CN113416694A - 一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：微量脂肪采集；原代制备脂肪间充质干细胞；洗涤脂肪组织；使用不同的消化酶对脂肪组织进行两步消化；将消化后的细胞离心；加入完全培养基，重悬细胞沉淀，之后接种至包被好的培养瓶中进行培养；脂肪间充质干细胞的传代；润洗培养之后的脂肪细胞；加入胰蛋白酶消化脂肪细胞，至脂肪细胞在显微镜下由梭性贴壁状变为圆形脱壁状态，加入DMEM终止消化；之后将细胞悬液转移至离心管中离心；将离心管底部的细胞加入完全培养基，重悬细胞沉淀，接种至培养瓶中进行培养；传代培养细胞。本发明使用的脂肪量极少，同时不影响细胞的最终得率。

Description

一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法
技术领域
本发明涉及目前脂肪间充质干细胞的制备技术，具体涉及一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法。
背景技术
目前脂肪间充质干细胞的制备技术已趋于成熟，但对脂肪样本量的要求仍然比较高，这对一些不便于获得大量脂肪的个体受到了限制。
在现有技术中，对脂肪样本量的要求一般是10ml-300ml不等，以下几篇文献均提到了由10ml-300ml脂肪中分离脂肪间充质干细胞。这些文献中，对细胞的最终获取量没有明确的要求，只是停留在细胞的获得和鉴定层面。
文献【1】Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from humanadipose tissue:implications for cell－based therapies[J].Tissue Eng，2001，7(2):211－228.中提到的使用的脂肪样本量为300ml.。
文献【2】Yang XF，He X，He J，et al.High efficient isolation andsystematic identification of human adipose－derived mesenchymal stem cells[J].J Biomed Sci，2011，18:59..中提到的使用的脂肪样本量为300ml。
文献【3】李兴天，黄彬，黄海霞，陈军，李遇梅。体外分离培养人脂肪间充质干细胞及鉴定。临床和实验医学杂质.2015.9(18)：1489-1491中提到的使用的脂肪样本量为10ml。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明公开了一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法。
本发明所采用的技术方案如下：
一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
微量脂肪采集；所述微量脂肪指0.9-1.1ml的脂肪组织；
原代制备脂肪间充质干细胞；洗涤脂肪组织；使用不同的消化酶对脂肪组织进行两步消化；将消化后的细胞离心；加入完全培养基，重悬细胞沉淀，之后接种至包被好的培养瓶中进行培养；
脂肪间充质干细胞的传代；润洗培养之后的脂肪细胞；加入胰蛋白酶消化脂肪细胞，至脂肪细胞在显微镜下由梭性贴壁状变为圆形脱壁状态，加入DMEM终止消化；之后将细胞悬液转移至离心管中；离心细胞悬液；离心结束后，弃上清；将离心管底部的细胞加入完全培养基，重悬细胞沉淀，接种至培养瓶中进行培养；
传代培养细胞。
其进一步的技术方案为，使用不同的消化酶对脂肪组织进行两步消化的具体过程是，使用消化酶I加入到洗涤后的脂肪组织进行第一次消化；之后使用消化酶II进行第二次消化；所述消化酶I包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶中的一种或者几种；所述消化酶I包括胰蛋白酶、DNA酶的一种或者几种。
其进一步的技术方案为，所述消化酶I的配置方法是取I型胶原酶，溶解在DMEM中，用0.22μm规格的滤器过滤；所述消化酶II的配置方法是取DNA酶，溶解在胰蛋白酶中，用0.22μm规格的滤器过滤。
其进一步的技术方案为，在原代制备脂肪间充质干细胞的步骤中，将消化后的细胞离心包括两次离心过程；将细胞放入离心机进行第一次离心，第一次离心后将上层油滴吸取弃之；加入与剩余的溶液等体积的DMEM，轻轻混匀，以终止消化；之后进行第二次离心，第二次离心后下层沉淀即为获得的细胞。
其进一步的技术方案为，原代制备脂肪间充质干细胞的步骤中，培养瓶在接种前进行包被处理；在包被处理中使用促进细胞贴壁的物质包被培养瓶。
其进一步的技术方案为，促进细胞贴壁的物质包括胶原蛋白和纤维黏连蛋白。
其进一步的技术方案为，包被处理具体为：将培养瓶用含有1ug/cm2的FN、0.2ug/cm2的Collagen I、1ug/cm2的Collagen IV的PBS，在2-8℃的条件下孵育过夜；在接种前弃去培养瓶中的包被液，用PBS润洗培养瓶2次。
其进一步的技术方案为，所述完全培养基为无血清培养基。
其进一步的技术方案为，传代培养细胞至P5代。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明是用微创的方法采集微量(例如1ml)脂肪，进行原代制备，经过传代培养获得15-0亿脂肪间充质干细胞的方法。本发明使用的脂肪量极少，明显降低了脂肪干细胞制备对脂肪的量的限制，同时不影响细胞的最终得率。解除了一些由于身体原因或心理原因，例如身体消瘦、对抽脂手术恐惧及一些其他原因不能大量获得脂肪样本的个体的限制，使受众体更加广泛。
(2)本发明使用促进细胞贴壁的物质包被培养瓶。
本发明包被培养瓶时使用了Collagen I和Collagen IV，是支持细胞和组织生长的重要胞外基质蛋白，其形成的胞外环境有利于多种细胞的黏附、生长、迁移和分化。还试用了FN，也即纤维黏连蛋白，是一种位于细胞表面和血浆中的大分子蛋白质，是一种主要的细胞黏附分子，在细胞纤维基质中发挥结构和黏附性作用。
(3)本发明使用了两步消化法。
先使用消化酶I消化脂肪组织，可用于上皮组织细胞的分离。再使用消化酶II进行消化，DNA酶可以防止分离细胞时细胞黏附聚集，可有效降低消化粘稠度，分离得到的脂肪干细胞具有优良的增殖活性和分化能力。
(4)本发明使用了不含血清培养基的完全培养基，并且加入了促进干细胞生长的因子等其他物质。不添加血清物质可避免动物源物质进入。另外，还添加了促进干细胞生长的蛋白因子：表皮生长因子EGF可在细胞生长和增殖过程中发挥强力促有丝分裂作用；神经生长因子NGF促进细胞良性有丝分裂；胰岛素样生长因子IGF-1可以促进细胞增殖，延长细胞寿命；血小板衍生生长因子PDGF是一种重要的促有丝分裂因子，可以刺激干细胞群分裂增殖；睾酮能够促进脂肪源性干细胞增殖，可加速脂肪源干细胞的细胞周期由G1期向S期的进程；雌二醇可上调端粒酶活性，阻止端粒的缩短，保证细胞在扩增中的稳定性；人参皂苷Rg5能够促进干细胞增殖，抑制凋亡、促进旁分泌；益气汤，成分包括黄芪18g、白术9g、党参6g、甘草9g、川陈皮6g、当归3g、柴胡6g和升麻6g，可促进细胞生长因子的表达上调，平衡细胞微循环。以上细胞因子均对体外干细胞生长具有促进和保护作用。
附图说明
图1是实施例中原代培养的脂肪间充质干细胞在显微镜下的形态。
图2是实施例中第3代脂肪间充质干细胞在显微镜下的形态。
图3是实施例中第5代脂肪间充质干细胞在显微镜下的形态。
图4是实施例中成脂分化的细胞示意图。
图5是实施例中成骨分化的细胞示意图。
图6是实施例中成软骨分化的细胞示意图。
具体实施方式
下面结合附图，说明本发明的具体实施方式。
步骤1、微量脂肪采集。微量脂肪指0.9-1.1ml的脂肪组织。在本实施例中，使用旋切活检仪，采集1ml脂肪组织作为样本。
步骤2、原代制备脂肪间充质干细胞。步骤2具体包括：
2.1、包被细胞培养瓶。优选使用促进细胞贴壁的物质包被培养瓶。促进细胞贴壁的物质包括胶原蛋白和/或纤维黏连蛋白。
在本实施例中，用含有1ug/cm2的FN(纤维黏连蛋白)、0.2ug/cm2的Collagen I(I型胶原蛋白)、1ug/cm2的Collagen IV(IV型胶原蛋白)的PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)，在2-8℃的条件下孵育过夜。
2.2、配置消化酶I和消化酶II。消化酶I和消化酶II配置好后备用。
消化酶I包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶中的一种或者几种；消化酶II包括胰蛋白酶、DNA酶的一种或者几种。
在本实施例中，消化酶I的配置方法是，称取I型胶原酶，溶解在DMEM(dulbecco'smodified eagle medium，杜尔贝科改良伊格尔培养基)中，用0.22μm规格的滤器过滤。消化酶I的浓度为0.1％(m/v)。I型胶原酶包含有胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶，用于细胞和组织的解离，为本领域常用的产品，可选用市售产品。
消化酶II的配置方法是，称取浓度为0.2％(mg/ml)的DNA酶，溶解在胰蛋白酶中，用0.22μm规格的滤器过滤。
2.3、洗涤脂肪。将PBS加入到脂肪样本中，且脂肪样本的体积：PBS的体积为1:2，充分晃动，然后静止约30s，将下层的液体吸出弃之。重复此操作2-3次，直至吸出的液体较为澄清，脂肪样本较为澄清为止。
2.4、消化脂肪。使用两种不同的消化酶对脂肪样本进行两步消化。
第一次消化：将配制好的消化酶I加入到洗涤后的脂肪样本中，且脂肪样本体积：消化酶I的体积＝1:2。之后放入37℃恒温震荡培养箱中，在200rpm的条件下，消化30min。
第二次消化：第一次消化结束后，加入消化酶II继续消化5min。
2.5、离心获得细胞。消化结束后，进行两次离心操作获得SVF(tromal vascularfraction，基质血管成分)细胞。
第一次离心：将细胞放入离心机，以转速为1100rpm的条件离心8min，将上层油滴吸取弃之。加入与剩余的溶液等体积的DMEM，轻轻混匀，以终止消化。
第二次离心：以转速为1100rpm的条件离心5min，弃上清，下层沉淀即为获得的SVF细胞。
2.6、清洗步骤2.1中包被好的培养瓶：弃去培养瓶中的包被液，用PBS润洗培养瓶2次。
2.7、接种。加入8ml完全培养基重悬细胞沉淀，接种至包被好的培养瓶中，拧好瓶盖，置于37℃，CO2浓度5％的培养箱中培养。
上述的完全培养基是无血清培养基。在本实施例中，完全培养基包括无血清培养基、0.02g/ml的血清替代物、2mol/L的谷氨酰胺、4ng/ml的EGF(Epidermal Growth Factor，表皮生长因子、2ng/ml的NGF(Nerve Growth Factor，神经生长因子)、5ng/ml的IGF-1(nsulin-like growth factor 1，类胰岛素一号增长因子)、5ng/ml的PDGF(Plateletderived growth factor，血小板衍生生长因子)、1.0×10-6mol/L的睾酮+1.0×10-6mol/L的雌二醇+100μmol/L的人参皂苷Rg5以及1mg/ml的益气汤。
其中，睾酮能够促进脂肪源性干细胞增殖，可加速脂肪源干细胞的细胞周期由G1期向S期的进程；雌二醇可上调端粒酶活性，阻止端粒的缩短，保证细胞在扩增中的稳定性；人参皂苷Rg5能够促进干细胞增殖，抑制凋亡、促进旁分泌；益气汤促进细胞生长因子的表达上调，平衡细胞微循环。以上细胞因子均对体外干细胞生长具有促进和保护作用。
进一步的，益气汤的制作方法是，使用黄芪18g、白术9g、党参6g、甘草9g、川陈皮6g、当归3g、柴胡6g、升麻6g制成粉料，之后取益气汤粉料在索氏提取器中进行蒸馏、减压、干燥处理，使之为膏状，将其溶解至PBS中，备用。浓度为1mg/ml。在益气汤的成分中，黄芪中含有黄芪多糖、皂苷、黄酮等化合物，具有较强的生物活性，黄酮和皂苷能抑制自由基和清除过剩的自由基，保护细胞免受自由基产生的过度氧化作用的影响，延长细胞寿命。白术主要含有苍术酮、苍术醇及维生素A等物质，可调节免疫功能。党参含有铁、锌、铜等微量元素，以及其中的苍术内酯III具有明显的抗炎活性。甘草中的主要成分甘草酸具有抗炎解毒功效。川陈皮具有抗炎功效。当归对细胞的免疫功能有较强的促进作用。
步骤3、脂肪间充质干细胞的传代。步骤3具体包括：
3.1、吸取步骤2.7中培养瓶中的培养液，弃之。加入PBS轻轻晃动培养瓶，润洗细胞后，吸取润洗细胞后的液体，弃之。
3.2、加入0.05％浓度的胰蛋白酶消化细胞，至细胞在显微镜下由梭性贴壁状变为圆形脱壁状态，加入DMEM终止消化。轻轻敲打混匀，将细胞悬液转移至离心管中。
3.3、在转速为1100rpm的条件下，离心细胞悬液5min。离心结束后，弃上清。手指轻弹离心管底部，之后加入完全培养基重悬细胞沉淀，接种至新的培养瓶中，拧好瓶盖，置于37℃，CO2浓度5％的培养箱中培养。
3.4、传代培养细胞至P5代，收集细胞。
首先，检验上述方法所得到的细胞数量。
由于本发明在步骤2.7中使用了新的配方的无血清培养基，所以可以显著提高细胞数量，以下用三个实施例来说明细胞数量的差异。下述三个实施例，是用上文所述的步骤1～步骤3培养得到的细胞数量，与普通培养基培养的细胞数量进行对比。下文三个实施例的培养条件相同，重复三次，均发现有相同的实验结果，即：使用新的配方的无血清培养基所得到的细胞数量远超过现有的普通培养基培养的细胞数量。
在下文三个实施例中，作为对照所使用的普通完全培养基，成分包括DMEM、10％FBS和2mol/l谷氨酰胺。
实施例1
培养基种类 最终收获细胞量
普通完全培养基 10.2亿
添加了细胞因子等物质的完全培养基 21.0亿
实施例2
培养基种类 最终收获细胞量
普通完全培养基 8.8亿
添加了细胞因子等物质的完全培养基 19.96亿
实施例3
培养基种类 最终收获细胞量
普通完全培养基 9.2亿
添加了细胞因子等物质的完全培养基 20.48亿
其次，观察其中一个实施例中的细胞状态。
图1是实施例中原代培养的脂肪间充质干细胞在显微镜下的形态。图2是实施例中第3代脂肪间充质干细胞在显微镜下的形态。图3是实施例中第5代脂肪间充质干细胞在显微镜下的形态。由图1-图3可以看出，接种后原代培养9d可见细胞形态均一，呈梭形贴壁生长，细胞增殖能力活跃，细胞呈成簇分布，方向性好。当细胞融合到85％-90％时，进行细胞传代，培养至第5代脂肪干细胞脂肪间充质干细胞，细胞生长良好。
表1是不同细胞代次的细胞数量和成活率数据。由表1可见，由原代脂肪间充质干细胞制备，获得P0代细胞，传代至P5代，可收获20亿左右细胞。
表1
细胞代次 细胞数量 细胞活率
P0代 400万 100％
P1代 1200万 99％
P2代 3200万 100％
P3代 1.28亿 100％
P4代 5.12亿 99％
P5代 20.48亿 100％
表2是流式检测细胞免疫表型检测数据。由表2可见，培养至第5代脂肪间充质干细胞，应用流式细胞术检测脂肪干细胞分化群表面抗原的表达，细胞表面抗原CD49d、CD90、CD105及CD73呈现阳性表达，CD14、CD34、CD45及HLA-DR呈现阴性表达，证明实验所得细胞是脂肪间充质干细胞。
表2
抗原 抗原表达百分比
CD14 0.00％
CD34 0.00％
CD45 0.00％
CD49d 99.99％
CD90 99.97％
CD105 99.99％
HLA-DR 0.00％
CD73 99.99％
图4是成脂分化的细胞示意图。如图4所示，P5代脂肪间充质干细胞经过成脂诱导，细胞的形态逐渐由梭形变为椭圆形或圆形，细胞体积逐渐增大，轮廓模糊，在光镜下可见细胞内有晶莹透亮的脂肪小滴，部分融合变大，油红O染色结果显示细胞内有大小不等的橘红色脂肪滴，提示所培养的细胞能分化为成熟的脂肪细胞。
图5是成骨分化的细胞示意图。如图5所示，P5代脂肪间充质干细胞生长至80％-90％以上融合后，更换成骨诱导液，随着诱导时间增加，细胞胞体增大，密集、重叠生长，出现聚集趋势，逐渐围绕集落中央呈小岛状分布，随后出现小点状不透光的钙化斑，随着诱导时间的延长，钙化斑逐渐增大，成骨诱导19d后，茜素红染色可见着橘红色的典型钙化结节。
图6是成软骨分化的细胞示意图。如图6所示，P5代脂肪间充质干细胞离心后加入成软骨诱导液，连续诱导28天后，形成球状，对软骨球进行福尔马林固定和石蜡包埋切片，然后进行阿利辛蓝染色，表明存在软骨中的内酸性粘多糖。
图4至图6说明了使用本发明的方法获得的脂肪间充质干细胞具有多能分化的性质。
以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的基本结构的情况下，本发明可以作任何形式的修改。

Claims (9)

1.一种从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
微量脂肪采集；所述微量脂肪是0.9-1.1ml的脂肪组织；
原代制备脂肪间充质干细胞；洗涤脂肪组织；使用不同的消化酶对脂肪组织进行两步消化；将消化后的细胞离心；离心后将细胞加入完全培养基，重悬细胞沉淀，之后接种至包被好的培养瓶中进行培养；
脂肪间充质干细胞的传代；润洗培养之后的脂肪细胞；加入胰蛋白酶消化脂肪细胞，至脂肪细胞在显微镜下由梭性贴壁状变为圆形脱壁状态，加入DMEM终止消化；之后将细胞悬液离心；离心后将离心管底部的细胞加入完全培养基，重悬细胞沉淀，之后接种至培养瓶中进行培养；
传代培养细胞。
2.根据权利要求1所述的从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，使用不同的消化酶对脂肪组织进行两步消化的具体过程是，使用消化酶I加入到洗涤后的脂肪组织进行第一次消化；之后使用消化酶II进行第二次消化；所述消化酶I包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶中的一种或者几种；所述消化酶I包括胰蛋白酶、DNA酶的一种或者几种。
3.根据权利要求2所述的从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述消化酶I的配置方法是取I型胶原酶，溶解在DMEM中，用0.22μm规格的滤器过滤；所述消化酶II的配置方法是取DNA酶，溶解在胰蛋白酶中，用0.22μm规格的滤器过滤。
4.根据权利要求1所述的从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，在原代制备脂肪间充质干细胞的步骤中，将消化后的细胞离心包括两次离心过程；将细胞放入离心机进行第一次离心，第一次离心后将上层油滴吸取弃之；加入与剩余的溶液等体积的DMEM，轻轻混匀，以终止消化；之后进行第二次离心，第二次离心后下层沉淀即为获得的细胞。
5.根据权利要求1所述的从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，原代制备脂肪间充质干细胞的步骤中，培养瓶在接种前进行包被处理；在包被处理中使用促进细胞贴壁的物质包被培养瓶。
6.根据权利要求5所述的从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，促进细胞贴壁的物质包括胶原蛋白和纤维黏连蛋白。
7.根据权利要求5所述的从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，包被处理具体为：将培养瓶用含有1ug/cm2的FN、0.2ug/cm2的CollagenI、1ug/cm2的CollagenIV的PBS，在2-8℃的条件下孵育过夜；在接种前弃去培养瓶中的包被液，用PBS润洗培养瓶2次。
8.根据权利要求1所述的从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，所述完全培养基为无血清培养基。
9.根据权利要求1所述的从微量脂肪中高效获得脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，传代培养细胞至P5代。
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