CN101851162A - 一种新的丹酚酸化合物l、其制备方法和用途 - Google Patents

一种新的丹酚酸化合物l、其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101851162A
CN101851162A CN201010135800A CN201010135800A CN101851162A CN 101851162 A CN101851162 A CN 101851162A CN 201010135800 A CN201010135800 A CN 201010135800A CN 201010135800 A CN201010135800 A CN 201010135800A CN 101851162 A CN101851162 A CN 101851162A
Authority
CN
China
Prior art keywords
salvianolic acid
water
medicinal extract
preparation
alcohol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201010135800A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101851162B (zh
Inventor
周水平
李伟
靳元鹏
马晓慧
韩建平
崔红芳
罗学军
陈晓鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Original Assignee
Tianjin Tasly Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Tasly Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Tianjin Tasly Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201010135800.6A priority Critical patent/CN101851162B/zh
Publication of CN101851162A publication Critical patent/CN101851162A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101851162B publication Critical patent/CN101851162B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新的丹酚酸类化合物L、其制备方法、含有丹酚酸L的药物组合物及其在制备治疗心脑血管的药物中的应用。

Description

一种新的丹酚酸化合物L、其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及中药领域，具体涉及一种新的丹酚酸类化合物。
背景技术
丹参为唇形科鼠尾草属植物的根部，性味苦，微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效。现代药理研究证明，丹参具有扩张冠脉、改善微循环、保护心脏的作用，能抑制和解除血小板聚集，提高机体耐缺氧能力以及抗肝炎、抗肿瘤和抗病毒等活性。2001年，中国医学科学院协和医科大学药物研究所报道了丹参及其同属植物的水溶性活性成分共计13种酚酸类化合物，包括丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、紫草酸、迷迭香酸及异丹酚酸C等(黎莲娘等人《医学研究通讯》2001年第30卷第7期)，并报道了这13种酚酸类化合物的药理作用。2002年，热娜·卡斯木等报道了丹酚酸K的化学结构(热娜·卡斯木等人《新疆医科大学学报》2002年第25卷第3期)。国外也对丹参水溶性活性成分进行了研究。1999年，美国乔治顿大学就“丹参酚酸类13个化学结构抗HIV整合酶和其他病毒”申请并获得了美国专利，表明丹参是一种极具潜力和开发价值的药用植物资源。
本发明所述的丹酚酸L，正是在大量筛选研究过程发现的丹参中一个新化合物，而且涉及该结构的化合物及药理作用迄今尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的丹酚酸化合物L。
本发明进一步的目的是提供含有丹酚酸L的药物组合物。
本发明的又一目的是提供丹酚酸L的制备方法。
本发明的再一目的是提供丹酚酸L在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
本发明涉及的新化合物的结构式(I)及其药学上可接受的盐、其溶剂化物和可水解的酯。
Figure GSA00000048393500021
本发明的酚酸类新化合物，经过化合物的理化性质、高分辨质谱(QFT-ESI)、电喷雾质谱(ESI-MS)、1H-NMR，13C-NMR，DEPT，gCOSY，gHMBC，gHMQC图谱的鉴定，确证了其结构。
本发明的化合物为淡黄色粉状。
本发明的化合物的薄层层析FeCl3试剂显色反应呈阳性，提示其可能为酚类化合物。
高分辨质谱(QFT-ESI)给出准分子离子峰[M-H]+ m/z＝537.1034，确定其分子式为C27H22O12，不饱和度Ω＝17。
电喷雾质谱中，本发明化合物的分子离子峰m/z 537易脱去8”位的羧基(-44)生成m/z 493的离子(与丹酚酸A分子离子峰的结构相同)，然后按照丹酚酸A的裂解规律生成m/z 313、295的离子。
丹酚酸A的质谱裂解规律：
Figure GSA00000048393500031
可见几个主要离子m/z 493、313、295均是丹酚酸A质谱图的主要峰。所以，本发明的化合物具有与丹酚酸A相同的骨架结构。
1H-NMR(氢谱)提示分子中有1个连氧次甲基质子信号δ5.09(1H，dd，J＝8.0，4.5Hz)；11个芳香质子信号δ6.88(1H，d，J＝8.5Hz)、δ7.25(1H，d，J＝8.5Hz)、δ7.59(1H，d，J＝16.0Hz)、δ6.22(1H，d，J＝16.0Hz)、δ6.68(1H，s)、δ6.55(2H，d，J＝8.0Hz)、δ6.58(1H，d，J＝2.0Hz)、δ6.69(1H，d，J＝8.0Hz)、δ6.54(1H，dd，J＝8.5，2.0Hz)、δ7.92(1H，s)；2个脂肪族质子信号δ3.01(2H，ddd，J＝14.0，8.0，4.5Hz)。
13C-NMR(碳谱)给出27个碳信号，其中1个脂肪碳信号δ39.6，1个连氧次甲基碳信号δ76.4，3个羰基碳信号δ170.1、δ173.0、δ175.1，22个双键碳信号δ117.4、δ117.8、δ117.8、δ118.2、δ119.2、δ120.2、δ121.7、δ123.7、δ125.7、δ126.6、δ128.0、δ128.8、δ129.9、δ130.9、δ146.2、δ146.5、δ146.9、δ147.4、δ147.7、δ147.8、δ150.3、δ150.9。
DEPT谱显示分子中存在1×CH2、12×CH、14×C。
根据1H-NMR谱中芳香质子的化学位移及其相互之间的偶合情况，结合13C-NMR谱所提供的信息，可推知分子中存在2个1，3，4-三取代的苯环、1个1，2，3，4-四取代的苯环，1个反式双键及1个单取代双键；而这些与丹参中丹酚酸类化合物所具有的谱学特征相吻合。
综合以上信息初步推测本发明的化合物可能为酚酸类化合物，其结构上与已报道的丹参中的酚酸类化合物类似。
Figure GSA00000048393500041
丹酚酸A                                  本发明化合物
通过与现有技术比较及相关谱学对照，发现本发明的化合物在谱学上与丹酚酸A接近，差别在于丹酚酸A的1H-NMR中有两对反式双键质子，而本发明的化合物只有一对反式双键及一个单取代双键质子；13C-NMR中，本发明化合物比丹酚酸A多出一个羰基碳信号，同时C-7″和C-8″的化学位移分别向低场位移8ppm和6ppm，由此说明本发明的化合物与丹酚酸A的差别在C-7″或C-8″被羧基所取代。
为了进一步确认C-7″和C-8″的取代情况，进行了本发明化合物的2D-NMR测试，在其HMBC谱中H-7″与C-9″、C-2″、C-2及C-6″间存在远程偶合，据此可以推知本发明化合物的C-8″被羧基所取代。
所以，通过与现有技术比较，本发明的化合物为一新的丹酚酸类化合物，将其命名为丹酚酸L。
在提取制备过程中，由于本发明的化合物可能发生构型、构象的变化，因此，波谱数据可能会有所变化。但由构型、构象变化所产生的各种异构体均在本发明的保护范围之内。
根据本领域的普通技术知识和现有技术，本发明的丹酚酸L还可以利用其药学上可接受的盐或溶剂化物的形式。本发明的丹酚酸L的药学上可接受的盐包括常规的、药学上可接受的无机碱或有机碱生成的盐，所述的盐通过常规的成盐方法制备而得。适合的盐的实例包括钠、钾、锂、镁、铝、钙、锌等的盐，或与N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、黄连素形成的盐。下文所提到的丹酚酸L包括式(I)所表示的丹酚酸L及其药学上可接受的盐、溶剂化物和可水解的酯。
本发明的丹酚酸L适宜以药物组合物的形式给药。这类组合物可以按照常规方式与一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂混合使用。若有可能，在治疗上将本发明的丹酚酸L作为原料药给药，优选活性成分直接作为药物制剂。在与其他成分相容和对服药者无害的意义上，载体必须是药学上可接受的。
因此，本发明进一步提供本发明的丹酚酸L的药物制剂，包括本发明的丹酚酸L和一种或多种药学上可接受的载体，以及含有或不含其他治疗和/或预防性成分。这些制剂适用于口服、胃肠外(包括皮下例如注射或药库片；真皮内；鞘内；肌内例如药库；静脉内等)、直肠和局部(如舌下)给药，但最适合的给药途径应取决于患者的病症。该制剂可以是单位制剂，并且可以通过用药学领域熟知的任一种方法制备。所有方法包括使本发明的丹酚酸L与载体结合的步骤，该载体构成一种或多种辅助成分。一般来说，该制剂的制备过程如下：使本发明的丹酚酸L与液体载体、或微细粉碎的固体载体、或二者的结合均匀而紧密的结合，然后，如果必要的话，使产物成型为所必须的制剂。
通常可使用标准的制药技术，即可将本发明的丹酚酸L和药用载体制得本发明药物组合物，这些方法包括混合、制粒和压制。本领域技术人员所熟知的是，可药用载体或稀释剂的形式和特性取决于与其混合的活性成分的量、给药途径和其他已知因素。在此，所用的药用载体是可与组合物联用给药的各种有机或无机载体，例如：用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂和包衣剂；也可使用药用添加剂，例如着色剂和甜味剂。所述药用载体选自：甘露醇、山梨醇等糖醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠、一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂，例如糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂；胶囊剂，例如硬胶囊剂、软胶囊剂；口服液；口含剂；颗粒剂；冲剂；丸剂；散剂；膏剂；丹剂；混悬剂；粉剂；溶液剂；注射剂；栓剂；膏剂，例如软膏剂、硬膏剂；霜剂；喷雾剂；滴剂以及贴剂。本发明的制剂优选：口服剂型，如胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；以及注射剂，如粉针剂、注射液、输液等。本发明的制剂最优选为片剂。
其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂、粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
优选的示例赋形剂包括：乳糖、D-甘露醇、D-山梨醇、淀粉如α-淀粉、糊精、结晶纤维素、低取代的羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、阿拉伯胶、支链淀粉、轻质无水硅酸、合成硅酸铝、硅酸铝镁等。
优选的示例润滑剂包括：硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉、硅胶等。
优选的示例粘合剂包括：α-淀粉、蔗糖、明胶、阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、糖、D-甘露醇、海藻糖、糊精、支链淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、吡咯烷酮等。
优选的示例崩解剂包括：乳糖、糖、淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、氨烷基钠、羧甲基淀粉钠、轻质无水硅酸、低取代的羟丙基纤维素等。
优选的示例包衣剂包括：羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇等。
优选的示例着色剂包括：水溶性食用枸橼黄染料(食用染料例如食用红No.2和No.3，食用黄No.4和No.5，食用蓝No.1和No.2)；水不溶性色沉染料(例如上述水溶性食用枸橼黄染料的铝盐)；天然染料(例如β-胡萝卜素、叶绿素、铁丹)等。
优选的示例甜味剂包括：糖精钠、甘草次酸、阿斯帕坦、甜菊等。
片剂的制备方法一般为，本发明的丹酚酸L与一种或多种药学上可接受的辅料一起压制或模制。
本发明的丹酚酸L还可以制成口服液体制剂，例如水性或油性悬液、溶液、乳剂、糖浆剂等。本发明的丹酚酸L还可以是干燥产品，使用前用水或其他适合的载体混合。这类液体制剂可以含有常规的添加剂，可以包括悬浮剂，例如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(可以包括食用油)，如杏仁油、分馏椰子油、油性酯、丙二醇或乙醇；以及防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸。
用于胃肠道外给药的制剂包括水性与非水性无菌注射液，其中可以含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂、等渗剂等；以及水性与非水性无菌混悬液，其中可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以存放在单剂量或多计量容器内，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在临时用前加入无菌的液体载体，例如注射用水。
用于直肠给药的制剂可以是栓剂，含有常规的栓剂基质，例如可可脂、硬脂肪酸或其他甘油酯，或乙二醇。
用于口腔局部、例如颊部或舌下给药的制剂包括锭剂，其中在加味的基质中包含活性成分，该基质例如蔗糖和阿拉伯胶；还包括软锭剂，其中在基质中含有活性成分，该基质可以是明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶。
本发明的丹酚酸L还可以配制成药库制剂。这类长效制剂可以通过植入(如皮下或肌内)或肌内注射给药。所以，本发明丹酚酸L可以与适合的聚合物或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂进行配制，或者配制成微溶性衍生物，例如微溶性盐。
根据本领域的普通技术知识和现有技术，本发明所涉及的治疗包括预防和既定疾病或症状的治疗。而且，用于治疗所需的本发明丹酚酸L的量应根据所治疗病症的性质和患者条件而异，或遵医嘱。一般来说，用于成人治疗的剂量通常将在0.02-5000mg/天的范围，优选1-1500mg/天。所需剂量可以是单一的剂量或多次的剂量，按适当的间隔给药，例如每天给予两次、三次、四次或更多。根据本发明的制剂可以含有0.1-99wt％的活性成分，对片剂和胶囊剂优选含有30-95wt％的活性成分，液体制剂优选含有3-50wt％的活性成分。
本发明是通过如下方案实现的：
(1)提取：将丹参药材或者丹参与其他药材的混合物进行水提，醇沉，上清液浓缩为浸膏。
(2)分离：将步骤(1)中所得浸膏经水溶解后，过大孔吸附树脂，用水进行洗脱，将洗脱液调至酸性后再次过大孔吸附树脂，用酸性水溶液冲洗除去杂质，然后用乙醇洗脱，乙醇洗脱液经浓缩得浸膏。
(3)纯化：将步骤(2)中所得浸膏过硅胶柱，干法上样，洗脱液为氯仿-甲醇-甲酸，等度洗脱，收集洗脱液；用薄层层析法监测洗脱过程，合并同类洗脱液，得到所述丹酚酸L。
所述步骤(1)中，所述丹参药材或者丹参与其他药材的混合物，可以切成饮片、粉碎成颗粒或粉末，优选制成饮片；所述丹参药材优选丹参的根部；所述的其他药材可以是本领域技术人员所公知的可与丹参配伍的中药材，优选三七、黄芪和/或首乌。
所述步骤(1)中，所述水提步骤为加入4-8倍药材量体积的水，优选4倍量；煎煮1.5-3.5h，优选2h；滤过；药渣继续用3-6倍量水煎煮1-3h，优选3倍量水煎煮1h；滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.11-1.28(80℃)的浸膏，优选相对密度为1.2(80℃)的浸膏。为使酚酸类成盐更易于溶出，所述的水提步骤优选使用碱的水溶液进行，所述的碱优选于由碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钾、碳酸钾和氢氧化钾组成的组中的至少一种，进一步优选碳酸氢钠或氢氧化钠；碱的水溶液为0.30％-0.68％的碳酸氢钠或0.0025‰-0.004‰氢氧化钠，优选为0.45％的碳酸氢钠。
所述步骤(1)中，所述醇沉步骤为浸膏中加入95％乙醇进行醇沉至65％-70％(25℃)，优选70％，静置12-36小时，优选静置24h；减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30-1.38(60℃)的浸膏，优选相对密度为1.37(60℃)的浸膏。
为了更好地去除脂溶性的杂质，优选在水提之前进行醇提，醇提步骤为加入5-8倍药材量体积的50％-95％乙醇，煎煮2次，每次1-2h，滤过，醇提液弃去，药渣继续按以上所述水提步骤提取。
所述步骤(2)中，所述大孔吸附树脂柱可以是非极性活弱极性的树脂，例如，AB-8型、HPD450、HPD700、D101、D4020或X5型大孔吸附树脂，优选AB-8型；原药材与大孔吸附树脂重量比为5∶1-1∶1，优选为4∶1；用8-15倍量柱床体积的水冲洗，优选用12倍量柱床体积的水冲洗。
水洗脱液用盐酸调节至pH值2.2-3.5，优选3.0。
将上述酸性的水洗脱液再次过大孔吸附树脂，原药材与大孔吸附树脂重量比为5∶1-1∶1，优选4∶1；用pH值2.2-3.5、优选3.0的盐酸冲洗至近无色。
用3-8倍量的50％-95％乙醇洗脱，优选4倍量的95％乙醇；洗脱液浓缩至无醇味，得浸膏。
所述步骤(3)中，将步骤(2)中浓缩得到浸膏以有机溶剂溶解，优选以甲醇溶解；加入层析硅胶拌样，优选加入与浸膏等重量的200-300目的层析硅胶；将拌好的样品铺在装好的硅胶柱上，硅胶优选200-300目；用氯仿-甲醇-甲酸(90∶10∶3-40∶10∶0.5)洗脱，优选氯仿-甲醇-甲酸(85∶15∶3)，所述洗脱过程可以是等度洗脱(即洗脱液配比不变)，也可以是梯度洗脱(即洗脱液配比变化)，所述的梯度洗脱可以根据本领域的技术常识，根据需要收集的物质的极性进行调整，例如洗脱液极性由小逐渐变大；为了准确地跟踪洗脱进程，优选以氯仿-甲醇-甲酸(50∶10∶2)为展开剂用薄层层析法监测。
将同类的洗脱液合并，即得到丹酚酸L。
为了获得更好的分离效果，还可以采用制备液相色谱进行分离。例如在Waters Delta prep 4000半制备液相色谱仪，色谱柱：AgilentZORBAX XDB-C18(21.2×150mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1％的甲酸水溶液(15∶85)；流速：20ml/min；检测波长：280nm条件下分离制备得到单体。
药效试验结果表明：丹酚酸L的自由基清除力明显大于维生素C的自由基清除力(表3和图9)；并且，丹酚酸L的还原力明显强于维生素C(图10)。本发明的丹酚酸L还具有抗氧化活性和清除自由基的活性。因此，本发明的丹酚酸L还可用于制备具有清除自由基活性或具有预防性抗氧化功能活性的药物。
本发明还涉及丹酚酸L在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。所述的心血管疾病至少包括选自下列组中的一种：由缺氧引起的血管舒张功能障碍；缺氧、缺糖和过氧化状态引起的体外神经细胞损伤和急性心肌缺血。
本发明的药效实验结果显示：丹酚酸L冻干粉可以导致去甲肾上腺素的血管收缩曲线出现一定的右移，但是没有显著性差异。丹酚酸L冻干粉对缺氧的血管环在三个ACH梯度(10-5、10-4、10-3mol/L)的血管舒张都显著增强(P＜0.05)，说明丹酚酸L对于缺氧引起的血管舒张功能障碍有显著的改善作用(表7-8以及图11-12)。
本发明的丹酚酸L在心血管系统方面具有广泛的药理作用，可减轻缺血缺氧所致血管内皮损伤、促进血管内皮增生、且能改善缺血缺氧所致的心肌细胞损伤、抗动脉粥样硬化、抑制血小板聚集和抗血栓形成作用。丹酚酸L还具有扩张冠脉，增加冠脉流量；和对脑缺血损伤的保护作用。
本发明的药效试验结果显示：本发明的丹酚酸L对于缺氧缺糖和双氧水损伤引起的体外神经细胞损伤有显著改善作用，可以提高细胞存活率，具有保护缺氧、缺糖及过氧化状态下神经细胞的功能(表12-15)。本发明的药效试验结果还表明，本发明的丹酚酸L具有抗急性心肌缺血作用(表16-17)。
附图说明
图1丹酚酸L的高分辨质谱图。
图2丹酚酸L的电喷雾质谱图。
图3丹酚酸L的1H-NMR图，500MHZ，CD3OD。
图4丹酚酸L的13C-NMR图，125MHZ，CD3OD。
图5丹酚酸L的DEPT谱，125MHZ，CD3OD。
图6丹酚酸L的gCOSY谱，500MHZ，CD3OD。
图7丹酚酸L的gHMBC谱，500MHZ，CD3OD。
图8丹酚酸L的gHMQC谱，500MHZ，CD3OD。
图9受试物对自由基清除力的比较。
图10丹酚酸L和维生素C的还原力比较。
图11丹酚酸L冻干粉对于血管收缩的影响。
图12丹酚酸L冻干粉对于血管舒张的影响。
图13给予垂体后叶素后的心电图(ECG)。其中，(A)模型对照组的正常心电图；(B)为模型对照组给予垂体后叶素后15秒的心电图；(C)为模型对照组给予垂体后叶素后30秒的心电图。
具体实施方式
下面通过具体的实验数据进一步说明本发明丹酚酸L的抗氧化、清除自由基的有益效果。
除非另有说明，本发明中所述的％以及‰均为重量百分比。
实施例1丹酚酸L的制备
取丹参饮片，置提取器中，加入4倍药材量体积的水(含0.45％的碳酸氢钠)，煎煮2h，滤过；药渣继续用3倍量水煎煮1h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.2(80℃)的浸膏；浸膏中加入95％乙醇进行醇沉至70％(25℃)，静置12h以上，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.37(60℃)的浸膏。
将得到的浸膏用水溶解，过AB-8大孔吸附树脂，用12倍量柱床体积的水冲洗，水洗脱液用盐酸调节至pH值3.0。将上述酸性的水洗脱液再次过AB-8大孔吸附树脂，用pH值3.0的酸性水溶液冲洗至近无色后，用4倍量的95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至浓浸膏，洗脱液浓缩至无醇味，得浸膏。
将得到的浸膏用甲醇溶解，加入相当重量的200-300目的层析硅胶拌样，将拌好的样品铺在装好的硅胶柱上，用氯仿-甲醇-甲酸(85∶15∶3)洗脱，用薄层层析法检测，将同类的洗脱液合并，即得丹酚酸L。
高分辨质谱(QFT-ESI)给出准分子离子峰[M-H]+ m/z＝537.1034。
表1丹酚酸L的1H(500M，CD3OD)和13C-NMR(125M，CD3OD)数据归属
  编号   δH   δc   H-H COSY C-H COSY
  1   -   128.0 H-5，H-8
  2   -   128.8 H-6，H-7，H-7″
  3   -   146.2 H-5
  4   -   150.9 H-5，H-6
  5   6.88(1H，d，J＝8.5Hz)   117.8   H-6
  6   7.25(1H，d，J＝8.5Hz)   121.7   H-5 H-7
  7   7.59(1H，d，J＝16.0Hz)   147.4   H-8 H-6
  8   6.22(1H，d，J＝16.0Hz)   117.4   H-7
  9   -   170.1 H-7，H-8
  1′   -   130.9 H-2′，H-5′，H-8′，H-7′
  2′   6.68(1H，s)   119.2 H-6′，H-7′
  3′   -   146.9 H-5′
  4′   -   147.8 H-2′，H-5′，H-6′
  编号   δH   δc   H-H COSY C-H COSY
  5′   6.55(1H，d，J＝8.0Hz)   117.8
  6′   6.55(1H，d，J＝8.0Hz)   123.7 H-2′
  7′   3.01(1H，ddd，J＝14.0，8.0，4.5Hz)   39.6   H-8’ H-2′
  8′   5.09(1H，dd，J＝8.0，4.5Hz)   76.4   H-7′ H-7′
  9′   -   175.11 H-7′，H-8′
  1″   -   129.9 H-2″
  2″   6.58(1H，d，J＝2.0Hz)   120.2 H-6″，H-7″
  3″   -   147.7 H-2″，H-5″
  4″   -   150.3 H-6″，H-2″
  5″   6.69(1H，d，J＝8.0Hz)   118.2
  6″   6.54(1H，dd，J＝8.5，2.0Hz)   126.6 H-2″，H-7″
  7″   7.92(1H，s)   146.5
  8″   -   125.7 H-7″
  编号   δH   δc   H-H COSY C-H COSY
  9″   -   173.0 H-7″，H-8″
DEPT谱显示分子中存在1×CH2、12×CH、14×C。
实施例2丹酚酸L的制备
取丹参和三七饮片，置提取器中，加入6倍药材量体积的水(含0.45％的碳酸氢钠)，煎煮3h，滤过；药渣继续用5倍量水煎煮2h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.25(80℃)的浸膏；浸膏中加入95％乙醇进行醇沉至68％(25℃)，静置12h以上，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.32(60℃)的浸膏。
将得到的浸膏用水溶解，过AB-8大孔吸附树脂，用12倍量柱床体积的水冲洗，水洗脱液用盐酸调节至pH值2.5。将上述酸性的水洗脱液再次过AB-8大孔吸附树脂，用pH值3.0的酸性水溶液冲洗至近无色后，用5倍量的95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至浓浸膏，洗脱液浓缩至无醇味，得浸膏。
将得到的浸膏用甲醇溶解，加入相当重量的200-300目的层析硅胶拌样，将拌好的样品铺在装好的硅胶柱上，用氯仿-甲醇-甲酸(85∶15∶3)洗脱，用薄层层析法检测，将同类的洗脱液合并，即得丹酚酸L。
高分辨质谱(QFT-ESI)给出准分子离子峰[M-H]+m/z＝537.1027。
表2丹酚酸L的1H(500M，CD3OD)和13C-NMR(125M，CD3OD)数据归属
  编号   δH   δc   H-H COSY   C-H COSY
  1   -   128.0   H-5，H-8
  2   -   128.8   H-6，H-7，H-7″
  3   -   146.2   H-5
  4   -   150.9   H-5，H-6
  5   6.88(1H，d，J＝8.5Hz)   117.8   H-6
  6   7.24(1H，d，J＝8.5Hz)   121.8   H-5   H-7
  7   7.58(1H，d，J＝16.0Hz)   147.4   H-8   H-6
  8   6.20(1H，d，J＝16.0Hz)   117.4   H-7
  9   -   170.1   H-7，H-8
  1′   -   130.9   H-2′，H-5′，H-8′，H-7′
  2′   6.68(1H，s)   119.1   H-6′，H-7′
  3′   -   146.9   H-5′
  4′   -   147.8   H-2′，H-5′，H-6′
  5′   6.54(1H，d，J＝8.0Hz)   117.8
  6′   6.54(1H，d，J＝8.0Hz)   123.7   H-2′
  编号   δH   δc   H-H COSY   C-H COSY
  7′   2.97(1H，ddd，J＝14.0，8.0，4.0Hz)   39.6   H-8’   H-2′
  8′   5.05(1H，dd，J＝8.0，4.0Hz)   76.4   H-7′   H-7′
  9′   -   175.2   H-7′，H-8′
  1″   -   129.8   H-2″
  2″   6.56(1H，s Hz)   120.1   H-6″，H-7″
  3″   -   147.7   H-2″，H-5″
  4″   -   150.3   H-6″，H-2″
  5″   6.67(1H，d，J＝8.5Hz)   118.2
  6″   6.48(1H，d，J＝8.5Hz)   126.7   H-2″，H-7″
  7″   7.90(1H，s)   146.5
  8″   -   125.7   H-7″
  9″   -   173.0   H-7″，H-8″
DEPT谱显示分子中存在1×CH2、12×CH、14×C。
实施例3丹酚酸L的制备
取丹参饮片，置提取器中，加入6倍药材量体积的85％乙醇，煎煮2次，每次2h，滤过，醇提液弃去。
药渣加入4倍药材量体积的水(含0.45％的碳酸氢钠)，煎煮2h，滤过；药渣继续用3倍量水煎煮1h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.2(80℃)的浸膏；浸膏中加入95％乙醇进行醇沉至70％(25℃)，静置12h以上，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.37(60℃)的浸膏。
将得到的浸膏用水溶解，过AB-8大孔吸附树脂，用12倍量柱床体积的水冲洗，水洗脱液用盐酸调节至pH值3.0。将上述酸性的水洗脱液再次过AB-8大孔吸附树脂，用pH值3.0的酸性水溶液冲洗至近无色后，用4倍量的95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至浓浸膏，洗脱液浓缩至无醇味，得浸膏。
将得到的浸膏用甲醇溶解，加入相当重量的200-300目的层析硅胶拌样，将拌好的样品铺在装好的硅胶柱上，用氯仿-甲醇-甲酸(85∶15∶3)洗脱，用薄层层析法检测，将同类的洗脱液合并，即得丹酚酸L。
实施例4丹酚酸L片剂的制备
处方：
丹酚酸L             100g
微晶纤维素          50g
乳糖                50g
淀粉                51g
羧甲基淀粉钠        12g
5％PVP无水乙醇      适量
硬脂酸镁            3g
                                       
                制成1000片
工艺：
1.制粒
丹酚酸L及处方中其它辅料分别过100目筛，称取处方量丹酚酸L与微晶纤维素、淀粉及羧甲基淀粉钠采用等量递加法混合均匀，用适量5％PVP无水乙醇溶液制软材，14目筛制粒，50-60℃干燥1h，加入处方量的硬脂酸镁用14目筛整粒。
2.压片
取上述颗粒用特制菱形异型冲模压片。实施例5丹酚酸L胶囊剂的制备
处方：
丹酚酸L             100g
淀粉                200g
羧甲基淀粉钠        12g
5％PVP无水乙醇      适量
硬脂酸镁            3g
                                   
            制成1000粒
工艺：
1.制粒
丹酚酸L及处方中其它辅料分别过100目筛，称取处方量丹酚酸L与淀粉及羧甲基淀粉钠采用等量递加法混合均匀，用适量5％PVP无水乙醇溶液制软材，14目筛制粒，50-60℃干燥1h，加入处方量的硬脂酸镁用14目筛整粒。
2.灌装
取上述颗粒装入胶囊。
实施例6丹酚酸L注射液的制备
处方：
丹酚酸L             100g
甘露醇              100g
注射用水            加至2500ml，
                                           
                    制成1000支
工艺：
取丹酚酸L，加注射用水1000ml适量使溶解，搅匀；另取甘露醇，加注射用水500ml使溶解，加入上述溶液中，搅匀，0.5克活性炭保温搅拌20min，过滤，滤液调节pH值为4.5-5.0，加注射用水至2500ml，除菌过滤，分装，即得。
实施例7丹酚酸L冻干粉针的制备
处方：
丹酚酸L           100g
甘露醇            100g
注射用水          2000ml
                                      
                制成1000支
工艺：
称取丹酚酸L及处方中辅料甘露醇，加注射用水1500ml，搅拌溶解，0.5克活性碳搅拌脱色20min，0.45微米微孔滤膜脱碳，补水到2000毫升，除菌过滤、分装、冷冻干燥，即得。
药效例
药效例1丹酚酸L的自由基俘获反应
自由基是一类具有高度活性的物质，可以在细胞代谢过程中连续不断地产生，它可直接或间接地发挥强氧化作用，广泛地参与机体的生理与病理过程。机体自由基过量时，能通过氧化作用攻击体内的生命大分子，如核酸、蛋白质、糖类和脂质等，使这些物质发生过氧化变性、交联和断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导致机体的组织破坏和退行性变化。大量研究表明：自由基参与许多疾病的病理过程，从而诱发如心血管疾病、某些癌症、老年白内障和黄斑变性、某些炎症及多种神经元疾病。
从化学结构上分析，丹酚酸类化合物是酚羟基的供体，具有抗氧化活性的结构基础。本发明采用1，1-二苯基-2-苦肼基(1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)自由基清除反应模型观察丹酚酸L对自由基的清除效力。
1、试剂和仪器
丹酚酸L，纯度95％以上，由天津天士力集团研究院提供，按照实施例1的方法制备。
维生素C和DPPH均购于SIGMA公司。
紫外分光光度计UV-1800购于北京瑞利分析仪器公司
2、实验方法
反应总体积为2ml，取1ml不同浓度样品80％甲醇溶液加入100μMDPPH甲醇溶液中，混匀后在暗处25℃下反应20min，测定反应液在517nm处的吸光度。实验中采用维生素C作为阳性比较。自由基清除率采用下述公式计算：
自由基清除率(％)＝[1-Asample/Acontrol)/Acontrol]×100％。
其中，Asample为受试样品的吸光度值，Acontrol为无受试样品的吸光度值。
3、实验结果
表3和图9显示不同浓度丹酚酸L和维生素C对DPPH自由基的清除率。丹酚酸L的自由基清除力明显大于维生素C的自由基清除力。
表3不同浓度丹酚酸L和维生素C对DPPH自由基的清除率比较
  样品(μg/ml)   0.314   0.625   1.25   2.5   5
  丹酚酸L   5.41±0.74   12.95±2.42   25.21±1.82   44.19±3.70   83.17±4.12
  维生索C   3.42±0.42   7.06±1.88   13.82±1.83   29.39±5.92   55.34±7.21
药效例2丹酚酸L的还原力测定
药物还原力的大小在一定程度上反映了其预防性抗氧化功能的强弱。本发明对丹酚酸L的还原力进行实验研究。
1、试剂和仪器
丹酚酸L，纯度95％以上，由天津天士力集团研究院提供，按照实施例1的方法制备。
铁氰化钾，分析纯，购于天津市化学试剂一厂。
三氯乙酸，分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
三氯化铁，分析纯，购于天津市风船化学试剂科技有限公司。
维生素C购于Sigma公司。
紫外分光光度计UV-1800购于北京瑞利分析仪器公司。
冷冻离心机：Z323K，购于德国HEMMLE。
2、实验方法
吸取0.5mL含有不同浓度丹酚酸L的200mM pH 6.8磷酸缓冲液，1.0％铁氰化钾溶液，50℃水浴20min后冰浴冷却，加入0.5ml 10％三氯乙酸溶液，于1000g/min离心10min，取上清液1.0mL，加1.0mL蒸馏水和0.2ml 0.1％FeCl3溶液，静止10min于700nm处测定吸光度，同时进行空白实验。维生素C是一种强还原性物质，在本研究中作为阳性对照。样品还原力等于样品吸光值减去空白对照组的吸光值，则吸光度越大则还原力越强。
3、实验结果
图10显示两者都随浓度的增大吸光度逐渐增加。丹酚酸L的还原力明显强于维生素C。
以下药效例3-5所用浸膏1和浸膏2的制备及组分测定
所用材料均来自于天津天士力集团研究院中药所。浸膏1的含量为：6.825g生药/g；浸膏2的含量为：4.162g生药/g。
工艺
浸膏1的制备工艺：丹参、三七(89.8wt％的丹参，9.6wt％的三七)药材加0.45％的碳酸氢钠，5倍量提取2h，4倍量提取1h，共水提两次。用95％乙醇进行回流浓缩，醇沉至乙醇浓度为70％。静置过夜，取上清液，浓缩即得。
浸膏2的制备工艺：丹参、三七(89.8wt％的丹参，9.6wt％的三七)药材加水，5倍量提取2h，4倍量提取1h，共进行两次水提。用95％乙醇进行回流浓缩，醇沉至乙醇浓度为70％。静置过夜，取上清液，浓缩即得。
丹酚酸L：本发明实施例1的方法。
检测方法
Waters 2695液相色谱仪；Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以0.02％的磷酸水溶液为流动相A；以0.02％磷酸的80％乙腈溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为1ml/min；检测波长为280nm；柱温30℃；记录时间为50min。
表4色谱流动相线性洗脱梯度表
Figure GSA00000048393500201
浸膏1和浸膏2中各组分的含量如下表：
表5浸膏1中各组分含量
Figure GSA00000048393500202
表6浸膏2中各组分含量
药效例3丹酚酸L冻干粉对大鼠离体胸主动脉的作用研究
实验材料
1、受试物及试剂：丹酚酸L冻干粉，来源于天津天士力集团研究院中药所；枸橼酸去甲肾上腺素(NA)；乙酰胆碱(ACH)：sigma公司，批号：137751144908131；K氏液配制原料：氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、硫酸镁、葡萄糖、氯化钙。
2、主要仪器：MedLab离体组织浴槽以及Medlab-U/8C采集系统：南京美易科技公司；张力换能器；数控超级恒温槽SC-15；分析天平；纯水仪；氧气瓶。
3、实验动物：SD大鼠，体重适宜，雌雄兼用，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证：SCXK(京)2007-0001。饲养在动物饲养室中，室温20-25℃，照明时间12h，食用鼠专用饲料(北京科澳协力饲料有限公司生产)，饮用自来水。
实验方法
1.给药剂量设计：
丹酚酸L冻干粉的剂量根据其他丹酚酸的药效实验，本实验的剂量设计为0.1mg/ml。
K氏液(mol/L)：NaCl(120)、NaHCO3(25)、KH2PO4(1.2)、MgSO4(1.2)、KCl(4.5)、CaCl2(1.25)、C6H12O6(葡萄糖11.1)
KCl：3mol/L的KCl溶液每次加入100μl(终浓度60mmol/L)
NA：10-4mol/L(终浓度为10-6mol/L)，稀释，共四个梯度
ACH：10-3mol/L(终浓度10-5mol/L)，稀释，共四个梯度
2.分组：
大鼠自由饮食，根据当日的药物配制，随机加入某组。保证每组八只动物，每只动物有四根血管环的数据。分为正常组、缺氧模型组、丹酚酸L缺氧组进行考察。
3.实验方法
SD大鼠自由饮食，根据当日的药物配制，随机加入某组，每组8只。动物脱颈椎处死，快速打开胸腔，取出胸主动脉，在0℃通氧K氏液中，剔除结缔组织，将胸主动脉修饰成2mm左右的血管环。将血管环小心挂到离体浴皿中，恒温37℃，通氧，连接张力换能器和多导生理记录仪。张力基础为2g，血管环平衡45min-1h，每隔15min更换一次K氏液。血管稳定后，加入氯化钾溶液进行预处理，20min后洗脱，平衡15min，再次加入氯化钾进行预处理。使血管收缩达到生理最大值。然后按照梯度加入去甲肾上腺素(10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)观察血管的收缩情况。达到最大收缩值后，稳定在平台值，再按照梯度加入乙酰胆碱(10-5、10-4、10-3、10-2mol/L)观察血管舒张情况。加入NA和ACH的整个过程不能更换K氏液。
缺氧模型时，在两次氯化钾预处理后，取消氧气供应20min，同时加入丹酚酸L冻干粉或者同样量的K氏液，进行共浴，然后按照梯度加入去甲肾上腺素以及乙酰胆碱。从缺氧开始至最后加完乙酰胆碱的最后一个浓度梯度期间不能更换K氏液。
结果用t检验进行数据统计分析。
实验结果
1、对于血管收缩的影响
结果表明，在本实验条件下，和正常组比较，丹酚酸L冻干粉对于血管的收缩没有显著影响，但是血管张力曲线出现明显的右移。数据见表7。
表7血管环收缩数据
Figure GSA00000048393500221
*：和正常组比较有显著性差异，P＜0.05；#：和模型组比较有显著性差异，p＜0.05。丹酚酸L冻干粉对血管环收缩的影响请参见图11。
2、对于血管舒张的影响
结果表明，在本实验条件下，和正常组比较，缺氧模型组在四个ACH梯度的血管舒张都显著减弱(P＜0.01)；丹酚酸L组和正常组比较没有显著性差异。和缺氧模型组比较，丹酚酸L组在三个ACH梯度的血管舒张都显著增强(P＜0.05)。说明丹酚酸L组对于缺氧引起的血管舒张功能障碍可以显著改善。数据见表8。
表8血管环舒张数据
Figure GSA00000048393500231
**：和正常组比较有显著性差异，P＜0.01；***：和正常组比较有显著性差异，P＜0.001；#：和模型组比较有显著性差异，p＜0.05
丹酚酸L冻干粉对血管环舒张的影响请参见图12。
实验结论
丹酚酸L冻干粉可以导致去甲肾上腺素的血管收缩曲线出现一定的右移，但是没有显著性差异。20min缺氧可以导致模型组对乙酰胆碱引起的血管梯度舒张显著性减弱(P＜0.01)，出现舒张障碍；丹酚酸L冻干粉对缺氧的血管环在三个ACH梯度(10-5、10-4、10-3mol/L)的血管舒张都显著增强(P＜0.05)。说明丹酚酸L对于缺氧引起的血管舒张功能障碍有显著改善作用。
注意事项讨论
1、配置K氏液时，其他的物质加完后再加入CaCl2和葡萄糖，防止溶液浑浊；不能把K氏液长时间室温放置，以防止出现絮状沉淀。K氏液要现用现配。
2、尽量在冰浴中取心主动脉；减少器械对血管环的损伤；取心主动脉时应尽量靠近血管弓的位置，防止血管活性减弱。
3、氧气要尽量以小气泡排出，气泡过大会影响张力换能器，使数据失真。
药效例4丹酚酸L冻干粉及浸膏对体外神经细胞的保护作用研究
实验材料
1、主要仪器：超净工作台(安泰净化设备有限公司)、恒温CO2培养箱(德国Heraeus)、酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD)、平板摇床(江苏省光明实验仪器厂)、倒置生物显微镜(日本OLYMPUS)。
2、主要试剂：DMEM高糖培养基(GIBCO)、DMEM无糖培养基(GIBCO)、胰蛋白酶(SIGMA)、胎牛血清(PAA)、MTT(Sigma)、DMSO(Sigma)、LDH检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
3、耗材：96孔细胞培养板(CORNING)。
4、细胞株：PC12。
实验方法
1、MTT方法
①将MTT加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中反应4h。
②弃去上清液，加入DMSO，150μl/孔，平板摇床上振摇10min。
③用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算细胞存活率。
细胞存活率％＝(给药组OD值/阴性对照组OD值)×100％
2、LDH活性测定
按南京建成生物工程研究所提供的LDH检测试剂盒的说明书进行，具体步骤如表9。
表9LDH活性测定的具体步骤
LDH活性(U/L)＝(ODU-ODC)/(ODS-ODB)×CS×N×1000
其中，ODU为待测样品吸光值ODC为样品对照吸光值；ODB为空白管吸光值；ODS为对照液吸光值；CS为标准浓度(2mmol/L)；N为样品测试前稀释倍数。
实验结果
1、双氧水损伤模型的建立
(1)取处于指数生长期状态良好的PC12细胞，用PBS洗涤两次，加入0.25％胰蛋白酶消化液，37℃消化1min左右，加入含血清培养基终止反应，离心重悬后，计数，制成细胞密度为2×104-4×104个/ml的悬液。
(2)取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔(n＝3)，置于37℃恒温CO2培养箱中培养24h。
(3)实验分组及处理：实验分为4组，分别为空白对照组(PBS)、溶剂对照组(DMSO)、模型组(H2O2)、阳性对照组(依达拉奉(Edaravone))。
空白对照组：只加PBS。
溶剂对照组：加0.1％DMSO。
模型组：H2O2浓度分别为0.25mM、0.5mM和1mM，作用时间1h。
阳性对照组：用依达拉奉(2μg/ml)作为阳性对照。加入后，预处理6h，加入0.5mM H2O2损伤1h，然后换为新鲜DMEM+10％FBS培养基，200μl/孔。
(4)用MTT方法检测细胞活力。
表10双氧水损伤模型的建立
Figure GSA00000048393500261
*：P＜0.05，与0.5mM H2O2的模型组对比；##：P＜0.01，与溶剂对照组对比
从表10可看出，0.5mM的H2O2作用PC 12细胞1h，细胞存活率为40％，抑制率达到60％。建立的双氧水损伤模型为：0.5mM的H2O2作用PC12细胞1h。
2、缺氧缺糖模型的建立
(1)取处于指数生长期状态良好的PC12细胞，用PBS洗涤两次，加入0.25％胰蛋白酶消化液，37℃消化1min左右，加入含血清培养基终止反应，离心重悬后，计数，制成细胞密度为2×104-4×104个/ml的悬液。
(2)取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔(n＝3)，置于37℃恒温CO2培养箱中培养24h。
(3)实验分组及处理：实验分为3组，分别为空白对照组(normoxia+0.1％DMSO)、模型组(OGD+0.1％DMSO，缺氧缺糖)、阳性对照组(依达拉奉)。
模型组：培养板的细胞换无糖DMEM培养基，置于缺氧箱中，自O2％＜2.6起计时0.5h，然后转移至正常培养箱。
阳性对照组：用依达拉奉(2μg/ml)作为阳性对照。药物加入后，预处理6h后，换无糖DMEM培养基，180μl/孔，重新加药，置于缺氧箱中，自O2％＜2.6起计时0.5h，然后转移至正常培养箱，培养一段时间再进行测定
(4)用MTT方法检测细胞活力。
表11缺氧缺糖模型的建立
  组别  终浓度   存活率(％)
  空白对照组  0.1％DMSO   100±6.66
  模型组  0.1％DMSO   42.59±3.06##
  阳性对照组  2μg/ml依达拉奉   48.50±1.81*
*：P＜0.05，与模型组对比；##：P＜0.01，与空白对照组相比
从表11可见，缺氧缺糖损伤PC12细胞，细胞的存活率只有42％，抑制率达到58％。因此，实验的缺氧缺糖模型为：细胞换无糖DMEM培养基，置于缺氧箱中，自O2％＜2.6起计时0.5h，转移至正常培养箱，培养一段时间再进行测定。
3、药物对双氧水损伤PC12细胞存活率的影响
(1)取处于指数生长期状态良好的PC12细胞，用PBS洗涤两次，加入0.25％胰蛋白酶消化液，37℃消化1min左右，加入含血清培养基终止反应，离心重悬后计数，制成细胞密度为2×104-4×104个/ml的悬液。
(2)取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔(n＝3)，置于37℃恒温CO2培养箱中培养24h。
(3)实验分组及处理：实验分为5组，分别为空白对照组(PBS)、溶剂对照组(DMSO或乙酸乙酯)、模型组(H2O2)、阳性对照组(依达拉奉)、药物处理组。
模型组：H2O2浓度0.5mM，作用时间1h。
阳性对照组：用依达拉奉(2μg/ml)作为阳性对照。加入细胞预处理6h后，加入0.5mM H2O2损伤1h，然后换为新鲜DMEM+10％FBS培养基。
药物处理组：将细胞加到培养板后，先加入不同浓度的不同受试药物，20μl/孔，预处理6h，0.5mM H2O2损伤1h，然后换为新鲜DMEM+10％FBS培养基。
(4)收集上清液，20μl/孔，用于检测LDH活性。
(5)对细胞板内的细胞进行MTT活力检测。
表12药物对双氧水损伤PC12细胞存活率的影响
Figure GSA00000048393500281
*：P＜0.05，与(0.5mM H2O2+DMSO)组对比；**：P＜0.01，与(0.5mM H2O2+DMSO)组对比；##：P＜0.01，与DMSO组对比
药物的三个浓度分别用0.1％、0.01％和0.001％的DMSO配制，比较时与相应浓度的溶剂对照组比较。其中，药物处理组与模型组(0.5mMH2O2+EtOAc)对比。模型组(H2O2+EtOAc)与溶剂对照组(EtOAc)对比。
表13药物对双氧水损伤PC12细胞LDH活性影响
Figure GSA00000048393500291
*：P＜0.05，与(0.5mM H2O2+DMSO)组对比；**：P＜0.01，与(0.5mM H2O2+DMSO)组对比；##：P＜0.01，与溶剂对照组DMSO对比
其中，药物处理组与模型组(0.5mM H2O2+EtOAc)对比，模型组(H2O2+EtOAc)组与溶剂对照组(EtOAc)对比。
4、药物对缺氧缺糖PC12细胞存活率的影响
(1)取处于指数生长期状态良好的PC12细胞，用PBS洗涤两次，加入0.25％胰蛋白酶消化液，37℃消化1min左右，加入含血清培养基终止反应，离心重悬后计数，制成细胞密度为2×104-4×104个/ml的悬液。
(2)取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔(n＝3)，置于37℃恒温CO2培养箱中培养24h。
(3)实验分组及处理：实验分为4组，分别为空白对照组(normoxia+0.1％DMSO)、模型组(OGD+DMSO，缺氧缺糖)、阳性对照组(依达拉奉)、药物处理组。
模型组：为培养板的细胞更换无糖DMEM培养基，置于缺氧箱中，自O2％＜2.6起计时0.5h，转移至正常培养箱，过夜培养。
阳性对照组：用依达拉奉(2μg/ml)作为阳性对照。药物加入后，预处理6h后，换为无糖DMEM培养基，180μl/孔，重新加药，置于缺氧箱中，自O2％＜2.6起计时0.5h，转移至正常培养箱，过夜培养。
药物处理组：不同浓度的药物加入后，预处理6h后，换无糖DMEM培养基，180μl/孔，重新加药，置于缺氧箱中，自O2％＜2.6起计时0.5h，转移至正常培养箱，过夜培养。
(4)第二天收集上清，20μl/孔，用于检测LDH活性。
(5)MTT检测细胞活力。
表14药物对缺氧缺糖PC12细胞存活率的影响
Figure GSA00000048393500311
*：P＜0.05，与模型组(OGD+DMSO)对比；**：P＜0.01，与模型组(OGD+DMSO)对比；##：P＜0.01，与空白对照组(Normoxia+DMSO)对比。其中，药物处理组与空白对照组(OGD+EtOAc)对比。模型组(OGD+EtOAc)与空白对照组(Normoxia+EtOAc)对比。
(6)LDH活性
表15药物对缺氧缺糖PC12细胞LDH活性影响
Figure GSA00000048393500321
*：P＜0.05，与模型组(OGD+DMSO)对比；**：P＜0.01，与模型组(OGD+DMSO)对比；##：P＜0.01，与空白对照组(Normoxia+DMSO)对比。其中，药物处理组与空白对照组(OGD+EtOAc)对比。模型组(OGD+EtOAc)与空白对照组(Normoxia+EtOAc)对比。
结论
本实验结果：针对双氧水损伤PC12细胞模型，丹酚酸L干粉剂量为0.02μg/ml时，存活率为47％(P＜0.05)。丹酚酸L干粉剂量为0.2μg/ml时，LDH活性为474(P＜0.05)。丹酚酸L浸膏1在0.02、0.2、2μg/ml三个剂量时，LDH活性分别为483(P＜0.01)、416(P＜0.01)、465(P＜0.05)；丹酚酸L浸膏2在0.2、2μg/ml两个剂量时，LDH活性分别为407(P＜0.01)、488(P＜0.01)，和模型组比较都有降低LDH的作用。
针对缺氧缺糖模型中的PC12细胞存活率，丹酚酸L干粉剂量为0.02、0.2μg/ml时，存活率分别为48％(P＜0.01)、37％(P＜0.05)；丹酚酸L浸膏1剂量为0.2、2μg/ml时，存活率分别为40％(P＜0.01)、42％(P＜0.01)；丹酚酸L浸膏2在0.02、0.2、2μg/ml三个剂量时，存活率分别为47％(P＜0.01)、47％(P＜0.01)、41％(P＜0.05)。对于LDH的活性，丹酚酸L干粉剂量为2μg/ml时，LDH活性为40(P＜0.05)；丹酚酸L浸膏1剂量为2μg/ml时，LDH活性为31(P＜0.01)；丹酚酸L浸膏2剂量为0.2μg/ml时，LDH活性为31(P＜0.05)。
丹酚酸L冻干粉对于缺氧缺糖和双氧水损伤引起的体外神经细胞损伤有显著改善作用，可以提高细胞存活率，具有保护缺氧、缺糖及过氧化状态下神经细胞的功能。
药效例5丹酚酸L干粉及浸膏对大鼠实验性急性心肌缺血的保护作用研 究
实验材料
1、受试物及试剂：垂体后叶素(Pit)注射液，南京新百药业有限公司生产，批号：070302；生理盐水，天津天安药业股份有限公司生产，规格500ml/瓶，批号：200605241。
2.主要仪器：MedLab八道生理记录仪：南京美易科技公司。
3.实验动物：SD大鼠，体重适宜，雌雄兼用，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证：SCXK(京)2007-0001。饲养在动物饲养室中，室温20-25℃，照明时间12h，食用鼠专用饲料(北京科澳协力饲料有限公司生产)，饮用自来水。
实验方法
1.剂量设计：
浸膏1的含量为：6.825g生药/g。浸膏2的含量为：4.162g生药/g。
本实验中浸膏1和浸膏2都分别设高、低剂量组，剂量分别为1.086g生药/kg和0.543g生药/kg。根据生药材剂量换算可得，浸膏1高剂量的丹酚酸L冻干粉给药剂量为4.67mg/kg，低剂量的丹酚酸L冻干粉给药剂量为2.33mg/kg。浸膏2不含丹酚酸L。
丹酚酸L冻干粉给药剂量：10.0mg/kg、5.0mg/kg。
2.分组：
2.1动物筛选
于正式实验前分别给大鼠尾静脉注射垂体后叶素(Pit)(1U/kg)，描记正常及注射后5min心电图，观察J点抬高、T波异常的情况，将未注射前就出现异常心电图者以及对Pit不敏感者剔除。
2.2动物分组
入选大鼠随机分为7组，分别为①模型对照组；②丹参浸膏1低剂量组(A组)；③丹参浸膏1高剂量组(B组)；④丹参浸膏2低剂量组(C组)；⑤丹参浸膏2高剂量组(D组)；⑥丹酚酸L冻干粉低剂量组(E组)；⑦丹酚酸L冻干粉高剂量组(F组)；
3.实验方法
SD大鼠，雌雄各半，随机分组，每组8只。模型对照组的大鼠每日灌胃等容积的生理盐水，给药组每日灌服不同样品的水悬液，全部动物均连续给药7天。末次给药后40min，麻醉大鼠，连接仪器，描记II导联正常心电图。按1U/kg体重由大鼠尾静脉恒速推注垂体后叶素(Pit)，推注时间控制在10s左右，描记给药后0s、5s、10s、15s、30s、45s及1min、2min、3min、4min、5min、10min、15min心电图变化，比较各组注射Pit前后以及给药组与模型对照组的差异，分析J点、T波的变化。结果用t检验进行数据统计分析。
实验结果
1.对于J点的影响
结果表明，在本实验条件下，对于垂体后叶素造成的急性心肌缺血，丹酚酸L冻干粉高剂量组(F组)在15s、30s、45s时，ECG的J点升高幅度小于模型对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。浸膏1高剂量组(B组)在15s时，ECG的J点升高幅度小于模型对照组，且差异有统计学意义(p＜0.05)。其他组和模型组比较各时间点均没有显著性降低。数据请见表16。
Figure GSA00000048393500361
2.对于T波的影响
结果表明，在本实验条件下，丹酚酸L冻干粉高剂量组(F组)在15s、30s时，ECG的T波升高幅度小于模型组，且差异有统计学意义(p＜0.05)。浸膏1高剂量组(B组)在15s时，ECG的T波升高幅度小于模型对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。其他各组和模型对照组进行比较，各时间点均没有显著性下降。数据请见表17。
Figure GSA00000048393500381
实验结论
丹酚酸L冻干粉高剂量组(F组)在15s、30s时，ECG的J点和T波升高幅度小于模型对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。
浸膏1高剂量组(B组)和模型对照组比较，15s时J点和T波都有显著性下降(P＜0.05)。
其它各组，在各时间点，与模型对照组比较，J点和T波都没有显著下降。
结果表明：在本实验条件下，丹酚酸L冻干粉(10mg/kg)和含有丹酚酸L的浸膏1(含丹酚酸L冻干粉4.67mg/kg)有抗急性心肌缺血作用。不含丹酚酸L的浸膏2在本实验剂量下没有抗急性心肌缺血作用。注意事项讨论：
1、J点定义：J点为QRS波群的终了与ST段交接处的结合点。
2、正常大鼠静脉注射垂体后叶素后，由于垂体后叶素可以收缩冠脉血管，引起动物急性心肌缺血，大鼠心电图的J点及T波均有明显增高。若给予某受试物后，该给药组的J点位移有明显恢复，T波亦呈下降趋势，逐渐趋于正常，说明该药物有拮抗垂体后叶素收缩冠状血管而导致的急性心肌缺血作用。无论对I期异常(0-45s内由垂体后叶素引起的异常)还是II期异常(45s-15min内由垂体后叶素引起的异常)都有治疗抑制作用，即可以认为该药物有抗心肌缺血作用。
3、垂体后叶素应当使用同一批号，以免药物效价差异而影响结果。重复注射垂体后叶素要隔2h以上，以免有耐受性。最好将所挑选的动物隔天使用。

Claims (15)

1.一种具有式(I)新的丹酚酸化合物L及其药学上可接受的盐、其溶剂化物和可水解的酯：
Figure FSA00000048393400011
式(I)。
2.权利要求1所述丹酚酸化合物L的制备方法，其包括如下步骤：
(1)提取：将丹参药材或者丹参与其他药材的混合物进行水提，醇沉，上清液浓缩为浸膏；
(2)分离：将步骤(1)中所得浸膏经水溶解后，过大孔吸附树脂，用水进行洗脱，将水洗脱液调至酸性后再次过大孔吸附树脂，用酸性水溶液冲洗除去杂质，然后用乙醇洗脱，乙醇洗脱液经浓缩得浸膏；
(3)纯化：将步骤(2)中所得浸膏过硅胶柱，洗脱液为氯仿-甲醇-甲酸，等度洗脱，收集洗脱液；用薄层层析法监测洗脱过程，合并同类洗脱液，得到所述丹酚酸L。
3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，将所述丹参药材或者丹参与其他药材的混合物切成饮片；所述水提步骤为加入4-8倍药材量体积的水，煎煮1.5-3.5h，滤过；药渣继续用3-6倍量水煎煮1-3h，滤过；合并滤液，浓缩至相对密度为1.11-1.28(80℃)的浸膏；所述醇沉步骤为向上述浸膏中加入95％醇沉淀至含醇量65％-70％，静置12-36h，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30-1.38(60℃)的浸膏；
所述步骤(2)中，过大孔吸附树脂柱，原药材与大孔吸附树脂重量比为5∶1-1∶1，用8-15倍量柱床体积的水冲洗；水洗脱液用盐酸调节至pH值2.2-3.5；将上述酸性水洗脱液再次过大孔吸附树脂，原药材与大孔吸附树脂重量比为5∶1-1∶1，用pH值2.2-3.5的盐酸冲洗至近无色；用3-8倍量的50％-95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，得浸膏；所述大孔吸附树脂选自AB-8、HPD450、HPD700、D101、D4020和X5型大孔吸附树脂中的一种。
所述步骤(3)中，将步骤(2)中浓缩得到的浸膏以有机溶剂溶解，加入层析硅胶拌样，将拌好的样品铺在装好的硅胶柱上，用90∶10∶3-40∶10∶0.5的氯仿-甲醇-甲酸洗脱。
4.权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述水提步骤为加入4倍药材量体积的水，煎煮2h，滤过；药渣继续用3倍量水煎煮1h，滤过；合并滤液，浓缩至相对密度为1.2的浸膏；所述醇沉步骤为向上述浸膏中加入95％醇进行醇沉至含醇量70％，静置24h，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.37的浸膏；
所述步骤(2)中，过大孔吸附树脂柱，原药材与大孔吸附树脂重量比为4∶1，用12倍量柱床体积的水冲洗；水洗脱液用盐酸调节至pH值3.0；将上述酸性水洗脱液再次过大孔吸附树脂，原药材与大孔吸附树脂重量比为4∶1，用pH值3.0的盐酸冲洗至近无色；用4倍量的95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，得浸膏；所述大孔吸附树脂为AB-8型。
所述步骤(3)中，将步骤(2)中浓缩得到的浸膏以甲醇溶解，加入200-300目层析硅胶拌样，将拌好的样品铺在装好的200-300目硅胶柱上，用50∶10∶2的氯仿-甲醇-甲酸洗脱。
5.权利要求2-4任意一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中所述的水提步骤使用碱的水溶液进行，所述的碱选自于由碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钾、碳酸钾和氢氧化钾组成的组中的至少一种。
6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述碱的水溶液为碳酸氢钠水溶液或氢氧化钠水溶液。
7.权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述碱的水溶液为0.30％-0.68％的碳酸氢钠水溶液或0.0025‰-0.004‰氢氧化钠水溶液。
8.权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述碱的水溶液为0.45％的碳酸氢钠水溶液。
9.权利要求2-8任意一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，在水提步骤之前还包括醇提的步骤。
10.权利要求9所述的制备方法，所述醇提的步骤为加入5-8倍药材量体积的50％-95％乙醇，煎煮2次，每次1-2h，滤过，醇提液弃去，药渣继续水提。
11.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1所述的丹酚酸L和药学上可接受的载体。
12.权利要求1所述的丹酚酸L在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
13.权利要求12所述的应用，其中，所述的心血管疾病至少包括选自下列组中的一种：由缺氧引起的血管舒张功能障碍；缺氧、缺糖和过氧化状态引起的体外神经细胞损伤和急性心肌缺血。
14.权利要求1所述的丹酚酸L在制备具有清除自由基活性的药物中的应用。
15.权利要求1所述的丹酚酸L在制备具有预防性抗氧化功能活性的药物中的应用。
CN201010135800.6A 2009-03-30 2010-03-29 一种丹酚酸化合物的制备方法和用途 Active CN101851162B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010135800.6A CN101851162B (zh) 2009-03-30 2010-03-29 一种丹酚酸化合物的制备方法和用途

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910068289 2009-03-30
CN200910068289.X 2009-03-30
CN201010135800.6A CN101851162B (zh) 2009-03-30 2010-03-29 一种丹酚酸化合物的制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101851162A true CN101851162A (zh) 2010-10-06
CN101851162B CN101851162B (zh) 2014-09-17

Family

ID=42802877

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201010135800.6A Active CN101851162B (zh) 2009-03-30 2010-03-29 一种丹酚酸化合物的制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101851162B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102249918A (zh) * 2011-05-20 2011-11-23 华南农业大学 一种丹酚酸戊镁盐的制备方法
CN104062392A (zh) * 2013-03-22 2014-09-24 天士力制药集团股份有限公司 一种测定血浆中丹酚酸l的方法
CN104418744A (zh) * 2013-08-29 2015-03-18 天士力制药集团股份有限公司 一种新的丹酚酸化合物t、其制备方法和用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6043276A (en) * 1998-06-25 2000-03-28 Georgetown University School Of Medicine Compounds obtained from salvia species having antiviral activity
CN1751706A (zh) * 2004-09-22 2006-03-29 天津天士力制药股份有限公司 一种丹参药材的提取方法
CN1830947A (zh) * 2006-04-21 2006-09-13 王国振 一种丹酚酸a的提取方法
CN100999470A (zh) * 2006-11-17 2007-07-18 北京本草天源药物研究院 一种丹参丹酚酸a及制剂的制备方法和用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6043276A (en) * 1998-06-25 2000-03-28 Georgetown University School Of Medicine Compounds obtained from salvia species having antiviral activity
CN1751706A (zh) * 2004-09-22 2006-03-29 天津天士力制药股份有限公司 一种丹参药材的提取方法
CN1830947A (zh) * 2006-04-21 2006-09-13 王国振 一种丹酚酸a的提取方法
CN100999470A (zh) * 2006-11-17 2007-07-18 北京本草天源药物研究院 一种丹参丹酚酸a及制剂的制备方法和用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YINRONG LU ET AL.: "Salvianolic acid L, a potent phenolic antioxidant from Salvia officinalis.", 《TETRAHEDRON LETTERS》 *
杜冠华: "丹酚酸药理作用及作用机制", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士） 医药卫生科技辑》 *
郭永学: "丹酚酸B的降解机理及纯化工艺研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102249918A (zh) * 2011-05-20 2011-11-23 华南农业大学 一种丹酚酸戊镁盐的制备方法
CN102249918B (zh) * 2011-05-20 2013-12-04 华南农业大学 一种丹酚酸戊镁盐的制备方法
CN104062392A (zh) * 2013-03-22 2014-09-24 天士力制药集团股份有限公司 一种测定血浆中丹酚酸l的方法
CN104418744A (zh) * 2013-08-29 2015-03-18 天士力制药集团股份有限公司 一种新的丹酚酸化合物t、其制备方法和用途
CN104418744B (zh) * 2013-08-29 2017-03-01 天士力制药集团股份有限公司 一种新的丹酚酸化合物t、其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN101851162B (zh) 2014-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5755633B2 (ja) 新規サルビアノール酸化合物ｌ、その調製方法及び使用
CN104418744B (zh) 一种新的丹酚酸化合物t、其制备方法和用途
CN101433545B (zh) 生物类黄酮类或多酚化合物在制备治疗帕金森病的药物中的用途
EP1506951B9 (en) Method for the preparation of total salvianolic acid
CN105582000A (zh) 杜仲皮或杜仲叶中萜类和木脂素类物质的制备方法及其在制备治疗老年性痴呆药物中的应用
AU2021469614A1 (en) Use of composition comprising astilbin and/or isomer thereof in preparation of drug for treating psoriasis
CN101851162B (zh) 一种丹酚酸化合物的制备方法和用途
KR101736916B1 (ko) 프탈라이드 유도체를 이용한 아토피 피부염 개선제 조성물
CN106619674A (zh) 栀子有效部位或有效成分在制备治疗异质性及多因性阿尔茨海默病药物或保健食品中的应用
CN101209278A (zh) 一种番泻叶提取物及其制备方法
CN102992988A (zh) 一种取代间苯三酚衍生物及其应用
KR101182199B1 (ko) 단삼 추출물 또는 크립토탄시논을 유효성분으로 함유하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 조성물
CN101115763B (zh) 来源于针叶樱桃的多元酚配糖物
CN111529515B (zh) 12,15-二氧-α-蛇床烯在制药中的应用
CN106554349A (zh) 野八角新异戊烯基取代c6‑c3类化合物及其制备方法、应用和其药物组合物
CN105218495A (zh) 一种丹参水溶性成分新化合物、制备方法及其应用
CN112807337A (zh) 一种坎巴嘎布提取物及其制备方法和应用
CN101721434A (zh) 一种阿里红有效组分及其制备方法和用途
CN107875162A (zh) 齐墩果烷型三萜皂苷的制备和应用
CN106421077A (zh) 一种高纯度文冠果总皂苷提取物的制备新方法及用途
TWI484969B (zh) 具有抗老化防皺的活性化合物
CN113209059A (zh) 一种石斛菲类组合物及其应用
CN110483598A (zh) 具有抗氧化活性的环烯醚萜苷类化合物及其制备方法和应用
CN106317003A (zh) 呋喃唑酮的药物组合物及其在生物医药中的应用
CN107865876A (zh) 常春藤皂苷元及其糖苷在制备治疗骨质疏松的药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: 300410 Tianjin City Hedong District of Beichen Puji Road No. 2 city of the modern Chinese Medicine

Applicant after: Tasly Pharmaceutical Group Co., Ltd.

Address before: 300410 Tianjin City Hedong District of Beichen Puji Road No. 2 city of the modern Chinese Medicine

Applicant before: Tianjin Tianshili Pharmaceutical Co., Ltd.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: TIANJIN TIANSHILI PHARMACEUTICAL CO., LTD. TO: TASLY PHARMACEUTICAL GROUP CO., LTD.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: 300410 Tianjin City Hedong District of Beichen Puji Road No. 2 (city of the modern Chinese Medicine)

Patentee after: Tasly Pharmaceutical Group Limited by Share Ltd

Address before: 300410 Tianjin City Hedong District of Beichen Puji Road No. 2 city of the modern Chinese Medicine

Patentee before: Tasly Pharmaceutical Group Co., Ltd.