CN110487612A - 一种五味子甲素纯度标准物质及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了五味子甲素纯度标准物质的制备方法。制备方法包括：从五味子药材中提取制备五味子甲素纯度标准物质的候选物；候选物的纯度分析和结构鉴定；候选物的均匀性检验；候选物的稳定性检验；候选物的纯度定值检测；不确定度评定；若纯度分析、结构鉴定、均匀性检验、稳定性检验和不确定度评定均满足要求，则制得五味子甲素纯度标准物质。本发明还提供由上述方法制备得到的五味子甲素纯度标准物质及其应用。本发明的五味子甲素纯度标准物质能作为标准物质用于准确检测由五味子和南五味子作为原料生产的相关产品中五味子甲素成分含量，为实现我国准确定量五味子甲素成分含量提供了具备可溯源性和量值传递功能的标准物质资源。

Description

一种五味子甲素纯度标准物质及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种五味子甲素纯度标准物质及其制备方法与应用，属于化学计量中标准值传递技术领域。
背景技术
五味子和南五味子都有收敛固涩，益气生津，补肾宁心等作用。五味子和南五味子含有多种化学成分，其中联苯环辛烯类木脂素是其主要活性成分，而五味子甲素是其中一个重要的活性成分。五味子甲素(Schisandrin A)为白色结晶粉末状，CAS登记号为61281-38-7，分子式为C24H32O6，相对分子量为416.51，溶于氯仿、甲醇、乙酸乙酯、丙酮，不溶于水。研究发现，五味子甲素表现出多种良好的药理活性作用，比如抗肝纤维化、抑制多重耐药大肠杆菌生长、防治老年痴呆、糖尿病、防治肥胖、拮抗甲醛细胞毒性、抗抑郁等，是一种优秀的潜在药物。
目前，针对五味子甲素的制药用途开发、五味子及其相关产品的质量控制研究遇到了一些难题，其中一个主要原因是：五味子甲素纯度标准物质的缺乏，已影响五味子及其相关产品的标准制定和已有标准的开展执行，影响到了五味子甲素的制药研究的进展。五味子甲素纯度标准物质的研制体系尚未见报道。国内医药行业大都使用国外的相关标准品，但这些国外的相关标准品不仅价格昂贵、采购周期长、而且大都不具溯源性，无法有效实现对检测方法的验证和检测结果的仲裁，难以满足对五味子及其相关产品的制药研发的需求。为了保证测量结果的可溯源性及量值准确可靠，本领域急需配套相应的五味子甲素纯度标准物质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，克服现有技术的缺陷，提供一种五味子甲素纯度标准物质的制备方法。
本发明的第二方面，提供一种五味子甲素纯度标准物质。
本发明的第三方面，提供一种五味子甲素纯度标准物质的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种五味子甲素纯度标准物质的制备方法，包括：
1)从五味子药材中提取制备五味子甲素纯度标准物质的候选物；
1a.提取：将五味子药材粉碎，按质量比加入5～50倍的甲醇作为提取溶剂，于60℃至回流温度下提取1～10h，得提取液；
1b.萃取：将提取液浓缩除去提取溶剂，加入0.5～5倍体积的正己烷萃取1～3次，合并正己烷层，得萃取液；
1c.正相硅胶柱层析：将萃取液浓缩，上样，采用硅胶柱层析，用体积比正己烷：乙酸乙酯＝6:1进行洗脱，合并含五味子甲素的洗脱液，浓缩，得浓缩物；
1d.结晶：将浓缩物按每克加入0.2～1L甲醇并在加热下溶解，放置后有无色晶体析出，过滤；将过滤得到的晶体再按每克加入0.2～0.5L甲醇在加热下溶解，放置重结晶，过滤，真空干燥，即得五味子甲素候选标准物质；
2)候选物的纯度分析和结构鉴定：确认该候选物是否是五味子甲素，确认该候选物的纯度是否不低于99％；如果纯度分析和结构鉴定符合要求，则进行均匀性检验；
3)候选物的均匀性检验：如果候选物均匀性满足要求，则进行稳定性检验；
4)候选物的稳定性检验：如果候选物稳定性满足要求，则进行纯度定值检测；
5)候选物的纯度定值检测：
5a.采用高效液相色谱面积归一化法测定所述五味子甲素原料中五味子甲素的质量百分含量，得出所述五味子甲素原料的纯度定值PO；测定所述五味子甲素原料中的水分质量百分含量XW、挥发性杂质质量百分含量XV和非挥发性杂质质量百分含量Xe；按照如下公式I计算，得出五味子甲素纯度标准物质的纯度定值1，记为PHPLC-AN；
公式I：PHPLC-AN＝Po(1-XW-XV-Xe)，
其中，PHPLC-AN为采用高效液相色谱面积归一化法测得的纯度定值1；PO为五味子甲素原料的液相色谱法定值，XW为水分质量百分含量，XV为挥发性杂质质量百分含量，Xe为非挥发性杂质质量百分含量；
5b.采用定量核磁法测定所述五味子甲素原料中五味子甲素的质量百分含量，所述定量核磁法采用内标法，内标物为尼泊金乙酯；按照如下公式II进行计算，得出五味子甲素纯度标准物质的纯度定值2，记为PNMR；
公式II：PNMR＝Ix/IStd·NStd/Nx·Mx/MStd·mStd/mx·PStd，
其中：PNMR为采用定量核磁法测得的被测物的纯度定值2；Ix为样品指定峰的积分面积；IStd为内标物指定峰的积分面积；NStd为内标物指定峰的核群核个数；Nx为样品指定峰的核群核个数；Mx为样品的相对分子质量；MStd为内标物的相对分子质量；mStd为添加内标物的质量；mx为样品称样量；PStd为内标物的纯度；
5c.计算所述纯度定值1和所述纯度定值2的平均值，即得五味子甲素纯度标准物质的纯度定值；
6)不确定度评定：对候选物进行不均匀性引入的不确定度、不稳定性引入的不确定度、和标准物质的定值过程引入的不确定度进行评定；
若纯度分析、结构鉴定、均匀性检验、稳定性检验和不确定度评定均满足要求，则制得五味子甲素纯度标准物质。
上述方法中，优选的，步骤1)中，提取时，甲醇的用量为五味子药材质量的10倍。优选的，步骤1)中，提取时，在回流温度下提取2h。
上述方法中，优选的，步骤1)中，萃取时，加入1倍体积的正己烷萃取2次，合并正己烷层，得萃取液。
上述方法中，优选的，步骤1)中，正相硅胶柱层析用体积比正己烷：乙酸乙酯＝6:1的流动相进行洗脱。
上述方法中，步骤2)中，采用液相色谱法进行纯度分析，采用质谱法和核磁法进行结构鉴定。
上述方法中，步骤3)中，采用单因素方差分析法对五味子甲素纯度标准物质的候选物的均匀性检验结果进行统计分析。
在一些实施例中，上述均匀性检验的方法为：从标准物质总体单元中抽取不少于11个包装，在相同的条件下在每个包装不同部位取三次平行，重量-容量法配制不低于1g/L甲醇溶液，采用高效液相色谱-面积归一化法检验，获得的数据采用方差分析法分析；通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值间有无统计差异；如两者的比值小于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的。
上述方法中，步骤4)中，采用直线拟合法对五味子甲素纯度标准物质的候选物进行稳定性检验。所述稳定性检验包括长期稳定性和短期稳定性检验。在规定的贮存条件下，较长周期内定期地进行标准物质待定特性值的检验为长期稳定性检验；在极限运输条件下，较短周期内根据时间点进行标准物质待定特性值的检验为短期稳定性检验。
在一些实施例中，上述的长期稳定性检验的方法为：将五味子甲素标准物质置于低温(4℃)储存条件，采用经典稳定性评估方法，分别在第0、1、3、6、9、12个月进行稳定性监测；每个时间点随机选取3～5个包装，每个包装取2～3个子样，采用重量-容量法配制溶液，以高效液相色谱法-面积归一化法进行测定；通过HPLC归一化法含量变化情况，经过t-检验对数据进行分析，评价样品的长期稳定性。
在一些实施例中，上述的短期稳定性检验的方法为：随机选取分装好的五味子甲素纯度标准物质包装单元，置于-50℃～70℃条件下，采用经典稳定性评估方法，分别于1、3、5、7、14天抽取3～5个包装进行检验，每个包装取2～3子样进行稳定性检测，采用重量-容量法配制溶液，以高效液相色谱法-面积归一化法进行测定；通过HPLC归一化法含量变化情况，经过t-检验对数据进行分析，评价样品的短期稳定性。
在上述长期稳定性和短期稳定性检验中，t-检验的结果判断中，若|β1|＜t0.95，n-2·s(β1)，则稳定性检验结果为稳定。
在一些实施例中，纯度定值检测中的高效液相色谱面积归一化法的色谱条件为：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，4.6×250mm，5μm；流动相：甲醇:水＝79:21；流速：0.5mL/min；进样量：5μL；UV检测波长：249nm；HPLC：Agilent 1260系统。
在上述纯度定值检测中，五味子甲素纯度标准物质的候选物测定时配制为2000mg/L的五味子甲素甲醇溶液。
上述方法中，五味子甲素纯度标准物质的候选物中水分质量百分含量XW采用卡尔费休库伦法测定。
上述方法中，五味子甲素纯度标准物质的候选物中挥发性杂质质量百分含量XV采用顶空气相色谱法测定。
上述方法中，五味子甲素纯度标准物质的候选物中非挥发性杂质质量百分含量Xe采用炽灼残渣法测定。
在一些实施例中，所述顶空气相色谱法的具体条件如下：色谱柱为DB-624(30m×0.32mm，1.80m)；载气流速为2mL/min(氮气)；程序升温条件为初始40℃保持8min，以8℃/min速率升温至120℃，保持10min；进样量为1μL；分流比为10:1；加热箱为90℃；环路为95℃；传输线为100℃。
上述方法中，步骤3)采用采用BRUKER AvanceⅢ400MHz核磁共振仪，GBW(E)100064尼泊金乙酯纯度标准物质为内标物，天平为METTLER TOLEDOD，ME204/02，氘代试剂为CDCl3(美国Cambridge Isotope Laboratories)。
在一些实施方式中，五味子甲素纯度标准物质的候选物为粉末形式。
上述的方法中，五味子甲素纯度标准物质的候选物的不确定度由不均匀性引入的不确定度、不稳定性引入的不确定度和定值过程引入的不确定度三部分合成。
上述的方法中，采用单因素方差分析进行均匀性检验，候选物不均匀性引入的不确定度为：
其中，S1为组间标准偏差；S2为组内标准偏差；SH为均匀性标准偏差；n为组内测量次数。
上述的方法中，长期稳定性引入的不确定度为：ults＝s(β1)·X，其中，s(β1)为线性斜率的标准偏差；X为给定的保存期限。
上述的方法中，短期稳定性引入的不确定度为：usts＝s(β1)·X，其中，s(β1)为线性斜率的标准偏差；X为给定的保存期限。
上述的方法中，定值过程引入的不确定度，包括：液相色谱面积归一化法定值引入的不确定度、水分测定引入的不确定度、其他杂质(挥发性杂质及非挥发性杂质)测定引入的不确定度、定量核磁法引入的不确定度。
液相色谱面积归一化法定值引入的不确定度u(PHPLC-AN)计算公式如下：
其中，u(PHPLC-AN)为液相色谱面积归一化法定值的不确定度；urel(P0)为液相色谱法的相对不确定度；u(XW)为水分测定的不确定度；u(XV)为挥发性杂质测定的不确定度；u(Xe)为非挥发性杂质测定的不确定度。
水分测定引入的不确定度来源是测量重复性，水分测定引入的不确定度u(XW)为水分测定的标准偏差。
其他杂质(挥发性杂质及非挥发性杂质)测定引入的不确定度来源为测量的重复性，挥发性杂质测定的不确定度u(XV)为挥发性杂质测定的标准偏差，非挥发性杂质测定的不确定度u(Xe)为非挥发性杂质测定的标准偏差。
定量核磁共振法的定量引入的不确定度计算公式如下：
其中：u(Ix/IStd)为定量峰面积的不确定度；u(Mx)为五味子甲素相对分子质量的不确定度；u(MStd)为内标物尼泊金乙酯的相对分子质量的不确定度；u(mx)、u(mStd)为样品及内标物称样量的不确定度；u(PStd)为内标物的不确定度。
液相色谱面积归一化法和定量核磁共振法两种不同原理方法定值引入的不确定度uchar：
将3部分不确定度分量按照下述公式进行合成，即得标准物质的合成标准不确定度uCRM：
本发明中，所述五味子甲素纯度标准物质的定值不确定度的分析采用本领域常规的方法进行分析，对所述五味子甲素纯度标准物质定值的不确定度分析目的是对定值结果的分散性进行合理的表征。
上述的方法中，内标物指定峰为尼泊金乙酯的核磁图谱出峰，样品指定峰为五味子甲素的核磁图谱出峰；内标物指定峰和样品指定峰的选择标准为：相互之间没有重叠干扰，且场区接近。
在一些实施方式中，内标物指定峰为尼泊金乙酯化学位移1.34的氢峰，样品指定峰为五味子甲素化学位移0.75的氢峰。
本发明还提供了上述的方法得到定值的所述五味子甲素纯度标准物质。本发明提供的五味子甲素纯度标准物质的质量分数不低于99.5％。
在一具体实施例中，所述五味子甲素纯度标准物质的质量分数为99.5％；当k＝2时，它的不确定度为0.3％。
本发明进一步提供了所述五味子甲素纯度标准物质在以下1)-5)任一项中的应用：
1)作为标准物质应用于五味子药材及以其为原料的药品及保健品中五味子甲素成分检测；
2)检测实验室质量控制；
3)作为标准物质对分析仪器校准；
4)分析方法确认评价；
5)对给定材料赋值。
标准物质通常要求高纯度，其组成和化学式高度一致且化学稳定，由于对标准物质的这种严格要求，标准物质的制备一般需要在高度受控的条件下制造，以达到这种高纯度，并尽可能的避免所含杂质对后续测定的影响，因此标准物质的制备(包括提取制备原料)要比常规化学试剂的制备要复杂得多。本发明针对五味子甲素的物理和化学性质，研究出五味子甲素的标准物质的制备方法，该方法制备得到的五味子甲素标准物质的纯度高，化学、物理性质稳定。
本发明提供的标准物质是从五味子药材中提取得到，本发明提供的提取工艺能够制得五味子甲素纯度标准物质的候选物，其纯度分析和结构鉴定符合要求，经过后续的一系列检测后能够确认得到五味子甲素纯度标准物质。
本发明提供的制备方法采用高效液相面积归一化法(UV检测器)和定量核磁两种不同原理的方法对标准物质的纯度进行分析，通过使用满足计量学特性要求的制备方法、测量方法和计量器具，保证标准物质标准值的溯源性，同时保证检测结果的准确性和可比性。
本发明方法制备得到的五味子甲素纯度标准物质体系，是首次以国际计量等效一致的技术研制了五味子甲素纯度标准物质，填补国内空白，所获得的五味子甲素纯度标准物质的不确定度为0.3％，五味子甲素纯度标准物质的质量分数为99.5％，其各方面理化性质符合标准物质的要求，为传统五味子药材的制药研究提供重要的技术支撑。
本发明中所称的五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.和/或华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果实。前者习称“北五味子”，后者习称“南五味子”。
本发明五味子甲素纯度标准物质能作为标准物质用于准确检测由五味子和南五味子作为原料生产的相关产品中五味子甲素成分含量，对五味子相关产品进行严格质量控制，为实现我国准确定量五味子甲素成分含量提供了具备可溯源性和量值传递功能的标准物质资源。
附图说明
图1为五味子甲素原料的质谱图。
图2A为五味子甲素原料的核磁1H-NMR图。
图2B为五味子甲素原料的核磁13C-NMR图。
图3为五味子甲素纯度标准物质12个月稳定性监测结果。
图4为五味子甲素纯度标准物质在60℃条件下的短期稳定性结果。
图5为五味子甲素纯度标准物质高效液相色谱图。
图6为五味子甲素和尼泊金乙酯混合样品1H-NMR图谱。
图7为五味子甲素纯度标准物质定值不确定度来源分析及评定图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
五味子甲素原料是将南五味子药材粉碎，按质量比1:10加入甲醇，加热回流下提取2h；将提取液浓缩到小体积至无醇味，加入等体积的正己烷萃取两次，合并正己烷层，浓缩至小体积；将正己烷浓缩液与硅胶拌样烘干，硅胶柱用流动相正己烷：乙酸乙酯(6:1)装柱，拌样样品烘干后粉碎上样，正己烷：乙酸乙酯(6:1)洗脱，点板确定目标物洗脱组分并合并；合并的洗脱组分浓缩至干，按每克加入0.2～1L甲醇并加热溶解，放置后有无色方晶析出，过滤；将过滤的方晶按每克加入0.2～0.5L甲醇加热溶解，放置重结晶，结晶用甲醇洗涤过滤，碾碎真空干燥过夜即得五味子甲素候选标准物质。
五味子甲素原料经高分辨质谱和核磁进行定性(图1、2A、2B)及液相色谱法(紫外检测器，UV)进行纯度初步确认后，在干燥条件下充分混匀。对该原料进行均匀性初步检验，检验合格后，将五味子甲素候选物分装至干燥洁净的带内插管的2mL西林瓶中，密封，压盖。每个包装量为20mg，共计200瓶，低温(4℃)，避光，干燥保存。
本发明五味子甲素标准物质的定值步骤如下：
一、均匀性检验
根据JJG1006-1994《一级标准物质技术规范》和JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求对标准物质进行均匀性检验。本研究采用单因素方差分析法对五味子甲素纯度标准物质均匀性检验结果进行统计分析。
从标准物质总体单元中抽取11个包装，在相同的条件下在每个包装不同部位取三次平行，重量-容量法配制2g/L甲醇溶液，采用高效液相色谱-面积归一化法检验，获得的数据采用方差分析法分析。通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值间有无统计差异，如两者的比值小于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的。结果如表1所示。
均匀性检验公式如下：
ν1＝m-1(组间自由度)，ν2＝m(n-1)(组内自由度)，
其中，Q1为组间方差和；Q2为组内方差和，为总平均值；为第i个单元内的测定平均值；xij为第i个单元的第j个取样的测定结果；s1为组间标准偏差；s2为组内标准偏差；ν1为组间自由度；ν2为组内自由度。
根据自由度(v1,v2)及给定的显著水平α，可查得临界值Fα值。
表1五味子甲素纯度标准物质均匀性检验结果(％)
由上述统计分析可知，五味子甲素纯度标准物质分装单元均匀，符合技术规范要求。对均匀性检验的数据进行统计分析，结果表明对均匀性标准偏差sH计算如下式III所示：
二、稳定性检验
为考察五味子甲素纯度标准物质在长期储存条件下以及外部环境变化条件影响下，物质物理化学性质和特性量值保持不变的能力，本研究根据JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求，采用直线拟合法对五味子甲素纯度标准物质进行长期稳定性和短期稳定性考察。
稳定性分为长期稳定性和短期稳定性。在规定的贮存条件下，较长周期内定期地进行标准物质待定特性值的检验为长期稳定性检验，在极限运输条件下，较短周期内根据时间点进行标准物质待定特性值的检验为短期稳定性检验。
稳定性的评价是通过在不同时间点测量标准物质待定测特性值，以时间为X轴，以特性量值为Y轴，采用(经典)线性模型，描绘出待测特性值与时间的关系。计算公式如下：
截距由下式计算：
线性斜率的标准偏差由下式计算：
s为直线上每点的标准偏差由下式计算：
其中，Xi为第i个时间点的；Yi为第i个时间点的观测值；β0，β1为回归系数；n测量次数。
可用t-检验进行判断：若|β1|＜t0.95，n-2·s(β1)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性，在X内标准物质候选物是稳定的。
其中均匀性引入的不确定度为：us＝s(β1)·X。
1.长期稳定性考察
将五味子甲素标准物质置于低温(4℃)储存条件，采用经典稳定性评估方法，分别在第0、1、3、6、9、12个月进行稳定性监测。每个时间点随机选取5个包装，每个包装取3个子样，采用重量-容量法配制溶液，以高效液相色谱法-面积归一化法进行测定。通过HPLC归一化法含量变化情况，评价样品的长期稳定性。
长期稳定性检验结果列于表2，五味子甲素纯度标准物质在4℃储存12个月，五味子甲素纯度无明显变化，经过t测试对数据进行分析。长期稳定性测量数据及分析结果见表2及图3，五味子甲素纯度标准物质在低温(4℃)条件下储存12个月，变化的差异未达到显著水平，表明五味子甲素纯度标准物质在4℃储存条件下，12个月内标准物质的纯度值稳定。
表2五味子甲素纯度标准物质长期稳定性检验结果
2.短期稳定性
随机选取分装好的25个五味子甲素纯度标准物质包装单元，置于60℃极端运输条件下，采用经典稳定性评估方法，分别于1、3、5、7、14天抽取5个包装进行检验，每个包装取3个子样进行稳定性检测，检测方法及检测数据结果统计分析方法与长期稳定性相同。短期稳定性检测数据及分析结果见表3及图4，五味子甲素纯度标准物质在60℃条件下储存14天后，五味子甲素纯度无明显变化，经过t测试对数据进行分析，结果表明变化的差异未达到显著水平，表明五味子甲素纯度标准物质的纯度值在60℃条件下储存14天是稳定的。
表3五味子甲素纯度标准物质短期稳定性检验结果
综上所述，五味子甲素纯度标准物质在储存条件下12月内稳定性良好，在60℃的模拟运输条件下14天内稳定性良好。
三、标准物质定值
根据JJF1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》技术规范要求及前期文献查询，本研究采用液相色谱面积归一化法和定量核磁法两种不同原理的方法对五味子甲素纯度标准物质进行定值。液相色谱面积归一化法包括HPLC-UV法测定五味子甲素中主成分含量，卡尔费休库伦法测定水分含量，顶空气相色谱法测定挥发性杂质的含量，炽灼残渣法测定非挥发性杂质的含量。
为保证测量结果的溯源性，对定值的测量方法和测量过程进行了系统研究，同时对测量仪器定期进行检定校准，选用具有可溯源的基准试剂和标准物质，五味子甲素纯度标准物质可以直接将特性量值与国际基本单位SI单位直接联系起来，测定结果直接溯源到SI单位，具有量值溯源性。
定值方法1：液相色谱面积归一化法
1.高效液相色谱条件
采用Agilent 1260(VWD检测器)仪器，色谱条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相:甲醇-水(79:21)；流速：0.5mL/min；进样量：5μL；检测波长：249nm。
在上述确定色谱条件过程中，比较了100mg/L、1000mg/L、2000mg/L及5000mg/L等不同浓度的五味子甲素检测情况，在样品浓度为2000mg/L时，五味子甲素纯度标准物质中杂质就能均被检出(如图5所示)，定值浓度不小于2000mg/L，。
2.卡尔费休库伦法测定水分含量
采用卡尔费休库伦法测定五味子甲素纯度标准物质中水分含量。对实验随机选取的8个包装单元，采用METTLER TOLEDOD卡尔费休库伦水分测定仪V20，依据2015年版《中国药典》四部通则0832水分测定法(第一法库仑滴定法)测定水分，结果如表4所示。
3.顶空气相色谱法测定挥发性杂质含量
由于在五味子甲素纯度标准物质原料粉末提取过程中不可避免的会使用有机溶剂，采用顶空气相色谱法测定五味子甲素纯度标准物质中挥发性杂质的含量。
(1)主要仪器与试剂
Agilent 690型气相色谱仪，氢火焰离子化检测器(FID)(美国Agilent公司)，甲醇(GBW06111，中国计量科学研究院)。
(2)仪器工作条件
顶空进样气相色谱条件：色谱柱为DB-624(30m×0.32mm，1.80m)；载气流速为2mL/min(氮气)；程序升温条件为初始40℃保持8min，以8℃/min速率升温至120℃，保持10min；进样量为1μL；分流比为10:1；加热箱为90℃；
(3)实验步骤
标品溶液配制：取166.9mg甲醇纯度标准物质，精密称定，溶于100mL二甲基亚砜(DMSO)溶液中作为母液。取母液1mL于10mLDMSO溶剂中配制为150ppm左右的溶液。取1mL配制的150ppm左右的溶液于10mLDMSO溶剂中，配制成6.5ppm标品溶液，取1mL于20mL顶空瓶中，立即密封压盖，带测定。
样品溶液配制：称取10mg样品，精密称定，于20ml顶空瓶中，加1mLDMSO溶剂溶解，立即密封压盖，带测定。测定结果见表4所示。
4.炽灼残渣法测定非挥发性杂质含量
依据GB/T 9741-2008《化学试剂炽灼残渣测定通用方法》测定标准物质中的无机杂质含量，测定结果见表4所示。
5.五味子甲素纯度标准物质的定值结果
五味子甲素纯度标准物质液相色谱面积归一化法定值结果见表4，计算公式如下：
PHPLC-AN＝Po(1-XW-XV-Xe)，
其中，PHPLC-AN为液相色谱面积归一化法定值结果；PO为五味子甲素高效液相法的定值，XW为水分质量百分含量，XV为挥发性杂质质量百分含量，Xe为非挥发性杂质质量百分含量。
表4五味子甲素纯度标准物质液相色谱面积归一化法定值结果(质量分数，％)
综上所述，五味子甲素纯度标准物质液相色谱面积归一化法纯度定值结果为99.35％。
定值方法2：定量核磁法
核磁技术在化合物纯度定值、含量测定方面具有很多优势，其用于定量分析的基础是化学环境中不同的原子核共振吸收峰的面积只与所包含的原子数有关。本标准物质采用定量核磁法作为第二种标准物质定值方法。定量核磁法计算公式如下：
Px＝Ix/IStd·NStd/Nx·Mx/MStd·mStd/mx·PStd，
其中：Px为采用核磁共振法测得的被测物纯度；Ix为样品指定峰的积分面积；IStd为内标物指定峰的积分面积；NStd为内标物指定峰的核群核个数；Nx为样品指定峰的核群核个数；Mx为样品的相对分子质量；MStd为内标物的相对分子质量；mStd为添加内标物的质量；mx为样品称样量；PStd为内标物的纯度。
本发明采用中国计量院有证标准物质尼泊金乙，五味子甲素化学位移0.75和尼泊金乙酯化学位移1.34的氢峰相互之间没有重叠干扰，且场区接近，适合进行定量分析。根据定量核磁计算公式，五味子甲素纯度标准物质纯度定值结果如表5及图6中所示。
表5五味子甲素纯度标准物质定量核磁法定值结果(质量分数，％)
四、纯度定值结果
五味子甲素纯度标准物质两种不同原理方法定值结果取两种方法定值结果的平均值，结果如下：
五、不确定度评定
根据《JJF 1343-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理》、《JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示》，对五味子甲素纯度标准物质进行不确定度评定。五味子甲素纯度标准物质的定值结果的不确定度由三部分组成。分别为标准物质的不均匀性引入的不确定度ubb，标准物质不稳定性引入的不确定度(短期稳定性usts和长期稳定性ults)，标准物质的定值过程引入的不确定度uchar。
1.均匀性引入的不确定度
根据技术规范要求，采用单因素方差分析进行均匀性检验，由样品不均匀性引入的不确定度为：
2.稳定性引入的不确定度
根据技术规范要求及稳定性检测数据，长期稳定性引入的不确定度为：
ults＝s(β1)·X＝1.5×10-4×12＝0.0018％。
短期稳定性引入的不确定度为：
usts＝s(β1)·X＝9.4×10-5×14＝0.0013％。
3.定值过程引入的不确定度
(1)液相色谱面积归一化法定值引入的不确定度
液相色谱面积归一化法的定值引入的不确定度u(PHPLC-AN)计算公式如下：
其中，u(PHPLC-AN)为液相色谱面积归一化法定值的不确定度；urel(P0)为液相色谱法的相对不确定度；u(XW)为水分测定的不确定度；u(XV)为挥发性杂质测定的不确定度；u(Xe)为非挥发性杂质测定的不确定度。
a.液相色谱法纯度测定重复性引入的不确定度u1由测量的相对标准偏差计算，u1＝0.002％。
b.不同检测波长下各组分响应差异对定值结果引入的不确定度u2：
u2-i＝Bi maxλ-Bi valλ＝(Ai maxλ-Ai valλ)/∑Ai valλ，
其中，Bi为组分i在定值波长下的峰面积百分比；∑Bi为总是等于100％；u2-i为杂质i在最大响应波长峰面积与定值波长峰面积的差异。Aimaxλ为杂质i在其最大响应波长下的峰面积(mAu·s)；Ai valλ为杂质i在定值波长下的峰面积(mAu·s)；∑Ai valλ为定值波长下所以峰峰面积的总和(mAu·s)。按矩型分布估计不确定度，故使用作为包含因子。
各组分在不同检测波长下响应差异引入的不确定度u2＝0.158％，结果见表6。
表6五味子甲素纯度标准物质多波长定值结果(定值波长249nm)
液相色谱测定合成相对标准不确定度为：
(2)水分测定引入的不确定度
天平称量引入的不确定度分量较小，所以水分测定引入的不确定度来源是测量重复性，水分测量的结果为0.251％，标准偏差为0.050％，因此水分测定引入的标准偏差为：u2(XW)＝0.050％。
(3)其他杂质测定引入的不确定度
由于天平称量不确定度分量引入的不确定度较小，挥发性杂质及非挥发性杂质测量不确定度来源为测量的重复性，挥发性杂质的不确定度为u(XV)＝0.013％，非挥发性杂质的不确定度为u(Xe)＝0.018％。
由液相色谱面积归一化法定值引入的不确定度为：
4.定量核磁法引入的不确定度
定量核磁共振法的定量引入的不确定度计算公式如下：
其中：u(Ix/IStd)为定量峰面积的不确定度；u(Mx)为五味子甲素相对分子质量的不确定度；u(MStd)为内标物尼泊金乙酯的相对分子质量的不确定度；u(mx)、u(mStd)为样品及内标物称样量的不确定度；u(PStd)为内标物的不确定度。
(1)定量峰面积引入的不确定度
积分面积不确定度通过多次定量分析测量结果的标准偏差给出，定量核磁测定的结果为99.56％，标准偏差为0.160％，转化为标准不确定度，u(Ix/IStd)＝0.160％。
(2)元素的原子量引入的不确定度
其中：Nj为样品分子式中j元素的原子个数；u(j)为j元素的相对分子质量的不确定度。
对于每个元素来说，其标准不确定度可按IUPAC给出的数值求得。3种原子的相对原子质量及其不确定度为C：12.0107±0.0008；H：1.00794±0.00007；O：15.9994±0.0003，按照矩形分布转化为标准偏差。
五味子甲素的分子式为C24H32O6，相对分子质量为416.51，其标准不确定度为：
五味子甲素的相对分子质量的相对标准不确定度为：
urel(Mx)＝u(Mx)/Mx＝0.011/416.51＝2.70×10-5，
以同样方式计算得到内标物尼泊酸乙酯(C9H10O3)相对分子质量(166.173)的相对标准不确定度为：
urel(MStd)＝u(MStd)/MStd＝0.0043/166.173＝2.54×10-5。
(3)内标物标准物质和样品天平称量引入的不确定度
天平最小分度为0.001mg，样品称量质量在20mg，内标物称样量在10mg，因此天平称量相对标准不确定度为：
(4)内标物纯度引入的不确定度
内标物GBW(E)100064尼泊金乙酯的纯度不确定度由标准物质证书获得，纯度值的相对扩展不确定度为0.2％(k＝2)，因此相对标准不确定度为urel(PStd)＝0.2％/2＝0.1％。
定量核磁定值引入的标准不确定度为：
5.两种不同原理方法定值引入的不确定度
两种不同原理方法定值引入的不确定度uchar：
6.合成标准不确定度
将3部分不确定度分量按照下述公式进行合成，即得标准物质的合成标准不确定度uCRM：
7.扩展不确定度
将纯度标准物质特性值的合成标准不确定度uCRM乘以包含因子k(一般取k＝2或3，对应的置信概率为95％或99％)，即为欲研制标准物质特性值的扩展不确定度UCRM：
U＝k·uCRM＝0.26％(k＝2)。
8.五味子甲素纯度鼻癌准物质定值结果的表示
五味子甲素纯度标准物质的定值结果表示为：
99.5％±0.3％(k＝2)。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种五味子甲素纯度标准物质的制备方法，其特征在于，包括：
1)从五味子药材中提取制备五味子甲素纯度标准物质的候选物；
1a.提取：将五味子药材粉碎，按质量比加入5～50倍的甲醇作为提取溶剂，于60℃至回流温度下提取1～10h，得提取液；
1b.萃取：将提取液浓缩除去提取溶剂，加入0.5～5倍体积的正己烷萃取1～3次，合并正己烷层，得萃取液；
1c.正相硅胶柱层析：将萃取液浓缩，上样，采用硅胶柱层析，用体积比正己烷：乙酸乙酯＝(5～7):1进行洗脱，合并含五味子甲素的洗脱液，浓缩，得浓缩物；
1d.结晶：将浓缩物按每克加入0.2～1L甲醇并在加热下溶解，放置后有无色晶体析出，过滤；将过滤得到的晶体再按每克加入0.2～0.5L甲醇在加热下溶解，放置重结晶，过滤，干燥，即得五味子甲素候选标准物质；
2)候选物的纯度分析和结构鉴定：确认该候选物是否是五味子甲素，确认该候选物的纯度是否不低于99.5％；如果纯度分析和结构鉴定符合要求，则进行均匀性检验；
3)候选物的均匀性检验：如果候选物均匀性满足要求，则进行稳定性检验；
4)候选物的稳定性检验：如果候选物稳定性满足要求，则进行纯度定值检测；
5)候选物的纯度定值检测：
5a.采用高效液相色谱面积归一化法测定所述五味子甲素原料中五味子甲素的质量百分含量，得出所述五味子甲素原料的纯度定值PO；测定所述五味子甲素原料中的水分质量百分含量XW、挥发性杂质质量百分含量XV和非挥发性杂质质量百分含量Xe；按照如下公式I计算，得出五味子甲素纯度标准物质的纯度定值1，记为PHPLC-AN；
公式I：PHPLC-AN＝Po(1-XW-XV-Xe)
其中，PHPLC-AN为采用高效液相色谱面积归一化法测得的纯度定值1；PO为五味子甲素原料的液相色谱法定值，XW为水分质量百分含量，XV为挥发性杂质质量百分含量，Xe为非挥发性杂质质量百分含量；
5b.采用定量核磁法测定所述五味子甲素原料中五味子甲素的质量百分含量，所述定量核磁法采用内标法，内标物为尼泊金乙酯；按照如下公式II进行计算，得出五味子甲素纯度标准物质的纯度定值2，记为PNMR；
公式II：PNMR＝Ix/IStd·NStd/Nx·Mx/MStd·mStd/mx·PStd，
其中：PNMR为采用定量核磁法测得的被测物的纯度定值2；Ix为样品指定峰的积分面积；IStd为内标物指定峰的积分面积；NStd为内标物指定峰的核群核个数；Nx为样品指定峰的核群核个数；Mx为样品的相对分子质量；MStd为内标物的相对分子质量；mStd为添加内标物的质量；mx为样品称样量；PStd为内标物的纯度；
5c.计算所述纯度定值1和所述纯度定值2的平均值，即得五味子甲素纯度标准物质的纯度定值；
6)不确定度评定：对候选物进行不均匀性引入的不确定度、不稳定性引入的不确定度、和标准物质的定值过程引入的不确定度进行评定；
若纯度分析、结构鉴定、均匀性检验、稳定性检验和不确定度评定均满足要求，则制得五味子甲素纯度标准物质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，采用单因素方差分析法对五味子甲素纯度标准物质的候选物的均匀性检验结果进行统计分析。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，均匀性检验的方法为：从标准物质总体单元中抽取不少于11个包装，在相同的条件下在每个包装不同部位取三次平行，采用重量-容量法配制溶液，采用高效液相色谱-面积归一化法检验，获得的数据采用方差分析法分析；通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值间有无统计差异；如两者的比值小于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，采用直线拟合法对五味子甲素纯度标准物质的候选物进行稳定性检验，所述稳定性检验包括长期稳定性和短期稳定性检验。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述长期稳定性检验的方法为：将五味子甲素标准物质置于4℃储存条件，分别在第0、1、3、6、9、12个月进行稳定性监测；每个时间点随机选取3～5个包装，每个包装取2～3个子样，采用重量-容量法配制溶液，以高效液相色谱法-面积归一化法进行测定；通过HPLC归一化法含量变化情况，经过t-检验对数据进行分析，评价样品的长期稳定性；t-检验的结果判断中，若|β1|＜t0.95，n-2·s(β1)，则稳定性检验结果为稳定。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述短期稳定性检验的方法为：随机选取分装好的五味子甲素纯度标准物质包装单元，置于-50℃～70℃运输条件下，分别于1、3、5、7、14天抽取3～5个包装进行检验，每个包装取2～3子样进行稳定性检测，采用重量-容量法配制溶液，以高效液相色谱法-面积归一化法进行测定；通过HPLC归一化法含量变化情况，经过t-检验对数据进行分析，评价样品的短期稳定性；t-检验的结果判断中，若|β1|＜t0.95，n-2·s(β1)，则稳定性检验结果为稳定。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，五味子甲素纯度标准物质的候选物中水分质量百分含量XW采用卡尔费休库伦法测定，挥发性杂质质量百分含量XV采用顶空气相色谱法测定，非挥发性杂质质量百分含量Xe采用炽灼残渣法测定。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用单因素方差分析进行均匀性检验，不均匀性引入的不确定度为：
其中，S1为组间标准偏差；S2为组内标准偏差；SH为均匀性标准偏差；n为组内测量次数；
长期稳定性引入的不确定度为：ults＝s(β1)·X，其中，s(β1)为线性斜率的标准偏差；X为给定的保存期限；
短期稳定性引入的不确定度为：usts＝s(β1)·X，其中，s(β1)为线性斜率的标准偏差；X为给定的保存期限；
定值过程引入的不确定度，包括：液相色谱面积归一化法定值引入的不确定度、水分测定引入的不确定度、挥发性杂质及非挥发性杂质测定引入的不确定度、定量核磁法引入的不确定度；
液相色谱面积归一化法定值引入的不确定度u(PHPLC-AN)计算公式如下：
其中，u(PHPLC-AN)为液相色谱面积归一化法定值的不确定度；urel(P0)为液相色谱法的相对不确定度；u(XW)为水分测定的不确定度；u(XV)为挥发性杂质测定的不确定度；u(Xe)为非挥发性杂质测定的不确定度；
水分测定引入的不确定度u(XW)为水分测定的标准偏差；
挥发性杂质测定的不确定度u(XV)为挥发性杂质测定的标准偏差，非挥发性杂质测定的不确定度u(Xe)为非挥发性杂质测定的标准偏差；
定量核磁共振法的定量引入的不确定度计算公式如下：
其中：u(Ix/IStd)为定量峰面积的不确定度；u(Mx)为五味子甲素相对分子质量的不确定度；u(MStd)为内标物尼泊金乙酯的相对分子质量的不确定度；u(mx)、u(mStd)为样品及内标物称样量的不确定度；u(PStd)为内标物的不确定度；
液相色谱面积归一化法和定量核磁共振法两种不同原理方法定值引入的不确定度uchar：
将均匀性检验、稳定性检验、定值检验3部分不确定度分量按照下述公式进行合成，即得五味子甲素纯度标准物质的候选物的合成标准不确定度uCRM：
9.由权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的五味子甲素纯度标准物质。
10.如权利要求9所述的五味子甲素纯度标准物质在以下1)-5)任一项中的应用：
1)作为标准物质应用于五味子药材及以其为原料的药品及保健品中五味子甲素成分检测；
2)检测实验室质量控制；
3)作为标准物质对分析仪器校准；
4)分析方法确认评价；
5)对给定材料赋值。
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