CN110243969A - 一种同时测定虎掌南星中7种有机酸的hplc方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时测定虎掌南星中4种有机酸的HPLC方法(草酸、L‑苹果酸、枸橼酸和富马酸)的HPLC方法,该方法还能同时检测另外3种有机酸(琥珀酸、顺式乌头酸和反式乌头酸)。本发明的HPLC检测方法,能同时测定虎掌南星药材中的多种有机酸成分,且操作简单,灵敏度高,专属性好,准确度高,可以有效地评价虎掌南星药材的质量。
Description
技术领域
本发明属于中药分析技术领域,具体涉及一种同时测定虎掌南星中7种有机酸的HPLC方法。
背景技术
虎掌南星来源于天南星科半夏属植物虎掌(掌叶半夏)Pinellia pedatisectaSchott的干燥块茎,具有燥湿化痰,祛风定惊,消肿散结的功效。治中风痰壅,口眼歪斜,半身不遂,癫痫,惊风,破伤风,风痰眩晕,喉痹,瘰疬,痈肿,跌扑折伤,蛇虫咬伤。
关于虎掌南星药材及其同属植物半夏的含量测定已有许多报道,但只是测定其中的2~4种成分。众所周知中药的多效性源于其复杂的化学成分,仅靠一两个成分的含量测定不能反映其他成分的情况,难以真正控制其质量。选择更多的成分作为指标进行质量控制研究,更能合理、全面评价虎掌南星药材质量。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种同时测定虎掌南星药材中4种有机酸的HPLC方法。
本发明的虎掌南星中有机酸的HPLC测定方法,包括如下操作步骤:
1)对照品溶液的制备:取对照品,溶解,即得对照品溶液;
2)供试品溶液的制备:取虎掌南星药材,提取,即得供试品溶液;
3)分别吸取对照品和供试品溶液注入高效液相色谱仪,色谱条件如下:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;检测波长:190~260nm;流动相:乙腈为流动相A,0.1%磷酸溶液-甲醇-乙腈为流动相B;梯度洗脱程序如下:
其中,步骤1)所述对照品包括:草酸、L-苹果酸、枸橼酸和富马酸对照品。
更进一步地,该方法还能同时检测另外3种有机酸:琥珀酸、顺式乌头酸和反式乌头酸。
其中,步骤1)所述溶解是加入水溶解。
其中,步骤2)所述提取是指:加入水,超声提取,离心,取上清液,加入乙酸乙酯萃取。
其中,步骤2)所述提取方法如下:
取虎掌南星药材,加入药材25~200w/v(g/mL)倍的水,超声提取30~90min,放冷,用水补足减失的质量,滤过或离心(10000r/min,离心5min,取上层清液再离心一次),精密量取清液5mL,加磷酸(或盐酸)后,摇匀,用乙酸乙酯萃取5次,合并乙酸乙酯,减压浓缩至干,残渣加0.1%磷酸溶液使溶解,并定容,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
进一步地,所述提取方法如下:
取虎掌南星药材粉末(过四号筛)0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入药材100w/v(g/mL)倍的水,称定质量,超声提取60min,放冷,用水补足减失的质量,滤过或离心(10000r/min,离心5min,取上层清液再离心一次),精密量取上清液5mL,加磷酸(或盐酸)0.5mL,摇匀,用乙酸乙酯萃取5次,每次25mL,合并乙酸乙酯,减压浓缩至干,残渣加0.1%磷酸溶液使溶解,并定容至5mL,摇匀,滤过,取续滤液,过0.45μm微孔滤膜,即得供试品溶液。
其中,所用色谱柱为Intersil ODS-3 C18色谱柱;规格为4.6mm×250mm,5μm。
其中,所述检测波长为210nm。
其中,所述流动相B中0.1%磷酸溶液、甲醇、乙腈比例为99:0.5:0.5。
其中,所述色谱条件还包括:
流速为0.5mL/min;和/或,柱温为25℃;和/或,进样量为20μL。
本发明的虎掌南星的HPLC检测方法,能同时定量测定虎掌南星药材中的7种成分,且本法操作简单,灵敏度高,专属性好,准确度高,可以有效地评价虎掌南星药材的质量。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1A供试品HPLC图,1.草酸,2.L-苹果酸,3.枸橼酸,4.琥珀酸,5.富马酸,6.顺式乌头酸,7.反式乌头酸
图1B对照品HPLC图,1.草酸,2.L-苹果酸,3.枸橼酸,4.琥珀酸,5.富马酸,6.顺式乌头酸,7.反式乌头酸
具体实施方式
仪器与试药
1、仪器:安捷伦1200高效液相色谱仪(DAD检测器);电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司);旋转蒸发仪(德国Heldolph);循环水式多用真空泵;离心机(美国Beckmancoulter)。
2、试药:对照品:草酸(批号101097-201101),L-苹果酸(批号190014-201302),枸橼酸(批号1003396-201302),富马酸(批号111541-201102,纯度99.4%),以上对照品均购于中国食品药品检定研究院;琥珀酸(批号wkq16081104,纯度≥98%)购于维克奇生物科技有限公司;顺式乌头酸、反式乌头酸均购于成都中科微大科技有限公司,纯度>98%。甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯,水为超纯水,其他为分析纯。11批虎掌南星药材从河北、黑龙江、四川、甘肃等地收集。
实施例1虎掌南星药材的定量测定方法
1、对照品溶液制备:分别精密称取草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸对照品适量,加水制成每1mL含草酸200μg、L-苹果酸100μg、枸橼酸200μg、琥珀酸200μg、富马酸5μg、顺式乌头酸10μg、反式乌头酸10μg的混合对照品溶液。
2、供试品溶液制备:取样品粉末(过四号筛)约0.5g,精密称定,加水50mL,称定重量,超声处理60min,放冷,再称定重量,用水补足减失的重量,滤过或离心(10000r/min,离心5min,取上层清液再离心一次),精密量取上清液5mL,加磷酸1mL,摇匀,用乙酸乙酯萃取5次,每次25mL,合并乙酸乙酯,减压浓缩至干,残渣加0.1%磷酸溶液使溶解,并定容至5mL,滤过,取续滤液,作为供试品溶液。
3、分别吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL,注入高效液相色谱仪,色谱条件如下:色谱柱为Intersil ODS-3 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈为流动相A,0.1%磷酸溶液-甲醇-乙腈(99:0.5:0.5)为流动相B进行梯度洗脱;流速0.5mL/min;柱温25℃;检测波长为210nm;梯度洗脱如下:
4、绘制标准曲线:以对照品峰面积为纵坐标(Y),以对照品浓度X(μg/mL)为横坐标。根据标准曲线,分别计算供试品中草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸的含量。供试品高效液相色谱图参见图1A,对照品高效液相色谱图参见图1B。
实施例2虎掌南星药材含量测定方法的方法学考察
1、线性关系考察:精密吸取实施例1中的混合对照品溶液,加水稀释成系列不同浓度的混合对照品溶液,进样20μL,进行测定,记录色谱图,测定其峰面积,并以对照品浓度(μg/mL)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线,得回归方程,结果见表1。
表1线性关系考察结果
结果显示草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸对照品线性范围良好。
2、精密度试验:精密吸取混合对照品溶液,按实施例1中的色谱条件重复进样6次,测定峰面积。草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸峰面积的RSD范围为0.19%~1.85%,表明仪器精密度良好。
3、稳定性试验:精密吸取同一份供试品溶液,分别于制备后0h、2h、4h、8h、16h、24h进样,按实施例1中的色谱条件测定峰面积。草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸峰面积的RSD范围为0.79%~2.44%,结果表明供试品溶液在室温下24h稳定。
4、重复性试验:取药材粉末6份,按实施例1中的供试品溶液制备方法制备,按实施例1中的色谱条件进行测定,结果草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸质量分数的RSD范围为1.61%~3.82%,表明该方法重复性良好。
5、加样回收率试验:取样品粉末(过4号筛)6份,每份约0.25g,精密称定,分别加入混合对照品溶液,按实施例1中供试品溶液制备方法制备,根据测得量和加入量计算各成分的加样回收率和RSD,结果草酸、L-苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸的平均回收率为105.3%、95.2%、99.0%、98.5%、86.8%、93.3%、96.8%。
实施例3虎掌南星样品的含量测定
取虎掌南星样品粉末(过4号筛)0.5g,精密称定,按实施例1中的方法制备供试品溶液,按实施例1中的色谱条件对7种有机酸进行定量分析,测定各成分的峰面积,代入回归方程计算各有机酸的含量,结果见表2。
表2 11批虎掌南星中7种有机酸含量测定结果(n=2)
综上,本发明的虎掌南星药材HPLC检测方法,不仅能同时检测虎掌南星药材中的4种有机酸成分:草酸、L-苹果酸、枸橼酸和富马酸,还能同时检测另外3种有机酸:琥珀酸、顺式乌头酸和反式乌头酸,该发明方法灵敏度高、专属性好、准确、简便,可以有效地评价虎掌南星药材的质量,为虎掌南星药材的质量控制、物质基础等研究奠定了基础。
Claims (11)
1.一种同时测定虎掌南星中4种有机酸的HPLC方法,其特征在于:它包括如下操作步骤:
1)对照品溶液制备:取对照品,溶解,即得对照品溶液;
2)供试品溶液制备:取虎掌南星药材,提取,即得供试品溶液;
3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪,色谱条件如下:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;检测波长:190~260nm;流动相:乙腈为流动相A,0.1%磷酸溶液-甲醇-乙腈为流动相B;梯度洗脱程序如下:
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤1)所述对照品包括:草酸、L-苹果酸、枸橼酸和富马酸对照品。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:该检测方法还能同时检测另外3种有机酸:琥珀酸、顺式乌头酸、反式乌头酸。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤1)所述溶解是加入水溶解。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤2)所述提取是指:加入水,超声提取,滤过或离心,取清液,酸化,加入乙酸乙酯萃取。
6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤2)所述提取方法如下:
取虎掌南星药材,加入药材25~200w/v(g/mL)倍的水,超声提取30~90min,放冷,用水补足减失的质量,滤过或离心,取清液加磷酸(或盐酸),摇匀,用乙酸乙酯萃取5次,合并乙酸乙酯,减压浓缩至干,残渣加0.1%磷酸溶液使溶解,并定容,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
7.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于:所述提取方法如下:
取虎掌南星药材粉末(过四号筛)0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入药材100w/v(g/mL)倍的水,称定质量,超声提取60min,放冷,用水补足减失的质量,滤过或离心(10000r/min,离心5min,取上层清液再离心一次),精密量取清液5mL,加磷酸(或盐酸)0.5mL,摇匀,用乙酸乙酯萃取5次,每次25mL,合并乙酸乙酯,减压浓缩至干,残渣加0.1%磷酸溶液使溶解,并定容至5mL,摇匀,滤过,取续滤液,过0.45μm微孔滤膜,即得供试品溶液。
8.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所用色谱柱为Intersil ODS-3 C18色谱柱;规格为4.6mm×250mm,5μm。
9.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述检测波长为210nm。
10.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述流动相B中0.1%磷酸溶液、甲醇、乙腈比例为99:0.5:0.5。
11.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述色谱条件还包括:流速为0.5mL/min;和/或,柱温为25℃;和/或,进样量为20μL。
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