CN110420237A - 黄芪花及其提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用 - Google Patents

黄芪花及其提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110420237A
CN110420237A CN201910768735.1A CN201910768735A CN110420237A CN 110420237 A CN110420237 A CN 110420237A CN 201910768735 A CN201910768735 A CN 201910768735A CN 110420237 A CN110420237 A CN 110420237A
Authority
CN
China
Prior art keywords
extract
pulmonary fibrosis
astragalis flower
drug
flower
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910768735.1A
Other languages
English (en)
Inventor
郭盛
段金廒
朱悦
李园
钱大玮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University of Chinese Medicine
Original Assignee
Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing University of Chinese Medicine filed Critical Nanjing University of Chinese Medicine
Priority to CN201910768735.1A priority Critical patent/CN110420237A/zh
Publication of CN110420237A publication Critical patent/CN110420237A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/481—Astragalus (milkvetch)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation or decoction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了黄芪花及其提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用，本发明提供的黄芪花提取物可有效降低博莱霉素致c57BL/6小鼠肺纤维化模型肺重系数，显著降低肺组织中的MDA、HYP含量和血清中TGF‑β1和TNF‑α，同时增加血清中的T‑AOC含量，减轻模型动物肺组织病理变化；且细胞实验也显示本发明提供的黄芪花提取物可较好的保护过氧化氢损伤下的HELF细胞作用。体内外实验均表明本发明提供的黄芪花提取物可用于肺纤维化的防治。且与现有的药物相比，该提取物以天然传统药用植物为原料，更加安全，无不良反应。

Description

黄芪花及其提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的 应用
技术领域
本发明涉及一种天然产物，特别是涉及一种具有防治肺纤维化作用的天然产物及其制备方法与应用。
背景技术
肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是以肺泡间质炎性细胞浸润、成纤维细胞增生和肺泡间质纤维结缔组织沉积为特征的慢性肺部疾病，该病为多种肺部疾病的病理结局。近年来，肺纤维化发病有增多的趋势，其中特发性肺纤维化确诊后平均存活期为2～4年，5年生存率为30％～50％，欧洲和日本的患病率为(3-8)/10万人口，病死率男性为6.43/10万，女性为5.84/10万，并都呈上升趋势。目前肺纤维化治疗化学药物首选糖皮质激素与免疫抑制剂，但仅对50％的肺纤维化患者有效。且长期应用激素易出现骨质疏松、免疫力低下等不良反应。传统中医药具有毒副作用小，可长期服用等优点，因此基于中药资源开发治疗肺纤维化药物已成为近年来的研究热点。
黄芪为豆科黄芪属多年生草本植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。作为常用大宗中药黄芪，随着市场对其需求量不断增长，野生黄芪植物资源越来越稀缺，人工栽培面积逐年增加，目前已超过70万亩。黄芪为多年生草本植物，一般为3～8年采收，在其栽培过程中，为提升黄芪药材产量及品质，部分产区在每年的7月前后对黄芪进行捋花打顶。初步估算由此每年可产生大约3.5万吨黄芪花副产物因无有效利用途径而废弃，带来了黄芪植物资源的巨大浪费。因此，开展黄芪花资源利用途径挖掘，以充分实现其资源价值，不仅可有效利用资源，减少浪费，同时也可为黄芪资源产业的提质增效提供支撑，促进产区农民增收。目前尚未见以黄芪花为原料制备活性提取物的技术，也未见以黄芪花为主要组成组分应用于防治肺纤维化的药品或保健食品的报道。
发明内容
发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，开发黄芪花新的临床用途，提供黄芪花在防治肺纤维化中的应用，实验结果表明，其具有很好的防治肺纤维化作用。本发明的另一个目的在于公开一种黄芪花提取物的制备方法。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
黄芪花在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用。
黄芪花的水提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用。
黄芪花的乙醇提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用。
黄芪花的多糖提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用。
作为优选方案，黄芪花的多糖提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述的黄芪花的多糖提取物是通过以下方法制备得到的：
精密称取黄芪花，加入乙醇溶液，提取1～3次，每次0.5～1h，合并提取液，减压浓缩，得到乙醇提取物；取乙醇提取后的药渣烘干后，再加入水，超声提取1～3次，合并超声提取液，减压浓缩、干燥得到黄芪花的多糖提取物。
作为更加优选方案，所述的黄芪花的多糖提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用，所述的黄芪花的多糖提取物是通过以下方法制备得到的：
精密称取过40目筛的黄芪花300.0g，加入3L 80％乙醇溶液，提取3次，每次1h，合并提取液，减压浓缩，得到乙醇提取物；取乙醇提取后的药渣烘干后，再加入3L水，超声提取2次，合并2次超声提取液，减压浓缩、干燥得到黄芪花的多糖提取物。
有益效果：
本发明采用博莱霉素建立肺纤维化c57BL/6小鼠模型，筛选黄芪花不同提取物对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型灌胃进行干预，实验结果表明，黄芪花多糖和10％乙醇大孔树脂洗脱物可有效降低模型动物肺重系数，显著降低肺组织中的MDA、HYP含量和血清中TGF-β1和TNF-α，同时增加血清中的T-AOC含量，减轻模型动物肺组织病理变化，表现出较好的防治肺纤维化作用。
附图说明
图1为各组小鼠体重变化情况柱状图。
图2为各组c57BL/6小鼠生化指标分析柱状结果图。
图3为各部位及单体给药后HELF细胞存活率柱状结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1基于模型动物的防治肺纤维化实验研究
一、材料与试剂
1.药品与试剂
注射用盐酸博来霉素(BLM，海正辉瑞制药有限公司)。羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒(碱水解法)、丙二醛MDA(TBA法)、总抗氧化能力T-AOC(FRAP法)、小鼠转化生长因子β1(TGF-β1)酶联免疫分析试剂盒和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫分析试剂盒均由南京建成生物工程公司提供。醋酸泼尼松片购自浙江仙琚制药股份有限公司。
黄芪花产自山西省浑源县，经本校段金廒教授鉴定来源于豆科多年生草本植物蒙古黄芪的花。
2.仪器
EnSpire多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司)，Microllige 22R Centrifiige离心机(美国Beckman Coulter公司)，MX-S可调式混匀仪(大龙兴创实验仪器有限公司)等。
3.动物
c57BL/6小鼠，雄性，体质量(28±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(苏2016-0003)，动物房温度(22±2)℃，湿度(55±10)％，12h明暗交替。
二、实验方法
1.供试药品的制备
黄芪花提取物的制备：精密称取3份黄芪花样品，每份300.0g。其中一份加入3L水，在室温下超声提取3次，每次1h。合并提取液在65℃下减压浓缩，用冷冻干燥机干燥，得到96.0g的水提物样品(AE)。另取一份样品加入3L的80％乙醇溶液，提取3次，每次1h，合并提取液，减压浓缩，得到乙醇提取物(EE)125.4g，取乙醇提取后的黄芪花药渣在37℃烘箱中烘干后，再加入3L水，超声提取2次，合并2次提取液，滤液70℃下减压浓缩、干燥得到黄芪花多糖样品(DT)145.3g。第三份黄芪花粉末样品，加入3L的80％乙醇溶液，提取3次，每次1h，合并提取液，减压浓缩至200mL，然后用AB-8大孔树脂柱(7.0cm×80cm)以不同体积浓度的乙醇水溶液(10％，50％和90％体积比)洗脱，直到每个梯度洗脱液无色。在此基础上，用冷冻干燥机对洗脱液进行浓缩和干燥，分别获得LE(10％洗脱液)60.5g、ME(50％洗脱液)9.3g和HE(90％洗脱液)6.9g样品。所有干燥后的粉末均储存在4℃冰箱中备用。
提取物使用前取出，ME与HE部位用0.5％羧甲基纤维素钠溶液超声溶解配制成相应的给药浓度溶液，DT和LE用纯水超声溶解配制成相应的给药浓度。15mg BLM冻干粉溶于5mL生理盐水，混匀，配成3mg·mL-1的溶液，现配现用。
2.肺纤维化模型建立
将108只小鼠随机分为正常组(C)、模型组(M)、对照组(DZ)、醋酸泼尼松组(YX)、黄芪花多糖样品(DT)高、低剂量组(2.7g·kg﹣1·d﹣1，DTH；0.9g·kg﹣1·d﹣1，DTL)、LE10％乙醇溶液高、低剂量组(13.2g·kg﹣1·d﹣1，LEH；4.4g·kg﹣1·d﹣1，LEL)、ME50％乙醇溶液高、低剂量组(1.62g·kg﹣1·d﹣1，MEH；0.54g·kg﹣1·d﹣1，MEL)、HE90％乙醇溶液高、低剂量组(0.81g·kg﹣1·d﹣1，HEH；0.27g·kg﹣1·d﹣1，HEL)每组9只。适应性饲养7天后，除正常组外，模型组与各给药组采用气管内滴注BLM(5mg/kg)的方法建立肺纤维化模型，而对照组将气管内滴注等量的生理盐水。造模第二天开始，各组药物通过灌胃连续给药3周，期间正常组、对照组和模型组气管滴注与灌胃均给予生理盐水，观察至21d所有小鼠进行后续检测。
3.标本收集
于给药第21天末，收集新鲜粪便于-80℃条件下保存后，各组小鼠放入代谢笼中，禁食不禁水收集12h尿液并记录尿量。最后一天腹腔注射(ip)5％水合氯醛麻醉小鼠，采用摘眼球取血后，静止半小时，离心(3500r·min-1，4℃条件下离心10min)分离血清，尿液和血清保存于-80℃条件下；取肺组织，用冷生理盐水清洗肺组织后称重，统计肺系数。沿左肺肺门到肺尖用剪刀剪取厚约2mm的肺组织，浸泡于福尔马林溶液中，用于病理切片。剩余肺组织放入标记好的EP管中，置液氮暂存，之后转移到－80℃冰箱冻存备用。
4.主要观察指标
造模后第5、10、15、21天称量小鼠体重，分析体重变化，根据第21天测量出的体重及湿肺重计算肺系数：肺系数(mg·kg-1)＝肺湿重/体重。取甲醛固定的肺组织，制作石蜡病理切片，分别进行肺组织HE与Masson染色，取出冻存备用的每只每组各小鼠肺组织进行组织匀浆检测MDA(丙二醛)和HYP(羟脯氨酸)的含量，取每组各小鼠血清检测T-AOC、TGF-β1和TNF-α的含量，各指标检测按照试剂盒说明书操作。
5.统计学分析
实验结果采用SPSS 20.0软件分析，多组间比较采用T检验，计算显著性，P＜0.05认为差异具有统计学意义。
三、实验结果
1.小鼠状态观察
小鼠在进行气管滴注博来霉素造模后第3日开始出现被毛凌乱，部分小鼠呼吸音明显，四肢冰冷等症。模型组小鼠采食下降，体重下降，精神差，活动减少，并于7d开始均有不同程度的死亡小鼠，M与HEH组均出现死亡个体。整个试验期间，M组死亡3只，LEL组死亡2只，HEH组死亡2只，死亡个体体重均低于16g。死亡缘由与严重的肺部损伤引起的呼吸障碍以及个体衰弱有关。
2.小鼠平均体重及肺系数变化结果与分析
在试验过程中的小鼠体重变化如图1所示，在试验第6日，除空白组和多糖高剂量组外各模型组小鼠体重均开始下降，模型组小鼠平均体重下降最明显。试验第11日，除了多糖高剂量组，各模型小鼠平均体重开始恢复增长，但增长速率与对照组相比仍缓慢。而模型组第11天开始模型组小鼠体重与其他各组相比较，体重差异显著(P<0.05)。特别是黄芪花多糖样品多糖(高、低)组均有恢复造模小鼠体重现象。
各组小鼠肺重系数测定结果见表1，结果显示模型组与对照组、各给药组与模型组之间的肺重系数具有显著性差异。其中模型组显著高于对照组(##P<0.01)，DTH组和LEH组与模型组相比均显著降低(**P<0.01)，特别是黄芪花多糖样品高浓度组接近于对照组(***P<0.001)。
表1各组小鼠造模前后肺重系数变化情况
分组 n 肺重系数g/kg 分组 n 肺重系数g/kg
C 9 4.41±0.03 LEH 9 8.32±0.05<sup>**</sup>
DZ 9 8.26±0.06 LEL 7 10.07±0.61
M 6 14.00±0.06<sup>##</sup> MEH 9 11.16±0.23
YX 9 10.41±0.24<sup>*</sup> MEL 9 10.88±0.19<sup>*</sup>
DTH 9 5.52±0.06<sup>***</sup> HEH 7 13.35±0.02
DTL 9 9.66±0.01 HEL 9 11.99±0.21
注：与对照组比较：##P<0.01；与模型组比较:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
3.小鼠病理组织观察结果与分析
将各组小鼠的肺组织HE染色和Masson染色依照Szapiel等评分方法，确定肺泡炎和肺纤维化的程度结果。各组c57BL/6小鼠的HE染色和Masson染色，分析结果见表2。其中空白组与对照组c57BL/6小鼠肺部未出现明显炎症，肺组织学正常。模型组小鼠肺泡结构紊乱，中性粒细胞浸润严重，炎症病变累及面积较大，肺间质中胶原纤维显著增多，炎症与肺纤维评分与对照组具有显著性差异(P<0.01)。给药组及醋酸泼尼松组其肺泡炎及肺纤维化程度均较模型组明显减轻，其中多糖高、低剂量组(DTH和DTL组)小鼠肺组织中大部分肺泡结构清晰，并呈轻度肺纤维化，少数小鼠无纤维化形成，而HEH组与模型组比较并无明显差异。DTH组c57BL/6小鼠炎症评分与Masson评分结果发现与对照组比较无明显差异。
表2c57BL/6小鼠肺组织病理评分
分组 炎症评分 肺纤维化评分 分组 炎症评分 肺纤维化评分
K 0 0 LEH 1.33±1.92<sup>*</sup> 0.59±0.16<sup>**</sup>
DZ 0.33±0.12 0.76±0.08 LEL 2.33±0.13 1.32±0.07
M 2.67±0.20<sup>##</sup> 1.78±0.33<sup>##</sup> MEH 2.00±0.28 0.71±0.34<sup>**</sup>
YX 1.10±0.01<sup>*</sup> 0.65±0.21<sup>**</sup> MEL 1.67±0.23<sup>*</sup> 0.76±0.40<sup>**</sup>
DTH 0.33±0.02<sup>**</sup> 0.45±0.28<sup>**</sup> HEH 2.33±0.57 1.35±0.68
DTL 1.33±0.15<sup>*</sup> 0.59±0.13<sup>**</sup> HEL 2.33±0.26 0.80±0.35
注：与对照组比较：##P<0.01；与模型组比较:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
4.生化指标的结果与分析
c57BL/6小鼠生化指标的分析结果如图2。给药21天后，与对照组相比，模型组小鼠肺组织MDA和HYP的含量和血清中TGF-β1和TNF-α的含量显著增加，而血清中T-AOC含量明显降低(P<0.05)。醋酸泼尼松组和黄芩花多糖组(DT)能显著降低肺组织中的MDA、HYP含量和血清中TGF-β1和TNF-α，同时增加血清中的T-AOC含量。
本实验通过博莱霉素气管内滴注建立了肺纤维化c57BL/6小鼠模型，用黄芪花中分离得到的不同部位对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型灌胃进行干预，结果发现黄芪花多糖、10％乙醇提取物可有效降低模型动物肺重系数，显著降低肺组织中的MDA、HYP含量和血清中TGF-β1和TNF-α，同时增加血清中的T-AOC含量，减轻模型动物肺组织病理变化，取得了预料不到的防治肺纤维化作用。
实施例2基于细胞模型的防治肺纤维化实验研究
一、仪器与材料
1.仪器
CO2孵育箱(SERIES II WATER JAVKET型，美国Thermo公司)；高压灭菌锅(TOMYSX-500型，南京基天生物科技有限公司)；水浴锅(BWS-10型，昆山一恒仪器有限公司)；Enspire酶标仪(美国perkinelmer公司)；紫外分光光度计(DU-650，Beckman)；稳压电源(Bio-Rad)；摇床(Thermo-Shaker)；垂直电泳仪(Bio-Rad)；电转移装置(Bio-Rad)；凝胶成像系统(GelDOC2000，Bio-Rad)，Panasonic制冰机。
2.材料
槲皮素、咖啡酸、山柰酚、异槲皮苷、原儿茶酸和金丝桃苷单体对照品购自均购自南京良玮生物科技有限公司，以上化学经HPLC检测纯度均大于98％。黄芪花各提取物AE、EE、DT、LE、ME和HE制备方法同实施例1。
细胞株：HELF细胞(人胚肺成纤维细胞)，来源于ATCC细胞库，购自南京凯基生物有限公司。
二、实验方法
1.药品制备
黄芪花AE、EE、DT、LE、ME和HE部位、槲皮素、咖啡酸、山柰酚、异槲皮苷、原儿茶酸和金丝桃苷单体对照品用二甲基亚砜(DMSO)溶解成为质量浓度均为100mg·mL-1.
2.细胞培养
采用含有10％FBS和1％P/S的高糖型DMEM培养基进行培养，细胞培养箱参数控制在37℃，5％CO2气体。2-3天换液。
(1)细胞复苏
水浴锅设置在37℃，从液氮罐中迅速取出HT22冻存管，立刻在水浴中快速溶解，准备含有3.5mL培养基的60mm细胞培养皿，用移液枪将已溶解的细胞液缓慢而均匀地滴加到培养皿中，振摇分散开后放入培养箱中培养；8h之后换液一次，细胞贴壁并长满后进行传代。
(2)细胞传代
HT22细胞长到80％左右，将旧的培养基吸掉，用PE(V PBS:V EDTA＝49:1)荡洗一遍之后加入0.5mL TE，消化0.5min后吸走TE，加入2mL完全培养基吹打细胞使其呈现单个分散于培养基中，取其中的0.5mL细胞培养液于新的60mm无菌培养皿，用完全培养基补足至体积为4mL。
(3)细胞冻存
同“细胞传代”操作步骤得到单个分散的细胞培养液，将其收集到50mL离心管中，在4℃条件下，800rpm离心4min，弃去上清，加入提前配制好的含有90％FBS和10％DMSO的细胞冻存液，吹打分散后每0.5mL分装到一支冻存瓶中，盖好瓶盖，封口膜密封瓶口，标记细胞名称，冻存日期和冻存者姓名，先放入－80℃保存，第二天再至于液氮罐中保存。
(4)细胞计数
取消化后的分散的细胞培养液，再显微镜下，用计数器计数。
3.MTT法检测细胞生存率
给药前将对数生长期HELF细胞，按每孔2000个细胞接种于96孔板，待细胞贴壁过夜后，除了空白对照孔，其它每个孔中加入最终浓度为(3μM)30％过氧化氢，同时分别加入用完全培养基稀释(逐级稀释3倍，分别配制成5个不同浓度)后的AE、EE、DT、LE、ME和HE及单体化合物各10μL使得最终培养孔中的每个给药最高浓度分别为初始配制浓度1/1000倍，每个样品的每个浓度做3个平行复孔，放回细胞培养箱中培养2h后换液，每孔加入10μL，5mg·mL-1MTT溶液，继续培养3h。将培养基吸取干净，每孔加入150μLDMSO溶解甲臜，检测570nm波长下OD值。实验重复3次，取其平均值，检测黄芪花各提取物对过氧化氢诱导的HELF细胞损伤的保护作用。
三、实验结果
MTT试验结果如图3，AE较EE部位具有较好的保护HELF细胞的作用，另外可以看出DT部位保护过氧化氢氧化损伤下的HELF细胞的作用最强。
由以上实验结果可知，本发明提供的黄芪花提取物可有效保护过氧化氢损伤下的HELF细胞，表明其具有较好的抗肺纤维化作用。
综合以上实验结果表明，本发明提供的黄芪花提取物可有效降低博莱霉素致c57BL/6小鼠肺纤维化模型肺重系数，显著降低肺组织中的MDA、HYP含量和血清中TGF-β1和TNF-α，同时增加血清中的T-AOC含量，减轻模型动物肺组织病理变化；且细胞实验也显示本发明提供的黄芪花提取物可较好的保护过氧化氢损伤下的HELF细胞作用。体内外实验均表明本发明提供的黄芪花提取物可用于肺纤维化的防治。且与现有的药物相比，该提取物以天然传统药用植物为原料，更加安全，无不良反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.黄芪花在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用。
2.黄芪花的水提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用。
3.黄芪花的乙醇提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用。
4.黄芪花的多糖提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用。
5.根据权利要求4所述的黄芪花的多糖提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述的黄芪花的多糖提取物是通过以下方法制备得到的：
称取黄芪花，加入乙醇溶液，提取1~3次，每次0.5~1 h，合并提取液，减压浓缩，得到乙醇提取物；取乙醇提取后的药渣烘干后，再加入水，超声提取1~3次，合并超声提取液，减压浓缩、干燥得到黄芪花的多糖提取物。
6.根据权利要求5所述的黄芪花的多糖提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述的黄芪花的多糖提取物是通过以下方法制备得到的：
称取过40目筛的黄芪花300.0 g，加入3 L 80%乙醇溶液，提取3次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩，得到乙醇提取物；取乙醇提取后的药渣烘干后，再加入3L水，超声提取2次，合并2次超声提取液，减压浓缩、干燥得到黄芪花的多糖提取物。
7.根据权利要求3所述的黄芪花的乙醇提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述的黄芪花的乙醇提取物是通过以下方法制备得到的：
称取黄芪花300.0 g，加入3 L 80%乙醇溶液，提取3次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩，得到乙醇提取物；浓缩至200 mL，然后上AB-8大孔树脂柱，用体积浓度分别为10%，50%和90%的乙醇水溶液洗脱，得到洗脱液，用冷冻干燥机对洗脱液进行浓缩和干燥，分别获得10%乙醇洗脱液部位、50%乙醇洗脱液部位和90%乙醇洗脱液部位。
CN201910768735.1A 2019-08-20 2019-08-20 黄芪花及其提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用 Pending CN110420237A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910768735.1A CN110420237A (zh) 2019-08-20 2019-08-20 黄芪花及其提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910768735.1A CN110420237A (zh) 2019-08-20 2019-08-20 黄芪花及其提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110420237A true CN110420237A (zh) 2019-11-08

Family

ID=68417045

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910768735.1A Pending CN110420237A (zh) 2019-08-20 2019-08-20 黄芪花及其提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110420237A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102885878A (zh) * 2012-09-29 2013-01-23 甘肃中医学院 黄芪、红芪有效部位的应用
WO2015027891A1 (zh) * 2013-08-29 2015-03-05 天士力制药集团股份有限公司 一种新的丹酚酸化合物t、其制备方法和用途
CN107213158A (zh) * 2017-07-01 2017-09-29 广州中医药大学 沙苑子苷在制备治疗肺纤维化药物中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102885878A (zh) * 2012-09-29 2013-01-23 甘肃中医学院 黄芪、红芪有效部位的应用
WO2015027891A1 (zh) * 2013-08-29 2015-03-05 天士力制药集团股份有限公司 一种新的丹酚酸化合物t、其制备方法和用途
CN107213158A (zh) * 2017-07-01 2017-09-29 广州中医药大学 沙苑子苷在制备治疗肺纤维化药物中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李园: "《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑2019年第08期》", 15 August 2019 *
李园等: "黄芪花营养成分分析与资源价值评价 ", 《中草药》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Matsuda et al. Promotion of hair growth by ginseng radix on cultured mouse vibrissal hair follicles
CN106727147B (zh) 草本洋参皮肤美容改善药物及化妆品应用和制备
CN106924327A (zh) 罗汉果提取物抗肺纤维化的应用
CN105722974A (zh) 全能干细胞的诱导方法、及用该方法制备的全能干细胞
CN102220281B (zh) 一种肝细胞与Kupffer细胞共培养体系及其应用
CN104721301B (zh) 一种苹果多酚乙醇提取物及其制备方法和应用
CN106975007B (zh) 一种中药组合物及其在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用
CN113288831B (zh) 灵芝和/或人参在制备抗炎症因子产品方面的用途及其护肤品或化妆品
CN107410289B (zh) 一种骨髓间充质干细胞储存液
CN102114170B (zh) 防治心肌缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法
CN102488779B (zh) 鹿茸草提取物的应用
CN110420237A (zh) 黄芪花及其提取物在制备防治肺纤维化的药物或保健品中的应用
CN107041924A (zh) 一种防治糖尿病肾病的朝药复方提取物及其制备方法
CN102100737B (zh) 包含人参总皂苷与丹参总酚酸的药物组合物及其制备方法
CN102199081A (zh) 2-乙酰基芦荟大黄素及其制备方法和应用
CN106176564B (zh) 利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法
CN102805836B (zh) 一种治疗原发性肝癌的中药组合物及其制备方法
CN109224038A (zh) 一种治疗瘀血阻络型肝纤维化的含引经药吴茱萸的中药组合物及其制备方法和应用
CN104906162A (zh) 一种苍术挥发油的制备方法及其应用
CN108210518B (zh) 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病
CN107793403A (zh) 一种具有环氧结构的新化合物及其制备方法和医药用途
CN108324737B (zh) 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病
CN108310015B (zh) 脐带间充质干细胞联合药物治疗高血糖和糖尿病肾病
CN118370789B (zh) 一种用于细胞损伤修复的中药组合物及其制备方法与用途
CN104523809B (zh) 一种山茱萸色素的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191108