CN105806985A - 一种马钱子苷元生物样品的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种马钱子苷元生物样品的测定方法，属于医药技术领域。该方法采用超高效液相色谱法‑电喷雾离子化串联质谱法来检测马钱子苷元在生物样品中的浓度，其中生物样品采用甲醇作为沉淀溶剂；液相条件中流动相由0.1％的甲酸水和甲醇组成，梯度洗脱；环黄芪醇作为马钱子苷元生物样品测定的内标。本发明所建立的马钱子苷元生物样品LC‑MS‑MS测定法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药典2015年版以及SFDA2014年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品的分析要求。

Description

一种马钱子苷元生物样品的测定方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种马钱子苷元生物样品的测定方法。

背景技术

马钱子苷元是常用中药材山茱萸中主要成分马钱子苷的皂苷元，其相对分子质量为228，结构式如下所示：

马钱子苷元是马钱子苷发挥免疫调节、抗休克、抗过氧化脂质等作用的起效成份，具有显著的药理作用，同时也具有较大的毒性，临床治疗窗窄。开发马钱子苷元就需要有一种稳定可靠精密的检测方法，可以检测给药后生物体内微量马钱子苷元的动态变化，及时了解该药物的吸收、代谢情况。后期临床用药时也需要随时监测用药过程，根据体内暴露量调节剂量，以确保安全用药、有效用药。马钱子苷元水溶性良好，但其在生物样品中极不稳定。

目前对马钱子苷元体内药物含量检测方法报道的文献较少。所以，开发一种快速、准确、稳定的检测生物样品中马钱子苷元含量的方法尤为重要。因此，本专利对马钱子苷元生物样品测定方法的开发，对于解释马钱子苷元的体内过程指导新药开发以及指导临床合理用药是十分必要的一项工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马钱子苷元生物样品的测定方法，所述的方法包括确定一种大鼠皮下注射马钱子苷元后其血浆中的马钱子苷元浓度的方法。

本发明的马钱子苷元生物样品的测定方法，其包括采用超高效液相色谱法-电喷雾离子化串联质谱法即UPLC-MS-MS法来检测马钱子苷元在生物样品中的浓度。

所述的马钱子苷元生物样品的测定方法中血浆、血清、尿液等液体组织样品与甲酸生理盐水等体积混合后离心；脏器、粪便等固体组织取样后立即用相应体积的0.3％甲酸生理盐水研磨；样品测定前预处理采用有机溶剂沉淀法；甲醇作为沉淀溶剂；液相条件中流动相由0.1％甲酸水和甲醇组成，梯度洗脱；环黄芪醇作为马钱子苷元生物样品测定的内标。

本发明所述的马钱子苷元生物样品的测定方法，其具体包括如下步骤：

1)生物样品处理：血浆、血清、尿液等液体组织取出后立即与等体积0.3％甲酸生理盐水混合，脏器、粪便等固体组织取样后立即用相应体积的0.3％甲酸生理盐水研磨，4000rpm离心10min，取上层澄清液体作为待测液；

2)测定前预处理：取50μL待测生物样品，加入10μL内标工作液和140μL甲醇，涡旋混匀，10000r/min离心10min，取上清液，进样3μL进行LC-MS分析；

3)马钱子苷元采用超高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高通量测定方法：取上述待测液3μL进行LC-MS分析，其中液相条系统条件为流动相：A相为0.1％甲酸水，B相为甲醇，梯度洗脱；0-1min 20％B，1-2min 20％～95％B，2-3min 95％B，3-3.5min 95％～20％B；色谱柱为Thermo Hypersil GOLD 50*2.1；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；样品盘温度：20℃；进样量：3μL；

质谱系统条件为：离子源：H-ESI；喷射电压：3500V；鞘气：30Arb；辅助气：8Arb尾吹气：0Arb离子传输毛细管温度：325℃气化温度：50℃；

4)马钱子苷元标准曲线的确定：取大鼠空白生物组织45μL，加入系列混合标准溶液5μL，配制成相当于马钱子苷元浓度为8000，4000，800，200，40，8，4ng·mL^-1的模拟生物组织样品，按步骤2)所述的测定方法操作，每一浓度进行双样本分析，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法进行回归分析，确定马钱子苷元的生物样品标准曲线及其定量限；所述的内标物为环黄芪醇；

5)大鼠皮下注射马钱子苷元药代动力学试验：将大鼠随机分为1组和2组，其中1组静脉注射马钱子苷元溶液，2组皮下注射给予马钱子苷元溶液，静脉给药和皮下给药后一段时间后取样0.2ml，按照步骤1)中的血液样品处理、步骤2)测定前预处理和步骤3)中的超高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高通量测定方法以及步骤4)中所获得马钱子苷元标准曲线计算确定不同取样时间的血浆中马钱子苷元的浓度，并利用DAS软件确定马钱子苷元的体内药代动力学参数。

药物在生物样品处理过程中的稳定性是样品处理过程的关键。马钱子苷元在生物样品中的稳定性极差，加入到大鼠血液内5分钟后即降解30％；加甲酸能增加其稳定性。因此，我们在生物样品采出后立即与相应体积0.3％甲酸生理盐水混合，保证在样品处理过程中马钱子苷元不显著降解。申请人还在大鼠皮下注射马钱子苷元药代动力学试验中考察了直接将甲酸加到血液中对马钱子苷元稳定性的影响，但是高浓度甲酸加入后，会造成血液溶血和凝固，不利于血浆的离出，因此，本发明采用0.3％甲酸生理盐水作为马钱子苷元生物样品的稳定剂。

血浆样品的处理是LC-MS/MS法测定获得高灵敏度的关键过程。常见的血浆样品处理方法包括蛋白沉淀法、固相萃取法和液-液萃取法。本方法采用操作相对简单，耗时又少的蛋白沉淀法去除血浆样品基质干扰；沉淀溶剂考察了甲醇和乙腈，由于乙腈沉淀后进样峰形不好，因此，本发明采用甲醇为沉淀溶剂。

液相条件中流动相由0.1％甲酸水甲醇组成，梯度洗脱，申请人发现，加入甲酸可以促进被分析物的离子化，提高检测的灵敏度。采用C18 50mm短柱进行分析，单个样品的分析时间仅为3.8min，大大增加了分析通量，提高了分析速度，有利于大批量样品的快速分析，本方法亦可用于临床快速监测患者的血药浓度。

母离子/子离子离子对的选择是建立本发明中检测方法的关键。样品直接以恒定流速由微量注射泵流入质谱仪时，正离子模式一级全扫描可见明显的[M+H]⁺母离子峰，m/z为229.1，二级碎片离子峰度最大的为m/z为179.104。改变电压和鞘气的大小可明显影响峰强度；通过优化，确定本方法最优的电离电压为3500v，鞘气为30Arb。

内标的选择对于检测的灵敏度和特异性至关重要，理想的内标应为同位素标记物或结构类似物。申请人在工作开展中发现，环黄芪醇的LC-MS/MS检出条件与马钱子苷元类似，并且预试验发现两者在此条件下出峰时间相近、无相互干扰、峰形均好，因此本方法确定将环黄芪醇作为马钱子苷元生物样品测定的内标。

本发明所建立的马钱子苷元生物样品LC-MS-MS测定法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药典2015年版以及SFDA 2014年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品的分析要求。

附图说明

图1大鼠空白血浆样品色谱图

图2大鼠空白血浆加药样品色谱图

图3大鼠皮下注射马钱子苷元5min血浆样品色谱图

注：通道I为马钱子苷元峰，通道II为环黄芪醇峰

具体实施方式

为了使本领域技术人员更清楚地了解本发明，申请人对本发明所述马钱子苷元生物样品的测定方法进一步描述如下，其中检测方法的方法学考查以大鼠血浆为例，具体实施以大鼠皮下注射马钱子苷元药代动力学实验为例，但本领域技术人员应能知晓，所述的进一步阐述和举例并不以任何方式限定本发明的专利保护范围。

实施例1 本发明检测方法的方法学考察

一、标准溶液的制备

(1)标准系列溶液的配制

精密称定马钱子苷元适量，置于10mL量瓶中，0.1％甲酸水溶解并稀释至刻度，获得浓度为1.0mg/L的标准储备液。精密量取适量标准储备液，用0.1％甲酸水梯度稀释，配制浓度分别为80.0，40.0，8.00，2.00，0.400，0.0800，0.0400μg·mL^-1的标准系列溶液。

(2)内标溶液的配制

精密称定环黄芪醇对照品适量，置于10mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，获得浓度为1.0mg·mL^-1的储备液。精密量取储备液0.1mL，置于100mL量瓶中50％甲醇水稀释并定容至刻度，获得浓度为1.00μg·mL^-1的内标溶液。

(3)标准质控溶液的配制

精密称定马钱子苷元适量，置于10mL量瓶中，0.1％甲酸水溶解并稀释至刻度，获得浓度为1.0mg/L的标准质控储备液。精密量取适量标准质控储备液，用0.1％甲酸水梯度稀释，配制浓度分别为40.0，2.00，0.0800μg·mL^-1的标准质控工作液。

各储备液及标准系列溶液置4℃冰箱保存备用。

二、分析方法的确证

(1)方法的专属性

大鼠空白血浆50μL，除用10μL流动相代替内标溶液外，其余按“血浆样品预处理”项下方法操作，获得空白样品的色谱图(图1)；将一定浓度的马钱子苷元对照品溶液和内标溶液加入空白血浆中，依法操作，获得相应的色谱图(图2)，取大鼠皮下注射马钱子苷元后的血浆样品，同法操作，得色谱图(图3)。其中马钱子苷元的保留时间为2.35min，内标环黄芪醇的保留时间为3.09min；结果表明，血浆中内源性物质不干扰测定。

(2)标准曲线和线性范围

取大鼠空白血浆45μL，加入系列混合标准溶液5μL，配制成相当于马钱子苷元血浆浓度为8000，4000，800，200，40，8，4ng·mL^-1的模拟血浆样品，按“血浆样品预处理”项下操作，每一浓度进行双样本分析，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法进行回归分析。典型大鼠血浆样品标准曲线为Y＝0.102958+0.00276888*X，r＝0.9982；定量下限(LLOQ)为4ng·mL^-1。

(3)精密度和准确度

取大鼠空白血浆45μL，按照“标准血浆样品的配制”项下方法，配制低(0.0800mg/L)、中(2.00mg/L)、高(40.0mg/L)三个浓度的质量控制(QC)样品。按“血浆样品预处理”项下操作，每一浓度进行6样本分析，连续测定3天，随行标准曲线。根据当日标准曲线计算QC样品的浓度，结果进行方差分析，求得方法的精密度RSD和准确度RE，两个被测组分的日间RSD≤11％，日内RSD≤12％，RE在-6.6％～4.6％之间，

(5)基质效应

使用6个不同来源的大鼠空白血浆，配制低(0.00800mg/L)、中(0.200mg/L)、高(4.00mg/L)三个浓度水平进行基质效应考察。

样品A：取45μL流动相，5μL马钱子苷元质控工作液(0.800、2.00、.40.0mg/L)，10μL环黄芪醇(1.00μg/L)内标工作液和140μL甲醇，10000r/min离心10min，进样3μL进行LC-MS/MS分析。记录马钱子苷元和内标环黄芪醇的色谱峰面积。

样品B：45μL空白大鼠血浆，加入140μL甲醇，涡旋沉淀蛋白，5μL马钱子苷元质控工作液(0.800、2.00、.40.0mg/L)，10μL环黄芪醇(1.00μg/L)内标工作液和140μL甲醇，10000r/min离心10min，取5μL进行LC-MS/MS分析。记录马钱子苷元和内标环黄芪醇的色谱峰面积。

样品B测得的峰面积与相应浓度的样品A测得的峰面积比即为马钱子苷元和内标环黄芪醇的基质效应。

结果表明待测物马钱子苷元在低、中、高三个QC浓度水平上的基质效应分别为99.7％、93.3％、88.1％；内标环黄芪醇的基质效应为101％。因此在本试验选择的色谱和质谱条件下，可忽略基质效应对马钱子苷元及环黄芪醇测定的影响。

(6)提取回收率

样品C：按照“标准血浆样品的配制”项下配制高、中、低浓度水平的质控样品，采用“血浆样品预处理”的方法进行血浆样品处理，进行LC-MS/MS分析，记录马钱子苷元和内标环黄芪醇的色谱峰面积。

样品C测得的峰面积与相应浓度的样品B测得的峰面积比即为马钱子苷元和内标的提取回收率。

结果表明低、中、高三浓度的回收率分别为103％，100％和105％。内标回收率以同法测定结果为101％。

(7)样品稳定性

本专利考察了未处理的血浆样品室温放置4h的稳定性，血浆样品经历3次冷冻-解冻循环的稳定性，处理后的血浆样品室温放置24h内的稳定性。每一项稳定性考察时，按“标准曲线和线性范围”项下配制低、中、高三个浓度的QC样品，每一浓度进行3样本分析，照“血浆样品的预处理”项下操作，测得样品浓度，计算相对误差(RE％)。结果表明处理后的血浆样品室温放置24h内稳定，未处理的血浆样品室温放置4h稳定，血浆样品经历3次冷冻-融化循环后稳定。

(8)血浆样品预处理

取50μL含药血浆，加入10μL内标工作液和140μL甲醇，涡旋混匀，10000r/min离心10min，取上清液，进样3μL进行LC-MS分析。

实施例2 马钱子苷元溶液大鼠药代动力学预试验试验方法

取体重约300g的SD大鼠8只，分为2组，每组4只，其中1组静脉注射马钱子苷元溶液，剂量为20mg/kg，另外1组灌胃马钱子苷元溶液，剂量为20mg/kg。给药当天称量体重，根据体重精确计算给药剂量及相应体积。各组大鼠于给药前锁骨下静脉取空白血。静脉给药后0.0167、0.0833、0.167、0.333、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4h取血0.2ml；皮下注射组于给药后0.0833、0.167、0.333、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4h取血0.2ml，血液取出后立即与等体积0.3％甲酸生理盐水混合，4000rpm离心10min，取上层澄清血浆，迅速贮存于-20℃冰箱中待测定。

测定大鼠血浆中马钱子苷元采用超高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高通量测定方法。具体为：

1.实验药品及仪器

1.1标准品与试剂

马钱子苷元对照品，山东新时代药业有限公司生产，批号：140210，含量97％，环黄芪醇对照品：内标，山东新时代药业有限公司，批号：141001，含量95％，甲醇：HPLC级，merk；甲酸：HPCL级，ROE SCIENTIFIC INC.。

1.2仪器

分析天平：BT125D，Sartorius，Germany；高速离心机：SIGMA 3K15，Sigma；LC-MS/MS仪器组成：Waters Acquity UPLC/Thermo TSQ Endura MS串联三重四级杆质谱仪；工作站：Xcalibur；

1.3实验动物

SD大鼠来源于北京维通利华实验动物技术有限公司。

2.仪器方法

2.1液相系统条件

流动相：A相为0.1％甲酸水，B相为甲醇，梯度洗脱；0-1min 20％B，1-2min 20％～95％B，2-3min 95％B，3-3.5min 95％～20％B。色谱柱：Thermo Hypersil GOLD 50*2.1；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；样品盘温度：20℃；进样量：3μL

2.2质谱系统条件

采用选择反应检测(SRM)、正离子模式扫描，内标物为环黄芪醇。所用的离子对和碰撞反应条件如下表1：

表1.马钱子苷元和环黄芪醇的离子对和碰撞反应条件

离子源：H-ESI；喷射电压：3500V；鞘气：30Arb；辅助气：8Arb；尾吹气：0Arb；离子传输毛细管温度：325℃；气化温度：50℃。

2、实验结果：

(1)大鼠静脉注射马钱子苷元的药代动力学分析：大鼠尾静脉注射马钱子苷元溶液后马钱子苷元在血浆中消除迅速，消除半衰期为0.153h，清除率为20.0L/h/kg，表观分布容积为4.29L/kg利用DAS软件模拟马钱子苷元在大鼠体内的房室模型特征，结果表明马钱子苷元在体内呈二室房室模型特征，具体见表2。

表2.大鼠静脉注射马钱子苷元的非房室模型药代动力学参数

(2)大鼠皮下注射马钱子苷元的非房室模型药代动力学分析：本项目建立的马钱子苷元血药浓度测定方法学的定量限为4.0ng/ml，最低检测浓度小于Cmax的1/500(中国药典2015版要求至少检测到Cmax的1/10到1/20)，梯形法计算的AUC(0-∞)占AUC(0-t)达95％以上(中国药典2015版要求至少达80％以上)，从而保证了马钱子苷元皮下注射完整血药浓度曲线的获取，在此基础上提取的药动学参数精确可靠。

马钱子苷元皮下注射后吸收非常迅速，于10min即达峰浓；皮下注射后绝对生物利用度80％以上。马钱子苷元大鼠皮下注射后吸收程度和吸收速度的个体差异均较小，AUC和Cmax的相对标准偏差(RSD)分别为9.45％和2.69％，具体见表3。

表3.马钱子苷元大鼠皮下注射马钱子苷元的非房室模型药代动力学参数

参数	单位	No1	No2	No3	No4	Mean	SD	RSD/％
									AUC(0-t)	ug/L*h	748.72	919.80	836.70	768.84	818.52	77.31	9.45
AUC(0-∞)	ug/L*h	752.94	920.13	837.85	769.98	820.22	76.03	9.27
									AUMC(0-t)		162.30	210.05	178.80	160.94	178.02	22.84	12.8
t1/2z	h	0.133	0.074	0.096	0.098	0.1	0.024	24
									Tmax	h	0.167	0.167	0.167	0.167	0.167	0	0
CLz/F	L/h/kg	26.6	21.7	23.9	26.0	24.5	2.20	8.95
									Cmax	ug/L	2848	2921	3001	2830	2900	77.987	2.69

Claims (10)

1.一种马钱子苷元生物样品的测定方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)生物样品处理：生物样品采集后，立即与甲酸生理盐水混合，离心，取混合离心后的上层澄清液体作为待测液。在待测液中加入内标、甲醇，涡旋后离心，取上清液进行LC-MS/MS分析。所述的内标为环黄芪醇。

(2)采用超高效液相色谱法-电喷雾离子化串联质谱(LC-MS/MS)法检测马钱子苷元在生物样品中的浓度：

所用的液相系统条件为；流动相为0.1％甲酸水和甲醇，梯度洗脱；质谱系统采用ESI源，正离子扫描模式。

2.如权利要求1所述的马钱子苷元生物样品的测定方法，其特征在于，生物样品处理中的生物样品包括血液、尿液、胆汁、脏器、粪便。

3.如权利要求2所述的马钱子苷元生物样品的测定方法，其特征在于，血液、尿液、胆汁采集后与等体积甲酸生理盐水混合，离心后取上层澄清液体作为待测液；脏器、粪便取样后立即用甲酸生理盐水研磨，离心后取上层澄清液体作为待测液。

4.如权利要求3所述的马钱子苷元生物样品的测定方法，其特征在于，所述的甲酸生理盐水浓度为0.3％(v/v)。

5.如权利要求1所述的马钱子苷元生物样品的测定方法，其特征在于，生物样品处理时取50μL待测液，加入10μL内标工作液和140μL甲醇沉淀液，涡旋混匀，10000r/min离心10min，取上清液，进样3μL进行LC-MS分析。

6.如权利要求5所述的马钱子苷元生物样品的测定方法，其特征在于，所述的内标工作液为1.0μg/mL的环黄芪醇甲醇溶液。

7.如权利要求1所述的马钱子苷元生物样品的测定方法，其特征在于，LC-MS/MS法中液相条系统条件为流动相：A相为0.1％甲酸水，B相为甲醇，梯度洗脱；0-1min 20％B，1-2min20％～95％B，2-3min 95％B，3-3.5min 95％～20％B。

8.如权利要求1所述的马钱子苷元生物样品的测定方法，其特征在于，LC-MS/MS法中液相条系统条件为色谱柱为Thermo Hypersil GOLD 50*2.1；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；样品盘温度：20℃；进样量：3μL。

9.如权利要求1所述的马钱子苷元生物样品的测定方法，其特征在于，LC-MS/MS法中质谱系统条件为：离子源：H-ESI；喷射电压：3500V；鞘气：30Arb；辅助气：8Arb；尾吹气：0Arb；离子传输毛细管温度：325℃；气化温度：50℃。

10.如权利要求1所述的马钱子苷元生物样品的测定方法，其特征在于，马钱子苷元的m/z母离子→子离子为229.1→179.104，碰撞能为11v，RF lens为109v；内标环黄芪醇的m/z母离子→子离子为491.4→143.2，碰撞能为9v，RF lens为105v。