CN107410289B - 一种骨髓间充质干细胞储存液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种骨髓间充质干细胞储存液，溶液为0.9％生理盐水，溶液中还含有有效浓度的人参皂苷RZ1。本发明提供的储存液可以最大限度地维持骨髓间充质干细胞的存活率，存储12小时存活率的下降百分比可以控制10％以内，显著优于不含有人参皂苷RZ1的0.9％生理盐水；另外，若再添加有效浓度的人参皂苷RG5，存储12小时存活率的下降百分比可以控制5％以内。因此，人参皂苷RZ1可以用于制备骨髓间充质干细胞储存液，人参皂苷RG5可以进一步增强人参皂苷RZ1对骨髓间充质干细胞存活率的维持效果。

Description

一种骨髓间充质干细胞储存液
技术领域
本发明涉及干细胞储存，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞储存液。
背景技术
骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可以用于脊髓损伤等疾病的治疗，对损伤的脊髓进行骨髓间充质干细胞移植后发现，BMSCs可以促进损伤部位轴突再生和运动功能的恢复。
BMSCs在移植前，均需要从其扩增的培养瓶中进行收集，再用非培养基的溶液制成细胞悬液以供移植。在进行动物模型实验时，我们会在最短的时间内将重悬的干细胞进行移植。但是，在临床治疗中，将重悬的细胞立即进行移植是不可行的。细胞收集，外科手术及长距离的运输干细胞都可能会增加移植等待的时间。因此，新鲜干细胞在移植前需要进行一定时间的存储。为了便于移植，先以细胞悬液的形式进行短时间的存储，即短时的存储液亦是收集细胞时所用到的溶液。目前，在干细胞移植研究中，常用的细胞收集溶液有0.9％生理盐水、0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)，两种存储液常被用来提取、收集、检测和存储。
但是，BMSCs使用0.9％生理盐水或0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)存储效果一般，存储12小时存活率下降20-30％左右。
人参皂苷RZ1是从蒸制三七中分离得到的一种稀有人参皂苷，其与同样从蒸制三七中分离得到的另外两种稀有人参皂苷RK1、RG5为同分异构体(化学结构式如下)。已有研究发现这三种稀有人参皂苷具有多种药理作用，而且这三种稀有人参皂苷虽然结构非常相似(仅仅为双键位置不同或双键两端的基团顺反式不同)，但是药理作用差异较大。
目前尚未见人参皂苷RZ1或RG5用于保存BMSCs以最大限度保持其存活率的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供提供一种骨髓间充质干细胞储存液。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种骨髓间充质干细胞储存液，溶液为0.9％生理盐水，溶液中还含有有效浓度的人参皂苷RZ1。
优选地，人参皂苷RZ1质量浓度优选20-40mM。
优选地，还含有有效浓度的人参皂苷RG5。
优选地，人参皂苷RG5质量浓度优选5-15mM。
人参皂苷RZ1用于制备骨髓间充质干细胞储存液的用途。
优选地，所述储存液中还含有有效浓度的人参皂苷RG5。
本发明的优点：
本发明提供的储存液可以最大限度地维持骨髓间充质干细胞的存活率，存储12小时存活率的下降百分比可以控制10％以内，显著优于不含有人参皂苷RZ1的0.9％生理盐水；另外，若再添加有效浓度的人参皂苷RG5，存储12小时存活率的下降百分比可以控制5％以内。因此，人参皂苷RZ1可以用于制备骨髓间充质干细胞储存液，人参皂苷RG5可以进一步增强人参皂苷RZ1对骨髓间充质干细胞存活率的维持效果。另外，本发明储存液还有一个亮点：人参皂苷RZ1、RG5的水溶性很差，但是却可以直接溶解在0.9％生理盐水，无需添加助溶剂，使得储存液配方非常简单，避免了助溶剂可能对骨髓间充质干细胞的损伤。
附图说明
图1是BMSCs使用不同储存液存储12h后的存活率(％)。
图2是不同储存液储存12h的BMSCs对脊髓损伤大鼠髓鞘再生的作用比较。
具体实施方式
实施例1：对骨髓间充质干细胞存活率的影响
一、实验方法
1、干细胞储存液的配制
分别配制0.9％生理盐水(对照组)、人参皂苷RZ1组(0.9％生理盐水+30mM人参皂苷RZ1)、人参皂苷RK1组(0.9％生理盐水+30mM人参皂苷RK1)、人参皂苷RG5组(0.9％生理盐水+30mM人参皂苷RG5)、人参皂苷RZ1+RG5组(0.9％生理盐水+30mM人参皂苷RZ1+10mM人参皂苷RG5)，人参皂苷RZ1、RK1、RG5直接溶于0.9％生理盐水，摇匀即可。
2、BMSCs的分离培养
使用颈椎脱臼法将6-8周的C57BL/6小鼠处死后取股骨和胫骨，用PBS冲洗骨髓腔，吹打成单细胞悬液过滤，离心(1500r/min，5min)，去上清，加入红细胞裂解液5ml，裂解5-6min，加入等量的PBS离心(1500r/min，5min)，去上清，加入完全培养液6(DMEM、10％FBS、1％双抗)，以2×106/ml的密度接种到培养瓶中，于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，3d后换液。取第3代BMSCs用于后续实验。
3、不同储存液存储12h及存活率测定计算方法
取第3代BMSCs，用0.2％胰蛋白酶消化，然后分别用上述不同干细胞储存液制备成单个细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml，接种至96孔板内，常温存储12h。取九滴细胞悬液移至小试管内，加一滴0.4％胎盼蓝稀释液，混匀。在3min内，使用细胞计数板和计数器分别计数活细胞(拒染)和死细胞(被染成浅蓝色)。根据细胞计数结果，计算细胞活力：
细胞活力％＝活细胞数/细胞总数×100％。
二、实验结果
如表1和图1所示，人参皂苷RZ1组BMSCs的存活率显著高于对照组0.9％生理盐水，具有显著性差异(P＜0.05)；人参皂苷RK1组、人参皂苷RG5组BMSCs的存活率与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)；而人参皂苷RZ1+RG5组BMSCs的存活率比人参皂苷RZ1组进一步提高。该结果证明，人参皂苷RZ1可以提高BMSCs的储存存活率，其两个结构非常相似的同分异构体RK1、RG5不具有这种作用，但是人参皂苷RG5可以有效增强人参皂苷RZ1对BMSCs储存存活率的维持效果。
表1 BMSCs使用不同储存液存储12h后的存活率(％)
组别 存活率(％)
0.9％生理盐水(对照组) 73.6±2.9
人参皂苷RZ1组 90.3±2.3
人参皂苷RK1组 74.2±2.0
人参皂苷RG5组 71.9±3.1
人参皂苷RZ1+RG5组 97.5±1.8
实施例2：储存12h的BMSCs对脊髓损伤大鼠髓鞘再生的作用
一、实验方法
1、脊髓损伤大鼠模型的制备
将成年大鼠(体重250-280g)进行麻醉后，暴露T9-T11棘突及椎板并摘除，充分暴露T9-T11端脊髓。注意不破坏硬脊膜。以10.0g，0.45mm/s打击脊髓，以鼠尾痉挛性摆动、双下肢瘫痪提示模型制备成功。术后7d内给予青霉素(10mg/kg)防止感染。每天两次进行人工排尿，直至自主排尿恢复。
2、骨髓间充质干细胞原位移植
将实施例1中经不同储存液存储12h的BMSCs原位移植到脊髓损伤7天的模型大鼠中，方法为：脊髓损伤后7d，再次暴露损伤部位，用微量注射器将5μl的密度为1×105/μl细胞悬液原位移植到脊髓损伤部位；推注后，为防止外溢微量注射器至少在注射部位停留5min。
3、LFB染色比较不同组的髓鞘化区域
在移植后21天对各组大鼠脊髓组织进行LFB染色检测(基于脊髓冠状切面LFB染色)。具体染色方法为：石蜡切片脱蜡；95％乙醇脱水5min；0.1％LFB染液56℃染色过夜；依次以95％乙醇溶液和双蒸水洗涤5min；0.05％碳酸锂分化处理1-1.5min，双蒸水洗涤5min；70％乙醇溶液分化处理0.5-1min；双蒸水洗涤5min；0.1％结晶紫染液于56℃复染2min；95％乙醇溶液分化处理3-5min；100％乙醇中脱水处理5min两次，于二甲苯中透明化处理5min两次，经中性树胶封固，于光学显微镜下观察记录。
二、实验结果
如表2和图2所示，人参皂苷RZ1组大鼠LFB染色阳性髓鞘化区域面积显著高于对照组0.9％生理盐水，具有显著性差异(P＜0.05)；人参皂苷RK1组、人参皂苷RG5组大鼠LFB染色阳性髓鞘化区域面积与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)；而人参皂苷RZ1+RG5组大鼠LFB染色阳性髓鞘化区域面积比人参皂苷RZ1组进一步提高。该结果证明，使用含有人参皂苷RZ1的0.9％生理盐水储存12h的BMSCs可以促进脊髓损伤大鼠的髓鞘再生，其促进作用优于单独的0.9％生理盐水储存的BMSCs，该BMSCs仍然具备高生物活性；使用含有人参皂苷RK1、RG5的0.9％生理盐水储存12h的BMSCs与0.9％生理盐水相比无显著改善；与含有人参皂苷RZ1的0.9％生理盐水相比，进一步含有人参皂苷RG5的0.9％生理盐水储存12h的BMSCs对脊髓损伤大鼠髓鞘再生的促进作用进一步提高。
表2不同储存液储存12h的BMSCs对脊髓损伤大鼠髓鞘再生的作用比较
组别 LFB染色阳性髓鞘化区域占比(％)
0.9％生理盐水(对照组) 26.2±5.6
人参皂苷RZ1组 48.7±4.4
人参皂苷RK1组 28.5±4.7
人参皂苷RG5组 24.7±6.3
人参皂苷RZ1+RG5组 59.1±4.2
本发明提供的储存液可以最大限度地维持骨髓间充质干细胞的存活率，存储12小时存活率的下降百分比可以控制10％以内，显著优于不含有人参皂苷RZ1的0.9％生理盐水；另外，若再添加有效浓度的人参皂苷RG5，存储12小时存活率的下降百分比可以控制5％以内。因此，人参皂苷RZ1可以用于制备骨髓间充质干细胞储存液，人参皂苷RG5可以进一步增强人参皂苷RZ1对骨髓间充质干细胞存活率的维持效果。另外，本发明储存液还有一个亮点：人参皂苷RZ1、RG5的水溶性很差，但是却可以直接溶解在0.9％生理盐水，无需添加助溶剂，使得储存液配方非常简单，避免了助溶剂可能对骨髓间充质干细胞的损伤。
本领域技术人员应当知道，上述具体实施方式仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不局限于上述具体实施方式。

Claims (1)

1.一种骨髓间充质干细胞储存液，其特征在于：由0.9%生理盐水、人参皂苷RZ1和人参皂苷RG5组成；人参皂苷RZ1在0.9%生理盐水中的浓度为30mM，人参皂苷RG5在0.9%生理盐水中的浓度为10mM。
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