CN116500159A - 一种洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法 - Google Patents

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CN116500159A CN202310448448.9A CN202310448448A CN116500159A CN 116500159 A CN116500159 A CN 116500159A CN 202310448448 A CN202310448448 A CN 202310448448A CN 116500159 A CN116500159 A CN 116500159A
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Abstract

本发明提供一种洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，采用的三元流动相体系解决了辅料在低吸收波段，对已知杂质检测的干扰，从而避免了杂质的漏检及少检的问题，有效解决有关物质测定时，辅料羟苯甲酯对杂质检测的干扰，监测的杂质种类及个数多，各杂质间及杂质与主成分间、杂质与辅料间分离度良好，可以快速准确的监控洛索洛芬钠口服溶液中的有关物质，对洛索洛芬钠口服溶液的质量评估具有重要意义。

Description

一种洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于化学药物分析技术领域，具体涉及一种洛索洛芬钠口服溶液中有关物质检测的检测方法。
背景技术
洛索洛芬钠口服溶液是日医工株式会社开发的非甾体抗炎药镇痛药，于2012年12月在日本上市，每包含68.1mg洛索洛芬钠水合物(60mg无水物)，生产商是日医工株式会社。
洛索洛芬钠，化学名为2-[4-(2-氧代环戊基甲基)苯基]丙酸钠二水合物，结构式如下：
目前，关于洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法鲜有文献报道，且对辅料和关键的及重要的降解产物未进行分析和检测，部分杂质易受辅料峰干扰，对药品质量的评估存在一定的风险。或虽有报道，例如，专利CN 115236255 A公开一种洛索洛芬钠有关物质检测方法，其检测的对象为洛索洛芬钠原料药，但由于洛索洛芬钠口服溶液中含有多种辅料，采用该专利的检测方法，以磷酸水溶液(用磷酸调节pH至2.3～2.7)-乙腈为混合流动相，无论如何调整梯度洗脱程序，均不能解决在检测的过程中特定辅料与某些杂质之间分离度偏低的问题，无法排除辅料对某些杂质的干扰，故不适用于洛索洛芬钠口服溶液中有关物质检测。
为了保证洛索洛芬钠口服溶液制剂的安全有效，需要对原料药的工艺副产物、降解产物、制剂中的工艺产物和所用的辅料进行梳理，对于洛索洛芬钠口服溶液制剂的质量对比研究至关重要。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，检测出的杂质多、灵敏度高、专属性好，各杂质峰之间、主峰及其相邻杂质峰之间的分离度好，有效解决有关物质测定时，辅料羟苯甲酯对杂质检测的干扰，可以快速、有效、准确的监控洛索洛芬钠口服溶液中的有关物质。
本发明的技术方案如下：
一种洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱对洛索洛芬钠口服溶液中有关物质进行定量检测，其高效液相色谱条件包括：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，以流动相A、流动相B和流动相C为混合流动相进行梯度洗脱，其中，流动相A为0.05～0.15％磷酸水溶液，以三乙胺调pH值至2.0-4.0；流动相B为乙腈，流动相C为甲醇，在梯度洗脱过程中流动相A、流动相B和流动相C的初始比例为78～82:7～3:15，具体梯度洗脱过程如下：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由78～82:7～3:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至78～82:7～3:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持78～82:7～3:15不变。
目前针对洛索洛芬钠原料药中有关物质的检测时，一般选择无甲醇的二元流动相体系，可以实现原料药中大多数有关物质的测定，但是针对含其他辅料的洛索洛芬钠口服溶液，例如，抑菌剂羟苯甲酯干扰本申请中杂质1和杂质6的检测，导致出现杂质漏检的问题，而本申请中采用以流动相A、流动相B和流动相C为混合流动相三元流动相体系，优化梯度洗脱过程中时间和流动相的比例，使得检出的杂质多，主成分及各杂质在该检测方法中保留能力较强，响应较高，各成分间分离良好，有效解决有关物质测定时，辅料对杂质检测的干扰，可以快速准确的监控洛索洛芬钠口服溶液中的有关物质，对洛索洛芬钠口服溶液的质量评估具有重要意义。
本发明提供的检测方法，以流动相A、流动相B和流动相C为混合流动相进行梯度洗脱。在色谱分析时，选择色谱柱和流动相后，需要确定洗脱过程是等度洗脱或是梯度洗脱，并在洗脱过程中，流动相A、流动相B和流动相C的比例，都会影响分析物在色谱柱上的响应，以及主峰后杂质峰会不会干扰主峰的分析。对于本发明而言，洛索洛芬钠口服溶液，辅料包括羟苯甲酯(抑菌剂)、无水乙醇(抑菌增效剂)、丙二醇(抑菌增效剂)、糖精钠(甜味剂)、枸橼酸钠(pH调节剂)、无水枸橼酸(pH调节剂)和香精(矫味剂)，辅料量大且种类较多，需要检测的杂质种类多，干扰的因素特别多，梯度洗脱过程的时间和流动相的比例并不是可以随机选择的，是需要进行大量的实验和分析确定的，否则，主峰附近会出现较大辅料峰，各杂质出峰受辅料峰干扰，在实际样品检测过程中，某些杂质可能会被当成辅料峰扣除，从而产生误判本品质量的严重后果。
在一种优选方案中，梯度洗脱过程中流动相A、流动相B和流动相C的初始比例为80:5:15，具体梯度洗脱过程如下：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由80:5:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至80:5:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持80:5:15不变。
在本发明中，流动相A为0.05～0.15％磷酸水溶液，以三乙胺调pH值至2.0-4.0；优选地，流动相A为0.1％磷酸水溶液，以三乙胺调pH值至2.3-2.7；更优选地，流动相A为0.1％磷酸水溶液，以三乙胺调pH值至2.5。
对于本发明而言，溶解样品的溶剂是由流动相A和流动相B组成的混合溶液；优选地，在混合溶液中，流动相A和流动相B的体积比为75～85:25～15，可以但不局限于75:25、78:22、80:20、82:18或85:15；为了获得更好的效果，在混合溶液中，流动相A和流动相B的体积比为80:20。
在一种优选方案中，色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶；色谱柱型号为Inertsil ODS-3C18、InertSustain C18和Wondasil C18；优选为InertSustain C18，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm。
进一步的，检测器的检测波长为220～224nm；优选为222nm。
进一步的，柱温为20～30℃；优选为25℃。
进一步的，流速为0.5～1.5ml/min，优选为1.0ml/min。
更进一步的，进样量为10～50μl；优选为20μl。例如，进样量可以为10μl、15μl、20μl或50μl。
本发明提供的一种洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其中有关物质包括以下物质：
本发明提供的检测方法，可以配制如下溶液，在配制如下溶液时，所选择的溶剂为：流动相A和流动相B的体积比80:20的混合溶液。
混合杂质溶液：精密称取各杂质对照品，先加乙腈溶解，再加乙腈定容并稀释制成每1ml约含各杂质12μg的杂质对照品混合溶液。
样品加混合杂质溶液：精密量取混合杂质溶液2ml及洛索洛芬钠口服溶液2ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：精密量取洛索洛芬钠口服溶液2ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；。
精密量取供试品溶液适量，加溶剂稀释制成每1ml中含12μg的溶液，作为对照溶液。
空白辅料溶液：称取相当于配制2ml洛索洛芬钠口服溶液所需的辅料(含羟苯甲酯、无水乙醇、丙二醇抑菌增效剂、糖精钠、枸橼酸钠、无水枸橼酸和香精)，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
本发明通过筛选合适的色谱条件，对洛索洛芬钠口服溶液以及上述的各杂质进行色谱检测，确定了本发明检测方法，通过对各杂质和洛索洛芬钠峰定位试验，干扰性试验和洛索洛芬钠的降解试验对本发明进行专属性验证。
采用本发明的技术方案，优势如下:
(1)本发明提供的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，监测的杂质种类及个数多，各杂质间及杂质与主成分间、杂质与辅料间分离度良好，能快速准确的监控洛索洛芬钠口服溶液中的有关物质。
(2)本发明提供的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，采用的三元流动相体系解决了辅料在低吸收波段，对已知杂质检测的干扰，从而避免了杂质的漏检及少检的问题，有效解决有关物质测定时，辅料羟苯甲酯对杂质检测的干扰，可以快速准确的监控洛索洛芬钠口服溶液中的有关物质，对洛索洛芬钠口服溶液的质量评估具有重要意义。
附图说明
图1是实施例1中空白辅料溶液的高效液相色谱图；
图2是实施例1中混合杂质溶液的高效液相色谱图；
图3是实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图；
图4是实施例1中样品加混合杂质溶液的高效液相色谱图；
图5是对比例1中样品加混合杂质溶液的高效液相色谱图；
图6是对比例2中样品加混合杂质溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明涉及的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质检测方法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：
高效液相色谱条件：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为InertSustain C18(250×4.6mm，5μm)，以0.1％磷酸水溶液(以三乙胺调pH值至2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，甲醇为流动相C，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为222nm，柱温25℃，进样量20μl。
梯度洗脱程序为：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由80:5:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至80:5:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持80:5:15不变。
溶剂为流动相A和流动相B体积比80:20的混合溶液，样品溶液的配制如下：
混合杂质溶液：精密称取各杂质对照品，先加乙腈溶解，再加乙腈定容并稀释制成每1ml约含各杂质12μg的杂质对照品混合溶液。
样品加混合杂质溶液：精密量取混合杂质溶液2ml及洛索洛芬钠口服溶液2ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：精密量取洛索洛芬钠口服溶液2ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；。
精密量取供试品溶液适量，加溶剂稀释制成每1ml中含12μg的溶液，作为对照溶液。
空白辅料溶液：称取相当于配制2ml洛索洛芬钠口服溶液所需的辅料(含羟苯甲酯、无水乙醇、丙二醇抑菌增效剂、糖精钠、枸橼酸钠、无水枸橼酸和香精)，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
取上述溶液各20μl，进样分析，记录色谱图，具体谱图见图1、图2、图3和图4。
由图1～图4可知，基线平稳，空白辅料不干扰各成分的测定；供试品溶液、混合杂质溶液和样品加混合杂质溶液中，主成分与杂质间、杂质与杂质间分离度良好。
在供试品溶液的色谱图中，仅杂质1和杂质10检出，检测结果如表1所示：
表1供试品检测结果
杂质编号 含量/％ RSD/％
1 0.036 0.87
10 0.019 2.39
对有关物质检测方法进行验证，如下：
1、专属性
取空白辅料、各单个杂质对照品溶液、供试品溶液、混合杂质溶液和样品加混合杂质溶液各20μl，进样分析，记录色谱图，考察各成分的保留时间、分离度及理论板数。结果见表2。
表2专属性试验结果
保留时间(min) 分离度 理论板数 拖尾因子 归属
16.348 / 43752 1.16 未知
17.713 4.2 45586 1.10 杂质13
20.888 8.4 34746 1.04 杂质8
28.300 13.1 27629 1.18 杂质6
29.618 2.2 54876 1.10 杂质1
34.917 10.2 68826 1.13 杂质9
35.941 1.8 58305 1.08 杂质12
39.979 6.8 72157 1.11 未知
46.508 12.4 166363 1.37 杂质4
47.884 3.4 280647 1.24 主成分
50.355 7.9 575925 1.12 杂质11
53.132 7.7 604163 0.79 未知
57.034 15.6 1002293 1.11 杂质10
58.339 5.6 967120 0.69 未知
结果表明，在该色谱条件下，基线平稳，空白辅料均不干扰各成分的测定；混合杂质溶液中各成分间分离度良好，理论板数较高，纯度因子较高；供试品溶液中各杂质间分离度良好。
2、破坏试验
取本品适量，分别于各严苛条件下进行破坏试验，考察降解产物的来源、降解产物与主成分的分离情况及物料平衡。用实施例1中高效液相色谱条件进行有关物质测定。具体方法如下：
溶剂：流动相A和流动相B中体积比80:20的混合溶液。
未破坏：精密量取本品溶液2ml，至10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
光破坏：精密量取本品溶液2ml，至10ml透明量瓶中，用适量溶剂稀释，于5000Lx下，放置8h，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
空白辅料光破坏：称取相当于配制2ml洛索洛芬钠口服溶液所需的辅料(含羟苯甲酯、无水乙醇、丙二醇抑菌增效剂、糖精钠、枸橼酸钠、无水枸橼酸和香精)，至10ml透明量瓶中，用适量溶剂溶解并稀释，于5000Lx下，放置8h，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
酸破坏：精密量取本品溶液2ml，至10ml量瓶中，加入2M盐酸溶液1ml，室温下放置4h后，加入2M氢氧化钠溶液1ml，中和后先加入乙腈2ml，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
空白辅料酸破坏：称取相当于配制2ml洛索洛芬钠口服溶液所需的辅料(含羟苯甲酯、无水乙醇、丙二醇抑菌增效剂、糖精钠、枸橼酸钠、无水枸橼酸和香精)，至10ml量瓶中，加入2M盐酸溶液1ml，室温下放置4h后，加入2M氢氧化钠溶液1ml，中和后先加入乙腈2ml，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
碱破坏：精密量取本品溶液2ml，至10ml量瓶中，加入2M氢氧化钠溶液1ml，室温下放置4h后，加入2M盐酸溶液1ml，中和后先加入乙腈2ml，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
空白辅料碱破坏：称取相当于配制2ml洛索洛芬钠口服溶液所需的辅料(含羟苯甲酯、无水乙醇、丙二醇抑菌增效剂、糖精钠、枸橼酸钠、无水枸橼酸和香精)，至10ml量瓶中，加入2M氢氧化钠溶液1ml，室温下放置4h后，加入2M盐酸溶液1ml，中和后先加入乙腈2ml，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
氧化破坏：精密量取本品2ml，至10ml量瓶中，加入30％过氧化氢1ml，混匀，室温下放置4h，先加入乙腈2ml，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
空白辅料氧化破坏：称取相当于配制2ml洛索洛芬钠口服溶液所需的辅料(含、无水乙醇、丙二醇抑菌增效剂、糖精钠、枸橼酸钠、无水枸橼酸和香精)，至10ml量瓶中，加入30％过氧化氢1ml，混匀，室温下放置4h，先加入乙腈2ml，再用溶剂稀释至刻度，摇匀。
高温破坏：精密量取本品2ml，至10ml量瓶中，用适量溶剂稀释，100℃水浴破坏1h，用溶剂稀释至刻度，即得。
空白辅料高温破坏：称取相当于配制2ml洛索洛芬钠口服溶液所需的辅料(含羟苯甲酯、无水乙醇、丙二醇抑菌增效剂、糖精钠、枸橼酸钠、无水枸橼酸和香精)，至10ml量瓶中，用适量溶剂溶解并稀释，100℃水浴破坏1h，用溶剂稀释至刻度，即得。
取各破坏条件下的样品各20μl，进样分析，记录色谱图。
结果显示，本品较稳定，各降解条件产生的主要杂质是杂质1，且各降解产物与主峰的分离度良好，主峰的峰纯度较高(峰纯度值均大于阈值990)，说明主峰中不包含未能分离的杂质或降解产物，即拟定有关物质色谱条件适用于本品的有关物质检测。
物料平衡考察结果见表3。
表3物料平衡考察
样品 f/f未破坏 杂质总量(％)
未破坏 / 0.243
酸破坏 100.6 0.206
碱破坏 100.3 1.443
高温破坏 100.6 0.223
氧化破坏 100.7 0.583
光照破坏 100.4 0.238
物料平衡考察数据表明，各破坏条件下样品物料基本守恒，各破坏溶液的总峰面积与未破坏溶液总峰面积之比均在90～110％之间；各破坏条件主峰峰纯度良好(峰纯度值大于设定的阈值990)，物料平衡。
3、定量限检测限
取洛索洛芬钠口服溶液混合杂质溶液50μl，进样分析，记录色谱图，以信噪比S/N≈3、S/N≈10分别测定检测限及定量限。结果见表4。
表4检测限定量限结果
由表4可以看出，洛索洛芬钠口服溶液及各杂质检测限定量限均较小，充分验证了本发明的检测方法检测灵敏度高。
4、溶液稳定性
室温条件下50h内，对照品混合溶液中各成分峰面积RSD均小于2.0％，对照品溶液50h内稳定性良好；供试品溶液杂质个数未有变化，各杂质的峰面积RSD均小于5.0％，主成分峰面积RSD小于2.0％，样品溶液稳定性良好。
5、线性
取洛索洛芬钠对照品约13.6mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并定量稀释制成每lml中约含洛索洛芬钠1.2mg(以无水物计)的溶液，作为洛索洛芬钠对照品母液。
取杂质1、杂质4、杂质6、杂质8～13对照品各适量，精密称定，分别加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含杂质0.24mg的杂质对照品母液。
精密量取洛索洛芬钠对照品母液及各杂质对照品母液1ml，置同一20ml量瓶中，用溶剂定量稀释制成每1ml中约含洛索洛芬钠60μg(以无水物计)及各杂质均约为12μg的对照品混合母液。
取各成分定量限浓度的混合溶液作为线性最低浓度点；同时精密量取对照品混合母液0.5ml、1ml、1.6ml、2ml、2.4ml及3ml，分别至10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，得到一系列浓度的溶液，。精密吸取上述系列梯度浓度溶液及定量限浓度溶液各20μl，从低浓度到高浓度依次进样分析，记录色谱图。以对照品溶液浓度C(μg/ml)为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，进行线性回归并求出回归方程，结果见表5。
表5线性关系考察结果
由表5可以看出，洛索洛芬钠口服溶液及各杂质在线性范围内线性关系良好。
6、校正因子测定
在2台液相色谱仪上，使用3根色谱柱，共计4次，以各杂质及主成分的定量限浓度、杂质规定限度(0.2％)浓度的50％、80％、100％(限度浓度)、120％和150％分别配制杂质及主成分的对照品溶液，以质量浓度对峰面积进行回归，并计算杂质相对洛索洛芬钠的校正因子，测定结果见表6。
表6校正因子测定结果
/>
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由表6可以看出，杂质1、杂质6、杂质8，杂质10及杂质11的校正因子均在0.9～1.1之间；杂质4、杂质9、杂质12及杂质13需峰面积校正后计算。
7、准确度
精密称取洛索洛芬钠口服溶液样品9份，分别加入杂质限量的80％、100％、120％的杂质对照品溶液，加溶剂溶解并稀释至刻度，分别精密量取50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以各杂质的[(测得量-本底量)/加入量]计算回收率，结果见表7。
表7杂质回收率测定结果
杂质编号 回收率结果(％) 平均回收率(％) RSD(％)
1 100.6～102.9 101.5 0.76
4 100.7～102.6 101.5 0.67
6 96.8～100.7 98.5 1.60
8 99.9～103.6 101.3 1.59
9 101.5～105.3 102.6 1.28
10 98.4～99.8 99.2 0.53
11 102.2～104.7 103.1 0.91
12 99.5～100.9 100.2 0.53
13 98.4～99.5 99.0 0.40
由表7可以看出，各个杂质回收率均在92％～105％之间，RSD均小于5.0％，回收率良好；表明本发明的方法适用于本品有关物质的测定。
8、重复性
在本测试条件下，用同一均质供试品，由同一分析人员经多次取样进行一系列检测，分别采用已知杂质外标法以及加校正因子的自身对照法对已知杂质1及10的检测结果进行对比，结果见表8。
表8杂质1及杂质10重复性试验结果(外标法和加校正因子的自身对照法)
由表8可以看出，已知杂质采用外标法与加校正因子的自身对照法计算，结果无差异，RSD均在10.0％以内，表明本发明测定方法的中间精密度良好。
9、中间精密度
在本测试条件下，用同一均质供试品，在不同时间，不同仪器，由不同分析人员经多次取样进行一系列检测，以加校正因子的自身对照法计算已知杂质1及10的检测结果，考察中间精密度，结果见表9。
表9杂质1及杂质10中间精密度试验结果
由表9可以看出，已知杂质采用加校正因子的自身对照法计算，结果无差异，RSD均在10.0％以内，表明本发明测定方法的中间精密度良好。
实施例2：
高效液相色谱条件：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为InertSustain C18(250×4.6mm，5μm)，以0.1％磷酸水溶液(以三乙胺调pH值至2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，甲醇为流动相C，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长分别为220nm和224nm，柱温25℃，进样量20μl。
梯度洗脱程序为：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由80:5:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至80:5:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持80:5:15不变。
样品加混合杂质溶液和供试品溶液的配制：同实施例1。
取样品加混合杂质溶液和供试品溶液各20μl，进样分析，记录色谱图。
本例将波长调整为220nm和224nm，考察洛索洛芬钠口服溶液峰与杂质峰及杂质与杂质之间分离度，以及样品中杂质检测情况。结果显示，各成分间分离度良好，检测效果同实施例1。
综上所述，波长在220nm～224nm范围内，检测效果良好。
实施例3：
高效液相色谱条件：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为InertSustain C18(250×4.6mm，5μm)，以0.1％磷酸水溶液(以三乙胺调pH值至2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，甲醇为流动相C，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为222nm，柱温分别为20℃和30℃，进样量20μl。
梯度洗脱程序为：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由80:5:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至80:5:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持80:5:15不变。
样品加混合杂质溶液和供试品溶液的配制：同实施例1。
取样品加混合杂质溶液和供试品溶液各20μl，进样分析，记录色谱图。
本例将柱温调整为20℃和30℃，考察洛索洛芬钠口服溶液峰与杂质峰及杂质与杂质之间分离度，以及样品中杂质检测情况。结果显示，各成分间分离度良好，检测效果同实施例1。
综上所述，柱温在20℃～30℃范围内，检测效果良好。
实施例4：
高效液相色谱条件：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为InertSustain C18(250×4.6mm，5μm)，以0.1％磷酸水溶液(以三乙胺调pH值分别为2.3和2.7)为流动相A，以乙腈为流动相B，甲醇为流动相C，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为222nm，柱温为25℃，进样量20μl。
梯度洗脱程序为：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由80:5:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至80:5:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持80:5:15不变。
样品加混合杂质溶液和供试品溶液的配制：同实施例1。
取样品加混合杂质溶液和供试品溶液各20μl，进样分析，记录色谱图。
本例流动相A的pH值调整为2.3和2.7，考察洛索洛芬钠口服溶液峰与杂质峰及杂质与杂质之间分离度，以及样品中杂质检测情况。结果显示，各成分间分离度良好，检测效果同实施例1。
综上所述，流动相A的pH值在2.2～2.7范围内，检测效果良好。
实施例5：
高效液相色谱条件：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为InertSustain C18(250×4.6mm，5μm)，以0.1％磷酸水溶液(以三乙胺调pH值至2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，甲醇为流动相C，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为222nm，柱温为25℃，进样量20μl。
梯度洗脱程序为：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由82:3:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至82:3:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持82:3:15不变。
样品加混合杂质溶液和供试品溶液的配制：同实施例1。
取样品加混合杂质溶液和供试品溶液各20μl，进样分析，记录色谱图。
本例将梯度洗脱程序初始比例流动相A、流动相B和流动相C的体积比由80:5:15调整为82:3:15，相应的调整了洗脱程序的终止比例，考察洛索洛芬钠口服溶液峰与杂质峰及杂质与杂质之间分离度，以及样品中杂质检测情况。结果显示，各成分间分离度良好，检测效果同实施例1。
实施例6：
高效液相色谱条件：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为InertSustain C18(250×4.6mm，5μm)，以0.1％磷酸水溶液(以三乙胺调pH值至2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，甲醇为流动相C，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为222nm，柱温为25℃，进样量20μl。
梯度洗脱程序为：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由78:7:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至78:7:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持78:7:15不变。
样品加混合杂质溶液和供试品溶液的配制：同实施例1。
取样品加混合杂质溶液和供试品溶液各20μl，进样分析，记录色谱图。
本例将梯度洗脱程序初始比例流动相A、流动相B和流动相C的体积比由80:5:15调整为82:3:15，相应的调整了洗脱程序的终止比例，考察洛索洛芬钠口服溶液峰与杂质峰及杂质与杂质之间分离度，以及样品中杂质检测情况。结果显示，各成分间分离度良好，检测效果同实施例1。
综上所述，梯度洗脱步骤：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由78～82:7～3:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至78～82:7～3:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持78～82:7～3:15不变。当初始洗脱比例及终止洗脱比例发生变化时，检测效果良好。
对比例1：
高效液相色谱条件：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为InertSustain C18(250×4.6mm，5μm)，以0.1％磷酸水溶液(以三乙胺调pH值至2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，甲醇为流动相C，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长222nm，柱温25℃，进样量20μl。
梯度洗脱程序为：(1)在0-5分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持75:20:5不变；(2)在5-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由75:20:5匀速渐变至30:65:5；(3)在40-41分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由30:65:5匀速渐变至75:20:5；(4)在41-48分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持75:20:5不变。
样品加混合杂质溶液的配制：同实施例1。
取样品加混合杂质溶液20μl，进样分析，记录色谱图，如图5所示。
如图5所示，杂质6的出峰时间为21.052min，羟苯甲酯出峰时间为21.494min，杂质1出峰时间为22.335min，杂质6和羟苯甲酯呈现部分重叠，羟苯甲酯对杂质6存在干扰，影响杂质6的准确定量。杂质10出峰为46.097min与未知杂质45.769min部分重叠，影响杂质10的准确定量。辅料糖精钠与枸橼酸钠的出峰完全重叠。
对比例2：
高效液相色谱条件：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为InertSustain C18(250×4.6mm，5μm)，以0.1％磷酸水溶液(以三乙胺调pH值至2.5)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长222nm，柱温25℃，进样量20μl。
梯度洗脱程序为：(1)在0-15分钟，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至72:28；(2)在15-24分钟内，流动相A和流动相B的体积比由72:28匀速渐变至35:65；(3)在24-30分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持35:65不变；(4)在30-34分钟内，流动相A和流动相B的体积比由35:65匀速渐变至80:20；(5)在34-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持80:20不变。
样品加混合杂质溶液的配制：同实施例1。
取样品加混合杂质溶液20μl，进样分析，记录色谱图，如图6所示。
如图6所示，杂质6出峰时间为13.326min；杂质1出峰时间为13.778min，羟苯甲酯出峰时间为14.140min，杂质1、杂质6和羟苯甲酯呈现部分重叠，出现相互干扰的情况，影响杂质1和杂质6的准确定量。杂质4出峰为24.857min与未知杂质24.432min部分重叠，影响杂质4精准定量。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其特征在于，该检测方法采用高效液相色谱对洛索洛芬钠口服溶液中有关物质进行定量检测，其高效液相色谱条件包括：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，以流动相A、流动相B和流动相C为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为0.05～0.15％磷酸水溶液，以三乙胺调pH值至2.0-4.0；所述流动相B为乙腈，所述流动相C为甲醇，所述梯度洗脱过程中流动相A、流动相B和流动相C的初始比例为78～82:7～3:15，具体梯度洗脱过程如下：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由78～82:7～3:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至78～82:7～3:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持78～82:7～3:15不变。
2.根据权利要求1所述的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程中流动相A、流动相B和流动相C的初始比例为80:5:15，具体梯度洗脱过程如下：(1)在0-10分钟，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由80:5:15匀速渐变至70:15:15；(2)在10-40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由70:15:15匀速渐变至60:25:15；(3)在40-60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由60:25:15匀速渐变至10:75:15；(4)在60-70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由10:75:15匀速渐变至80:5:15；(5)在70-80分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持80:5:15不变。
3.根据权利要求1所述的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其特征在于，所述溶解样品的溶剂是由流动相A和流动相B组成的混合溶液；优选地，在混合溶液中，流动相A和流动相B的体积比为75～85:25～15；更优选地，在混合溶液中，流动相A和流动相B的体积比为80:20。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A为0.05～0.15％磷酸水溶液，以三乙胺调pH值至2.3-2.7；优选地，所述流动相A为0.1％磷酸水溶液，以三乙胺调pH值至2.3-2.7；更优选地，以三乙胺调pH值至2.5。
5.根据权利要求4所述的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其特征在于，所述有关物质如下：
6.根据权利要求5所述的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的型号为Inertsil ODS-3C18、InertSustain C18和Wondasil C18，优选地，所述色谱柱的型号为InertSustain C18；更优选地，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm。
7.根据权利要求6所述的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：检测波长为220～224nm，优选为222nm。
8.根据权利要求6所述的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：柱温为20～30℃；优选为25℃。
9.根据权利要求6所述的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：流速为0.5～1.5mL/min；优选为1.0mL/min。
10.根据权利要求6所述的洛索洛芬钠口服溶液中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：进样量为10～50μl；优选为20μl。
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