CN1763526A - 一种同时检测血或尿中多种酚酸类化合物的测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种同时检测血或尿中多种酚酸类化合物的液相色谱—串连质谱测定方法，其特点为采用键合相硅胶为固定相，以甲醇或乙腈或甲醇与乙腈的混合液/甲酸水溶液或乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液为流动相进行反相色谱—等度或梯度分离。定量采用内标法，内标物为氯霉素。对血样采用酸化后的用有机相提取的预处理方法。采用本法可简便、可靠地对血或尿中的6种酚酸类化合物进行定量检测，各项方法学指标均能可靠地满足检测血清或尿中多种酚酸类化合物的需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时检测血或尿中多种酚酸类化合物的方法，更具体是涉及一种可同时对血样及尿样中的六种水溶性酚酸类化合物进行定量测定的液相色谱一串连质谱(LC-MS/MS)方法。
背景技术
丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸是存在于唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)、南丹参(S.Bowleyana Dunn)等多种植物中的水溶性酚酸类化合物。近年来研究发现丹酚酸B等水溶性酚酸类化合物具有强烈的抗氧化作用(例如丹酚酸B的抗氧化作用约为维生素E的1000倍)和清除氧自由基作用，对多种心、脑血管疾病及肝、肾功能损伤和肺纤维化等组织器官的病变均有明显的保护作用，业已得到人们日益广泛的关注。由于对水溶性酚酸类化合物的研究起步较晚，有关其含量测定的报道并不多见。上海市徐汇区中心医院采用反相高效液相色谱法对药材中所含有的丹酚酸B进行了定量测定，但灵敏度低，且只能检测一种化合物(Zhang H et al.Acta Pharmacol Sin 2002；23：1163-68.)。
研究表明，丹酚酸B等水溶性酚酸类化合物作为一种强抗氧剂，其本身化学结构并不太稳定。在加温、光照、潮湿和暴露在空气的条件下，会发生明显的降解，因此样品预处理难度大。血清(或血浆)及尿样中水溶性酚酸类化合物的定量测定具有灵敏度要求高，样品预处理复杂等特点，国外曾有报道采用高效液相色谱法对血浆中的丹酚酸B进行检测(Zhang et al.Planta Med 2004；70(2)：138-42.)。有关采用液相色谱质谱法同时对多种酚酸类化合物进行定量检测，迄今未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中预处理操作复杂，不能同时测定多种酚酸类化合物的缺陷，提供一种可快速而有效地定量检测出血或尿中多种酚酸类化合物含量的液相色谱-串连质谱(LC-MS/MS)方法。
本发明建立的LC-MS/MS检测方法采用一次色谱过程分析血尿中包括丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸在内的6种酚酸类化合物的含量。本发明方法的特点为采用内标法定量，内标物为氯霉素。采用键合相硅胶为固定相，以甲醇或乙腈或甲醇与乙腈的混合液/甲酸水溶液或乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液为流动相进行反相色谱-等度或梯度分离。本发明方法根据酚酸类化合物的理化特性，对血样的预处理采用酸化后用有机相提取的液-液萃取方法。对尿样则采用水稀释后高速离心的预处理方法。
本发明方法包括以下步骤：
一、样品处理：
1、血样的处理：采用液-液萃取法，其操作步骤为：取适量血样，添加内标溶液，加入酸化剂酸化，使样品溶液pH达到1-6，加入相当于待提取溶液体积1-10倍量的有机溶剂萃取后旋涡混合提取，16000g离心2min，取有机相氮气吹干，用10-200μl水溶液或有机酸水溶液(如丙酮水溶液、甲醇水溶液、乙腈水溶液等)溶解残渣后进样供LC-MS/MS进样测定。本预处理方法中，血样的用量一般为50-200μl；内标溶液可采用含氯霉素10-200ng/ml的水溶液，用量一般为10-200μl；酸化剂为浓度为10-50％(V/V)的有机酸水溶液，其中有机酸可采用甲酸、乙酸、三氯乙酸等；旋涡提取的时间为1-10min；优选使用的有机萃取剂包括乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚或甲醇。
2、尿样的处理：采用水稀释后高速离心的方法，其操作步骤为：取尿样10μl，准确加入10μl内标工作溶液和80μl水混旋，经高速离心(16000r/min×2min)后取上层溶液进样。
二、液相分离：
1、流动相：由A和B组成，pH为1-6，流速为0.2ml/min。其中A指甲醇或乙腈或乙腈与甲醇的等体积比混合液，B指浓度为0.01～1％(V/V)的甲酸水溶液或乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液。
2、色谱柱：采用细口径硅胶键合相填料柱，如C18柱、C8柱、氰基柱等键，色谱柱的内径为1.0-3.0mm；长度为30-100mm。
3、洗脱方法：采用等度或梯度洗脱方法。采用等度洗脱方法时，流动相的组成为(以体积百分比计)A30～60％、B70～40％；采用梯度洗脱方法时，流动相的组成为(以体积百分比计)A60～10％、B40～90％。洗脱梯度根据不同的键合相色谱柱进行设计和调整，对于C18键合相色谱柱，当A为乙腈、B为0.5％(V/V)甲酸水溶液时可参考下列方法进行：梯度(以体积百分比计算)：0～1.0min，A：15％、B：85％；
1.0～2.5min，A：15～30％、B：85～70％；
2.5～4.0min，A：30％、B：70％；
4.0～7.0min，A：30～15％、B：70～85％；
7.0～9.0min，A：15％、B：85％。
三、质谱检测：
质谱条件为：采用电喷雾离子源，负离子多反应监测扫描。雾化气压力：10L/min，气帘气压力：10L/min，辅助气流速：12L/min，电喷雾电压：-4500V，离子源温度：450℃，离子选择通道(Q1/Q3m/z)分别为：丹酚酸B 717.2/519.2、迷迭香酸359.1/160.6、紫草酸537.5/493.3、丹参素197.1/134.3、原儿茶醛137.1/107.9、咖啡酸179.3/134.9、氯霉素321.3/151.4(内标)。以上各化合物离子通道范围可为±1.0amu。
四、浓度计算方法和检测限：
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中6种酚酸类化合物的浓度。
本发明方法的检测限为0.1～2.0ng/mL(信噪比≥3)；线性范围8～2048ng/ml，相关系数r在0.995以上；日内及日间精密度≤15％；各化合物的绝对回收率在60～90％。
有益效果：
1、本发明方法可同时对血或尿中多种酚酸类化合物进行定量测定，以内标法定量，可对包括样品预处理、色谱分离和质谱检测在内的样品分析的全过程进行校正。
2、本发明方法对样品的检测专一性强、灵敏度高，操作简便，各项方法学指标均能可靠地满足检测血清或尿中多种酚酸类化合物的需要。
3、本发明方法根据酚类化合物的理化性质和LC-MS/MS特性所设计的样品处理方法简便，血样品经一次液-液萃取法就可使其中的化合物得到净化，采用细口径的色谱柱和等度洗脱实现了酚酸类化合物的快速色谱分离。
附图说明
图1表示等度洗脱条件下6种酚酸类化合物及内标水溶液的整体碎片离子扫描图，其中图1-a表示丹酚酸B的图谱；1-b表示迷迭香酸的图谱；图1-c表示紫草酸的图谱；图1-d表示原儿茶醛的图谱；图1-e表示咖啡酸的图谱；图1-f表示丹参素的图谱；图1-g表示氯霉素的图谱。
图2等度洗脱条件下血样中6种酚酸类化合物及内标的整体色谱图，其中图2-a表示丹酚酸B的图谱；2-b表示迷迭香酸的图谱；图2-c表示紫草酸的图谱；图2-d表示咖啡酸的图谱；图2-e表示原儿茶醛的图谱；图2-f表示丹参素的图谱；图2-g表示氯霉素的图谱。
图3梯度洗脱条件下血样中6种酚酸类化合物及内标的整体色谱图，其中图3-a表示丹酚酸B的图谱；3-b表示迷迭香酸的图谱；图3-c表示紫草酸的图谱；图3-d表示咖啡酸的图谱；图3-e表示原儿茶醛的图谱；图3-f表示丹参素的图谱；图3-g表示氯霉素的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
实施例
1材料
1.1仪器和材料
API3000串联质谱仪(美国应用生物系统公司)；Angilen 1100系列液相色谱仪，包括在线脱气仪、四元泵、自动进样器；XW-80旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；TGL·16G台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。色谱柱：CAPCELL PAK C18柱(MG.5μm，100mm×2.0mm(i.d))及CAPCELLPAK C18柱(MG.5μm，50mm×2.0mm(i.d))
1.2药品与试剂
丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸纯品，各含量＞99％，上海药物研究所制备。
1.3储备液
1.3.1对照品储备液
6种酚酸类化合物各10.0mg，混合后加入10mL的甲醇溶液，成为各含量均为1.0mg/mL的甲醇溶液，-20℃储备。使用时用水稀释。
化学品标准曲线为80，160，320，640，1280，2560，5120，10240，20480ng/ml，质控样品浓度为80，200，8000，16000ng/ml。
1.3.2内标液
1.0μg/ml氯霉素水溶液。
1.4血样及尿样
取上述10μL化学品溶液，加入90μL空白血样，得到浓度为8，16，32，64，128，256，512，1024，2048ng/ml的标准曲线血样及浓度为8，20，800，1600ng/ml的质控血样。
取上述10μL化学品溶液，加入90μL空白尿样，得到浓度为8，16，32，64，128，256，512，1024，2048ng/ml的标准曲线尿样及浓度为8，20，800，1600ng/ml的质控尿样。
2方法
2.1样品预处理方法
2.1.1血样处理：取100μl标准曲线及质控血样置于2ml试管中，准确加入10μl氯霉素内标工作溶液，加入200μl含70％(V/V)丙酮的水溶液(另含有2％V/V甲酸)和1ml乙酸乙酯，在旋涡混合器旋涡混合1.5min，以16000r/min离心2min，吸取上层有机相转入另-2ml试管中，用氮气吹干仪在35℃吹干，加入100μl含25％丙酮的水溶液溶解，以16000r/min离2min，取上清液进样。
2.1.2尿样处理：取标准曲线及质控尿样10μl，准确加入10μl内标工作溶液和80μl水混旋，经高速离心(16000r/min×2min)后取上层溶液进样。
2.2仪器条件
2.2.1液相色谱条件
流动相：A.乙腈-甲醇(v∶v，1∶1)；B.0.5％(v∶v)甲酸水溶液。
流速：0.20mL/min；
进样量：5μl。
2.2.1.1等度洗脱：
A∶B＝0.104∶0.96(v∶v)
色谱柱：CAPCELL PAK C18，5μm，100×2.0mm；
2.2.1.2梯度洗脱(以体积百分比计算)：
0～1.0min，A：15％、B：85％；
1.0～2.5min，A：15～30％、B：85～70％；
2.5～4.0min，A：30％、B：70％；
4.0～7.0min，A：30～15％、B：70～85％；
7.0～9.0min，A：15％、B：85％。
色谱柱：CAPCELL PAK C18，5μm，50×2.0mm；
2.2.2质谱条件
采用电喷雾离子源，负离子扫描，多反应监测(MRM)。雾化气压力(NEB)：10L/min，气帘气压力(CUR)：10L/min，辅助气流速(CAD)：12L/min，电喷雾电压(IS)：-4500V，离子源温度(TEM)：450℃。定量离子对和测定参数见表1：
表1
| 化合物 | Q1m/z(Th) | Q3m/z(Th) | DwellTime(ms) | 参数 | ||||
| DP(V) | FP(V) | EP(V) | CE(V) | CXP(V) | ||||
| 丹酚酸B迷迭香酸紫草酸丹参素原儿茶醛咖啡酸 | 717.2359.1537.5197.1137.1179.3 | 519.2160.6493.3134.3107.9134.9 | 200200200200200200 | -36-36-30-36-40-45 | -215-280-240-200-200-255 | -9-10-9-9-10-14 | -27-23-12-27-32-21 | -15-12-14-23-7-8 |
| 氯霉素 | 321.3 | 151.4 | 200 | -30 | -170 | -14 | -25 | -10 |
注：DP：去簇电压；FP：聚焦电压；EP：进口电压；CE：碰撞能量；CXP：碰撞池进口能量
2.3工作曲线
按内标法以峰面积或峰高法计算出样品中各种酚酸类化合物的浓度。以添加浓度为X轴，样品与内标物的峰面积或峰高法比为Y轴，进行线性回归，经“1/X”权重得回归方程。
2.4精密度和回收率
根据质控样品，分别测定批内、批间精密度，计算相对回收率。绝对回收率由质控样品的峰面积比上相同浓度的化学品峰面积来计算。检测限要求信噪比(S/N)≥3。
3检测结果
等度洗脱时保留时间为：丹酚酸B 2.52min、迷迭香酸2.28min、紫草酸2.27min、咖啡酸1.89min、原儿茶醛1.91min、丹参素1.63min、氯霉素(内标)2.85min。血样中6种酚酸类化合物色谱峰见图2，其中6种酚酸类化合物浓度为64ng/mL，氯霉素为100ng/mL。
梯度洗脱时保留时间为：丹酚酸B 5.91min、迷迭香酸5.16min、紫草酸4.62min、咖啡酸2.20min、原儿茶醛1.75min、丹参素1.09min、氯霉素(内标)4.62min。血样中6种酚酸类化合物色谱峰见图3。其中6种酚酸类化合物浓度为64ng/mL，氯霉素为100ng/mL。
样品中各种酚酸类化合物的检测限为0.1-2.0ng/ml(信噪比≥3)。日内及日间标准差在10％以内，相对回收率在85％-120％，各酚酸类化合物提取回收率为60％-90％。具体结果见表2。
表2血样检测统计结果。
| 药品名称 | 丹酚酸B | 迷迭香酸 | 紫草酸 | 丹参素 | 原儿茶醛 | 咖啡酸 | 氯霉素 |
| 检测限(ng·mL-1) | 0.5 | 0.5 | 0.7 | 1.5 | 1.5 | 2.0 | 0.1 |
| 线性范围(ng·mL-1) | 8-2048 | 8-2048 | 8-2048 | 8-2048 | 8-2048 | 8-2048 | 8-2048 |
| 相关系数γ | 0.998 | 0.999 | 0.999 | 0.997 | 0.998 | 0.997 | / |
| 日内精密度 | ＜8.2％ | ＜6.5％ | ＜8.4％ | ＜7.8％ | ＜6.9％ | ＜7.2％ | / |
| 日间精密度 | ＜9.5％ | ＜9.7％ | ＜8.8％ | ＜9.2％ | ＜8.6％ | ＜11.2％ | / |
| 相对回收率(％) | 93～106 | 94～112 | 94～114 | 88～115 | 85～110 | 92～109 | / |
| 绝对回收率(％，n＝6) | 72 | 78 | 75 | 61 | 84 | 90 | 92 |
Claims (6)
1.一种同时检测血或尿中多种酚酸类化合物的测定方法，包括样品处理、液相分离、质谱检测三个步骤，其特征在于该方法对血样预处理采用酸化后用有机相提取的液-液萃取方法；尿样预处理采用水稀释后高速离心的方法；采用内标法定量，内标物为氯霉素；采用硅胶键合相填料的细径液相色谱柱，流动相由A和B组成，pH为1-6，其中A指甲醇或乙腈或乙腈与甲醇的等体积比混合液，B指浓度为0.01～1％(V/V)的甲酸水溶液或乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液，作等度或梯度洗脱分离；质谱检测采用电喷雾离子源，负离子多反应监测扫描。
2.根据权利要求1所述的同时检测血或尿中多种酚酸类化合物的测定方法，其特征在于负离子多反应监测扫描分析时，各酚酸类化合物的离子选择通道(Q1/Q3m/z)分别为：丹酚酸B镁309.6/281.3、迷迭香酸304.5/181.9、紫草酸300.6/183.2、丹参素285.5/154.1、原儿茶醛295.5/267.0、咖啡酸314.3/268.2、氯霉素(内标)321/151。
3.根据权利要求1所述的同时检测血或尿中多种酚酸类化合物的测定方法，其特征在于血样预处理使用的酸化剂为浓度为10％-50％(v/v)的有机酸水溶液，酸化后样品溶液的pH为1-6，萃取剂包括乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚、甲醇。
4.根据权利要求3所述的同时检测血或尿中多种酚酸类化合物的测定方法，其特征在于血样预处理使用的酸化剂为甲酸水溶液、乙酸水溶液、三氯乙酸水溶液。
5、根据权利要求1所述的同时检测血或尿中多种酚酸类化合物的测定方法，其特征在于色谱柱长度为30-100mm，内径为1.0-3.0mm。
6、根据权利要求1所述的同时检测血或尿中多种酚酸类化合物的测定方法，其特征在于等度洗脱时流动相的组成为(以体积百分比计)A 30～60％、B70～40％；梯度洗脱时，流动相的组成为(以体积百分比计)A 60～10％、B40～90％。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20060426 |