CN100457748C - 一种酚酸类化合物丹酚酸n及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酚酸类化合物及其制备方法和在抗艾滋病中的用途，所说化合物以丹参为原料，采用溶媒提取法和大孔吸附树脂纯化法等工艺，结合常用干燥法制成总酚酸，然后将此总酚酸以水加热溶解，再经柱层析分离手段，反复纯化得到新化合物丹酚酸N，通过酶和细胞活性实验表明，该化合物具有抗HIV活性，有望开发成为一种新的抗艾滋病药物。

Description

一种酚酸类化合物丹酚酸N及其应用

技术领域：

本发明涉及丹参中一个新酚酸类化合物及其在抗艾滋病中的应用。

背景技术：

丹参为唇形科鼠尾草属植物的根部，性味苦，微寒，归心、肝经，具有祛淤止痛、活血通经、清心除烦之功效，中医传统以其配伍组方。现代药理研究证明，丹参具有扩张冠脉、增加冠脉流量、改善微循环、保护心脏的作用，能抑制和解除血小板聚集，提高机体耐缺氧能力以及抗肝炎、抗肿瘤和抗病毒等活性。1988年，中国医学科学院医药生物技术研究所通过抗病毒中药的研究，发现丹参水提物同时具有显著的抗HIV和抗HBV作用，并就“丹参抗艾滋病病毒和抗乙型肝炎病毒的用途”申请了中国发明专利(专利号：ZL95105902.5)。之后，利用活性追踪方法，发现丹参中总酚酸具有抗HIV整合酶活性，并从中分离到一些有活性化合物，其中一个为新化合物迷迭香酸糖苷并已申请专利(申请号：200310117349.5)。国外也对丹参抗病毒活性成分进行了研究。1999年，美国乔治顿大学就“丹参酚酸类13个化学结构抗HIV整合酶和其他病毒”申请并获得了美国专利。Abd-ElazeN等发现，丹参中的紫草酸和紫草酸B具有抑制HIV整合酶活性，已于2002年申请国际专利(WO 02/26726)。Tewtrakul等报道，迷迭香酸也具有抑制HIV整合酶活性。以上所说丹参中的许多化合物均具有抗病毒特别是抗艾滋病病毒作用，表明丹参是一种极具潜力和开发价值的药用植物资源。本发明所述丹酚酸N，正是在大量筛选研究过程发现的丹参中一个新化合物，而且涉及该结构的化合物，迄今尚未见有报道。

本发明目的之一是，提供一种新化合物丹酚酸N。

本发明目的之二是，提供化合物丹酚酸N的制备方法。

本发明目的之三是，提供丹酚酸N的抗HIV用途。

发明内容：

本发明涉及的丹酚酸N的结构如式(1)所示：

本发明是通过如下方案实现的：

一、提取：取丹参药材根部，切成饮片或粉碎成粉末，选用一定量的溶媒，室温下渗漉提取，或用超声波震荡提取，或在加热状态下浸润提取或回流提取，滤液备用。药渣再加适量溶媒，煎煮或回流提取数次，滤过。合并滤液，减压浓缩，即得提取浸膏。

二、纯化：将提取浸膏以水加热溶解，注入D-101型、HP20型、SP825、AB-8型或其它类型的大孔吸附树脂柱内，先水洗至基本无物质流出为止，水洗液弃去；再用甲醇、乙醇、丙酮、含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种进行洗脱，洗脱时可以等浓度洗脱，也可以梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩，利用低温低压浓缩即得总酚酸。该总酚酸以水加热溶解，经Sephadex LH-20、toyopearlHW40-C、ODS柱层析反复分离纯化，洗脱液为乙醇、甲醇或丙酮∶水＝0∶1～1∶0，得到化合物丹酚酸N。

三、鉴定：通过化合物的理化性质、ESIMS图谱、¹HNMR(CD₃OD)、¹³CNMR(CD₃OD)、gCOSY(CD₃OD)、gHSQC(CD₃OD)和gHMBC(CD₃OD)图谱，对化合物结构进行了鉴定，证明丹酚酸N为一个新化合物。

四、测活：利用HIV-1逆转录酶抑制活性³H标记检测法、HIV-1整合酶抑制活性ELISA检测法和MTT染色法测定对HIV-1IIIB的抑制作用，结果表明，化合物丹酚酸N对HIV的活性具有明显抑制作用。

发明效果：

本发明提供了一种新酚酸类化合物丹酚酸N，由于其化学结构是新的且具有HIV-1逆转录酶抑制活性和HIV-1整合酶抑制活性，因而具有进一步研制开发成有效的抗艾滋病药物前景。

附图说明：

图1.化合物丹酚酸N的ESI质谱。

图2.化合物丹酚酸N在CD₃OD溶剂中的碳谱。

图3.化合物丹酚酸N在CD₃OD溶剂中的氢谱。

图4.化合物丹酚酸N在CD₃OD溶剂中的gCOSY谱。

图5.化合物丹酚酸N在CD₃OD溶剂中的gHSQC谱。

图6.化合物丹酚酸N在CD₃OD溶剂中的gHMBC谱。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但不以此限制本发明。

实施例1.提取方法

取丹参药材根部4kg，切成饮片，加8倍量水浸泡0.5小时后煎煮提取1小时，滤过，滤液备用。药渣再加6倍量水煎煮提取2次，每次0.5小时，滤过，合并三次滤液，减压浓缩，得提取浸膏0.8kg。

实施例2.纯化方法

将提取浸膏加5倍量水加热溶解，慢慢注入已处理好的HP20型、SP825型大孔吸附树脂柱内，先用水洗脱，弃去；再用50％乙醇洗脱，收集药材3倍量50％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得总酚酸170g。

将总酚酸以水加热溶解，慢慢加入到Sephadex LH-20柱中，先用水洗脱，接着用2倍柱体积的40％乙醇洗脱，弃去；再用2倍柱体积的60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，再经ODS柱反复柱层析纯化，得到新化合物丹酚酸N。

实施例3.结构鉴定：

丹酚酸N：黄色无定型粉末，C₂₆H₂₀O₁₀，与1％FeCl₃试剂反应呈现褐色，ESI-MS(图1)：515(M+Na)⁺、493(M+H)⁺、295(M-197-Na)⁺。¹HNMR(CD₃OD)δ(图3)：7.88(1H，d，J＝16.0Hz，H-7)和6.22(1H，d，J＝16.0Hz，H-8)为一组反式双键质子信号，其gHMBC(图6)谱提示，该组反式双键质子与羰基共轭，7.27(1H，d，J＝8.5Hz，H-7″)和6.81(1H，d，J＝8.5Hz，H-8″)为一组顺式双键质子信号，3.05(1H，dd，J＝15.0/4.0Hz，H_α-7′)，2.96(1H，dd，J＝15.0/8.0Hz，H_β-7′)和5.14(1H，dd，J＝8.0/4.0Hz，H-8′)，提示化合物中有-CH(O)-CH₂-结构片段，结合芳香区的一组ABX偶合系统，6.70(1H，d，J＝1.5Hz，H-2′)，6.66(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)和6.57(1H，dd，J＝1.5/8.0Hz，H-6′)，表明该化合物中存在一个β-(3，4-二羟基苯基)乳酸结构单元，6.81(1H，s，H-2″)和6.59(1H，s，H-5″)为苯环上的对位氢，6.78(1H，d，J＝1.5Hz，H-2)和6.77(1H，d，J＝1.5Hz，H-6)为另一苯环上的间位氢。¹³CNMR(CD₃OD)(图2)谱，共有两个羰基碳信号，其gHMBC(图6)谱提示，δ173.47为羧基碳，δ168.07为酯基碳，由于此类酚酸类化合物均含有邻二酚羟基结构单元，每个单元中δc在140～150范围内均有2个接氧芳香季碳，故根据δc在140～150范围内出现的接氧芳香季碳个数，可判断该化合物的聚合度。而该化合物的¹³CNMR(CD₃OD)(图2)中，δc在140～150范围内共有7个接氧芳香季碳，由此推测，结构中应含三个邻二酚羟基结构单元，并存在一个二苯噁庚英骨架，这种结构的存在由HMBC谱进一步证实，同时由gHMBC(图6)谱可知，7″，8″-不饱和双键与芳香核的5位碳相连。另外，¹³CNMR(CD₃OD)(图2)谱还表明，该化合物中存在两组双键碳，一组为δ143.66和δ117.35，另一组为δ125.26和δ117.52，一个含氧次甲基峰δ37.89和一个亚甲基峰δ74.66，化学位移由gCOSY(图4)和gHSQC(图5)谱确认。gHMBC(图6)谱表明，共轭羧基碳与β-(3，4-二羟基苯基)乳酸结构单元中的含氧次甲基质子δ5.14具有相关性，说明α，β-不饱和羰基与乳酸结构单元通过酯键相连。综上所述，从而推导出该化合物的结构。由于该属植物中酚酸类化合物的命名是根据化合物发现的先后顺序，以丹酚酸为基础，再结合英文字母顺序来命名，故该化合物命名为丹酚酸N。该化合物的¹H和¹³C-NMR化学位移数据由gCOSY(图4)、gHMQC(图5)和gHMBC(图6)谱确定。

                            丹酚酸N

氢谱数据归属如下：

¹HNMR(CD₃OD)δppm：6.77(1H，d，J＝1.5Hz，H-2)、6.78(1H，d，J＝1.5Hz，H-6)、7.88(1H，d，J＝16Hz，H-7)、6.22(1H，d，J＝16Hz，H-8)、6.70(1H，d，J＝1.5Hz，H-2′)、6.66(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)、6.57(1H，dd，J＝8.0/1.5Hz，H-6′)、3.05(1H，dd，J＝4.5/15Hz，H-7′α)、2.96(1H，dd，J＝8.5/15Hz，H-7′_β)、5.14(1H，dd，J＝4.5/8.0Hz，H-8)、6.80(1H，s，H-2″)、6.59(1H，s，H-5″)、6.82(1H，d，J＝8.5Hz，H-7″)、7.28(1H，d，J＝8.5Hz，H-8″)

碳谱数据归属如下：

¹³CNMR(CD₃OD)δppm：

132.50(C-1)、124.80(C-2)、143.92(C-3)、152.17(C-4)、123.26(C-5)、132.82(C-6)、143.66(C-7)、117.35(C-8)、168.07(C-9)、129.25(C-1′)、117.57(C-2′)、146.22(C-3′)、145.30(C-4′)、116.30(C-5′)、121.82(C-6′)、37.89(C-7′)、74.66(C-8′)、173.47(C-9′)、125.00(H-1″)、109.66(H-2″)、147.33(H-3″)、148.31(H-4″)、115.51(H-5″)、152.28(H-6″)、117.52(H-7″)、125.26(H-8″)

实施例4.活性测定：

1)HIV-1逆转录酶抑制活性³H标记检测法

将标定浓度的基因工程HIV-1逆转录酶(p66/51)、不同浓度的药液、反应缓冲液和³H-dTTP加入后，混合，37℃反应30分钟，0℃终止反应。反应液滴加滤纸片上，冷三氯乙酸洗3次，乙醇脱水后烤干。液闪仪测定放射性强度cpm值，同时设酶对照、空白对照和药物对照，计算半数抑制浓度值IC₅₀＝67.10μg/ml(表1)。

2)HIV-1整合酶抑制活性ELISA检测法

将供体底物包被COVALINK NH酶标板，洗板后加入：反应缓冲液、不同浓度药液和标定浓度的基因工程HIV整合酶，同时设酶对照、空白对照和阳性对照(S-y)，37℃反应1小时。加入靶底物，混合，37℃反应1小时，洗板。加入BSA(牛血清蛋白)，室温30分钟，洗板。加入碱性磷酸酶标记的亲和素，室温反应1小时，洗板。加显色底物显色30分钟，加0.1N NaOH终止显色反应。酶标仪测OD_450nm值，计算半数抑制浓度IC₅₀＝1.78μg/ml(表1)

3)MTT染色法测定对HIV-1IIIB的抑制作用

将MT-4细胞接种于96孔细胞培养板内，同时分别加丹酚酸N或阳性药2倍稀释共8个浓度的药液，每个稀释度重复3孔，设细胞对照组。置37℃、5％CO₂和饱和湿度培养箱内培养，每天观察细胞病变。加药后第四天(96h)后吸弃上清100μl，每孔加10μl5mg/mlMTT染色，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内继续培养4小时，每孔加100μl50％DMF-17％Triton X-100脱色液，37℃过夜，在酶联仪上测定波长为570nm的OD_570nm值，计算药物半数有毒浓度值TC₅₀＝3.7μg/ml(表1)

将MT-4细胞接种于96孔细胞培养板内，加入HIV-1实验室病毒株IIIB培养液，同时加最大无毒浓度以下稀释的不同浓度提取物或阳性对照药AZT和NVP药液，在37℃、5％CO₂和饱和湿度下培养，观察细胞病变。于第7天用MTT法染色，测定OD_570nm值，计算药物半数有效浓度EC₅₀＝0.649μg/ml，并计算出治疗指数SI＝5.7μg/ml(表1)。

表1丹酚酸N抗HIV活性

Claims (7)

1、一种酚酸类化合物丹酚酸N，其结构如式(1)所示：

式(1)。

2、一种制备如权利要求1所述丹酚酸N的方法，其特征是以丹参为原料，采用溶媒提取和大孔吸附树脂纯化工艺，结合常用干燥法制成总酚酸，并将所说总酚酸以水加热溶解，再经柱层析分离手段，反复纯化，得到所说化合物丹酚酸N。

3、如权利要求2所述的制备方法，其特征是，溶媒提取法系将丹参药材切成饮片或粉碎成粉末，选用水、甲醇或乙醇，在室温下渗漉提取或用超声波振荡提取，或在加热状态下浸润提取，或回流提取，其提取次数是一次或是多次。

4、如权利要求2所述的制备方法，其特征是，纯化工艺中所采用的大孔吸附树脂为D-101型、HP20型、SP825或AB-8型吸附树脂，洗脱溶剂用水、甲醇、乙醇、丙酮、含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮的一种或多种，洗脱时等浓度洗脱或梯度洗脱。

5、如权利要求2所述的制备方法，其特征是柱层析分离手段所采用的填料为Sephadex LH-20、toyopearl HW40-C、ODS中的一种或多种结合使用，或通过HPLC来制备。

6、含有权利要求1所述丹酚酸N和药学上可接受的载体的药物组合物。

7、权利要求1所说丹酚酸N在制备抗HIV药物中的应用。

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