CN110297054A - 一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，即采用高效液相色谱法对血清中左乙拉西坦的含量进行定性和/或定量检测，包括以下步骤：S1、血清样品预处理，取血清样本与二氯甲烷混合，涡旋震荡，在常温下于高速离心，取下清液，于常温下使用氮气吹干，再加入复溶液，涡旋混匀，在常温下于高速离心，得到上清液，即为待测样品；S2、标准品溶液的标定，将含左乙拉西坦的系列保准品溶液进行S1相同的前处理得到待测标准品溶液并检测；S3、待测样品检测。本发明通过液液萃取的方法进行除杂，通过氮气浓缩，再采用高效液相色谱法进一步分离，对血清中的左乙拉西坦含量进行定量和/或定性分析，检测过程简单，提取步骤少，提取用时少。

Description

一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法
技术领域
本发明涉及药物浓度监测技术领域，具体为一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法。
背景技术
左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)为第2代乙酰胆碱激动药，属吡咯烷酮衍生物。吡咯烷酮类促智药属于五元杂环内酞胺类促智药，可视为γ-氨基丁酸(GABA)的衍生物，对参与神经保护和记忆过程的受体具有特殊作用，是目前最引人注目的一类促智药，具有广谱、起效迅速的抗癫痫活性，药物代谢动力学特性较理想、耐受性和安全性好，特别适用于成人和儿童的难治性部分性发作的辅助治疗。左乙拉西坦的结构与作用机制均与其他抗癫痫药物不同，它的药代动力学与给药剂量呈线性关系，生物利用度能达到100％，不具备肝药酶诱导效应，大约91％的剂量能通过肾脏排泄；而且可以通过监控血浆中LEV的浓度来优化治疗效果，特别对于有肾损伤的病人或者小孩具有良好的效果，且不良反应小。左乙拉西坦于2000年获得美国FDA批准上市，2007年引入国内，用于治疗癫痫的部分发作、原发性或继发性全身发作，也可以作为肌阵挛的添加治疗。
目前测定左乙拉西坦血药浓度的方法主要有高效液相色谱法和液-质联用法，但是高效液相色谱法存在干扰因素多、分析时间长、灵敏度不高的问题；液-质联用法则需要购置非常昂贵的仪器和试剂。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术的不足，提供一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，通过二氯甲烷和血清样本液液萃取的方法进行除杂，通过氮气浓缩，再采用高效液相色谱法进一步分离，对血清中的拉西坦含量进行定量和/或定性分析。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，采用高效液相色谱法对血清中左乙拉西坦的含量进行定性和/或定量检测，包括以下步骤：
S1、血清样品预处理
取100μL血清样本与1000μL二氯甲烷混合，涡旋震荡5min，在常温下于14000r高速离心5min，取下清液950μL，于常温下使用氮气吹干，再加入100～300μL复溶液，涡旋混匀3min，在常温下于14000r高速离心5min，得到上清液，即为待测样品；
S2、标准品溶液的标定
将含左乙拉西坦浓度为12.5～800μg/mL的系列浓度的标准品溶液进行前处理得到待测标准品溶液，将待测标准品溶液使用高效液相色谱仪进行检测，得到不同浓度待测标准品溶液的信号强度，以待测标准品溶液的浓度为横坐标x，相应浓度的信号强度作为纵坐标y，将以上检测所得到的的至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；
S3、待测样品检测
将S1得到的待测样品通过高效液相色谱仪中的色谱柱进行初步分离，再使用紫外检测器检测，得到待测样品在固定保留时间下的信号，根据信号的有无进行血清中左乙拉西坦的定性检测；
将S1得到的待测样品使用高效液相色谱仪进行检测，得到待测样品的信号强度，将得到的信号强度代入S2得到的标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待测样品中左乙拉西坦的浓度。
优选的，所述S2中系列浓度的标准品溶液的制备过程为：将左乙拉西坦标准品与甲醇混合得到左乙拉西坦含量为1mg/mL的储存液，并将储存液进行一系列稀释，得到左乙拉西坦浓度分别为800，500，250，125，50，25，12.5μg/mL的标准品溶液。
优选的，所述稀释液由甲醇和水按照3:7的体积比混合得到。
优选的，所述标准品溶液进行前处理过程为：将10μL标准品溶液与90μL空白血清加入1000μL二氯甲烷混合，涡旋震荡5min，在常温下于14000r高速离心5min，取下清液950μL，于常温下使用氮气吹干，加入100～300μL复溶液，涡旋混匀3min，在常温下于14000r高速离心5min，得到上清液，即为待测标准品溶液。
优选的，所述S1中复溶液的加入量为200μL，所述复溶液由乙腈和水按照1:9的体积比混合得到。
优选的，所述S1中涡旋的转速为1500r/min。
优选的，所述S2和S3中高效色谱仪检测的条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：乙腈-无机盐溶液；梯度洗脱分离；柱温35℃；检测波长225nm。
优选的，所述色谱柱为Waters -C18，所述C18色谱柱的规格为100mm×2.1mm，填料粒径为3.5μm。
优选的，所述流动相的具体组成为：流动相A：含有5mmoL/L磷酸二氢钠，用体积分数为25％磷酸调节pH的水溶液；流动相B：乙腈。
优选的，所述梯度洗脱过程为：0～2min，11％B；2～3min，100％B；3～12min，11％B；流速为0.25mL/min；进样量为5μL；其中，所述梯度洗脱过程中的A、B采用体积百分比。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明通过二氯甲烷和血清样本液液萃取的方法对血清样本进行除杂，除杂效果好，通过氮气浓缩，再采用高效液相色谱法进一步分离，对血清中的拉西坦含量进行定量和/或定性分析，检测过程简单，提取步骤少，1小时能够处理40个样本，提取用时少。
附图说明
图1是本发明方法所检测得到的典型谱图；
图2是人血清样本中左乙拉西坦色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式例对本发明进行详细描述。本发明的范围并不受限于该具体实施方式。
实施例1
一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，包括以下步骤：
1、配制试剂，包括样本前处理液、标准品溶液和仪器分析液，分别如下：
1.1样本前处理液含有：二氯甲烷溶液，复溶液；
其中二氯甲烷溶液为分析级别；复溶液为乙腈和水按照1:9的体积比混合的混合液；
1.2标准品溶液：精密称量左乙拉西坦标准品，将称量好的左乙拉西坦加入A级定容瓶准确定容作为储存液，溶剂为甲醇，此时，储存液中左乙拉西坦含量为1mg/mL；并使用体积比为3:7的甲醇和水的混合溶液进行稀释，经一系列稀释使左乙拉西坦的浓度分别为800，500，250，125，50，25，12.5μg/mL。
1.3仪器分析液中含有：
流动相A：含有5mmoL/L磷酸二氢钠，用体积分数为25％磷酸调节pH的水溶液；
流动相B：乙腈。
2、样本制备：取100μL待测血清样本或标准品溶液至1.5mL离心，加入1mL二氯甲烷，混合震荡，取下层液950μL，氮气吹干，加入200μL复溶液，等待上机测试，进样体积：5μL。
3、检测：
液相色谱流动相A和流动相B按如下梯度进行设置：
流速：0.25mL；
时间(min)A(V％)B(V％)0.00 89 11；2.00 89 11；2.01 0 100；3.00 0 100；3.0189 11；12.00 89 11；
4、检测效果：利用本发明所述方法所检测得到的典型谱图如图1所示。
图2为人血清样本中左乙拉西坦色谱图，由图2可以看出，左乙拉西坦色谱峰与其他内源性物质，互不干扰，峰型良好。
5、检测不同浓度待测标准品溶液的信号强度，以待测标准品溶液的浓度作为横坐标，以待测标准品溶液信号强度作为纵坐标，制作标准曲线。
当检测到血清样本中存左乙拉西坦，并需对其进行定量测定时，可通过检测血清样本的色谱峰强度，将其代入上述标准曲线中进行计算，得到血清样本中左乙拉西坦的浓度。
6、方法的准确性评价：
将本发明所述方法进行线性试验、回收率试验、精密度试验、定量限试验、检测限试验。其中线性试验结果r2≥0.990；不同浓度水平回收率试验结果在99.41％-107.67％；日间精密度3.31％-6.27％；日内精密度2.79％-3.54％；定量限为0.25；检测限为0.09μg/mL。方法的专属性高、灵敏度高、重现性好、检测结果的准确度高。
实施例2
本实施例与实施例1的检测过程相同，不同的是加入复溶液体积为100μL。
实施例3
本实施例与实施例1的检测过程相同，不同的是加入复溶液体积为300μL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法对血清中左乙拉西坦的含量进行定性和/或定量检测，包括以下步骤：
S1、血清样品预处理
取100μL血清样本与1000μL二氯甲烷混合，涡旋震荡5min，在常温下于14000r高速离心5min，取下清液950μL，于常温下使用氮气吹干，再加入100～300μL复溶液，涡旋混匀3min，在常温下于14000r高速离心5min，得到上清液，即为待测样品；
S2、标准品溶液的标定
将含左乙拉西坦浓度为12.5～800μg/mL的系列浓度的标准品溶液进行前处理得到待测标准品溶液，将待测标准品溶液使用高效液相色谱仪进行检测，得到不同浓度待测标准品溶液的信号强度，以待测标准品溶液的浓度为横坐标x，相应浓度的信号强度作为纵坐标y，将以上检测所得到的的至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；
S3、待测样品检测
将S1得到的待测样品通过高效液相色谱仪中的色谱柱进行初步分离，再使用紫外检测器检测，得到待测样品在固定保留时间下的信号，根据信号的有无进行血清中左乙拉西坦的定性检测；
将S1得到的待测样品使用高效液相色谱仪进行检测，得到待测样品的信号强度，将得到的信号强度代入S2得到的标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待测样品中左乙拉西坦的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，其特征在于，所述S2中系列浓度的标准品溶液的制备过程为：将左乙拉西坦标准品与甲醇混合得到左乙拉西坦标含量为1mg/mL的储存液，并将储存液进行一系列稀释，得到左乙拉西坦浓度分别为800，500，250，125，50，25，12.5μg/mL的标准品溶液。
3.根据权利要求2所述的一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，其特征在于，所述稀释液由甲醇和水按照3:7的体积比混合得到。
4.根据权利要求3所述的一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，其特征在于，所述标准品溶液进行前处理过程为：将10μL标准品溶液与90μL空白血清加入1000μL二氯甲烷混合，涡旋震荡5min，在常温下于14000r高速离心5min，取下清液950μL，于常温下使用氮气吹干，加入100～300μL复溶液，涡旋混匀3min，在常温下于14000r高速离心5min，得到上清液，即为待测标准品溶液。
5.根据权利要求1或4所述的一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，其特征在于，所述S1中复溶液的加入量为200μL，所述复溶液由乙腈和水按照1:9的体积比混合得到。
6.根据权利要求1或4所述的一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，其特征在于，所述S1中涡旋的转速为1500r/min。
7.根据权利要求1所述的一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，其特征在于，所述S2和S3中高效色谱仪检测的条件为：固定相：C18色谱柱；流动相：乙腈-无机盐溶液；梯度洗脱分离；柱温35℃；检测波长225nm。
8.根据权利要求6所述的一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters -C18，所述C18色谱柱的规格为100mm×2.1mm，填料粒径为3.5μm。
9.根据权利要求6所述的一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，其特征在于，所述流动相的具体组成为：流动相A：含有5mmoL/L磷酸二氢钠，用体积分数为25％磷酸调节pH的水溶液；流动相B：乙腈。
10.根据权利要求6所述的一种人血清中左乙拉西坦含量的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程为：0～2min，11％B；2～3min，100％B；3～12min，11％B；流速为0.25mL/min；进样量为5μL；
其中，梯度洗脱过程中的A、B采用体积百分比。
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