CN104418744A - 一种新的丹酚酸化合物t、其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本文涉及医药领域。具体涉及一种结构式(I)所述的丹酚酸T、其手性异构体、其制备方法、含有该化合物的医药组合物、抗氧化剂、自由基清除剂以及该化合物的用途。

Description

一种新的丹酚酸化合物T、其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及医药领域。具体涉及一种新的丹酚酸类化合物。
背景技术
丹参为唇形科鼠尾草属植物的根部，性味苦，微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效。现代药理研究证明，丹参具有扩张冠脉、改善微循环、保护心脏的作用，能抑制和解除血小板聚集，提高机体耐缺氧能力以及抗肝炎、抗肿瘤和抗病毒等活性。2001年，中国医学科学院协和医科大学药物研究所报道了丹参及其同属植物的水溶性活性成分共计13种酚酸类化合物，包括丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、紫草酸、迷迭香酸及异丹酚酸C等(黎莲娘等人，医学研究通讯，2001年，第30卷，第7期)，并报道了这13种酚酸类化合物的药理作用。2002年，热娜·卡斯木等报道了丹酚酸K的化学结构(热娜·卡斯木等人，新疆医科大学学报，2002年，第25卷，第3期)。国外也对丹参水溶性活性成分进行了研究。1999年，美国乔治顿大学就“丹参酚酸类13个化学结构抗HIV整合酶和其它病毒”申请并获得了美国专利，表明丹参是一种极具潜力和开发价值的药用植物资源。
本发明所述的丹酚酸T正是在大量筛选研究过程发现的丹参中一个新化合物，而且涉及该结构的化合物及药理作用迄今尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种结构式(Ⅰ)的丹酚酸化合物T、其药学上可接受的盐、其溶剂化物和可水解的酯。
本发明的又一目的是提供丹酚酸T的制备方法。
本发明进一步的目的是提供含有丹酚酸T的药物组合物、抗氧化剂、自由基清除剂。
本发明的再一目的是提供丹酚酸T在制备治疗急性心肌梗塞和急性心肌缺血的药物中的应用。
本发明的再一目的是提供丹酚酸T在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。
本发明的再一目的是提供丹酚酸T在制备抗氧剂中的应用。
本发明的再一目的是丹酚酸T用于治疗急性心肌梗塞、急性心肌缺血或肺纤维化疾病。
本发明的再一目的是丹酚酸T用于延缓衰老。
本发明的再一目的是丹酚酸T用于抗氧化作用。
具体而言，本发明涉及如下(1)-(37)项发明：
[1]一种结构式(I)的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物和可水解的酯。
[2]一种如[1]所述的丹酚酸T的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：
(1)提取：将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提，滤液浓缩为水提浸膏，然后醇沉，使上清液浓缩为醇沉浸膏；
(2)分离：将所述步骤所述(1)中所得醇沉浸膏经水稀释后，过大孔吸附树脂，用酸性水溶液冲洗除去杂质，然后用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；
(3)纯化：将所述步骤(2)所得浸膏使用高压制备液相色谱仪进行纯化，色谱填料为C18反相硅胶柱，洗脱液为乙腈-水-甲酸，进行等度洗脱或梯度洗脱，检测波长280nm；用高效液相色谱监测洗脱过程，收集含有丹酚酸T的洗脱液，浓缩后得所述丹酚酸T。
[3]一种如[1]所述的丹酚酸T的手性异构体的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：
(1)提取：将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提，滤液浓缩为水提浸膏，然后醇沉，使上清液浓缩为醇沉浸膏；
(2)分离：将所述步骤(1)中所得醇沉浸膏经水稀释后，过大孔吸附树脂，用酸性水溶液冲洗除去杂质，然后用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；
(3)纯化：将所述步骤(2)所得浸膏使用高压制备液相色谱仪进行纯化，色谱填料为C18反相硅胶柱，洗脱液为乙腈-水-甲酸，进行等度洗脱，检测波长280nm；用高效液相色谱监测洗脱过程，合并含有丹酚酸T的洗脱液，浓缩后得所述丹酚酸T；
(4)手性异构体制备：将所述步骤(3)得到的丹酚酸T使用制备液相色谱仪进行手性异构体分离，色谱柱为反相手性色谱柱，洗脱液为乙腈-水-甲酸，进行等度洗脱或梯度洗脱，检测波长280nm；用高效液相色谱监测洗脱过程，分别收集含有(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T的洗脱液，冻干后得到所述(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T纯品。
[4]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物为饮片、粉碎颗粒或粉末，所述的其它药材为与丹参配伍的三七、黄芪或二者的组合。
[5]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述水提步骤为加入4-8倍所述药材体积的水，煎煮1.5-4h；滤过；滤液浓缩至相对密度为1.10-1.30(80℃)的水提浸膏。
[6]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述水提步骤为加入6倍所述药材体积的水，煎煮3h；滤过；滤液浓缩至相对密度为1.22(80℃)的水提浸膏。
[7]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述水提步骤使用碱性水溶液进行，所述碱性水溶液为碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢钾水溶液、碳酸钾水溶液、氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液中的至少一种。
[8]如[7]所述的制备方法，其中，所述碱性水溶液为0.3％-0.45％(w/v)的碳酸氢钠水溶液。
[9]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述醇沉步骤为向上述水提浸膏中加入95％(v/v)乙醇进行醇沉至醇含量为50％-70％(v/v)(25℃)，静置8-36h；取上清液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.5(60℃)的醇沉浸膏。
[10]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述醇沉步骤为向上述水提浸膏中加入95％(v/v)乙醇进行醇沉至醇含量为60％(v/v)(25℃)，静置24h；取上清液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.32(60℃)的醇沉浸膏。
[11]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂。
[12]如[11]所述的制备方法，其中，所述非极性或弱极性大孔吸附树脂为AB-8型、HPD450型、D101型或X5型大孔吸附树脂。
[13]如[12]所述的制备方法，其中，所述非极性或弱极性大孔吸附树脂为AB-8型。
[14]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中，所述步骤(1)中使用的药材与所述大孔吸附树脂的重量比为(5:1)-(1:1)。
[15]如[14]所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中使用的药材与所述大孔吸附树脂的重量比为3:1。
[16]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中，所述酸性水溶液选自盐酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液和乙酸水溶液中的任意一种或它们的组合；将溶液的pH调节为1.0-5.0；使用该酸性溶液冲洗至洗脱液近乎无色。
[17]如[16]所述的制备方法，其中，所述酸性水溶液为盐酸水溶液；将溶液的pH调节为3.0。
[18]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中，使用柱体积4-10倍量的50％-95％(v/v)乙醇进行洗脱；然后，将洗脱液浓缩为无醇味的浸膏。
[19]如[18]所述的制备方法，其中，使用柱体积5倍量的95％(v/v)乙醇进行洗脱。
[20]如[2]或[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(3)中，所述的高压制备液相色谱仪为动态轴向高压制备液相色谱仪，色谱填料为C18反相硅胶柱，将所述步骤(2)中所得浸膏用流动相溶解，所述流动相为乙腈:水:甲酸(体积比)＝(10:90:1)-(90:10:1)；洗脱液使用上述流动相配比，洗脱为等度洗脱或梯度洗脱；流速300mL/min；检测波长280nm；使用高效液相色谱法监测洗脱过程，收集保留时间在21.2-24.0min的组分，浓缩至干，得到丹酚酸T样品。
[21]如[20]所述的制备方法，其中，所述流动相为乙腈:水:甲酸(体积比)＝(10:90:1)-(50:50:1)。
[22]如[20]所述的制备方法，其中，所述流动相为乙腈:水:甲酸(体积比)＝15:85:1。
[23]如[20]所述的制备方法，其中，所述洗脱使用流动相乙腈:水:甲酸(体积比)＝15:85:1进行等度洗脱。
[24]如[3]所述的制备方法，其中，所述步骤(4)中，使用制备液相色谱仪进行手性异构体分离，色谱柱为反相手性色谱柱，将步骤(3)中所得的丹酚酸T样品用流动相溶解，所述流动相为乙腈:水:甲酸(体积比)＝(90:10:1)-(10:90:1)；洗脱液使用上述流动相配比，洗脱为等度洗脱或梯度洗脱；流速25mL/min；检测波长280nm；使用高效液相色谱法监测洗脱过程，分别收集保留时间在19.5-21.1min的(S)-丹酚酸T组分、23.9-25.3min的(R)-丹酚酸T组分，先低温浓缩后再冻干，得到(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T纯品。
[25]如[24]所述的制备方法，其中，所述流动相为乙腈:水:甲酸(体积比)＝17:83:1。
[26]如[24]所述的制备方法，其中，所述洗脱使用流动相乙腈:水:甲酸(体积比)＝17:83:1进行等度洗脱。
[27]如[24]所述的制备方法，其中，所述低温为10-40℃。
[28]如[24]所述的制备方法，其中，所述低温为30℃。
[29]一种含有[1]所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯的药物组合物。
[30]一种含有[1]所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯的抗氧化剂。
[31]一种含有[1]所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯的自由基清除剂。
[32][1]所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯在制备治疗急性心肌梗塞和急性心肌缺血的药物中的应用。
[33][1]所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。
[34][1]所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯在制备抗氧剂中的应用。
[35][1]所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯用于治疗急性心肌梗塞、急性心肌缺血或肺纤维化疾病。
[36][1]所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯用于延缓衰老。
[37][1]所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯用于抗氧化作用。
附图说明
图1丹酚酸T的高分辨质谱图，A：(R)-丹酚酸T；B：(S)-丹酚酸T。
图2丹酚酸T的1H-NMR图(500MHz，DMSO)，A：(R)-丹酚酸T；B：(S)-丹酚酸T。
图3丹酚酸T的13C-NMR图(125MHz，DMSO)，A：(R)-丹酚酸T；B：(S)-丹酚酸T。
图4丹酚酸T的DEPT谱，A：(R)-丹酚酸T；B：(S)-丹酚酸T。
图5丹酚酸T的COSY谱，A：(R)-丹酚酸T；B：(S)-丹酚酸T。
图6丹酚酸T的ROESY谱，A：(R)-丹酚酸T；B：(S)-丹酚酸T。
图7丹酚酸T的HSQC谱，A：(R)-丹酚酸T；B：(S)-丹酚酸T。
图8丹酚酸T的HMBC谱，A：(R)-丹酚酸T；B：(S)-丹酚酸T。
图9丹酚酸T的CD谱，A：(R)-丹酚酸T；B：(S)-丹酚酸T。
图10丹酚酸T的CD谱与ECD模拟谱对照，A：(R)-丹酚酸T；B：(S)-丹酚酸T。
图11(S)-丹酚酸T抗冠脉结扎急性心肌梗塞作用的研究中，各试验组的心脏切片图。
图12(R)-丹酚酸T和(S)-丹酚酸T对TGF-β1诱导的L929细胞增殖的抑制作用。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种结构式(Ⅰ)的丹酚酸化合物T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物和可水解的酯。
本发明的酚酸类新化合物，经过化合物的理化性质、高分辨质谱(QFT-ESI)、电喷雾质谱(ESI-MS)、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、COSY、HMBC、HMQC、CD等图谱的鉴定(图1-图10)，确证了其结构。
1H-NMR(氢谱)提示分子中有1个连氧次甲基质子信号δ4.93(1H，dd，8.0，4.5Hz)；11个芳香质子信号δ6.85(1H，d，8.5Hz)、δ7.31(1H，d，8.5Hz)、δ7.41(1H，d，15.5Hz)、δ6.27(1H，d，15.5Hz)、δ6.62(1H，s)、δ6.63(1H，d，8.0Hz)、δ6.47(1H，d，8.0Hz)、δ6.44(1H，d，2.0Hz)、δ6.55(1H，d，8.5Hz)、δ6.43(1H，dd，8.5，2.0Hz)、δ7.69(1H，s)；2个脂肪族质子信号δ2.89(2H，ddd，14.0，8.0，4.5Hz)。
13C-NMR(碳谱)给出27个碳信号，其中1个脂肪碳信号δ36.0；1个连氧次甲基碳信号δ72.8；3个羰基碳信号δ166.0、δ170.6、δ168.4；22个双键碳信号δ123.7、δ126.4、δ142.9、δ147.7、δ115.0、δ118.4、δ143.7、δ113.9、δ127.1、δ116.5、δ143.9、δ144.8、δ115.5、δ120.0、δ126.0、δ117.3、δ144.8、δ147.2、δ115.3、δ122.9、δ141.1、δ123.4。
本发明化合物两种异构体的旋光分别为：-157.5°、196.6°。对C-8′绝对构型设定为S/R构型的化合物分别进行了分子结构优化，然后采用具有TD-SCF的BPV86方法，在6-31++G(2d，p)基组下进行计算，读取其计算结果与本发明化合物CD谱对照，最终结果发现两种构型化合物的计算结果与本发明化合物的实验CD谱图基本重合，推断本发明化合物两种异构体的C-8′的绝对构型分别为S构型和R构型(参见图10)。本发明的化合物主要HMBC相关如下：
本发明的化合物为一个新的丹酚酸类化合物，本文将其命名为丹酚酸T。
在提取制备过程中，由于本发明的化合物可能发生构型、构象的变化，因此，波谱数据可能会有所变化。但由构型、构象变化所产生的各种异构体均在本发明的保护范围之内。
根据本领域的普通技术知识和现有技术，本发明的丹酚酸T还可以利用其药学上可接受的盐或溶剂化物的形式。本发明的丹酚酸T的药学上可接受的盐包括：常规的、药学上可接受的无机碱或有机碱生成的盐，所述的盐通过常规的成盐方法制备而得。适合的盐的实例包括钠、钾、锂、镁、铝、钙、锌等的盐，或与N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、黄连素形成的盐。在描述本发明第二方面之前，下文所提到的丹酚酸T包括式(I)所表示的丹酚酸T及其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物和可水解的酯。
本发明的丹酚酸T适宜以药物组合物的形式给药。这类组合物可以按照常规方式与一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂混合使用。若有可能，在治疗上将本发明的丹酚酸T作为原料药给药，优选活性成分直接作为药物制剂。在与其它成分相容和对服药者无害的意义上，载体必须是药学上可接受的。
因此，本发明进一步提供本发明的丹酚酸T的药物制剂，包括本发明的丹酚酸T和一种或多种药学上可接受的载体，以及含有或不含其它治疗和/或预防性成分。这些制剂适用于口服、胃肠外(包括皮下例如注射或药库片；真皮内；鞘内；肌内例如药库；静脉内等)、直肠和局部(如舌下)给药，但最适合的给药途径应取决于患者的病症。该制剂可以是单位制剂，并且可以通过用药学领域熟知的任一种方法制备。所有方法包括使本发明的丹酚酸T与载体结合的步骤，该载体构成一种或多种辅助成分。一般来说，该制剂的制备过程如下：使本发明的丹酚酸T与液体载体、或微细粉碎的固体载体、或二者的结合均匀而紧密的结合，然后，如果必要的话，使产物成型为所必须的制剂。
通常可使用标准的制药技术，即可将本发明的丹酚酸T和药用载体制得本发明药物组合物，这些方法包括混合、制粒和压制。本领域技术人员所熟知的是，可药用载体或稀释剂的形式和特性取决于与其混合的活性成分的量、给药途径和其它已知因素。
本文中，所用的药用载体是可与药物组合物联用给药的各种有机或无机载体，例如：用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂和包衣剂；也可使用药用添加剂，例如着色剂和甜味剂。所述药用载体选自：糖醇，例如甘露醇、山梨醇、木糖醇；氨基酸，例如盐酸半胱氨酸、蛋氨酸、甘氨酸；维生素C；EDTA二钠、EDTA钙钠；无机盐，例如一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液；氯化钠、氯化钾；焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠；碳酸钙、碳酸氢钙；硬脂酸盐，例如硬脂酸钙、硬脂酸镁；无机酸，例如盐酸、醋酸、硫酸、磷酸；有机酸盐，例如乳酸钠；寡糖、多糖、纤维素及其衍生物，例如麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、蔗糖、乳糖、环糊精(例如β-环糊精)、淀粉；硅衍生物；藻酸盐；明胶；聚乙烯吡咯烷酮；甘油；琼脂；表面活性剂，例如吐温80；聚乙二醇；磷脂类材料；高岭土；滑石粉等。
其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂，例如糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂；胶囊剂，例如硬胶囊剂、软胶囊剂；口服液；口含剂；颗粒剂；冲剂；丸剂；散剂；膏剂；丹剂；混悬剂；粉剂；溶液剂；注射剂；栓剂；膏剂，例如软膏剂、硬膏剂；霜剂；喷雾剂；滴剂以及贴剂。本发明的制剂优选：口服剂型，如胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；以及注射剂，如粉针剂、注射液、输液等。本发明的制剂最优选为片剂。
其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂、粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
优选的示例赋形剂包括：乳糖、D-甘露醇、D-山梨醇、淀粉如α-淀粉、糊精、结晶纤维素、低取代的羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、阿拉伯胶、支链淀粉、轻质无水硅酸、合成硅酸铝、硅酸铝镁等。
优选的示例润滑剂包括：硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉、硅胶等。
优选的示例粘合剂包括：α-淀粉、蔗糖、明胶、阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、糖、D-甘露醇、海藻糖、糊精、支链淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、吡咯烷酮等。
优选的示例崩解剂包括：乳糖、糖、淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、氨烷基钠、羧甲基淀粉钠、轻质无水硅酸、低取代的羟丙基纤维素等。
优选的示例包衣剂包括：羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇等。
优选的示例着色剂包括：水溶性食用枸橼黄染料(食用染料例如食用红No.2和No.3，食用黄No.4和No.5，食用蓝No.1和No.2)；水不溶性色沉染料(例如上述水溶性食用枸橼黄染料的铝盐)；天然染料(例如β-胡萝卜素、叶绿素、铁丹)等。
优选的示例甜味剂包括：糖精钠、甘草次酸、阿斯帕坦、甜菊等。
片剂的制备方法一般为，本发明的丹酚酸T与一种或多种药学上可接受的辅料一起压制或模制。
本发明的丹酚酸T还可以制成口服液体制剂，例如水性或油性悬液、溶液、乳剂、糖浆剂等。本发明的丹酚酸T还可以是干燥产品，使用前用水或其它适合的载体混合。这类液体制剂可以含有常规的添加剂，可以包括悬浮剂，例如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(可以包括食用油)，如杏仁油、分馏椰子油、油性酯、丙二醇或乙醇；以及防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸。
用于胃肠道外给药的制剂包括水性与非水性无菌注射液，其中可以含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂、等渗剂等；以及水性与非水性无菌混悬液，其中可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以存放在单剂量或多计量容器内，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在临时用前加入无菌的液体载体，例如注射用水。
用于直肠给药的制剂可以是栓剂，含有常规的栓剂基质，例如可可脂、硬脂肪酸或其它甘油酯，或乙二醇。
用于口腔局部、例如颊部或舌下给药的制剂包括锭剂，其中在加味的基质中包含活性成分，该基质例如蔗糖和阿拉伯胶；还包括软锭剂，其中在基质中含有活性成分，该基质可以是明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶。
本发明的丹酚酸T还可以配制成药库制剂。这类长效制剂可以通过植入(如皮下或肌内)或肌内注射给药。所以，本发明丹酚酸T可以与适合的聚合物或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂进行配制，或者配制成微溶性衍生物，例如微溶性盐。
根据本领域的普通技术知识和现有技术，本发明所涉及的治疗包括预防和既定疾病或症状的治疗。而且，用于治疗所需的本发明丹酚酸T的量应根据所治疗病症的性质和患者条件而异，或遵医嘱。一般来说，用于成人治疗的剂量通常将在0.02-5000mg/天的范围，优选1-1500mg/天。所需剂量可以是单一的剂量或多次的剂量，按适当的间隔给药，例如每天给予两次、三次、四次或更多。根据本发明的制剂可以含有0.1-99wt％的活性成分，对片剂和胶囊剂优选含有30-95wt％的活性成分，液体制剂优选含有3-50wt％的活性成分。
第二方面，本发明涉及丹酚酸T的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1、提取：将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提，滤液浓缩为水提浸膏，然后醇沉，使上清液浓缩为醇沉浸膏；
2、分离：将步骤1中所得醇沉浸膏经水稀释后，过大孔吸附树脂，用酸性水溶液冲洗除去杂质，然后用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；
3、纯化：将步骤2所得浸膏使用高压制备液相色谱仪进行纯化，色谱填料为C18反相硅胶柱，洗脱液为乙腈-水-甲酸，等度洗脱或梯度洗脱，检测波长280nm；用高效液相色谱监测洗脱过程，收集含有丹酚酸T的洗脱液，浓缩后得所述丹酚酸T。
进一步地，本发明涉及丹酚酸T的手性异构体的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：
1、提取：将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提，滤液浓缩为水提浸膏，然后醇沉，使上清液浓缩为醇沉浸膏；
2、分离：将步骤1中所得醇沉浸膏经水稀释后，过大孔吸附树脂，用酸性水溶液冲洗除去杂质，然后用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；
3、纯化：将步骤2所得浸膏使用高压制备液相色谱仪进行纯化，色谱填料为C18反相硅胶柱，洗脱液为乙腈-水-甲酸，进行等度洗脱或梯度洗脱，检测波长280nm；用高效液相色谱监测洗脱过程，收集含有丹酚酸T的洗脱液，浓缩后得所述丹酚酸T；
4、手性异构体制备：将上述丹酚酸T样品使用制备液相色谱仪进行手性异构体分离，色谱柱为反相手性色谱柱，洗脱液为乙腈-水-甲酸，等度洗脱或梯度洗脱，检测波长280nm；用高效液相色谱监测洗脱过程，分别收集含有(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T的洗脱液，冻干后得到所述(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T纯品。
所述步骤1中，丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物，可以是饮片、粉碎颗粒或粉末，优选饮片；所述的其它药材可以是本领域技术人员所公知的可以与丹参配伍的中药材，优选三七、黄芪或二者的组合。
所述步骤1中，所述水提步骤为加入4-8倍药材体积的水，煎煮1.5-4h，优选加入6倍药材体积的水煎煮3h；滤过；滤液浓缩至相对密度为1.10-1.30(80℃)的水提浸膏，优选相对密度为1.22(80℃)的水提浸膏。为了提高提取效率、加快酚酸类物质的溶出，所述水提步骤优选使用碱性水溶液进行，所述碱性水溶液优选碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢钾水溶液、碳酸钾水溶液、氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液中的至少一种，优选0.3％-0.45％(w/v)的碳酸氢钠水溶液。
所述步骤1中，所述醇沉步骤为向上述水提浸膏中加入95％(v/v)乙醇进行醇沉至醇含量为50％-70％(v/v)(25℃)，优选60％(v/v)，静置8-36h，优选静置24h；取上清液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.5(60℃)、优选相对密度为1.32(60℃)的醇沉浸膏。
所述步骤2中，所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性树脂，可以选自AB-8型、HPD450型、D101型或X5型大孔吸附树脂，优选AB-8型；所述步骤(1)中使用的药材与所述大孔吸附树脂的重量比为(5:1)-(1:1)，优选3:1；所述酸性水溶液选自盐酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液和乙酸水溶液中的任意一种或它们的组合，优选盐酸水溶液；将溶液的pH调节为1.0-5.0，优选3.0；使用该酸性溶液冲洗至洗脱液近乎无色。然后，使用柱体积4-10倍量的50％-95％(v/v)乙醇进行洗脱，优选使用柱体积5倍量的95％(v/v)乙醇进行洗脱；洗脱液浓缩为无醇味的浸膏。
所述步骤3中，所述的高压制备液相色谱仪可以使用动态轴向高压制备液相色谱仪，例如法国NOVASEP LC80-600，色谱填料优选为C18反相硅胶柱(10μm，YMC公司)，将步骤2中所得浸膏用流动相溶解(乙腈:水:甲酸(体积比)＝(10:90:1)-(90:10:1))，优选乙腈:水:甲酸(体积比)＝(10:90:1)-(50:50:1)，更优选乙腈:水:甲酸(体积比)＝15:85:1；洗脱液使用上述流动相配比，洗脱可以选择等度洗脱或梯度洗脱，优选乙腈:水:甲酸(体积比)＝15:85:1等度洗脱；流速300mL/min；检测波长280nm。使用高效液相色谱法监测洗脱过程，收集保留时间在21.2-24.0min的组分，浓缩至干，得到丹酚酸T样品。
所述步骤4中，可以使用Waters Prep400制备液相色谱仪进行手性异构体分离，色谱柱为反相手性色谱柱(250×20mm，5μm)，将步骤3中所得的丹酚酸T样品用流动相溶解(乙腈:水:甲酸(体积比)＝(90:10:1)-(10:90:1))，优选乙腈:水:甲酸(体积比)＝17:83:1；洗脱液使用上述流动相配比，洗脱可以选择等度洗脱或梯度洗脱，优选乙腈:水:甲酸(体积比)＝17:83:1等度洗脱；流速25mL/min；检测波长280nm。使用高效液相色谱法监测洗脱过程，分别收集保留时间在19.5-21.1min的(S)-丹酚酸T组分、23.9-25.3min的(R)-丹酚酸T组分，先低温(10-40℃，优选30℃)浓缩后再冻干，得到(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T纯品。
本发明的药效试验结果表明：本发明的丹酚酸T具有抗急性心肌梗塞活性和抗急性心肌缺血活性，具有较好的自由基清除力和还原力，并且，还具有肺纤维化治疗活性。
因此，本发明还涉及如下方面：
含有丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯的抗氧化剂、自由基清除剂。
丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯在制备治疗急性心肌梗塞和急性心肌缺血的药物中的应用。
丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。
丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯在制备抗氧剂中的应用。
丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯用于治疗急性心肌梗塞、急性心肌缺血或肺纤维化疾病。
丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯用于延缓衰老。
丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯用于抗氧化作用。
实施例
下面将参考制备例和试验例对本发明的技术方案进行进一步的详细描述。然而应当理解的是，本发明的保护范围并不限于这些制备例和试验例。
制备例1 丹酚酸T、(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T的制备
取丹参饮片，置中药煎煮器中，加入丹参饮片质量6倍量的0.3％(w/v)的碳酸氢钠水溶液，煎煮2.5h，滤过；滤液浓缩至相对密度1.22(80℃)的水提浸膏。
在上述浸膏中加入95％(v/v)乙醇进行醇沉至醇含量60％(v/v)(25℃)，静置24h；取上清液减压浓缩至相对密度1.32(60℃)的醇沉浸膏。
将上述醇沉浸膏用水溶解，过AB-8大孔吸附树脂，用pH＝3.0的盐酸水溶液冲洗至洗脱液近乎无色，然后，用柱体积5倍量的95％(v/v)乙醇进行洗脱，洗脱液浓缩为无醇味的浸膏。
将前一步骤得到的浸膏用流动相溶解(乙腈:水:甲酸(体积比)＝15:85:1)，使用法国NOVASEP LC80-600动态轴向高压制备液相色谱仪进行纯化，色谱填料为C18反相硅胶柱(10μm，YMC公司)；用乙腈:水:甲酸(体积比)＝15:85:1进行等度洗脱；流速300mL/min；检测波长280nm。使用高效液相色谱法监测洗脱过程，收集保留时间在21.2-24.0min的组分，用旋转蒸发仪浓缩至干，得到丹酚酸T样品。
将上述丹酚酸T样品用流动相(乙腈:水:甲酸(体积比)＝17:83:1)溶解，使用Waters Prep400制备液相色谱仪进行手性异构体分离，色谱柱为反相手性色谱柱(250×20mm，5μm)；用乙腈:水:甲酸(体积比)＝17:83:1进行等度洗脱；流速25mL/min；检测波长280nm。使用高效液相色谱法监测洗脱过程，收集保留时间在19.5-21.1min的(S)-丹酚酸T组分、23.9-25.3min的(R)-丹酚酸T组分，先用旋转蒸发仪在30℃下浓缩洗脱液，然后再冻干，得到(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T纯品。
高分辨质谱给出准分子离子峰[M-H]-(S)-丹酚酸T m/z＝537.1033；(R)-丹酚酸T m/z＝537.1032。
(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T的核磁共振图谱数据归属见下表：
表1 (R)-丹酚酸T的核磁共振数据(DMSO，J Hz)
表2 (S)-丹酚酸T的核磁共振数据(DMSO，J Hz)
制备例2 丹酚酸T、(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T的制备
取丹参和三七饮片，置中药煎煮器中，加入丹参和三七饮片体积4倍量的0.45％(w/v)碳酸氢钠水溶液，煎煮2h，滤过；滤液浓缩至相对密度1.25(80℃)的水提浸膏。
在上述水提浸膏中加入95％(v/v)乙醇进行醇沉至65％(v/v)(25℃)，静置12h；取上清液减压浓缩至相对密度1.28(60℃)的醇沉浸膏。
将上述醇沉浸膏用水溶解，过AB-8大孔吸附树脂，用pH＝2.5的盐酸水溶液冲洗至近乎无色，然后，使用柱体积4倍量的95％(v/v)乙醇进行洗脱，洗脱液浓缩为无醇味的浸膏。
将前一步骤得到的浸膏用流动相溶解(乙腈:水:甲酸(体积比)＝15:85:1)，使用法国NOVASEP LC80-600动态轴向高压制备液相色谱仪进行纯化，色谱填料为C18反相硅胶(10μm，YMC公司)；采用如下条件进行线性梯度洗脱：从0min至60min，乙腈:水:甲酸(体积比)由15:85:1线性变化至20:80:1；流速250mL/min；检测波长280nm。使用高效液相色谱法监测洗脱过程，收集保留时间在29.5-32.1min组分，用旋转蒸发仪浓缩至干，得到丹酚酸T样品。
将上述丹酚酸T样品用流动相溶解(乙腈:水:甲酸(体积比)＝17:83:1)，使用Waters Prep400制备液相色谱仪进行手性异构体分离，色谱柱为反相手性色谱柱(250×20mm，5μm)；采用如下条件进行线性梯度洗脱：从0min至45min，乙腈:水:甲酸(体积比)由17:83:1线性变化至22:78:1；流速20mL/min；检测波长280nm。使用高效液相色谱法监测洗脱过程，收集保留时间在25.2-27.1min的(S)-丹酚酸T组分、32.4-34.2min的(R)-丹酚酸T组分，先用旋转蒸发仪在30℃下浓缩洗脱液，然后再冻干，得(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T纯品。
高分辨质谱给出准分子离子峰[M-H]-(S)-丹酚酸T m/z＝537.1035；(R)-丹酚酸T m/z＝537.1034。
(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T的核磁共振图谱数据归属见下表：
表3 (S)-丹酚酸T的核磁共振数据(DMSO，J Hz)
表4 (R)-丹酚酸T的核磁共振数据(DMSO，J Hz)
制备例3 丹酚酸T、(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T片剂的制备
工艺：
1.制粒
丹酚酸T或(S)-丹酚酸T或(R)-丹酚酸T及处方中其它辅料分别过100目筛，称取处方量的丹酚酸T与微晶纤维素、淀粉和羧甲基淀粉钠，采用等量递加法混合均匀，用适量5％(w/v)PVP的无水乙醇溶液制软材，14目筛制粒，于50-60℃干燥1h，加入处方量的硬脂酸镁，用14目筛进行整粒。
2.压片
取上述颗粒用冲模压片机压片。
制备例4 丹酚酸T、(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T胶囊剂的制备
工艺：
1.制粒
丹酚酸T或(S)-丹酚酸T或(R)-丹酚酸T及处方中其它辅料分别过100目筛，称取处方量的丹酚酸T与淀粉、羧甲基淀粉钠采用等量递加法混合均匀，用适量5％(w/v)PVP的无水乙醇溶液制软材，14目筛制粒，50-60℃干燥1h，加入处方量的硬脂酸镁，用14目筛进行整粒。
2.灌装
取上述颗粒装入胶囊壳中。
制备例5 丹酚酸T、(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T注射液的制备
工艺：
取处方量的丹酚酸T或(S)-丹酚酸T或(R)-丹酚酸T，加注射用水1000mL使溶解，搅拌均匀；另取处方量的甘露醇，加注射用水500mL使溶解，加入上述溶液中，搅匀，用0.5g活性碳保温搅拌30min，过滤，滤液调节pH为4.5-5.0，加注射用水至2500mL，除菌过滤，分装即得。
制备例6丹酚酸T、(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T冻干粉针的制备
工艺：
称取处方量的丹酚酸T或(S)-丹酚酸T或(R)-丹酚酸T以及甘露醇，加注射用水1500mL，搅拌溶解，加0.5g活性碳搅拌脱色20min，用0.45μm滤膜脱碳，补水至2000mL，除菌过滤、分装、冷冻干燥即得。
药效试验例1 (S)-丹酚酸T抗冠脉结扎急性心肌梗塞作用
实验材料
1、受试物及试剂：
(S)-丹酚酸T，批号：120301，由天士力控股集团研究院提供。
阿司匹林肠溶片：规格：100mg/片，拜耳医药保健有限公司，批号：BJ07160。
0.9％(w/v)氯化钠注射液：规格：500mL，南京小营药业集团有限公司，批号：2012051205。
水合氯醛：AR，国药集团化学试剂有限公司，批号：20100111。
红四氮唑(TTC)，国药集团化学试剂公司，批号：F20040308。
肌酸激酶(CK)测定试剂盒，批号：20120917；乳酸(LD)测定试剂盒，批号：20120919；丙二醛(MDA)测定试剂盒，批号：20120919；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，批号：20120918；肌酸激酶同工酶(CK-MB)测定试剂盒，批号：20120922；ATP酶测定试剂盒，批号：20120921。均由南京建成生物工程研究所提供。
2.主要仪器：
HX-300呼吸机：成都泰盟科技有限公司。
ECG-6511心电图机：上海光电医用电子仪器有限公司。
HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司产品。
BS224s型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
BS110s型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
3.实验动物：
SD大鼠，体重210～230g，雄性，苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司，动物生产质量合格证号：SCXK(苏)2009-0001。
实验方法及结果
1.剂量设计：
(S)-丹酚酸T冻干粉给药剂量：20mg/kg体重、10mg/kg体重。阿司匹林：30mg/kg体重。
2.实验方法
取清洁级雄性SD大鼠，按体重随机分组，分别为：伪手术组(蒸馏水)、模型组(蒸馏水)、阿司匹林组、(S)-丹酚酸T低剂量组、(S)-丹酚酸T高剂量组，每组10只。各组大鼠每天灌胃给药一次，连续给药10天。给药体积为1mL/100g体重。于末次给药后1h，腹腔注射水合氯醛300mg/kg体重，麻醉，仰位固定，先后用碘酒和酒精对手术切口部位消毒，之后在第三、四根肋骨开胸，并进行人工呼吸，暴露心脏，用医用无损伤缝合针5/0结扎冠脉左前降支，迅速关闭胸腔并常规消毒，手术操作过程不超过30s，术后继续人工呼吸1～2min，肌注(i.m.)20万单位青霉素预防感染。手术开始前5min、结扎后0s、1min、5min、15min、1h、4h分别记录标准II导联心电图，考察心电图J点变化。
试验结束后，立即取出心脏，用生理盐水洗去血液，剪去心房及心底部血管，称心室重量，将心室沿房室沟平均切成5片放入1％(w/v)TTC溶液内，在37℃恒温水浴染色5min，取出后首先拍数码照片，而后分离未染色部分(即梗塞部分)并称重计算其占整个心室重量的百分率(心肌梗塞百分率)，并与缺血模型组进行组间t检验。计算梗塞百分率公式如下：
梗塞百分率(％)＝(苍白区重量/心室重量)×100％
以2000rpm对血液进行离心处理25min后，分离出血清，按试剂盒所述的方法，测定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LD)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、ATP酶的含量或活性。结果见表5、表6、表7及图11所示。
由表5 可见，各组大鼠冠脉结扎手术后心电图J点显著高于手术前(P<0.01)，说明造模成功。与模型组比较，术后5min，(S)-丹酚酸T高剂量组能显著抑制J点的抬高(P<0.05)；术后15min，(S)-丹酚酸T高剂量组能显著抑制J点的抬高(P<0.05)；术后1h和4h，阿司匹林组、(S)-丹酚酸T高剂量组均能显著抑制J点的抬高(P<0.05)。
由表6 可见，模型组和各给药组心肌梗塞率均显著高于伪手术组(P<0.01)，表明造模成功。与模型组相比，阿司匹林组、(S)-丹酚酸T高剂量组均能显著降低心肌梗塞率(P<0.05)。
由表7可见，模型组中的血清MDA、LD、CK、CK-MB水平显著高于伪手术组(P<0.01)，而SOD、Na+-K+-ATPase活力显著低于伪手术组(P<0.01)，表明造模成功。与模型组相比，阿司匹林组、(S)-丹酚酸T低剂量组、(S)-丹酚酸T高剂量组可显著降低心肌缺血大鼠血清MDA及LD含量(P<0.05)；阿司匹林组、(S)-丹酚酸T高剂量组可显著升高心肌缺血大鼠血清SOD活性(分别为P<0.05、P<0.01)；阿司匹林组、(S)-丹酚酸T低剂量组、(S)-丹酚酸T高剂量组可显著降低心肌缺血大鼠血清CK的活力(P<0.05，P<0.01)；阿司匹林组、(S)-丹酚酸T高剂量组可显著降低CK-MB的活力(P<0.01)；阿司匹林组、(S)-丹酚酸T低剂量组、(S)-丹酚酸T高剂量组可显著升高Na+-K+-ATPase的活力(P<0.05)。
从图11可以看出，(S)-丹酚酸T高剂量组与阿司匹林组具有同等程度的抗冠脉结扎急性心肌梗塞作用。通过进一步的试验显示，与(S)-丹酚酸T类似，(R)-丹酚酸T高剂量组与阿司匹林组也具有同等程度的抗冠脉结扎急性心肌梗塞作用。
药效试验例2(R)-丹酚酸T对大鼠实验性急性心肌缺血的保护作用研究实验材料
1.受试物及试剂：垂体后叶素(Pit)注射液，南京新百药业有限公司生产，批号：081004：生理盐水，天津天安药业股份有限公司生产，规格500ml/瓶，批号：201009231，(R)-丹酚酸T，纯度95％以上，由天士力控股集团研究院提供。
2.主要仪器：MedLab八道生理记录仪：南京美易科技公司。
3.实验动物：SD大鼠，体重220-250g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证：SCXK(京)2007-0001。饲养在动物饲养室中，室温20-25℃，照明时间12h，食用鼠专用饲料(北京科澳协力饲料有限公司生产)，饮用自来水。
实验方法
1.剂量设计：(R)-丹酚酸T冻干粉给药剂量：高剂量组：10.0mg/kg体重；低剂量组：5.0mg/kg体重。
2.分组：
2.1动物筛选：于正式实验前分别给大鼠尾静脉注射垂体后叶素(Pit)(1U/kg)，描记正常及注射后5min心电图，观察J点抬高、T波异常的情况，将未注射前就出现异常心电图者以及对Pit不敏感者剔除。
2.2动物分组：入选大鼠随机分为3组，分别为①模型对照组；②(R)-丹酚酸T冻干粉低剂量组；③(R)-丹酚酸T冻干粉高剂量组。
3.实验方法：SD大鼠，体重220-250g，雌雄各半，随机分组，每组10只。模型对照组的大鼠每日灌胃等容积的生理盐水，给药组每日灌服不同样品的水悬液，全部动物均连续给药7天。末次给药后40min，麻醉大鼠，连接仪器，描记II导联正常心电图。按1U/kg体重由大鼠尾静脉恒速推注垂体后叶素(Pit)，推注时间控制在10s左右，描记给药后0s、15s、30s、45s及1min、5min、10min心电图变化，比较各组注射Pit前后以及给药组与模型对照组的差异，分析J点、T波的变化。结果用t检验进行数据统计分析。
实验结果
1.对于J点的影响
表8的结果表明，在本实验条件下，对于垂体后叶素造成的急性心肌缺血，(R)-丹酚酸T高剂量组在15s、30s、45s时，ECG的J点升高幅度小于模型对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。
表8 对急性心肌缺血的中J点的变化
*：P<0.05，与模型组进行比较。
表9的结果表明，在本实验条件下，(R)-丹酚酸T高剂量组在15s、30s时，ECG的T波升高幅度小于模型组，且差异有统计学意义(P<0.05)。
表9 对急性心肌缺血的中T波的变化
*：P<0.05，与模型组进行比较。
实验结论
(R)-丹酚酸T高剂量组在15s、30s时，ECG的J点和T波升高幅度小于模型对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明：在本实验条件下，(R)-丹酚酸T(10.0mg/kg)有抗急性心肌缺血作用。通过进一步的试验显示，与(R)-丹酚酸T类似，(S)-丹酚酸也具有类似的抗急性心肌缺血作用。
药效试验例3(S)/(R)-丹酚酸T的自由基俘获反应
自由基具有直接或间接地发挥强氧化作用，广泛地参与机体的生理与病理过程。机体自由基过量时，能通过氧化作用损伤机体。丹酚酸类化合物是酚羟基的供体，具有抗氧化活性的结构基础。本药效实验采用1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)自由基清除反应模型观察(S)/(R)-丹酚酸T对自由基的清除效力。
1、试剂和仪器
(S)/(R)-丹酚酸T，纯度95％以上，由天士力控股集团研究院提供。维生素C和DPPH均购于Sigma公司。紫外分光光度计ΜV-1800购于北京瑞利分析仪器公司。
2、实验方法
反应总体积为2ml，取1ml不同浓度样品80％甲醇溶液加入100μMDPPH甲醇溶液中，混匀后在暗处25℃下反应20min，测定反应液在517nm处的吸光度。实验中采用维生素C作为阳性比较。自由基清除率采用下述公式计算：
自由基清除率(％)＝[1-A样品/A对照)/A对照]×100％。
其中，A样品为受试样品的吸光度值，A对照为无受试样品的吸光度值。
3、实验结果
(S)/(R)-丹酚酸T的自由基清除力明显大于维生素C的自由基清除力，但两种异构体的自由基清除力无显著性差异(P<0.05)。
表10(S)/(R)-丹酚酸T的自由基清除力
样品(μg/ml) 0.625 1.25 2.5 5 10
(S)-丹酚酸T 10.32±0.81 28.77±2.26 44.22±1.95 86.01±8.92 98.97±5.41
(R)-丹酚酸T 10.51±0.73 28.15±2.47 43.41±1.85 85.59±8.75 99.47±5.14
维生素C 8.02±0.47 15.56±1.81 21.32±1.89 56.29±5.93 79.51±7.26
药效试验例4 (S)/(R)-丹酚酸T的还原力测定
药物还原力的大小在一定程度上反映了其预防性抗氧化功能的强弱。本发明对(S)/(R)-丹酚酸T的还原力进行实验研究。
1、试剂和仪器
(S)/(R)-丹酚酸T，纯度95％以上，由天士力控股集团研究院提供。铁氰化钾，分析纯，购于天津市化学试剂一厂。三氯乙酸，分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。三氯化铁，分析纯，购于天津市风船化学试剂科技有限公司。维生素C购于Sigma公司。紫外分光光度计ΜV-1800购于北京瑞利分析仪器公司。冷冻离心机：Z323K，德国HEMMLE。
2、实验方法
吸取0.5mL含有不同浓度(S)/(R)-丹酚酸T的200mM pH6.8磷酸缓冲液，0.2mL1.0％(w/v)铁氰化钾溶液，50℃水浴20min后冰浴冷却，加入0.5ml10％三氯乙酸溶液，于1000g/min离心10min，取上清液1.0mL，加1.0mL蒸馏水和0.2ml0.1％(w/v)FeC13溶液，静置10min后于700nm处测定吸光度，同时进行空白实验。维生素C是一种强还原性物质，在本研究中作为阳性对照。样品还原力等于样品吸光值减去空白对照组的吸光值，吸光度越大，则还原力越强。
3、实验结果
(S)/(R)-丹酚酸T的还原力均明显强于维生素C，二者的还原力无显著性差异(P<0.05)。
表11 (S)/(R)-丹酚酸T的还原能力
样品(μg/ml) 3.125 6.25 12.5 25 50
(S)-丹酚酸T 0.157±0.027 0.215±0.011 0.039±0.012 0.771±0.023 1.573±0.036
(R)-丹酚酸T 0.152±0.034 0.212±0.009 0.042±0.011 0.761±0.018 1.561±0.026
药效试验例5(S)/(R)-丹酚酸T抗小鼠肺纤维化实验
肺纤维化是肺损伤后常见的反应和并发症，其主要的病理改变为弥漫性肺泡炎症、肺成纤维细胞灶的形成以及细胞外基质的反复修复和过度沉积。肺纤维化常以呼吸功能永久丧失为最终结局，目前尚缺乏有效防治手段。博来霉素诱导的小鼠肺纤维化是研究人体肺纤维化常用的模型，在这个模型中博来霉素直接和间接产生的氧自由基是促发肺纤维化的机制之一。
1、试剂和仪器
(S)/(R)-丹酚酸T，纯度95％以上，由天士力控股集团研究院提供。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成工程研究所。博来霉素，购自Sigma公司。
2、动物
昆明种小鼠，全雌性，体重22-25g，北京维通利华实验动物公司提供，在温度23±2℃、相对湿度65％-75％、光照周期12h:12h环境中饲养。
3、实验方法
将40只小鼠随机分为4组：①正常对照组，鼻内滴生理盐水，灌胃给生理盐水；②模型对照组：鼻内滴博来霉素，灌胃给生理盐水；③(S)-丹酚酸T组(16mg/kg)：鼻内滴博来霉素，灌胃给(S)-丹酚酸T溶液；④(R)-丹酚酸T组(16mg/kg)：鼻内滴博来霉素，灌胃给(R)-丹酚酸T溶液；每组10只小鼠。
实验第一天，用水合氯醛将小鼠麻醉，博来霉素50μg/只对小鼠一次性滴鼻建立肺纤维化模型。实验第二天，两个治疗组灌胃给予(S)/(R)-丹酚酸T，模型组和正常组灌胃给与等容量的生理盐水，每日1次，连续3周。实验第21天，眼眶静脉取血分离血清用于检测TGF-β1，处死小鼠取肺脏，用双蒸馏水研磨(肺脏与双蒸馏水的比例为1:5(w/v))成组织匀浆，离心后用于组织MDA、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)检测。
统计方法：结果均以x±s表示，采用SPSS110统计软件进行组间单因素方差分析，两两比较用两组独立样本t检验。
4、实验结果
对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响：与正常小鼠比较，博来霉素诱导的小鼠纤维化肺组织中TGF-β1升高9.96倍，MDA升高1.83倍，抗氧化酶SOD、POD、CAT降低约1.5倍，血清TGF-β1也增加4.44倍，造模成功。(S)/(R)-丹酚酸T均能抑制博来霉素诱导的小鼠血清TGF-β1升高(表12)，阻止博来霉素诱导的小鼠肺脏SOD、POD、CAT降低(表13)，并降低肺脏MDA及TGF-β1含量(表12)。
表12(S)/(R)-丹酚酸T对博来霉素诱导的小鼠组织及血清中因子水平的影响(x±s，n＝10)
组别 血清TGF-β1(ng/L) 组织TGF-β1(pg/g) MDA(μg/g)
正常组 145±19 129±17 241±24
模型组 651±124 1350±264 472±54
(S)-丹酚酸T组 263±35** 541±51** 324±33**
(R)-丹酚酸T组 254±29** 562±69** 311±29**
*：P<0.05；**：P<0.01，与模型组进行比较。
表13(S)/(R)-丹酚酸T对博来霉素诱导的小鼠组织中氧化酶类水平的影响(x±s，n＝10)
组别 SOD(U/g) POD(U/g) CAT(U/g)
正常组 61.2±6.7 21.3±2.0 27.4±2.4
模型组 33.6±5.2 11.5±1.6 14.9±1.4
(S)-丹酚酸T组 57.3±4.9* 15.3±2.1** 24.9±2.3**
(R)-丹酚酸T组 52.2±5.1** 16.4±1.9* 23.1±2.9**
*：P<0.05；**：P<0.01，与模型组进行比较。
药效试验例6(S)/(R)-丹酚酸T对TGF-β诱导的成纤维细胞的抑制作用
TGF-β诱导的成纤维细胞过度增生和成纤维细胞激活后向肌成纤维细胞分化在肺纤维化形成过程中扮演了重要的角色，抑制TGF-β信号转导可阻止肺成纤维细胞的增生和激活，对有效的防治肺纤维化是重要的手段之一。
1、试剂和仪器
(S)/(R)-丹酚酸T，纯度95％以上，由天士力控股集团研究院提供。DMEM培养基、MTT、重组TGF-β1购自Sigma公司。青霉素和链霉素为石家庄制药集团公司产品。胎牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所产品。胶原检测试剂盒，Biocolor公司产品。层粘连蛋白(LN)放免试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
EL-800X型酶标仪，购自BIO-TEK公司；CO2培养箱，购自Thermo公司；流式细胞仪，购自FACS公司。
2、细胞株
L929细胞，购自军事医学科学院细胞研究所。
3、实验方法
将L929细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液调细胞数5×107/L接种于96孔板，培养24h。补充含2μg/L的TGF-β1及不同浓度(S)/(R)-丹酚酸T的同样培养基。每个做6个复孔，(S)/(R)-丹酚酸T终浓度设为0、1、3、10、20、40、80、150μmol/L。培养72h后除去培养基，按MTT法测定细胞活性。
4、实验结果
(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T对TGF-β1诱导的L929细胞增殖有抑制作用(图12)，(S)-丹酚酸T的IC50为26.1μmol/L，(R)-丹酚酸T的IC50为26.9μmol/L，两者无显著性差异。
本发明的药效试验结果表明：本发明的丹酚酸T具有抗急性心肌梗塞活性和抗急性心肌缺血活性，具有较好的自由基清除力和还原力，并且还具有肺纤维化的治疗活性。

Claims (9)

1.一种结构式(I)的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物和可水解的酯。
2.一种如权利要求1所述的丹酚酸T的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：
(1)提取：将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提，滤液浓缩为水提浸膏，然后醇沉，使上清液浓缩为醇沉浸膏；
(2)分离：将所述步骤(1)中所得醇沉浸膏经水稀释后，过大孔吸附树脂，用酸性水溶液冲洗除去杂质，然后用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；
(3)纯化：将所述步骤(2)所得浸膏使用高压制备液相色谱仪进行纯化，色谱填料为C18反相硅胶柱，洗脱液为乙腈-水-甲酸，进行等度洗脱或梯度洗脱，检测波长280nm；用高效液相色谱监测洗脱过程，收集含有丹酚酸T的洗脱液，浓缩后得所述丹酚酸T。
3.一种如权利要求1所述的丹酚酸T的手性异构体的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：
(1)提取：将丹参药材或丹参药材与其它药材的混合物进行水提，滤液浓缩为水提浸膏，然后醇沉，使上清液浓缩为醇沉浸膏；
(2)分离：将所述步骤(1)中所得醇沉浸膏经水稀释后，过大孔吸附树脂，用酸性水溶液冲洗除去杂质，然后用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩为浸膏；
(3)纯化：将所述步骤(2)所得浸膏使用高压制备液相色谱仪进行纯化，色谱填料为C18反相硅胶柱，洗脱液为乙腈-水-甲酸，进行等度洗脱或梯度洗脱，检测波长280nm；用高效液相色谱监测洗脱过程，收集含有丹酚酸T的洗脱液，浓缩后得所述丹酚酸T；
(4)手性异构体制备：将所述步骤(3)得到的丹酚酸T使用制备液相色谱仪进行手性异构体分离，色谱柱为反相手性色谱柱，洗脱液为乙腈-水-甲酸，进行等度洗脱或梯度洗脱，检测波长280nm；用高效液相色谱监测洗脱过程，分别收集含有(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T的洗脱液，冻干后得到所述(S)-丹酚酸T和(R)-丹酚酸T纯品。
4.一种含有权利要求1所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯的药物组合物。
5.一种含有权利要求1所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯的抗氧化剂。
6.一种含有权利要求1所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯的自由基清除剂。
7.权利要求1所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯在制备治疗急性心肌梗塞和急性心肌缺血的药物中的应用。
8.权利要求1所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯在制备治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。
9.权利要求1所述的丹酚酸T、其药学上可接受的盐、其手性异构体、溶剂化物或可水解的酯在制备抗氧剂中的应用。
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