分析员按实施例2所述方法配制重复性项下系统适用性溶液及6份供试品溶液，使用不同的色谱柱按重复性项下步骤进样。
3.实验过程及结果
系统适用性按实施例2方法验证合格后，取6份供试品溶液各进样25μ1，分别进样2针，计算每份供试品溶液含量平均值，6份供试品溶液测定结果的RSD应≤5.0％。并计算与重复性项下共12份供试品溶液测定结果的RSD，应≤5.0％。中间精密度结果见表11、表12。
表11供试品溶液中间精密度结果
表12中间精密度结果总结
通过上述试验和结果可知，该方法的供试品含量的RSD为0.83％，不同人员进行的两组样品测定结果的RSD为1.0％，远远小于中间精密度的可接受标准(RSD≤5.0％)，证明本方法中间精密度良好，不会因为实验者和实验日期的改变而对实验结果造成较大的影响。
实施例7本发明含量测定方法准确度考察试验
本实验的目的在于：确定该色谱方法在预期线性范围内的测定结果与真实值的差异，从而确认是否该方法可以获得准确的测试结果。
1.仪器及分析条件同实施例1。
2.溶液配制
辅料空白溶液：精密量取安慰剂2.5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
80％水平加样回收溶液：取去氧胆酸对照品20mg，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入安慰剂2.5ml至上述量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
100％水平加样回收溶液：取去氧胆酸对照品25mg，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入安慰剂2.5ml至上述量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
120％水平加样回收溶液：取去氧胆酸对照品30mg，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入安慰剂2.5ml至上述量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
3.实验过程及结果
系统适用性按实施例2方法验证合格后，取辅料空白溶液25μ1，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，应无干扰。取80％水平加样回收溶液，100％水平加样回收溶液和120％水平加样回收溶液各进样25μ1，计算浓度平均值，各浓度项下回收率的平均值应为97.0％～103.0％，回收率的RSD应≤5.0％。准确度结果见下表13。
表13准确度结果
通过试验可知，去氧胆酸各浓度项下回收率的平均值为101.1％～101.6％，回收率的RSD为0.97％，准确度良好，证明本方法对去氧胆酸的测定准确可行。
实施例8本发明含量测定方法的线性试验
本实验的目的在于：确定在预先设定的范围内，被测溶液的测定结果与浓度之间的线性关系。
1.仪器及分析条件同实施例1。
2.溶液配制
线性储备液：取去氧胆酸对照品25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液10.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
80％线性溶液：精密量取线性储备液4.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
90％线性溶液：精密量取线性储备液4.5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
100％线性溶液：精密量取线性储备液5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
110％线性溶液：精密量取线性储备液5.5ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
120％线性溶液：精密量取线性储备液6.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
3.实验过程及结果
系统适用性按实施例2方法验证合格后，依次取80％、90％、100％、110％、120％各浓度的线性溶液各进样2针，计算峰面积平均值，以峰面积平均值(A均)对浓度(CS，μg/ml)作线性回归方程(五点)，相关系数r应≥0.995。选取浓度水平为80％、100％、120％三个点，以峰面积平均值(A均)对浓度(CS，μg/ml)作线性回归方程(三点)，相关系数r应≥0.995。线性结果见下表14。
表14线性结果
通过上述试验和结果可知，去氧胆酸在8.0942～12.1412μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好线性关系，三点回归曲线的相关系数r为0.9999，五点回归曲线的相关系数r为0.9996。三点回归方程和五点线性回归方程的线性相关系数高，本发明含量测定方法的定量能力高。
实施例9本发明分析方法的耐用性考察试验
确定在测定条件有微小变动时，测定结果不受影响的程度。
1.仪器及分析条件
仪器同实施例1，分析条件具体设置见下表15。通过改变流速(1.0ml/min±10％)、柱温(35℃±5℃)、流动相B比例(65％±2％)、流动相中甲酸浓度(0.1％±0.005％)、色谱柱批次(2批)，测试样品并运行系统适用性。
表15耐用性考察试验结果
2.溶液配制
系统适用性溶液：溶剂、标准品溶液1、标准品溶液2、标准品溶液3、标准品溶液4的配制方法参照系统适用性项下。
供试品溶液：取去氧胆酸注射液10支，混匀，精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得，平行配制2份。
3.实验过程及结果
各耐用性条件系统适用性按实施例2方法验证合格后，取2份供试品溶液各进样25μ1，计算含量平均值，4个含量结果的RSD应不得大于3.0％，含量平均值应为95.0％～105.0％，各条件含量结果与原条件含量结果的差值均应不大于5.0％。耐用性结果见表16、表17。
表16耐用性结果-系统适用性
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表17供试品溶液耐用性结果
通过试验可知，改变柱温、流速、流动相中甲酸比例、流动相B比例和更换色谱柱时，系统适用性均符合要求，各条件下供试品溶液的4个含量结果的RSD均小于3.0％，含量平均值均为95.0％～105.0％，各条件含量结果与原条件含量结果的差值均小于5.0％，证明本方法小的变动能符合系统适用性要求，对实验结果不会造成影响。
实施例10、本发明实施例1含量测定方法、对比实施例1方法的准确度对比
本实验的目的在于：考察本发明实施例1方法和对比实施例1分析方法，在80％，120％浓度水平的准确度。
1.仪器及分析条件参见实施例1。
2.溶液配制
参见实施例1的溶液配制方法制备标准品溶液1、2、3，参见实施例7的溶液配制方法制备80％、120％浓度水平的加样回收溶液。
3.试验过程及结果
按实施例2方法验证系统适应性合格后，取标准品溶液1、标准品溶液2和标准品溶液3各25μl分别进样2针，去氧胆酸标准品的保留时间在4.5左右，取峰面积平均值，以峰面积平均值(As)对标准品溶液浓度(Cs,μg/ml)作三点线性回归方程Y＝kX+b，线性回归方程的线性系数r应不小于0.995。以标准品溶液2的峰面积平均值(As)对标准品溶液浓度(Cs,μg/ml)作外标一点法方程Y＝aX。相关实验结果及方程见表18。
表18标准品溶液及线性方程
取25μl的80％、120％浓度水平的加样回收溶液注入高效液相色谱仪，每份供试品溶液进样2针，取峰面积平均值代入线性回归方程(三点)和外标一点法方程，计算对应的实测浓度，每个浓度水平进行3次平行实验。具体结果见下表18。
表18不同浓度条件下的准确度对比实验结果
通过上述试验及结果可知：外标一点法的结果在浓度水平为80％时测得结果偏大，在浓度水平为120％时测得结果偏小，这样相当于放宽了药品限度；线性回归方程法在80％～120％的浓度水平测得的结果基本一致，更能够反映药品真实含量值，对于药品质量控制更加严格，药物含量的测定结果更加准确，更有利于对去氧胆酸注射液的药品质量进行控制。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种去氧胆酸注射液的药物含量测定方法，其包括以下步骤：
a)将去氧胆酸标准品溶于溶剂中，配制成8μg/ml～12μg/ml梯度浓度分布的去氧胆酸标准品溶液，各标准品溶液浓度分别为Xi；
b)在常压下，采用高效液相色谱分析法测定各个标准品溶液的峰面积Yi；
c)应用最小二乘法进行线性回归，建立峰面积、标准品溶液浓度两者之间的数学关系，Y＝kX+b；
d)在常压下，采用高效液相色谱分析法测定待测去氧胆酸供试品溶液的峰面积A；
e)利用步骤c)中的数学关系，按照以下公式①、②计算待测去氧胆酸注射液的药物浓度C药和药物含量；
①去氧胆酸注射液的药物浓度计算公式为：
②去氧胆酸注射液的药物含量计算公式为：
上式中：A为供试品溶液峰面积，k为线性方程斜率，
b为线性方程截距，N为供试品溶液的稀释倍数，
C为制剂标示量，10mg/ml。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其中，步骤a)中，所述溶剂为80％的甲醇溶液；所述的8μg/ml～12μg/ml梯度浓度选自8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml梯度浓度或8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml梯度浓度中的一种。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其中，所述高效液相色谱分析法的条件为：高效液相色谱仪、检测器为电喷雾检测器；色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱条件为A相：B相＝35：65等度洗脱；柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量为25μl。
4.根据权利要求3所述的含量测定方法，其中，所述色谱柱为Agilent Pursuit C18色谱柱。
5.根据权利要求3所述的含量测定方法，其中，所述色谱柱为Agilent Pursuit C18 3μm 4.6×150mm色谱柱。
6.一种去氧胆酸注射液的药物含量测定方法，其包括以下步骤：
a)将去氧胆酸标准品溶于溶剂中，配制成8μg/ml～12μg/ml梯度浓度分布的去氧胆酸注射液的标准品溶液，各标准品溶液浓度分别为Xi；
b)在常压下，采用高效液相色谱分析法测定各个标准品溶液的峰面积Yi；
c)应用最小二乘法进行线性回归，建立峰面积、标准品溶液浓度两者之间的数学关系，Y＝kX+b；
d)在常压下，配制10μg/ml浓度的去氧胆酸标准品溶液作为质控溶液，采用高效液相色谱分析法测定质控溶液的峰面积，代入公式③计算质控回收率，质控回收率应在97.0％～103.0％范围内；
e)在常压下，采用高效液相色谱分析法测定待测去氧胆酸供试品溶液的峰面积A；
f)利用步骤c)中的数学关系，按照以下公式①、②计算待测去氧胆酸注射液的药物浓度和药物含量；
①去氧胆酸注射液的药物浓度计算公式为：
②去氧胆酸注射液的药物含量计算公式为：
上式①、②中：A为供试品溶液峰面积，k为线性方程斜率，
b为线性方程截距，N为供试品溶液的稀释倍数，
C为制剂标示量，10mg/ml；
③标准品溶液4质控回收率：
上式③中：AS为标准品溶液4峰面积，CS为标准品溶液4浓度，mg/ml，
b为线性方程截距，k为线性方程斜率。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其中，所述溶剂为80％的甲醇溶液；所述的8μg/ml～12μg/ml梯度浓度选自8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml梯度浓度或8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml梯度浓度中的一种。
8.根据权利要求6所述的含量测定方法，其中，所述高效液相色谱分析法的条件为：高效液相色谱仪、检测器为电喷雾检测器；色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱条件为A相：B相＝35：65等度洗脱；柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量为25μl。
9.根据权利要求8所述的含量测定方法，其中，所述色谱柱为Agilent Pursuit C18色谱柱。
10.根据权利要求8所述的含量测定方法，其中，所述色谱柱为Agilent Pursuit C18 3μm 4.6×150mm色谱柱。
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