CN107478756B - 王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，属于凉茶植物饮料质量控制技术领域。该分离纯化方法以AB‑8型大孔树脂进行粗分，以HP20型大孔树脂进行细分，在液相色谱进行检测监控的条件下，以Sephadex LH‑20凝胶与反相硅胶柱为固定相，对各组份进行色谱分离纯化，最终得到能够作为王老吉凉茶指标性成分的单体化合物，可用做对照品，辅助检测其中各成分，为王老吉凉茶的质量检测提供先决条件和保障。

Description

王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及凉茶植物饮料质量控制技术领域，特别是涉及一种王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法。

背景技术

岭南凉茶文化拥有悠久的历史积蕴和民俗内涵。古时岭南为百越之地，多瘴气，染者无有不死。岭南人民在与恶劣自然环境的不断抗争中，积累了调理保健、防病治病的宝贵经验。他们根据本地的气候、水土特性，以一些具有清热解毒、生津止渴、祛火除湿等功效的岭南特色中草药为基础，在中医养生理论指导下经过长期实践，创造出各种各样的"凉茶"，用于防病治病，形成了一条岭南文化的独特风景线。

王老吉凉茶是历史最早的广东凉茶，始创于1828年(清道光八年)，至今已有180多年历史，被公认为凉茶始祖，有"药茶王"之称。最近几十年，随着现代化生产设备和先进管理理念的引入，凉茶业发生了大变革，过去守着凉茶铺喝凉茶的局面被打破，凉茶被加工成饮用更方便的颗粒剂、袋泡茶、利乐包、罐装等多种规格。

王老吉凉茶以水、白砂糖、仙草、蛋花、菊花、夏枯草、甘草、金银花、布渣叶为原料，经提取、浓缩、配制、灭菌、包装等主要加工工艺制成，其口感清凉爽口，冷热饮用皆宜，受到消费者的喜爱。为全面的反映及监测该品种的内在质量，促进该品种的发展，应开展该品种中各成分检测方法的研究。

但是，要对王老吉凉茶中各成分进行检测，需要满足的先决条件为获得这些指标性成分的纯品，用以辅助检测。

发明内容

本发明提供一种王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，能够将王老吉凉茶中的指标性成分分离纯化，用以辅助检测其中各成分，为王老吉凉茶的质量检测提供先决条件和保障。

一种王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，包括以下步骤：

粗分：取王老吉凉茶浸膏，上样至AB-8型大孔吸附树脂柱；以3-5个柱体积的水洗脱，弃去水液；再以2-4个柱体积的体积百分数为70-80％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液；蒸干得稠膏，备用；

细分：取上述稠膏，上样至HP20型大孔树脂柱；以3-5个柱体积的水洗脱，弃去水液；再以8-12个柱体积的体积百分数为15-25％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂得到组份2；以8-12个柱体积的体积百分数为35-45％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将相同流份合并，依次得到组份3和组份4；以15-25个柱体积的体积百分数为60-80％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂得到组份5；

纯化：将上述得到的各组份经Sephadex LH-20凝胶与反相硅胶柱分离纯化，并以液相色谱进行检测监控，得到单体化合物，即为王老吉凉茶指标性成分。

上述王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，以AB-8型大孔树脂进行粗分，以HP20型大孔树脂进行细分，再在液相色谱进行检测监控的条件下，以Sephadex LH-20凝胶与反相硅胶柱为固定相，对各组份进行色谱分离纯化，最终得到能够作为王老吉凉茶指标性成分的单体化合物，可用做对照品，辅助检测其中各成分，为王老吉凉茶的质量检测提供先决条件和保障。

在其中一个实施例中，所述粗分步骤中：取王老吉凉茶浸膏，上样至AB-8型大孔吸附树脂柱；以4个柱体积的水洗脱，弃去水液；再以3个柱体积的体积百分数为75％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液；蒸干得稠膏，备用；

所述细分步骤中：取上述稠膏，上样至HP20型大孔树脂柱；以3-5个柱体积的水洗脱，弃去水液；再以10个柱体积的体积百分数为20％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂得到组份2；以10个柱体积的体积百分数为40％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将相同流份合并，依次得到组份3和组份4；以20个柱体积的体积百分数为75％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂得到组份5。

在其中一个实施例中，所述纯化步骤中：

将组份2上样至反相C18硅胶柱，先以甲醇-水梯度洗脱，再配合Sephadex LH-20凝胶柱和反相C18硅胶柱，以甲醇-水梯度洗脱，并通过液相色谱进行检测监控，收集合并相同流份，纯化得到甘草酸、甘草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、异绿原酸A、绿原酸。

在其中一个实施例中，所述纯化步骤中：

将组份3上样至反相C18硅胶柱，先以甲醇-水梯度洗脱，再配合Sephadex LH-20凝胶柱和反相C18硅胶柱，以甲醇-水梯度洗脱、氯仿甲醇等度洗脱，并通过液相色谱进行检测监控，收集合并相同流份，纯化得到木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、水仙苷、芦丁、原儿茶酸、和儿茶醛。

在其中一个实施例中，所述纯化步骤中：

将组份4上样至反相C18硅胶柱，先以甲醇-水梯度洗脱，再配合Sephadex LH-20凝胶柱和反相C18硅胶柱，以甲醇-水梯度洗脱，并通过液相色谱进行检测监控，收集合并相同流份，纯化得到咖啡酸、迷迭香酸、三叶豆苷、和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖。

在其中一个实施例中，所述纯化步骤中：

将组份5上样至Sephadex LH-20凝胶柱，先以氯仿-甲醇梯度洗脱，再配合反相C18硅胶柱和Sephadex LH-20凝胶柱，以甲醇-水梯度洗脱，并通过液相色谱进行检测监控，收集合并相同流份，纯化得到迷迭香酸甲酯、β-香树脂醇。

在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，所述液相色谱进行检测监控的条件为：

固定相：碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；

流动相：乙腈或甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为16:84-70:30；或以乙腈为流动相；

流速：0.8-1.2mL/min。

采用上述液相色谱条件，能够很好的表征分离纯化中各组份，为分离和纯化提供指引和依据。

在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，所述固定相为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)色谱柱或Agilent Zorbax SB-C18(4.6×150mm)色谱柱。

在其中一个实施例中，所述AB-8型大孔树脂分离步骤中，将王老吉凉茶浸膏以水稀释至相对密度在1.15-1.2之间，再上样至AB-8型大孔吸附树脂柱。以上述浓度上样，具有较好的吸附效果。

在其中一个实施例中，所述HP20型大孔树脂分离步骤中，将所述稠膏以水溶解后离心，取离心上清液上样至HP20型大孔树脂柱。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，以AB-8型大孔树脂进行粗分，以HP20型大孔树脂进行细分，在液相色谱进行检测监控的条件下，以Sephadex LH-20凝胶与反相C18硅胶柱为固定相，对各组份进行色谱分离纯化，最终得到能够作为王老吉凉茶指标性成分的单体化合物，可用做对照品，辅助检测其中各成分，为王老吉凉茶的质量检测提供先决条件和保障。

并且，该方法对具体分离纯化工艺条件进行了优化，得到提高得到的指标性成分单体的纯度和产量。

附图说明

图1为实施例中粗分工艺流程示意图；

图2为实施例中细分工艺流程示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

以下实施例中的仪器与试药如下：

仪器：

NMR：用Bruker Avance DRX 500MHz超导核磁共振仪(瑞士Bruker公司)测定，TMS内标；

MS：用Agilent 1260-6460液相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)；

实验室专用超纯水机(重庆利迪现代水技术设备有限公司)、电热鼓风干

燥箱101-1AB型、万分之一电子天平(Sartorius BP110s，德国sartorius公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣仪器有限公司)、离心机(TDL-5-A型，上海安亭科学仪器厂)、循环水泵(SHZ-D型，巩义市予华仪器有限责任公司)；

大连依利特P230双泵梯度高效液相色谱仪、EC2000色谱工作站、Kromasil C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱。

试药：

王老吉凉茶的流浸膏，呈棕褐色稠浸膏状，有特殊气味，味微甜，由王老吉药业股份有限公司提供。

液相用甲醇为色谱纯(Merck公司)，水为超纯水，其余所用试剂均为国产分析纯(广东光华化学厂有限公司)。

AB-8型大孔树脂：购自南开大学化工厂，型号：AB8。

HP20型大孔树脂：购自南开大学化工厂，型号：HP20。

Sephadex LH-20凝胶：购自Pharmada，型号Biotech AB Swedon 2S-100μm。

反相C18硅胶：购自YMC CO，LTD，Kyoto，Japan，型号YMC-GEL ODS-A。

洗脱液浓度表示均为体积百分数。

实施例1

一种王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，包括以下步骤：

一、粗分。

取王老吉凉茶的流浸膏，加蒸馏水稀释至相对密度在1.15-1.2之间(60℃测得)，缓缓加于预处理好的AB-8型大孔树脂柱，待样品被树脂吸附完全后，水洗4BV(Bed Volume，柱体积)，弃去水液，75％乙醇洗脱3BV，收集洗液，蒸干后得稠膏，备用，最后用3BV 95％乙醇冲柱，如图1所示。

二、细分。

取上述75％乙醇洗脱洗下稠膏，加热水溶解后离心，取离心液分别加于HP20型大孔树脂柱(水浸泡后湿法装柱)，水洗3～5BV，弃去，20％甲醇洗脱10BV，收集洗脱液，回收溶剂得到组份2(Pre2)；40％甲醇洗脱10BV，相同流份合并回收溶剂，依次得到组份3(Pre3)和组份4(Pre4)；10-25BV的75％甲醇洗至无明显化学成分(经液相色谱检测保留时间为12-13分钟无色谱峰，约需洗脱20BV)，得到组份5(Pre5)，如图2所示。

三、纯化。

1、组分2纯化。

1-1、第一层纯化。

将组份2(Pre2)上样至反相C18硅胶柱(5cm×50cm)，先以甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为16:84；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分2-1(Pre2-1)。

当流份成分产生变化时，调整洗脱液为甲醇-水(v：v＝5:5)洗脱，采用和上述相同的流动相监控，收集合并相同流份，得到组分2-2(Pre2-2)。

当流份成分产生变化时，调整洗脱液为甲醇-水(v：v＝55:45)洗脱，采用和上述相同的流动相监控，收集合并相同流份，得到组分2-3(Pre2-3)。

1-2、第二层纯化。

将上述得到的组分2-1上样至反相C18硅胶柱(1cm×40cm)，以甲醇-水(v：v＝2:8)洗脱，通过液相色谱进行检测监控再运用质谱和核磁共振技术进行鉴定，得到单体化合物WLJ-1。

将上述得到的组分2-2上样至反相C18硅胶柱(5cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝1:9)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为20:80；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分2-2-1(Pre2-2-1)。

当流份成分产生变化时，调整洗脱液为甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，采用和上述相同的流动相监控，收集合并相同流份，得到组分2-2-2(Pre2-2-2)。

将上述得到的组分2-3上样至反相C18硅胶柱(2.6cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝3:7)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分2-3-1(Pre2-3-1)和2-3-2(Pre2-3-2)。

1-3、第三层纯化。

将上述得到的组分2-2-1上样至反相C18硅胶柱(2.6cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝5:95)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为25:75；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分2-2-1-1。

当流份成分产生变化时，调整洗脱液为甲醇-水(v：v＝1:9)洗脱，采用和上述相同的流动相监控，收集合并相同流份，得到组分2-2-1-2。

将上述得到的组分2-2-2上样至凝胶制备柱，以甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到单体化合物WLJ-4。

将上述得到的组分2-3-1上样至反相C18硅胶柱(2.6cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝5:95)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分2-3-1-1。

将上述得到的组分2-3-2上样至反相C18硅胶柱(1.0cm×40cm)，以甲醇-水(v：v＝1:9)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为40:60；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分2-3-2-1。

1-3、第四层纯化。

将组分2-2-1-1上样至凝胶制备柱，配合甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，得到单体化合物WLJ-2。

将组分2-2-1-2上样至凝胶制备柱，配合甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，得到单体化合物WLJ-3。

将组分2-3-1-1上样至凝胶制备柱，配合甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到单体化合物WLJ-5。

将组分2-3-2-1上样至凝胶制备柱，配合甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到单体化合物WLJ-6。

2、组分3纯化。

2-1、第一层纯化。

将组份3(Pre3)上样至反相C18硅胶柱(5cm×50cm)，先以甲醇-水(v：v＝65:35)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为16:84；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分3-3(Pre3-3)。

当流份成分产生变化时，调整洗脱液为甲醇-水(v：v＝65:35)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为70:30；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分3-4(Pre3-4)。

2-2、第二层纯化。

将上述得到的组分3-3上样至反相C18硅胶柱(3.5cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝25:75)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分3-3-1(Pre3-3-1)和3-3-2(Pre3-3-2)。

当流份成分第三次产生变化时，调整洗脱液为甲醇-水(v：v＝3:7)洗脱，采用和上述相同的流动相监控，收集合并相同流份，得到组分3-3-3(Pre3-3-3)。

将上述得到的组分3-4上样至反相C18硅胶柱(2.6cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝48:52)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为65:35；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分3-4-1(Pre3-4-1)。

2-3、第三层纯化。

将组分3-3-1上样至正相硅胶柱，配合氯仿-甲醇(v：v＝20:1)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为40:60；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分3-3-1-1。

当流份成分产生变化时，调整洗脱液为氯仿-甲醇(v：v＝10:1)洗脱，采用和上述相同的流动相监控，收集合并相同流份，得到组分3-3-1-2。

将组分3-3-2上样至凝胶制备柱，配合甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到单体化合物WLJ-9。

将组分3-3-3上样至凝胶制备柱，配合甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，得到单体化合物WLJ-7。

将组分3-4-1上样至凝胶制备柱，配合甲醇-水(v：v＝6:4)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到单体化合物WLJ-8。

2-4、第四层纯化。

将组分3-3-1-1上样至凝胶制备柱，配合甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到单体化合物WLJ-10。

将上述得到的组分3-3-1-2上样至反相C18硅胶柱(1.6cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝3:7)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到单体化合物WLJ-11。

3、组分4纯化。

3-1、第一层纯化。

将组份4(Pre4)上样至反相C18硅胶柱(5cm×50cm)，先以甲醇-水(v：v＝3:7)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为16:84；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分4-1(Pre4-1)。

当流份成分产生变化时，调整洗脱液为甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，采用和上述相同的流动相监控，收集合并相同流份，得到组分4-2(Pre4-2)。

当流份成分产生变化时，调整洗脱液为甲醇-水(v：v＝6:4)洗脱，采用和上述相同的流动相监控，收集合并相同流份，得到组分4-3(Pre4-3)。

3-2、第二层纯化。

将上述得到的组分4-1上样至反相C18硅胶柱(5cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝1:9)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分4-1-1(Pre4-1-1)。

当流份成分产生变化时，调整洗脱液为甲醇-水(v：v＝2:8)洗脱，采用和上述相同的流动相监控，收集合并相同流份，得到组分4-1-2(Pre4-1-2)。

将上述得到的组分4-2上样至反相C18硅胶柱(3.5cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝3:7)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为30:70；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分4-2-1(Pre4-2-1)。

将上述得到的组分4-3上样至反相C18硅胶柱(3.5cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝45:55)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为50:50；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到单体化合物WLJ-17。

3-3、第三层纯化。

将上述得到的组分4-1-1上样至凝胶制备柱，以40％甲醇洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为40:60；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到单体化合物WLJ-12。

将上述得到的组分4-1-2上样至凝胶制备柱，以40％甲醇洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为70:30；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到单体化合物WLJ-13。

将上述得到的组分4-2-1上样至反相C18硅胶柱(1.6cm×40cm)，以甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：乙腈为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为60:40；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分4-2-1-1。

3-4、第四层纯化。

将组分4-2-1-1上样至凝胶制备柱，配合甲醇-水(v：v＝6:4)洗脱，得到单体化合物WLJ-14。

4、组分5纯化。

4-1、第一层纯化。

将组份5(Pre5)上样至凝胶制备柱，先以氯仿-甲醇(v：v＝1:1)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为16:84；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分5-1(Pre5-1)与组分5-2(Pre5-2)。

4-2、第二层纯化。

将上述得到的组分5-1上样至反相C18硅胶柱(3.5cm×50cm)，以甲醇-水(v：v＝6:4)洗脱，通过液相色谱进行检测监控(液相条件为，固定相：反相C18硅胶色谱柱；流动相：甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为40:60；流速：1.0mL/min)，收集合并相同流份，得到组分5-1-1(Pre5-1-1)。

4-3、第三层纯化。

将组分5-1-1上样至凝胶制备柱，配合甲醇-水(v：v＝4:6)洗脱，得到单体化合物WLJ-15。

将组分Pre5-2重新结晶得到单体化合物WLJ-16(β-香树脂醇)

所述凝胶柱指Sephadex LH-20凝胶柱。

四、鉴定。

得到上述单体化合物后，再运用质谱和核磁共振技术进行鉴定，结果如下：

WLJ-1：白色无定形粉末(甲醇)，Libermann-Burchard反应和Molish反应均为阳性。化合物经水解检出有葡萄糖酸。ESI-MS m/z 821[M-H]-。1H-NMR(500MHz,CD3OD)δ:4.65(1H,d,J＝8.0Hz,H-1″),4.54(1H,d,J＝7.0Hz,H-1″),3.17～3.78(8H,m,H-2’～5’,H-2″～5″),2.20(2H,dd,J＝12.0,3.0Hz,H-2),0.85,0.86,1.08,1.15,1.19,1.42,1.44(each 3H,s,7×CH3)；13C-NMR(125MHz,CD3OD)δ:27.7(C-1),27.2(C-2),91.0(C-3),38.2(C-4),50.1(C-5),18.6(C-6),34.0(C-7),45.1(C-8),56.7(C-9),33.1(C-10),202.9(C-11),129.1(C-12),112.5(C-13),46.7(C-14),27.5(C-15),39.2(C-16),40.7(C-17),49.4(C-18),42.6(C-19),44.8(C-20),32.2(C-21),40.4(C-22),17.2(C-23),17.0(C-24),28.4(C-25),18.6(C-26),24.0(C-27),29.4(C-28),28.9(C-29),180.6(C-30)；C3-Sugarδ:105.4(CglcA-1),84.0(CglcA-2),76.4(CglcA-3),73.1(CglcA-4),77.7(CglcA-5),175.4(CglcA-6),106.3(CglcA-1’),73.2(CglcA-2’),63.3(CglcA-3’),77.4(CglcA-4’),77.5(CglcA-5’),173.1(CglcA-6’)。以上数据与文献报道的甘草酸(glycyrrhizic acid)基本一致。

WLJ-2：白色无定形粉末(甲醇)，Libermann-Burchard反应和Molish反应均为阳性。化合物经水解检出有葡萄糖。ESI-MS m/z 417[M-H]-。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:10.54(1H,s,7-OH),7.44(2H,d,J＝9.0Hz,H-2',6'),7.06(2H,d,J＝8.5Hz,H-3',5'),7.64(1H,d,J＝8.5Hz,H-5),6.51(1H,dd,J＝8.5,2.0Hz,H-6),6.35(1H,d,J＝2.5Hz,H-8),5.52(1H,dd,J＝12.5,3.0Hz,H-2),5.08(2H,dd,J＝12.5,3.0Hz,H-3),4.89(1H,d,J＝7.0Hz,H-1″),3.13～5.04(5H,m,H-2″～6″),2.67(1H,dd,J＝16.0,3.0Hz,H-2)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:78.8(C-2),43.2(C-3),190.1(C-4),128.9(C-5),110.7(C-6),164.7(C-7),100.4(C-8),163.2(C-9),113.6(C-10),132.4(C-1′),128.5(C-2′,6′),116.3(C-3′,5′),157.5(C-4′),100.4(Cglc-1),73.3(Cglc-2),77.1(Cglc-3),69.8(Cglc-4),76.7(Cglc-5),60.8(Cglc-6)。以上数据与文献报道的甘草苷(liquirtin)基本一致。

WLJ-3：白色无定形粉末(甲醇)，Libermann-Burchard反应和Molish反应均为阳性。化合物经水解检出有葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖。ESI-MS m/z1421.5[M+Na]+，1399.6[M+H]+。1H-NMR(500MHz,C5D5N)δ:5.38(1H,d,J＝8.5Hz,H-glc),5.27(1H,s,H-rha),5.21(1H,d,J＝1.5Hz,H-glc),4.61(1H,m,H-12),4.56(1H,d,J＝2.0Hz,H-ara),4.21(1H,m,H-3),3.14(1H,dd,J＝4.5,14.0Hz,H-2),1.54(1H,d,J＝6.2Hz,H-rha’),0.84,0.86,0.98,1.02,1.11,1.19(each 3H,s,6×CH3)；13C-NMR(125MHz,C5D5N)δ:40.6(C-1),28.1(C-2),82.6(C-3),45.2(C-4),49.2(C-5),19.7(C-6),34.7(C-7),41.5(C-8),49.8(C-9),38.5(C-10),24.9(C-11),124.6(C-12),145.7(C-13),42.9(C-14),29.9(C-15),25.3(C-16),48.6(C-17),43.2(C-18),47.7(C-19),32.2(C-20),35.5(C-21),34.7(C-22),65.7(C-23),15.7(C-24),17.9(C-25),19.1(C-26),27.7(C-27),176.7(C-28),34.1(C-29),25.5(C-30)；C3-Sugarδ:106.8(Cara-1),77.1(Cara-2),76.0(Cara-3),71.3(Cara-4),68.0(Cara-5),101.3(Crha-1),72.8(Crha-2),86.1(Crha-3),74.2(Crha-4),71.6(Crha-5),19.7(Crha-6),108.9(Cglc-1),76.9(Cglc-2),78.4(Cglc-3),82.7(Cglc-4),78.6(Cglc-5),63.6(Cglc-6),106.4(Cglc-1’),76.6(Cglc-2’),80.4(Cglc-3’),72.9(Cglc-4’),79.9(Cglc-5’),64.2(Cglc-6’)；C28-Sugarδ:98.1(Cglc-1),75.5(Cglc-2),79.9(Cglc-3),72.6(Cglc-4),79.8(Cglc-5),70.1(Cglc-6),106.8(Cglc-1’),76.8(Cglc-2’),80.1(Cglc-3’),73.2(Cglc-4’),79.9(Cglc-5’),64.1(Cglc-6’)。以上数据与文献报道的灰毡毛忍冬皂苷乙(macranthoidin B)基本一致。

WLJ-4：白色无定形粉末(甲醇)，Libermann-Burchard反应和Molish反应均为阳性。化合物经水解检出有葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖。ESI-MS m/z 1074[M-H]-。1H-NMR(500MHz,C5D5N)δ:6.27(1H,d,J＝8.2Hz,H-glc),6.20(1H,s,H-rha),5.06(1H,d,J＝6.0Hz,H-ara),5.44(1H,m,H-12),4.21(1H,m,H-3),3.15(1H,dd,J＝4.5,14.0Hz,H-2),3.71(1H,d,J＝10.8Hz,H-22),0.86,0.90,1.01,1.05,1.14,1.19(each 3H,s,6×CH3)；13C-NMR(125MHz,C5D5N)δ:39.7(C-1),28.1(C-2),80.8(C-3),45.9(C-4),48.0(C-5),18.3(C-6),33.7(C-7),41.4(C-8),47.5(C-9),36.6(C-10),23.4(C-11),122.7(C-12),143.9(C-13),41.9(C-14),28.1(C-15),25.8(C-16),48.6(C-17),43.3(C-18),46.8(C-19),32.3(C-20),35.5(C-21),34.7(C-22),65.4(C-23),13.7(C-24),15.9(C-25),17.3(C-26),28.0(C-27),176.3(C-28),32.9(C-29),25.8(C-30)；C3-Sugarδ:104.1(Cara-1),76.9(Cara-2),78.4(Cara-3),69.5(Cara-4),63.8(Cara-5),101.5(Crha-1),72.1(Crha-2),78.6(Crhac-3),73.9(Crha-4),69.2(Crha-5),18.3(Crha-6)；C28-Sugarδ:95.4(Cglc-1),75.5(Cglc-2),80.8(Cglc-3),72.6(Cglc-4),74.9(Cglc-5),69.0(Cglc-6),105.1(Cglc-1’),73.7(Cglc-2’),78.2(Cglc-3’),70.7(Cglc-4’),71.2(Cglc-5’),62.4(Cglc-6’)。以上数据与文献报道的川续断皂苷乙(dipsacoside B)基本一致。

WLJ-5：白色无定形粉末(甲醇)，ESI-MS m/z:515[M-H]-。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.26(1H,s,COOH),7.50(1H,d,J＝16.0Hz,H-3’),7.46(1H,d,J＝16.0Hz,H-3”),7.06(1H,d,J＝2.0Hz,H-5’),7.05(1H,d,J＝2.0Hz,H-5”),7.00(1H,dd,J＝4.0,2.0Hz,H-9’),6.99(1H,dd,J＝4.0,2.0Hz,H-9”),6.79(1H,d,J＝5.0Hz,H-8’),6.77(1H,d,J＝5.0Hz,H-8”),6.26(1H,d,J＝16.0Hz,H-2’),6.18(1H,d,J＝16.0Hz,H-2”),5.36(1H,d,J＝2.5Hz,H-3),5.20(1H,dd,J＝11.5,3.5Hz,H-4),5.14(1H,d,J＝3.0Hz,H-5),2.01～2.17(2H,m,H-2a,6a),1.94～2.00(2H,m,H-2b,6b)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:34.8(C-2),48.7(C-6),70.8(C-4),71.0(C-3,5),72.6(C-1),114.2(C-8″),114.7(C-8′),114.8(C-2′,2″),115.9(C-5′,5″),121.5(C-6′,6″),125.7(C-1′,1″),145.2(C-3′),144.9(C-3″),145.7(C-7′,7″),148.3(C-4′),148.5(C-4″),165.7(C-9′),166.2(C-9″),175.5(COOH)。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物WLJ-5为3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(异绿原酸A，isochlorogenic aicd A)。

WLJ-6：白色无定形粉末(甲醇)，三氯化铁-铁氰化钾反应呈阳性，溴甲酚绿反应呈阳性。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.63(1H,s,COOH),9.22(1H,s,H-3),7.42(1H,d,J＝16.0Hz,H-3),6.16(1H,d,J＝16.0Hz,H-2),7.04(1H,d,J＝2.0Hz,H-5),6.98(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz,H-9),6.77(1H,d,J＝8.0Hz,H-8),5.06(1H,d,J＝4.0Hz,H-6),4.95(1H,d,J＝4.0Hz,H-7),4.80(1H,s,H-3’),3.92(1H,s,H-4),3.56(1H,d,J＝3.0Hz,H-5),2.02(2H,m,H-2a,6a),1.80(2H,m,H-2b,6b)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:175.0(COOH),165.8(C-1),148.4(C-7),145.6(C-3),145.0(C-6),125.7(C-4),121.5(C-9),115.8(C-8),114.8(C-2),114.4(C-5),73.6(C-1′),71.0(C-4′),70.4(C-3′),68.1(C-5′),37.2(C-6′),36.3(C-2′)。上述数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物WLJ-6为绿原酸(chlorogenic aicd)。

WLJ-7：黄色无定形粉末(甲醇)，遇FeCl3-K3[Fe(CN)6]试剂显蓝色，提示该化合物中含有酚羟基。ESI-MS:m/z 447[M-H]-，分子量448，分子式为C21H20O11；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:12.98(1H,s,5-OH),7.46(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz),7.42(1H,d,J＝2.4Hz),6.92(1H,d,J＝8.4Hz),6.79(1H,d,J＝2.0Hz),6.74(1H,s),6.45(1H,d,J＝2.0Hz),5.08(1H,d,J＝7.2Hz),3.73-3.16(6H,m)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:181.9(C-4),164.5(C-2),163.0(C-7),161.6(C-5),156.9(C-9),150.4(C-4),145.8(C-3),121.4(C-1),119.2(C-6),116.0(C-5),113.6(C-2),105.3(C-10),103.2(C-3),99.6(C-6),94.7(C-8),99.9(Cglc-1),77.9(Cglc-3),76.4(Cglc-5),73.1(Cglc-2),69.6(Cglc-4),60.6(Cglc-6)。以上数据与文献报道的木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷一致，故推定化合物WLJ-7为木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(luteoloside)。

WLJ-8：黄色无定形粉末(甲醇)，遇FeCl3-K3[Fe(CN)6]试剂显蓝色，提示该化合物中含有酚羟基。ESI-MS:m/z 623[M-H]-，分子量624，分子式为C28H32O16；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:12.57(1H,s,5-OH),7.85(1H,d,J＝2.0Hz,H-2’),7.52(1H,dd,J＝8.5,2.0Hz,H-6’),6.91(1H,d,J＝8.0Hz,H-5’),6.44(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),6.21(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),5.44(1H,d,J＝7.5Hz,Hglc-1),5.40(1H,d,J＝4.0Hz,Hrha-1),3.84(3H,s,-OCH3),3.72-3.05(6H,m),0.98(3H,d,J＝6.0Hz,-CH3)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:177.4(C-4),164.2(C-7),161.3(C-5),156.6(C-9),149.5(C-4),146.9(C-3),133.1(C-3),122.4(C-2),121.1(C-1),113.7(C-6),115.7(C-5),122.7(C-2),104.1(C-10),98.8(C-6),93.9(C-8),101.6(Cglc-1),76.8(Cglc-3),74.7(Cglc-5),71.0(Cglc-2),68.7(Cglc-4),60.6(Cglc-6),101.3(Crha-1),76.4(Crha-3),72.2(Crha-5),70.8(Crha-2),67.4(Crha-4),56.1(O-CH3),18.1(Crha-6)。以上数据与文献报道的水仙苷(narcissoside)一致，故推定化合物WLJ-8为水仙苷。

WLJ-9：淡黄色无定形粉末(甲醇)，ESI-MS:m/z 609[M-H]-，分子量610，分子式为C27H30O16；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:12.60(1H,s,5-OH),10.85(1H,s,7-OH),9.19(1H,s,4-OH),7.56-7.49(m,2H,H-2,6),6.80(1H,t,J＝8.7Hz,H-5),6.38(1H,dd,J＝7.2Hz,2.1Hz,H-8),6.18(1H,t,J＝2.3Hz,H-6),0.98(3H,t,J＝7.2Hz,Hrha-6)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:179.4(C-4),166.1(C-7),163.2(C-5),150.4(C-4),158.4(C-2),158.6(C-9),135.3(C-3),123.2(C-6),118.3,(C-2),123.6(C-1),δ146.3C-3),δ117.2(C-5),105.9(C-10),100.7(C-6),95.6(C-8),103.2(Cglc-1),78.4(Cglc-5),77.9(Cglc-3),76.1(Cglc-2),72.6(Cglc-4),70.2(Cglc-6)；102.8(Crha-1),72.4(Crha-2),72.0(Crha-3),73.4(Crha-4),69.0(Crha-5),19.7(Crha-6)。以上数据与文献报道一致，其Rf值及显色行为与标准品芦丁一致，推定化合物WLJ-9为芦丁(rutin)。

WLJ-10：白色无定形粉末(甲醇)，ESI-MS:m/z 153[M-H]-，分子量154，分子式为C7H6O4；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:7.35(1H,s),7.30(1H,d,J＝8.5Hz),6.79(1H,d,J＝8.0Hz)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:167.5(C-7),150.1(C-4),144.9(C-3),122.0(C-1),121.8(C-6),116.6(C-2),115.2(C-5)。以上数据与文献报道的原儿茶酸一致，故推定化合物WLJ-10为原儿茶酸(protocatechuic acid)。

WLJ-11：白色无定形粉末(甲醇)，ESI-MS:m/z 137[M-H]-，分子量138，分子式为C7H6O3；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.70(1H,s,CHO),7.27(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz),7.24(1H,d,J＝2.0Hz),6.92(1H,d,J＝8.0Hz)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:191.2(C-7),152.2(C-4),145.9(C-3),128.9(C-1),124.7(C-6),115.6(C-5),114.4(C-2)。以上数据与文献报道的原儿茶醛一致，故推定化合物WLJ-11为原儿茶醛(protocatechuic aldehyde)。

WLJ-12：淡黄色无定形粉末(甲醇)，ESI-MS m/z 179[M-H]-，分子量为180，分子式C9H8O4，FeCl3-K3[Fe(CN6)]反应呈黑色。1H-NMR谱中芳香区域共出现5个氢，δ7.42(1H,d,J＝15.9Hz)和6.18(1H,d,J＝15.9Hz)提示存在Z型双键；7.03(1H,d,J＝2.0Hz),6.97(1H,dd,J＝8.2,2.0Hz,),6.76(1H,d,J＝8.1Hz)，为一组ABX自旋耦合的芳香质子信号。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ7.42(1H,d,J＝15.9Hz,H-7),7.03(1H,d,J＝2.0Hz,H-2),6.97(1H,dd,J＝8.2,2.0Hz,H-6),6.76(1H,d,J＝8.1Hz,H-5),6.18(1H,d,J＝15.9Hz,H-8)；13C-NMR谱中出现9个碳信号峰，δ169.9羧基碳信号，13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):δ169.9(C-9),150.1(C-3),147.6(C-4),146.6(C-7),127.7(C-1),123.2(C-8),117.8(C-6),117.1(C-5),116.6(C-2)。其波谱数据与文献基本一致，因此推断WLJ-12为咖啡酸(caffeicacid)。

WLJ-13：黄色粉末(甲醇)，ESI-MS:m/z 359[M-H]-，分子量360，分子式为C18H16O8；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.45(1H,d,J＝15.9Hz,H-7),7.10–6.95(1H,m,H-2),6.76(1H,d,J＝8.1Hz,H-5),6.65(1H,dd,J＝20.4,5.0Hz,H-6),6.52(1H,dd,J＝8.0,1.9Hz,H-5'),6.24(1H,d,J＝15.9Hz,H-8'),5.02(1H,dd,J＝8.4,4.2Hz,H-8),2.94(2H,ddd,J＝26.0,8.5,4.0Hz,H-7a,H-7β)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ172.9(C-9'),74.9(C-8'),38.1(C-7'),122.1(C-6'),117.6(C-5'),150.6(C-4'),146.0(C-3'),115.3(C-2'),129.3(C-1'),167.9(C-9),116.8(C-8),147.6(C-7),123.7(C-6),118.7(C-5),147.9(C-4),146.9(C-3),115.3(C-2),127.4(C-1)。其波谱数据与文献报道的迷迭香酸基本一致，故推断WLJ-13为迷迭香酸(rosmarinic acid)。

WLJ-14：黄色粉末(甲醇)，ESI-MS(m/z):447[M-H]-，分子量448，分子式为C21H20O11；1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ12.72(1H,s,5-OH),10.98(1H,s,7-OH),10.52(1H,s,5-OH),8.15(2H,d,J＝8.9Hz,H-2',H-6'),6.99(2H,d,J＝8.9Hz,H-3',H-5'),6.54(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),6.31(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),5.57(1H,d,J＝7.5Hz,gal,H-1”),3.67–3.25(6H,m,gal,糖上H)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):δ178.2(C-4),164.8(C-7),161.9(C-5),160.6(C-4'),157.0(C-2,9),133.9(C-3),131.6(C-2',6'),121.6(C-1'),115.8(C-3',C-5'),104.7(C-10),101.5(C-1”),99.4(C-8),94.3(C-6),78.2(C-5”),77.1(C-3”),74.9(C-2”),70.6(C-4”),61.5(C-6”)。其波谱数据与文献报道的三叶豆苷基本一致，故推断WLJ-14为三叶豆苷(trifolin)。

WLJ-15：黄色油状物(甲醇)，ESI-MS(m/z):373[M-H]-，分子量374，分子式为C19H18O8，硫酸乙醇显紫红色。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):7.56(1H,d,J＝15.6Hz,H-7’),7.06(1H,d,J＝1.6Hz,H-2’),6.96(1H,d,J＝8.0Hz,H-5’),6.79(1H,d,J＝1.6Hz,H-2),6.72(1H,dd,J＝8.0,1.6Hz,H-6’),6.70(1H,d,J＝8.0Hz,H-5),6.58(1H,dd,J＝8.0,1.6Hz,H-6),6.27(1H,d,J＝15.6Hz,H-8’),5.20(1H,d,H-8),3.70(3H,s,OCH3),3.03(2H,m,H-7)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):128.8(s,C-1),117.6(d,C-2),146.8(s,C-3),145.4(s,C-4),116.5(d,C-5),121.8(d,C-6),37.9(t,C-7),74.7(d,C-8),172.2(s,C-9),52.7(q,C-10),127.6(s,C-1’),114.2(d,C-2’),146.2(s,C-3’),149.8(s,C-4’),116.3(d,C-5’),123.3(d,C-6’),148.0(d,C-7’),115.3(d,C-8’),168.4(s,C-9’)。以上波谱数据与文献报道的迷迭香酸甲酯基本一致，故推定WLJ-15为迷迭香酸甲酯(methylrosmarinate)。

WLJ-16：白色片状结晶(丙酮)，EI-MS显示其分子离子峰m/z427[M+H]+，故该化合物分子量为426，Liebermann Burchard反应呈阳性，提示该化合物可能为三萜化合物。1H-NMR(400MHz,CDCl3)谱给出烯氢信号δ5.18(1H,m)，连氧叔碳氢信号δ3.63(1H,m)和8个角甲基氢信号δ:0.79(3H,S)，0.80(3H,S)，0.83(3H,S)，0.87(3H,S)，0.94(3H,S)，0.96(3H,S)，1.01(3H,S)，1.17(3H,S)。13CNMR(100MHz,CDCl3)显示，δc150.9和δc124.3有1对烯键碳，结合13C-NMR和DEPT推测分子式为C30H50O，计算不饱和度为5，表明化合物1为齐墩果烷型五环三萜类化合物。13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:38.7(C-1),27.4(C-2),79.0(C-3),38.8(C-4),55.2(C-5),18.3(C-6),32.7(C-7),38.8(C-8),47.9(C-9),37.1(C-10),23.3(C-11),124.4(C-12),139.5(C-13),41.5(C-14),26.6(C-15),27.3(C-16),32.9(C-17),47.9(C-18),47.7(C-19),31.2(C-20),34.7(C-21),37.2(C-22),28.1(C-23),15.6(C-24),15.6(C-25),16.1(C-26),26.6(C-27),28.7(C-28),33.7(C-29),23.3(C-30)，以上数据与β-香树脂醇的文献值[14]一致。综上所述，WLJ-16的结构应为β-香树脂醇(beta-Amyrin)。

WLJ-17：淡黄色无定形粉末(甲醇)，ESI-MS(m/z):593[M-H]-，分子量594，分子式为C27H30O15；1H-NMR(500MHz,CD3OD)δ:12.60(1H,br.s,5-OH),7.97(2H,d,J＝8.8Hz,H-2,6),6.80(2H,d,J＝8.8Hz,H-3,5),δ6.30(1H,br.s,H-8),δ6.10(1H,br.s,H-6),δ5.12(1H,d,J＝7.2Hz,Hglc-1),δ1.11(3H,d,J＝6.2Hz,Hrha-6)；1C-NMR(125MHz,CD3OD)δ:179.5(C-4),166.2(C-7),161.6(C-4),159.5(C-2),158.6(C-9),135.6(C-3)，δ132.3(C-2,6),122.8(C-1),δ116.2(C-3,5),105.7(C-10),102.5(C-6),95.0(C-8)；3-O-β-D-glc:δ:104.1(Cglc-1),78.4(Cglc-5),77.3(Cglc-3),75.9(Cglc-2),71.5(Cglc-4),68.7(Cglc-6)；7-O-α-L-rha:100.1(Crha-1),70.3(Crha-2),72.4(Crha-3),74.0(Crha-4),72.2(Crha-5),18.1(Crha-6)。以上数据与文献报道一致，推定该化合物为山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖(kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7O-α-L-Rhamnopyranoside)。

将上述得到的化合物单体以HPLC进行纯度分析，结果如下所示：

WLJ-1(甘草酸)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(44:56)，流速为1mL/min，检测波长为254nm。

纯度：98.07％(峰面积归一化法)。

WLJ-2(甘草苷)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(26:74)，流速为1mL/min，检测波长为276nm。

纯度：98.04％(峰面积归一化法)。

WLJ-3(灰毡毛忍冬皂苷乙)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为甲醇-0.1％甲酸(70:30)，流速为1mL/min，检测器为ELSD。

纯度：100％(峰面积归一化法)。

WLJ-4(川续断皂苷乙)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为甲醇-0.1％甲酸(70:30)，流速为1mL/min，检测器为ELSD。

纯度：98.22％(峰面积归一化法)。

WLJ-5(异绿原酸A)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(26:74)，流速为1mL/min，检测波长为327nm。

纯度：98.00％(峰面积归一化法)。

WLJ-6(绿原酸)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(16:84)，流速为1mL/min，检测波长为330nm。

纯度：98.47％(峰面积归一化法)。

WLJ-7(木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(24:76)，流速为1mL/min，检测波长为350nm。

纯度：99.98％(峰面积归一化法)。

WLJ-8(水仙苷)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(26:74)，流速为1mL/min，检测波长为256nm。

纯度：98.61％(峰面积归一化法)。

WLJ-9(芦丁)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(16:84)，流速为1mL/min，检测波长为254nm。

纯度：99.04％(峰面积归一化法)。

WLJ-10(原儿茶酸)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(19:81)，流速为1mL/min，检测波长为280nm。

纯度：99.68％(峰面积归一化法)。

WLJ-11(儿茶醛)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(19:81)，流速为1mL/min，检测波长为280nm。

纯度：99.76％(峰面积归一化法)。

WLJ-12(咖啡酸)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(19:81)，流速为1mL/min，检测波长为323nm。

纯度：98.15％(峰面积归一化法)。

WLJ-13(迷迭香酸)：

分析条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(4.6×150mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(25:75)，流速为1mL/min，检测波长为280nm。

纯度：99.02％(峰面积归一化法)。

WLJ-14(三叶豆苷)：

分析条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(4.6×150mm)，流动相为乙腈-0.1％甲酸(25:75)，流速为1mL/min，检测波长为280nm。

纯度：98.57％(峰面积归一化法)。

WLJ-15(迷迭香酸甲酯)：

分析条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(4.6×150mm)，流动相为甲醇-0.1％甲酸(45:55)，流速为1mL/min，检测波长为254nm。

纯度：99.42％(峰面积归一化法)。

WLJ-16(β-香树脂醇)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈，流速为1mL/min，检测波长为210nm。

纯度：98.32％(峰面积归一化法)。

WLJ-17(山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖)：

分析条件：色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6×250mm)，流动相为甲醇-0.1％甲酸(40:60)，流速为1mL/min，检测波长为254nm。

纯度：99.24％(峰面积归一化法)。

五、分析。

鉴定得到上述17个化合物结构，其结构如下所示：

其中：

上述所分离的化合物多为水溶性较好或者极性较大的化合物，主要的结构类型为酚酸类成分7个(WLJ-5、WLJ-6、WLJ-10、WLJ-11、WLJ-12、WLJ-13、WLJ-15)，黄酮苷类成分6个(WLJ-2、WLJ-7、WLJ-8、WLJ-9、WLJ-14、WLJ-17)，皂苷类成分3个(WLJ-1、WLJ-3、WLJ-4)，甾醇类成分1个(WLJ-16)。

随后，本发明人通过液质联用法对单味药材及缺少单位药材的阴性样品进行成分分析，对上述17个指标性成分进行了归属，结果如下表所示。

表1王老吉组成药味中分离纯化的对照品信息

从上述结果中可以看出，通过上述分离纯化方法，王老吉凉茶中每味药均分离得到2个或2个以上的单体化合物纯品，可用做对照品，在王老吉凉茶质量监控体系中辅助检测其中各成分，为王老吉凉茶的质量检测提供先决条件和保障。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

粗分：取王老吉凉茶浸膏，上样至AB-8型大孔吸附树脂柱；以3-5个柱体积的水洗脱，弃去水液；再以2-4个柱体积的体积百分数为70-80％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液；蒸干得稠膏，备用；

细分：取上述稠膏，上样至HP20型大孔树脂柱；以3-5个柱体积的水洗脱，弃去水液；再以8-12个柱体积的体积百分数为15-25％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂得到组份2；以8-12个柱体积的体积百分数为35-45％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将相同流份合并，依次得到组份3和组份4；以15-25个柱体积的体积百分数为60-80％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得到组份5；

纯化：将上述得到的各组份经Sephadex LH-20凝胶柱、反相C18硅胶柱与正相硅胶柱分离纯化，并以液相色谱进行检测监控，得到单体化合物，即为王老吉凉茶指标性成分。

2.根据权利要求1所述的王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，其特征在于，所述粗分步骤中：取王老吉凉茶浸膏，上样至AB-8型大孔吸附树脂柱；以4个柱体积的水洗脱，弃去水液；再以3个柱体积的体积百分数为75％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液；蒸干得稠膏，备用；

所述细分步骤中：取上述稠膏，上样至HP20型大孔树脂柱；以3-5个柱体积的水洗脱，弃去水液；再以10个柱体积的体积百分数为20％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂得到组份2；以10个柱体积的体积百分数为40％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，将相同流份合并，依次得到组份3和组份4；以20个柱体积的体积百分数为75％的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得到组份5。

3.根据权利要求1所述的王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，其特征在于，所述纯化步骤中：

将组份2上样至反相C18硅胶柱，先以甲醇-水梯度洗脱，再配合Sephadex LH-20凝胶柱和反相C18硅胶柱，其中反相C18硅胶柱以甲醇-水梯度洗脱和以甲醇-水等度洗脱，Sephadex LH-20凝胶柱以甲醇-水等度洗脱，并通过液相色谱进行检测监控，收集合并相同流份，纯化得到甘草酸、甘草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、异绿原酸A、绿原酸。

4.根据权利要求1所述的王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，其特征在于，所述纯化步骤中：

将组份3上样至反相C18硅胶柱，先以甲醇-水梯度洗脱，再配合Sephadex LH-20凝胶柱、反相C18硅胶柱和正相硅胶柱，其中反相C18硅胶柱以甲醇-水等度洗脱和甲醇-水梯度洗脱，正相硅胶柱以氯仿-甲醇梯度洗脱，Sephadex LH-20凝胶柱以甲醇-水等度洗脱，并通过液相色谱进行检测监控，收集合并相同流份，纯化得到木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、水仙苷、芦丁、原儿茶酸、和儿茶醛。

5.根据权利要求1所述的王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，其特征在于，所述纯化步骤中：

将组份4上样至反相C18硅胶柱，先以甲醇-水梯度洗脱，再配合Sephadex LH-20凝胶柱和反相C18硅胶柱，其中反相C18硅胶柱以甲醇-水梯度洗脱和以甲醇-水等度洗脱，Sephadex LH-20凝胶柱以甲醇-水等度洗脱，并通过液相色谱进行检测监控，收集合并相同流份，纯化得到咖啡酸、迷迭香酸、三叶豆苷、和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖。

6.根据权利要求1所述的王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，其特征在于，所述纯化步骤中：

将组份5上样至Sephadex LH-20凝胶柱，先以氯仿-甲醇等度洗脱，再配合反相C18硅胶柱和Sephadex LH-20凝胶柱，以甲醇-水等度洗脱，并通过液相色谱进行检测监控，收集合并相同流份，纯化得到迷迭香酸甲酯、β-香树脂醇。

7.根据权利要求1-6任一项所述的王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，其特征在于，所述纯化步骤中，所述液相色谱进行检测监控的条件为：

固定相：碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；

流动相：乙腈或甲醇为流动相A，体积百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为16∶84-70∶30；或以乙腈为流动相；

流速：0.8-1.2mL/min。

8.根据权利要求7所述的王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，其特征在于，所述纯化步骤中，所述固定相为Kromasil 100-5 C18色谱柱或Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，所述Kromasil 100-5 C18色谱柱的规格为4.6×250mm，所述Agilent Zorbax SB-C18色谱柱的规格为4.6×150mm。

9.根据权利要求1所述的王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，其特征在于，所述粗分步骤中，将王老吉凉茶浸膏以水稀释至相对密度在1.15-1.2之间，再上样至AB-8型大孔吸附树脂柱。

10.根据权利要求1所述的王老吉凉茶指标性成分的分离纯化方法，其特征在于，所述细分步骤中，将所述稠膏以水溶解后离心，取离心上清液上样至HP20型大孔树脂柱。

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