CN110715989B - 九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法及质量检测方法 - Google Patents

九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法及质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法，包括：对阿魏酰基苯乙胺的对照品溶液进行色谱分析，并获取峰面积和浓度的线性方程；将九层风制备形成待测样品溶液后进行色谱分析获得待测样品峰面积，根据所述线性方程算出待测样品的浓度，最后得到九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量。通过本发明能够快速、精确的测定九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量的测定方法，为其质量控制和壮药民族药的研究开发奠定基础。

Description

九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法及质量检测方法
技术领域
本发明属于色谱检测技术领域，具体涉及一种九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法及使用其作为九层风的质量的检测的方法。
背景技术
九层风(C.frutescens)为苋科浆果苋属植物浆果苋Cladostachysamaranthoides(Lam.)Kua.的干燥茎枝，是广西的常用道地药材[1]，在广西壮医药民族医用药应用十分广泛，具有通水道谷道，调火路，去风毒，除湿毒等功效，用于发旺(风湿骨痛)，肉扭(淋证)，白冻(泄泻)，阿意咪(痢疾)等疾病[2]。在民间也常用其备置药酒治疗风湿性关节炎。虽然九层风在《中国植物志》和《广西壮族自治区壮药质量标准》第一卷中都有记载，但是却未见有其标准含量测定相关内容。
九层风中的成分复杂，并且在不同地区、不同环境条件下培养得到的九层风中的成分含量有差异，虽然九层风在中药复方中的使用历史长久，但九层风的使用量指导都是以九层风干燥茎枝的重量为参考，这不仅会影响九层风的开发利用更影响了九层风的临床用药安全。在九层风中阿魏酰基苯乙胺含量较高，且九层风中的阿魏酰基苯乙胺活性较好，适合用以测定以评价指导九层风的临床药用。其中，九层风中的阿魏酰基苯乙胺中含有2种成分含量较高的单体化合物：N-反式阿魏酰基-5′-甲氧基-6′-羟基苯乙胺和N-反式阿魏酸酰对羟基苯乙胺。
因此，亟需一种可以快速、精确的测定九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量的测定方法，为其质量控制和壮药民族药的研究开发奠定基础。
发明内容
本发明的目的是解决至少上述的缺陷，并提供以后将说明的优点。
本发明的另一个目的是，为九层风建立一个快速有效的指标成分含量的测定方法。
本发明的再一个目的是，通过测定九层风的指标成分阿魏酰基苯乙胺的含量以判定九层风的质量。
为了实现本发明的这些目的和其他优点，现提供阿魏酰基苯乙胺中单体化合物N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺和N-反式阿魏酸酰对羟基苯乙胺的分子结构式：
1、N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺：
Figure BDA0002257846690000021
2、N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺：
Figure BDA0002257846690000022
一种九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法，其中，包括：
对阿魏酰基苯乙胺的对照品溶液进行色谱分析，并获取峰面积和浓度的线性方程；将九层风制备形成待测样品溶液后进行色谱分析获得待测样品峰面积，根据所述线性方程算出待测样品的浓度，最后计算得到九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量；其中，色谱分析条件为：色谱柱：4.6×250mm，5μm粒径，Agilent TC-C18层析柱；检测波长：317nm；进样量：10μL；流动相为：色谱纯乙腈-水；其中，流动相的梯度为：0～16min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75；16～25min，色谱纯乙腈和水的体积比为90：10；25～30min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75。
本发明的上述方法能够快速检测出九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量，速度快效果好。
本发明的色谱分析条件能够使得主峰和杂质峰达到基线分离，干扰小，具有良好的专属性。
优选的是，所述阿魏酰基苯乙胺为N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺或N- 反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺或N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺和N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺。
优选的是，所述线性方程的获得方法为：量取质量浓度为1.0mg/mL的 N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、2.4mL各一份，分别置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度线并摇匀，得到不同浓度的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液；分别对不同浓度的 N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液进行色谱分析，并记录得到的不同浓度的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液的色谱峰面积；以对照品溶液的色谱峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制得到标准曲线，根据标准曲线计算得到所述线性方程。
优选的是，所述线性方程的获得方法为：量取质量浓度为1.0mg/mL的 N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.6mL 各一份，分别置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度线并摇匀，得到不同浓度的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液；分别对不同浓度的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液进行色谱分析，并记录得到的不同浓度的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液的色谱峰面积；以对照品溶液的色谱峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制得到标准曲线，根据标准曲线计算得到所述线性方程。
优选的是，当所述阿魏酰基苯乙胺为N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺时所述峰面积与浓度的线性方程为：y＝0.4836x-0.1863；其中，y为峰面积，x为浓度，且20<x<240μg/mL。
优选的是，当所述阿魏酰基苯乙胺为N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺时所述峰面积与浓度的线性方程为：y＝0.6327x-0.6019；其中，y为峰面积，x为浓度，且20<x<160μg/mL。
优选的是，所述待测样品溶液通过以下方法获得：
步骤一、取九层风的干燥茎杆磨成粉末，过三号筛，得到待测粉末。
步骤二、称取上述待测粉末2g置于三角瓶中，并加入50mL甲醇溶液，浸泡20～60min得到第一混合液。
步骤三、取上述第一混合液进行第一次超声处理，过滤得到第一滤液；向第一滤液加入甲醇溶液补充至50mL后进行第二次超声处理，过滤得到第二滤液；向第二滤液加入甲醇溶液补充至50mL后进行第三次超声处理，过滤即得到所述提取液；其中，超声处理的条件为：150W、40kHz，30min。
步骤四：取所述提取液在水浴条件下浓缩至所述提取液蒸干，加入15～20
mL甲醇溶液进行溶解，得到第二混合液。
步骤五、取上述第二混合液转移至25mL容量瓶中，并加入甲醇溶液定容至刻度线，摇匀即得到所述待测样品溶液。
优选的是，所述的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法中，所述待测样品溶液在色谱分析前采用0.45μm的微孔滤器进行过滤处理。
一种九层风药材质量快速检测方法，利用所述测定方法进行九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定，其中，包括：对标准九层风药材中的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺、或N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺、或N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺和N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺含量进行多次测定获得标准含量范围并作为评定指标；对待检测九层风药材中的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺、或N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺、或N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺和N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺含量进行测定获得对比含量；将对比含量和标准含量范围比对以检测待检测九层风药材质量。
优选的是，所述的九层风药材质量快速检测方法中，九层风药材中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺标准含量范围为0.069％～0.072％；N-反式阿魏酰-5'- 甲氧基-6'-羟基苯乙胺标准含量范围为0.0267％～0.0275％；阿魏酰基苯乙胺的总含量范围为0.096％～0.099％。
本发明的优点：
本发明的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量测定的方法能快速、有效的检测得到九层风中的指标成分阿魏酰基苯乙胺的含量，且检测的精密度、稳定性良好，且重复性、回收率高。
附图说明
图1为本发明中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的碳谱图；
图2为本发明中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的氢谱图；
图3为本发明中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的碳谱图；
图4为本发明中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的氢谱图；
图5为本发明中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液的色谱图；
图6为本发明中待测样品溶液的色谱图；
图7为本发明中阴性对照品溶液的色谱图；
图8为本发明中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的标准曲线；
图9为本发明中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液的色谱图；
图10为本发明中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的标准曲线。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
一、获取N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品的线性方程
S1、吸取质量浓度为1.0mg/mL的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、2.4mL各一份，分别置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度线并摇匀，得到不同浓度的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液。
S2、分别对不同浓度的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液进行色谱分析，并记录得到的不同浓度的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液的色谱峰面积。色谱条件：色谱柱：4.6×250mm，5μm粒径，Agilent TC-C18 层析柱；检测波长：317nm；进样量：10μL；流动相为：色谱纯乙腈-水。其中，流动相的梯度为：0～16min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75；16～25 min，色谱纯乙腈和水的体积比为90：10；25～30min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75。
S3、以对照品溶液的色谱峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制即得到标准曲线，结果如图8所示，然后计算得到标准曲线的线性方程，所述线性方程为：y＝0.4836x-0.1863；其中，y为峰面积，x为浓度，且20<x<240μg/mL。
二、进行九层风中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺含量的测定
1、制备待测样品溶液：
步骤一、取九层风的干燥茎杆磨成粉末，过三号筛，得到待测粉末。
步骤二、称取上述待测粉末2g置于三角瓶中，并加入50mL甲醇溶液，浸泡24小时得到第一混合液。
步骤三、取上述第一混合液在150W、40kHz条件下进行超声处理两次，每次30min，合并滤液，即得到所述提取液。
步骤四：取所述提取液在水浴条件下浓缩至所述提取液蒸干，加入20mL 甲醇溶液进行溶解，得到第二混合液。
步骤五、取上述第二混合液并转移至25mL容量瓶中，并加入甲醇溶液定容至刻度线，摇匀即得到所述待测样品溶液。
2、对待测样品溶液进行色谱分析并获得待测样品溶液的色谱峰面积：
色谱条件和N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液进行色谱分析的色谱条件一致，均为：色谱柱：4.6×250mm，5μm粒径，Agilent TC-C18层析柱；检测波长：317nm；进样量：10μL；流动相为：色谱纯乙腈-水。其中，流动相的梯度为：0～16min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75；16～25 min，色谱纯乙腈和水的体积比为90：10；25～30min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75。
3、根据获得待测样品溶液的色谱峰峰面积代入到所述线性方程计算得到九层风中的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的浓度，再根据待测样品溶液的体积计算即可得到九层风中的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的含量。
实施例2
一、对实施例1中的色谱条件的专属性进行考察
分别精密吸取N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液，待测品溶液，阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，使用实施例1中的色谱条件进行色谱分析，结果见图5～7所示，结果表明：九层风待测品中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺与N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品色谱峰保留时间一致，并与其他共存成分分离度为1.58(大于1.5)，理论塔板数为7798(大于3000)，主峰与杂质峰达到基线分离，且阴性对照样品在相应位置没有色谱峰干扰，说明本发明的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法的色谱条件的专属性良好。
其中，阴性对照品溶液的制备步骤为：
步骤一、量取50mL甲醇溶液置于三角瓶中，在150W、40kHz条件下进行超声处理两次，每次30min，合并滤液，得到第一对照品溶液。
步骤二：取所述第一对照品溶液在水浴条件下浓缩至所述第一对照品溶液蒸干，加入20mL甲醇溶液进行溶解，得到第二对照品溶液。
步骤三、取上述第二对照品溶液并转移至25mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容至刻度线，摇匀即得到所述阴性对照品溶液。
二、线性范围的确定
分别精密量取N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液(1.0mg/mL) 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4mL，置于10mL容量瓶中，使用甲醇溶解并稀释至刻度线，按照实施例1中的色谱条件依次进样10μL，以色谱峰面积为纵坐标，以对照品浓度为横坐标绘制标准曲线，计算得到标准曲线线性方程： y＝0.4836x-0.1863，R2＝0.9999，其中，y为峰面积，x是浓度。结果表明，N- 反式阿魏酰基对羟基苯乙胺进样量在0.2μg～2.4μg之间时，N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的浓度与峰面积之间有着良好线性关系。结果如下表和图8所示：
表1线性关系考察
Figure BDA0002257846690000081
三、精密度试验
精密吸取N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液连续重复进样6次，记录色谱峰面积，考察峰面积的变化情况，并计算RSD，结果如表2所示，结果表明：本发明的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法测定所得到的 N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的色谱峰面积的精密度良好。
表2精密度试验
Figure BDA0002257846690000082
四、稳定性试验
精密称取九层风样品约2g，按照实施例1待测样品溶液的制备方法制得待测样品溶液，分别于配制后0、1、2、4、8、12h进行过滤，再取续滤液 10μL注入高效液相色谱仪中以实施例1的方法对N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺进行测定，记录色谱峰面积，并计算RSD，结果如表3所示，结果表明：待测样品溶液在12h内稳定。
表3稳定性试验
Figure BDA0002257846690000091
五、重复性试验
精密称取同一批九层风药材粉末6份，每份约2g，按测样品溶液的制备方法制得待测样品溶液，并按照实施例1的方法进行含量的测定，并计算九层风中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的含量以及RSD，结果如表4所示，结果表明：本发明的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法测定所得到的N- 反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的含量重复性良好。
表4重复性试验
Figure BDA0002257846690000092
六、加样回收率试验
精密称取已测定含量的九层风粉末6粉，每份约1g，与等含量的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品混合，再按照实施例1的方法制备得到待测样品溶液，并以实施例1的方法进行N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺含量的测定，计算回收率和RSD，结果如表5所示，结果表明：本发明的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法用于N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺含量测定的准确性良好。
表5加样回收率试验
Figure BDA0002257846690000101
七、九层风中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的含量测定
取3份九层风药材，按照实施例1的方法进行色谱分析，并计算九层风中的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的含量，结果如表6，结果表明：九层风中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺含量在0.069％～0.072％，平均含量为 0.071％，九层风中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的含量均不低于0.069％。
表6九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量测定
Figure BDA0002257846690000102
实施例3
一、获取N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品的线性方程
S1、吸取质量浓度为1.0mg/mL的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.6mL各一份，分别置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度线并摇匀，得到不同浓度的N-反式阿魏酰-5'- 甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液。
S2、分别对不同浓度的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液进行色谱分析，并记录得到的不同浓度的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液的色谱峰面积。色谱条件：色谱柱：4.6×250mm，5μm粒径，Agilent TC-C18层析柱；检测波长：317nm；进样量：10μL；流动相为：色谱纯乙腈-水。其中，流动相的梯度为：0～16min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75；16～25min，色谱纯乙腈和水的体积比为90：10；25～30min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75。
S3、以对照品溶液的色谱峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制即得到标准曲线，结果如图10所示，然后计算得到标准曲线的线性方程，所述线性方程为：y＝0.6327x-0.6019；其中，y为峰面积，x为浓度，且20<x<160μg/mL。
二、进行九层风中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺含量的测定
1、制备待测样品溶液：
步骤一、取九层风的干燥茎杆磨成粉末，过三号筛，得到待测粉末。
步骤二、称取上述待测粉末2g置于三角瓶中，并加入50mL甲醇溶液，浸泡24小时得到第一混合液。
步骤三、取上述第一混合液在150W、40kHz条件下进行超声处理两次，每次30min，合并滤液，即得到所述提取液。
步骤四：取所述提取液在水浴条件下浓缩至所述提取液蒸干，加入20mL 甲醇溶液进行溶解，得到第二混合液。
步骤五、取上述第二混合液并转移至25mL容量瓶中，并加入甲醇溶液定容至刻度线，摇匀即得到所述待测样品溶液。
2、对待测样品溶液进行色谱分析并获得待测样品溶液的色谱峰面积：
色谱条件和N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液进行色谱分析的色谱条件一致，均为：色谱柱：4.6×250mm，5μm粒径，Agilent TC-C18 层析柱；检测波长：317nm；进样量：10μL；流动相为：色谱纯乙腈-水。其中，流动相的梯度为：0～16min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75；16～25 min，色谱纯乙腈和水的体积比为90：10；25～30min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75。
3、根据获得待测样品溶液的色谱峰峰面积代入到所述线性方程计算得到九层风中的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺的浓度，再根据待测样品溶液的体积计算即可得到九层风中的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的含量。
实施例4
一、对实施例3中的色谱条件的专属性进行考察
分别精密吸取N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液，待测品溶液，阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，使用实施例3中的色谱条件进行色谱分析，结果见图6、7、9所示，结果表明：九层风待测品中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺与N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品色谱峰保留时间一致，并与其他共存成分分离度为1.58(大于1.5)，理论塔板数为7798(大于3000)，主峰与杂质峰达到基线分离，且阴性对照样品在相应位置没有色谱峰干扰，说明本发明的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法的色谱条件的专属性良好。
其中，阴性对照品溶液的制备步骤为：
步骤一、量取50mL甲醇溶液置于三角瓶中，在150W、40kHz条件下进行超声处理两次，每次30min，合并滤液，得到第一对照品溶液。
步骤二：取所述第一对照品溶液在水浴条件下浓缩至所述第一对照品溶液蒸干，加入20mL甲醇溶液进行溶解，得到第二对照品溶液。
步骤三、取上述第二对照品溶液并转移至25mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容至刻度线，摇匀即得到所述阴性对照品溶液。
二、线性范围的确定
分别精密量取N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液(1.0 mg/mL)0.2、0.4、0.6、0.8、1.6mL，置于10mL容量瓶中，使用甲醇溶解并稀释至刻度线，按照实施例3中的色谱条件依次进样10μL，以色谱峰面积为纵坐标，以对照品浓度为横坐标绘制标准曲线，计算得到标准曲线线性方程：y＝0.6327x-0.3019，R2＝0.9998，其中，y为峰面积，x是浓度。结果表明， N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺进样量在0.2μg～1.6μg之间时，N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的浓度与峰面积之间有着良好线性关系。结果如下表和图10所示：
表7线性关系考察
Figure BDA0002257846690000131
三、精密度试验
精密吸取N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液连续重复进样6次，记录色谱峰面积，考察峰面积的变化情况，并计算RSD，结果如表 8所示，结果表明：本发明的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法测定所得到的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的色谱峰面积的精密度良好。
表8精密度试验
Figure BDA0002257846690000132
四、稳定性试验
精密称取九层风样品约2g，按照实施例3待测样品溶液的制备方法制得待测样品溶液，分别于配制后0、1、2、4、8、12h进行过滤，再取续滤液 10μL注入高效液相色谱仪中以实施例1的方法对N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'- 羟基苯乙胺进行测定，记录色谱峰面积，并计算RSD，结果如表9所示，结果表明：待测样品溶液在12h内稳定。
表9稳定性试验
Figure BDA0002257846690000141
五、重复性试验
精密称取同一批九层风药材粉末6份，每份约2g，按测样品溶液的制备方法制得待测样品溶液，并按照实施例3的方法进行含量的测定，并计算九层风中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的含量以及RSD，结果如表10 所示，结果表明：本发明的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法测定所得到的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的含量重复性良好。
表10重复性试验
Figure BDA0002257846690000142
六、加样回收率试验
精密称取已测定含量的九层风粉末6粉，每份约1g，与等含量的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品混合，再按照实施例3的方法制备得到待测样品溶液，并以实施例3的方法进行N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺含量的测定，计算回收率和RSD，结果如表11所示，结果表明：本发明的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法用于N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺含量测定的准确性良好。
表11加样回收率试验
Figure BDA0002257846690000151
七、九层风中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的含量测定
取3份九层风药材，按照实施例3的方法进行色谱分析，并计算九层风中的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的含量，结果如表12，结果表明：九层风中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺含量在0.0267％～0.0275％，平均含量为0.027％，九层风中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的含量均不低于0.0267％。
表12九层风中N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的含量测定
Figure BDA0002257846690000152
八、九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量测定
取3份九层风药材，分别按照实施例1和实施例3的方法进行色谱分析，并计算九层风中的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺和N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺的含量，九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量为N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺和N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺含量的总和，结果如表 13，结果表明：九层风中阿魏酰基苯乙胺含量在0.096％～0.099％，平均含量为0.098％，九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量均不低于0.095％。
表13九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量测定
Figure BDA0002257846690000161
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此，在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (6)

1.一种九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法，其特征在于，包括：
对阿魏酰基苯乙胺的对照品溶液进行色谱分析，并获取峰面积和浓度的线性方程；将九层风制备形成待测样品溶液后进行色谱分析获得待测样品峰面积，根据所述线性方程算出待测样品的浓度，最后得到九层风中阿魏酰基苯乙胺的含量；
其中，色谱分析条件为：色谱柱：4.6×250 mm，5 μm粒径，Agilent TC-C18层析柱；检测波长：317 nm；进样量：10 μL；流动相为：色谱纯乙腈-水；其中，流动相的梯度为：0~16 min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75；16~25 min，色谱纯乙腈和水的体积比为90：10；25~30min，色谱纯乙腈和水的体积比为25：75；
所述阿魏酰基苯乙胺为N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺和N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺；
当所述阿魏酰基苯乙胺为N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺时所述峰面积与浓度的线性方程为：y=0.4836x-0.1863；其中，y为峰面积，x为浓度，且20<x<240 μg/mL；
当所述阿魏酰基苯乙胺为N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺时所述峰面积与浓度的线性方程为：y=0.6327x-0.6019；其中，y为峰面积，x为浓度，且20<x<160 μg/mL；
待测样品溶液通过以下方法获得：
步骤一、取九层风的干燥茎杆磨成粉末，过三号筛，得到待测粉末；
步骤二、称取上述待测粉末2 g置于三角瓶中，并加入50 mL甲醇溶液，浸泡20~60 min得到第一混合液；
步骤三、取上述第一混合液进行第一次超声处理，过滤得到第一滤液；向第一滤液加入甲醇溶液补充至50 mL后进行第二次超声处理，过滤得到第二滤液；向第二滤液加入甲醇溶液补充至50 mL后进行第三次超声处理，过滤即得到提取液；其中，超声处理的条件为：150W、40 kHz，30 min；
步骤四：取所述提取液在水浴条件下浓缩至所述提取液蒸干，加入15~20 mL甲醇溶液进行溶解，得到第二混合液；
步骤五、取上述第二混合液转移至25 mL容量瓶中，并加入甲醇溶液定容至刻度线，摇匀即得到所述待测样品溶液。
2.如权利要求1所述的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法，其特征在于：所述线性方程的获得方法为：
量取质量浓度为1.0 mg/mL的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、2.4 mL各一份，分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度线并摇匀，得到不同浓度的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液；
分别对不同浓度的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液进行色谱分析，并记录得到的不同浓度的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺对照品溶液的色谱峰面积；
以对照品溶液的色谱峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制得到标准曲线，根据标准曲线计算得到所述线性方程。
3.如权利要求1所述的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法，其特征在于：所述线性方程的获得方法为：
量取质量浓度为1.0 mg/mL的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.6 mL各一份，分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度线并摇匀，得到不同浓度的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液；
分别对不同浓度的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液进行色谱分析，并记录得到的不同浓度的N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺对照品溶液的色谱峰面积；
以对照品溶液的色谱峰面积为纵坐标，以对照品溶液的浓度为横坐标，绘制得到标准曲线，根据标准曲线计算得到所述线性方程。
4.如权利要求1所述的九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定方法，其特征在于：所述待测样品溶液在色谱分析前采用0.45 μm的微孔滤器进行过滤处理。
5.一种九层风药材质量快速检测方法，利用如权利要求1~4任一所述测定方法进行九层风中阿魏酰基苯乙胺含量的测定，其特征在于，包括：
对标准九层风药材中的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺和N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺含量进行多次测定获得标准含量范围并作为评定指标；
对待检测九层风药材中的N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺和N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺含量进行测定获得对比含量；
将对比含量和标准含量范围比对以检测待检测九层风药材质量。
6.如权利要求5所述的九层风药材质量快速检测方法，其特征在于，九层风药材中N-反式阿魏酰基对羟基苯乙胺标准含量范围为0.069%~0.072%；N-反式阿魏酰-5'-甲氧基-6'-羟基苯乙胺标准含量范围为0.0267%～0.0275%；阿魏酰基苯乙胺的总含量范围为0.096%～0.099%。
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Assignee: Guangxi Guinong Precision Farming Machinery Service Co.,Ltd.

Assignor: GUANGXI BOTANICAL GARDEN OF MEDICINAL PLANTS

Contract record no.: X2023980045319

Denomination of invention: Method for determining the content and quality control of ferulic phenylethylamine in Jiujianfeng

Granted publication date: 20220826

License type: Common License

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