CN104062392A - 一种测定血浆中丹酚酸l的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药物在血浆中的含量的方法，步骤如下：（1）样品处理：取血浆样品，加入酸溶液和内标溶液适量，混合；之后加入有机溶剂混合进行萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，在水浴下吹干，然后用液相流动相复溶后离心，取上清液进样测定；（2）液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相硅胶色谱柱作为分离介质，进样后用固定比例流动相进行等度洗脱，使干扰物、待测物和内标获得初步分离；其中流动相A相选自甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液或醋酸铵水溶液，B相选自乙腈或甲醇，A相占整个流动相的30-90%；（3）质谱检测：液质联用仪的质谱部分按照设定的离子化条件，采用SRM扫描功能检测血浆样品中丹酚酸L和内标的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物在血浆中的含量的方法，特别涉及一种测定血浆中丹酚酸L的方法。
背景技术
丹酚酸L是由天津天士力集团研究院发现的一种新的酚酸类化合物，具有抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集和抗血栓形成等药理作用。
其化学结构式如下：
其分子量如下：538
其分子式如下：C27H22O12
该化合物及其制备方法公开在中国专利：一种新的丹酚酸化合物L，其制备方法和用途，CN201010135800.6
液质联用（HPLC‐MS）又叫液相色谱‐质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。
丹酚酸L作为新的药物需要进行大量的药物研究工作，包括的药物代谢动力学研究，但由于丹酚酸L结构复杂，稳定性差，含有大量的酚和酸基团，而且含量极低，用现有技术难以准确测定其在体液或溶液中的存在及其含量。
此前，有研究人员建立了丹酚酸L的高效液相定量方法，但该方法灵敏度低（50ng/mL），在口服给药下血药浓度的测定中有一定局限。因此需要开发一种灵敏度高，专属性好的方法。本发明经过筛选，同时对色谱条件进行了考察，意外的发现采用液质联用仪器进行丹酚酸L血药浓度测定，专属性好，灵敏度高（5ng/mL），精密度、准确度、提取回收率和稳定性等均达到体内药物分析的要求。并利用该方法对丹酚酸L在大鼠体内的药动学特征进行了考察。
发明内容
本发明提供一种测定血浆中丹酚酸L的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）样品处理：取血浆样品，加入酸溶液和内标溶液适量，混合；之后加入有机溶剂混合进行萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，在水浴下吹干，然后用液相流动相复溶后离心，取上清液进样测定；
（2）液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相硅胶色谱柱作为分离介质，进样后用固定比例流动相进行等度洗脱，使干扰物、待测物和内标获得初步分离；其中流动相A相选自选自甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液或醋酸铵水溶液，B相选自乙腈或甲醇，A相占整个流动相的30-90%；
（3）质谱检测：液质联用仪的质谱部分按照设定的离子化条件，采用SRM扫描功能检测血浆样品中丹酚酸L和内标的含量。
优选的本发明所述测定血浆中丹酚酸L的方法，包括以下步骤：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入0.25倍体积酸溶液、内标溶液适量，涡旋混合10s-3min；之后加入有机萃取溶剂，涡旋混合1-10min；上述混合液在2000-6000r/min下离心1-10min后取有机溶剂层，在10-60℃水浴下氮气吹干，然后用0.5倍体积的流动相复溶，10000-15000r/min离心1-10min后取上清液进样测定；
（2）液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相C8或C18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后用固定比例流动相进行等度洗脱，流动相流速为0.1-0.4mL/min；流动相选自0.02-5%的甲酸水溶液和乙腈的组合或0.02-5%的甲酸水溶液和甲醇的组合，两种组合中甲酸水溶液的比例为30-90%；
（3）质谱检测：液质联用仪的质谱部分采用电喷雾离子化（ESI）离子源将液相洗脱液离子化，采用三重四级杆液质联用仪的SRM扫描功能检测血浆样品中丹酚酸L内标的含量。
更优选的本发明所述测定血浆中丹酚酸L的方法，包括以下步骤：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入0.25倍体积酸溶液、0.1倍体积内标迷迭香酸溶液，涡旋混合30s；之后加入萃取用有机溶剂，涡旋混合3min；上述混合液在3500r/min下离心6min后取有机溶剂层，在30℃水浴下氮气吹干，然后用0.5倍体积的流动相复溶，12000r/min离心3min后取上清液进样测定；
（2）液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相C18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后用流动相进行洗脱，流动相流速为0.25mL/min；流动相A相为0.1%的甲酸水溶液，B相为乙腈，A相占流动相的百分比为70%；
（3）质谱检测：液质联用仪的质谱部分采用电喷雾离子化（ESI）离子源将液相洗脱液离子化，采用三重四级杆液质联用仪的SRM扫描功能检测血浆样品中丹酚酸L内标的含量。
其中，步骤（1）所述的酸选自盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸所组成的组中的至少一种。所述酸优选为0.01-5mol/L的盐酸水溶液或0.1-10%的甲酸水溶液或0.01-0.1%的磷酸水溶液。更优选的为1mol/L的盐酸水溶液。
步骤（1）所述内标溶液选自丹参素、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B中的一种。优选的内标溶液为迷迭香酸水溶液。所述内标溶液的配制方法如下：精密称定迷迭香酸标准品10mg置于10mL容量瓶中，加乙腈溶解后定容至刻度，作为母液，置4℃冰箱保存。使用时取母液用水稀释至所需浓度。
步骤（1）所述机溶剂选自乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷所组成的组中的至少一种。优选的有机溶剂为5-25倍血浆体积的乙酸乙酯或5-25倍血浆体积的二氯甲烷：正己烷=1：9-9：1或5-25倍血浆体积的三氯甲烷：正己烷=1：9-9：更优选的有机溶剂为15倍血浆体积的乙酸乙酯。
其中，步骤（3）所述离子化条件，选用电喷雾离子化（ESI），其参数设置为喷雾电压：-2500—-3500V；壳气：1-15arb；辅助气：5-30arb；毛细管温度：250-400℃。优选的步骤（3）所述离子化条件，参数设置为喷雾电压：-3000V；壳气：5arb；辅助气：20arb；毛细管温度：350℃。
步骤（3）所述SRM扫描，检测丹酚酸L离子对选自m/z537—295或537—493或537—185中的一种，碰撞能CE=5-40eV；检测迷迭香酸离子对选自：m/z359—161，碰撞能CE=5-30eV。优选的SRM扫描，检测丹酚酸L离子对选自：m/z537—295，CE=20eV；检测迷迭香酸离子对选自：m/z359—161，CE=19eV。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
一、实验目的：
本实验通过液质联用定量方法，建立一种专属性好，灵敏度高的丹酚酸L血药浓度测定方法，以满足口服给药下药动学数据测定的要求。
二、材料和方法：
（一）实验材料：
雄性Wistar大鼠5只（250-280g，北京维通利华），乙酸乙酯（分析纯，康科德），盐酸（分析纯，康科德），甲酸（色谱纯，天津科密欧），乙腈（色谱纯，德国Merck），高纯氮气（天津同利达），丹酚酸L（>98%，中药所提取）。
Thermo TSQ Quantum液质联用仪，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical2.1×150mm3.5-Micron色谱柱，Thermo Scientific高速离心机。
（二）实验方法
2.1样品测定方法：
2.1.1血浆样品预处理：
取大鼠血浆，200uL血浆，加入50uL1M盐酸和20uL内标（迷迭香酸），涡旋混合30s，加入3mL乙酸乙酯，涡旋4min，离心取乙酸乙酯层，30℃水浴氮气吹干。吹干后以100uL流动相（0.1%甲酸水：乙腈=7：3）复溶，涡旋3min，12000r/min离心3min，取上清进样20uL。
2.1.2测定条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical2.1×150mm3.5-Micron流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈。
洗脱条件：0-3.7min，A：B=70：30（v/v）等度洗脱，流速0.25mL/min。
质谱条件：负离子扫描，喷雾电压-3000V，壳气5arb，辅助气20arb，毛细管温度350℃。采用SRM检测模式，检测离子对：丹酚酸L m/z537—295，碰撞能（CE）=20eV，迷迭香酸m/z359—161，CE=19eV，碰撞气：1.5mTorr。
2.1.3测定结果：
用上述方法测定1-5号大鼠血样中的丹酚酸L含量所得结论见下表
表1
2.2、方法学验证
2.2.1专属性
分别取6只大鼠的空白血浆200μL，除不加内标外，按“2.1.1血浆样品预处理”项下操作，进样分析，获得空白血浆样品的色谱图；将一定浓度丹酚酸L的标准溶液及内标溶液加入空白血浆中，依同法操作得标准品的色谱图；取大鼠给药后的血浆样品，依同法操作，得大鼠血浆样品色谱图。在拟定的分析条件下，得到丹酚酸L色谱图(见图1A，图1B)。其中上，下两图分别表示空白血浆、对照品及样品的丹酚酸L色谱图。由图可见在本实验条件下，丹酚酸L与内标能完全分离，血浆中内源性物质不干扰丹酚酸L和内标化合物的检测，方法的专属性良好。图1A为空白血浆液质图谱，图1B为含标准品及内标空白血浆液质图谱。
2.2.2标准曲线和线性范围
取丹酚酸L标准溶液及大鼠空白血浆，按倍数稀释法制成不同浓度(5,10,20,50,100,200,500,1000,2000ng/mL)的丹酚酸L血浆样品，按“2.1.1”项处理后检测，进样分析，记录色谱图，以血浆中丹酚酸L的浓度(x)对丹酚酸L与内标的峰面积比值(y)进行加权(1/x2)最小二乘回归，得血浆中丹酚酸L的标准曲线方程为y=0.00206x-0.00072，r=0.998(图2)，线性范围5～2000ng/mL，定量下限为5ng/mL。图2血浆中丹酚酸L标准曲线
2.2.3精密度
取丹酚酸L标准溶液及大鼠空白血浆，配制不同浓度(50,200,500,2000ng/mL)的丹酚酸L血浆样品，每种浓度6个样本，连续测定3d，求得测定方法的精密度。结果见表1，上述方法测得的日内RSD均小于10.0%，日间RSD小于12.0%，符合生物分析方法指导原则的要求。
表2血浆中丹酚酸L含量测定精密度
2.2.4提取回收率
取丹酚酸L标准溶液及大鼠空白血浆，配制丹酚酸L由低到高4种浓度分别为：50，100,500,2000ng/mL，按“2.1.1”项下操作，进样分析，得丹酚酸L的峰面积。同时取另一组空白血浆，除丹酚酸L标准液挪至吹干前加入外按“2.1.1”项下操作，进样分析，获得相应峰面积。正常处理组的峰面积与后加丹酚酸L标准液获得的峰面积相比计算提取回收率，每个浓度进行6个样本分析。丹酚酸L浓度点提取回收率如表2所示。（表2数据说明，在此种样品处理方法下各浓度样品提取回收率在86%-91%之间，提取回收率较高，且比较接近，符合生物样品分析的要求）
表3血浆中丹酚酸L提取回收率
2.2.5常温放置稳定性
配制丹酚酸L由低到高4种浓度分别为：50,100,500,2000ng/mL的样品，每种浓度6个样本，常温放置12h后按样品测定方法进行分析，以考察样品经室温放置12h的稳定性。表3结果显示质量浓度变化均在85%～115%，RSD均小于9%，表明待测物的血浆样品在上述条件下均较稳定。
表4血浆中丹酚酸L常温放置12h稳定性
2.3该方法应用于丹酚酸L在大鼠体内药动学的实验
2.3.1动物实验
取5只雄性健康Wistar大鼠，实验前禁食12h，灌胃给予40mg/kg丹酚酸L。给药后按以下时间点取血：0’，5’，10’，20’，30’，45’，1h，1.5h，2h，4h，6h，8h，12h；每次取血0.5mL，离心取血浆，冻存于-20℃冰箱中待用。
2.3.2数据测定
将上述采集获得样品按照“2.1样品测定方法”项下方法进行处理和测定，获得各样品中丹酚酸L浓度数据如表5：
表5灌胃40mg/kg各大鼠血浆样品中丹酚酸L浓度（ug/mL）
获得该数据后，采用BAPP3.0药动学软件处理血药浓度-时间数据，得到丹酚酸L的药动学参数。
三、实验结果
(一)测定方法：
血浆样品前处理方法：
合适的血浆样品是本方法的关键之一。实验中我们曾经尝试比较了乙腈沉淀蛋白法，乙酸乙酯液液萃取法，固相小柱萃取法进行血浆样品的处理。结果表明乙腈沉淀蛋白法处理后的样品含有的干扰物质较多，导致测定结果不稳定；固相小柱萃取的方法干扰最少，但是提取回收率较低，不符合样品测定的要求；乙酸乙酯萃取法干扰相对较少，提取回收率较高。综合以上实验结果，选择了乙酸乙酯萃取法进行样品的前处理，并对此方法进行了优化。
该乙酸乙酯萃取方法的关键在于血浆样品的酸化步骤。实验中使用了50uL lmol/L的盐酸对血浆样品进行酸化处理，保证了血浆中丹酚酸L具有较高的提取回收率。不加酸或使用浓度较低的酸会导致提取回收率的降低和不稳定，使用过高浓度的酸则容易对血浆中丹酚酸L产生破坏。
样品测定方法：
合适的液相条件是本方法的关键之一。实验中考察了不同种类，不同比例流动相以及不同流速对样品测定的影响。实验发现，流动相A使用0.1％甲酸水溶液，可以保证丹酚酸L及内标迷迭香酸具有良好的色谱行为，使其峰形对称，不使用酸或使用浓度较低的酸会导致被测物峰形拖尾，使用浓度较高的酸则容易对被测物的质谱响应造成干扰。实验中流动相的比例A：B=70：30(v/v)，流速0.25mL/min，使得杂质与待测物获得分离，减少了杂质对测定的影响。
合适的质谱条件是本方法的关键之一。实验中对喷雾电压、壳气、辅助气、毛细管温度、定量离子对及其碰撞能等质谱参数均进行了优化。在正离子扫描下，丹酚酸L及迷迭香酸的响应均较低，在负离子扫描下响应值较高，并优化选择了喷雾电压-3000V。其它离子化参数：壳气5arb，辅助气20arb，毛细管温度350℃，保证了待测物离子最高的响应值，任意参数的改变都可能导致待测物离子响应值的降低。定量离子对的选择，保证了方法的专属性和灵敏度。
方法学
如上所述（图1，表1-4），方法学验证显示该方法专属性好；精密度：日内RSD小于10%，日间RSD小于12%；提取回收率：50，100，500，5000ng/mL浓度分别为（86.11±3.65），（90.88±2.26），（88.18±1.83），（87.20±0.93）%，RSD均小于5%；常温12h稳定性：50，100，500，5000ng/mL浓度分别为（110.14±9.33），（90.70±5.52），（98.11±6.14），（103.12±6.49）%，浓度变化均在85%～115%，RSD均小于9%。以上结果均符合生物样品含量测定的要求。
（二）药动学实验
经实验测定和BAPP3.0软件计算，丹酚酸L在大鼠体内药动学数据如下（表5）表5均为根据测定数据计算获得的丹酚酸L的药动学参数，Cmax：峰浓度；Tmax：达峰时间；t1/2：半衰期；MRT：平均驻留时间；AUC0-t：0-t时间的药时曲线下面积；AUC0-∞：0-∞时间的药时曲线下面积。表6数据显示：灌胃给药后丹酚酸L吸收较快，大于35min达到峰值。
表6丹酚酸L在大鼠体内药动学参数
本实验采用液质联用仪器，建立了一种新的丹酚酸L血药浓度测定方法，该方法专属性好，灵敏度高（5ng/mL），精密度、准确度、提取回收率和稳定性等均达到体内药物分析的要求。之后又利用该方法对丹酚酸L在大鼠体内的药动学特征进行了考察，药物半衰期（217.36±63.92）min，AUC0-τ（56.89±26.17）。
本发明的突出特点在于：
1.血浆前处理使用的盐酸；
2.内标迷迭香酸的使用；
3.前处理使用的乙酸乙酯或二氯甲烷；
4.流动相中添加甲酸以及水和乙腈的比例；
5.质谱的各项参数，离子对的选择。
附图说明
图1A空白血浆液质图谱
图1B含标准品及内标空白血浆液质图谱
图2血浆中丹酚酸L标准曲线
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
血浆样品预处理：
200uL血浆+50uL1M盐酸+20uL内标（迷迭香酸），涡旋混合30s，加入3mL乙酸乙酯，涡旋4min，离心取乙酸乙酯层，30℃水浴氮气吹干。吹干后以100uL流动相（0.1%甲酸水：乙腈=7：3）复溶，涡旋3min，12000r/min离心3min，取上清进样20uL。
测定条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical2.1×150mm3.5-Micron流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈。
洗脱条件：0-3.7min，A：B=70：30（v/v）等度洗脱，流速0.25mL/min。
质谱条件：负离子扫描，喷雾电压-3000V，壳气5arb，辅助气20arb，毛细管温度350℃。采用SRM检测模式，检测离子对：丹酚酸L m/z537—295，碰撞能（CE）=20eV，迷迭香酸m/z359—161，CE=19eV，碰撞气：1.5mTorr。
实施例2
血浆样品预处理：
200uL血浆+50uL0.01M盐酸+20uL内标（迷迭香酸），涡旋混合10s，加入1mL乙酸乙酯，涡旋1min，离心取乙酸乙酯层，10℃水浴氮气吹干。吹干后以100uL流动相复溶，涡旋3min，12000r/min离心1min，取上清进样20uL。
测定条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical2.1×150mm3.5-Micron流动相：A：0.02%甲酸水，B：乙腈。
洗脱条件：0-3.7min，A：B=30：70（v/v）等度洗脱，流速0.1mL/min。
质谱条件：负离子扫描，喷雾电压-2500V，壳气1arb，辅助气5arb，毛细管温度250℃。采用SRM检测模式，检测离子对：丹酚酸L m/z537—493，碰撞能（CE）=5eV，迷迭香酸m/z359—161，CE=5eV，碰撞气：1.5mTorr。
实施例3
血浆样品预处理：
200uL血浆+50uL5M硫酸+20uL内标（丹参素），涡旋混合3min，加入3mL石油醚，涡旋10min，离心取石油醚层，60℃水浴氮气吹干。吹干后以100uL流动相复溶，涡旋3min，15000r/min离心10min，取上清进样20uL。
测定条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8Analytical2.1×150mm3.5-Micron流动相：A：5%甲酸水，B：乙腈。
洗脱条件：0-3.7min，A：B=90：10（v/v）等度洗脱，流速0.4mL/min。
质谱条件：负离子扫描，喷雾电压-3500V，壳气15arb，辅助气30arb，毛细管温度400℃。采用SRM检测模式，检测离子对：丹酚酸L m/z537—185，碰撞能（CE）=40eV，丹参素m/z197—135，CE=30eV，碰撞气：1.5mTorr。
实施例4
血浆样品预处理：
200uL血浆+50uL0.1M硝酸+20uL内标（咖啡酸），涡旋混合30s，加入3mL1:1的二氯甲烷正己烷混合液，涡旋4min，离心取1:1的二氯甲烷正己烷混合液层，30℃水浴氮气吹干。吹干后以100uL流动相复溶，涡旋3min，12000r/min离心3min，取上清进样20uL。
测定条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical2.1×150mm3.5-Micron流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈。
洗脱条件：0-3.7min，A：B=50：50（v/v）等度洗脱，流速0.25mL/min。
质谱条件：负离子扫描，喷雾电压-3000V，壳气5arb，辅助气20arb，毛细管温度350℃。采用SRM检测模式，检测离子对：丹酚酸L m/z537—295，碰撞能（CE）=20eV，咖啡酸m/z179—135，CE=19eV，碰撞气：1.5mTorr。
实施例5
血浆样品预处理：
200uL血浆+50uL1M乙酸+20uL内标（阿魏酸），涡旋混合30s，加入5mL三氯甲烷，涡旋4min，离心取三氯甲烷层，30℃水浴氮气吹干。吹干后以100uL流动相（0.1%甲酸水：乙腈=7：3）复溶，涡旋3min，12000r/min离心3min，取上清进样20uL。
测定条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical2.1×150mm3.5-Micron流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈。
洗脱条件：0-3.7min，A：B=70：30（v/v）等度洗脱，流速0.25mL/min。
质谱条件：负离子扫描，喷雾电压-3000V，壳气5arb，辅助气20arb，毛细管温度350℃。采用SRM检测模式，检测离子对：丹酚酸L m/z537—295，碰撞能（CE）=20eV，阿魏酸m/z193—149，CE=19eV，碰撞气：1.5mTorr。
实施例6
血浆样品预处理：
200uL血浆+50uL1M三氟乙酸+20uL内标（丹酚酸A），涡旋混合30s，加入2mL正己烷，涡旋4min，离心取正己烷层，30℃水浴氮气吹干。吹干后以100uL流动相（0.1%甲酸水：乙腈=7：3）复溶，涡旋3min，12000r/min离心3min，取上清进样20uL。
测定条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical2.1×150mm3.5-Micron流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈。
洗脱条件：0-3.7min，A：B=70：30（v/v）等度洗脱，流速0.25mL/min。
质谱条件：负离子扫描，喷雾电压-3000V，壳气5arb，辅助气20arb，毛细管温度350℃。采用SRM检测模式，检测离子对：丹酚酸L m/z537—295，碰撞能（CE）=20eV，丹酚酸A m/z493—295，CE=19eV，碰撞气：1.5mTorr。
Claims (15)
1.一种测定血浆中丹酚酸L的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）样品处理：取血浆样品，加入酸溶液和内标溶液适量，混合；之后加入有机溶剂混合进行萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，在水浴下吹干，然后用液相流动相复溶后离心，取上清液进样测定；
（2）液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相硅胶色谱柱作为分离介质，进样后用固定比例流动相进行等度洗脱，使干扰物、待测物和内标获得初步分离；其中流动相A相选自选自甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氟乙酸水溶液或醋酸铵水溶液，B相选自乙腈或甲醇，A相占整个流动相的30-90%；
（3）质谱检测：液质联用仪的质谱部分按照设定的离子化条件，采用SRM扫描功能检测血浆样品中丹酚酸L和内标的含量。
2.权利要求1所述测定血浆中丹酚酸L的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入0.25倍体积酸溶液、内标溶液适量，涡旋混合10s-3min；之后加入有机萃取溶剂，涡旋混合1-10min；上述混合液在2000-6000r/min下离心1-10min后取有机溶剂层，在10-60℃水浴下氮气吹干，然后用0.5倍体积的流动相复溶，10000-15000r/min离心1-10min后取上清液进样测定；
（2）液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相C8或C18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后用固定比例流动相进行等度洗脱，流动相流速为0.1-0.4mL/min；流动相选自0.02-5%的甲酸水溶液和乙腈的组合或0.02-5%的甲酸水溶液和甲醇的组合，两种组合中甲酸水溶液的比例为30-90%；
（3）质谱检测：液质联用仪的质谱部分采用电喷雾离子化（ESI）离子源将液相洗脱液离子化，采用三重四级杆液质联用仪的SRM扫描功能检测血浆样品中丹酚酸L内标的含量。
3.权利要求1所述测定血浆中丹酚酸L的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入0.25倍体积酸溶液、0.1倍体积内标迷迭香酸溶液，涡旋混合30s；之后加入萃取用有机溶剂，涡旋混合3min；上述混合液在3500r/min下离心6min后取有机溶剂层，在30℃水浴下氮气吹干，然后用0.5倍体积的流动相复溶，12000r/min离心3min后取上清液进样测定；
（2）液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相C18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后用流动相进行洗脱，流动相流速为0.25mL/min；流动相A相为0.1%的甲酸水溶液，B相为乙腈，A相占流动相的百分比为70%；
（3）质谱检测：液质联用仪的质谱部分采用电喷雾离子化（ESI）离子源将液相洗脱液离子化，采用三重四级杆液质联用仪的SRM扫描功能检测血浆样品中丹酚酸L内标的含量。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，中步骤（1）所述的酸选自盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸所组成的组中的至少一种。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酸为0.01-5mol/L的盐酸水溶液或0.1-10%的甲酸水溶液或0.01-0.1%的磷酸水溶液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酸为1mol/L的盐酸水溶液。
7.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，中步骤（1）所述内标溶液选自丹参素、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B中的一种。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述内标溶液为迷迭香酸水溶液。
9.如权利要求1-3所述的方法，其特征在于，中步骤（1）所述机溶剂选自乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷所组成的组中的至少一种。
10.如权利要求9所述的方法，特征在于，所述有机溶剂为5-25倍血浆体积的乙酸乙酯或5-25倍血浆体积的二氯甲烷：正己烷=1：9-9：1或5-25倍血浆体积的三氯甲烷：正己烷=1：9-9：1。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述有机溶剂为15倍血浆体积的乙酸乙酯。
12.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述离子化条件，其特征在于离子化条件选用电喷雾离子化（ESI），其参数设置为喷雾电压：-2500—-3500V；壳气：1-15arb；辅助气：5-30arb；毛细管温度：250-400℃。
13.如权利要求1-3所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述离子化条件参数设置为喷雾电压：-3000V；壳气：5arb；辅助气：20arb；毛细管温度：350℃。
14.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）SRM扫描，检测丹酚酸L离子对选自m/z537—295或537—493或537—185中的一种，碰撞能CE=5-40eV；检测迷迭香酸离子对选自：m/z359—161，碰撞能CE=5-30eV。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤（3）SRM扫描，为检测丹酚酸L离子对选自：m/z537—295，CE=20eV；检测迷迭香酸离子对选自：m/z359—161，CE=19eV。
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