CN115201360A - 血、尿中氟乙酸的离子色谱串联三重四极杆质谱检测方法 - Google Patents
血、尿中氟乙酸的离子色谱串联三重四极杆质谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种血、尿中氟乙酸的离子色谱串联三重四极杆质谱检测方法，包括(1)标准工作溶液配制；(2)样品提取液的制备与净化；(3)样品检测等步骤；利用梯度浓度的氟乙酸标准工作溶液建立氟乙酸标准溶液工作曲线，根据已建立的标准工作曲线和样品提取液的检测数据进行定量计算，得到血液、尿液样品中氟乙酸的浓度。本发明具有前处理无需衍生化，简便高效，检测灵敏度高的特点，能够对血液、尿液中的氟乙酸准确定性和定量分析的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及毒物检测领域，涉及离子色谱串联三重四极杆质谱仪器分析方法，尤其涉及一种血、尿中氟乙酸的离子色谱串联三重四极杆质谱检测方法。
背景技术
氟乙酸是一种用于杀灭啮齿类动物的强极性毒物，主要用于灭鼠工作，对动物和人体均有剧毒，大鼠经口半数致死量为0.22mg/kg。研究表明，氟乙酸被人体摄入后会严重损害神经细胞和心脏等组织，造成心脏骤停或呼吸衰竭而死亡。因氟乙酸毒性强，又具有二次毒性，1982年被我国禁止生产、销售和使用。
目前，检测氟乙酸的方法有：气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法和离子色谱法等。其中，气相色谱-质谱法需利用五氟苄基溴衍生化，并进行氮吹等复杂的前处理操作；使用液相色谱-质谱法检测氟乙酸时，由于该物质极性强，在采用C18等反相色谱柱分离前须衍生化以降低极性；而离子色谱虽然可以较好地分离氟乙酸，但定性能力弱，灵敏度有待提高。
以三重四极杆质谱取代离子色谱的电导检测器，既能结合离子色谱高效分离极性物质的特点，又能发挥质谱准确定性的优势，避免离子色谱检测“假阳性”的现象。因此，可以针对性开发通过离子色谱串联三重四极杆质谱完成氟乙酸的检测方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种血、尿中氟乙酸的离子色谱串联三重四极杆质谱检测方法，利用梯度浓度的氟乙酸标准工作溶液建立氟乙酸标准溶液工作曲线，根据已建立的标准工作曲线和样品提取液的检测数据进行定量计算，得到血液、尿液样品中氟乙酸的浓度。本发明具有前处理无需衍生化，简便高效，检测灵敏度高的特点，能够对血液、尿液中的氟乙酸准确定性和定量分析的有益效果。
技术方案：本发明的血、尿中氟乙酸的离子色谱串联三重四极杆质谱检测方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)标准工作溶液配制：配制一系列浓度的氟乙酸标准工作溶液，氟乙酸标准工作溶液的浓度分别为0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、20μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L；
(2)样品提取液的制备与净化：
方法一：在血液或者尿液样品中加入乙腈和去离子水，振荡后离心，萃取得到上清液；将萃取得到的上清液依次流过Dionex OnGuardⅡRP固相萃取柱和0.22±0.01μm水相滤膜，稀释50±2倍后得到样品提取液；优选的，采用0.22μm水相滤膜，稀释50倍；
方法二：开启快速溶剂萃取仪，滤纸填入萃取池，在萃取池底部加入2g硅藻土，取1mL血液或尿液滴入后，在上层填入若干硅藻土；以去离子水为溶剂，设置萃取温度120℃，置换率60％，加热6min，静态萃取5min，氮气吹扫100s，循环次数2次；取上清液2mL于Ultra-4超滤管中离心，离心后的滤液过0.22±0.01μm水相滤膜并稀释 50±2倍，得到样品提取液；优选的，采用0.22μm水相滤膜，稀释50倍；
(3)样品检测：采用离子色谱串联三重四极杆仪分别检测步骤(1)获得的氟乙酸标准工作溶液和步骤(2)获得的血液或者尿液的样品提取液；根据氟乙酸标准工作溶液测得的氟乙酸离子对数据定性检测样品中的氟乙酸；以标准工作溶液中氟乙酸的浓度为横坐标，以标准工作溶液中氟乙酸的定量离子对的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，然后根据标准工作曲线和样品提取液的检测数据进行定量计算，获得检测结果。
其中，所述的步骤(2)中血液或者尿液样品、乙腈、去离子水的体积比为 0.5:1±0.1:8.5±0.2；萃取时，采用RP固相萃取柱，活化过程为依次使用5±0.5mL甲醇和 10±0.5mL去离子水以4±0.1mL/min流速淋洗，然后平放静置20±1min；离心的速率为 7800±100r/min，时间为8±1min。优选的，血液或者尿液样品、乙腈、去离子水的体积比为0.5:1:8.5，活化过程为依次使用5mL甲醇和10mL去离子水以4mL/min流速淋洗，然后平放静置20min；离心的速率为7800r/min，时间为8min。
其中，所述的步骤(2)中快速溶剂萃取仪进样前手动冲洗两次；收集提取液后将收集瓶静置10min；Ultra-4超滤管离心的速率为7800±100r/min，时间为8±1min。优选的，Ultra-4超滤管离心的速率为7800r/min，时间为8min。
其中，所述的步骤(3)中离子色谱串联三重四极杆的检测条件如下：离子色谱条件：色谱柱：Dionex IonPac AS20；保护柱：Dionex IonPac AG20；抑制器：ADRS-600；淋洗液：氢氧化钾溶液；淋洗液浓度：15mmol/L；进样量：100μL；流速：0.25mL/min；柱温：30℃。
其中，所述的步骤(3)中离子色谱串联三重四极杆的检测条件如下：质谱条件：离子源：电喷雾电离源，负离子模式；检测模式：多反应监测MRM；气帘气压力：241.3kPa；碰撞气强度：Medium；离子化电压：4500V；离子源温度：600℃；喷雾气压：379.2kPa；辅助加热气压：379.2kPa。
检测时采用多反映监测模式，氟乙酸的离子对信息如下：母离子的荷质比为77m/z；子离子的荷质比为57m/z，碰撞能为-15eV，去簇电压为-20V；子离子的荷质比为33，碰撞能为-24eV，去簇电压为-20V。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
1、本发明前处理方法一以乙腈和水为提取溶剂，使用RP固相萃取柱和水相滤膜净化，无需衍生化，前处理便捷高效。
2、本发明前处理方法二以水为提取溶剂，使用快速溶剂萃取仪在高温条件下充分沉淀样品中的蛋白质，无需衍生化、节省有机溶剂、自动化程度高，操作更便捷。
3、本发明采用Dionex IonPac AS20色谱柱直接分离氟乙酸和样品基质中的杂质离子，氟乙酸在色谱柱上的保留效果好，且样品基质中的杂质离子能够得到分离。
4、本发明利用质谱检测，具有灵敏度高、检出限低、不易受无机阴离子干扰的优点。根据此特点，高倍数地稀释净化过的样品提取液，既能实现血液、尿液中氟乙酸的准确检测，又能大幅降低血液、尿液中氯离子的浓度以避免污染仪器，同时省去Ag/H 固相萃取柱去除氯离子的前处理操作。
5、现有的血液、尿液等生物检材中氟乙酸的检测方法尚有欠缺，而各类刑事案件中频见氟乙酸类毒物，本发明弥补了现有检测方法的不足。
附图说明
图1为本发明的200μg/L的氟乙酸标准工作溶液总离子流图；
图2为本发明的检测标准工作曲线；
图3为本发明的血液空白样品中(方法一提取)添加200μg/L氟乙酸的定量离子对提取离子图；
图4为本发明的尿液空白样品中(方法一提取)添加200μg/L氟乙酸的定量离子对提取离子图；
图5为本发明的血液空白样品中(方法二提取)添加200μg/L氟乙酸的定量离子对提取离子图；
图6为本发明的尿液空白样品中(方法二提取)添加200μg/L氟乙酸的定量离子对提取离子图；
图7为本发明的实施例2中血液样品(方法一提取)的氟乙酸检出情况；
图8为本发明的实施例2中尿液样品(方法一提取)的氟乙酸检出情况；
图9为本发明的实施例2中血液样品(方法二提取)的氟乙酸检出情况；
图10为本发明的实施例2中尿液样品(方法二提取)的氟乙酸检出情况。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1：
本实施例的血、尿中氟乙酸的离子色谱串联三重四极杆质谱检测方法，具体如下：
一、前处理方法优化
血液、尿液基质中存在大量蛋白质和氯离子等干扰物质，需净化处理后才能进行仪器分析。本发明考察了分散固相萃取、乙腈沉淀蛋白和快速溶剂萃取3种前处理方法，以净化前后的峰面积比值作为提取回收率对比3种前处理方法，结果表明：分散固相萃取操作较为复杂，且提取回收率低于80％；乙腈沉淀蛋白提取回收率较高、操作简便，高倍数稀释后能够有效避免氯离子等杂质离子对仪器的污染；快速溶剂萃取的回收率高、自动化程度高、节省有机溶剂，能够利用高温环境使蛋白质充分变性和沉淀。最终确定采用乙腈沉淀蛋白和快速溶剂萃取两种前处理方法。
二、离子色谱条件优化
分别考察Dionex IonPac AS11、AS19和AS20离子色谱柱，结果表明：AS11色谱柱无法分离氟乙酸，AS19得到的氟乙酸峰型较差且分离效果弱于AS20色谱柱，而AS20 色谱柱既能高效地分离氟乙酸，又能得到较好的色谱峰，因此选用AS20色谱柱分离氟乙酸。此外，本发明对柱温、淋洗模式和淋洗液浓度进行了考察，确定了最优离子色谱条件。
三、质谱条件优化
使用1:1甲醇水配制200μg/L的氟乙酸工作溶液，采用流动注射方式进样，在电喷雾负离子模式下确定氟乙酸的质谱条件。Q1模式扫描得到氟乙酸的母离子为m/z77， MS2模式扫描得到子离子m/z57和m/z33，MRM模式优化母离子和子离子的碰撞能和去簇电压。综合考虑信噪比和碎片离子响应，选择子离子m/z57为定量离子对：
四、实验操作
(1)标准工作溶液配制：配制一系列浓度的氟乙酸标准工作溶液，所述氟乙酸标准工作溶液的浓度分别为0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、20μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L。
(2)样品制备与净化：
方法一：分别取0.5mL血液、尿液样品于离心管中，依次加入1mL乙腈和8.5mL 去离子水，然后振荡混匀，离心(7800r/min)8分钟，取上清液。按如下步骤活化RP 固相萃取柱：依次使用5mL甲醇和10mL去离子水以4mL/min流速淋洗，然后平放静置20min。使用注射器在RP固相萃取柱中注入步骤(2)取得的上清液，弃去前3mL 废液后收集流出液，并经0.22μm水相滤膜过滤，稀释50倍后得到待测样品溶液供仪器分析。
方法二：开启快速溶剂萃取仪，滤纸填入萃取池，在萃取池底部加入2g硅藻土，取1mL血液或尿液滴入后，在上层填入少量硅藻土。以去离子水为溶剂，设置萃取温度120℃，置换率60％，加热6min，静态萃取5min，氮气吹扫100s，循环次数2次。收集瓶静置10min，取上清液2mL于Ultra-4超滤管中离心8min，转速7800r/min。离心后的滤液过0.22水相滤膜并稀释50倍，得到样品提取液。
(4)样品检测：采用离子色谱串联三重四极杆仪分别检测步骤(1)中的氟乙酸标准工作溶液和步骤(3)中的血液、尿液的样品提取液；根据氟乙酸标准工作溶液测得的氟乙酸离子对数据定性检测样品中的氟乙酸；以标准工作溶液中氟乙酸的浓度为横坐标，以标准工作溶液中氟乙酸的定量离子对峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，然后根据标准工作曲线和样品提取液的检测数据进行定量计算。结果表明，氟乙酸在 0.5μg/L～500μg/L范围内线性关系良好，相关系数大于0.999，线性方程为： Y＝13812.63X–430.87，结果见附图2；以信噪比(S/N)≥3计算检出限为0.14μg/L，信噪比(S/N)≥10计算定量限为0.47μg/L。
本发明选定10μg/L、50μg/L、200μg/L这3种不同添加浓度，连续六天每种浓度测定六次，获得添加后的样品提取液回收率和精密度数据。结果表明，3种添加浓度下，前处理方法一得到血液和尿液中的氟乙酸回收率均在95.2％～107.7％，相对标准偏差在1.6％～9.2％范围内；前处理方法二得到血液和尿液中的氟乙酸回收率均在93.4％～98.4％，相对标准偏差在2.3％～6.9％范围内。故本发明的可重复性强、精密度高，符合实际案件中氟乙酸检测的要求。
实施例2：
使用本发明确定的氟乙酸前处理方法一和检测方法，测定某疑似氟乙酸中毒案件中提取的血液和尿液检材，检测结果见附图7、附图8，由图可知血液和尿液中均检出氟乙酸，血液和尿液中氟乙酸的含量分别为：7.5μg/L、6.6μg/L；使用本发明确定的氟乙酸前处理方法二和检测方法，测定同上血液和尿液检材，检测结果见附图9、附图10，由图可知血液和尿液中均检出氟乙酸，血液和尿液中氟乙酸的含量分别为：7.8μg/L、 6.9μg/L，满足实际案件中氟乙酸检测的要求。相比现有技术，本发明检测方法具有前处理无需衍生化，简便高效，检测灵敏度高的特点，能够对血液、尿液中的氟乙酸准确定性和定量分析的有益效果。
Claims (6)
1.血、尿中氟乙酸的离子色谱串联三重四极杆质谱检测方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)标准工作溶液配制：配制一系列浓度的氟乙酸标准工作溶液，氟乙酸标准工作溶液的浓度分别为0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、20μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L；
(2)样品提取液的制备与净化：
在血液或者尿液样品中加入乙腈和去离子水，振荡后离心，萃取得到上清液；将萃取得到的上清液依次流过Dionex OnGuard Ⅱ RP固相萃取柱和0.22±0.01μm水相滤膜，稀释50±2倍后得到样品提取液；
或者，开启快速溶剂萃取仪，滤纸填入萃取池，在萃取池底部加入2g硅藻土，取1mL血液或尿液滴入后，在上层填入若干硅藻土；以去离子水为溶剂，设置萃取温度120℃，置换率60％，加热6min，静态萃取5min，氮气吹扫100s，循环次数2次；取上清液2mL于Ultra-4超滤管中离心，离心后的滤液过0.22±0.01μm水相滤膜并稀释50±2倍，得到样品提取液；
(3)样品检测：采用离子色谱串联三重四极杆仪分别检测步骤(1)获得的氟乙酸标准工作溶液和步骤(2)获得的血液或者尿液的样品提取液；根据氟乙酸标准工作溶液测得的氟乙酸离子对数据定性检测样品中的氟乙酸；以标准工作溶液中氟乙酸的浓度为横坐标，以标准工作溶液中氟乙酸的定量离子对的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，然后根据标准工作曲线和样品提取液的检测数据进行定量计算，获得检测结果。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤(2)中血液或者尿液样品、乙腈、去离子水的体积比为0.5:1±0.1:8.5±0.2；萃取时，采用RP固相萃取柱，活化过程为依次使用5±0.5mL甲醇和10±0.5mL去离子水以4±0.1mL/min流速淋洗，然后平放静置20±1min；离心的速率为7800±100r/min，时间为8±1min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤(2)中快速溶剂萃取仪进样前手动冲洗两次；收集提取液后将收集瓶静置10min；Ultra-4超滤管离心的速率为7800±100r/min，时间为8±1min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)中离子色谱串联三重四极杆的检测条件如下：离子色谱条件：色谱柱：Dionex IonPac AS20；保护柱：DionexIonPac AG20；抑制器：ADRS-600；淋洗液：氢氧化钾溶液；淋洗液浓度：15mmol/L；进样量：100μL；流速：0.25mL/min；柱温：30℃。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)中离子色谱串联三重四极杆的检测条件如下：质谱条件：离子源：电喷雾电离源，负离子模式；检测模式：多反应监测MRM；气帘气压力：241.3kPa；碰撞气强度：Medium；离子化电压：4500V；离子源温度：600℃；喷雾气压：379.2kPa；辅助加热气压：379.2kPa。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于：检测时采用多反映监测模式，氟乙酸的离子对信息如下：母离子的荷质比为77m/z；子离子的荷质比为57m/z，碰撞能为-15eV，去簇电压为-20V；子离子的荷质比为33，碰撞能为-24eV，去簇电压为-20V。
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